10 e 11_Crescimento Microbiano

CRESCIMENTO MICROBIANOem suspensão em meio líquido

Fases da divisão celular – fissão binária (p.ex. E.coli)

Microscopia de contraste de fase

Microscopia de fluorescência (coloração do nucleóide

com DAPI)

Detecção das proteínas que formam o anel FtsZ)

- Anel proteico (~10000 moléculas FtsZ) no centro da célula , quando começa a

segregação dos dois nucleóides (DNA). Fts – “Filamentous temperature sensitive”

- Proteinas Fts do anel proteico → divisoma (no centro da célula em divisão; orquestra síntese da

membrana plasmática e da parede celular durante enlongamento da célula, seguindo-se constrição

para formar o septo e separação das células).

(combinação de colorações –nucleóide e anel FtsZ)

Fase C

Ciclo celular(ex. Eschericia coli)

Fase D

E. coliTempo de geração médio, em condições óptimas

~ 25 minutos

EXPERIÊNCIA DE CRESCIMENTO DE UMA POPULAÇÃO MICROBIANA EM SUSPENSÃO EM MEIO LIQUIDO

A B

1. INOCULAÇÃO

2. INCUBAÇÃO COM AGITAÇÃO

ORBITAL CONSTANTE E

TEMPERATURA CONTROLADA

3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS, AO LONG O DO TEMPO

CRESCIMENTO EXPONENCIAL

Escherichia coli – tempo de duplicação ~ 25 minutos

Imagine que arranja uma forma de manter uma populaç ão de células de E. coli em

crescimento exponencial durante 24 horas. Se partir de uma única célula, estime

quantas células obteria após esse período de 24 hor as.

24 horas ⇒ 57 duplicações= 140.737.488.400.000.000 células

(~1,4 x 1017)

~ 144 Kg de biomassa

1 célula

(10-12 gramas)

(http://www.e-escola.utl.pt)

Evolução da concentração de células da população mi crobiana

[células] 1 21 22 2n (após n gerações)

CRESCIMENTO EXPONENCIAL

[células] N0 N0. 21 N0.22 N0.2n (após n gerações)

Concentração de células no início da fase de crescimento exponencial

Concentração de células após um periodo de tempo t de crescimento exponencial - Nt.

n =log Nt - log N0

log 2

n - nº de gerações ocorridas durante o período t de crescimento exponencial

Nt = N0.2n⇒

g = t / n g é o tempo de duplicação (ou, de geração) (min ou h)

Representação gráfica do crescimento exponencial

Escala logaritmica

t0

N0

Fase exponencial

g

N,

Cinética do crescimento exponencial

Crescimento exponencial equilibrado –células completamente adaptadas às condições de crescimento→→→→ N pode representar:- Concentração de células, N;

- Densidade óptica da cultura, DO; - concentração de biomassa, X, - concentração de qualquer componente celular

(p.ex. proteinas)

dNt= µ.Nt

dt

Representação matemática (fase exponencial)

Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002

Nt = N0 eµ (t-t0)lnN t = lnN0 + µ (t-t0) (1)

Equivalente a

Ou

µ -taxa específica de crescimento da população microbiana

(t-t0) = g quando Nt = 2.N0

Substituindo na equação (1)g =

ln 2

µ(h; min)

µ - taxa específica de crescimento da população microbiana (o valor de µ corresponde ao declive da recta lnNt vs. (t-t0))

Unidades : tempo -1

(h-1; min -1)

ln N t = lnN0 + µ (t-t0) (1)

A equação que representa o crescimento exponencial de uma população microbiana corresponde à equação de uma recta ( onde y = lnNt , x = (t-t0))

y = b + ax

b – ordenada na origem (= ln N0)

a - declive (= µ)

�� Estimativa da taxa específica de crescimento da pop ulação, µ

� Estimativa do tempo de duplicação da população, g

� Contagem de células viáveis (N)- Método das diluições sucessivas e espalhamentoem meio sólido

