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Agentes Químicos e Físicos no

Controle Microbiano e Biossegurança

no Cultivo de Bactérias

Profa Dra Cristina Alvarez Martinez

Depto Genética – IB

Lab de Genética de Bactérias

E-mail: ceamarti@unicamp.br

Termos Importantes:

• Esterilização: eliminar todas as formas de vida microbianas → calor,

filtração e UV → físicos

• Desinfecção: destruição de microrganismos em ambientes e objetos

→ químicos ou físicos

• Antissepsia: destruição de microrganismos em tecidos vivos →

agentes químicos

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Termos Importantes:

Bactericida: mata as bactérias (fungicida, viricida)

Bacteriostático: inibem o crescimento

Taxa de Morte Microbiana

Constante para um determinado tratamento

Ex: 90% por minuto de tratamento

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Taxa de Morte Microbiana: Fatores Críticos

1) Número inicial de microrganismos: Nível de Contaminação!

2) Características do microrganismos: conhecer as possíveis fontes de contaminação

no ambiente de trabalho!

endosporos ?

vírus envelopado?

3) Tempo de Exposição, concentração do agente

4) Ambiente:

Temperatura

Presença de Matéria orgânica: IMPORTÂNCIA DE LIMPAR ANTES DA DESINFECÇÃO!!!!

Agentes Físicos no Controle Microbiano em Laboratório

1) Calor:

- Calor úmido: autoclave e fervura

- Calor seco: estufas, incineração, bico de Bunsen

2) Filtração:

- Para material sensível a temperatura

- Cabines de Segurança Biológica

3) Radiação

- UV: Cabines de Segurança Biológica

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Calor Úmido: fervura

1) Fervura: elimina a maioria dos microrganismos, mas não todos!!

Ex: vírus da hepatite precisa de mais de 30 min

E os endósporos? Sobrevivem por mais de 20 hs!!!

Calor Úmido: autoclave

- Vapor sob pressão: ESTERILIZAÇÃO

- Atinge temperaturas mais elevadas que o ponto de ebulição da

água: 121°C

- 10-15 minutos suficiente para esterilizar até formas mais resistentes

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Calor Úmido: autoclave

Calor Úmido: autoclave

Materiais sólidos e grandes volumes de líquido precisam de tempo

extra: mais difícil de atingir temperaturas

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Autoclave: Cuidados para eficiência

- Limpar antes os materiais

- Embalar adequadamente

- Tempo apenas após a temperatura atingir 121°C

- Distribuir o material permitindo que o vapor entre em contato com

todo o material.

Autoclave: controle de eficiência

Indicadores Químicos

Indicadores Biológicos:

discos de papel impregnados com esporos de Geobacillus stearothermophilus ATCC7953;

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Calor seco

- Incineração: eliminação de material biológico contaminado, lixo

hospitalar, carcaças de animais

- Ar quente – Forno - transmissão de calor menos eficiente em

ambiente seco:

Seco: 170°C por 2 h

Chama direta: alça de inoculação

Calor seco

Área estéril de ≈10 cm de raio

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Filtração

- Material sensível a altas temperaturas

- Uso de membranas filtrantes

- Tamanho do poro varia:

Bactéria: 0,22 µm ou 0,45 µm

Vírus, Micoplasmas e espiroquetas: 0,01 µm (vírus tem de 0,025-0,2 µm)

Radiação UV

- Radiação Não-Ionizante: UV → parada na replicação do DNA

Pouco penetrante!!!! contato direto

Usada para obter ambientes estéreis

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Cabines de Segurança Biológica

Proteção em procedimentos com potencial de produção de aerossóis:

- Agitar

- Verter

- Pingar

- Misturar

- Vortexar

- Abertura de recipientes com pressão interna maior que a externa

Partículas não visíveis a olho nu que podem carregar número alto de microrganismos

Cabines de Segurança Biológica (CSB) x Fluxo Laminar

• Usa filtro de esterilização: HEPA

• Retenção de 99.97% das partículas de 0.3μm de diâmetro e 99.99%

das partículas maiores.

