Bioinformática Estrutural - biocristalografia.df.ibilce ... · que é fortemente influenciado pela limitação das estruturas disponíveis na base de dados estruturais, que tendem

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© 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

Bioinformática Estrutural

Modelagem Molecular

Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

© 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

Bioinformática Estrutural

Resumo Previsão da estrutura secundária Modelagem molecular PARMODEL DBMODELING Bioinformática na era pós-genoma Referências

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Previsão de estrutura secundária

wfdaj.sites.uol.com.br © 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.



Introdução. É possível prever a estrutura secundária de peptídeos e proteínas a partir da estrutura primária. Há diversas abordagens e algoritmos, normalmente a taxa de sucesso desses algoritmos não ultrapassa 80 %, quando comparada com estruturas resolvidas por cristalografia por difração de raios X e ressonância magnética nuclear. Para ilustrar as principais características desses algoritmos descreveremos o algoritmos Chou e Fasman (1978, 1989), que apesar de obsoleto descreve os aspectos fundamentais de boa parte dos algoritmos de previsão de estrutura secundária de proteínas.

MIAALTKAAIKKTEALLAKIWYLK

Algoritmo de previsão

Fonte: Chou, P.Y., Fasman, G.D. (1978). Empirical predictions of protein conformations. Annu. Rev. Biochem, 47, 251-276.



Algoritmo de Chou e Fasman. Esse algoritmo baseia-se nas informações disponíveis sobre a estrutura tridimensional de proteínas disponíveis em base de dados com o PDB. A partir de uma análise estatística das tendências de formação de hélice e fitas das aminoácidos contidos nas estruturas resolvidas depositadas no PDB é determinada propensão dos aminoácidos de adotarem uma determinada estrutura secundária. É estabelecida um janela de um certo número de aminoácidos, por exemplo 4, e determina-se qual a propensão para o trecho, segue-se na cadeia e quando há mudança na propensão há mudança na indicação da estrutura provável para o trecho da cadeia do peptídeo ou proteína.

Fonte: P.Y. Chou: "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Compositions". p 549-586 in the Fasman's 1989 book: G.D. Fasman: "Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation", Plenum, New York 1989.



Algoritmo de Chou e Fasman. No método são usados conjuntos de parâmetros que refletem a média da propensão de um dado aminoácido adotar hélice alfa <Palfa>, fita beta <Pbeta> ou laços <Pturn>. A propensão de um dado aminoácido formar hélice é determinado a partir da fração molar que este aminoácido apresenta em hélice a partir da análise da base de dados estruturais. O parâmetro χalfa, i representa a ocorrência do aminoácido i em hélice dividido pela a ocorrência total desse aminoácido na base de dados. Assim temos que a propensão de um dado aminoácido estar em hélice como dado pela equação:

<Palfa> = χalfa, i/<χalfa>

onde <χalfa> é a média de χalfa, i para todos os 20 aminoácidos naturais.

De forma similar são determinados os <Pbeta> e <Pturn> .Fonte: P.Y. Chou: "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Compositions". p 549-586 in the Fasman's 1989 book: G.D. Fasman: "Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation", Plenum, New York 1989.



Algoritmo de Chou e Fasman. Na forma de algoritmo o método de Chou e Fasman tem a seguinte implementação.

4. Leitura da sequência de aminoácido;

6. Determinar os valores das propensões, a partir da tabela de Chou e Fasman (próximo slide);

8. Procurar por trechos com um certo número de aminoácidos em hélice, ou fita beta ou laço;

10. Atribuir a estrutura secundária conforme a propensão média em cada trecho;

12. Resolver conflitos.



Glicina 0,57 0,75 1,56

Alanina 1,42 0,83 0,66

Serina 0,77 0,75 1,43

Treonina 0,83 1,19 0,96

Cisteina 0,70 1,19 1,19

Valina 1,06 1,70 0,50

Isoleucina 1,08 1,60 0,47

Leucina 1,41 1,30 0,59

Prolina 0,57 0,55 1,52

Fenilalanina 1,13 1,38 0,60

Tirosina 0,69 1,47 1,14

Metionina 1,45 1,05 0,60

Triptofano 1,08 1,37 0,96

Asparagina 0,67 0,89 1,56

Glutamina 1,11 1,10 0,98

Histidina 1,00 0,87 0,95

Aspartato 1,01 0,54 1,46

Glutamato 1,39 1,17 0,74

Lisina 1,14 0,74 1,01

Arginina 0,98 0,93 0,95

Propensão de formação de hélice, fitas e laços (Chou e Fasman, 1978).

Aminoácido Palfa Pbeta Pturn Aminoácido Palfa Pbeta Pturn



Algoritmo de Chou e Fasman. O algoritmo de Chou e Fasman tem uma taxa de acertos relativamente baixa, por volta de 50 %, quando comparado a métodos mais modernos que atingem margens próximas a 75 %. Um dos problemas do método e que é fortemente influenciado pela limitação das estruturas disponíveis na base de dados estruturais, que tendem a ter influência na facilidade que certas famílias de proteínas têm em serem resolvidas. O algoritmo de Chou e Fasman tem uma taxa de acertos relativamente baixa, por volta de 50 %, quando comparado a métodos mais modernos que atingem margens próximas a 75 %. Um dos problemas do método e que é fortemente influenciado pela limitação das estruturas disponíveis na base de dados estruturais, que tendem a ter influência na facilidade que certas famílias de proteínas têm em serem resolvidas, o que acaba criando concentração de informações estruturais em determinadas famílias de proteínas, enquanto outras, por serem apresentarem dificuldade em cristalizar não apresentam informação estrutural.