� Método espectrofotométrico (DO)

• Determinação da massa celular (biomassa, X )

� Contagem directa de células– Câmaras de contagem (microscópio óptico)– Contadores electrónicos

OBTENÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICRO BIANA

MÉTODOS PARA AVALIAR ACONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS NUMA POPULAÇÃO MICROBIANA

CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS [expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colónias) por ml de suspensão]

N = 1.59 x 105 UFC / ml

Método das diluições sucessivas e espalhamento em meio sólido

As placas devem ter entre ~ 20 e 300 colónias

DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DA DENSIDADE CELUL AR(Densidade Optica – DO λ - medida a um comprimento de onda, λ, particular)


DO = Abs = - log T/100= log ( I0/I )

I0

I0

I

I

I0 – intensidade de luz incidente ( λ particular)

I – intensidade de luz transmitida através da suspensão de células

Transmitância (T) = ( I /Io) x 100 (%)

�D

O64

0nm

0

Concentração de células

TeóricoMedido

Medições no espectrofotómetro

BIOMASSA - representado normalmente por X

Estimativa da biomassa seca (peso seco)

- Pesagem da massa de células presentes na cultura microbiana.

- Peso seco ou húmido

- É usado em circunstâncias específicas, como, por exemplo quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.

Em certas condições, o aumento da massapode não reflectir crescimento da população, mas aumento de compostos de reserva

Câmara de contagem

Figure 6.5Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002

Observação noMicroscópio

Óptico

• Lâmina de vidro especial, onde

está marcado um reticulado com dimensões conhecidas; também é

conhecida a distância da lâmina à

lamela, sendo possível estimar o volume de suspensão de células

sobre o reticulado.

• Fácil, barato e rápido.

• Útil para contar células de

eucariotas e procariotas.

• Não distingue células viáveis de

mortas.

CURVA DE CRESCIMENTO DUMA POPULAÇÃO MICROBIANA EM DESCONTÍNUO (“BATCH”)


Fase de latência Fase exponencial

Log

Opt

ical

Den

sity

(O

D. -

--)

Fase de morte

Fase estacionáriaCultura “batch” – sistema fechado (excepto troca de gases)

Exemplo – cálculo da taxa específica de crescimento Variação da concentração de células duma população bacteriana(incubação em meio de cultura líquido, a 37ºC)

Tempo (h) N (células / mL)

0 1.0 x 104

0.5 1.0 x 104

1 1.5 x 104

2 3.0 x 104

2.5 3.6 x 104

3 4.9 x 104

4 5.0 x 104

Estimativa da taxa específica de crescimento da po pulação, µ

ln (3.0 x 104) - ln (1.5 x 104)ln N2 – ln N1

(2-1)µ = = = 0.7 h-1

(Análise de regressão linear: ln N t vs. t →→→→ declive = 0.7 →→→→ µ = 0.7 h -1 )

Latencia

Exponencial

Estacionária

Declive: 0,7

0 1 2 3 4 Tempo (h)

x 10

4 N

(Esc

ala

loga

ritm

ica)

�

��

�

��

�

População duplica em 1h

Estimativa do tempo de duplicação, g

g = ln2 / µ = ln2 / 0.7 = 1 h

1

2

345

Valores de g e de µ dependem de:

- potencial genético da estirpe microbiana.

- composição do meio de cultura;

- condições ambientais (Temperatura, pH,

disponibilidade de água, nível de oxigénio, etc.)Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,Mc GrawHill, 2002

Crescimento diáuxico

Consumo de glucose

Consumo de lactose

Glucose esgotada

ln [

Cél

ulas

viá

veis

]

Tempo

Glucose rapidamente metabolizada;Repressão da expressão do operão da lactose

(Fenómeno: Repressão Catabólica )

Exemplo: Crescimento de população de Escherichia coliem meio de cultura com duas fontes de C e energia,glucose e lactose.

lactose glucose + ga lactose β-galactosidade

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE LIMITANTE

NO CRESCIMENTO MICROBIANO

543

2

1

0 1 2 3 4

Tempo (h)

[Bio

mas

sa]X

(mg/

L)

�

��

�

��

�

[Nut

rient

e], S

(-

--)

30

15

0

A cheio (vermelho) - Curva de crescimento expressa em termos de evolução da concentração total de biomassa formada (escala logaritmica) em função do tempo.

