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ANA CAROLINA SILVA DE FARIA
Avaliação Microbiológica, Molecular e Patológica de
Lesões articulares e peri-articulares de suínos.
C u i a b á - MT
Abril - 2009
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ANA CAROLINA SILVA DE FARIA
Avaliação Microbiológica, Molecular e Patológica de Lesões
articulares e peri-articulares de suínos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de Concentração: Produção Animal. Orientadora: Profª. Drª. Valéria Dutra. Co-Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel.
C u i a b á - MT
Abril - 2009
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
Permitida a reprodução parcial ou total desde que citada a fonte
F224a Faria, Ana Carolina Silva de.
Avaliação microbiológica, molecular e patológica de lesões articulares e peri-articulares de suínos / Ana Carolina Silva de Faria, 2009. 90 f. : il. colors ; 30 cm. (inclui tabelas e fotos).
Orientadora: Valéria Dutra Co-orientador: Edson Moleta Colodel Dissertação (mestrado). Universidade Federal de Mato Grosso. Faculdade de Medicina Veterinária. Programa de pós-graduação em Ciência animal, 2009.
1. Suínos. 2. Locomotor. 3.Osteocondrose. 4. Artrite
infecciosa. I. Título. CDU 634.4 : 616.72
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Aluna: ANA CAROLINA SILVA DE FARIA
Título: Avaliação Microbiológica, Molecular e Patológica de lesões articulares e peri-
articulares de suínos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato
Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal
Aprovada em: 01/04/2009
Banca Examinadora:
Profª. Drª.: Valéria Dutra (Orientadora)
Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT Assinatura:_______________________________
Prof. Dr.: Mateus Matiuzzi da Costa (Membro)
Instituição: UNIVASF Assinatura:________________________________
Profa. Drª.: Caroline Argenta Pescador (Membro)
Instituição: CLIMEV/FAMEV/UFMT Assinatura:_______________________________
Profº. Dr.: João Garcia Caramori Júnior (Membro)
Instituição: DCBPA/FAMEV/UFMT Assinatura:________________________________
Dedico este trabalho aos meus pais, grandes amigos de todas as horas e exemplos de força e persistência; à minha irmã Ana Paula, amiga e madrinha; e ao querido João Pedro, alegria maior de nossas vidas.
Agradecimentos
A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, pelas mãos estendidas nos momentos de
angústia e de dificuldade.
Aos meus pais Benedito Nelson e Ivaldete pelo carinho, compreensão, pela dedicação,
pela paciência nos momentos difíceis, pelos conselhos, por toda força, estímulo e eterna
amizade.
À minha irmã por compartilhar os dias estressantes de uma mestranda, pelas dicas,
conselhos e pela presença sempre amiga e ao meu querido João Pedro, mesmo tão pequeno,
soube compreender minha ausência nas brincadeiras e na participação ativa de suas
descobertas.
Ao Alisson pela presença sempre amiga, pelos conselhos e puxões de orelha, por
compreender sempre minha teimosia e por me dedicar tanto carinho e companheirismo em
uma jornada tão difícil.
Aos dedinhos maravilhosos: Giselde, Flávia, Isis, Patricia e Priscila. Uma
desconhecida, outras colegas de faculdade, hoje grandes amigas, cada uma a sua maneira,
porém sempre unidas pelo coração.
Aos colegas, hoje amigos: Waltinho, Júnior, Bruno, Elder, Leo, Marcuxxx e Gutão,
todos integrantes do Inimigos do Ritmo. A todos os demais integrantes da Segunda Turma do
PPGCA: Rafaela, Laura, Karlla, Luís Carlos, Lorenzo, Ronaldo, Cassiano, Gilson, João
Paulo, Índia e Robson, em especial à Vivian, uma pessoa maravilhosa, que soube dividir
comigo as alegrias e as angústias do mestrado, além de me proporcionar amizade. É claro que
eu não poderia esquecer os grandes companheiros das outras turmas: Nelcino e Inácio
Ao laboratório de Microbiologia Veterinária e Biologia Molecular Veterinária por
todo aprendizado em especial a Daphine pela paciência e pelas dúvidas sempre sanadas, aos
técnicos Suen, Ramirie e “Seo” Zé pela ajuda durante todo o experimento e pelos momentos
de descontração.
À minha orientadora Valéria Dutra pelo exemplo de sabedoria, pela orientação, pela
grande paciência nas horas de tamanha teimosia, por todos os ensinamentos e principalmente,
pela grande oportunidade e dedicação.
Ao Professor Luciano Nakazato por seu exemplo de dedicação e inestimável
contribuição para a realização deste trabalho.
À Juçara, que com tamanha paciência me ajudou a aprender e compreender um pouco
da microbiologia.
Ao querido amigo João, pela brilhante parceria, pela grande amizade, companhia e
ajuda em todas as coletas, pela gargalhadas durante as viagens e pela paciência, pois eu sei
muito bem que me aturar todo esse tempo não foi nada fácil. E à Andréia Tirloni pela
simpatia e amizade.
Ao Laboratório de Patologia Veterinária pela recepção calorosa, pela ajuda, pelos
ensinamentos e momentos de descontração, em especial à Fabiana, ao técnico Manuel, às
estagiárias Mayara e Raquel, aos Professores Edson e Caroline, em especial à mestranda
Laura que compartilhou comigo os horários noturnos, os sábados, os domingos e os feriados
no laboratório, além de me proporcionar amizade.
Aos Médicos Veterinários e gerentes de granjas que permitiram a coleta de materiais e
também por ampliar nossos horizontes na Suinocultura.
À Joice por nos deixar acompanhá-la em suas coletas, facilitando assim a nossa
entrada nas granjas.
Ao Professor João Caramori, por toda ajuda desde coleta de materias até o custeio
financeiro em épocas em que muito precisei.
À FAPEMAT pelo auxílio concedido na forma de bolsa de estudos, que foi
imprescindível para custear certos gastos durante as coletas.
Ao amigo Marcos pela dedicação na realização de parte deste estudo. Por ter me
aturado nas horas de estresse e desespero, pelas dúvidas sanadas, pelas grandiosas horas de
aulas particulares de Patologia, por me ajudar na leitura das lâminas e principalmente, por
dedicar-me tanta atenção nessa difícil jornada.
Aos animais, parte desse estudo, que contribuíram para engrandecimento de nossos
conhecimentos.
"Não há virtude nem vitória mais bela do
que comandar e vencer a si próprio."
Bantôme
RESUMO
FARIA, A.C.S. Avaliação Microbiológica, Molecular e Patológica de lesões articulares e
peri-articulares de suínos. 2009. 90f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Faculdade
de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2009.
O experimento foi conduzido nos Laboratórios de Microbiologia Veterinária, Biologia
Molecular Veterinária e Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso
(UFMT) com o objetivo de realizar a avaliação microbiológica, molecular e patológica de
suínos que apresentaram a condição clínica de aumento de volume articular e/ou claudicação
em Sistemas Intensivos de Produção de suínos (SIPS) no Estado de Mato Grosso. Foram
coletadas amostras de líquido articular e peri-articular de 115 suínos e 43 membros
independente de sexo, linhagem, idade e fase de criação. Em cada SIPS foi realizado exame e
monitoria clínica do rebanho para a caracterização e quantificação da condição clínica. Ao
exame clínico 70% dos animais da fase de recria/terminação, apresentaram andar anormal e
claudicação; e na avaliação macroscópica da cartilagem articular observou-se principalmente
a osteocondrose (81,4%). Os resultados do isolamento bacteriano e da PCR demonstraram
que 48,7% dos animais apresentaram um ou mais agentes infecciosos; no isolamento, 45
(39,13%) amostras apresentaram crescimento bacteriano e à PCR, 23 (20%) amostras foram
positivas. Os microrganismos identificados com maior freqüência foram Mycoplasma
hyosynoviae, Streptococcus spp. e Arcanobacterium pyogenes. Candida sp. foi isolada em
três casos na maternidade e creche. O M. hyosinoviae e A. pyogenes foram os microrganismos
mais encontrados na creche e recria/terminação. Erysipelothrix rhusiopathiae foi detectada
com baixa freqüência (0,88%) apenas na fase de recria/terminação. Foi realizado
antibiograma em 41 amostras positivas ao isolamento bacteriano, sendo tetraciclina e a
eritromicina os antimicrobianos mais resistentes e a amoxilina associada ao ácido clavulânico
o mais sensível. Na avaliação microscópica, observou-se osteocondrose (72,09%). Todos os
animais apresentaram áreas de retenção de cartilagem na região metafisária, caracterizada por
não mineralização das colunas de condrócitos hipertróficos. O presente estudo confirma a
importância das enfermidades ligadas ao sistema locomotor, e que possuem como principal
etiologia fenômenos degenerativos associados ou não a problemas infecciosos, provavelmente
relacionados ao rápido ganho de peso, tipo das instalações e erro de manejo.
Palavras-chave: Suínos, Locomotor, osteocondrose, artrite infecciosa, PCR
ABSTRACT
FARIA, A.C.S. Microbiological, Molecular and Patologycal Evaluation of articles and
peri-article lesions in 2009. 90f. Dissertation (Master degree of Animal Science), Faculdade
de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2009.
The experiment was conducted in the laboratories of Veterinary Microbiology, Veterinary
Molecular Biology and Veterinary Pathology on the Universidade Federal de Mato Grosso
(UFMT) in order to carry out the assessment microbiological, molecular and pathological pig
who had the clinical conditionof increased of articular volume and/or lameness in an
intensive production system of pigs (SIPS) in Mato Grosso. Samples of fluids were collected
of the peri-articular and articular of 115 pigs and 43 members regardless of sex, strain, age
and stage of development. SIPS in each examination was performed and clinical monitoring
of the herd for the characterization and quantification of the clinical condition. The clinical
examination of animals 70% of the stage of growing/finishing, showed abnormal walking and
limping, and the macroscopic assessment of articular cartilage was observed mainly
osteocondrose (81.4%). The results of bacterial isolation and PCR showed that 48.7% of the
animals had one or more infectious agents; in isolation, 45 (39.13%) samples showed
bacterial growth and at the PCR, 23 (20%) samples were positive. The microrganisms most
frequently identified were Mycoplasma hyosynoviae, Streptococcus spp. and
Arcanobacterium pyogenes. Candida sp. was isolated in three cases in the maternity and
nursery. The M. hyosinoviae and A. pyogenes microorganisms were most found in nursery
and growing/finishing. Erysipelothrix rhusiopathiae was detected with low frequency
(0.88%) only at the growing/finishing. Antibiogram was realized in 41 positive samples for
bacterial isolation, and the antibiotics tetracycline and erythromycin were the most resistant
and amoxilina associated with clavulanic acid the most sensitive. On microscopic evaluation,
was observed osteocondrose (72.09%). All areas showed retention of cartilage in the
metaphyseal region, with no mineralization of the columns of hypertrophic chondrocytes.
This study confirms the importance of diseases related to the locomotor system, and which
have as main cause degenerative diseases associated or not with infectious problems, probably
related to rapid weight gain, type of construction and handling.
Key words: Pigs, Locomotive, osteocondrose, infectious arthritis, PCR
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Capítulo 1
Figura 1: Freqüência (%) de microrganismos identificados de suínos
portadores lesões articulares e peri-articulares nas fases de
Maternidade, Creche e recria/terminação no Estado de
Mato Grosso, no período de Junho/07 a Dezembro/08.
56
LISTA DE TABELAS
Páginas
Capítulo 1:
Tabela 1: Freqüência de microrganismos detectados através do isolamento
bacteriano e da PCR em suínos portadores lesões articulares e
peri-articulares no Estado de Mato Grosso, no período de
Junho/07 a Dezembro/08.
54
Tabela 2: Freqüência de diagnóstico associado ao sexo de suínos
portadores de lesões articulares e peri-articulares no Estado de
Mato Grosso, no período de Junho/07 a Dezembro/08.
55
Capítulo 2:
Tabela 1: Resistência a Antimicrobianos (%) das bactérias isoladas de
líquidos articulares e peri-articulares de suínos nas diversas
fases de desenvolvimento.
64
Capítulo 3:
Tabela 1: Avaliação macroscópica da cartilagem articular de acordo com
critérios de A – F correlacionando com seu grau de intensidade
(discreta a acentuada) em suínos no Estado de Mato Grosso.
69
Tabela 2: Avaliação microscópica da osteocondrose e da osteomielite
apresentando critérios de determinação de distribuição e
intensidade em suínos no Estado de Mato Grosso.
71
LISTA DE PRANCHAS
Páginas
Capítulo 3:
Prancha 1: Imagens macro e microscópicas de membros de suínos com
aumento de volume e/ou claudicação.
76
SUMÁRIO
Páginas
1. Introdução 16
2. Revisão Bibliográfica 18
2.1. Articulação 18
2.2. Doenças Articulares 19
2.2.1. Doenças Degenerativas 19
2.2.1.1. Osteocondrose 19
2.2.1.2. Osteocondrite Dissecante 24
2.2.2. Doenças Inflamatórias 25
2.2.2.1. Artrite 25
2.2.2.1.1. Artrite Infecciosa 27
2.2.2.1.1.1. Artrite causada pela Erysipelothrix rhusiopathiae 29
2.2.2.1.1.2. Artrite causada pelo Mycoplasma hyosinoviae 30
2.2.2.1.1.3. Artrite causada pelo Streptococcus spp. 31
2.2.2.1.1.4. Artrite causada pelo Haemophilus parasuis 32
2.2.2.1.2. Artrite não infecciosa 32
2.2.2.2. Osteomielite 33
2.3. Doenças Peri-articulares 34
2.3.1. Bursite 34
2.3.2. Miosite 35
Referências Bibliográficas 37
3. Capítulo I: Avaliação Microbiológica e Molecular de líquidos
articulares e peri-articulares de suínos.
45
Introdução 46
Material e Métodos 46
Resultados e discussão 47
Conclusão 50
Referências Bibliográficas 50
4. Capítulo II: Avaliação da resistência antimicrobiana de isolados de
amostras de líquido articular e peri-articular de suínos.
57
Nota 57
Referências 61
5. Capítulo III: Avaliação microbiológica, molecular e patológica de
suínos com aumento de volume articular e peri-articular e/ou
claudicação em Sistemas Intensivos Produção de Suínos no Estado de
Mato Grosso.
65
Introdução 66
Material e Métodos 67
Resultados 69
Discussão 71
Conclusão 73
Referências Bibliográficas 74
6. Conclusões gerais 77
ANEXOS
Páginas
1. Prevalência de Streptococcus suis tipo 2 através da técnica de
reação em cadeia da polimerase em suínos abatidos no Estado do
Mato Grosso.
78
2. Protocolo de extração de DNA - Método isoticianato de guanidina 89
16
Considerações Iniciais
1. Introdução
A suinocultura no Brasil na década de 50 era toda voltada para o mercado
interno, sendo a produção basicamente composta por animais tipo banha e carne. Nesta
época, havia uma grande dificuldade na comercialização dos produtos, pois não havia
controle sanitário tanto com os animais como com os produtos terminados. O modo de
criação era extensivo e como parte da alimentação era utilizado resíduo de lavouras e
restos de alimentação humana. Os suinocultores criavam raças comuns que
apresentavam baixo desempenho, não tinham certificação sanitária e abatiam animais
com idades superiores há um ano, e com alto teor de gordura, em torno de 50%
(Especial Porkworld, 2006).
No Brasil, do total da produção, 65% são dirigidas ao mercado interno, em
forma de produtos industrializados. A produção de carne suína cresceu quase 6% em
2006 atingindo a marca de 2,86 milhões de toneladas, 162 mil toneladas a mais que em
2005, estando assim, cada vez mais presente na mesa dos brasileiros, registrando um
crescimento de 63,75% em 15 anos (Porkworld, 2008a). Em 2007, o setor não teve o
desempenho esperado, houve uma maior oferta de animais, associado ao fato de que as
indústrias ainda dispunham de grandes estoques. A situação piorou com o aumento dos
valores dos grãos, que acabaram por prejudicar toda a cadeia produtiva pela elevação
dos custos de produção, que não podem ser repassados para os consumidores
(ABIPECS, 2008)
A produção industrial de suínos e o peso médio de abate, entre 2004 e 2007,
cresceram 5%. Os abates de suínos sob Inspeção Federal - SIF, em 2007, tiveram um
aumento de 3,7% em relação a 2006. Do total da produção industrial, 76,4% foi abatido
sob Inspeção Federal e 23,6% sob as outras formas de certificação. A estimativa de
matrizes alojadas no Brasil para 2007 foi de, aproximadamente, 100 mil a mais que em
2006, incluindo Granjas de Qualidade, Granjas de Reprodutores Suídeos Certificadas
(GRSCs) e criatórios, porém os números não aumentaram muito em virtude da elevação
do número de suínos terminados abatidos por fêmea/ano que foi de 12,5% nos últimos 3
anos. O aumento da produção em 2007 foi devido à melhora da produtividade e não
apenas pelo aumento do número de matrizes alojadas. Foram construídas novas granjas,
para substituir as de menor produtividade e realizadas reposições com animais de maior
17
potencial genético. Com esses dados conclui-se que o plantel praticamente não cresceu
em 2007 (ABIPECS, 2008).