Aplicação do algoritmo de Chou e Fasman. Para ilustrar o método vamos prever a estrutura secundária do peptídeo mastoparano. A sequência apresenta 14 resíduos de aminoácidos.

Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu

<Palfa> 1,08-0,67 -1,41 -1,14 -1,42 -1,41-1,42 -1,42-1,41 -1,42-1,14-1,14 -1,08-1,41

<Pbeta> 1,60-0,89 -1,30 -0,74 -0,83 -1,30- 0,83 -0,83 -1,30-0,83-0,74-0,74-1,60-1,30

<Pturn> 0,47-1,56- 0,59 -1,01- 0,66- 0,59- 0,66- 0,66- 0,59- 0,66-1,01-1,01-0,47-0,59

Hélice alfa



Aplicação do algoritmo de Chou e Fasman. A estrutura desse peptídeo foi resolvida por RMN (Hori et al., 2001). A figura abaixo mostra sua estrutura tridimensional, que como prevista é helicoidal.

Referência:Hori, Y., Demura, M., Iwadate, M., Ulrich, A. S., Niidome, T., Aovagi, H., Asakura, T. Interaction of mastoparan with membranes studied by 1H-NMR spectroscopy in detergent micelles and by solid-state 2H-NMR and 15N-NMR spectroscopy in oriented lipid

bilayers. Eur.J.Biochem. v268 pp.302-309 , 2001

C

Código de acesso PDB: 1D7N



Outros algoritmos de previsão de estrutura secundária. O uso do algoritmo de Chou e Fasman tem uma taxa de acerto de aproximadamente 50 %, métodos mais recentes de previsão de estrutura secundária, como o PSIPRED (Bryson et al., 2005), PROFphd(Rost et al., 1994), SSpro (Pollastri et al., 2002) atingem níveis de acerto de ate 77 %. Muitos desses métodos fazem uso de redes neurais para previsão da estrutura secundária, contudo nenhum deles apresentam resultados positivos acima de 80 %.

Referências:Bryson, K., McGuffin, L. J., Marsden, R. L., Ward, J. J., Sodhi, J. S. & Jones, D. T. (2005) Protein structure prediction servers at University College London. Nucl. Acids Res. 33(Web Server issue):W36-38. Rost, B., Sander, C. and Schneider, R. (1994) PHD--an automatic mail server for protein secondary structure prediction. Comput Appl Biosci 10:53-60.Pollastri G, Przybylski D, Rost B, Baldi P. Improving the prediction of protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles.Proteins. 2002; 47(2):228-35.



Uso do PSIPRED. Para comparação usaremos o servidor wev PSIPRED (Bryson et al., 2005) na previsão da estrutura secundária do peptídeo mastoparano. O PSIPRED está disponível no site: http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html .

http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html

http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html



Uso do PSIPRED. A interface de entrada do servidor web do PSIPRED está mostrada ao lado. Para usá-la basta inserirmos a sequência de aminoácidos do peptídeo o proteína que queremos identificar a estrutura secundária.



Uso do PSIPRED. Inserimos a sequência de aminoácidos do mastoparano na janela indicada com código de uma letra para cada aminoácido. Após inserirmos a sequência escolhemos a opção de predição, no caso PSIPRED 2.5. Há ainda opções de filtragens e por último a colocação do e-mail do usuário.



Uso do PSIPRED. Depois clicamos “predict”. O resultado será enviado via e-mail para o usuário.



Uso do PSIPRED. O resultado do PSIPRED corrobora a previsão do método de Chou e Fasman.

Modelagem Molecular



Algoritmo

A modelagem molecular por homologia, baseia-se no princípio que uma proteína, que apresenta identidade sequencial superior a 30 %, com outra proteína, compartilhará o mesmo enovelamento. A partir desse princípio podemos usar a estrutura tridimensional de um proteína, para modelar a estrutura tridimensional de uma que não apresenta estrutura resolvida. A abordagem desse problema admite diversas implementações, uma das mais utilizadas é a do MODELLER (Sali & Blundell, 1993), que usa o conceito de restrições espaciais. Parâmetros estruturais de um molde, são usados como guia para a modelagem.


Algoritmo

A modelagem por homologia pode seguir o algoritmo mostrado à direita. Nesta abordagem o usuário seleciona um molde para a modelagem, é iniciado o alinhamento do molde com a sequência a ser modelada, para posteriormente ser construído o modelo. O modelo construído é avaliado, caso satisfaça a uma condição padrão é considerado adequado, caso contrário é selecionado outro molde, se possível. O processo de modelagem permite que sejam selecionados diferentes conjuntos de parâmetros estruturais a serem na montagem de modelos distintos.

Início

Identificação de moldes

Seleção de moldes

Alinhamento

Construção domodelo

Avaliação do modelo

Modelo OK?

Fim

Sim

Não

Início


Seleção de moldes

Alinhamento



Modelo OK?

Fim

Sim

Não


Algoritmo

O algoritmo do PARMODEL usa uma implementação paralela do MODELLER, o que permite automatizar o processo de modelagem usando programação de grão grosso, onde as modelagem são divididas entre os nós de um cluster de computadores do tipo Beowulf. Cada modelagem usa um conjunto distinto de restrições espaciais, o que permite varrer diversas condições iniciais, gerando modelos distintos para a mesma sequência, sem contudo ocorrer uma mudança drástica na estrutura. Podemos obter modelos com melhor qualidade estereoquímica, variando-se as restrições espaciais.

Último modelo ?

