Nutrição e cultivo microbiano

Como estudar microrganismos no laboratório???

� Cultivo “in vitro”

� conhecer as exigências nutricionais e ambientais dos m.o.

NUTRIÇÃO MICROBIANA

� fornecimento de nutrientes para a síntese de macromoléculas essenciais e para a obtenção de energia

ANABOLISMO

CATABOLISMO

METABOLISMO

EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS : Grande diversidade

ÁGUA : sem ela não há vida

� essencial para os microrganismos: absorção nutrientes dissolvidos

� disponibilidade variável no ambiente

� Se ambiente possui < concentração de água: célula aumenta

concentração de solutos internos (bombeamento de íons para o interior

celular ou pela síntese de solutos orgânicos)

Os elementos químicos fundamentais

� C, N, H, O, S, P, K, Ca, Mg, Fe

1. CARBONO

� todos os organismos requerem alguma forma de carbono

� esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgânicos : lipídeos,

carboidratos e proteínas: fornecem energia para o crescimento e servem

como unidade básica para biossíntese

� heterotróficos utilizam compostos orgânicos como fonte de carbono

� autotróficos utilizam o CO2 como fonte de carbono

2. NITROGÊNIO

� todos os organismos necessitam em alguma forma

� parte essencial dos aminoácidos (proteínas) e ácidos nuclêicos

� bactérias são mais versáteis para N que eucariotos

� podem utilizar o N2 (fixação biológica), nitratos, nitritos e sais de amônia

� em geral compostos nitrogênio orgânico: aminoácidos e peptídeos

3. HIDROGÊNIO, OXIGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO

� essenciais a todos os organismos

�S é necessário na biossíntese de cisteína, cistina, metionina e de

vitaminas (tiamina e biotina)

� P é essencial para a síntese de ácidos nuclêicos e ATP

� sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos) podem ser utilizados para suprir

estes elementos

� também presentes em fontes protêicas (aa), DNA e RNA

� alguns destes elementos são encontrados na água ou na atmosfera

4. POTÁSSIO, MAGNÉSIO, CÁLCIO, FERRO (minerais essenciais)

� K, Mg cofatores enzimático

� Ca estabilização parede celular e formação de endosporos

� Fe faz parte dos citocromos, e proteínas transporte elétrons

C, H, O, N, S, P � macronutrientes (g/L)

Fe, Mg, Ca, K, Na � metais / minerais essenciais (mg/L)

5. MICRONUTRIENTES OU ELEMENTOS TRAÇO:

� Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr

� necessários em concentração muito baixa (µg/L)

� cofatores de enzimas

� geralmente não é preciso adicionar: presentes na água

� se água desmineralizada: adicionar solução elementos traço

6. FATORES DE CRESCIMENTO:

� compostos orgânicos: vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas

� muitas vitaminas (tiamina, biotina, cobalamina) atuam como coenzimas

� alguns m.o. não sintetizam os fatores que devem ser disponíveis no meio

Classificação nutricional dos microrganismos

Quanto a fonte de Carbono:

- autotrófico: CO2

- heterotrófico: carbono orgânico

Quanto a fonte de energia:

- fototróficos: luz

- quimiotróficos: oxidação compostos químicos

orgânicos: quimiorganotróficos

inorgânicos: quimiolitotróficos

Classificação Nutricional dos Organismos

Grupo NutricionalFonte de Carbono

Fonte de Energia Exemplos

QuimioautotróficosQuimiolitotrófico

CO2compostos inorgânicos

bactérias nitrificantes

do Fe, H e S

QuimioheterotróficosQuimioorganotróficos

compostos orgânicos

compostos orgânicos

bactérias, fungos, protozoários e

animais

FotoautotróficosCO2 luz

bactérias sulfurosas,cianobactérias, algas,

plantas

Fotoheterotróficoscompostos

orgânicosluz

bactérias púrpuras e verdes não enxofradas

MEIO DE CULTURA: preparação contendo os nutrientes necessários

para cultivar e manter microrganismos viáveis em laboratório.