Do ponto de vista do mercado interno, 2008 foi um ano excelente. Houve
aumento do consumo per capita, pouco acima de 13 kg. Estimou-se que a produção de
carne suína terminaria o ano com 3,03 milhões de toneladas, em relação a 2,98 milhões
de toneladas em 2007. Em 2009, estima-se uma produção de 3,1 milhões de toneladas, o
que deverá significar uma ampliação de 2,3% em relação a 2008 (ACRISMAT, 2008).
Porém em discordância com o mercado, o Ministério da Agricultura calcula que as
exportações do agronegócio vão recuar de 5% a 10% em 2009, podendo chegar a até
20% para o caso das carnes, sendo que as mais afetadas devem ser as de bovinos e de
suínos (Porkworld, 2008b).
O Brasil tem um grande potencial no mercado externo. É o quarto maior
exportador mundial da carne suína, o que contribui para a formação 40% das
exportações e 37% dos empregos gerados no país. Esta eficiência na produção de
commodites se dá pelas condições climáticas favoráveis, extensão territorial, condição
sanitária livre de doenças graves devido aos rígidos programas sanitários, mão-de-obra e
matérias primas abundantes e grande mercado interno gerando escala de produção e
propiciando a competitividade (Mendes, 2005).
O Estado do Mato Grosso possui um grande potencial para expansão do rebanho
suíno, em virtude das seguintes características: possui 27% da soja brasileira, 5% do
milho, baixa densidade de suínos por Km2, boa oferta de energia, excelente nível
sanitário, infra-estrutura de transporte e logística em consolidação, política ambiental
exigente e bem fundamentada, conduzindo à sustentabilidade das operações. Isso
justifica o crescimento total do rebanho desde 1997 que era de 656.454 cabeças para
1.069.301 em 2005, tendo um aumento de 38,6% (ACRISMAT, 2008).
Para garantir a alta produtividade, foram realizadas seleções genéticas para
aumento da velocidade do ganho de peso, aumento da concentração de animais
por m² de instalações e do tamanho das granjas, instalações mecanizadas com novos
sistemas de ambiência e de arraçoamento, novos fluxos de produção, modificações no
manejo e na nutrição sem considerar as necessidades esqueléticas e locomotoras destes
animais (Barcellos et al., 2008).
Toda essa evolução para obtenção de melhorias na produtividade trouxe
consigo problemas para o aparelho locomotor dos animais, afetando-o em toda a sua
extensão. Essas lesões levaram ao aparecimento de locais dolorosos com conseqüente
18
claudicação, afetando, principalmente, os cascos, músculos, articulações e ossos
(Lopez et al., 1997), tendo como principais doenças a osteocondrose, osteocondrite
dissecante, artrite, osteoartrite e sinovites, denominadas como doenças articulares, as
bursites e miosites como doenças peri-articulares e as lesões de cascos.
2. Revisão Bibliográfica
2.1. - Articulação
A articulação é o ponto de união de um ou mais ossos. Apresentam componentes
que servem de estabilizadores e diminuem o risco de lesões que possam resultar do uso
constante (Manual Merck On line, 2009).
Existem três tipos de articulações adjacentes aos ossos e/ou estruturas
cartilaginosas ao longo de todo o esqueleto. São classificadas baseadas na morfologia e
na composição dos tecidos, como fibroso (articulações de pequenos movimentos entre
ossos), cartilaginoso (apresenta em sua composição tecido fibroso, cartilaginoso ou a
união dos dois tecidos, com realização de pequenos movimentos) ou sinovial
(articulações predominantes, apresentando grandes movimentos entre os ossos
adjascentes) (Thompson, 2007).
As articulações sinoviais são móveis, ou seja, são consideradas verdadeiras,
sendo as mais importantes no ponto de vista de movimento. São revestidas por uma
cápsula fibrosa, conhecida como cápsula articular. Esta é responsável por envolver as
epífises dos ossos da articulação, é vascularizada, inervada e apresenta duas camadas: a
membrana fibrosa (externa), responsável pela resistência da cápsula e a membrana
sinovial (interna) que tem a função de filtrar o sangue e produzir o líquido sinovial a
partir do plasma sanguíneo. É composta por cartilagem hialina, que é desprovida de
inervação e vascularização, por isso, depende do líquido sinovial para o transporte de
nutrientes e retirada de catabólitos e possui a função de diminuir o atrito entre os ossos,
pois esta reveste a superfície de contato de um osso com o outro. O líquido sinovial é
encontrado na Cavidade Articular, a qual é delimitada pela cápsula
(Artrologia Animal, 2009).
A cartilagem articular contém células metabólicas ativas como uma baixa
resposta às lesões e uma mínima capacidade de reparação (Weisbrode, 2007), sendo
19
considerada a peça chave da articulação sinovial e necessária para suportar as forças
compressivas associadas com peso tendo em adição o cisalhamento de forças que
ocorrem durante o movimento (Thompson, 2007).
2.2. Doenças Articulares
2.2.1. Doenças Degenerativas
2.2.1.1. Osteocondrose
A Osteocondrose (OC) é uma lesão degenerativa dos ossos e das cartilagens e da
região articular, responsável pela alteração da estrutura dos tecidos afetando a
resistência dos membros locomotores (Kliminiè e Klimas, 2006). Consiste em um grupo
heterogêneo de lesões da cartilagem de crescimento em animais jovens
(Weisbrode, 2007).
É considerada como a principal doença que acomete o esqueleto dos suínos,
sendo caracterizada pela deformação óssea e retenção da cartilagem articular
(Kliminiè e Klimas, 2006). Foi descrita por Barcellos et al. (2007) como uma condição
não inflamatória, progressiva e crônica que, acomete animais de crescimento rápido e os
destinados a reprodução.
Além dos suínos, acomete outros animais domésticos como cães, cavalos,
bovinos, ovinos e ratos com diferentes manifestações clínicas, sendo, portanto,
considerada uma doença muito importante na ortopedia (Weisbrode, 2007). A doença é
semelhante à observada em humanos e na condrodisplasia de galinhas e perus
(Thompson, 2007).
A OC é observada como uma das maiores etiologias de problemas locomotores
de suínos (Nakano et al., 1987) e representa uma grande preocupação na suinocultura
moderna (Ytrehus et al., 2004c), podendo causar desde uma simples claudicação até a
total incapacidade de se locomover (Alberton et al., 2000).
A etiopatogenia da OC é caracterizada por anormalidades no processo
de ossificação endocondral da placa epifisária (placa de crescimento) e organização e
estruturação do Complexo Cartilagem Articular-Epifisárias (CAE) (Weisbrode, 2007;
Thompson, 2007).
20
A CAE de animais imaturos necessita da presença vasos sanguíneos viáveis
dentro dos canais cartilaginosos, pelo menos nos primeiros meses de vida. Esses vasos
surgem no pericôndrio e desaparecem gradualmente no interior dos canais
cartilaginosos que estão cheios de cartilagem hialina (Thompson, 2007). Com o passar
do tempo ocorre atrofia desses canais cartilaginosos, morte de células dos vasos e a
nutrição passam a ser realizada pelos vasos sanguíneos encontrados abaixo da
cartilagem epifisária localizada no osso subcondral, processo denominado de
ossificação (Ytrehus et al., 2004b).
A ossificação endocrondral é o processo de formação do osso, responsável pelo
crescimento da maioria dos ossos do esqueleto, iniciado durante a vida uterina e
persistindo até a maturidade (Althaus, 2004; Alberton, 2007a). Durante esse processo, o
período de crescimento é marcado pela presença de uma camada de cartilagem
especializada em crescimento localizada entre a camada profunda da cartilagem
articular e óssea, tendo a finalidade de adicionar volume e comprimento ao osso
(Ytrehus, 2004). Dessa forma, por volta dos cinco meses de idade, justamente quando
cessa o crescimento do animal, a CAE são substituídos por osso restando apenas uma
pequena porção de cartilagem nas extremidades dos ossos longos chamada de
cartilagem articular (Barcellos et al., 2007), que recebe os seus nutrientes por difusão a
partir do líquido sinovial (Thompson, 2007).
Nestas regiões, o tecido cartilaginoso hipertrofia, podendo ficar retido em
determinados pontos causando espessamento, dificultando a nutrição das camadas
periféricas resultando em morte celular (Alberton et al., 2000; Alberton, 2008). Este
processo leva ao aparecimento de áreas de fragilidade nas áreas de cartilagem do osso,
predispondo-os a doenças articulares e fraturas (Alberton, 2007a). A etiologia da OC é
multifatorial, no entanto, os principais fatores envolvidos no desencadeamento
da doença estão: nutrição, traumas, genética, velocidade de crescimento e sexo
avaliados separadamente por Althaus (2004), influência do exercício (Hill, 1990);
agentes infecciosos (Turner et al., 1991; Johnston et al., 1987) e qualidade e quantidade
de carne, taxa de crescimento e conversão alimentar (Kardamideen et al., 2004).
Segundo Alberton (2007b), há uma forte influência genética para o
desenvolvimento da doença, pois a OC apresenta um percentual elevado em animais
melhorados geneticamente para um elevado ganho de peso diário e com maior
deposição de músculo na carcaça, predispondo-o ao desenvolvimento da doença.
Crenshaw (2006), afirmou que suínos de todas as raças que foram inseridos em
21
programas de cruzamentos industriais têm sido afetados pela OC. Isso pode ser
explicado, pois o desenvolvimento ósseo do suíno está mais relacionado com idade do
animal do que com peso, com isso, quando o reprodutor suíno chega à maturidade
sexual (5 a 6 meses de idade) o seu esqueleto ainda está imaturo
(Barcellos et al., 2008).
Para Sobestiansky et al. (1999), a OC também está relacionada a problemas
genéticos, pois o suíno foi selecionado para o desenvolvimento precoce e excessivo de
peso, desta forma ocorre uma sobrecarga na articulações levando ao aparecimento de
lesões e, por isso, é considerada um problema na perda da produtividade em criações
de suínos (Nakano et al., 1987). Somente animais selecionados para rápido ganho de
peso desenvolvem lesões significantes, por isso, pequenas evidencias são avaliadas para
indicar que as lesões de OC resultam de deficiências nutricionais específicas
(Weisbrode, 2007). Em relação à nutrição, muitos trabalhos já foram realizados, tendo
resultados contraditórios, de modo que não existe nenhuma comprovação de que a falta
ou excesso de algum nutriente possam desencadear a doença (Alberton, 2007b).
Quanto aos fatores infecciosos, Barcellos et al. (2008) afirmam que não existem
evidências que o desenvolvimento primário da OC esteja relacionado com presença de
microrganismos patogênicos, porém, algumas enfermidades infecciosas podem levar ao
enfraquecimento do animal, pela liberação de citocinas que podem agravar um quadro
de OC pré-existente (Crenshaw, 2006).
A apresentação clínica da OC ocorre aos 4 a 7 meses de idade, embora lesões
possam ser encontradas em animais mais jovens (Alberton, 2007b) a partir de 12 dias de
idade (Alberton, 2007a), variando de acordo com a localização das lesões, lembrando-se
que qualquer articulação pode ser afetada. Em 80% dos casos, a OC é bilateral
(Alberton et al., 2003b) podendo apresentar-se de forma simétrica (Thompson, 2007).
Esses sinais consistem em claudicações crônicas e progressivas, os animais deslocam-se
com os membros estendidos, deixando visível a dificuldade em realizar movimentos
articulares (Alberton, 2007a). Com isso acabam evitando a realização de certos
movimentos, preferindo permanecer em repouso (Barcellos et al., 2007), porém quando
os realizam são de forma lenta. A dor é causada por um aumento da produção de líquido
sinovial e pelo inchaço da cápsula articular
(Reiland, 1975; Aherne e Brennan, 19851 citado por Dewey, 2006). Com freqüência
1 AHERNE, F. X.; BRENNAN, J. J. Nutrition and leg weakness. Proc. Guelph Pork Symposium, 1985, p.157-163.
22
ocorre a OC subclínica e o diagnóstico pode ser realizado através da inspeção das
articulações, durante o abate (Alberton, 2007a).
Em relação ao mecanismo patogenético da OC, após vários estudos, obteve-se
um grande progresso na detecção das alterações celulares e teciduais que ocorrem, mas
sua etiologia ainda permanece desconhecida, sendo, portando, considerada como uma
doença idiopática (Crenshaw, 2006). Ytrehus (2004) comprovou a importância de
algumas hipóteses envolvidas na etiologia da OC tais como: isquemia e necrose da
cartilagem epifiseal; regressões prematuras dos canais da cartilagem; rápido e elevado
ganho de peso; e a hereditariedade, sendo está ultima considerada como o maior fator
etiológico para o desenvolvimento da doença e a conformação anatômica das
articulações.
As lesões são comuns e aparecem com freqüência nas articulações úmero-radial,
coxo-femural, fêmuro-tíbio-patelar (Alberton, 2007a), e apresentam diferentes
manifestações clínicas em suínos, cães, cavalos, bovinos, galinhas e ratos
(Thompson, 2007) e devido a perturbações no crescimento normal, podem ocorrer más
formações ósseas com irregularidade na superfície articular que resultam em
claudicação e problemas locomotores (Wardale e Duance, 1994). Essas lesões iniciam-
se na junção condro-óssea (Alberton, 2007b) e são caracterizadas, macroscopicamente,
pela presença de uma ou mais áreas focais de aumento acentuado da espessura da
cartilagem articular, contendo ainda presença de dobras, abas ou úlceras na cartilagem
(Johnston et al., 1987). A sinovite, é secundária e aparece devido a lesões na cartilagem
e instabilidade articular (Johnston et al., 1987; Barcellos et. al., 2008). Em casos mais
severos, a lesão pode se desenvolver para uma osteoartrite levando a calcificação da
membrana sinovial com invasão de osteófitos no tecido adjacente a articulação, sendo
este quadro considerado irreversível (Crenshaw, 2006).
A sinovite pode ser induzida por substâncias liberadas da cartilagem articular
danificada, levando a exposição de colágeno e enzimas dentro da articulação.
Lipowitz et al., (1985), relatam que o colágeno tipo 2, estimula a produção de
anticorpos e, logo após a ocorrência do dano na cartilagem, o colágeno é liberado sendo
reconhecido como estranho pelo sistema imune. A partir desse momento, os fagócitos
liberam substâncias nocivas (enzimas) levando a destruição da cartilagem e como
conseqüência, ocorre um aumento na liberação dessas enzimas, determinando a
perpetuação do processo inflamatório. Quando as lesões atingem o Disco Metafisário de
crescimento (DMC), ficam mais visíveis nos casos de fratura, levando ao aparecimento
23
da epifisiólise e apofisiólise ou, segundo Alberton (2007a), a OC pode curar
completamente dependendo do sítio de ocorrência.
As lesões microscópicas são mais freqüentes do que os sinais clínicos ou os
achados de necropsias (Thompson, 2007). Essas lesões são desencadeadas pelo
surgimento de uma área de necrose isquêmica focal da cartilagem epifiseal de
crescimento, resultante da destruição do vaso proximal levando a anastomose nos canais
da cartilagem. Tais danos são causados, provavelmente, por microtraumas nas
trabéculas subcondrais, causando oclusão ou uma ruptura de um ou vários vasos
(Ytrehus, 2004). Essa área de necrose, provavelmente seria secundária a uma trombose
fisiológica dos vasos da cartilagem e poderia contribuir para o aparecimento de lesões
de OC no CAE (Thompson, 2007). Inicialmente, são encontrados focos de condrócitos
hipertróficos, onde este se apresenta com maturação retardada, com falha na penetração
vascular subcondral e na calcificação provisória da matriz, o que resulta em cones
cartilaginosos no osso subcondral (Alberton, 2007a).