Não Selecionao melhormodelo

Fim

Sim

Uchoa et al., BBRC (2004)Silveira et al., J. Mol. Mod. (2005)


Algoritmo do Parmodel

A paralelização obtida com o PARMODEL permite que diversos modelos sejam gerados simultaneamente, o número de modelos é escolhido pelo usuário. Cada nó do cluster gera uma carga aproximadamente igual de modelos, que são testados no final. O melhor modelo é enviado ao usuário.

Início


Seleção de moldes

Alinhamento



Modelo OK?

Sim


Computação Paralela

O diagrama esquemático ao lado ilustra a arquitetura básica de um cluster de computadores. Esse cluster é dividido em diferentes nós, sendo cada nó uma CPU. Esses nós estão interconectados ao um nó central chamado de “front end”, responsável pelo gerenciamento dos processos em execução no cluster.

Computação Paralela


A figura ao lado mostra 2 clusters do tipo Beowulf usados para modelagem molecular por homologia. O programa PARMODEL, para modelagem molecular por homologia, está instalado no clusterda direita.

PARMODEL



Página de entrada do PARMODEL. O PARMODEL é um servidor web dedicado à modelagem molecular por homologia e análise da qualidade estrutural de modelos de proteínas. Clicando-se na opção “parmodel modeling” temos acesso à página de entrada para modelagem molecular por homologia on-line. A interface do PARMODEL é simples e intuitiva, permitindo acesso a uma ferramenta poderosa de modelagem molecular de forma rápida.

PARMODEL

Referência:UCHOA et al. .Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004;325(4):1481-1486.


PARMODEL

Página de entrada do PARMODEL. A página de entrada do PARMODEL descreve brevemente as principais ferramentas presentes no servidor web. Além do “parmodel modeling”, temos interfaces para otimização do modelo estrutural (parmodel optimization) e análise da qualidade de modelos de proteínas (parmodel assesment).


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Para modelagem molecular por homologia o PARMODEL solicita ao usuário o preenchimento de um formulário breve, com as informações necessárias para modelagem.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. O PARMODEL retornará os resultados da modelagem molecular por homologia por e-mail, assim como primeira etapa é solicitado ao usuário seu e-mail e uma identificação do usuário e da instituição.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Variando-se as restrições espaciais é possível a gerar até 1000 modelos para cada proteína a ser modelada. Caso o usuário deseje gerar 1000 modelos é necessário indicar que o número de modelos será de 1 até 1000, como indicado ao lado. Duas informações fundamentais para a modelagem molecular por homologia. 1) A sequência de aminoácidos da proteína a ser modelada (no formato fasta). 2) Arquivo PDB com as coordenadas atômicas do molde (template). Nesta versão é possível o uso de até 8 moldes. Os dois slides a seguir mostram os arquivos exemplos usados neste modelagem.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A sequência da proteína a ser modelada é carregada no PARMODEL no formato fasta. Neste formato a primeira linha começa com o símbolo “>” maior que, normalmente seguido com comentário sobre a proteína, identificação, código de acesso, organismo etc. Da segunda linha em diante fica a sequência de aminoácidos usando o código de uma letra. Na figura ao lado temos o arquivo fasta para a sequência de aminoácidos da CDK3 humana, a proteína a ser modelada neste exemplo.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. O arquivo com as coordenadas atômicas do molde (template), neste caso o arquivo PDB (1HCL) com a estrutura da CDK2 humana na forma apo, a ser usado para a modelagem da CDK3. A CDK2 apresenta identidade sequêncial de 74,8 % com a CDK3, o que indica que a CDK2 é um bom molde para a modelagem da CDK3.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Na fase seguinte o usuário indica o método usado para obtenção do molde (template). Há 3 opções: Difração de raios X, NMR e modelagem. No exemplo aqui analisado a opção é difração de raios X. Outro campo a ser preenchido é sobre a presença de ligantes, neste caso coloca-se “0” visto que estamos modelando a enzima na forma apo.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A etapa seguinte permite ao usuário indicar a forma como será avaliado os modelos gerados. Lembramos que podemos gerar diversos modelos (até 1000), para a mesma proteína. O PARMODEL retornará ao usuário o melhor modelo, segundo um critério estabelecido pelo usuário, como o PROCHECK ou o VERIFY3D, ou usarmos a função objetiva do programa MODELLER, como mostrado na figura ao lado. Depois de selecionar a forma de avaliação do modelo clicamos em “submit”, e termos a mensagem mostrada no slide a seguir.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A modelagem foi aceita e os resultados serão enviados via e-mail para o usuário. Os resultados incluem o arquivo PDB do melhor modelo gerado por homologia, o alinhamento do molde (template) e a sequência modelada.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. É possível avaliar a evolução do processo de modelagem na página de entrada (www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/bioxtal1.php ) escolhendo-se a opção “cluster”.

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/bioxtal1.php


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A partir do uso da ferramenta “Ganglia Cluster Toolkit”, usada para avaliar o desempenho de clusters de computadores podemos verificar a entrada da modelagem solicitada ao PARMODEL, caso o clusteresteja sem modelagens no momento da solicitação, como mostrado na figura ao lado. O gráfico da direita acima indica o número de processos atualmente sendo executados no cluster. O segundo gráfico abaixo indica a porcentagem da CPU sendo usada. À esquerda é indicado o número de CPUs sendo usados no cluster, 15 no total.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Na página seguinte é mostrado o tráfego de rede e a velocidade do tráfego de rede, bem como um gráfico de pizza indicando o uso do cluster. O PARMODEL divide o processo de modelagem igualmente entre os nós disponíveis para a modelagem.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. O final da página indica o uso de cada nó (CPU) do cluster. Cinza indica uso, branco indica sem uso. A situação indicada mostra sem uso, esta é a situação onde não nenhuma proteína está em processo de modelagem.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Vamos analisar o uso do cluster logo após a entrada da modelagem da CDK3. Poucos minutos após a submissão da modelagem vemos claramente um aumento nos gráficos do número de processos (gráfico de cima) e da porcentagem de CPU usada (segundo gráfico de cima para baixo)