Fluxo Laminar: Ar que entra é filtradoProteção ao produto

X

CSB: Ar que é expelido é filtradoProteção ao manipuladorProteção ao ambiente

CSB I, II, III

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Cabines de Segurança Biológica – CSB I

Apenas o ar que sai é filtrado

Não protege o produto

Cabines de Segurança Biológica – CSB II

Filtração ocorre na entrada e saída do ar

Protege o produto

4 tipos A1, A2, B1, B2

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Cabines de Segurança Biológica – CSB III

Agentes Grupo de Risco 4

Selagem das perfurações

Luvas acopladas

Ar expelido passa por 2 filtros HEPA

CSB II: NB-2 quando há risco de aerossol

NB-3

CSBIII: NB-4

Cabines de Segurança Biológica: Cuidados

- Evitar circulação de pessoas em torno da cabine.

- Ligar a cabine e a luz UV 10 a 15 minutos antes de seu uso.

- Desinfectar a superfície interior com gaze estéril embebida em álcool etílico ou isopropílico

a 70%.

- Lavar as mãos e antebraços com água e sabão.

- Passar álcool etílico ou isopropílico a 70% nas mãos e antebraços.

- Limpar todos os objetos antes de introduzi-los na cabine.

- Minimizar os movimentos dentro da cabine.

- Colocar os recipientes para descarte de material no fundo da área de trabalho

- NÃO USAR BICO DE BUNSEN

- Conduzir as manipulações no centro da área de trabalho.

- Limpar a cabine, ao término do uso, com gaze estéril embebida em álcool etílico ou

isopropílico à 70%.

- Deixar a cabine ligada 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.

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Agentes Químicos

Desinfecção e antissepsia

Diferentes suscetibilidades de acordo com o microrganismo

Cloro é o mais eficiente para uso geral

Efetividade: um bom agente químico

• Efetivo contra diferentes tipos de microrganismos, em baixas concentrações e na

presença de matéria orgânica

• Não tóxico e não corrosivo

• Uso abusivo: problemas ambientais e desenvolvimento de resistência

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Cloro

Água sanitária: hipoclorito de sódio (NaClO)

Não elimina esporos

Atividade muito reduzida pela presença de matéria orgânica: LIMPAR ANTES!!!

Recomendação de Uso como Desinfetante e para mergulhar material contaminado:

1g/L cloro ativo: pouco contaminadas

5g/L: muito contaminadas

Água sanitária: 50 g/L → diluir 1:50 ou 1:10

Usar em área ventilada! (gás tóxico)

Não misturar com ácido

Compostos fenólicos

Danos a membranas lipídicas

Ativos na presença de compostos orgânicos: pus, saliva, fezes

Ativos contra micobactérias

Cresol (Lysol):desinfetantes

Sabonetes antibacterianos, pasta de denteControle cirúrgico

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Iodo

Antisséptico

Eficaz contra muitos vírus e endosporos

Tintura de iodo: em solução com álcool, maior eficiência

Usado para feridas

AlcoóisEliminam bactérias , fungos e vírus

Não eficazes contra endosporos e alguns vírus

Não servem em feridas!!

Mais eficientes em mistura com água

Misturados a outros agentes: tinturas (maior eficiência)

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Sabões e detergentes:

remoção mecânica (degerminação) de microrganismos

Emulsificam gordura da pele

Agentes de Superfície: surfactantes

Antissepsia:

Lavagem de mãos e antebraços com água e sabão

Limpeza com álcool 70%

Antes e depois de iniciar o trabalho

Não são eliminados na autoclaveUso de proteases, incineração de carcaças

Pseudomonas e Burkholderia

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Fonte

• CIBIO – IB/UNICAMP (www.ib.unicamp.br/cibio/cartilha)

• Manual de Segurança Biológica em Laboratórios – OMS - 3ª edição

• Sistema de Informação em Biossegurança – FIOCRUZ

(http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/StartBIS.htm)