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Caracterização da reatividade serológica e antigénica em
pacientes com malária grave
Janine Guerreiro Domingos
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biológica
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Orientadores: Investigador Doutor Marcelo Sousa Silva
Professora Doutora Maria Ângela Cabral Garcia Taipa Meneses de Oliveira
Júri
Presidente: Professor Doutor Duarte Miguel Teixeira da França dos Prazeres Orientador: Investigador Doutor Marcelo Sousa Silva
Vogal: Professor Doutor Gabriel António Amaro Monteiro
Novembro, 2015
ii
iii
Agradecimentos
Ao meu orientador, Doutor Marcelo Sousa Silva, em primeiro lugar, por me ter dado a oportunidade
de realizar o estágio no Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Pelo conhecimento, apoio e dedicação
prestada, e pela confiança que depositou em mim para realizar este trabalho.
Ao Doutor Anaxore Casimiro, pela recolha das amostras.
À Doutora Fátima Nogueira, por ter disponibilizado as culturas de P. falciparum. À sua aluna,
Fernanda Murtinheira, pelas primeiras culturas. Ao Tiago Vaz, um muito obrigada por toda a ajuda e
apoio final.
À Professora Ângela Taipa, por sempre se mostrar disponível.
À Daniela Portugal, minha professora de laboratório, um enorme obrigada por tudo que ensinaste
(conhecimento científico e truques laboratoriais), por todas as dúvidas que tiraste e por todo o apoio
que deste.
Às minhas colegas de sala, Daniela Portugal, Joana Frazão, Sónia Pestana, Catarina Azevedo,
Adriana Temporão, Filipa Ferreira, por toda a animação e conversas.
Aos meus pais, irmã, avô Fernando e avó Aida, pelo apoio e carinho.
Ao Francisco Pires, pelo amor e apoio diário. À Ana Rita Brás, por todos os desabafos académicos
e frustrações que tiveste de ouvir. Muito obrigada aos dois.
iv
Resumo
A malária é uma doença infeciosa causada pelo parasita protozoário pertencente ao género
Plasmodium. A principal forma de transmissão manifesta-se através da picada da fêmea infetada do
mosquito Anopheles; contudo, poderá também ocorrer transmissão da malária através de transfusões
sanguíneas, bem como de mãe para filho durante a gravidez.
A imunidade adquirida durante a interação parasita-hospedeiro influencia o quadro clínico da infeção,
uma vez que repetidos níveis de exposição à malária podem levar ao desenvolvimento de uma
imunidade protetora.
Com este trabalho, pretende-se caracterizar as reatividades serológica e imunoquímica envolvidas
na indução e manutenção da imunidade humoral em pacientes (mais concretamente, crianças) com
quadro clínico de malária grave, por P. falciparum.
Pelas análises serológicas de um total de 12 amostras, verificou-se que 8 se apresentaram
serologicamente positivas para anticorpos IgG total anti-P. falciparum e 4 negativas. Relativamente aos
anticorpos totais anti-P. falciparum, verificaram-se 9 amostras serologicamente positivas e 3 negativas.
Para anticorpos IgM anti-P. falciparum, verificou-se que 7 amostras se apresentaram serologicamente
positivas, 4 negativas, e 1 indeterminada.
Pela análise dos perfis de immunoblotting, verificou-se um padrão consistente na imunoreatividade
a antigénios de P. falciparum com massas moleculares na gama dos 190 a 80kDa, bem como um
padrão menos consistente na gama dos 50 a 40kDa, valores estes indo de encontro aos apresentados
em trabalhos já realizados.
Através da análise in silico, as proteínas identificadas neste trabalho poderão ser um ponto de partida
para estudos futuros sobre a resposta imune humoral, apresentando impacto nas estratégias de
controlo e prevenção da doença.
Palavras-chave: Plasmodium falciparum, malária grave, anticorpos, crianças, antigénios parasitários.
v
Abstract
Malaria is an infectious disease caused by a protozoan parasite belonging to the genus Plasmodium.
Its main form of transmission is manifested through the bite of infected female Anopheles mosquito;
however, malaria transmission may also occur both through blood transfusions and mother-to-child
transmission during pregnancy.
Immunity acquired during the parasite-host interaction influences the clinical symptoms of infection,
since repeated exposure levels to malaria can lead to the development of protective immunity.
This work aims to characterize the serological and immunochemical reactivity, involved in the
induction and maintenance of humoral immunity in patients (notably children) presenting a clinical
picture of severe malaria by P. falciparum.
