Docentes: Prof. Dr. Felipe S. Chambergo – fscha@usp.br Prof. Dr. Luiz P. M. Andrioli – lpma@usp.br Monitores: MSc. Patrícia Pereira Adriani - paty_adriani@hotmail.com Bchr. Gustavo Roncoli - gustavoroncoli@hotmail.com Bchr. Daniela De Lucena Pedroso - pedrosoddl@usp.br Servidores não-docentes: Sr. Tec. Clarino do Divino Vieira Local: Laboratório de Biotecnologia, 1° andar bloco didático A2 - EACH/USP.

USP – 2019

Biotecnologia ACH5545 Engenharia Genética e Biologia Molecular

Atividades de Laboratório 2º Semestre 2019

Como produzir uma proteína recombinante?

10 to 70% of cellular

protein

0.1 to 1% of cellular

protein

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Vetores de Expressão e Proteínas de Fusão

1-Clonagem do cDNA da proteína de interesse num vetor de expressão -Seleção do vetor e proteína a expressar 2-Transformação e seleção de Bactérias ou células competentes -Seleção de organismo hospedeiro e técnica de transformação 3-Testes de Expressão -Identificar o clone que expressa a proteína recombinante 4-Produção em grande escala da proteína recombinante -Empregando um grande volumem de cultura 5-Recuperação e análises da proteína recombinante -Técnicas para recuperar a proteína a partir da cultura 6-Purificação -Técnicas de purificação de proteínas 7-Aplicação

Isto é possível por: -Universalidade do código genético. -Similaridade da maquinaria de transdução (ribossomos) -Rápido avanço das técnicas de biologia molecular e/ou engenharia genética:

– Clonagem de DNA – Sequenciamento de DNA – Enzimas para cleavagem, ligação, sínteses de moléculas de DNA, RNA, síntese de

nucleotídeos, etc Deve-se obter plasmídios para clonagem que garantissem um alto nível de

expressão da proteína de interesse (Vetor de Expressão)

Vetor de Expressão

1 2 3 5 4 6 7

1-Regulador do promotor: Proteína que modula o promotor 2-Promotor: Deve ser forte (lac, trp, tac, λpL, gene 10 do fago T7) 3-Seqüência Shine-dalgarno: Sitio de ligação do ribossomo, (RBS). 4-Região codificadora: sítios de múltipla clonagem 5-Terminador de transcrição: Estabiliza o mRNA 6-Marcador genético (antibiótico de seleção) 7-Ori: Origem de replicação.

Elementos de um vetor de expressão procariótico

Start Codon

Stop Codon

-10 TATAAT

ATG TAG

Enzima2 Enzima1

ATG-TCC-GCT-ATG TAG-TCC-GCT-CTG

AUG UAG

Oligo-Enzima1

Oligo-Enzima2

RT-PCR (Transcriptasa reversa)

Cliva e liga no vetor de expressão

Vetor de Expressão Vetor de Expressão

Seqüência Codificadora

mRNA

cDNA

Clonagem da Sequencia de Interesse

Manter o passo de leitura !!!!!!!

Proteína de Interesse

Fusão Proteína de Interesse

Sitio de clivagem de Protease

(lacZ, GST, His, CBD,etc)

Sinal Proteína de Interesse

(ompA, ompT)

A)Expressão da proteína de interesse

B)Expressão da proteína de interesse fusionada com outra Proteína

C)Expressão da proteína de interesse com sinal para secreção

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DNA templates: •Supercoiled plasmid DNA (recommended to obtain the highest yields) •Linear DNA •PCR product

Expressway Cell-Free E. coli Expression System:

Com um molde de DNA contendo um promotor T7 transcrito, ribossomos ligam-se ao extremo 5´ do mRNA nascente e sendo traduzido. Um sistema renovável de energia ATP acoplado para ligação estável dos ribossomos resulta em alto nível de proteína produzida.