Matos et al. (2008), observaram alterações histopatológicas na placa de
crescimento, tais como fraturas de trabéculas metafisárias, linhas de
deslocamento abrupto na placa de crescimento, estrias eosinofílicas, fissuras no interior
da cartilagem, desorientação de células cartilaginosas e desorganização do padrão de
crescimento cartilaginoso, em suínos tratados com diferentes dietas. Essas lesões foram
compatíveis com lesões iniciais de OC, porém elas não constituem efeito direto dos
tratamentos, já que as lesões foram encontradas em todos os animais e estão presentes
por se tratarem de animais precoces e oriundos de melhoramento genético.
As alterações presentes na placa de crescimento ocorrem quando há um
deslocamento da mesma pelas estrias eosinofílicas, onde estas acabam concorrendo para
o fechamento da placa em cada unidade óssea da epífise e da metáfise (Dewey, 2006).
Essas estrias eosinofílicas poderiam ser seqüelas da necrose fisiológica dos condrócitos
que podem ocorrer quando os vasos sanguíneos que se estendem em toda a placa de
crescimento após sofrer uma trombose fisiológica. Podem ser encontradas em
cartilagens normais e aparecer de forma exagerada em lesões de OC (Weisbrode, 2007).
Estrias eosinofílicas irregulares associadas com área de desorganização da arquitetura
da placa de crescimento, às vezes podem ocorrer na OC (Thompson, 2007).
Geralmente, o osso trabecular é grosseiro e modelado, porém quando ocorre
falha na ossificação endocondral, há uma descontinuidade entre a cartilagem retida e o
osso. Este espaço passa a ser ocupado por fibrose e as grandes áreas de
24
displasia tornaram-se necrótica. Ocorre também o preenchimento do espaço cístico por
líquido seroso e uma camada de tecido fibroso passa a cobrir a metáfise
(Weisbrode, 2007).
2.2.1.2. Osteocondrite Dissecante
O termo osteocondrite refere-se ao processo inflamatório que se desenvolve na
articulação e o termo dissecante relaciona-se com as fraturas e/ou fissuras que se
desenvolvem na cartilagem articular, que proporciona a formação do fragmento
separado da cartilagem (Sturion et al., 2009). A Osteocondrite dissecante (OCD) é uma
displasia na cartilagem articular-epifisária (CAE) que ocorre a partir de fissuras nas
cartilagens que ficam retidas com subseqüente fratura situadas na cartilagem articular,
levando ao aparecimento de uma aba cartilaginosa (Weisbrode, 2007). É caracterizada
por desligamento de segmentos da cartilagem epifiseal e/ou cartilagem articular, que
resulta em exposição do osso subcondral mineralizado. Em alguns casos, a cartilagem
pode colar-se novamente levando a formação da superfície articular irregular
(Crenshaw, 2006). Pode ocorrer o completo desligamento da cartilagem
articular, deixando uma profunda úlcera com exposição do osso subcondral e
fragmentos da cartilagem no interior da articulação (Thompson, 2007). As lesões
ocorrem em diversas articulações sinoviais, incluindo as da coluna vertebral
(Weisbrode, 2007).
As lesões dissecantes não envolvem os ossos, porém, algumas vezes abas ou
cartilagens contendo tecidos ósseos, podem estar presentes. Isso se desenvolve,
provavelmente, durante a ossificação endocondral após invasão de veias e células da
área de fixação, levando a formação de fibrocartilagem, deixando a superfície articular
defeituosa (Thompson, 2007). Ocorrem com freqüência nas superfícies dos côndilos
medial do úmero e fêmur em suínos em idade de terminação, por volta dos 5-7 meses de
idade. Em certos casos, pode haver presença do fragmento da cartilagem no espaço
interarticular (Thompson, 2007), podendo causar dor, derrame articular e sinovites
lifocitoplasmáticas inespecífica e secundária o que pode ocasionar interferência nos
movimentos das articulações, diretamente relacionada à OC, tendo como etiopatogenia
as mesmas causas (Weisbrode, 2007).
25
2.2.2. Doenças Inflamatórias
2.2.2.1. Artrite
O nome “artrite” é de origem grega, significa “articulações inflamadas” estando
relacionada a várias doenças reumáticas e muitas dessas, afetam não só as articulações,
mas também os músculos, ossos, tendões e ligamentos que as apóiam (TemCura, 2008).
É causa de dor e, freqüentemente, leva as condições crônicas de dores debilitantes que
são características de uma variedade de doenças articulares (Vermeirsch et al., 2007).
A artrite corresponde a uma inflamação das estruturas intra-articulares, podendo
ou não haver comprometimento de componentes externos às articulações onde pode
evidenciar a presença de dor, edema e calor (Barcellos et al., 2008). Implica em lesões
presentes na articulação em adição a uma inflamação da membrana sinovial
(Thompson, 2007). Essas doenças são consideradas complexas, pois além de acometer
estruturas adjacentes (músculos, ossos, tendões e ligamentos) e órgão internos, estão
sendo estudadas em conjunto a vários distúrbios, conhecidos como distúrbios músculos-
esqueléticos ou doenças do tecido conectivo (ABBOTT Brasil, 2008). São
caracterizadas por presença de células inflamatórias na membrana sinovial, mas a
natureza do processo inflamatório reflete melhor no aumento de volume e na
característica do exsudato presente no líquido sinovial (Weisbrode, 2007).
Nos últimos anos, a suinocultura adotou o sistema de confinamento total, em
todas as fases de criação com elevada densidade populacional e, segundo
Carregaro (2006) o constante contato com os excrementos, dissemina agentes
patogênicos importantes para a cadeia produtiva. Isso leva ao aumento da contaminação
culminando no aparecimento de várias doenças. A artrite aparece com freqüência em
suínos enviados ao comércio e, por isso, causa preocupações econômicas aos
produtores, decorrente das perdas por condenação parcial ou total da carcaça em
abatedouros (Hariharan et al., 1992) e, segundo Pereira et al. (1999), os índices de
condenações de carcaças de suínos por artrite têm aumentado significativamente no
Brasil, posicionando essa afecção como uma das principais causas de condenação de
carcaças nos abatedouros (Vieira-Pinto et al., 2001; Alberton et. al, 2003a;
Althaus et. al, 2005; Alberton 2007c).
Segundo Turner et al. (1991) e Alberton (2007c), na linha de inspeção,
geralmente as carcaças são consideradas portadoras de artrite quando apresentarem
26
aumento no volume e alteração da cor do líquido sinovial e hipertrofia da membrana
sinovial. No entanto, muitas carcaças de suínos que são condenadas ou destinadas ao
aproveitamento condicional, por apresentarem artrites, poderiam ser aproveitadas sem
restrição para o consumo humano (Alberton et al., 2003a; Althaus et al., 2005;
Alberton, 2007b).
Estudos realizados em vários países demonstraram que não existe acurácia na
linha de inspeção, pois muitas vezes as carcaças são condenadas como portadoras de
artrite, sem apresentar alterações nas articulações (Alberton et al., 2000). Isso acaba
gerando um grande desperdício, o que eleva os custos de produção para o frigorífico e,
conseqüentemente, reduz a remuneração dos produtores (Alberton et al., 2003a;
Althaus et al., 2005; Alberton, 2007b).
As artrites podem ocorrer em suínos de qualquer faixa etária, levando a grandes
problemas econômicos devido a mortes, atraso no crescimento, impotência coeundi,
gastos com medicamentos e mão de obra, refugagem e condenações de carcaças no
abate (Alberton et al., 2003b).
Problemas locomotores são a segunda maior causa de descarte de reprodutores
variando de 12 a 30% (Sobestiansky et al., 1999). Entre esses descartes, as alterações no
casco são responsáveis pelas maiores porcentagens (Mendes, et al., 2004). Segundo
estes autores, normalmente essas alterações cursam com o desgaste da sola e lesões de
bordos laterais, que acabam atingindo o tecido mole provocando a claudicação. A falta
de tratamento nestes casos é um fator agravante, pois a lesão dos mesmos serve como
porta de entrada para penetração bacteriana, onde estas podem ascender e atingir a
articulação. Os fatores de manejo, como pisos inadequados, abrasivos e escorregadios
agravam a lesão (Nakano e Aherne, 1992; Sobestianky et al., 1999;
Ytrehus, et al., 2004a).
Morés et al., (2003) avaliaram vários fatores de risco associados à artrite, e
concluíram que: a presença ou não de forro no galpão está ligado ao estresse térmico, e
isso pode afetar o sistema imune do animal o que resulta em menor resistência às
infecções; limpeza e higiene do ambiente visam reduzir a carga de contaminação
bacteriana o que reduz chances de ocorrer doenças; casos de artrites podem estar ligados
ao tipo de transporte; machos apresentam maior porcentagem de carcaças condenadas
por artrites, provavelmente devido ao ato cirúrgico da castração.
Dentre outros fatores de risco, Sobestiansky et al. (1999) afirmaram que pisos
abrasivos, desgastados e com exposição de britas, aumentam os casos de lesões e ainda
27
dificultam a boa limpeza e desinfecção do ambiente. Morés et al. (2003) concluíram
ainda que há uma forte relação com artrite e baixo ganho de peso diário, baixo
rendimento de carne magra e conversão alimentar ruim e baixo peso de carcaça.
A artrite pode ser classificada como infecciosa, onde estão envolvidos vários
agentes, tais como bactérias, vírus e fungos (Thompson, 2007) e a artrite não infecciosa,
classificada como erosiva e não erosiva, dependendo do reflexo da doença sobre a
cartilagem articular (Weisbrode, 2007).
2.2.2.1.1. Artrite Infecciosa
A artrite infecciosa é apenas uma manifestação de uma infecção sistêmica com
reações inflamatórias envolvendo vários tecidos (Thompson, 2007). Podem ser causadas
por vários agentes infecciosos, sendo, portanto, consideradas de riscos à saúde pública,
por serem responsáveis pelo aparecimento de zoonoses ocupacionais.
Podem aparecer também a partir de um trauma, geralmente, em animais
lactentes, devido ao tipo de piso utilizado nas maternidades estando associada às
condições higiênicas e ao nível de desinfecção das instalações. Podem ocorrer em
animais velhos, a partir de lesões causadas pelos tratadores durantes as limpezas das
baias, pelo tipo de pisos ou na ocasião dos transportes, tendo como principais agentes
Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Arcanobacterium pyogenes, Escherichia coli e
Pasteurella multocida (Sobestiansky et al., 1999).
Segundo Morés e Sobestiansky et al. (2007) o canibalismo é, em potencial, uma
porta de entrada para bactérias causadoras de abscessos em várias partes do corpo,
podendo provocar artrite, onde o líquido sinovial apresenta-se purulento podendo ou
não ocorrer fistulação. Dentre os principais agentes infecciosos citados por esses autores
encontram-se o Streptococcus spp., Arcanobacterium pyogenes e
Staphylococcus aureus.
O processo inflamatório, na artrite infecciosa, é desencadeado pela presença do
agente na articulação e, após a destruição dos agentes pelo organismo do animal, a
doença se perpetua por vários meses (Alberton, 2007c). Este autor relata que a
perpetuação da doença se deve às lesões irreversíveis causadas na cartilagem articular,
devido à enzima liberada pelos neutrófilos o que provoca erosões extensas, gerando
instabilidade articular e liberando o colágeno para o interior da articulação.
28
Segundo Huether e McCance2 citado por Weisbrode (2007), existem cinco rotas
para entrada da infecção na articulação: via hematógena, extensão de uma osteomielite,
disseminação de uma infecção de tecidos moles adjacentes, procedimentos diagnósticos
ou terapêuticos e penetração de agentes a partir de danos causados por punção ou corte.
A cronicidade pode ser devido a uma inabilidade do animal em retirar o agente causador
ou substância, trauma repetido ou inflamação imuno-mediada. Se há danos irreversíveis
na cartilagem ou sinóvia, mesmo que a causa primária da inflamação seja percebida, a
articulação poderá desenvolver uma doença degenerativa (Weisbrode, 2007).
Segundo Nielsen et al., (2005), os microrganismos têm predileção por
membranas serosas e causa infecções com maior freqüência em várias articulações dos
membros. No caso de artrites supurativas, se a bactéria penetrar no animal através de
um ferimento somente uma articulação será envolvida, mas caso o animal esteja com
um foco septicêmico, como infecções uterinas, lesões no casco ou ferimentos causados
por brigas, podem ocorrer o aparecimento da poliartrite (Dewey, 2006).
As bactérias podem chegar a articulação pela inoculação direta, como punção,
chegando a partir de tecidos moles peri-articulares ou por ossos adjacentes
(Weisbrode, 2007). Segundo Straw et al. (2007) esse processo pode ocorrer por uma
invasão bacteriana pelo cordão umbilical ou por um ferimento na pele que pode causar
ainda endocardites e meningites em animais que ainda não se restabeleceram. Isso está
associado também com a higiene do ambiente, pois quanto maior a pressão de infecção,
maior será a susceptibilidade a infecções (Sobestiansky et al., 1999). Outros fatores
predisponentes ao aparecimento da artrite infecciosas são: cortes de cauda (cauda curta),
cortes de dentes realizados de forma errada, com alicates sujos, mal desinfetados e sem
corte ou por desgaste profundo dos dentes com conseqüente abertura do alvéolo
dentário e ferimentos nas gengivas e lábios.
As principais causas de condenações por lesões articulares em suínos de abate
em ordem de incidência são: Osteocondrose, infecção por Erisypelothrix rhusiopathiae,
Mycoplasma hyosynoviae, Streptococcus spp. e as artrites traumáticas ocasionadas pelo
transporte de suínos ao abate (Alberton et al., 2003b, Alberton, 2007a) e com menor
freqüência o Haemophillus spp., Staphyloccocus aureus e Arcanobacterium pyogenes
(Morés e Sobestiansky, 2007).
2 HUENTER, S.E.; McCANCE, K.L. Understanding pathophysiology, ed.2, St. Louis, 2000, Mosby.
29
2.2.2.1.1.1. Artrite causada pela Erysipelothrix rhusiopathiae
Erysipelothrix rhusiopathiae (E. rhusiopathiae) é um bacilo gram positivo com
tendência a formar filamentos alongados (Wood et al., 2006). É ubíquo como comensal
ou patogênico em animais, cujo maior reservatório são os suínos (Ruiz et al., 2003).
Essa bactéria pode atingir várias espécies como, por exemplo, cordeiros, aves e
raramente outros animais domésticos (Thompson, 2007). É o agente etiológico de uma
zoonose, o Erisipelóide (Thompson, 2007) e esta infecção é mais comumente associada
à exposição ocupacional com carnes ou peixes contaminados (Romney et al. 2001).
Este microorganismo é o agente causador da Erisipela Suína (ES) e resulta em
enormes perdas econômicas na produção mundial (Takahashi, 1999), afetando animais
desde a creche até terminação (Dewey, 2006). Os animais com idade de 2 meses a 1 ano
e fêmeas prenhas são os mais suscetíveis (Thompson, 2007) e leitões mais jovens são
mais resistentes, pois adquirem imunidade através do colostro
(Sobestiansky et al., 1999).
Do ponto de vista econômico, a artrite é a mais importante manifestação da ES,
pois afeta a taxa de crescimento, mas principalmente, por provocar grandes perdas pela
condenação ou aproveitamento condicional de carcaças durante o abate
(Alberton, 2007). Estima-se que 30 a 50% dos suínos sadios sejam portadores da
E. rhusiopathiae em suas tonsilas ou em tecidos linfóides (Shimoji, 2000). A ES pode
aparecer dentro da criação a partir da ingestão do microrganismo, por contaminação
cutânea, por picadura de moscas infectadas (Thompson, 2007).
A infecção é manifestada pela septicemia subaguda e aguda, bem como por
lesões crônicas proliferativas e não supurativas (Wood et al., 2006). Estes mesmos
autores relatam que animais afetados com artrites crônicas apresentam uma ou mais
articulações afetadas. Nestes casos, ocorre proliferação da membrana sinovial, erosões
da cartilagem articular com formação de pannus, hiperplasia polipóide dos vilos da
sinóvia e severa hiperplasia linfóide, tendo como articulações mais afetadas as do jarrete
e do carpo (Morés e Sobestiansky, 2007).