From serological analysis of a total of 12 samples, 8 were serologically positive for total IgG anti-P.
falciparum, while the remaining 4 were negative. For total antibodies anti-P. falciparum, 9 samples were
serologically positive and 3 negative. For IgM anti-P. falciparum, 7 samples were serologically positive,
4 negative, and 1 indeterminate.
Through immunoblotting profile analysis, it was detected a consistent immunoreactivity pattern for P.
falciparum antigens with molecular weights in the range of 190 to 80kDa, and a less consistent pattern
in the range of 50 to 40kDa, which were in line with previous studies.
From in silico analysis, the proteins identified in this study could be a starting point for future studies
on the humoral immune response, impacting control strategies and disease prevention.
Keywords: Plasmodium falciparum, severe malaria, antibodies, children, malaria antigens.
vi
Índice
Página
Agradecimentos................................................................................................................................... iii
Resumo ............................................................................................................................................... iv
Abstract ................................................................................................................................................v
Lista de tabelas ................................................................................................................................. viii
Lista de figuras .................................................................................................................................... ix
Lista de abreviações ............................................................................................................................x
Capítulo 1 - Introdução ........................................................................................................................ 1
1.1 Malária ....................................................................................................................................... 1
1.2 Ciclo de vida e biologia parasitária de Plasmodium spp. .......................................................... 3
1.3 Aspetos clínicos da malária: sinais e sintomas ......................................................................... 6
1.4 Medidas de controlo e prevenção da malária ............................................................................ 8
1.5 Diagnóstico da malária ............................................................................................................ 11
1.5.1 Microscopia ....................................................................................................................... 11
1.5.2 Testes por antigénios: teste de diagnóstico rápido (rapid diagnostic test, RDT) ............. 12
1.5.3 Testes moleculares: reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction, PCR)
........................................................................................................................................................ 12
1.5.4 Testes serológicos ............................................................................................................ 12
1.5.5 Quantitative buffy coat (QBC) ........................................................................................... 13
1.6 Tratamento da malária ............................................................................................................. 13
1.7 Imunologia da malária ............................................................................................................. 15
1.7.1 Resistência genética contra a malária .............................................................................. 15
1.7.2 Imunidade adquirida .......................................................................................................... 16
1.7.3 Antigénios de Plasmodium falciparum .............................................................................. 18
1.7.4 Resposta imunológica humoral ......................................................................................... 19
1.7.5 Resposta imunológica celular ........................................................................................... 22
Capítulo 2 - Objetivos ........................................................................................................................ 26
Capítulo 3 – Materiais e métodos...................................................................................................... 27
3.1 Amostragem............................................................................................................................. 27
3.2 Tratamento e conservação das amostras ............................................................................... 27
3.3 Diagnóstico de infeção por Plasmodium spp. por imunocromatografia .................................. 27
3.4 Parasitas (Plasmodium falciparum) ......................................................................................... 28
3.5 Extração de proteínas totais de Plasmodium falciparum ........................................................ 28
3.6 Quantificação de proteínas totais de Plasmodium falciparum ................................................ 28
3.7 Determinação de anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-Plasmodium falciparum .............. 29
3.8 Determinação de anticorpos IgG total e IgE anti-Plasmodium falciparum .............................. 30
vii
3.9 Determinação de subclasses de anticorpo IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) anti-Plasmodium
falciparum........................................................................................................................................... 31
3.10 Imunodeteção de proteínas de Plasmodium falciparum por immunoblotting ....................... 31
Capítulo 4 – Resultados e discussão ................................................................................................ 34
4.1 Caraterização da população estudada .................................................................................... 34
4.2 Diagnóstico de infeção por Plasmodium spp. por imunocromatografia .................................. 34
4.3 Determinação de anticorpos anti-Plasmodium falciparum ...................................................... 37
4.3.1 Determinação de anticorpos totais (Ig G+A+M) e anticorpo IgM anti-Plasmodium falciparum
........................................................................................................................................................ 37
4.3.2 Determinação de anticorpos IgG total anti-Plasmodium falciparum ................................. 37