PARMODEL

PARMODEL Modeling. No terceiro gráfico vemos um pico do tráfego de rede, devido ao início da modelagem, e depois uma velocidade de transferência constante (quarto gráfico) devido à comunicação dos diferentes nós durante a modelagem. O PARMODEL divide a modelagem igualmente entre os nós, armazena os resultados e retorna ao usuário o arquivo PDB com o melhor modelo. Vemos também uma mudança no gráfico de pizza da esquerda, indicando um aumento do uso do cluster.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Os dezesseis gráficos do final da página indicam o uso de cada CPU, há uma CPU não sendo usada, e as outras quinze sendo usadas intensamente.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Ao final da modelagem vemos que o uso do clustervolta ao mínino.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Os resultados são enviandos via e-mail com informações sobre como descompactar em ambiente linux e windows.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Em linux basta copiar o arquivo para um diretório e usar o comando tar –xvf “nome-do-arquivo”. Em windows pode usar o winrar ou winzip ou qualquer outra programa para descompactar. O arquivo compactado apresenta três arquivos, mostrados no próximo slide.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. O arquivo alignment.pap com o alinhamento da sequência de aminoácidos do modelo e do template, usado na modelagem. O arquivo pdb com o melhor modelo e o arquivo rank com o valor da função objetiva do MODELLER.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A função objetiva é listada da menor para a maior, com o respectivo modelo. Quanto menor a função objetiva do MODELLER melhor é o modelo. O arquivo PDB enviado ao usuário é aquele que apresenta menor valor para a função objetiva.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. O programa PARMODEL retorna ao usuário as coordenadas atômicas do modelo, no caso a CDK3, mostrada em verde. A estrutura do molde usado, as coordenadas atômicas da CDK2 humana (código de acesso no pdb: 1HCL), na forma apo, está mostrada em seguida, em vermelho. A sobreposição das duas estruturas indica um rmsd de 0,3 Å, indicando um bom ajuste entre modelo (CDK3) e molde (CDK2).

CDK3 CDK2 Sobreposição da CDK2 e CDK3


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Análise do diagrama da Ramachandran da estrutura do molde (Código pdb: 1HCL) indica que o molde apresenta boa qualidade estereoquímica, com 91,4 % dos resíduos nas regiões permitidas, 8,2 % nas regiões adicionalmente permitidas, e 0,4 % nas regiões adicionalmente permitidas. Não há resíduos nas regiões proibidas.

CDK2 Diagrama de Ramachandran para a CDK2


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Para o modelo da CDK3, o diagrama de Ramachandran indica que a estrutura apresenta boa qualidade estereoquímica, com 92,1 % dos resíduos nas regiões permitidas, 6,0 % nas regiões adicionalmente permitidas, e 1,1 % nas regiões adicionalmente permitidas. Há 2 resíduos nas regiões proibidas (0,8%).

CDK3 Diagrama de Ramachandran para a CDK3


PARMODEL

PARMODEL Modeling. A interface de avaliação da qualidade de modelos do PARMODEL permite a avaliação do diagrama de Ramachandran por tipo de resíduo de aminoácido. A análise a seguir é para o modelo da CDK3.

Os pontos em vermelho indicam resíduos na região proibida. O número em parênteses indica quantos resíduos de aminoácidos do tipo indicado.


PARMODEL

PARMODEL Modeling. Outra opção avalia os ângulos chi1 e chi2 das cadeias laterais dos resíduos de aminoácido que apresentam estes ângulos. A análise abaixo é para o modelo da CDK3.

Os pontos em vermelho indicam resíduos na região proibida. O número em parênteses indica quantos resíduos de aminoácidos do tipo indicado.


Além dos ângulos de torção da cadeia principal, temos, para a maioria do aminoácidos a possibilidade de ângulos de torção para a cadeia lateral. Obviamente tais ângulos só existem para os aminoácidos de cadeia lateral média e longa. No exemplo abaixo temos uma lisina, com 5 ângulos de torção possíveis.

χ1χ2

χ3χ4χ5

PARMODEL

DBMODELING



Algoritmo do DBMODELING

DBMODELING. DBMODELING é uma base de dados que armazena modelos estruturais de proteínas identificadas em genomas de patógenos, foi desenvolvida usando-se Perl e MySQL. Esta base de dados é aberta e armazena modelos estruturais de proteínas identificadas nos genomas de Mycobacterium tuberculosis e Xylella fastidiosa. O DBMODELING permite um acesso fácil e intuitivo. O usuário ao entra no site tem a possibilidade de indicar o nome da proteína. Esta pesquisa gera uma solicitação ao sistema que retornará ao usuário um página com informações sobre a estrutura da proteína.


DBMODELING

DBMODELING. A interface permite selecionar dois genomas (versão atual). Uma vez selecionado o genoma é possível solicitar uma proteína ou via metabólica específica.


DBMODELING

DBMODELING. A possibilidade de acessar diretamente a via metabólica de interesse, como mostrado na coluna esquerda da página mostrada ao lado. Clicando-se da primeira via metabólica mostrada, é mostrada as enzimas dessa via metabólica que apresentam modelo estrutural. Nem todas enzimas de uma via metabólica apresentam modelo estrutural depositado, visto que não há moldes (templates) para todas as enzimas. As passíveis de modelagem estão depositadas no DBMODELING.