A artrite é muito comum na ES crônica e nem sempre está associada com sinais
agudos ou subagudos. A sinovite é bem evidente nas articulações maiores, onde ocorre
o aumento volume e da viscosidade do líquido sinovial e hiperemia da membrana
sinovial (Thompson, 2007).
30
2.2.2.1.1.2. Artrite causada pelo Mycoplasma hyosynoviae
Os Micoplasmas são bactérias gram negativas e pleomórficas, variando em
forma de pêra, podendo se ramificar ou apresentar formas helicoidais
(Coetzer e Tustin, 2004a). O Mycoplasma hyosynoviae (M. hyosynoviae) é causa
comum de artrite em suínos de abate (Nielsen et al. 2005). Acomete animais em fase de
recria e terminação e provoca atrasos no crescimento, gasto com tratamentos e
condenações de carcaças (Alberton et. al., 2004).
A artrite por M. hyosynoviae é uma doença freqüentemente observada em países
com criação tecnificada (Wallgren, 2004). Este agente foi isolado no Brasil pela
primeira vez por Alberton et al. (2004), em articulações suínas diagnosticadas com
artrite infecciosa. Nielsen et al. (2001) relatam que o isolamento a partir do líquido
sinovial é mais eficiente nos estágios iniciais da doença, porém a infecção pode persistir
até o momento do abate (Alberton et al., 2003a).
O organismo tem predileção por membranas serosas e causa infecção na maioria
das vezes nas grandes articulações (Nielsen et al., 2005), podendo causar artrites em
animais a partir de 4 a 8 semanas, freqüentes também em animais de 3 a 5 meses ou
animais de reposição recentemente introduzidos no rebanho (Ristow, 2007). Este autor
relata que a infecção é do tipo oronasal, dando características de portador aos animais
clinicamente sadios.
A doença clínica ocorre, principalmente, em suínos acima de 3 meses de idade e
em animais de reposição, sendo que a maior prevalência ocorre em animais musculosos
com conformação correta dos membros, havendo variabilidade entre de susceptibilidade
entre as raças. Apresenta morbidade de 5 a 15%, podendo chegar a 50% e mortalidade
baixa, de 2 a 15% (Radostits et al., 2002a).
As artrites causadas por esta bactéria foram caracterizadas por
(Alberton et al., 2003a) pela presença de hipertrofia da membrana sinovial e com
ausência de pannus. Morés e Sobestiansky (2007) classificaram este tipo de artrite com
presença de hiperemia e proliferação da membrana sinovial podendo haver formação de
pannus e alteração focal na cartilagem articular, semelhante à osteocondrose. Relataram
também a presença de líquido sinovial aumentado de volume e serofibrinoso a
serosanguinolento.
31
2.2.2.1.1.3. Artrite causada pelo Streptococcus spp.
Os Estreptococos são cocos gram positivos ovóides ou esféricos, anaeróbios
facultativos que, geralmente, ocorrem em correntes podendo apresentar-se em pares ou
sozinhos e apresentam catalase negativa e são fermentadores de açúcar
(Coetzer e Tustin, 2004b).
Infecções por Streptococcus spp. na criação, causam uma grande variedade de
condições supurativas tanto primárias como secundárias (Coetzer e Tustin, 2004b). São
patogênicos, pois produzem varias substâncias extracelulares que têm a capacidade de
aumentar a sua patogenicidade, dentre essas, podem ser encontradas substâncias que
destroem as células fagocíticas, essenciais para a defesa do organismo. Esse grupo de
bactérias é, provavelmente, responsável pelo aparecimento de muitas doenças se
comparado com outros grupos de bactérias (Tortora et al., 2007).
O S. suis é conhecido como um patógeno suíno de significância clínica na
maioria dos países com indústria suinícola (Marois et al., 2007). Nas criações pode
elevar a mortalidade de recém nascidos e desmamados a níveis inaceitáveis, porém a
maior perda ocorre devido aos elevados custos com a medicação e a queda no
crescimento (Penrith e Henton, 2004). Os sorotipos 1 e 2 são os tipo capsulares
envolvidos e responsáveis pela maioria dos surtos epidêmicos em suínos, sendo o
sorotipo 2 o mais prevalente (Radostists et al., 2002b).
São comumente encontrados como comensal em suínos
(Penrith e Henton, 2004), porém são potencialmente patogênicos
(Penrith e Henton, 2004; Thompson, 2007) estando associado a meningites, artrites,
pericardites, septicemia, pneumonia, morte súbita (Staats et al., 1997;
Marois et al., 2007) e infecções em seres humanos (Gottschalk et al., 2007;
Nghia et al., 2008).
Lara et al. (2007) em Santa Catarina e Oliveira (2008) em Mato Grosso,
obtiveram uma prevalência de 55,88% e 14,65%, respectivamente, de S. suis tipo 2 em
tonsilas de suínos portadores. A baixa prevalência encontrada em Mato Grosso pode ser
explicada pelo fato de que o Estado apresenta uma suinocultura mais recente e também
pelo tipo de sistema de criação (ciclo completo), predominante. Hariharan et al. (1992)
avaliaram suínos com lesões articulares, obtiveram isolados de S. suis, particularmente
o sorotipo 2.
32
Os achados clínicos mais comuns da infecção por S. suis são a meningite e a
artrite que podem ocorrer isoladas ou associadas. A artrite é caracterizada pelo
espessamento e distensão das cápsulas articulares, claudicação e dor á palpação. Os
animais podem apresentar febre, depressão e evitam locomover-se
(Radostists et al., 2002c). Abscessos ou infecções purulentas são produzidos a partir de
resposta de neutrófilos frente a produtos bacterianos (Coetzer e Tustin, 2004b).
2.2.2.1.1.4. Artrite causada pelo Haemophilus parasuis
O Haemophillus parasuis (H. parasuis) é uma bactéria gram negativa, não
hemolítica, imóvel e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) dependente,
comumente encontrada na cavidade nasal de suínos saudáveis (Menin et. al., 2005).
Afeta suínos comprometidos por estresse, com uma freqüência maior em animais entre
5 a 8 semanas de idade, mas também pode afetar suínos de 2 semanas a 4 meses
(Sobestiansky et al., 1999).
Coloniza também o trato respiratório de leitões, logo após o parto, a partir das
matrizes (Reis e Costa, 2008) podendo resultar no aparecimento da Doença de Glässer.
Esta doença está amplamente distribuída em todo o mundo (Sobestiansky et al. 1999). É
responsável por inúmeros prejuízos causados ao produtor pelo elevado número de
animais refugos, entre os sobreviventes (Sobestiansky et al., 1988) e na indústria pela
condenação de carcaças (Sobestiansky et al., 1999).
Tem a capacidade de infectar apenas suínos e pode resultar em doenças
sistêmicas de alta morbidade e mortalidade (Menin et al. 2005). Esta doença é
responsável pelo aparecimento de polisserosites e artrites em suínos jovens
(Rapp-Gabrielson et. al., 2006) e caracterizada por inflamação serofibrinosa das serosas,
podendo ocasionar também pleurites, pericardites, peritonites e meningites, em várias
combinações (Santos e Sobestiansky, 2007).
2.2.2.1.2. Artrite Não Infecciosa
As Lesões degenerativas podem desencadear, na região epifisária, reações
inflamatórias assépticas, principalmente, por áreas de necrose e fraturas no interior da
cavidade articular. São menos freqüentes que as de origem infecciosa, estando
relacionada a intensos processos dolorosos e claudicação (Thompson, 2007).
33
O exame microbiológico dessas articulações, geralmente, apresenta-se negativo,
pois a maioria das artrites é asséptica, e as artrites infecciosas são resultado de um
processo crônico onde o agente já se encontra instalado na articulação
(Alberton, 2007c).
Muitas carcaças de suínos são destinadas ao aproveitamento condicional ou para
a condenação total por apresentarem artrite. Essas poderiam ser utilizadas para consumo
humano sem qualquer risco, já que a maioria delas é causada pela OC. Este desperdício
acaba elevando os custos de produção dos frigoríficos e como conseqüência há uma
redução na remuneração destinada aos produtores, determinando a necessidade de
mudança nas descrições das condenações (Althaus et al., 2005).
2.2.2.2. Osteomielite
A osteomielite compreende a inflamação do osso, dos elementos da medula
óssea, do endósteo, do periósteo e dos canais vasculares (Smith et al., 1993), na maioria
das vezes provocada por bactérias (Thompson, 2007) tais como Arcanobacterium
pyogenes e Escherichia coli (Radostits et al., 2002c). É pouco diagnosticada, pois os
animais afetados, geralmente morrem de septicemia antes de suspeitar clinicamente de
osteomielite. Em geral, os ossos não são avaliados durante a necropsia, a menos que os
sinais clínicos apontem para uma desordem esquelética (Thompson, 2007).
Os agentes infecciosos podem entrar no osso diretamente no periósteo: trauma,
cirurgia ou via hematógena (Radostits et al., 2002c; Weisbrode, 2007). Em suínos, as
infecções hematógenas podem ocorrer esporadicamente, associada à onfalite, corte de
cauda ou após a castração (Radostits et al., 2002c); ocorrendo mais comumente em
animais jovens (Weisbrode, 2007).
Nos ossos, as bactérias possuem uma forte predileção por locais
metabolicamente ativos, principalmente na ossificação endocondral epifiseal e
metafiseal (Thompson, 2007). O fluxo sanguíneo nos sinusóides da região metafisária é
lento facilitando a propagação bacteriana. As lesões multifocais são comuns e podem
ser relacionadas à embolia séptica (Radostits et al., 2002c).
Muitas dessas infecções são controladas no estágio inicial, devido a um eficiente
tratamento antibacteriano. Se a infecção não for eliminada, poderá ocorrer a formação
de abscessos metafisários e/ou epifisários (Thompson, 2007).
34
O agente infeccioso pode invadir a cavidade medular adjacente, causando
necrose dos tecidos moles e osso trabecular. Estas lesões aparecem como áreas pálidas
discretas, bem demarcadas pela medula óssea vermelha. Ocorre reabsorção do osso
trabecular necrótico, e há proliferação de tecido de granulação em torno desse osso; o
que resulta na separação do tecido viável e do osso necrótico (Thompson, 2007).
De acordo com o tipo, quantidade e intensidade na liberação de mediadores
inflamatórios determinarão a severidade da lesão bem como do estímulo à reabsorção
óssea. As conseqüências de uma resposta inflamatória no interior do osso podem alterar
a estrutura e função dos mesmos (Weisbrode, 2007).
O osso cortical é relativamente poroso em animais jovens e oferece uma
pequena resistência na disseminação de infecções (Thompson, 2007). Baseado na
intensidade da reação inflamatória e a conseqüente formação de edema, ocorrendo um
aumento na pressão interna do osso, ocasionando compressão dos vasos sanguíneos, o
que pode resultar em necrose isquêmica (Weisbrode, 2007).
2.3. Doenças Peri-Articulares
2.3.1. Bursite
A bursite é uma inflamação da bursa, causada pelo excesso de fricção no local
onde as mesmas estão inseridas. Aparecem comumente nas articulações do joelho, na
projeção caudal do tarso, cotovelos, jarrete, articulação femorotibial, ponta do esterno e
tuberosidade isquiática (Barcellos, 2007). Em alguns casos, essas bursas são
encontradas em suínos frente a uma resposta patológica (Gilman et al., 2008), surgindo
abaixo do jarrete em conjunto com as superfícies latero-plantar, plantar e medial dos
membros posteriores, com menor freqüência nos membros anteriores
(Gilman et al., 2008; Thompson, 2007).
Os animais predisponentes para o desenvolvimento da doença são suínos de
rápido crescimento (Muirhead and Alexander, 19973 citado por Mouttotou, et al. 1999)
e os animais de raça despigmentada tais como Large White e Landrace
(Orsi, 19674 citado por Penny e Hill, 1974).
3 MUIRHEAD, R. M.; ALEXANDER, T. J. L. Managing Pig Health and Treatment of Disease. A Reference for the farm, 5M Enterprises, UK, 1997. 4 ORSI, A. The occurrence of swelling of the hock region in withe pork breeds. Moyar Allat Lapja 22, 271-274, 1967.
35
Smith et al. (1993)5 citado por Mouttotou et al. (1999) relataram que boa parte
da etiologia das bursites inclui fatores ambientais tais como o tipo, a cobertura e o
aumento do desgaste do piso e o aumento da densidade populacional que tendem a
aumentar a prevalência e a severidade das lesões. Relataram também, o fator da
sazonalidade, pois no inverno a prevalência aumenta em relação ao verão pelo aumento
da densidade, devido à aglomeração dos animais.
Geralmente, as lesões são estéreis, pois são resultantes de agressões ambientais,
mas podem ocorrer contaminações, tendo como as bactérias mais freqüentemente
isoladas os Staphylococcus sp. e Streptococcus sp. (Barcellos, 2007). As lesões podem
permanecer na forma de sacos repletos de líquido ou tornam-se sólidas após a sua total
formação (Mouttotou et al., 1999).
As lesões macroscópicas foram caracterizadas por Barcellos (2007) pela
presença de cápsula espessa com conteúdo líquido de coloração clara que, com a
evolução da doença torna-se turvo ou avermelhado, com presença de fibrina e formação
de tecido de consistência fibrosa.
Por ser tratarem de lesões peri-articulares, pode haver uma confusão entre
bursite e artrite durante a realização do diagnóstico clínico (Barcellos, 2007).
2.3.2. Miosite
O termo miosite significa inflamação do tecido muscular, muitas vezes de difícil
determinação, principalmente se o processo em questão é oriundo de uma resposta
inflamatória clássica ativada no músculo ou se alguns componentes da inflamação são
ativados por algum processo degenerativo (Vleet e Valentine, 2007).
As causas da miosite ainda não estão evidentes exceto em casos em que a
natureza da reação inflamatória é sinalizada por uma resposta supurativa ou
granulomatosa ou quando for um componente de uma infecção sistêmica, sendo o
agente mais freqüente em suínos o Arcanobacterium pyogenes
(Vleet e Valentine, 2007). Pode ser de origem infecciosa (bacterianas, virais, fúngicas
ou parasitárias) e não infecciosas. As miosites bacterianas ocorrem em associação a
áreas do corpo com ferimentos, que sofreram cirurgias, corpo estranho ou com presença
de isquemia (Crum-Cianflone, 2006). Podem ser ainda resultante de um trauma direto
5 SMITH, W. J. A study of adventitious bursitis of the hock of the pigs, DVM&S thesis, University of Edinburgh, UK, 1993
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ou indireto no músculo, ocorrendo como parte de uma síndrome ou de várias doenças
(Radostits et al., 2002c).
Um trauma externo pode ocasionar uma Miopatia Fibrosa, mas pode estar
associada a exercícios físicos excessivos ou de injeções intramusculares
(Radostits et al., 2002c). Às vezes os abscessos musculares (miosite supurativa), podem
ser de origem hematógena, porém, na maioria dos casos é resultante de inoculação, ou
seja, a partir de contaminação cirúrgica ou laceração, ferimentos penetrantes, foco
supurativo extenso em estruturas adjacentes ou injeções contaminadas
(Vleet e Valentine, 2007), sendo que esse último pode levar a uma necrose produzindo a
formação de escaras com fragmentos encapsulados que podem persistir por mais de um
mês, acarretando o aparecimento de tecido cicatricial persistente
(Radostits et al., 2002c), ou pela propagação de uma celulite, fasceíte, tendinite, artrite
ou osteomielite (Valentine e McGavin, 2007).
Pode apresentar-se de duas formas: Miosite Aguda, onde o animal apresenta
grave claudicação, aumento de volume e de temperatura e dor a palpação; e Miosite
Crônica, onde há grande debilidade dos músculos acometidos, sendo difícil a
diferenciação da atrofia muscular de outras causas (Radostits et al., 2002c).