4.3.3 Determinação de subclasses de anticorpo IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e do anticorpo IgE
anti-Plasmodium falciparum ........................................................................................................... 39
4.3.4 Resumo dos resultados serológicos específicos de Plasmodium falciparum .................. 39
4.4 Imunodeteção de proteínas de Plasmodium falciparum ......................................................... 44
4.5 Sequenciação para posterior análise in silico de antigénios envolvidos na reatividade
imunoquímica ..................................................................................................................................... 48
Capítulo 5 - Conclusões e perspetivas futuras ................................................................................. 49
Referências bibliográficas ................................................................................................................. 50
Anexos ............................................................................................................................................... 68
Anexo 1 - Parecer sobre Protocolo de Estudo .............................................................................. 68
Anexo 2 - Aprovação do Protocolo de Pesquisa ........................................................................... 69
viii
Lista de tabelas
Página
Tabela 1 - Características da infecção de malária grave pela OMS (18). .......................................... 7
Tabela 2 – Exemplos dos vários tipos de medicamentos usados numa infeção por malária. ........... 9
Tabela 3 - Tratamento aconselhado para malária aguda causada por P. falciparum em grupos
especiais (96). ....................................................................................................................................... 14
Tabela 4 - Critérios de inclusão e exclusão para o recrutamento dos pacientes no estudo (256). .. 27
Tabela 5 - Composição do gel de corrida (10% poliacrilamida) e do gel de empilhamento (4%
poliacrilamida). ...................................................................................................................................... 32
Tabela 6 - Resumo dos métodos de diagnóstico e de serologia utilizados previamente. Adaptado de
(256). ..................................................................................................................................................... 34
Tabela 7 - Resultados dos RDT efectuados (Figura 10) com as amostras em estudo. ................... 35
Tabela 8 - Valores da razão Abs/cut-off para IgG total, anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-P.
falciparum das amostras analisadas. .................................................................................................... 39
Tabela 9 - Valores de Abs para IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgE anti-P. falciparum das amostras
analisadas. ............................................................................................................................................ 41
Tabela 10 – Características sociodemográficas, clínicas e laboratoriais das amostras que foram
avaliadas previamente. Adaptado de (256)........................................................................................... 43
Tabela 11 – Frequência de bandas antigénicas para cada amostra analisada. .............................. 46
Tabela 12 – Frequência das proteínas detetadas nas 12 amostras analisadas na imunodeteção de
antigénios de P. falciparum por immunoblotting. .................................................................................. 47
ix
Lista de figuras
Página
Figura 1 - Países com transmissão corrente de malária (dados de 2013). Adaptado de (19). .......... 2
Figura 2 - Percentagem da população a viver com menos de US $2 por dia. Adaptado de (19). ..... 3
Figura 3 - Ciclo de vida de Plasmodium spp. Adaptado de (36) ......................................................... 4
Figura 4 – Imagens de microscopia: (A) esquizontes de P. falciparum; (B) trofozoítos em fase de anel
de P. falciparum; (C) gametócitos de P. falciparum (41). ....................................................................... 5
Figura 5 - (1) Ilustração de um merozoíto com destaque nos maiores organelos e estruturas celulares.
Adaptado de (47); (2) Ilustração do processo de invasão de eritrocitos por merozoítos (47). ............... 6
Figura 6 - O desenvolvimento das vacinas de malária. Alvos no ciclo da doença que poderiam ser
interrompidos pela vacina. São ilustrados três tipos de vacina candidatos que têm sido intensamente
investigados: pré-eritrocitárias (início da infeção), eritrocitárias (causa da doença) e bloqueadoras de
transmissão (transmissão do parasita do mosquito infetado). Adaptado de (70). ................................ 10
Figura 7 – Exemplo de um RDT (Boson Biotech, China): a linha do controlo (C) permite validar o
teste; S1 é o local onde se adiciona a amostra de sangue; S é onde se adiciona o tampão do teste dado
pelo fornecedor. Especificamente, este teste é positivo para P. falciparum (T2) e P. malariae (T1). .. 12
Figura 8 – Estruturas de alguns componentes usados no tratamento de malária: (A) arteméter,
C16H26O5; (B) lumefantrina, C30H32Cl3NO; (C) artesunato, C19H28O8; (D) amodiaquina, C20H22ClN3O; (E)
mefloquina, C17H16F6N2O. ..................................................................................................................... 14
Figura 9 - Desenvolvimento da imunidade clínica em comparação com a imunidade contra os
parasitas em Kénia. Adaptado de (112). ............................................................................................... 17
Figura 10 – Resultado dos RDT realizados às amostras (nT=12). ................................................... 35
Figura 11 - Determinação da diluição de anticorpo primário a utilizar nos ensaios para determinação
da reatividade serológica de anticorpos IgG total anti-P. falciparum, na concentração fixa de extrato
proteico de 2ng/µL. ................................................................................................................................ 38
Figura 12 - Resultado do ensaio serológico para determinação da reatividade a anticorpos totais (Ig
G+A+M), IgM e IgG total anti-P. falciparum (a cada ensaio, nT=12). .................................................... 40
Figura 13 - Resultado do ensaio serológico para determinação da reatividade a IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4 e IgE anti-P. falciparum (a cada ensaio, nT=12). .......................................................................... 42
Figura 14 - Representação esquemática do complexo estreptavidina-biotina no método ELISA.
