nutrição e cultivo de microrganismos

16/04/2009

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NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS

Verônica Ortiz Alvarenga

Introdução

• O termo crescimento refere-se aoaumento do número de microrganismospresentes na população.

• Este aumento é obtido através dedivisão binária, processo em que umacélula dá origem a duas outras pelaseparação do material celular em duasmetades equivalentes

Nutrição microbiana

• Fornecimento de nutrientes �

Síntese de macromoléculas

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Exigências Nutricionais

• ÁGUA– Essencial para os microrganismos:

absorção nutrientes dissolvidos

– Disponibilidade variável no ambiente

– Se ambiente possui < concentração deágua: célula aumenta

– Concentração de solutos internos(bombeamento de íons para o interior

– Celular ou pela síntese de solutosorgânicos)

Exigências Nutricionais• ENERGIA

Exigências NutricionaisTipo Fonte de Energia Fonte de Carbono

Fotolitotrófico (ou

fotoautotrófico)

Luz CO2

Fotoorganotrófico (ou

fotoheterotrófico)

Luz Composto orgânico

Quimiolitotrófico (ou

quimioautotrófico)

Oxidação de composto

químicos inorgânicos

CO2

Quimioorganotrófico

(ou

quimioheterotrófico)

Oxidação de composto

químico orgânicos

Composto orgânico

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• CARBONO– todos os organismos requerem alguma

forma de carbono– esqueleto das 3 maiores classes de

nutrientes orgânicos : lipídeos,carboidratose proteínas: fornecem energia para ocrescimento e servem como unidade básicapara biossíntese

– heterotróficos utilizam compostos orgânicoscomo fonte de carbono

– autotróficos utilizam o CO2 como fonte decarbono


• NITROGÊNIO– todos os organismos necessitam em

alguma forma– parte essencial dos aminoácidos

(proteínas) e ácidos nucléicos– bactérias são mais versáteis para N que

eucariotos– podem utilizar o N2 (fixação biológica),

nitratos, nitritos e sais de amônia– em geral compostos nitrogênio

orgânico: aminoácidos e peptídeos


• ENXOFRE, HIDROGÊNIO E FÓSFORO– essenciais a todos os organismos– S é necessário na biossíntese de cisteína,

cistina, metionina e de vitaminas (tiamina ebiotina)

– P é essencial para a síntese de ácidosnuclêicos e ATP

– sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos) podemser utilizados para suprir

– estes elementos também presentes emfontes protêicas (aa), DNA e RNA

– alguns destes elementos são encontradosna água ou na atmosfera

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• POTÁSSIO, MAGNÉSIO, CÁLCIO EFERRO– K, Mg cofatores enzimático

– Ca estabilização parede celular eformação de endosporos

– Fe faz parte dos citocromos, e proteínastransporte elétrons


• MICRONUTRIENTES OU ELEMENTOSTRAÇO:– Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr– necessários em concentração muito

baixa (µg/L)– cofatores de enzimas– geralmente não é preciso adicionar:

presentes na água– se água desmineralizada: adicionar

solução elementos traços


• FATORES DE CRESCIMENTO:

– compostos orgânicos: vitaminas,aminoácidos, purinas e pirimidinas

– muitas vitaminas (tiamina, biotina,cobalamina) atuam como coenzimas

– alguns m.o. não sintetizam os fatoresque devem ser disponíveis no meio

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Condições de cultivo

• Temperatura � importante, pois osmicrorganismos não possuem qualquermecanismo de controle interno deste fator,o que pode afetar as reações químicas dacélula.– Psicrófilos: ou microrganismos que crescem em

baixas temperaturas (7- 20ºC);

– Mesófilos: ou microrganismos que crescem em temperaturas moderadas (25 – 40ºC);


– Termófilos: ou microrganismos que crescem emaltas temperaturas;

• Baseado nesta temperatura tem-se osseguintes grupos:– Hipertermófilos: toleram ou crescem em

temperatura de 100 oC ou mais– Psicrotróficos: não possuem um ótimo de

temperatura. Crescem a 7 oC ou menos, algunscrescem abaixo de 0 oC e outros podem crescerem temperaturas entre 37 e 45 oC;

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• Exigências atmosféricas � osmicrorganismos podem ser divididos, ainda,de acordo com o seu requerimento emoxigênio e gás carbônico.– Aeróbios obrigatórios: são microrganismos que,

para crescerem e se multiplicarem, necessitamde uma atmosfera que contenha O2 em umaconcentração equivalente ao ar atmosférico (20-21%).