A tracejado (azul) – Evolução da concentração do nutriente S ao longo do tempo de crescimento.

The relationship between concentration of limiting nutrient, growth rate (green curve) and growth yield (red cur ve)

in a batch culture (closed system).

At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected.

A taxa específica de crescimento, µ, depende da concentração de nutriente limitante (S) fornecida n o meio de cultura

, S

µmax

µmax

2

Ks

Concentração saturante de S

EQUAÇÃO DE MONOD

µ = µmax

S

Ks + S

→ Situação raramente encontrada nos ambientes naturais , onde um ou mais nutrientes estão normalmente presentes em concentrações limitantes ( ⇒ µ < µmax )

µmax- Taxa específica máxima de crescimento

- quando concentração de S é saturante ; – sistemas de transporte transmembranar

para o nutriente S estão saturados

– Constante de semi-saturação- numericamente igual à concentração de substratoque permite uma taxa de crescimento igual a metade da µmax;

– reflecte a afinidade dos sistemas de transporte transmembranar para a molécula do nutriente limitante (maior Ks ⇒ menor afinidade ⇒ menor µ)

Os valores das constantes µmax e KS dependem:

- das caracteristicas intrínsecas do microrganismo;

- do substrato limitante;

- das condições ambientais (ex. Temperatura, pH, etc .)

KS

Microrganismo Temperatura Nutrien te limitante µmax (h-1) Ks (mg/L)

Escherichia coli 37ºC Glucose 0.8-1.4 2-4Escherichia coli 37ºC Glicerol 0.9 2Escherichia coli 37ºC Lactose 0.8 20Saccharomyces cerevisiae 30ºC Glucose 0.5 25Candida tropicalis 30ºC Glucose 0.5-0.6 50-75

- Competição entre diferentes microorganismos (p.ex. S. cerevisiae e C. tropicalis)

, S

- Y reflecte a eficiência do crescimento microbiano relativamente ao nutriente (substrato) limitante usado para crescimento

(fins comerciais / custos de produção)

Rendimento do crescimento , Y =

Biomassa total formada (fase estacionária)

Massa de nutriente usada=

X

S

Inibição pelo substrato

FACTOR DE RENDIMENTO EM ATP (Y ATP) = Biomassa produzida (g)

ATP produzido (moles)

Medida da eficiência com que a célula utiliza para crescimento (i.e. biossíntese de novo de biomassa) a energia que produz.

Conceito de ENERGIA DE MANUTENÇÃO

Exemplo: S – fonte de C e energia, fermentiscível (p.ex. glucose)

S

BIOSSÍNTESE DE MATERIAL CELULAR (CRESCIMENTO)

ENERGIA ( ATP)

Energia de MANUTENÇÃO (desvio)(Ex. Gastos em renovação de macromoléculas (proteínas, RNA), expulsão activa de metabolitos tóxicos, manutenção de gradientes electroquímicos de iões e do pH intracelular em níveis óptimos, etc.

Para uma dada estirpe microbiana, o valor YATP depende das condições ambientais.