Adaptado de (279). ................................................................................................................................ 44
Figura 15 – Perfis de immunoblotting das amostras estudadas. ...................................................... 45
Figura 16 - Percentagem de deteção das proteínas de P. falciparum por immunoblotting. ............. 48
x
Lista de abreviações
AARP2 Asparagine and aspartate rich protein 2 (proteína 2 rica em asparagine e aspartate)
Abs Absorvância
ACT Artemisinin-bases combination therapies (terapias que envolvam artemisinina)
ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity (citotoxicidade celular dependente de
anticorpos)
ADCI Antibody dependent cellular inhibition (inibição celular dependente de anticorpos)
AMA1 Apical membrane antigen 1 (antigénio de membrana apical 1)
ATP Adenina trifosfato
BSA Bovine serum albumin (albumina de soro bovino)
CMI Cell-mediated immunity (imunidade mediada por células)
CSP Circumsporozoite protein (proteína circunsporozoítica)
CTL Cytotoxic T lymphocyte (células T citotóxicas)
DAB Diaminobenzidine (diaminobenzidina)
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (ácido etilenodiaminotetra-acético)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays
G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase (desidrogenase glucose-6-fosfato)
HRP Horseradish peroxidase (peroxidase de rábano)
HRP-2 Histidine-rich protein 2 (proteína 2 rica em histidina)
IFN Interferon (interferão)
IFAT Indirect fluorescencent antibody test
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
IRS Indoor residual spraying (pulverização residual de interiores)
ITN Insecticide-treated bednets (mosquiteiros tratados com inseticida)
LDH Lactate dehydrogenase (lactato desidrogenase)
LLIN Long-lasting insecticidal nets (redes com inseticida de longa duração)
LSA Liver-stage antigen (antigénio da fase hepática)
MHC Major histocompatibility complex (complexo principal de histocompatibilidade)
MSP1 Merozoite surface protein 1 (proteína de superfície do merozoíto 1)
n Número de indivíduos
nT Número total de indivíduos da amostragem
NK Natural killer
NKT Natural killer T
OMS Organização Mundial de Saúde
OPD O-Phenylenediamine dihydrochloride
PBS Phosphate buffered saline (tampão fosfato salino)
PCR Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
pI Ponto isoelétrico
xi
PK Pyruvate kinase (piruvato cinase)
QBC Quantitative buffy coat
RDT Rapid Diagnostic Test (teste de diagnóstico rápido)
RH1 Reticulocyte-binding-like homologue
SALSA Sporozoite and liver-stage antigen (antigénio de esporozoíto e fase hepática)
SDS Sodium dodecyl sulfate (dodecil sulfato de sódio)
SERP Serine-rich protein (proteína rica em serina)
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
STARP Sporozoite threonine and asparagine-rich protein (proteína do esporozoíto rica em
treonina e asparagina)
TEMED Tetramethylethylenediamine
Th T helper
TNF Tumor necrosis factor (factor de necrose tumoral)
TRAP Thrombospondin-related adhesive/anonymous protein (proteína de adesão à
trombospondina)
α Alfa
β Beta
δ Delta
1
Capítulo 1 - Introdução
As doenças infeciosas são causadas por organismos patogénicos, tais como bactérias, vírus,
parasitas ou fungos. A malária, juntamente com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e a
tuberculose, é umas maiores ameaças à saúde pública a nível global, sendo uma das maiores causas
de mortalidade e morbilidade em áreas tropicais (1).