Ex: micobactérias, fungos filamentosos (bolores);

Condições de cultivo– Microaerófilas: o oxigênio requerido para

multiplicação é menor do que aquele encontrado noar atmosférico (cerca de 5% de O2)

Ex: Espécies de Campylobacter, causadora da diarréia;

– Anaeróbios estritos: crescem somente na ausênciatotal de oxigênio.

Ex.: Clostridium botulinum;

– Anaeróbios facultativos: crescem tanto na presençacomo na ausência de oxigênio.

Ex.: Enterobactérias, estreptococos e estafilococos;

– Anaeróbios aerotolerantes: não requer oxigênio ecresce melhor na sua ausência, mas podesobreviver em atmosferas que contenham o mesmo.

Ex.: Lactobacilos.

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Culturas de microrganismosmostrando na seqüência aeróbios,anaeróbios estritos, anaeróbiosfacultativos, microaerófilos eanaeróbios aerotolerantes.

Fonte: Brock et al. (1991).

Condições de cultivo• O2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor

de elétrons na respiração• Processos celulares geram formas reativas de O2

• Espécies reativas são oxidantes poderosos quedestroem constituintes celulares

• células devem ser capazes de se proteger contraestas espécies reativas para manter suaintegridade.

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• Superóxido dismutase (SDO) ecatalase são as enzimas maisimportantes– Presença de catalase é variável

– aeróbios, facultativos, microaerofílicos eaerotolerantes possuem SDO

– Anaeróbios estritos não possuem estasenzimas e portanto não conseguemsobreviver na presença de oxigênio



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Condições de cultivo• O envelope de Gaspak gera através

de adição de água H2 e CO2

• Jarra é fechada e O2 presente éremovido por reação com o H2catalisada pelo paládio formando água

• usada para anaeróbios aerotolerantes

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• Exigência em Gás carbônico– Algumas bactérias crescem melhor na

presença de concentrações aumentadasde CO2 , tais organismos são chamadosde capnofílicos.

Ex.: Campylobacter.


• pH– fator limitante do crescimento microbiano.– A maioria das bactérias cresce bem em

meios com pH ao redor de 7,0– Muitas espécies tolerarem variações de pH

entre 4,0 e 9,0– Ótimo de crescimento se localiza entre 6,5 e

7,5.– Poucas bactérias podem se desenvolver

abaixo de pH 4,5-5,0 � mas esses são oslimites preferidos pelos fungos e leveduras.


• pH

– Thiobacillus thiooxidans que transforma oenxofre em ácido sulfúrico, e cresce bem a pH1,0

– Vibrio comma, agente causador da cóleraasiática, que desenvolve a pH 10,0.

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• Pressão Osmótica– meios de cultura com pressões

osmóticas inferiores da célula,geralmente não afetam sua viabilidade �

que a rigidez da parede celular impede aentrada excessiva de água.

– Entretanto, meios de cultura compressões osmóticas mais elevadas �

causam a perda de água intracelular,podendo ter efeito bacteriostático oubactericida.


• Isotônico - onde a concentração de solutos emum meio é igual àquela no interior da célula.Não há movimento de água para dentro e parafora da célula

• Hipertônico - concentração de solutos fora dacélula é maior que no interior. A água flui parafora da célula resultando na desidratação econtração da célula

• Hipotônico - a concentração de soluto nointerior da célula é maior que fora dela. A águaflui para dentro da célula: pode inchar e seromper - plasmólise


• Outras Exigências• Halofílicos � crescem melhor em

concentrações aumentadas de sais.– Geralmente as bactérias crescem em

concentrações de 0,9 %.– Bactérias Halófilas facultativas (2 a 15% de

NaCl)– Bactérias Halófilas extremas (30% de sal)

• Xerofílicos � crescem melhor em ambientesmais secos, com menor teor de água.

• Osmofílicos � crescem melhor emambientes com altos teores de açúcares.

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• Meio de cultura �� preparação contendoos nutrientes necessários para cultivar emanter microrganismos viáveis emlaboratório.