DBMODELING

DBMODELING. Na interface é mostrada seis enzimas da via de biossíntese de ácido fólico. Para acessar as coordenadas atômica, bem como, detalhes sobre a modelagem, estrutura primária, reação catalisada e outras informações o usuário clica na enzima.


DBMODELING

DBMODELING. A interface mostra o modelo em fitas da estrutura 3D do modelo obtido por homologia. É mostrada a sequência de aminoácidos da proteína modelada. Há possibilidade de acessar a qualidade estereoquímica do modelo, usando-se o PROCHECK, VERIFY3D e o WHATCHECK. Há possibilidade de fazer download das coordenadas atômicas dos modelos.


DBMODELING

DBMODELING. Abaixo na página há links para as bases de dados com informações sobre enzimas e via metabólicas (Kegg e MetaCyc), bem como links para sites sobre o Mycobacterium tuberculosis.

Bioinformática na era pós-genoma


Enzimas alvo para desenho de drogas contra o

Mycobacterium tuberculosis


Número de pessoas infectadas por ano

0200400600800

100012001400160018002000

Índi

a

Chi

na

Indo

nési

a

Nigé

ria

Bang

lade

sh

Etió

pia

Filip

inas

Paqu

istã

o

Áfr

ica

do S

ul

Fede

raçõ

es

Con

go

Keni

a

Vie

tnam

Tanz

ânia

Bras

il

Tailâ

ndia

Ugan

da

Mya

nmar

Moç

ambi

que

Cam

bodi

a

Zim

bábu

e

Afe

gani

stão

País

Núm

ero

de c

asos

(milh

ares

)Fonte: WHO report 2002


Mycobacterium tuberculosis

O agente causado da tuberculose é o Mycobacterium tuberculosis. A tuberculose normalmente é uma doença relacionada ao século XIX, fortemente marcante no romantismo, sendo responsável pela morte precoce de diversos expoentes da literatura do final do século XIX e início do século XX. Contudo, devido à decadência dos centros urbanos e a epidemia de AIDS há um ressurgimento da tuberculose, sendo que a OMS declarou em 1993 a TB como epidemia mundial. O gráfico ao lado mostra a incidência de TB nos principais países atingidos.

Via metabólica do ácido chiquímico



Via metabólica do ácido chiquímico. Esta via é composta de sete passos enzimáticos, é responsável pela conversão de eritrose-4-fosfato e fosfoenol-piruvato em corismato. O corismato precursor para biossíntese de aminoácidos aromáticos, entre outros compostos. Como esta via metabólica está presente em bactérias, organismos do filo apiconplexa e plantas, mas ausente em mamíferos, as enzimas que a constituem são potenciais alvos moleculares para o desenho de drogas, a partir do paradigma de toxidade seletiva. A quinta enzima da via é a chiquimato quinase, que fosforila o chiquimato.

Via Metabólica do Ácido Chiquímico

0,5mm


Cristalização da MtCQ

A MtCQ foi cristalizada usando a técnica de difusão de vapor e o sistema de gota suspensa. A MtCQ foi concentrada e dializada contra uma solução de 50mM de Hepes Na em pH 7,5, contendo 0,5 M NaCl e 5,0 mM de MgCl2 . A proteína foi concentrada a 17 mg/ml. ADP e ácido chiquímico foram adicionados à solução da proteína. A solução do poço apresentava 0,1 M de Hepes em pH 7,5, 10 % de 2-propanol e 35 % de PEG 3350, as gotas consistiam de 1 µ l de solução do poço e 1,5 µ l de solução de proteína. Os cristais cresciam até aproximadamente 0,5 mm, após uma semana.

Mapa de difração do complexo MtCQ-MgADP-Ác.chiquímico obtido no LNLS (Estação PCr, Laboratório Nacional de Luz Síncroton, Campinas, Brasil). Os parâmetros da cela unitária estão na tabela abaixo.


Difração da MtCQ

Parâmetros da cela unitáriaa = b (Å) 62,91c (Å) 90,92Resolução (Å) 29,74-2,30 (2,41-2,30)Grupo espacial P3221Completeza (%) 98,7 (98,7)Rsym (%) 3,0 (7,2)

*Valores entre parênteses referem-se à mais alta camada de resolução


Ácido Chiquímico

A reação de fosforilação do ácido chiquímico é catalisada pela chiquimato quinase. Nesta reação há transferência de um grupo fosfato da molécula de ATP para o ácido chiquímico. O ácido chiquímico apresenta três hidroxilas e um grupo carboxílico, como mostrado na figura ao lado.


O principal objetivo deste trabalho é a identificação da posição do ácido chiquímico na estrutura da MtCQ, para isto foram gerados mapas de densidade eletrônica de omissão, onde uma grande região sem modelo de proteína e ADP apareceu de forma destacada (gradeado azul). Tal observação é uma indicação que há densidade eletrônica não incluída no modelo cristalográfico, no caso este modelo foi refinado como a molécula de ácido chiquímico. Na figura ao lado vemos o ác. Chiquímico, a molécula de ADP, o íon magnésio, e os carbonos alfa da MtCQ.

Complexo CQ-ADP-Ác. Chiquímico



A figura ao lado mostra a estrutura final do complexo MtCQ-ADP-Ac. Chiquímico. A estrutura indica o bolsão de ligação do ác. chiquímico próximo ao bolsão de ligação de ADP, com o íon magnésio entre as duas moléculas. A estrutura da MtCQ apresenta um folha beta central formada por cinco fitas beta (indicada em vermelho) e circundada por oito hélices alfa. Um pequeno trecho em hélice funciona como uma tampa sobre o bolsão de ligação do ác. chiquímico.

