Bioquímica computacional, 1º ciclo em Bioquímica, FCUL

Aula TP 3

Visualização molecular com o software UCSF Chimera: sobreposição de centros activos em

proteínas, conservação estrutural e conservação de sequência.

Programa a usar: UCSF Chimera.

Preparação

1. obtenha o conjunto de ficheiros PDB do “moodle” da disciplina (ficheiro TP3mats.zip).

Estrutura dos ficheiros PDB

2. Abra o pdb 1HEW (ficheiro 1hew.pdb) com um editor de texto (MS-Word, Wordpad,

SciTE)para ter uma noção do formato. Observe em particular as linhas ATOM. 1hew é

uma estrutura de que proteína? De que espécie?

Introdução ao uso geral do UCSF Chimera.

3. Abra o programa UCSF Chimera. Abra a estrutura 1HEW (com File-Open).

4. Familiarize-se com a funcionalidade do cursor do rato. Experimente as rotações,

translações e zoom. Experimente também o menu Actions-Focus.

5. Experimente várias representações a partir do menu Actions:

a. Convencional, átomos e ligações:

i. Actions-Ribbons-Hide (para evidenciar átomos e ligações)

ii. Actions-Atoms/Bonds-Show only

iii. Actions-Color-By element

iv. (Sticks) Actions-Atoms/Bonds- Stick

v. (Ball and sticks) Actions-Atoms/Bonds- Ball and stick

vi. (raios de Van Der Walls) Actions-Atoms/Bonds - Spheres

vii. O que são as esferas vermelhas que aparecem desconetadas com o

resto da figura?

viii. Que elemento químico, habitual nas proteínas, parece não estar

presente?

b. Evidenciando a estrutura secundária:

i. Actions-Atoms/Bonds- Hide

ii. Actions-Ribbons-Show

iii. Experimente diferentes colorações com a seguinte ferramenta: Tools-

Depiction-Color Secundary Structure.

c. Evidenciando a superfície molecular:

i. Actions-Atoms/Bonds- Show

ii. Actions-Atoms/Bonds- Ball and stick

iii. Actions-Ribbons-Hide

iv. Actions-Surface-Show

v. Actions-Surface-Solid

vi. Observe o encaixe do substrato sintético (NAG) no “pocket” da

proteína.

vii. Experimente também diferentes níveis de transparência da superfície

com Actions-Surface-Transparency.

6. No UCSF Chimera, é possível selecionar partes da estrutura, de tal forma que as ações

só afetam a parte selecionada. O menu Select tem muitas possibilidades de seleção.

Por exemplo, para obter uma imagem da parte proteica da proteína escondendo os

átomos, mas evidenciando a estrutura secundária, as águas de solvatação escondidas

e o ligando (NAG) na forma de ball and sticks, colorido “por elemento”:

a. Actions-Surface- Hide

b. Actions-Atoms/Bonds- Show

c. Actions-Color – By element

d. Select – Residue – Standard amino acids

e. Actions-Atoms/Bonds-Hide

f. Actions-Ribbons-Show

g. Select –Residue-HOH (são os “resíduos” com o nome HOH)

h. Actions-Atoms/Bonds-Hide

i. Select –Residue-NAG (são os resíduos com o nome NAG, neste caso o ligando

sintético é um composto com 3 “resíduos” de N-Acetil-D-Glucosamina)

j. Actions-Atoms/Bonds- Ball and stick

k. Select-Clear selection

7. Combinando os menus Select e Actions obtenha as seguintes representações:

a. Esconda as águas e o ligando, passe a proteína para ribbons (sem átomos),

com as hélices a azul e as folhas beta a vermelho. Selecione as cisteínas e

represente-as por ball and stick, coloridas por elemento. Quantas pontes

persulfureto existem na proteína?

b. Esconda tudo exceto as helices alfa, mostrando ribbons e átomos. Sugestão:

Select-Structure-Secondary structure...

c. Esconda as águas e o ligando, passe toda a proteína para ribbons (sem

átomos), com as hélices a azul e as folhas beta a vermelho. Selecione as

Argininas e Lisinas e represente-as por ball and stick, coloridas por elemento.

