Bibliotecas de Fragmentos para Inferência de

Estruturas de Proteínas

Tiago Edmundo Ribeiro BritoOrientadora: Katia S. Guimarães

Mestrado em Ciência da Computação

Roteiro

• Proteínas e sua Importância• Estruturas das Proteínas• Determinação da Estrutura 3-D• Bibliotecas de Fragmentos• Trabalho Proposto• Conclusões

Proteínas• Proteínas são polímeros cuja unidade básica é o aminoácido.

• São os principais e mais abundantes componentes orgânicos da célula, participando das estruturas celulares e dos processos bioquímicos da fisiologia celular.

Estruturas das Proteínas• Níveis Estruturais

– Est. Primária (Seqüência de Aminoácidos)– Est. Secundária (Arranjos Recorrentes dos R)– Est. Terciária (Conformação 3-D)

• Função x Forma 3-D

Determinação da Est. 3-D

• Métodos Experimentais:– Cristalografia – Ressonância Magnética Nuclear– Extremamente precisos, porém caros e instáveis

• Métodos Teóricos:– Homologia ou Modelagem Comparativa (tradicional)– Bibliotecas de Fragmentos (nova tendência)

Homologia• Baseia-se na comparação entre as proteínas-

alvo e outras cuja estrutura já seja conhecida– Alinhamento entre proteínas homólogas e o alvo– Verificação de proximidades locais– Construção e validação do modelo total

• Desvantagens– Requer pesquisa de proteínas homólogas– Processo iterativo, com aplicação de restrições ao

final de cada passo

Bibliotecas de Fragmentos• Baseia-se na construção de conjuntos de fragmentos

representativos de proteínas– 1986, Jones et al.: o backbone das proteínas é composto

de estruturas repetidas (4 a 10 resíduos)• Dificuldade

– Infinitas possibilidades de conformação entre dois fragmentos

• Solução– Usar forte restrição na conformação

Bib. Fragmentos - Motivação• Breve histórico estrutural das proteínas:

– Há quase 50 anos, as hélices e fitas foram descritas por Corey & Pauling.

– Dez anos mais tarde, os ângulos de torção e , permitidos a cada resíduo na interação das ramificações laterais com a cadeia principal, foram definidos por Ramachandran

– Em 1986 - Jones & Thirup detectam que quase todas as regiões do backbone da proteína são formadas por estruturas canônicas repetidas.

– Posteriormente, Unger et al. classificaram as unidades peptídicas, formadas de 4 a 10 resíduos, da cadeia principal das proteínas numa coleção de fragmentos. Nível intermediário de representação das estruturas das proteínas (entre a estrutura primária e a secundária).

Bib. Fragmentos - Motivação• Mesmo utilizando os ângulos de torção para restringir o

grau de liberdade, a cadeia de uma proteína pode ter um número infinito de diferentes conformações.

• Restringir a conformação local dos resíduos para um número limitado de estados pode ajudar na discretização da conformação da proteína, reduzindo o número de possíveis arranjos espaciais.

• Logicamente, a utilidade deste tipo de modelo depende da exatidão com que ele modela a conformação real da proteína bem como sua complexidade, o número de possíveis estados de cada resíduo.

Bib. Fragmentos – Princípio

• Encontrar um conjunto finito de fragmentos de proteínas que possam ser utilizados para aproximar a conformação espacial de qualquer proteína com boa precisão.

Bib. Fragmentos – Etapas

• I – Conjunto de Treinamento• II – Construção das Bibliotecas• III – Modelagem do Alvo• IV – Validação do Modelo

Bib. Fragmentos – Etapa I

• Conjunto de Treinamento– Seleção das proteínas que darão

origem às bibliotecas– Fragmentação com escolha do

comprimento dos fragmentos

Bib. Fragmentos – Etapa II

• Construção das Bibliotecas– Agrupamento dos fragmentos mais

representativos através de clustering – Escolha de uma das técnicas

existentes• Uso de uma métrica de comparação

entre fragmentos

Bib. Fragmentos – Etapa III

• Modelagem do Alvo– A partir de uma biblioteca, modela-se

a estrutura da proteína-alvo, semelhante à montagem de um quebra-cabeças

– Aplicação de restrições

Bib. Fragmentos – Etapa IV

• Validação do Modelo– Comparação com o modelo real

(testes) – Uso de softwares específicos

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Estudo exaustivo com bibliotecas de fragmentos de comprimento variando de 4 a 7 resíduos. (Cientistas da Univ. de Stanford)

• A exatidão das representações discretas depende da sua complexidade e varia de 1.9Å para um modelo de 4 estados e fragmentos de tamanho 7 até 0.76Å para um modelo de 15 estados e fragmentos de tamanho 5.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Para a fase inicial de clustering um conjunto de proteínas do PDB, com os dados estruturais mais confiáveis, serviu como conjunto de dados inicial (tabela 1).