CQ de Erwinia chrysanthemi na forma apo

CQ:ADP:Ac. Chiquímico de M. tuberculosis



A sobreposição da estrutura do complexo MtCQ-ADP-Ác. Chiquímico (código de acesso PDB: 1WE2) com a estrutura da CQ de Erwinia chrysanthemi na forma apo mostra um grande movimento do domínio da tampa (LID domain), este movimento provavelmente é induzido devido à ligação do ácido chiquímico.



Afim de averiguar a estabilidade que a adição da molécula de ácido chiquímico, proporciona à estrutura da chiquimato quinase realizamos uma simulação de dinâmica molecular da estrutura na forma apo e na forma complexada com ADP e ácido chiquímico. Foi realizada um simulação de dinâmica molecular por 5 ns (nanosegundos). O gráfico do desvio médio quadrádico (rmsd) com relação à estrutura inicial é mostrado ao lado. A linha preta indica a evolução da dinâmica da MtCQ na forma apo, e a linha cinza na forma complexada, vemos claramente que a forma apo apresenta maior rmsd, o que indica maior flexibilidade da estrutura.



A estrutura em cinza é a MtCQ complexada, e a estrutura em preto a MtCQ na forma apo, após a simulação computacional de dinâmica molecular por 5 ns. Vemos claramente a diferença da região da tampa, com a estrutura complexada mantendo o domínio na posição fechada.

Ác. chiquímico Átomo Distância (Å)Grupos hidroxil O1 Gly 80-N 3,10 Asp34-OD1 2,82 Asp34-OD2 2,57 Água1-O 2,46 O2 Asp34-OD1 2,66 Asp34-OD2 2,85Grupo carboxil O4 Gly 81-N 3,22 Arg136-NH2 2,68 O5 Arg58-NH2 2,67 Gly 81-N 3,49 Arg136-NH2 2,34

Tabela – Ligações de hidrogênio entre MtSK e ácido chiquímico

Sítio de ligação do ácido chiquímico. A linha descontínua em preto mostra as ligações de hidrogênio entre ác.chiq. e MtSK e a linha em verde, a ligação ligações de hidrogênio entre Glu61 e Arg58.



Análise dos resíduos de aminoácido da CQ, que participam de ligações de hidrogênio, indica a participação do resíduos: Gly80, Asp34, Gly81, Arg136 e Arg58, conforme a tabela abaixo.

Alinhamento das CQs

-A primeira estrutura de CQ complexada com Ác.chiquímico (este trabalho) vai fornecer informações para entendermos o mecanismo de catálise das CQs e também para o desenho de drogas baseado em estrutura.

-A estrutura cristalográfica da MtCQ poderá ser utilizada como “template” para futuras modelagens de CQs complexada com ác. Chiquímico.


Conclusões

2) Silveira NJ, Uchoa HB, Pereira JH, Canduri F, Basso LA, Palma MS, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Molecular models of protein targets from Mycobacterium tuberculosis. J Mol Model (Online). 2005 Mar;11(2):160-6.

3) Pereira JH, de Oliveira JS, Canduri F, Dias MV, Palma MS, Basso LA, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Structure of shikimate kinase from Mycobacterium tuberculosis reveals the binding of shikimic acid. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt 2):2310-9.

4) Dias MV, Ely F, Canduri F, Pereira JH, Frazzon J, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of chorismate synthase from Mycobacterium tuberculosis. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Nov;60(Pt 11):2003-5.

5) Arcuri HA, Canduri F, Pereira JH, da Silveira NJ, Camera Junior JC, de Oliveira JS, Basso LA, Palma MS, Santos DS, de Azevedo Junior WF. Molecular models for shikimate pathway enzymes of Xylella fastidiosa. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jul 30;320(3):979-91.

6) Pereira JH, Canduri F, de Oliveira JS, da Silveira NJ, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Structural bioinformatics study of EPSP synthase from Mycobacterium tuberculosis. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Dec 19;312(3):608-14.

7) Filgueira de Azevedo W Jr, Canduri F, Simoes de Oliveira J, Basso LA, Palma MS, Pereira JH, Santos DS. Molecular model of

shikimate kinase from Mycobacterium tuberculosis. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jul 5;295(1):142-8.


Publicações Sobre Via do Ácido Chiquímico

Pereira JH, de Oliveira JS, Canduri F, Dias MV, Palma MS, Basso LA, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Structure of shikimate kinase from Mycobacterium tuberculosis reveals the binding of shikimic acid. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt 2):2310-9.


Proteína quinase de Plasmodium falciparum



PfPK6

A alta identidade entre a Proteína Quinase de Plasmodium falciparum (PfPK6) e a CDK2 humana faz desta última um excelente molde para a modelagem por homologia da PfPK6. O alinhamento é mostrado ao lado, indicando uma identidade entre as duas proteína superior a 38 %. O servidor web PARMODEL foi usado para a modelagem por homologia da PfPK6.

PfPK6

A PfPK6 apresenta a estrutura tridimensional canônica das CDKs, com dois lóbulos, um menor no N-terminal com alta incidência de fitas beta, e outro no C-terminal, maior com presença majoritária de hélices alfa. O bolsão de ligação de ATP localiza-se entre os dois lóbulos. Na figura ao lado temos o inibidor roscovitine ligado ao bolsão de ligação de ATP. Roscovitine é um inibidor competitivo com ATP.