1.1 Malária
A malária é uma doença infeciosa causada por um parasita protozoário pertencente ao género
Plasmodium. A principal forma de transmissão é através da picada da fêmea infetada do mosquito
Anopheles; contudo, também poderá ocorrer transmissão da malária através da inoculação direta de
sangue infetado, por exposição acidental ou através da transfusão de sangue e componentes
sanguíneos de dadores assintomáticos com baixa parasitemia (2,3). Sabe-se que 10 parasitas por
unidade de glóbulos vermelhos são suficientes para transmitir a infeção, através do contato com sangue
infetado. No contexto de uma unidade de glóbulos vermelhos de 250mL, um teste de sensibilidade de
0,00004 parasitas por microlitro de glóbulos vermelhos seria necessário para detetar uma doação
potencialmente infeciosa (4). A incidência de casos de malária transmitida por transfusões é baixa em
países não-endémicos, devido à restrição na seleção de dadores (entrevista médica, questionário pré-
dádiva de sangue), à realização de testes laboratoriais (testes imunológicos ou testes de biologia
molecular) e à utilização de técnicas de inativação de patogénicos (3). Também pode ocorrer malária
congénita, onde as mulheres grávidas infetadas podem transmitir o parasita ao seu filho durante a
gravidez ou o parto (5,6). Há casos reportados de malária congénita na Indonésia (7), Índia (8–11), Irão
(12) e República de Gana (13).
Existem, aproximadamente, 400 espécies de Anopheles; destas, 60 são vetores de malária sob
condições naturais, das quais 30 apresentam índices de infeção mais elevados (14). Cerca de 200
espécies de Plasmodium foram já descritas a partir de vários hospedeiros, entre os quais mamíferos,
aves e répteis (15), mas apenas 5 infetam os humanos: Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale,
Plasmodium malariae, Plasmodium vivax e Plasmodium knowlesi (16). Estas espécies diferem na
morfologia, na virulência, na distribuição geográfica, nos padrões de doença e nos mecanismos de
suscetibilidade e resistência a fármacos.
A maioria da notificação dos casos deve-se a infeções causadas por P. falciparum e P. vivax, mas
P. falciparum causa a forma mais grave da doença. A infeção com este tipo de parasita pode ser fatal
na ausência de reconhecimento imediato da doença e das suas complicações, assim como na ausência
de gestão adequada e urgente do paciente (17). Apesar da espécie P. falciparum ser mais prevalente
no continente Africano, a espécie P. vivax tem uma distribuição geográfica mais ampla que P.
falciparum, pois pode desenvolver-se no vetor Anopheles a temperaturas mais baixas (18), sendo mais
frequente na Ásia e América (19). Embora a espécie P. vivax possa causar infeções por toda a África,
o risco é bastante baixo, devido à ausência do gene Duffy na população africana, que produz a proteína
necessária (glicoproteína Duffy) para que P. vivax invada os glóbulos vermelhos (18,19). Vários
2
polimorfismos no grupo sanguíneo Duffy conferem resistência inata à malária em humanos (20–22).
Nos últimos anos, P. knowlesi também tem causado infeções graves, sendo esta uma espécie que
infecta principalmente macacos, podendo ser transmitida para os seres humanos em determinadas
áreas florestais do sudeste asiático (17,23,24). As espécies P. ovale e P. vivax podem permanecer
“dormentes” no fígado e causar recaídas após meses, ou mesmo anos, da exposição. As infeções
causadas por P. malariae são raramente fatais (25).
O risco de doença e morte por malária está dependente de vários fatores, tais como a frequência de
polimorfismos genéticos protetores e imunidade adquirida do hospedeiro, acesso e uso de serviços
curativos, resistência aos fármacos usados e a existência (ou não) de medidas protetoras das
comunidades contra a infeção. Segundo o relatório mundial da Organização Mundial de Saúde (OMS)
sobre a malária de 2014, estima-se que, globalmente, 3,2 biliões de pessoas em 97 países e territórios
estão em risco de infeção por malária e desenvolver a doença (Figura 1), e 1,2 biliões em alto risco
(considerando-se alto risco uma probabilidade superior a 1 em 1000 de a contrair num ano) (18).
Figura 1 - Países com transmissão corrente de malária (dados de 2013). Adaptado de (18).
De acordo com as estimativas de 2013 da OMS, registaram-se globalmente 198 milhões de casos
de malária (gama de incerteza de 124-283 milhões), o que levou à morte de 584 mil indivíduos (gama
de incerteza de 367-755 mil). Isto representou uma diminuição na incidência de casos e na taxa de
mortalidade de 30% e 47%, respetivamente, a partir de 2000 (18). Segundo o mesmo relatório, estima-
se que 90% de todas as mortes devido à malária ocorram na Região Africana, e crianças com menos
de 5 anos representem 78% dessas mortes (18).