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45
Capítulo I
Artigo a ser submetido à Revista Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal
Science
AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA E MOLECULAR DE LÍQUIDOS ARTICULARES E PERI-
ARTICULARES DE SUÍNOS
Microbiological and molecular evaluation of articles and peri-articles fluids of pigs
Ana Carolina Silva de FARIA1,6 João Xavier de OLIVEIRA FILHO², Daphine Ariadne Jesus de PAULA1, Thaisy AVALHAES3, Marcos de
Almeida SOUZA4, Luciano NAKAZATO2 & Valéria DUTRA1*
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO.
1 Laboratório de Microbiologia Veterinária - UFMT ² Laboratório de Biologia Molecular Veterinária - UFMT ³ Faculdade de Ciências Biológicas - UFMT 4 Laboratório de Patologia Veterinária – UFMT *Autor para correspondência: [email protected]
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AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA E MOLECULAR DE LÍQUIDOS ARTICULARES E PERI-
ARTICULARES DE SUÍNOS.
Microbiological and molecular evaluation of articles and peri-articles fluids of pigs
INTRODUÇÃO
A tecnificação na suinocultura melhorou a produtividade e, conseqüentemente, acarretou problemas ao
aparelho locomotor dos animais. Lesões em cascos, músculos, articulações e ossos ocasionam locais dolorosos
com aumento de volume articular e/ou claudicação (Lopez et al.1), tendo como principais lesões a osteocondrose,
osteocondrite dissecante, artrite, osteomielite, sinovite, bursite, abscessos e as lesões de cascos.
As enfermidades locomotoras causam enormes perdas econômicas em Sistemas Intensivos de Produção
de Suínos – SIPS (Jensen2). Kirk, et al.3 observaram 72% de perdas por doenças relacionadas ao aparelho
locomotor em fêmeas abatidas, justificando a realização de outros estudos, pois os dados da literatura ainda são
escassos.
O diagnóstico dessas enfermidades deve incluir o exame e a monitoria clínica do rebanho para a
caracterização e quantificação do problema locomotor e, posteriormente, a realização de exames laboratoriais
para se estabelecer as medidas de tratamento e/ou controle (Straw4; Sobestiansky; Barcellos 5).
O objetivo desse trabalho foi realizar a avaliação microbiológica e molecular de amostras de líquido
articular e peri-articular de suínos em diversas fases com sinais clínicos de doença locomotora coletadas em
diferentes SIPS no Estado de Mato Grosso.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletadas amostras de líquido articular e peri-articular de 115 suínos, no período de junho de
2007 a dezembro de 2008. Foram acompanhados 9 SIPS no Estado do Mato Grosso com diferentes padrões
sanitários. Em cada SIPS foi realizado exame e monitoria clínica do rebanho para a caracterização do quadro
clínico de enfermidade locomotora de acordo com a metodologia de Sobestiansky e Barcellos5, tendo como
critério o aumento de volume articular e/ou claudicação.
47
A coleta de conteúdo articular foi realizada com auxílio de agulha e seringa estéreis com prévia
limpeza e antissepsia com álcool iodado. Com relação ao conteúdo peri-articular foi realizado um exame físico
através de palpação e identificação de áreas de flutuação, coletando-se de forma semelhante ao conteúdo
articular.
As amostras foram aliquotadas em microtubos estéreis e posteriormente acondicionadas em caixas
isotérmicas refrigeradas e enviadas ao Laboratório de Microbiologia Veterinária e Biologia Molecular
Veterinária. Para o cultivo, foram realizadas semeaduras nos meios Ágar Sangue ovino 7%, Ágar Mac Conkey e
Ágar Sabouraud permanecendo incubadas a 37ºC em aerobiose, com leitura em 24-48 horas. Nos casos de
crescimento de colônias, a identificação foi realizada de acordo com as características morfológicas, bioquímicas
e tintoriais (Quinn et al.6).
A extração de DNA foi realizada em 200µ de líquido articular e/ou peri-articular de cada amostra,
utilizando-se altas concentrações de isotiocianato de guanidina. A concentração de DNA e a sua integridade
foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada para detectar os organismo de difícil
isolamento, tais como Erysipelothrix tonsilarum e Erysipelothrix rhusiopathiae (Yamazaki7), Mycoplasma
hyosynoviae (Ahrens et al.8), Haemophilus parasuis (Angens et al.9), Brucella sp. (Bricker e Halling10) e para a
identificação do Streptococcus suis (Chatellier et al.11) e tipificação do sorotipo 2 (Marois et al.12)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 115 amostras, 48,7% foram positivas para pelo menos um microrganismo através do isolamento
e/ou pela PCR, tendo como microrganismos predominates o Mycoplasma hyosynoviae, Streptococcus spp. e
Arcanobacterium pyogenes (tabela 1).
No isolamento bacteriológico, 45 (39,13%) amostras apresentaram crescimento bacteriano, e 70
(60,87%) foram negativas. Resultado semelhante foi encontrado por Johnston; Doige e Osbornerne13 e
Hariharan et al.14, que obtiveram 38% e 37% de amostras positivas ao isolamento, respectivamente.
Martínez et al.15 realizaram avaliações microbiológicas em 48 suínos a partir das 3 maiores freqüências de
condenação em frigoríficos por lesões articulares e peri-articulares, destas, 42 (87,5%) foram positivas ao
isolamento para um ou mais agentes, sendo esse resultado superior aos encontrado no presente estudo.
48
Das 45 amostras positivas ao isolamento, 29 (64,44%) apresentaram apenas uma espécie bacteriana, 8
(17,78%) duas espécies, 6 (13,33%) três espécies e apenas 2 (4,45%) quatro espécies. Este resultado foi inferior
ao encontrado por Hariharan et al.14, onde obtiveram 88% de cultura para apenas um agente.
Foram identificados 71 isolados, sendo os principais agentes Streptococcus spp., A. pyogenes e E. coli.
O agente mais isolado foi o Streptococcus spp. (tabela 1). Hariharan et al.14, encontraram 40% de bactérias
piogênicas inclusive Streptococcus suis. O Streptococcus spp é capaz de causar uma variedade de condições
supurativas, tanto primárias como secundárias (Coetzer; Tustin16) estando associado a doenças em suínos, tais
como meningites, artrites, pericardites, septicemia, pneumonia e morte súbita (Staats et al 17; Marois et al.18).
O Arcanobacterium pyogenes foi o segundo microrganismo com maior freqüência de
isolamento (tabela 1). Martínez et al.16, obtiveram como isolado de maior freqüência Arcanobacterium pyogenes
em 75% dos casos. Este agente é um comensal oportunista de importância econômica na produção animal, por
ser responsável pelo aparecimento de diversas doenças, estando associado a infecções piogênicas envolvendo
pele, articulações e vísceras (Jost et al.19; Jost; Billington20).
A Escherichia coli foi o 3º agente mais isolado (tabela 1). A maioria das cepas de E. coli presentes no
trato gastrintestinal são comensais, no entanto podem causar lesões devido a imunossupressão dos animais
(Nataro; Kaper 21).
A Candida spp. foi isolada em 3 animais (tabela 1) na maternidade e creche (figura 1), sendo uma delas
colônia pura. A presença de isolados somente em animais da maternidade e creche neste estudo é similar ao
descrito em humanos, nos quais neonatos e crianças de até seis meses de idade são mais acometidas devido ao
aumento do suprimento sanguíneo para os ossos e articulações em desenvolvimento favorecendo a infecção pela
levedura (Silveira et al.22;Deshpand et al.23). Durante a coleta, alguns animais apresentavam perfurações na
região articular e peri-articular realizadas pelos funcionários das granjas com objetivo de drenar o líquido ou o
conteúdo dos locais com aumento de volume, provavelmente essas perfurações serviram como porta de entrada
para microrganismos, como por exemplo as enterobactérias.
Também foi realizada a técnica de PCR nas 115 amostras, obtendo-se 23 (20%) amostras positivas para
pelo menos um microrganismo, e 92 (80%) negativas. Das 23 amostras positivas, 12 (56,22%) apresentaram
apenas um agente infeccioso, 6 (30,43%) dois agentes e 1 (4,45%) cinco e seis agentes cada. Dentre os sete
microrganismos avaliados, detectou-se o Mycoplasma hyosynoviae (15), Erysipelothrix tonsillarum (9),
Streptococcus suis (7), Haemophillus parasuis (7), Streptococcus suis tipo 2 (5),
Erysipelothrix rhusiopathiae (1) e Brucella sp. (0).
49
Neste estudo não foi encontrado o S. suis na maternidade, e sim outros Streptococcus spp..
Morés; Sobestiansky24 relataram que, geralmente, o Streptococcus suis atinge a fase da maternidade, tendo como
principal porta de entrada a polpa dentária, porém pode ocorrer todas as idades (Sobestiansky et al.25).
O Mycoplasma hyosynoviae está presente em todas as fases de criação e foi o agente mais freqüente em
nosso estudo (figura 1; tabela 1). Nielsen, Nielsen e Friis26, descrevem o M. hyosynoviae como a maior causa de
lesões articulares de suínos na Dinamarca em fase de terminação. Wallgreen27 afirma que este agente é
encontrado principalmente na fase de terminação, porém Lauritsen, et al.28, relataram que animais de 6 semanas
de vida infectados experimentalmente desenvolvem lesões articulares. Neste estudo, o agente foi detectado em
animais com menos de 6 semanas, sugerindo que o animal possa desenvolver lesões antes mesmo de completar
três semanas de vida (maternidade), contrariando os relatos apresentados por Wallgreen27.
O Erysipelothrix rhusiopathiae foi encontrado apenas na recria/terminação com uma baixa freqüência
(figura 1; tabela 1). Este resultado justifica-se pelo fato de que animais com idade entre 2 meses a 1 ano serem
mais suscetíveis (Thompson29), e os leitões mais resistentes, pois adquirem imunidade colostral
(Sobestiansky et al.25). Outro fator seria que a maioria das vacinas comerciais é produzida a partir de bacterinas
capazes de conferir proteção contra a maioria dos sorotipos de E. rhusiopathiae
(Wood; Henderson; Rapp-Gabrielson 30). Das 9 propriedades visitadas, apenas 2 não utilizavam a vacina, o que
provavelmente justifica a baixa freqüência.
Em relação à fase de criação, houve diferença conforme a técnica utilizada. Das 115 amostras, tanto no
isolamento quanto na PCR 35 (30,43%) eram de maternidade (0-21dias), 51 (44,35%) creche (22-65dias), e 29
(25,22%) recria/terminação (66 dias ao abate).
Das 35 amostras da maternidade submetidas ao isolamento bacteriano, 11 (31,43%) foram positivas,
destas, obteve-se 19 isolados. Na creche, das 51 amostras, 14 (27,45%) foram positivas, onde se identificou 18
isolados. Na fase de recria/terminação, das 29 amostras, 20 (69%) foram positivas ao isolamento bacteriano, com
34 isolados.
Das amostras analisadas pela técnica de PCR em diferentes fases de criação, detectou-se na maternidade
2 (5,71%) amostras positivas, 13 (25,49%) na creche e 8 (27,58%) na fase de recria/terminação.
Neste estudo não houve diferença significativa entre machos e fêmeas (tabela 2), ao contrário de
estudos realizados por Morés, et al.31 onde encontraram um maior índice de machos com artrite infecciosa.
Os resultados da avaliação microbiológica e da PCR sugerem um problema infeccioso, porém não se
pode descartar os processos degenerativos em associação (Thompson29).
50
CONCLUSÃO
Os principais microrganismos detectados foram Mycoplasma hyosinoviae, Streptococcus spp. e
Arcanobaterium pyogenes, nas diferentes fases de criação utilizando-se o isolamento bacteriano e a PCR.
Boa parte dos animais apresentou lesões de caráter infeccioso sem predileção por sexo. Porém, mesmo
com a presença de lesões infecciosas, não se pode descartar os problemas degenerativos em associação, por se
tratar de animais geneticamente modificados.
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RESUMO
A tecnificação na suinocultura melhorou a produtividade e, conseqüentemente, acarretou problemas ao aparelho
locomotor dos animais. As enfermidades locomotoras são responsáveis por enormes perdas econômicas em
Sistemas Intensivos de Produção de Suínos. O objetivo desse trabalho foi realizar a avaliação microbiológica e
molecular de amostras de líquido articular e peri-articular de suínos em diversas fases com sinais clínicos de
doença locomotora coletadas em diferentes SIPS no Estado de Mato Grosso. Neste estudo, coletou-se amostras
de líquido articular e peri-articular de 115 suínos com a condição clínica de aumento de volume e/ou claudicação
em diferentes fases de criação em nove Sistemas Intensivos de Produção de Suínos no Estado de Mato Grosso
para avaliação microbiológica e molecular. Os resultados do isolamento bacteriano e da PCR demonstraram que
48,7% dos animais apresentaram um ou mais agentes infecciosos como causa dessa condição clínica; no
isolamento, 45 (39,13%) amostras apresentaram crescimento bacteriano e à PCR, 23 (20%) amostras
foram positivas. Os microrganismos identificados com maior freqüência foram Mycoplasma
hyosynoviae, Streptococcus spp. e Arcanobacterium pyogenes. Candida sp. foi isolada em três casos na
maternidade e creche. A freqüência dos microrganismos apresentou variação nas diferentes fases de criação,
sendo o M. hyosinoviae e A. pyogenes mais encontrados na creche e recria/terminação. Erysipelothrix
rhusiopathiae foi detectada com baixa freqüência (0,88%) apenas na fase de recria/terminação. Neste estudo
ficou caracterizado que aproximadamente 50% dos animais são portadores de lesões articulares e peri-articulares
de origem infecciosa, no entanto, não se pode descartar problemas degenerativos em associação.
Unitermos: Suínos, sistema locomotor, artrite infecciosa, PCR, Mycoplasma hyosynoviae
ABSTRACT
The swine technification in improved productivity and consequently led problems to locomotor system of
animals. The locomotor diseases are responsible for enormous economic losses in an intensive production
53
system of pigs (SIPS). The aim of this study was to evaluate molecular and microbiological sampling of liquid
articule and peri-article fluids of pigs in various stages with clinical signs of locomotory disease collected in
different SIPS in Mato Grosso State. In this study, samples were collected articular and peri-articular fluids of
115 pigs with clinical conditions of increased volume and / or lameness in different stages of development in
nine SIPS in Mato Grosso State for microbiological and molecular evaluation. The results of bacterial isolation
and PCR showed that 48.7% of the animals had one or more infectious agents as the cause of this clinical
condition; in isolation, 45 (39.13%) samples showed bacterial growth and PCR, 23 (20% ) samples were
positive. The microorganisms most frequently identified were Mycoplasma hyosynoviae, Streptococcus spp. and
Arcanobacterium pyogenes. Candida sp. was isolated in three cases in the maternity and nursery. The
frequencies of microorganisms vary in different stages of creation, and the M. hyosinoviae and A. pyogenes
found in most nursery and growing/finishing. Erysipelothrix rhusiopathiae was detected with low frequency
(0.88%) only during the growing/finishing. In this study was characterized that approximately 50% of animals
are carriers of articular and peri-articular lesions of infection source, however, we cannot discard degenerative
problems in combination.
Uniterms: Pigs, locomotor system, infectious arthritis, PCR, Mycoplasma hyosynoviae
54
Tabela 1: Freqüência de microrganismos detectados através do isolamento bacteriano e da PCR em suínos portadores lesões
articulares e peri-articulares no Estado de Mato Grosso, no período de Junho/07 a Dezembro/08.
Técnicas Microrganismos Agentes
infecciosos (%)
I
S
O
L
A
M
E
N
T
O
Streptococcus spp. 14 (12,28)
Arcanobacterium pyogenes 13 (11,40)
Escherichia coli 9 (7,89)
Staphylococcus aureus 8 (7,02)
Staphylococcus intermedius 7 (6,14)
Enterobacter sp. 5 (4,39)
Citrobacter sp. 5 (4,39)
Acinetobacter sp. 4 (3,51)
Candida sp. 3 (2,63)
Staphylococcus hycus 2 (1,75)
PCR
Mycoplasma hyosinoviae 15 (13,16)
Erysipelothrix tonsilarum 9 (7,89)
Haemophilus parasuis 7 (6,14)
Streptococcus suis 7 (6,14)
Streptococcus suis Tipo 2 5 (4,39)
Erysipelothrix
rhusiopathiae 1 (0,88)
Brucella sp. 0 (0)
TOTAL 114 (100)
55
Tabela 2: Freqüência de diagnóstico associado ao sexo de suínos portadores de lesões articulares e peri-articulares no Estado de
Mato Grosso, no período de Junho/07 a Dezembro/08.