PfPK6

O modelo tridimensional, obtido por modelagem molecular por homologia revela o padrão de ligações de hidrogênio intermolecular entre roscovitine e a PfPK6, revelando os principais resíduos de aminoácido responsáveis pelo contato intermolecular. Há duas ligações de hidrogênio intermolecular, envolvendo o resíduo Leu 95.


PfPK6

O modelo da PfPK6 em complexo com olomoucine revela as bases estruturais para as diferenças de especificidade mostrada por estes inibidores.



PfPK6

A figura ao lado mostra as ligações de hidrogênio intermoleculares entre a PfPK6 e o roscovitine. Estas ligações de hidrogênio intermoleculares são observadas no modelo estrutural da PfPK6 em complexo com o inibidor olomoucine. O slide a seguir mostra um resumo sobre a análise das ligações de hidrogênio entre olomoucine e roscovitine com diferentes quinases.

2.8N6Leu95O

2.9N7Leu95NPfPK6-Olomoucine

2.8N6Leu95O

3.4N7Leu95NPfPK6-Roscovitine

2.6N6Cys83O

2.9N7Cys83NCDK5-Olomoucine

2.6N6Leu83O

2.9N7Leu83NCDK2-Olomoucine

2.6N6Leu83O

2.9N7Leu83NCDK1-Olomoucine

3.2N1Asp86OD2

3.5N2Asp86OD2

3.3O1Gln130NE2

3.1N6Cys83O

3.5N7Cys83N

CDK5-Roscovitine

2.8N6Leu83O

3.4N7Leu83NCDK2-Roscovitine

3.3N2Asp86OD2

3.2N1Asp86OD2

2.8O1Gln132NL2

3.1N6Leu83O

3.4N7Leu83N

CDK1-Roscovitine

Distance (Å)InhibitorResiduesProtein

Tabela. Ligações de hidrogênio intermoleculares


PfPK6

A análise do padrão de ligações de hidrogênio intermolecular indicam um padrão comum observados em todos os complexos entre quinases e inibidores. Há um trecho da cadeia principal envolvendo os resíduos Leu 83 e Glu 81 nas CDKs e Leu 95 na PfPK6, que apresentam um conjunto aceitado, doador e aceitador de ligação de hidrogênio. Este padrão é chamado de garfo molecular e permite que diversas topologias moleculares se encaixem no bolsão de ligação de ATP.

A: H717B: StaurosporineC: DescloroflavopiridolD: OxindoleE: RoscovitineF: QuinazolineG: Composto 1


A figura ao lado ilustra alguns dos principais inibidores de CDKs. Vemos claramente a flexibilidade do bolsão de ligação de ATP das CDKs, que permite que topologias moleculares tal diversas liguem-se à CDK, fornecendo IC50 na faixa de nanomolar.

Inibidores de Quinases

PfPK6-Roscovitine PfPK6-Olomoucine


A figura ao lado ilustra a superfície do potencial eletrostático da proteína. Em branco neutro, azul positivo e vermelho negativo. A especificidade do ligante por uma proteína é determinada por ligações de hidrogênio e complementaridade de forma e carga. A análise da superfície do potencial eletrostático permite uma avaliação qualitativa da interação ligante-proteína. Vemos na figura ao lado uma certa complentaridade de carga entre inibidor-proteína.


2297180PfPK6-Olo

235630PfPK6-Rosc

22697CDK2-Olo

23200,7CDK2-Rosc

22893CDK5-Olo

53340,16CDK5-Rosc

22857CDK1-Olo

63390,45CDK1-Rosc

Número de ligações de HÁrea de contato (Å2) IC50 (μM)Complexo


Análise das estruturas dos complexos de olomoucine e roscovitine com diferentes quinases indica que quando comparamos a mesma quinase, com diferentes inibidores há uma correlação da área de contato e o número de ligações de H com o IC50, contudo tal correlação não é observada quando comparamos várias quinases, conforme a tabela abaixo.


• Os inibidores ligam-se ao bolsão de ligação de ATP

• Há participação do garfo molecular em ligações de hidrogênio

• Roscovitine e olomoucine são mais específicos para CDK1, CDK2, CDK5 e PfPK6

• Os tradicionais inibidores de CDK apresentam potencial de inibirem PfPKs


Conclusões

2) Manhani KK, Arcuri HA, Silveira NJ, Uchoa HB, Azevedo WF Jr, Canduri F. Molecular models of protein kinase 6 from Plasmodium falciparum. J Mol Model (Online). 2005 Aug 11;:1-7.

3) Canduri F, Uchoa HB, de Azevedo WF Jr.Related Articles, Links Molecular models of cyclin-dependent kinase 1 complexed with inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 12;324(2):661-6.

4) Filgueira de Azevedo W Jr, Gaspar RT, Canduri F, Camera JC Jr, Freitas da Silveira NJ. Molecular model of cyclin-dependent kinase 5 complexed with roscovitine. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 11;297(5):1154-8.

5) de Azevedo WF Jr, Canduri F, da Silveira NJ. Structural basis for inhibition of cyclin-dependent kinase 9 by flavopiridol. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 26;293(1):566-71.

6) Kim SH, Schulze-Gahmen U, Brandsen J, de Azevedo Junior WF. Structural basis for chemical inhibition of CDK2. Prog Cell Cycle Res. 1996;2:137-45.

7) De Azevedo WF, Leclerc S, Meijer L, Havlicek L, Strnad M, Kim SH. Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogues: crystal structure of human cdk2 complexed with roscovitine. Eur J Biochem. 1997 Jan 15;243(1-2):518-26.