• Deste conjunto de proteínas foram extraídos quatro conjuntos de treinamento de fragmentos de backbone de proteínas. Estes conjuntos de treinamento diferiam no comprimento dos fragmentos que variava de 4 a 7 resíduos. O número de fragmentos em cada conjunto foi 8949, 7123, 5910, 5029 para comprimentos de 4, 5, 6 e 7 resíduos, respectivamente.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Antes da aplicação da técnica de clustering duas observações a respeito dos dados do conjunto de testes precisam ser ressaltadas: os fragmentos considerados fora do padrão e a grande quantidade de fragmentos hélice .– Os primeiros são aqueles cujo desvio cRMS em relação a

todos os outros é relativamente alto. De acordo com um limiar, estes fragmentos são removidos. Cerca de 10% são descartados com os seguintes valores de limiar: 0.074Å, 0.307Å, 0.487Å e 0.755Å, para conjuntos de de comprimento 4, 5, 6 e 7 resíduos, respectivamente.

– A grande quantidade de fragmentos contendo hélices dificulta a rotina de clustering.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• A similaridade estrutural entre dois fragmentos é medida através do desvio cRMS entre os átomos Cα, após superposições usando mínimos quadrados.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Técnica de clustering: Simulated annealing k-means. – Indicado para vários problemas de clustering utilizando dados

biológicos com distribuição desconhecida e desigual dos objetos. – derivada da k-means pelo melhoramento do conjunto de

centroids.– O k-means clustering é executado repetidas vezes

mesclando dois conjuntos e dividindo outro.• Os conjuntos a serem mesclados são selecionados

aleatoriamente, sendo que os conjuntos mais próximos têm maiores chances de ser selecionados.

• O conjunto a ser dividido também é selecionado aleatoriamente, sendo que conjuntos dispersos têm mais chances de ser escolhidos.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Várias funções diferentes foram testadas na atribuição de uma pontuação a cada conjunto e a escolhida (melhores resultados) foi a variância total do conjunto (soma de todos os quadrados das distâncias dos fragmentos em relação ao elemento principal do conjunto - centroid).

• O número de conjuntos desejado é um parâmetro para a rotina de clustering.

• O método utilizado é melhor que o seu antecessor pois lida melhor com altas concentrações de fragmentos (grande quantidade de hélices ) e por ser indiferente à escolha inicial dos elementos centrais dos conjuntos.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Esta técnica é ainda um pouco melhor que o método de clustering hierárquico (cujo tempo de execução é muito maior) que mescla os conjuntos em baseando-se na distância máxima entre quaisquer dois membros de conjuntos diferentes.

• O resultado da aplicação da técnica de clustering é compilado em bibliotecas, pequenos conjuntos de fragmentos representativos de proteínas. As bibliotecas são representações dos conjuntos e são constituídas pelos elementos centrais dos mesmos (o fragmento com a mínima soma dos desvios cRMS relativo a todos os outros fragmentos do conjunto).

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Muitas execuções da rotina de clustering são realizadas

(variando o número de conjuntos e o comprimento dos fragmentos). Cada execução inicia-se com 50 diferentes elementos centrais (sementes) aleatórias e, ao final, escolhe a melhor biblioteca com a mínima pontuação de variância total.

• Como os fragmentos agrupados são utilizados para construir bibliotecas representativas de todos os fragmentos do conjunto de treinamento, é esperado que resultem em boas bibliotecas, representando também todos os motifs encontrados nas proteínas reais. Para mensurar a qualidade de uma biblioteca são usados o local e o global fits (ajustes), obtidos a partir da aproximação da estrutura das proteínas do conjunto de testes (independente do conjunto de treinamento).

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Local-fit: medida de quão bem a biblioteca modela a conformação local de todas as proteínas no conjunto de testes. – Cada proteína é desmembrada num conjunto de

fragmentos de tamanho específico f. Cada fragmento da proteína é associado a um fragmento da biblioteca que contenha o melhor valor do cRMS.

– O local-fit é a média dos valores dos cRMS de todos os fragmentos aproximados.

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Global-fit, é a medida de quão bem uma biblioteca modela a

conformação tridimensional global de todas as proteínas do conjunto de testes.– Uma forma de construir estruturas tridimensionais contíguas a

partir das bibliotecas de fragmentos é concatenar os fragmentos de bibliotecas com melhores local-fit citados anteriormente.

– Superpondo o primeiro átomo C de cada fragmento com o último átomo C do fragmento anterior, torna-se necessário especificar a orientação dos dois fragmentos. Isso pode ser feito pela especificação os ângulos de torção e .

– Porém, em muitos casos, estes ângulos podem assumir uma grande combinação de valores.

Bib. Fragmentos – Est. Caso– A solução encontrada foi utilizar o chamado global-fit

aproximado, onde a posição de um fragmento é determinada pela superposição dos seus três primeiros C com os três últimos do fragmento anterior (Exemplo 2-D na figura 6).

– Esta abordagem discretiza o espaço de todas as aproximações construindo uma relação de um para um entre uma sequência de fragmentos e sua representação tridimensional.

• Enquanto o melhor local-fit pode ser facilmente calculado, a sequência de fragmentos de biblioteca necessários para o global-fit é muito mais difícil de encontrar.