Quanto mais afastadas das condições óptimas, maiores são os gastos de energia para manutenção:

⇒ ↓ YATP

verifica-se que YATP real < YATP teórico(i.e., admitindo que

todo o ATP sintetizado é usado para biossíntese)


Esquema de bioreactor (ou fermentador)industrial para microrganismo aeróbio

(Note os sistemas para medição e controlo de temperatura, pH, nivel de oxigénio e

para análise de metabolitos – biosensor unit)

“Scale-up” na produção industrial de microrganismos(exemplo- produção de células da levedura Saccharomyces cerevisiae)

TIPOS E EXEMPLOS DE PRODUTOS DE ORIGEM MICROBIANA

Metabolitos prim ários vs. secundários

Metabolito primárioassociado ao metabolismo essencial do microrganismo

(Ex. etanol, produzido em resultado da fermentação alcoólica)

Tempo

Con

cent

raçã

o de

cél

ulas

ou

mas

sa c

elul

ar

Con

cent

raçã

o de

pro

duto

form

ado

Crescimento

Crescimento

Formação demetabolito primário

Formação de metabolito secundário

(

)

(

)

Metabolito secundárioapós a fase de produção das células (após o crescimento exponencial),normalmente a partir de um metabolitoprimário ou de substrato usado para crescimento que esteja em excesso

Ex. antibióticos produzidospor fungos miceliais ou por bactérias)

CULTURA CONTÍNUA DE MICRORGANISMOS NO QUIMIOSTATO

QUIMIOSTATO – opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.

X, S, F

Esquema de funcionamentode um bioreactor para acultura contínua demicrorganismos(exemplo - quimiostato)

S0, F

Caudal de alimentação do meio fresco = caudal de saída da cultura = F (Litros/hora)

Volume da cultura no quimiostato = V = constante (L)

FD – taxa de diluição = (h-1) (inverso do tempo de retenção médio da célula

V no interior do quimiostato )

O quimiostato permite manter a população microbiana em crescimento equilibrado, isto é, na fase de crescimento exponen cial, durante períodos de tempo longos – i.e. em ESTADO ESTACIONÁRIO.

TAXA DE DILUIÇÃO

ESTADO ESTACIONÁRIO

Equação do estado estacionário no quimiostato

� Balanço de massas à massa celular, X(não há morte celular; não há entrada de células do exterior, X0=0))

S0, F

X, S, F

V = volume de cultura no quimiostato (L)

X – massa celular (g/L)

F – caudal (L/h)

S – concentração de nutrienteLimitante (g/L)

µ – taxa específica de crescimento (h-1)

T – tempo (h)

Massa celular produzida

Variação da massa celular no quimiostato

= -Massa celular

que sai noefluente

dX

dt= 0Estado

estacionário ⇒

- F

V.X

dX

dt= µ.X

µ.XF

V.X⇒ = ⇒

F

Vµ = = D

D – taxa de diluição (h-1)µ = D

Estado estacionário (“steady state”) no quimiostato

Dependência da concentração de biomassa (X), da concentração de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicação da população microbiana no estado estacionário, em função dataxa de diluição a que o quimiostato opera (D).

(S0)(X)

(S)

(D)

Nota: alteração de F → alteração da taxa de diluição, D

Exemplo: Volume cultura = 5000 mL; Caudal através d oquimiostato, F = 2500 mL/hora --- D = 0,5 h -1

“WASHOUT”(quando D ≥≥≥≥ Dc Dc – taxa de diluição crítica)

� Desvio ao modelo estabelecido para o quimiostato (X em função de D):

Caso - limitação do crescimento pela fonte de C Microrganismos quimiorganotróficos hetrotróficos (p.ex., nutriente limitante S é fonte de Carbono e de energia) → uma parte significativa da energia produzida a partir de S é desviada para gastos energéticos de manutenção (Energia de Manutenção ).