• Duas grandes classes de meios decultura– Meio definido ou sintético: composição

química exata é conhecida– Meio complexo: composição química exata

não é conhecida (composto por extratosnaturais de carne, levedo, proteínashidrolisadas)


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• Substratos para meios complexos:– Extrato de Carne: extrato aquoso de

tecido muscular, concentrado sob aforma de pasta, contém carboidratos, Norgânico, vitaminas hidrossolúveis e sais.

– Peptona: produto da digestão da carne(enzimática ou ácida), fonte de Norgânico e vitaminas.

– Triptona: hidrolisado pancreático decarne , rica em nitrogênio-amínico;destinado ao isolamento de organismosde difícil crescimento.


• Substratos para meios complexos:– Extrato de Levedura: extrato aquoso de

células de leveduras lisadas, fonte excelente de substâncias estimulantes do crescimento como vitamina complexo B; contém compostos orgânicos de N e C.

– Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em carboidratos, contém material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.

– Tripticase: peptona derivada da caseína por digestão pancreática,fonte rica em nitrogênio de aminoácidos.

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• Meios complexos são altamente nutritivos– geralmente mais fáceis de preparar

– são os mais usados ( composição exata não é necessária)

– mais adequados para fastidiosos


• Quanto ao estado físico os meios podem ser:– líquidos: (caldos) nutrientes são dissolvidos em

água e esterilizados– sólidos: são preparados a partir da adição, ao

meio líquido de um agente solidificante, antes da esterilização do meio.

– ágar-ágar: polissacarídeo obtido de algas marinhas . Usado como agente solidificante dos meios. Funde a 100°C e gelifica qua ndo a temperatura é menor de 45°C. Concentração 1,5 - 2% p/v. Não serve como nutriente!!!!

– semi-sólidos: obtido através da adição de uma quantidade reduzida de agente solidificante (0,3 a 0,5% de ágar)


• Meios líquidos: multiplicação celular ;processos industriais em reatores

• Meios sólidos: usados para imobilizaçãode m.o. em placas ou tubos– aparecimento de massas celulares: colônias– Colônia: originada da multiplicação de m.o.

em meio sólido importante para acaracterização dos m.o. para colônia servisível : ≈1 x 106 células são isolados emmeios sólido visando obtenção de culturaspuras

– Cultura pura: contém um único tipo de m.o.sem contaminantes

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Meios de cultura com finalidadesespeciais

• Meios Seletivos � permitem crescimentode um tipo particular de microrganismosuprimindo o desenvolvimento de outros– ágar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentração de

glicose (seletivo para fungos)– ágar verde brilhante: seletivo para

enterobactérias Gram - (Salmonella); o coranteverde brilhante adicionado ao meio inibe asbactérias Gram (+)

– Adição de antibióticos: seletivos para os m.o.resistentes à estes agentes antimicrobianos

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• Meios diferenciais : permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o.

– Produção de enzimas: adição substrato e verificação halo hidrólise

– Hemólise em ágar sangue: Streptococcus e Staphylococcus hemolíticos


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• Meios Seletivos/Diferenciais � agem comoseletivos e diferenciais muito úteis nodiagnóstico de patogênicos (coliformes fecais)– Ex: ágar MacConkey - contém sais biliares e corante

cristal violeta, que inibem o crescimento deGram + e permitem o desenvolvimento deGram - e ainda lactose e o indicadorvermelho neutro, que distingue as Gramnegativas produtoras de ácido (vermelhas)das Gram negativas não produtoras deácido (amarelas) identificação de coliformes



• Meios de Enriquecimento � usados paraselecionar microrganismo presente empequenas quantidades em relação à populaçãode um ambiente.– favorece o crescimento da espécie desejada,

mas não o crescimento das outras espéciespresentes em uma população mista

– Ex: isolamento de bactérias que oxidam o fenol- podem ser isoladas de amostras do solo,utilizando meio de enriquecimento, contendosais de amônia, e fenol como única fonte decarbono e energia somente os microrganismoscapazes de oxidar o fenol estarão presente emgrande número depois de vários cultivos

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• Meios de Estocagem � utilizado para amanutenção da viabilidade e dascaracterísticas fisiológicas de uma cultura

– meio diferente do ótimo para o crescimento -desenvolvimento rápido: morte rápida

– a glicose favorece o crescimento, preferívelomiti-la na preparação de um meio deestocagem.

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