Há sempre um grande debate quanto à veracidade destes valores. Sem uma compreensão
informada da cartografia do risco de malária, a extensão global da doença continuará subestimada (26–
28).
A malária é endémica em 100 países (29) e representa um fardo pesado nas comunidades mais
pobres e vulneráveis, afetando primariamente países de baixo ou médio-baixo rendimento (Figura 2).
3
Dos países endémicos, as comunidades mais pobres são severamente afetadas, tendo um risco mais
elevado de infeção por malária.
Figura 2 - Percentagem da população a viver com menos de US $2 por dia. Adaptado de (18).
A malária em países não-endémicos é um desafio, pois sendo uma doença não tão frequente, a
(in)experiência no diagnóstico e tratamento pode ser fatal para o paciente. Contudo, devido à relação
próxima de Portugal com países africanos, o diagnóstico de malária não é algo raro, e quando um
viajante regressa doente de regiões endémicas, suspeita-se de imediato de uma infeção por malária
(30,31). Anualmente, existem cerca de 50 casos de malária importada em Portugal (dados reportados
ao Sistema de Saúde Nacional, entre 2004 a 2008) (32). Esta notificação pode ser feita através do
preenchimento de um formulário em papel ou online, portanto é possível que o número de casos
reportados não seja representativo da realidade por falha na entrega deste formulário. Também é
possível que alguns casos de malária importada passem despercebidos ou não sejam reportados, em
virtude de os indivíduos apresentarem poucos sintomas clínicos.
1.2 Ciclo de vida e biologia parasitária de Plasmodium spp.
O ciclo de vida do parasita envolve dois hospedeiros: um invertebrado (a fêmea do mosquito
Anopheles) e um vertebrado (o ser humano). Trata-se de um ciclo de vida muito complexo, que envolve
uma sequência de fases diferentes tanto no mosquito, como no ser humano (Figura 3).
4
Figura 3 - Ciclo de vida de Plasmodium spp. Adaptado de (33).
Durante a picada, o mosquito fêmea Anopheles infetado com malária inocula os esporozoítos no
hospedeiro humano (Figura 3.1). Os esporozoítos infetam as células do fígado (Figura 3.2) e maturam
a esquizontes (Figura 3.3), que se rompem e libertam os merozoítos (Figura 3.4) – P. vivax e P. ovale
têm uma fase dormente (hipnozoítos) que podem persistir no fígado e causar recaídas ao invadir a
corrente sanguínea semanas ou anos depois. Um único esporozoíto dá origem a dezenas de milhares
merozoítos em 5-8 dias dentro de um hepatócito (34,35).
Depois desta fase inicial de replicação no fígado (ciclo exo-eritrocitário - Figura 3.A), os parasitas
submetem-se a uma multiplicação assexuada nos eritrócitos (ciclo eritrocitário - Figura 3.B). Os
merozoítos infetam os eritrócitos (Figura 3.5). O ciclo assexuado no sangue demora 72 horas para P.
malariae, 48 horas para P. falciparum, P. vivax e P. ovale, e apenas 24 horas para P. knowlesi (34).
Dentro dos eritrócitos, os merozoítos desenvolvem-se a trofozoítos imaturos (fase anel), que depois
maturam a esquizontes, que se rompem libertando merozoítos (Figura 3.6). Alguns merozoítos
diferenciam-se nas fases eritrocitárias sexuais (gametócitos) (Figura 3.7). A fase sanguínea do parasita
é a responsável pela manifestação clínica da doença.
Os gametócitos, masculinos (microgametócitos) e femininos (macrogametócitos), são ingeridos
pelos mosquitos Anopheles durante a picada (Figura 3.8). A multiplicação do parasita no mosquito é
conhecido como o ciclo esporogónico (Figura 3.C). No estômago do mosquito, os microgametócitos
penetram os macrogametócitos, gerando zigotos (Figura 3.9). Os zigotos, por sua vez, tornam-se
móveis e alongados (oocinetos) (Figura 3.10), invadindo a parede do intestino médio do mosquito, onde
se desenvolvem a oocistos (Figura 3.11). Os oocistos crescem, rompem e libertam esporozoítos (Figura
5
3.12), que migram para as glândulas salivares do mosquito. A inoculação dos esporozoítos (Figura 3.1)
num novo hospedeiro humano perpetua o ciclo de vida da malária (33). Toda a replicação dentro do
hospedeiro humano ocorre através de mitose. No mosquito, ocorre apenas meiose, verificando-se
assim toda a recombinação genética nesta fase de vida do parasita.