Quantas argininas e lisinas existem na proteína?

d. Idêntico a c., mas mostre os resíduos na sequência CSALL.

e. Uma representação semelhante à da seguinte figura:

f. Uma representação semelhante à da figura seguinte:

g. Uma representação semelhante à da figura seguinte (o ligando está a amarelo,

a verde estão os resíduos a menos de 5 Angstron do ligando. Sugestão: use

Select-Zone após selecionar o ligando):

8. Obtenha ficheiros de imagem PNG com File – Save Image

9. Experimente a ferramenta Tools –Depiction –Rainbow

10. Experimente a ferramenta Tools – Viewing controls – Side view (mova as linhas

verticais com o cursor do rato)

11. Comece por esconder tudo. Experimente a ferramenta Tools – Sequence - Sequence:

a. Com a janela de sequência, selecione os resíduos Ala 110, Pro 70, Tyr 23 e

mostre-os na forma Ball and Stick.

b. Mostre apenas os ultimos 10 resíduos da proteína em Ball and Stick.

12. A partir da representação de 11.(ultimos 10 resíduos), faça Actions – Focus. Depois,

passando o cursor do rato sobre diferente átomos, encontre (mas não selecione): o

carbono alfa da Cys 127, o carbono delta da Arg 125, o oxigénio epsilon da Gln 121.

13. A partir da representação de 11.(ultimos 10 resíduos), experimente Actions – Label –

Name, (off), Actions – Label – Residue – Name+Specifier, (off).

14. Medição de distâncias e ângulos. A partir da representação de 11.(ultimos 10

resíduos), pode selecionar átomos individuais com ctrl-click sobre um átomo e ctrl-

shift-click para adicionar um átomo à seleção anterior. Com 2 ou 3 átomos

selecionados podemos medir distâncias ou ângulos. Para isso experimente a

ferramenta Tools – Structure analysis – Distances ou Angles/Torsions. Meça a

distância do carbono gama da Arg 128 ao carbono alfa da cisteína 127. Qual o ângulo

entre o carbono alfa, o carbono beta e o átomo de enxofre da Cys 127?

15. Feche a estrutura com File – Close session.

Sobreposição de centros ativos com o comando match: Proteases de serina que

evoluiram de forma convergente.

16. Abra a estrutura 1AB9.

17. Abra a estrutura 1AF4.

18. Esconda os átomos/ligações e mostre os ribbons.

19. Experimente a ferramenta Tools – General controls - Model Panel, para distinguir as

duas estruturas (experimente A: active e S:shown). Anote o Id das estruturas 1AB9 e

1AF4. Uma delas é a #0 e a outra #1.

20. Use a ferramenta rainbow (ponto 9) para colorir por chain. Quantas cadeias têm as

estruturas 1AB9 e 1AF4?

21. O UCSF Chimera suporta comandos escritos numa linha de comandos. A variedade é

imensa. Faça Tools – General controls – Command line.

22. Na linha de comandos experimente os seguintes comandos:

a. rock

b. roll

c. freeze

d. select #0 (este comando seleciona a estrutura com o Id 0)

e. color blue

f. rainbow chain

g. ~select (este comando limpa a seleção)

23. No ficheiro pdb em modo de texto informe-se sobre a proteína 1AB9. (abra com o

WordPad, por exemplo)

24. Na Uniprot (www.uniprot.org) informe-se sobre esta proteína (“chymotrypsin”,

espécie Bos taurus). Só encontra o precursor da proteína. Na secção de anotações

sobre a sequência tome nota dos resíduos que são clivados para activar a protease e

os 3 resíduos que fazem parte do centro activo.

25. No ficheiro pdb note que também existe informação sobre o centro ativo na linha SITE.

26. Informe-se também sobre a proteína e o centro ativo para a proteína 1AF4.

27. Resumo dos centros activos:

γγγγ-chymotripsin (1AB9):

Cadeia B, resíduo 57. H

Cadeia B, resíduo 102. D

Cadeia C, resíduo 195. S

Subtilisina (1AF4):

Cadeia A, resíduo 64. H

Cadeia A, resíduo 32. D

Cadeia A, resíduo 221. S

28. Na linha de comandos vamos selecionar os centros activos:

select #1:64,32,221|#0:57,102,195

(explicação:

#i indica a estrutura com o Id i.