Mensurável quando a taxa de diluição a que o quimio stato opera é muito baixa

(S0)(X)

(S)

(D)

Vantagens/aplicações do crescimento microbiano em c ontínuo no quimiostato(versus crescimento descontínuo ou “batch”):

� Produto com características constantes durante períodos de tempo longos

� População microbiana na fase exponencial do crescimento durante períodos

longos (semanas, meses)

� Culturas em crescimento exponencial com taxas específicas de crescimento diferentes

(através da (simples) modificação da taxa de diluição → útil para estudos fisiológicos)

� Maiores produtividades, e eliminação de tempos mortos

� Vantagens na selecção de microrganismos que sejam mais competitivos na utilização do nutriente limitante

� Vantagens no estabelecimento de culturas de enriquecimento para isolamento de

populações microbianas específicas a partir de populações mistas (por ex., amostras

ambientais)

A afirmação (ou não) de um dado microrganismo face a outro (p.ex., se a população for mista), depende da relação entre os coeficientes de Monod para os micr organismos em causa (depende em particular da const ante desemi-saturação para o substrato S, K S, que é inversamente proporcional à eficiência com qu e o microrganismoutiliza o nutriente limitante).

Microrganismo A Microrganismo BEXEMPLOQuimiostato a operar com D = µA µA = µmax A

S

KsA + SD =

�� Se KSB > KSA ⇒⇒⇒⇒

µB = µmax B

S

KsB + S

µB < µA ⇒ µB < D ⇒ Só o microrganismo A permanece no quimiostatoB não permanece no quimiostato (i.e. sofre “washout ”)

�� Se KSB < KSA ⇒⇒⇒⇒ µB > µA ⇒ µB > D ⇒ B permanece no quimiostato, juntamente com A

µmaxA ~ µmaxB

Em cultura contínua, um microrganismo invasor (p.ex. contaminante ou mutante viável) pode acumular no quimiostato, se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante eficientemente face à estirpe microbiana original ⇒ contaminação da cultura original.

Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostat o.

NOTAS sobre crescimento microbiano

CRESCIMENTO MICROBIANO

O crescimento microbiano é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celula res

(por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos ). Este aumento está normalmente associado ao aumento

do número de células em consequência da multiplicação celular.

É definido como o crescimento duma população de células dum microrganismo, ou seja,

o aumento do número de células do microrganismo ao longo do tempo.

É normalmente quantificado em termos do aumento no tempo de:

(i) nº de células; (ii) densidade óptica da cultura; ou, (iii) massa celular (biomassa).

Em certas condições, o aumento da massa pode não reflectir crescimento da população, mas

aumento de compostos de reserva (p.ex. glicogénio, poli-β-hidroxibutirato, etc.)

Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fissão binária (p.ex. maior parte das bactérias) ou

por gemulação (p.ex. maior parte das leveduras). Em consequência do processo de multiplicação

celular, uma célula dará origem a duas ao fim de um certo período de tempo que é designado por

tempo de geração ou duplicação .

O conhecimento dos valores de µ (taxa especifica de crescimento ) e de g (tempo de duplicação ) para um dado microrganismo permite:- prever como evoluirá a concentração de células ao longo do tempo de incubação num determinadomeio de cultura e/ou em determinadas condições ambientais;

- testar o efeito de uma determinada alteração das condições ambientais sobre o crescimento do microrganismo (p.ex. modificação do meio de cultura, da Temperatura, etc.)

⇒⇒⇒⇒ OBJECTIVOS ESSENCIAIS:� seleccionar as condições de cultura óptimas para um dado microrganismo.�� estabelecer métodos que permitam controlar o cresci mento de microrganismos.

O tempo de duplicação (ou geração) pode repetir-se várias vezes, enquanto estiverem disponíveis no

meio de cultura nutrientes em quantidade suficiente para assegurarem os metabolismos

catabólico (bioenergético) e anabólico (biossíntese) das células e enquanto as condições ambientais

forem favoráveis.

A duração do crescimento exponencial de bactérias em meio de cultura laboratorial

depende da bactéria em causa e pode ficar limitada por falta de nutrientes, privação de

oxigénio, acumulação de produtos tóxicos, ou outros factores.