Resultado / Sexo Machos (%) Fêmeas (%) Total
P 34(47,9)(N/S) 22(50)(N/S) 56
N 37(52,1) 22(50) 59
Total 71(100) 44(100) 115
Legenda: P – Positivos; N – Negativos; (N/S) - Não significativo (P= 0, 826)
56
Figura 1: Freqüência (%) de microrganismos identificados de suínos portadores lesões articulares e peri-articulares nas fases de
Maternidade, Creche e recria/terminação no Estado de Mato Grosso, no período de Junho/07 a Dezembro/08.
57
Capítulo II 1
2
Nota a ser submetida à Revista Ciência Rural 3
4
Avaliação da Resistência antimicrobiana de isolados de amostras de líquido 5
articular e peri-articular de suínos. 6
Evaluation of Antimicrobial resistance profile of isolates from samples of 7
articular and peri-articular fluids of pigs. 8
9
Ana Carolina Silva de FariaI, João Xavier de Oliveira FilhoII, Daphine Ariadne 10
Jesus de PaulaI, Juçara Tinasi de OliveiraIII, João Garcia CaramoriIV, 11
Luciano NakazatoII & Valéria DutraI* 12
13
- NOTA – 14
15
RESUMO 16
17
A elevada demanda de produção de suínos, fez com que o sistema de produção fosse 18
intensificado com emprego de novas tecnologias o que culminou com o aparecimento 19
de diversas doenças relacionadas ao aparelho locomotor. O uso indiscriminado de 20
antimicrobianos em animais tem sido apontado com uma das possíveis causas da 21
seleção de microrganismos resistentes O presente estudo teve como objetivo avaliar a 22
resistência a antimicrobianos em bactérias isoladas a partir de amostras de líquido 23
I Laboratório de Microbiologia Veterinária - UFMT II Laboratório de Biologia Molecular Veterinária - UFMT III Instituto Federal de Tecnologia (IFET – Cáceres) IV Departamento de Ciências Básicas e Produção Animal (DCBPA/FAMEV/UFMT) * Autor para correspondência - E-mail: [email protected].
58
articular e peri-articular em suínos com sinal clínico de aumento de volume articular 1
e/ou claudicação. No presente estudo, utilizou-se 41 amostras positivas ao isolamento 2
bacteriano oriundas de animais com essas condições clínica. Foram testados doze 3
antimicrobianos: Amicacina (30µg), Ampicilina (10µg), Amoxicilina + Ácido 4
Clavulânico (30µg), Eritromicina (15µg), Cefalotina (30µg), Gentamicina (10µg), 5
Neomicina (30µg), Nitrofurantoína (300µg), Novobiocina (30µg), Penicilina (10µg), 6
Sulfa+Trimetropim (25µg) e Tetraciclina (30µg). Foi encontrada resistência a maioria 7
dos antimicrobianos, sendo os mais resistentes a tetraciclina e eritromicina. O 8
antimicrobiano mais sensível foi a amoxicilina associada ao ácido clavulânico. 9
A elevada resistência aos antimicrobianos pode estar associada ao uso indiscriminado 10
de antibióticos utilizados no tratamento e no controle de doenças. Porém, pode-se 11
utilizar práticas adequadas de manejo e higiene para prevenir o aparecimento de 12
doenças. 13
14
Palavras-chave: suínos, antimicrobianos, Tetraciclina, Eritromicina, amoxilina+ácido 15
clavulânico 16
17
ABSTRACT 18
19
The high demand for of pigs production, led to the production system was enhanced 20
with the use of new technologies that led to the emergence of various diseases related to 21
the locomotor system. The indiscriminate use of antimicrobials in animals has been 22
identified with one of the possible causes of selection of resistant microorganisms The 23
present study aimed to evaluate the antimicrobial resistance in bacteria isolated from 24
samples of articular and peri-articular fluids in pigs with this clinical signs of increased 25
59
volume of joint and/or lameness. In this study, it was used 41 positive samples for 1
bacterial isolation from animals with this clinical condition. Twelve antimicrobials were 2
tested: Amikacin (30µg), ampicillin (10µg), amoxicillin + clavulanic acid (30µg), 3
erythromycin (15µg), cephalothin (30µg), gentamicin (10µg), Neomycin (30µg), 4
nitrofurantoin (300µg), novobiocin (30µg), penicillin (10µg), Sulfa + Trimetropim 5
(25µg) and Tetracycline (30µg). Was found resistant to the most antibiotics, being the 6
most resistant to tetracycline and erythromycin. The antimicrobial more sensitive was 7
amoxicillin associated with clavulanic acid. 8
9
Key words: pigs, antimicrobial, tetracycline, erythromycin, amoxilin + clavulanic acid 10
11
12
Com a elevada demanda de produção de suínos, os métodos de produção 13
intensificaram-se com emprego de tecnologias avançadas ao longo dos anos culminando 14
com o aparecimento de diversas doenças do aparelho locomotor. Nestes sistemas 15
intensivos de produção, o controle de enfermidades com antimicrobianos tem papel 16
fundamental, principalmente aqueles utilizados via ração (SILVA, et al. 2008). O uso 17
indiscriminado de antimicrobianos em animais tem sido apontado com uma das 18
possíveis causas da seleção de microrganismos resistentes (COSTA et al., 2006; 19
MACÊDO, et al., 2007). 20
O presente estudo teve como objetivo avaliar a resistência a antimicrobianos 21
em bactérias isoladas a partir de amostras de líquido articular e peri-articular em suínos 22
com sinal clínico de claudicação e/ou aumento de volume articular. 23
As bactérias isoladas: Arcanobacterium pyogenes (13); 24
Streptococcus spp. (11); Staphylococcus aureus (8); Escherichia coli (8); 25
60
Staphylococcus intermedius (7); Citrobacter sp. (5); Enterobacter sp. (5); 1
Acinetobacter sp. (4) e Staphylococcus hyicus (2); foram submetidas ao teste de 2
susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de difusão em ágar Müller Hinton, 3
seguindo a metodologia de BAUER e KIRBY (1966). Foram testados doze 4
antimicrobianos: Amicacina (30µg), Ampicilina (10µg), Amoxicilina + Ácido 5
Clavulâmico (30µg), Eritromicina (15µg), Cefalotina (30µg), Gentamicina (10µg), 6
Neomicina (30µg), Nitrofurantoína (300µg), Novobiocina (30µg), Penicilina (10µg), 7
Sulfa+Trimetropim (25µg) e Tetraciclina (30µg), de acordo com a metodologia 8
modificada de HARIHARAN et al. (1992). 9
Neste trabalho a tetraciclina foi o antimicrobiano com maior nível de 10
resistência (31,5%), seguido pela eritromicina (30,9%) e penicilina (30%). A amoxilina 11
em associação com o ácido clavulânico (17,3%) foi o antimicrobiano que apresentou o 12
menor nível de resistência nas amostras testadas. 13
HARIHARAN et al. (1992), encontraram como antibióticos mais resistentes 14
a Amicacina, Neomicina e Tetraciclina, no entanto, a penicilina foi a droga eletiva para 15
o tratamento de lesões articulares infecciosas, pois foi o agente antimicrobiano mais 16
sensível às bactérias testadas. Em nosso estudo, a Penicilina foi o terceiro 17
antimicrobiano com maior resistência, sugerindo que a utilização deverá ser feita com 18
cautela. 19
A origem desta resistência pode estar associada à utilização de antibióticos 20
na produção suína, principalmente de forma preventiva e curativa (BURCH, 2005), com 21
altos índices de detecção molecular no ambiente de genes de resistência como no caso 22
da tetraciclina e eritromicina (PATTERSON et al., 2006; KOIKE et al 2007). 23
SILVA, et al. (2008), encontraram resistência de 82,3% à tetraciclina, 36% à 24
sulfa/trimetropin, 1% à amoxilina/ácido clavulânico e 1% à amicacina, em amostras de 25
61
Escherichia coli isoladas de dejetos de suínos, sendo o perfil semelhante ao descrito 1
neste estudo. 2
A utilização de beta lactâmicos tem apresentado altos níveis de resistência, 3
no entanto a associação de amoxilina com ácido clavulâmico apresentou melhor 4
desempenho como descrito por outros autores devido a sua utilização recente 5
(GEDDES et al, 2007; SILVA et al 2008), porém dessa associação tem sido relatada 6
como resistentes em cepas de enterobacterias como E. coli e Salmonela sp. 7
(HUANG et al., 2009; VARGA et al, 2008) 8
Na atualidade, os antibióticos são utilizados para tratamento de doenças, 9
utilizando doses subterapêuticas na presença de patógenos ou em situações de estresse 10
ou como promotores de crescimento, via água ou ração. No entanto, quando são 11
utilizados dessa forma, os antibióticos podem selecionar bactérias resistentes, 12
principalmente as do trato gastrointestinal (ANDREMONT, 2003). 13
A elevada resistência aos antimicrobianos pode estar associada ao uso 14
indiscriminado de antibióticos utilizados no tratamento e no controle de doenças. Porém 15
pode-se utilizar de práticas adequadas de manejo e higiene para prevenir o aparecimento 16
de doenças. 17
18
REFERÊNCIAS 19
20
ANDREMONT A. Commensal flora may play key role in spreading antibiotic 21
resistance. ASM News. n.69. p.601–607, 2003. 22
BAUER, A. W.; KIRB, E. M. Antibiotic Susceptibility Testing by Standardized Single 23
Disk Method. American Journal of Clinical Patology, v.45, p.493-496, 1966. 24
62
BURCH, D. Problems of antibiotic resistance in pigs in the UK. In Practice. n.27. 1
p.37-43, 2005. 2
COSTA, M.M. et al. Caracterização epidemiológica, molecular e perfil de resistência 3
aos antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos do sul do Brasil. 4
Pesquisa Veterinária Brasileira, v.26, p.5-8, 2006. 5
GEDDES, A.M. et al. Introduction: historical perspective and development of 6
amoxicillin/clavulanate. International Journal of Antimicrobial Agents. 7
s.30. p.s109–s112, 2007. 8
HARIHARAN, H. et al. An investigation of bacterial causes of arthritis in slaughter 9
hogs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. V.4, p.28-30, 1992. 10
HUANG, T.M. et al. Serovar distribution and antimicrobial susceptibility of swine 11
Salmonella isolates from clinically ill pigs in diagnostic submissions from Indiana in 12
the United States. Letters in Applies Microbiology. v.48, n.3. p.331-336, 2009. 13
KOIKE, S. et al. Monitoring and source tracking of tetracycline resistance genes in 14
lagoons and groundwater adjacent to swine production facilities over a three-year 15
period. Applied and Environmental Microbiology. v.73, n.15. p.4813-4823. 16
MACÊDO, N.R. et al. Detecção de cepas patogênicas pela PCR multiplex e avaliação 17
da sensibilidade a antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de leitões diarréicos. 18
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.1117-1123, 2007. 19
PATTERSON, A.J. et al. Mosaic tetracycline resistance genes are widespread in human 20
and animal fecal samples. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.51, n.3. 21
p. 1115-1118, 2007. 22
SILVA, F.F.P. et al. Resistência a antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de 23
dejetos suínos em esterqueiras. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e 24
Zootecnia, v.60, n.3, p.762-765, 2008. 25
63
VARGA, C. et al. Antimicrobial resistance in generic Escherichia coli isolated from 1
swine fecal samples in 90 Alberta finishing farms. Canadian Journal of Veterinary 2
Research. v.72, n.2. p.175-180, 2008. 3
4
64
Tabela 1: Resistência a Antimicrobianos (%) das bactérias isoladas de líquidos articulares e peri-articulares de 1
suínos nas diversas fases de desenvolvimento. 2
3
Legenda: AMI – Amicacina, AMP – Ampicilina, AMC – Amoxicilina+Ác. Clavulânico, CFL – Cefalotina, ERI – Eritomicina, 4
GEN – Gentamicina, NIT – Nitrofurantoína, NEO – Neomicina, NOV – Novobiocina, PEN – Penicilina, SUT – Sulfa+Trimetropin, 5
TET – Tetraciclina. 6
AMI AMP AMC CFL ERI GEN NIT NEO NOV PEN SUT TET
Arcanobacterium pyogenes
61,5 23,3 23 15,39 53,85 30,77 61,52 53,25 30,77 30,77 46,75 30,77
Streptococcus spp. 81,8 45,46 27,28 45,46 90,9 81,8 72,8 72,73 72,8 45,46 72,8 90,9
S. aureus 37,5 25 12,5 50 62,5 25 37,5 37,5 25 87,5 50 87,5
E. coli 62,5 87,5 62,5 75 100 37,5 75 75 100 100 87,5 100
S. intermedius 57,15 57,15 28,58 28,58 57,15 57,15 28,58 28,58 42,86 85,7 42,86 85,7
Citrobacter sp. 40 100 80 100 100 100 80 40 100 100 100 100
Enterobacter sp. 40 100 80 40 100 60 100 40 100 100 100 100
Acinetobacter sp. 50 100 100 75 75 50 75 50 75 100 50 75
S. hiycus 100 100 100 100 100 100 100 50 50 100 50 100
65
Capítulo III
Artigo a ser submetido à Revista Pesquisa Veterinária Brasileira
Avaliação microbiológica, molecular e patológica de suínos com aumento de volume
articular e peri-articular e/ou claudicação em Sistemas Intensivos Produção de Suínos
no Estado de Mato Grosso.
Ana Carolina Silva de Faria1,7Marcos de Almeida Souza², João Xavier de Oliveira Filho³,
Fabiana Boabaid4, Raquel Aparecida Sales2, Mayara Inácio Vicenzi da Silva2, Edson Moleta
Colodel2, Luciano Nakazato3, Valéria Dutra1.
ABSTRACT – Faria A.C.S, Souza M.A, Oliveira Filho J.X, Boabaid F., Sales R.A., Silva M.I.V., Colodel E.M., Nakazato L., Dutra V., 2009. [Microbiological, molecular and pathology evaluation of pigs with increased articular and peri-articular fluids and / or lameness in intensive production systems of pigs in Mato Grosso State, Brazil]. Pesquisa Veterinária Brasileira. Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa s/n, Bairro Coxipó, Cuiabá/MT, 78068-900, Brazil. E-mail: [email protected] The main diseases of the locomotor pigs are multifactorial pathogenesis, mainly related to the conditions of management, facilities and the workforce. The aim of this study was to evaluate the article and peri-article of pigs who had clinical increase of articular volume and/or lameness through microbiological, molecular and pathology analysis in pigs from different Pig Production in Mato Grosso State. In each Intensive systems was held for examination and herd monitoring in clinical phases of maternity, nursery and growing/finishing. Members were collected from 43 animals. Microbiological evaluations, molecular (PCR) and pathological (gross and microscopic). In clinical examination 70% of animals showed abnormal walking and lameness. Macroscopic evaluation of articular cartilage was observed mainly: osteocondrose (81.4%), arthritis (39.53%) and hypertrophy of the synovial membrane (37.21%). During the molecular and microbiological evaluation, 29 (72.09%) were positive for at least one infectious agent. On microscopic evaluation, there was the presence OC (72.09%) mostly with different intensities. All areas showed retention of cartilage in the metaphyseal region with not mineralization of the columns of hypertrophic chondrocytes. The articular degenerative processes that are the main problem, being or not related with infectious processes, related to errors in management, installation and for the case of animals of rapid growth. INDEX TERMS: Pigs, locomotor, dysplasia, osteocondrose, arthritis
1 Laboratório de Microbiologia Veterinária - UFMT ² Laboratório de Patologia Veterinária - UFMT ³ Laboratório de Biologia Molecular Veterinária - UFMT 4 Setor de Patologia Veterinária - UFRGS
66
RESUMO
As principais enfermidades locomotoras dos suínos são de etiopatogenia multifatorial, relacionadas, principalmente, com as condições de manejo, instalações e de mão de obra. O objetivo deste estudo foi avaliar a região articular e peri-articular de suínos que apresentaram quadro clínico de aumento de volume articular e/ou claudicação através de análise microbiológica, molecular e patológica em suínos oriundos de diferentes Sistemas Intensivos de Produção de Suínos (SIPS) no Estado de Mato Grosso.Em cada SIPS realizou-se exame de rebanho e monitoria clínica nas fases de maternidade, creche e recria/terminação. Foram coletados membros de 43 animais. Foram realizadas avaliações microbiológica; molecular (PCR); e patológica (macro e microscópica). Ao exame clínico 70% dos animais apresentaram andar anormal e claudicação. Na avaliação macroscópica da cartilagem articular observou-se principalmente: osteocondrose (81,4%), artrite (39,53%), e hipertrofia da membrana sinovial (37,21%). Durante a avaliação microbiológica e molecular, 29 (72,09%) foram positivas para pelo menos um agente infeccioso. Na avaliação microscópica, observou-se a presença OC (72,09%) em sua maioria com diferentes intensidades. Todos os animais apresentaram áreas de retenção de cartilagem na região metafisária, caracterizada por não mineralização das colunas de condrócitos hipertróficos. Os que os processos degenerativos articulares são o principal problema, estando relacionados ou não com processos infecciosos, relacionado com erros de manejo, instalação e por se tratarem de animais de rápido crescimento. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Suínos, locomotor, displasia, osteocondrose, artrite
INTRODUÇÃO
As enfermidades no sistema locomotor causam um impacto econômico significativo
na suinocultura (HILL, 1990); devido a diversos fatores negativos como a redução no ganho
de peso, problemas reprodutivos, aumento do descarte e no número de condenações em
frigoríficos (BARCELLOS et al., 2008). As principais enfermidades locomotoras dos suínos
estão relacionadas a processos degenerativos e/ou infecciosos
(SOBESTIANSKY et al., 2007), havendo também a possibilidade de uma predisposição
genética (SERENIUS et al., 2001). A etiopatogenia é denominada como multifatorial, sendo
relacionadas principalmente com as condições de manejo, instalações e de mão de obra
(SOBESTIANSKY et al., 2007).