:j,k,l indica os resíduos nas posições j,k,l.

O símbolo |, indica reunião dos dois conjuntos.)

29. Com esta seleção, mostre os átomos, coloridos por elemento

30. O comando match sobrepõe estruturas de acordo com um conjunto correspondente

de átomos selecionados. Execute o seguinte comando na linha de comandos:

match #1:64,32,221 #0:57,102,195

31. Faça Actions – Focus. Observe a sobreposição dos centros ativos destes proteases (as

chamadas tríadas dos proteases de serina, envolvendo uma His, um Glu e uma Ser),

apesar do resto das estruturas serem muito distintas. Estas proteínas são um exemplo

de evolução convergente.

32. Faça File – Close Session.

Coloração por fator B e hidrofobicidade.

33. Abra a estrutura 2BGQ.

34. Esconda os ribbons e mostre todos os átomos em ball and stick.

35. Abra a ferramenta Tools – Depiction – render by attribute.

36. Escolha attributes of atoms, Attribute: b-factor. Observe o histograma de valores e

faça Apply. Observe a coloração da estrutura. Peça ao docente para lhe explicar o que

é o b-factor.

37. Com a mesma ferramenta , escolha attributes of residues, Attribute:

kdHydrophobicity. Faça Apply. Observe a coloração da estrutura. Peça ao docente

para lhe explicar o que é uma escala de hidrofobicidade.

38. File – Close session.

Sobreposição de proteínas homólogas. Conservação de sequência e conservação

estrutural.

39. Abra as estrutura 2BGQ (aldose redutase de cevada), 2BCJ (aldose redutase humana) e

2ALR (aldeído redutase humana). Esconda todos os átomos e passe para ribbons. Use

a ferramenta rainbow, colorindo por model para distinguir as 3 estruturas.

40. Abra a ferramenta sequence mas só para a 2BGQ. Na janela desta ferramenta,

adicione as outras duas sequências do seguinte modo:

a. Edit – Add sequence

b. From structure e escolha uma das outras duas estruturas. Faça Apply.

c. Repita, agora escolhendo a estrutura que falta.Faça OK. A janela da sequência

apresenta um alinhamento múltiplo das 3 sequências. Não feche esta janela.

41. O Chimera tem uma ferramenta chamada MatchMaker. Esta ferramenta, usada em

proteínas homólogas com sequências semelhantes, realiza uma sobreposição

estrutural baseada no alinhamento das sequências duas a duas, usando esses

alinhamentos como guia para a sobreposição estrutural. Abra a ferramenta com Tools

–Structure Comparison – Match Maker. Depois:

a. Em Reference structures, escolha uma das estruturas

b. Em structures to match escolha as 3 estruturas

c. Desative a opção After superposition compute ....

d. Faça OK e espere um pouco.

42. Observe como as estruturas foram sobrepostas por semelhança de sequência.

43. Na janela do alinhamento múltiplo podemos adicionar os histogramas de conservação

e de RMSD: nesta janela faça Headers – Conservation e Headers – RMSD.

44. Peça ao docente para explicar o que é o RMSD (medida da distância entre estruturas

sobrepostas) Repare que em zonas masi conservadas, o RMSD é menor.

45. Faça uma coloração das estruturas por conservação:

46. Na ferramenta Render by Attribute:

a. Escolha attributes of residues, Attribute: mavConservation. Observe o

histograma de valores e faça Apply. Observe a coloração da estrutura por

conservação de sequência. Apesar de haver zonas bem conservadas, não há

muita regularidade.

b. Com a mesma ferramenta , escolha attributes of residues, Attribute:

mavRMSD. Faça Apply. Observe a coloração da estrutura por conservação

estrutural. Nota a grande conservação estrutural entre estas 3 proteínas.

47. File – Close session.