Duas grandes classes de meios de cultura:

� Meio definido ou sintético: composição química exata é conhecida

� Meio complexo: composição química exata não é conhecida (composto por extratos naturais de carne, levedo, proteínas hidrolisadas)

Meio de Cultura Sintético

Glicose 10 g/l

NH4Cl 0,5 g/l

Na2HPO4 0,21 g/l

NaH2PO4 0,09 g/l

MgSO4.7H2O 0,2 g/l

KCl 0,04 g/l

CaCl2 0,015 g/l

FeSO4.7H2O 0,01 g/l

Água p/ 1 L

pH final 6.8

Meio complexo

Peptona 10 g/l

Extrato de levedura 5 g/l

NaCl 5 g/l

Completar com água p/ 1 L

pH final 7,0

L. mesenteroides: bactéria fastidiosa

� muito exigente em termos nutricionais

Substratos para meios complexos:

� Extrato de Carne: extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob

a forma de pasta, contém carboidratos, N orgânico, vitaminas

hidrossolúveis e sais.

� Peptona: produto da digestão da carne (enzimática ou ácida), fonte de

N orgânico e vitaminas.

� Triptona: hidrolisado pancreático de carne , rica em nitrogênio-amínico;

destinado ao isolamento de organismos de difícil crescimento.

� Extrato de Levedura: extrato aquoso de células de leveduras lisadas,

fonte excelente de substâncias estimulantes do crescimento como

vitamina complexo B; contém compostos orgânicos de N e C.

� Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em

carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.

� Tripticase: peptona derivada da caseína por digestão pancreática, fonte

rica em nitrogênio de aminoácidos.

� Meios complexos são altamente nutritivos

� geralmente mais fáceis de preparar

� são os mais usados ( composição exata não é necessária)

� mais adequados para fastidiosos

Quanto ao estado físico os meios podem ser:

a) líquidos: (caldos) nutrientes são dissolvidos em água e esterilizados

b) sólidos: são preparados a partir da adição, ao meio líquido de um agente

solidificante, antes da esterilização do meio.

�ágar-ágar: polissacarídeo obtido de algas marinhas . Usado como agente

solidificante dos meios. Funde a 100°C e gelifica q uando a temperatura é

menor de 45°C. Concentração 1,5 - 2% p/v. Não serve como nutriente!!!!

c) semi-sólidos: obtido através da adição de uma quantidade reduzida de

agente solidificante (0,3 a 0,5% de ágar)

Meios líquidos: multiplicação celular ; processos industriais em reatores

Meios sólidos: usados para imobilização de m.o. em placas ou tubos

� aparecimento de massas celulares: colônias

Colônia: originada da multiplicação de m.o. em meio sólido

� importante para a caracterização dos m.o.

� para colônia ser visível : ≅ 1 x 106 células

� são isolados em meios sólido visando obtenção de culturas puras

� Cultura pura: contém um único tipo de m.o. sem contaminantes

Numero de colônias obtidas a partir de uma amostra:

Contagem de microrganismos � controle de qualidade

� Contagem de microrganismos viáveis presentes

� Unidades formadoras de colônias: UFC por mL ou g

Colônias microbianas

Placas resultantes de isolamento microrganismos

� Obtenção culturas puras: isolamento de colônias

Técnica de esgotamento: diluição para obtenção de colônias isoladas

Meios com finalidades especiais

1. Meios Seletivos: permitem crescimento de um tipo particular de microrganismo suprimindo o desenvolvimento de outros

� ágar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentração de glicose (seletivo para fungos)

� ágar verde brilhante: seletivo para enterobactérias Gram - (Salmonella) ; o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactérias Gram + do TI

� Adição de antibióticos: seletivos para os m.o. resistentes à estes agentes antimicrobianos

Ágar SabouraudPeptona (fonte de C e N) .......... .....10 gGlicose (fonte C e energia) ............40 g Ágar (agente solidificante) ..............15 gÁgua ...........................................1000 mLpH 5,6

2. Meios diferenciais : permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o.

Produção de enzimas: adição substrato e verificação halo hidrólise

Hemólise em ágar sangue: Streptococcus e Staphylococcus hemolíticos

3. Meios Seletivos/Diferenciais : agem como seletivos e diferenciais

� muito úteis no diagnóstico de patogênicos (coliformes fecais)

Ex: ágar MacConkey - contém sais biliares e corante cristal violeta, que

inibem o crescimento de Gram + e permitem o desenvolvimento de Gram -

e ainda lactose e o indicador vermelho neutro, que distingue as Gram

negativas produtoras de ácido (vermelhas) das Gram negativas não

produtoras de ácido (amarelas) � identificação de coliformes

E. coli em MacConkey

4. Meios de Enriquecimento: usados para selecionar microrganismo presente

em pequenas quantidades em relação à população de um ambiente.