-Transformação: Introdução de DNA em células procarióticas e levedura. -Transfecção: Introdução de DNA em células eucarióticas. Pode ser por: 1-Eletroporação 2-Microinjeção 3-Liposomos 4-Virus eucarióticos 5-Biobalistica

Expressão da Proteína de interesse O vetor de expressão é empregado para transformar Bactérias competentes (E. coli deficientes em Proteasas). Após cultura é Testada a expressão

Figure 11.13

Well-developed genetics Many strains available Best known bacterium

Easily transformed Nonpathogenic Naturally secretes proteins Endospore formation simplifies culture

Well-developed genetics Nonpathogenic Can process mRNA and proteins Easy to grow

Potentially pathogenic Periplasm traps proteins

Genetically unstable Genetics less developed than in E. coli

Plasmids unstable Will not replicate most bacterial plasmids

Advantages Disadvantages

Escherichia coli Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae

Bacteria Eukaryote

© 2012 Pearson Education, Inc.

Expression of cloned proteins in bacterial cells

Escherichia coli is one of the most popular hosts for overexpression of cloned

proteins because of its fast and efficient growth.

The most widely used E. coli strains in expression of cloned proteins are BL21

and its derivatives.

This is mainly because BL21 strains are deficient in a cytoplasmic protease,

Lon, and an outer membrane protease, OmpT.

Both of these mutations (lon and ompT) allow intracellular accumulation of

heterologous proteins (i.e., proteins derived from species or cell types different

from the host) at a high rate while minimizing protein degradation during

purification.

4 – 12 ºC

pFLAG-ATS™ Expression Vector Bacterial vector for periplasmic expression of N-terminal FLAG fusion proteins

Sistema de Expressão bacteriano - pET

BL21(DE3)

Induce lac promoter with IPTG

T7 RNA polymerase

Gene product

Chromosome

Cloned gene

T7 promoter

pET plasmid

Gene for T7 RNA

polymerase

lac operator

lac promoter

lacl

Citoplasma Meio

Membrana Externa Membrana Interna

Periplasma

+ Secreção

Secreção

A)Proteínas Citoplasmáticas

B)Secreção de Proteínas

Met

Precipita Proteína Nativa Degrada

Precipita Degrada

Seqüência Sinal

Precipita ou

degrada

Lise celular: SONICAÇÂO

Figura 1 – Eletroforeses SDS-PAGE (12,5%) da expressão e purificação da proteína recombinante TrEH2, em E. coli BL21. (1) Amostra de 20 µL da bactéria não induzida; (2) Amostra de 20 µL da bactéria induzida com 0,5 mM de IPTG; (3) Amostra de 20 µL do precipitado do lisado bacteriano (não solúvel); (4) Amostra de 20 µL do sobrenadante do lisado bacteriano (solúvel); (5) Amostra de 20 µL das frações coletadas após a purificação. (PM) peso molecular BenchMark protein ladder (Invitrogen).

PM

Purificação

Histidine-tagged proteins are commonly purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)

https://www.gelifesciences.com/

DOI: 10.1039/C5TB02505B - J. Mater. Chem. B, 2016,4, 1960-1967

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Etapas de Purificação

1 2 3 Q-Sepharose Phenyl Chromatofocus Mono-Q

1-Periplasma 2-Preparação Anterior 3-Controle

Sítios de múltipla clonagem no Vetor de expressão pTRC-His

Ensaio de Atividade Enzimática

Product name Protein type Application Company

Adagen (Adenosine deaminase )

An enzyme Severe combined immunodeficiency

disease (SCID)

Enzon

Genotropin (Recombinant growth

hormone)

A hormone Growth hormone deficiency (GHD) in

children

Pharmacia & Upjohn

Humalog (Recombinant human insulin)

A hormone Diabetes Eli Lilly

Nabi-HB (Anti-Hepatitis B)

An antibody Hepatitis-B Nabi

Novo Seven (Recombinant

coagulation factor VIIa)

A modified factor Hemophillia patients with inhibitors

Novo Nordisk

Ontak (Diphtheria toxin-interleukin-2)

A fusion protein Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)

Ligand Pharmaceuticals

Roferon-A (Recombinant interferon alfa-2a)

A modifier Hairy cell leukemia or AIDS-related Kaposi's

sarcoma

Hoffmann-La Roche

Proteínas Humanas produzidas pela tecnologia de DNA recombinante

Proteína Doença α1-antitrypsin Emphysema B-cell growth factors Immune disorders Epidermal growth factors Burns Erythropoyetin Anemia, kidney disorders Factor VIII, Factor IX Hemophilia Growth Hormone Growth defects Insulin Diabetes