8) De Azevedo WF Jr, Mueller-Dieckmann HJ, Schulze-Gahmen U, Worland PJ, Sausville E, Kim SH. Structural basis for specificity

and potency of a flavonoid inhibitor of human CDK2, a cell cycle kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Apr 2;93(7):2735-40.


Publicações sobre CDKs

Purina Nucleosídeo Fosforilase Humana


Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP, EC 2.4.2.1)


Cristalização da PNP

Cook, W. J., Ealick, S. E., Bugg, C. E., Stoeckler, J. D. & Parks, R. E., Jr. (1981) J. Biol. Chem., 256, 4079-4080.

0,5mm


Densidade eletrônica da PNP


Electron density map (2Fobs - Fcalc, 1σ cutoff) for the Lys244 region of human PNP solved to 2.3 Å resolution.


Estrutura cristalográfica da PNP


Trímero da PNP


http://wfdaj.sites.uol.com.br

(1) O uso da cristalografia melhorou a resolução em 0,5 A.

(2) Análise das moléculas de água no sítio ativo indicam posições preferenciais para interação com inibidores.

(3) Redefinição do sítio ativo da PNP

(4) Análise do complexo da PNP com inibidores fornecem a base estrutural para a inibição da PNP.

Conclusões


Publicações sobre PNP entre 2002 e 2005

1) Canduri F, Silva RG, dos Santos DM, Palma MS, Basso LA, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Structure of human PNP complexed with ligands. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2005 Jul;61(Pt 7):856-62.

2) Canduri F, Fadel V, Basso LA, Palma MS, Santos DS, de Azevedo WF Jr. New catalytic mechanism for human purine nucleoside phosphorylase. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Feb 18;327(3):646-9.

3) Canduri F, Fadel V, Dias MV, Basso LA, Palma MS, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Crystal structure of human PNP complexed with hypoxanthine and sulfate ion. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jan 14;326(2):335-8.

4) Nolasco DO, Canduri F, Pereira JH, Cortinoz JR, Palma MS, Oliveira JS, Basso LA, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystallographic structure of PNP from Mycobacterium tuberculosis at 1.9A resolution. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 12;324(2):789-94.

5) da Silveira NJ, Uchoa HB, Canduri F, Pereira JH, Camera JC Jr, Basso LA, Palma MS, Santos DS, de Azevedo WF Jr. Structural bioinformatics study of PNP from Schistosoma mansoni. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 10;322(1):100-4.

6) Canduri F, dos Santos DM, Silva RG, Mendes MA, Basso LA, Palma MS, de Azevedo WF, Santos DS. Structures of human purine nucleoside phosphorylase complexed with inosine and ddI. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23;313(4):907-14.

7) de Azevedo WF Jr, Canduri F, dos Santos DM, Pereira JH, Bertacine Dias MV, Silva RG, Mendes MA, Basso LA, Palma MS, Santos DS. Crystal structure of human PNP complexed with guanine. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Dec 19;312(3):767-72.

8) Filgueira de Azevedo W Jr, dos Santos GC, dos Santos DM, Olivieri JR, Canduri F, Silva RG, Basso LA, Renard G, da Fonseca IO, Mendes MA, Palma MS, Santos DS. Docking and small angle X-ray scattering studies of purine nucleoside phosphorylase. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 3;309(4):923-8.

9) Filgueira de Azevedo W Jr, Canduri F, Marangoni dos Santos D, Pereira JH, Dias MV, Silva RG, Mendes MA, Basso LA, Palma MS, Santos DS. Structural basis for inhibition of human PNP by immucillin-H. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 3;309(4):917-22.

10) dos Santos DM, Canduri F, Pereira JH, Vinicius Bertacine Dias M, Silva RG, Mendes MA, Palma MS, Basso LA, de Azevedo WF Jr, Santos DS. Crystal structure of human purine nucleoside phosphorylase complexed with acyclovir. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Aug 29;308(3):553-9.

11) de Azevedo WF Jr, Canduri F, dos Santos DM, Silva RG, de Oliveira JS, de Carvalho LP, Basso LA, Mendes MA, Palma MS, Santos DS. Crystal structure of human purine nucleoside phosphorylase at 2.3A resolution. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Aug 29;308(3):545-52. wfdaj.sites.uol.com.br © 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

Perspectivas

Uso das estruturas determinadas para simulaçõesde docking

Análise da estrutura de complexos enzima-inibidor

Desenvolver ferramentas computacionais para bioinformática estrutural


Desenvolvimento de softwares para Bioinformática


BOURNE, P. E. & WEISSIG, H. Structural Bioinformatics. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, 2003.

LASKOWSKI, R. A., MACARTHUR, M. W., MOSS, D. S., THORNTON, J. M PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. of Appl. Cryst. 26(2), 283-291, (1993).

LESK, A. M. Introduction to Protein Architecture. Oxford University Press, New York, 2001.

DA SILVEIRA, N. J. F., UCHOA, H. B., PEREIRA, J. H., CANDURI, F., BASSO, L. A., PALMA, M. S., SANTOS, D. S., & DE AZEVEDO, W. F. Jr. Molecular models of protein targets from Mycobacterium tuberculosis. Journal of Molecular Modeling 11, 160-166, 2005.

UCHOA, H. B., JORGE, G. E., DA SILVEIRA, N. J. F, CAMERA, J. C. Jr., CANDURI, F., DE AZEVEDO, W. F.Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004;325(4):1481-1486.


Referências

Documents

Bioinformática Estrutural - biocristalografia.df.ibilce ... · que é fortemente influenciado pela limitação das estruturas disponíveis na base de dados estruturais, que tendem