Todas as espécies Plasmodium spp. invadem segundo o mecanismo descrito acima, mas P.
falciparum atinge valores mais altos de parasitemia, devido à maior flexibilidade nas vias de recetores
que este parasita pode utilizar para invadir os glóbulos vermelhos (36).
O ciclo de vida do Plasmodium requere uma expressão proteica especializada nos hospedeiros
vertebrado e invertebrado, para a sua sobrevivência intra e extracelular, para a invasão dos vários tipos
de células e para a evasão à resposta do sistema imunitário do hospedeiro.
Na Figura 4, pode-se ver algumas imagens por microscopia de fases presentes no ciclo de vida do
parasita.
(A) (B) (C)
Figura 4 – Imagens de microscopia: (A) esquizontes de P. falciparum; (B) trofozoítos em fase de anel de P. falciparum; (C) gametócitos de P. falciparum (33).
Durante o desenvolvimento assexual de Plasmodium em eritrócitos humanos, o parasita digere cerca
de 75% da hemoglobina da célula hospedeira, mas é incapaz de catabolizar o grupo heme libertado.
Para proteger a membrana do parasita contra os efeitos tóxicos do grupo heme livre, o grupo heme é
polimerizado a hemozoína (um pigmento castanho escuro), que depois se acumula no vacúolo
digestivo, um organelo acídico do parasita. A hemozoína é depois então libertada em conjunto com os
merozoítos aquando da rutura dos eritrócitos parasitados (37–39).
Os merozoítos são células eucarióticas muito pequenas (1-2µm), tendo o reportório convencional de
organelos de células eucarióticas com a arquitetura geral do citoesqueleto de uma célula apicomplexa1:
o complexo apical com organelos secretórios (micronemas, roptrias e grânulos densos), mitocôndria,
núcleo e plastídeo (Figura 5.1) (40).
1 Apicomplexa é o filo dentro do qual o protozoário causador de malária se encontra: (Domínio: Eukaryota;
Reino: Chromalveolata; Superfilo: Alveolata; Filo: Apicomplexa).
6
Figura 5 - (1) Ilustração de um merozoíto com destaque nos maiores organelos e estruturas celulares. Adaptado de (41); (2) Ilustração do processo de invasão de eritrocitos por merozoítos (41).
O contacto inicial entre merozoítos e eritrócitos é um passo crucial, pois o parasita tem de distinguir
entre eritrócitos competentes para invasão e outros tipos de células. Inicialmente, os merozoítos estão
livres no espaço intravascular após a rutura dos esquizontes, e o processo de invasão aos eritrócitos
começa quando um merozoíto se liga à superfície de um eritrócito (Figura 5.2-A). De seguida, o
merozoíto reorienta o fim apical para que este entre em contacto com a superfície do eritrócito (Figura
5.2-B). Posteriormente, uma série de interações de alta afinidade e irreversíveis de recetor-ligando
ocorrem entre o parasita e a célula hospedeira, possibilitando a formação de uma junção apertada que
se move desde o fim apical até o polo posterior, através de um motor de actina-miosina (Figura 5.2-
C,D). Enquanto isto acontece, o parasita invagina a membrana do eritrócito para formar o vacúolo
parasitóforo2, e as proteínas da superfície exterior são parcialmente clivadas à medida que o merozoíto
entra no eritrócito (Figura 5.2-E) (41,42).
1.3 Aspetos clínicos da malária: sinais e sintomas
Todos os casos de malária causada por P. falciparum são potencialmente graves e fatais,
especialmente quando tratados de forma inadequada. O resultado clínico de uma infeção por malária
depende de vários fatores: (1) relativos ao parasita, tais como a resistência aos medicamentos,
velocidade de multiplicação, vias de invasão e cito-aderência; (2) relativos ao hospedeiro, tais como a
imunidade, idade, gravidez e genética; (3) relativos à geografia e aspetos sociais, tais como o acesso
a tratamento, estabilidade política e intensidade de transmissão. Todos estes aspetos influenciam o
estado clínico do indivíduo que pode evoluir de infeção assintomática, infeção sintomática, malária
grave, até à morte (36).
Os sintomas clínicos da malária devem-se principalmente à rutura dos esquizontes e à destruição
dos eritrócitos. Malária grave, geralmente, é causada por P. falciparum; contudo, as espécies P. vivax
e P. knowlesi podem também causar doença grave (23,43). A apresentação de malária aguda causada
por P. falciparum é altamente variável, e mimetiza os sintomas de muitas outras doenças.