• A sequência ótima de fragmentos de biblioteca deve definir a estrutura 3-D com o mínimo desvio cRMS em relação à estrutura real da proteína alvo.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Conjunto de teste de proteínas utilizado por Park & Levitt. Inclui 145 proteínas com diferentes estruturas de motifs, de comprimentos variáveis entre 36 e 753 resíduos. (Tabela 1, identificadores do PDB das 145 proteínas).

• Facilidade na comparação e extensão dos resultados obtidos em relação aos dois autores citados.

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Tabela 2 mostra os melhores valores do local-fit.• A figura 1 mostra os dados da tabela 2 em função da

complexidade das bibliotecas. Os fragmentos das proteínas do conjunto de teste podem ser descritos satisfatoriamente por qualquer das bibliotecas consideradas (desvio abaixo de 1Å em todos os casos).

• Para bibliotecas cujos fragmentos têm o mesmo tamanho, a exatidão do local-fit aumenta junto com a complexidade.

• Para bibliotecas que possuem a mesma complexidade, a exatidão do local-fit aumenta com a diminuição do número de resíduos dos fragmentos (Menor número de átomos C).

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Tabela 2 mostra também os valores do global-fit.• A figura 2 mostra os dados da tabela 2 em função da

complexidade das bibliotecas. A média do global-fit no conjunto de testes varia de 2.58 Å, para a complexidade mais baixa, até 0.76 Å para a biblioteca de complexidade mais alta.

• Para fragmentos que têm o mesmo tamanho, bibliotecas mais complexas oferecem uma melhor aproximação pelo global-fit.

• Para uma mesma complexidade, bibliotecas cujos fragmentos têm maior comprimento resultam numa melhor aproximação do global-fit.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• Figura 4 mostra a média do desvio cRMS das aproximações local-fit versus a mesma medida das aproximações global-fit.– O local-fit é sempre menor que o cRMS global-fit

correspondente. Isto já era esperado, pois o local-fit ignora a ligação entre fragmentos adjacentes ao longo da cadeia.

– Desta forma, pode-se utilizar o local-fit na estimativa do global-fit. É possível perceber também que, para um mesmo nível de global-fit, o local-fit decresce com o comprimento do fragmento.

Bib. Fragmentos – Est. Caso

• A dependência da exatidão das aproximações em relação ao comprimento das proteínas aproximadas. – Foram considerados os desvios cRMS da melhor

aproximação local-fit e da melhor aproximação global-fit versus o comprimento do polipeptídio.

– A exatidão da aproximação local-fit é independente do comprimento da cadeia.

– Já as aproximações global-fit são ligeiramente dependentes do comprimento da cadeia (os dados não foram exibidos).

• Exemplo de aproximações na figura 5.

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Nas aproximações feitas com as bibliotecas de fragmentos o

global-fit varia de 2.9 Ǻ até 0.76 Ǻ com complexidades de 2.66 a 15 estados por resíduo, respectivamente.

• Os modelos resultantes da aproximação da estrutura das proteínas utilizando tais bibliotecas são úteis para: – predição de estruturas, – ajustes de loops, – enumeração exaustiva de conformações de peptídeos e– determinação de estrutura de baixa resolução através de

ressonância nuclear magnética (nuclear magnetic ressonance - NMR) ou critalografia de raio-X.

Bib. Fragmentos – Est. Caso• Resultados ainda melhores são esperados com a utilização de

bibliotecas de fragmentos de tamanho 6 ou 7. • Porém, para construção de tais bibliotecas uma grande

quantidade de dados de coordenadas de proteínas é necessário. Aqui, são utilizadas bibliotecas de 250 fragmentos de comprimento 7 que apresentam uma complexidade de 1.91 Å. Para atingir 1 Å seria necessário uma complexidade em torno de 8 e 84 = 4096 fragmentos (futuro, com o crescimento na determinação das estruturas das proteínas).

Proposta de Trabalho• Construir e analisar diferentes tipos de

bibliotecas de fragmentos • Objetivo principal:

– Determinar parâmetros ideais para aproximação de estruturas de proteínas

– Variações serem testadas• Métrica de similaridade• Técnicas de clustering• Comprimento dos resíduos• Tamanho das bibliotecas

Conclusões

• Técnicas computacionais x Distância entre seqüências e estruturas 3-D

• Uso de bibliotecas de fragmentos– técnica mais rápida e tão precisa quanto a modelagem

comparativa• Proposta

– Necessidade de aprofundamento e estabelecimento de parâmetros ideais na aplicação da nova técnica

Referências• HOLMES, J. Bradley and TSAI, Jerry. Protein Science.

2004, 13, P. 1636-1650.

• KOLODNY, Rachel; KOEHL, Patrice; GUIBAS, Leonidas and LEVITT, Michael. Journal of Molecular Biology. 2002, 323, P. 297-307.

Bibliotecas de Fragmentos para Inferência de

Estruturas de Proteínas

Tiago Edmundo Ribeiro Brito<terb@cin.ufpe.br>

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