Contadores electrónicos(ex. Contador coulter, citómetro de fluxo)

• São instrumentos usados para contar partículas em suspensão.• Possuem um pequeno orifício onde é estabelecida uma corrente eléctrica

por recurso a 2 eléctrodos.• Suspensão de células é forçada a passar pelo orifício.• A passagem de cada partícula (célula, esporo, etc.) causa uma diminuição

momentânea da condutividade eléctrica entre os eléctrodos.• Os períodos de interrupção da corrente eléctrica são contados,

sendo essa contagem uma medida do número de partículas presentes nasuspensão.

• Fácil e rápido

• Não permite distinguir células viáveis de mortas

• Útil para microrganismos grandes, mas não para a maior parte das bactérias

FASES DO CRESCIMENTO MICROBIANO EM DESCONTÍNUO

Fase de latenciaNão ocorre aumento mensurável do número de células. Fase de adaptação ao novo meio (p.ex. síntese de novas enzimas) e a condições ambientais novas.Duração da fase de latência – pode ser longa (várias horas), quando estão presentes compostos tóxicos, substratos dificeis de metaboliz ar ou o inóculo é insuficiente (nº de células viáveis ou vitalidade das células insuficie ntes).

Fase exponencialCrescimento da população com taxa (velocidade) constante. Durante esta fase, em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismo dividem-se e a população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima. O valor desta taxa de crescimento depende do potencial genético do microrganismo, da composição do meio de cultura e das condições de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de água, etc.).

Fase estacionáriaO crescimento da população pára, devido a esgotamento de nutriente essencialou acumulação de metabolito tóxico. Parte das células podem permanecer viáveis durantealgumas horas à custa do consumo de materiais de reserva endógenos.Algumas espécies bacterianas exibem, nesta fase de crescimento, a produção de endósporos.

Fase de mortePerda irreversível da capacidade de divisão celular; ocorre o decréscimo progressivo no nº de células viáveis da população.

Cultura “batch” – sistema fechado (excepto troca de g ases)

QUIMIOSTATO – opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante(relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.

Meio de cultura fresco (esterilizado) é fornecido contínuamente (caudal F), o qual contém, entre outros nutrientes, o nutriente limitante (concentração S0). Simultâneamente, parte da cultura é removida, com o mesmo caudal F a que meio de cultura fresco entra. O efluente removido contém células do microrganismo (biomassa, X), assim como produto(s) sintetizado(s) pelas células. A concentração de nutriente limitante à saída (S) é, em condições operacionais adequadas, muito baixa ou aproximadamente nula.

NOTAS SOBRE CULTURA CONTÍNUA

No estado estacionário (no quimiostato):

� a taxa específica de crescimento do microrganismo ( µ) é controlada pela taxa de diluição a que o quimiostato opera (D) (i.e. é válida a equação µ = D) e, consequentemente, pela razão entre o caudal (F) e o volume de cultura no recipiente (V)

⇒ é possível obter populações microbianas em crescimento com taxas específicas de crescimento diferentes através da alteração da taxa de diluição aplicada no quimiostato

�� a densidade celular (biomassa, X) obtida no quimio stato é controlada pela concentração do nutriente limitante, sendo válida a equação

X = Y (S0-S) onde Y é o rendimento do crescimento para o substrato limitante e S representa aconcentração residual do nutriente limitante no quimiostato.

� Modelo para o crescimento no quimiostato – equação de Monodi.e., o valor da taxa de diluição, D, relaciona-se com a concentração de nutriente

limitante do crescimento com base na equação de Monod

µmax

S

Ks + SD = D = µ →

D. KS

µmax - D→ S =

Notas sobre as representações gráficas da concentração de biomassa (X), daconcentração de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicação da populaçãomicrobiana no estado estacionário, em função da taxa de diluição a que o quimiostato opera (D).