Distúrbios nutricionais e hormonais, alterações circulatórias e fatores genéticos
diminuem à resistência estrutural dos ossos, que em situações de trauma e/ou estresse
67
biomecânico podem desencadear as discondroplasias, em especial a osteocondrose (OC)
(THOMPSON, 2007). A OC pode ocorrer no complexo articular-epifiseal (CAE) e/ou placa
epifisária em animais de rápido crescimento. E de acordo com o estágio da lesão, sendo
denominado de osteocondrite dissecante (OCD), quando apresenta fissuras e/ou flaps na
cartilagem articular (WEISBRODE, 2008).
Os processos infecciosos articulares são caracterizados por reação inflamatória,
geralmente aguda, causando aumento de volume e andar anormal (THOMPSON, 2007). Os
microrganismos têm predileção pelos componentes articulares, e causam infecções com
maior freqüência em várias articulações, principalmente as sinoviais (NIELSEN, et al. 2001).
O objetivo deste estudo foi avaliar a região articular e peri-articular de suínos
apresentando quadro clínico de aumento de volume articular e/ou claudicação através de
análise microbiológica, molecular e patológica em suínos oriundos de diferentes Sistemas
Intensivos de Produção de Suínos (SIPS) no Estado de Mato Grosso.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado 06 SIPS de ciclo completo, totalizando cerca de 20.000 mil
suínos, no período de Junho 2007 a Dezembro de 2008 no Estado de Mato Grosso.
Em cada SIPS realizou-se exame de rebanho e monitoria clínica nas fases de
maternidade, creche e recria/terminação de acordo com a metodologia de
SOBESTIANSKY et al. (2007). Tendo como critério clínico o aumento de volume articular
e/ou claudicação.
Foram selecionados 43 animais, independente de sexo, linhagem, idade e/ou fase de
criação, realizada por funcionários de cada SIPS para exame individual e colheita de
amostras para exames laboratoriais. Este exame foi realizado priorizando-se o membro mais
severamente acometido; sendo avaliados e caracterizados quanto a presença de lesões
peri-articulares e/ou articulares. Posteriormente, os mesmos foram previamente
insensibilizados por eletrocussão e eutanasiados por sangria (AASV, 2009).
68
Para o exame microbiológico e molecular foram colhidas amostras de líquido e/ou
conteúdo semi-sólido a sólido na região peri-articular e/ou articular; e acondicionados em
seringas, suabes e/ou microtubos estéreis, mantidos sob refrigeração. Posteriormente,
encaminhados ao Laboratório de Microbiologia Veterinária (LMV) para isolamento
bacteriano, empregando-se a metodologia de Quinn et al. (1994); e ao Laboratório de
Biologia Molecular Veterinária (LBMV) para a identificação, através da reação em cadeia da
polimerase (PCR), dos principais agentes responsáveis por infecção articular em suínos:
Streptococcus suis (Chatellier et al., 1998); Streptococcus suis tipo 2 (Marois et al., 2004);
Erysipelothrix rhusiopathiae (Yamazaki, 2006); Mycoplasma hyosynoviae
(Ahrens et al., 1996); Haemophillus parasuis (Angen et al., 2007) e Brucella sp.
(Bricker e Halling, 1995).
Para o exame patológico, os ossos foram seccionados na epífise com serra manual
em seu plano sagital para exame macroscópico da cartilagem articular. Essa avaliação
consistiu no exame de sua superfície e área de corte, obedecendo aos critérios modificados
de KIRK et al. (2008): (1) erosão: diminuição de cartilagem articular; (2) ulceração: ausência
de cartilagem articular, com exposição do osso subcondral, incluindo formação de flaps; (3)
reparação: formação de tecido conjuntivo ou fibrocartilagem; (4) osteófitos: projeções
ósseas na cartilagem articular; (5) retração: protusão da cartilagem articular no osso
subcondral e (6) normal: sem alterações na cartilagem articular. As alterações foram
avaliadas de acordo com a intensidade e o tipo de reação observada: discreta (até 20% de
área da cartilagem articular) e acentuada (acima de 20% de área da cartilagem articular).
A realização do exame histopatológico baseou-se na utilização de fragmentos
ósseos que representassem a cartilagem articular, placa epifisária e osso trabecular
(epifiseal e metafiseal). Esses fragmentos foram acondicionados em formalina tamponada a
10%, e encaminhados ao Laboratório de Patologia Veterinária (LPV). No LPV, procedeu-se
a desmineralização óssea com ácido nítrico a 8%, sendo o processamento histotécnico
realizado de forma específica para os ossos; para avaliação microscópica foram realizadas
69
as colorações de Hematoxilina-Eosina (HE) e Tricrômico de Masson
(KAMMERMAN et al., 1992).
RESULTADOS
Durante o exame de rebanho, cerca de 70% dos animais em fase de
recria/terminação apresentaram andar anormal e claudicação; já nas fases de creche e
maternidade apresentaram 40% e 25%, respectivamente.
De acordo com a avaliação macroscópica, pode-se inferir que 35 (81,4%) animais
apresentaram alterações degenerativas (A, B, C, E) na cartilagem articular características de
osteocondrose, e destes, 5 (B) apresentaram lesões características de osteocondrite
dissecante (tabela 1). Na região peri-articular, observou-se abscessos (32,56%),
principalmente na musculatura; e nas articulações observou-se: artrite (39,53%) (prancha
1b); hipertrofia das vilosidades da membrana sinovial (37,21%); espessamento e edema da
cápsula articular (6,98%) e fraturas (6,98%). Sendo que algumas dessas alterações
ocorreram simultaneamente em um mesmo animal.
Tabela 1: Avaliação macroscópica da cartilagem articular de acordo
com critérios de A – F correlacionando com seu
grau de intensidade (discreta a acentuada) em suínos no
Estado de Mato Grosso.
Critérios Animais (%) Discreta (%) Acentuada (%)
A 19 (44,19) 11 (25,58) 8 (18,60)
B 5 (11,63) 3 (6,98) 2 (4,65)
C 7 (16,28) 5 (11,63) 2 (4,65)
D 0 (0) 0 (0) 0(0)
E 4 (9,30) 3 (6,98) 1 (2,33)
F 8 (18,60) - -
Total 43 (100)
Legenda: A: Erosão; B: Úlcera; C: Reparação; D: Osteófito;
E: Retração; F: Normal; Discreto: até 20% e Acentuado: Acima de 20%.
Das 43 amostras submetidas ao isolamento bacteriano e à técnica de PCR, 31
(72,09%) apresentaram pelo menos um agente infeccioso. Na bacteriologia, 29 (67,44%)
70
amostras foram positivas ao isolamento, isolando-se 50 colônias, sendo os principais
agentes: Arcanobacterium pyogenes (9), Streptococcus spp.(9) e Escherichia coli (8)
seguidos de Citrobacter sp (5), Enterobacter sp (5), Staphylococcus intermedius (4),
Acinetobacter sp (3), Candida spp (3), Staphylococcus aureus (2) e Staphylococcus hyicus
(2). Na avaliação molecular das 43 amostras, apenas 8 (18,60%) foram positivas,
identificando-se 14 agentes infecciosos, sendo os principais agentes: Mycoplasma
hyosynoviae (5) e Haemophillus parasuis (4), seguidos de Streptococcus suis (2),
Streptococcus suis tipo 2 (2) e Erisipelothirx rhusiopathiae (1).
As principais alterações histológicas observadas foram: OC (72,09%), incluindo
lesões de osteocondrite dissecante; osteomielite (25,58%), caracterizada por infiltrado
inflamatório que variou entre mononuclear, polimorfonuclear e misto (tabela 2) (prancha 1d).
Outras alterações observadas também foram artrose (13,95%), caracterizada a partir da
proliferação de tecido fibrovascular, com presença ou não de infiltrado inflamatório,
associado a ilhas de regeneração de condrócitos sobre a superfície articular; sinovite
(4,65%); bursite (2,32%) e 13,95% foram consideradas normais. Neste estudo verificou-se
que as lesões de osteocondrite dissecante foram caracterizadas por displasia no complexo
articular-epifiseal causando fissuras e áreas de retenção de cartilagem, devido à áreas de
necrose, possuindo ou não microfraturas nas trabéculas epifisárias. Todos os animais
apresentaram áreas de retenção de cartilagem na região metafisária, caracterizada por não
mineralização das colunas de condrócitos hipertróficos (prancha 1e e 1f) variando em
intensidade: discreta (39,53%); moderada (44,19%); e acentuada (16,28%); e com
distribuição: focal (30,23%); multifocal (13,95%); e difusa (55,81%). Também foi observado o
preenchimento do espaço intertrabecular com tecido fibroso em quantidades variáveis entre
os animais, acentuando-se conforme a intensidade da displasia metafiseal. Outras
alterações microscópicas significativas que apresentaram freqüência e intensidade variáveis
foram: irregularidade nas colunas de condrócitos tanto na zona proliferativa quanto
hipertrófica; condrólise e condroclasia; estrias eosinofílicas; áreas de retenção de
71
condrócitos hipertróficos, placa epifisária com formato de cone até fraturas fiseais
(prancha 1c); osteonecrose; e microfraturas trabeculares.
Tabela 2: Avaliação microscópica da osteocondrose e da osteomielite
apresentando critérios de determinação de distribuição e
intensidade em suínos no Estado de Mato Grosso.
Lesão N* Caracterização Intensidade N %
OC 31 discondroplasia
Discreto 9 29,03%
Moderado 9 29,03%
Acentuado 7 22,59%
OCD 6 19,35%
Osteomielite 11
Mononuclear (A – D)
Discreto - -
Moderado B 25%
Acentuado A, C, D 75%
Focal B 25%
Multifocal - -
Difuso A, C, D 75%
Polimorfonuclear (E – I)
Discreto - -
Moderado G 20%
Acentuado E, F, H, I 80%
Focal F, I 40%
Multifocal E, G 40%
Difuso H 20%
Misto (J – L)
Discreto - -
Moderado L 50%
Acentuado J 50%
Focal L 50%
Multifocal - -
Difuso J 50%
Legenda: * - (N) Número de animais com lesões; (n) número de animais com
lesões de acordo com sua intensidade
DISCUSSÃO
SOBESTIANSKY et al. (2004) afirmaram que matrizes com 160 a 250 dias de idade
apresentavam cerca de 30% de claudicação acentuada. BARCELLOS et al. (2008),
realizaram exame clínico em 428 matrizes e que apresentaram 90,4% de claudicação,
principalmente relacionada às lesões de cascos. KIRK et al. (2008) relataram rigidez nos
membros anteriores na região do cotovelo, indicativas de lesões de OC e/ou artrose.
72
De acordo com SOBESTIANSKY et al. (2004) as principais alterações peri-articulares foram:
hemorragias na musculatura adjacente às articulações; e fraturas completas na região no
colo da escápula, provocadas pela OC. JOHNSTON et al. (1987) descreveram 18 (34,61%)
animais com lesões de artrite infecciosa, caracterizada por erosão/ulceração da cartilagem
articular e hipertrofia das vilosidades sinoviais. Baseado na literatura, há poucos relatos
sobre a parte clínica em relação a claudicação e aumento de volume articular. Os poucos
relatos apresentam uma grande variação de resultados relacionados a este problema,
provavelmente isso se justifique às diferenças de idade, instalações, e de manejos.
JOHNSTON et al. (1987) avaliaram 52 articulações coletadas de carcaças com
poliartropatias em frigoríficos, e destas 21 (40,38%) apresentaram OC.
NAKANO e AHERNE (1992) relataram que 12 (75%) varrões com claudicações
apresentaram OC umeral severa; resultados semilares aos encontrados por Kirk et al.
(2008); ALTHAUS (2004) relatou que, dentre as lesões de OC, havia predominância de
úlcera e flap na cartilagem articular. ALTHAUS et al. (2005) relataram que 70% das artrites
observadas em frigoríficos estão relacionadas a processos não infecciosos;
ARNBJERG (2007) em seu estudo verificou 90% dos animais de terminação com
osteocondrose em avaliação radiográfica. Os resultados de nosso estudo são semelhantes
aos descritos acima, demonstrando que a OC é uma lesão freqüente e importante no
sistema locomotor de suínos, cabe ressaltar que pouco se conhece sobre o impacto da OC
nos aspectos da produtividade.
Na avaliação microbiológica, os resultados encontrados foram superiores aos
apresentados por Johnston et al. (1987) e Hariharan et al.(1992), que obtiveram 38% e 37%
de amostras positivas ao isolamento, respectivamente. Já BUTTENSCHON et al. (1995),
avaliaram 44 amostras de articulações de suínos considerados artríticos coletadas em
abatedouros na Dinamarca, no entanto, cerca de 70% destas foram consideradas estéreis.
Martínez et al. (2007) avaliaram 48 suínos portadores de lesões articulares e peri-articulares
condenados em frigoríficos, obtendo 87,5% de amostras positivas; e que o principal agente
isolado foi Arcanobacterium pyogenes em 75% dos casos. A elevada ocorrência de animais
73
com processos infecciosos na região articular e peri-articular neste estudo é explicada por
falhas de manejo, onde é realizado o corte na região articular com aumento de volume para
extravasamento de líquido, abrindo uma porta de entrada para a infecção (prancha 1a). E
em segundo lugar a falta de higiene e sistema contínuo de produção nas instalações das
diversas fases de criação.
ALBERTON (2007); WEISBRODE (2007); THOMPSON (2007); YTREHUS (2004);
KIRKY et al. (2008); WARDALE et al. (1994); NAKANO e AHERNE (1992) relataram
resultados semelhantes aos encontrados em nosso estudo. Os resultados microscópicos
confirmaram os achados macroscópicos, demonstrando que este é um bom parâmetro para
detecção de doenças locomotoras. Baseado nos achados microscópicos é importante
considerar o estágio de evolução da lesão, sem desconsiderar o quadro clínico para a
caracterização e diagnóstico de processos degenerativos e/ou infecciosos. Por outro lado,
GILLMAN et al. (2008), acompanharam 93 granjas com cerca de 6250 animais
apresentando 41,2% de bursite, sendo classificado com de etiologia não infecciosa,
provocada por processos traumáticos relacionados aos tipos de pisos. Os SIPS em nosso
estudo foram caracterizados como instalações de pisos sólidos, no entanto, pouco
abrasivos, provavelmente justificando a baixa ocorrência.
CONCLUSÃO
De acordo com os resultados pode-se inferir que os problemas locomotores possuem
uma freqüência de moderada a acentuada; e que os processos degenerativos articulares
são o principal problema desses SIPS, estando relacionados ou não com processos
infecciosos. Desse modo a manifestação clínico-patológica dos animais deste estudo é
justificada por diversos erros de manejo, instalação e por se tratarem de animais de rápido
crescimento.