� favorece o crescimento da espécie desejada, mas não o crescimento das

outras espécies presentes em uma população mista

Ex: isolamento de bactérias que oxidam o fenol - podem ser isoladas de

amostras do solo, utilizando meio de enriquecimento, contendo sais de

amônia, e fenol como única fonte de carbono e energia

� somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estarão presente

em grande número depois de vários cultivos

5. Meios de Estocagem : utilizado para a manutenção da viabilidade e das

características fisiológicas de uma cultura

� meio diferente do ótimo para o crescimento - desenvolvimento rápido:

morte rápida

� a glicose favorece o crescimento, preferível omiti-la na preparação de um

meio de estocagem.

Conservação das Culturas Puras

� microrganismos isolados em cultura pura devem ser mantidos viáveis

� Para armazenar por um período curto, as culturas podem ser mantidas

em geladeira (4-10°C) em tubos de ensaio com meio d e estocagem

� Para armazenar por um período longo, as culturas são mantidas em

nitrogênio líquido (-196°C) ou em ultrafreezers (-7 0 a -120°C), ou ainda

liofilizadas (mais comum).

Métodos de conservação de microrganismos:

- transferência periódica para meios novos

- sob camada de óleo mineral

- liofilização

- ultracongelamento

Coleção de culturas:

� mantém banco de culturas puras de microrganismos

� fornecem microrganismos na forma liofilizada

� tempo viabilidade muito longo (pode chegar a 100 anos)

� ATCC (americana)

� Fiocruz (Brasil)

Liofilização de microrganismos

Fatores físicos que influenciam o crescimento:

1. TEMPERATURA

2. pH

3. PRESSÃO OSMÓTICA

4. ATMOSFERA GASOSA

EXIGÊNCIAS AMBIENTAIS PARA CULTIVO DE MICRORGANISMOS

1. TEMPERATURA :

� Um dos principais fatores que influenciam o desenvolvimento microbiano

� aumento de T: acelera as reações na célula e aumenta taxa crescimento

� a partir de certa T : desnaturação de proteínas e AN : morte celular

Temperaturas de crescimento: temperaturas cardeais

� Temperatura mínima: menor T que m.o. é capaz de crescer

� Temperatura ótima: aquela que m.o. apresenta melhor crescimento

� Temperatura máxima: maior T onde ainda é possível o crescimento

Relação entre a taxa de crescimento e a temperatura de cultivo

Classes de microrganismos de acordo com a temperatura

1) Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas (0 - 20ºC ótima 15°C)

2) Mesófilos: crescem em temperaturas moderadas (12-45°C ótima 37°C)

3) Termófilos: crescem em temperaturas elevadas (42 - 68°C ótima 62°C)

4) Hipertermófilos: crescem temp. muito elevadas (80-113°C ótima 105°C)

Psicrotróficos ou psicrotolerantes:

� temperatura ótima 20 a 30 °C

� mas são capazes de crescer em temperatura de refrigeração (4°C)

� Envolvidos na deterioração de alimentos refrigerados e congelados

� Tbé patógenos de alimentos: Listeria monocytogenes

Crescimento a baixas temperaturas: mares polares, geleiras

� Psicrófilos possuem membrana rica em AG insaturados: maior fluidez

� enzimas possuem maior quantidade de estruturas secundárias

2. pH:

� pH ótimo: valor mediano de variação de pH onde ocorre crescimento

� para o melhor crescimento do microrganismo num meio ácido ou básico,

ele deve ser capaz de manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, não

importando qual o valor do pH externo

� para manter o pH interno , a célula expulsa ou absorve íons hidrogênio

� variações de pH podem ser letais por isto adiciona-se tampão ao meio

Bactérias : geralmente pH ótimo próximo da neutralidade

- Bactérias acidófilas: alta tolerância à acidez (Thiobacillus pH ótimo 2- 3,5)

- Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).

Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).

3. PRESSÃO OSMÓTICA:

Os microrganismos retiram da água a maioria dos nutrientes solúveis (conteúdo celular 80 – 90 % de água)

Pressão Osmótica - força com a qual a água se move através da membrana citoplasmática a partir de uma solução de baixa concentração de soluto para uma contendo alta concentração de soluto.

As células podem estar em um meio:

a) Isotônico - onde a concentração de solutos em um meio é igual àquela no interior da célula. Não há movimento de água para dentro e para fora da célula

b) Hipertônico - concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula resultando na desidratação e contração da célula - plasmólise

c) Hipotônico - a concentração de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar (turgescência) e se romper (plasmoptise ou lise osmótica).

Em relação a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem ser

Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio.

Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio.

Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada

Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações.

� Os efeitos osmóticos são de maior importância em ambientes salinos

4. ATMOSFERA GASOSA

� O2 e CO2, são os gases principais que afetam o crescimento dos m.o.

- De acordo com resposta ao O2 os microrganismos são classificados em:

AERÓBIOS

- Estritos (obrigatórios): necessitam de O2

- Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor na sua presença

- Microaerófilo: necessitam de O2 em níveis menores que atmosfera

ANAERÓBIOS

- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas podem tolerar sua presença

- Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)

Classificação dos microrganismos de acordo com atmosfera gasosa

a) Aeróbio estrito

b) Anaeróbio estrito

c) Facultativos

d) Microaerofílicos

e) Aerotolerantes

Aeróbios estritos:

� requerem O2 para crescimento (padrão atmosfera 21% de O2)

� aeróbios podem crescer mais lentamente quando o O2 é limitado

� Se m.o. crescem em meio líquido podem rapidamente utilizam O2

dissolvido na camada superficial do meio

� então as culturas líquidas de m.o. aeróbios são agitadas (shaker) para

aumentar o suprimento de O2 dissolvido e favorecer o crescimento celular

Facultativos:

� crescem na presença de O2 ou podem crescer em anaerobiose

� quando em condições de anaerobiose, obtém energia pelo processo

metabólico chamado fermentação. Ex. Escherichia coli, Saccharomyces

cerevisiae

Anaeróbios

� aqueles que podem ser mortos pelo oxigênio

� não utilizam o O2 para reações de produção de energia

� alguns podem tolerar presença de oxigênio

� Clostridium perfringens - altamente tolerantes ao O2

� Clostridium tetani - moderadamente tolerantes ao O2

� Methanobacterium - anaeróbios estritos

Por que alguns microrganismos não toleram O2 ?????

ou

Por que alguns microrganismos toleram O2 ??????

Espécies reativas de oxigênio tóxicas as células

� células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para

manter sua integridade

� O2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiração

� Processos celulares geram formas reativas de O2

� Espécies reativas são oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares

Enzimas que destroem formas tóxicas de oxigênio

� Superóxido dismutase (SDO) e catalase são as enzimas mais importantes

� Presença de catalase é variável

� Aeróbios, facultativos, microaerofílicos e aerotolerantes possuem SDO

� Anaeróbios estritos não possuem esta enzima

� São muito sensíveis a presença de espécies reativas de O2

Teste de catalase

Como cultivar microrganismos anaeróbios ???

As condições de anaerobiose podem ser conseguidas:

a) uso de agentes redutores nos meios de cultura

Ex: tioglicolato de sódio, que reage com oxigênio, formando água

b) remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO2;

c) uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) que gera hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládio

d) uso de câmaras anaeróbicas

�O envelope contém borohidreto de sódio e bicarbonato de sódio e a

adição de água gera H2 e CO2

�Jarra é fechada e O2 presente é removido por reação com o H2

catalisada pelo paládio formando água

Câmara de anaerobiose