� A densidade celular (biomassa, X) é igual, para uma gama larga de taxas de diluição a que o quimiostato pode operar (consequentemente, a concentração residual de nutriente limitante, S, no quimiostato é mantida com um valor baixo, uma vez que este nutriente está a ser consumido pelas células da cultura em crescimento) ;

� Apesar da concentração de biomassa permanecer constante, a taxa específica de crescimento pode variar com a variação da taxa de diluição que é aplicada no quimiostato (porque µ = D); quanto maior a taxa de diluição, maior a taxa de crescimento da população (e, inversamente, menor é o tempo de duplicação ou geração).

� A gama de valores de taxa de diluição, D, a que o quimiostato pode operar é limitada. O valor limite é a taxa de diluição crítica (D c). Para valores muito altos da taxa de diluição (D ≥ Dc), o crescimentocelular não consegue compensar a diluição da cultura, e a população de células sai do quimiostato(“Wash-out” – “lavagem” do quimiostato) ; consequentemente, nessas condições, a concentração de nutriente limitante aumenta, porque não é consumido ; quando D ≥ Dc ⇒ S=S0)

� A taxa de diluição torna-se crítica e ocorre o “Wash-out” quando a taxa de diluição a que o quimiostato opera ultrapassa a taxa específica máxima de crescimento da população microbiana (µmáx)

� Cultura contínua permite estabelecer condições selectivas para o enriquecimento de amostras ambientais (populações mistas) em microrga nismos específicos

Por exemplo:� microganismos capazes de metabolizar eficientemente nutrientes tóxicos ou dificilmente metabolizáveis (comparativamente a outros microrganismos presentes numa amostra ambiental, p.ex. solo, água, esgoto, etc.)

P.ex. Útil para o isolamento de microrganismos capazes de biodegradar hidrocarbonetos do petróleo, benzeno, fenol, ácido benzóico, pesticidas ou outros compostos orgânicos, a partir de solo (popu lação mista).

(nestes casos, o quimiostato é inoculado com a amostra ambiental; o meio de cultura fresco contém o composto em causa como substrato limitante para crescimento e é fornecido contínuamente com taxa de diluição adequada; nestas condições, prolifera(m) preferencialmente o(s) microrganismo(s) que seja(m) capaz(es) de metabolizar eficientemente o composto em causa; outros microrganismos que não tenham essa capacidade (p.ex, com µ < D) eventualmente presentes na amostra ambiental, sofrerão “washout”, sendo expulsos do quimiostato)

Em cultura contínua , mediante a selecção de taxa(s) de diluição adequada(s), é possível seleccionar uma população de células dum microrganismo único, que seja muito competitivo e metabolize muito eficientemente um composto orgânico face a outros microrganismos menos competitivos eventualmente presentes numa população mista inicial.

Pelo contrário, em cultura descontínua/“batch”, todos os microrganismos, mais ou menos competitivosna utilização do composto orgânico, permanecem no meio de cultura ⇒ cultura “batch” é menos eficiente quando se pretende seleccionar microrganismos muito eficientes na utilização do composto em causa como substrato para crescimento.

1 �� Contaminação da cultura

Em cultura contínua, é necessário manter condições de esterilidade durante períodos longos.A adição contínua de meio fresco e o arejamento aumentam a probabilidade de ocorrer contaminaçãoda cultura. Contudo, condições especiais, tais como temperaturas elevadas, valores de pH extremose substratos pouco usuais podem reduzir a probabilidade de ocorrer contaminação da cultura.

2 �� Degenerescência da cultura

Durante a multiplicação celular dum certo microrganismo pode ocorrer uma mutação expontânea, e surgir um mutante viável na cultura.

Em cultura contínua, um microrganismo invasor (contaminante ou mutante viável) acumula no quimiostato se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante eficientemente face à estirpe microbiana original ⇒ contaminação da cultura original.

Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostat o.

Na cultura “bacth”, todo o contaminante (ou, mutante viável) capaz de utilizar o nutriente limitante acumula no meio de cultura, juntamente com o microrganismo que se pretende cultivar ⇒ contaminação da cultura original.

Consequências

Se ocorrer:

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