74
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76
Prancha 1: Imagens macro e microscópicas de membros de suínos com aumento de volume e/ou claudicação.
Legenda: A) Membro anterior suíno, aumentado de volume com inúmeras perfurações para drenagem de líquido; B) Articulação femoro-tibial, exsudato fibrino-purulento com discreta hipertrofia de vilosidades da membrana sinovial; C) Placa epifisária, irregularidade em forma de cone, dilatação dos canais cartilaginosos, desorganização das colunas de condrócitos e áreas de fraturas, (hematoxilina e eosina, 20x); D) Placa epifisária, infiltrado inflamatório misto associada a intensa desorganização das colunas de condrócitos, (hematoxilina e eosina, 40x); E) Osso trabecular, falha na mineralização do matriz cartilaginosa – ossificação endocondral (tricrômico de Masson, 20x); F) Trabécula óssea, falha na mineralização da matriz cartilaginosa - ossificação endocondral (tricrômico de Masson, 40x)
77
Conclusões Gerais
O presente estudo confirma a importância das enfermidades do sistema
locomotor, e que possuem como principal etiologia fenômenos degenerativos
(osteocondrose) associados ou não a processos infecciosos, provavelmente relacionados
ao rápido ganho de peso, instalações, principalmente com relação ao piso, geralmente
em animais de crescimento/terminação. Os processos infecciosos foram relacionados
principalmente em animais de maternidade e creche, provavelmente ligados a questões
de manejo com recém nascido; No entanto foi constatada uma prática de manejo, onde
se perfurava as articulações com aumento de volume com o objetivo de se drenar
líquidos, criando porta de entrada para agentes infecciosos.
Um dado importante foi o número elevado de antimicrobianos resistentes
provavelmente, resultado do uso indiscriminado de antibióticos utilizados no tratamento
e no controle de doenças, porém, podem ser utilizadas práticas adequadas de manejo e
higiene para prevenir o aparecimento dessas enfermidades.
78
ANEXOS 1
2
1. ARTIGO SUBMETIDO À REVISTA CIÊNCIA RURAL 3
4
Prevalência de Streptococcus suis tipo 2 através da técnica de reação em cadeia da 5
polimerase em suínos abatidos no Estado do Mato Grosso. 6
Prevalence of Streptococcus suis type 2 by the polimerase chain reaction in 7
slaughtered pigs in the State of Mato Grosso. 8
9
Ana Carolina S. de FariaI, Daphine A. J. de PaulaI, Maria Cristina da SilvaI, 10
João X. de Oliveira FilhoI, Juçara T. de OliveiraI, Cristiane ChitarraI, Luciano 11
NakazatoI a & Valéria DutraI 12
13
RESUMO 14
Streptococcus suis é um patógeno que a afeta a produção industrial de suínos em 15
todo o mundo. É de extrema importância, pois está associado a doenças em suínos e 16
humanos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência do Streptococcus suis 17
tipo 2 em 201 amostras de tonsilas de animais clinicamente sadios a partir da técnica de 18
PCR. As amostras positivas para o S. suis tipo 2 foram submetidas à pesquisa do gene 19
codificador do fator extracelular (ef). Os resultados demonstraram que a prevalência 20
(23,38%) foi maior que outro estudo recentemente realizado no mesmo Estado, 21
demonstrando que a PCR é um método mais sensível em relação ao isolamento 22
bacteriano. Houve baixa ocorrência do gene ef* (1,49%) demonstrando uma grande 23
I – Laboratório de Microbiologia Veterinária, Hospital Veterinário, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), 78060900, Cuiabá, MT. Brasil. a- E-mail: [email protected]
79
importância para população analisada, pois cepas negativas são potencialmente menos 1
virulentas que cepas positivas. 2
Palavras-chave: Streptococcus suis tipo 2, PCR, ef, suínos. 3
4
ABSTRACT 5
Streptococcus suis is a pathogen that affects the industrial production of swine 6
worldwide. It is extremely important, because is associated with pigs and humans 7
diseases. The aim of this study was to determine the prevalence of Streptococcus suis 8
type 2 in 201 samples of tonsils from clinically healthy animals by the PCR technique. 9
The samples positive for S. suis type 2 were tested for the gene encoding extracellular 10
factors (ef). The results showed that the prevalence (23,38%) was higher than other 11
recent survey in the State, demonstrating that the PCR is a more sensitive method in 12
relation to the bacterial isolation. There was a low occurrence of ef* gene in samples 13
(1,49%) showing great importance to local swine population, because negative strains 14
are potentially less virulent that positive strains . 15
Key words: Streptococcus suis type 2, PCR, ef, pigs 16
17
INTRODUÇÃO 18
19
O Streptococcus suis é conhecido como um patógeno suíno de significância 20
clínica na maioria dos países com indústria suína intensiva (MAROIS et al., 2007). Este 21
patógeno está associado a doenças em suínos, tais como meningites, artrites, 22
pericardites, septicemia, pneumonia, morte súbita (MAROIS et al., 2007) e infecções 23
em seres humanos (GOTTSCHALK et al., 2007). 24
80
Baseado no polissacarídeo capsular, 35 sorotipos foram identificados 1
(1 ao 34 e ½) (CALDERARO et al., 2004; MAROIS et al., 2004; 2
BERTHELOT-HÉRAULT et al., 2005; COSTA et al., 2005; LARA et al., 2007), porém 3
estudos realizados por HILL et al. (2005) demonstraram que o sorotipo 32 e 34 podem 4
ser classificados como Streptococcus orisratti. O sorotipo 2 é o de maior prevalência 5
em muitos países (BOSCO et al., 2000; COSTA et al., 2005; 6
GOTTSCHALK et al., 2007), inclusive no Brasil, principalmente nas regiões sul e 7
sudeste (BARCELLOS et al., 1995; CALDERARO et al., 2004; COSTA et al., 2005; 8
LARA et al., 2007). 9
O habitat natural do S. suis é o trato respiratório superior, particularmente 10
tonsilas e cavidade nasal, bem como o trato genital e alimentar de suínos 11
(ROBERTSON et al., 1989; GOTTSCHALHK & SEGURA, 2000; LUN et al., 2007). 12
S. suis tipo 2 coloniza tonsilas palatinas de suínos clinicamente doentes e sadios, e é 13
transmitido por via nasal e oral (ARENDS et al., 1984). 14
O isolamento de S. suis para a identificação de animais portadores, a partir de 15
tonsilas é difícil devido a alta contaminação desse tecido (MAROIS et al., 2007). 16
Recentemente, tem-se utilizado o teste de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para 17
melhorar o diagnóstico de animais portadores desta bactéria com maior sensibilidade e 18
especificidade (WISSELINK et al., 1999). 19
Vários fatores de virulência têm sido descritos, tais como a cápsula 20
(SMITH et al., 1999, 2000), “muraminidase-released-protein” (mrp), fator protéico 21
extracelular (ef) (SMITH et al., 1992, 1997), suilisina (NORTON et al., 1999; 22
JACOBS et al., 1996) e adesinas ( DE GREEFF et al., 2002) e tem sido utilizado 23
através da metodologia de vacina reversa como potencial candidatos a vacinas 24
LIU et al. (2008). Amostras de sorotipo 2, positivo para os genes mrp e ef, são 25
81
associadas a maior virulência (BAUMS et al., 2007), sendo que outras variantes do 1
gene, ef*, são consideradas menos virulentas ou associadas a infecções em seres 2
humanos (SMITH, et al., 1993). 3
Tendo em vista esses fatores de virulência, o presente estudo objetivou determinar 4
a prevalência do S. suis tipo 2 com a presença do gene fator protéico extracelular (ef) 5
em tonsilas de suínos abatidos no estado do Mato Grosso através da Reação em Cadeia 6
da Polimerase (PCR), que é um método rápido e específico. 7
8
MATERIAL E MÉTODOS 9
10
Foram colhidas 201 amostras de tonsilas de suínos abatidos em três frigoríficos 11
com Serviço de Inspeção Federal, durante os períodos de junho de 2005 a abril de 2008, 12
oriundos de nove municípios de diferentes regiões do estado de Mato Grosso. Esta 13
amostragem foi baseada no programa EPI-Info 3.3.2 (DEAN, 2007), considerando os 14
seguintes parâmetros: número de animais abatidos no Estado durante o ano de 2006 15
(800.000) (ABIPECS, 2006); prevalência estimada de 10,27% (BOSCO et al., 2000); 16
precisão absoluta de 9% e intervalo de confiança de 95%. As tonsilas, uma vez colhidas, 17
foram armazenadas individualmente em sacos plásticos, identificadas e encaminhadas 18
em caixa isotérmica com gelo reciclável ao Laboratório de Microbiologia Veterinária 19
para os devidos processamentos. Para extração de DNA foi utilizado o protocolo 20
descrito por SAMBROOK e RUSSEL et al (2004). 21
Para a técnica de PCR foram utilizados os seguintes pares de oligonucleotídeos 22
iniciadores: 16S-195(s) (CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT) e 16S-489(as2) 23
(GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA), definido pela seqüência 16S rRNA 24
(CHATELLIER et al., 1998) originando produtos de 294pb; cps2J-s 25
82
(GTTGAGTCCTTATACACCTGTT) e cps2J-as CAGAAAATTCATATTGTCCACC), 1
que corresponde ao sorotipo 2, originando produtos de 459pb (MAROIS et al., 2004); 2
(GCTACGACGGCCTCAGAAATC) e (TGGATCAACCACTGGTGTTAC) para o ef 3
(WISSELINK, 1999). Este último origina 626pb, porém, pode também, amplificar 4
produtos com 1278, 1505, 2313, 2537 e 2993pb que determinam cinco variantes do 5
gene que codifica o ef*. 6
A PCR foi conduzida em um volume final de 25 µl. Cada reação conteve 20 ng de 7
DNA, solução tampão para PCR 10X (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 8
2,5 mM), 200 µM de cada dNTP, 3 mM de cloreto de magnésio, 1U de Taq DNA 9
polimerase e 25 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador. Os testes de PCR para 16S 10
rRNA e cps2J-s foram realizadas em 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 30s, 11
anelamento de primer a 60°C por 30s, e extensão a 72°C por 60s e para o gene ef foi 12
realizada em 40 ciclos de desnaturação a 94,8°C por 1 min., anelamento de primer a 13
57°C por 55s, e extensão a 72°C por 2 min e 72ºC por 10 min. Os produtos amplificados 14
foram fracionados em gel de agarose 2% e corado com brometo de etídeo por 1 h a 125 15
V e observados em transiluminador UV. Como marcador foi utilizado Ladder de 16
tamanho molecular padrão 100 pares de base (Eurogentec, Angers, France). 17
18
RESULTADOS E DISCUSSÃO 19
20
Das 201 amostras testadas, 118 (58,70%) amplificaram o gene 16S rRNA. 21
Dentre o total das amostras, 47 (23,38%) amplificaram o gene capsular (cps2j) que 22
corresponde ao sorotipo 2 e, 3 (1,49%) amplificaram o gene que corresponde ao ef. Não 23
foram encontradas amostras positivas para o ef*. 24
83
Nos municípios analisados, as porcentagens de amostras positivas para o gene 1
16S rRNA variam de 36,36% a 85,71%. Observou-se que o S. suis tipo 2 está presente 2
em todos os municípios estudados em uma taxa percentual que varia de 16,67% a 60%. 3
O presente trabalho obteve uma prevalência superior à encontrada por 4
OLIVEIRA (2008) em estudo realizado neste mesmo Estado, utilizando-se a técnica de 5
isolamento bacteriano. Essa maior prevalência pode ser explicada devido à dificuldade 6
no isolamento da bactéria estudada, pois o local de colonização do S. suis é 7
muilti-infectado (MAROIS et al., 2007). Outro fator seria a alta sensibilidade e 8
especificidade da técnica de PCR realizada em tonsilas de suínos 9
(WISSELINK, et al., 2002) quando comparada com o isolamento bacteriano na mesma 10
amostra, além do fato de ser muito mais rápida de executar (WISSELINK, et al., 1999). 11
SWILDENS et al. (2005), ao estudar suínos abatidos na Holanda, detectaram 12
18% de amostras positivas para S. suis tipo 2 através da PCR. Na França, MAROIS, et 13
al (2007), utilizando a PCR, encontram S. suis tipo 2 em 71% das tonsilas e 81% de 14
swabs tonsilares de animais clinicamente doentes. Destas mesmas amostras foram 15
realizadas culturas, obtendo-se resultados positivos em 57% e 72%, respectivamente. 16
LARA et al. (2007), descreveram em Santa Catarina (SC) uma prevalência de 17
55,88% em lotes portadores. O resultado é superior ao encontrado no presente estudo. 18
Isso pode ser explicado pelo fato de que SC apresenta uma suinocultura mais antiga 19
(BARCELLOS et al, 1995) e também pelo tipo de sistema de criação (ciclo completo) 20
predominante em Mato Grosso, que é um outro fator a ser considerado já que, segundo 21
OLIVEIRA (2008), isso também influenciaria no nível sanitário do rebanho. 22
MARTINEZ et al. (2003), analisaram amostras de swabs de animais doentes de 23
3 diferentes estados brasileiros. Das amostras isoladas foram detectadas pela técnica de 24
PCR multiplex amostras positivas para o gene ef*. CALDERARO et al. (2004), 25
84
encontraram 72,2% de amostras positivas para ef e 20,3% para ef* de amostras 1
brasileiras de S. suis isoladas de 7 diferentes estados também de animais doentes. Esse 2
resultado é bem superior ao encontrado neste estudo, o que pode ser considerado como 3
um fator importante, pois as cepas ef positivas são potencialmente mais virulentas que 4
cepas negativas (GOTTSCHALK & SEGURA, 2000). Outro fator a ser considerado é a 5
diferença de animais estudados, já que neste estudo foram utilizados animais sadios. 6
7
CONCLUSÃO 8
9
A prevalência de S. suis tipo 2 em suínos sadios no Estado de Mato Grosso foi 10
superior a outros estudos realizados, no qual foi utilizado a técnica de isolamento 11
bacteriano, com a presença de amostras positivas para o fator ef em suínos sadios no 12
Estado de Mato Grosso. Isto justifica a realização de outros estudos para detecção de 13
mais fatores de virulência que podem acarretar prejuízos na atividade suinícola. 14
15
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89
2. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA – Método Isoticianato de guanidina
1. Reservar 200ml do líquido coletado;
2. Acrescentar 1000ml de tampão de lise e 40ml da suspensão carreadora;
3. Agitar em vortex até total homogeneização;
4. Centrifugar a 10000 rpm durante 4 minutos;
5. Desprezar o sobrenadante;
6. Adicionar 500ml de tampão de lavagem;
7. Agitar em vortex até total homogeneização;
8. Centrifugar a 10000 rpm durante 2 minutos;
9. Desprezar o sobrenadante;
10. Repetir as etapas 6, 7 8 e 9;
11. Adicionar 1000ml de etanol 70%;
12. Repetir as etapas 7,8 e 9;
13. Repetir as etapas 11 e 12;
14. Adicionar 500ml de acetona PA
15. Centrifugar a 10000 rpm durante 2 minutos
16. Desprezar o sobrenadante
17. Secar o pellet em estufa a 37°C durante 20 minutos;
18. Adicionar 150ml de tampão de eluição;
19. Agitar em vortex até total homogeneização;
20. Colocar em banho-maria a 60ºC durante 10 minutos;
21. Agitar em vortex até total homeneização;
22. Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos;
23. Recolher o sobrenadante;
1.1. PREPARO DAS SOLUÇÕES
Tampão de Lise
- 120gr de Isoticianato de Guanidina;
- 11,2mL de TRIS-HCL 0,1M pH6,4;
- 8,8mL de EDTA 0,5M pH7,5;
- 1mL de Triton x100;
90
Tampão de Lavagem
- 120gr de Isoticianato de Guanidina;
- 100mL de TRIS-HCl 0,1M pH6,4;
Solução Carreadora
- 4gr de areia diatomácea;
- 283µl de HCL
- 19,8µl de água
Tampão de Eluição
- 10mM TRIS-HCL pH7,5;
- 1mM EDTA;
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