2 O vacúolo parasitóforo encontra-se nas células hospedeiras, onde a maioria dos parasitas residem e se
desenvolvem. Durante a invasão da célula hospedeira, os parasitas iniciam a formação de uma membrana (a membrana do vacúolo parasitóforo), que rodeia o parasita intracelular.
7
Embora a febre seja comum, muitas vezes é intermitente e pode mesmo encontrar-se ausente em
alguns casos. A maioria dos pacientes experienciam febre, calafrios, dor de cabeça, dor abdominal,
dores noutras partes do corpo, e diarreia (17,44). Infeções por malária podem levar à disfunção de
órgãos vitais e morte. A OMS estabeleceu vários aspetos clínicos e laboratoriais para definir a malária
grave (Tabela 1).
Tabela 1 - Características da infecção de malária grave pela OMS (17).
Malária grave
Características clínicas Características laboratoriais
Alteração do estado de consciência Hipoglicemia (<2,2mmol/L ou <40mg/dl);
Prostração, isto é, fraqueza generalizada em que o paciente é incapaz de se sentar, estar em
pé ou andar sem ajuda;
Acidose metabólica (bicarbonato de plasma <15mmol/L);
Múltiplas convulsões (mais de dois episódios em 24 horas);
Anemia normocítica grave (hemoglobina <5g/dl e volume globular <15% em crianças;
hemoglobina <7g/dl e volume globular <20% em adultos);
Respiração profunda e dificuldade respiratória (respiração acidótica);
Hemoglobinúria;
Edema pulmonar agudo e Síndrome de Dificuldade Respiratória Aguda;
Hiperlactatémia (lactato >5mmol/L);
Colapso circulatório ou choque, pressão arterial sistólica (<80mmHg em adultos e <50mmHg em
crianças);
Insuficiência renal (creatinina sérica >265μmol/L);
Lesão renal aguda; Edema pulmonar (radiológica).
Icterícia clínica com evidência de outra disfunção de órgão vital;
-
Hemorragia anormal. -
Note-se que estas manifestações podem ocorrer isoladamente ou, como é mais vulgar, em combinação no mesmo paciente.
Naturalmente que valores altos de parasitemia são um fator de risco em infeções malária causadas
por P. falciparum, mas a relação entre parasitemia e prognóstico varia de acordo com o nível de
transmissão da doença. Em áreas de baixa transmissão, a mortalidade por malária grave começa a
aumentar com valores de parasitemia maiores que 100 000/µL (~2,5% parasitemia3), ao passo que nas
áreas de transmissão mais elevada, poderá verificar-se tolerância mesmo a valores mais elevados.
Uma parasitemia maior que 20% é de risco elevado, independentemente do contexto epidemiológico
(17).
Como em todas as doenças, existem fatores de risco para a malária grave, tais como idade superior
a 65 anos, sexo feminino (especialmente se associado a gravidez), condição de “não-imune”,
coexistência de outras condições médicas (por exemplo, SIDA), falta de profilaxia contra a malária,
atraso no tratamento, severidade da doença na admissão (coma, insuficiência renal aguda, choque,
edema pulmonar). Crianças (de 1 mês a 5 anos de idade) em países com alta transmissão apresentam
risco de infeção acrescido quanto à malária grave (44).
3 A parasitemia é dada como o número de eritrócitos infetados a dividir pelo total de eritrócitos (infetados e não
infetados).
8
1.4 Medidas de controlo e prevenção da malária
Apesar de a morbilidade e mortalidade terem diminuído desde 2000, a malária ainda se apresenta
como a doença parasitária que mais afeta os seres humanos. O controlo desta doença exige uma
abordagem multifacetada, que inclui estratégias variadas como o controlo do vetor com pulverização
de inseticida residual, controlo das larvas, medidas de proteção, tais como, mosquiteiros tratados com
inseticida (insecticide-treated bednets, ITN), repelentes de insetos, uso de roupa adequada,
medicamentos contra a malária e vacinas.
O controlo do vetor é um elemento fundamental na estratégia global no combate à malária, havendo
um histórico comprovado de redução ou interrupção da transmissão da doença com sucesso,
especialmente em áreas que são altamente propensas à infeção por malária. A pulverização residual
de interiores (indoor residual spraying, IRS) e redes com inseticida de longa duração (long-lasting
insecticidal nets, LLIN) são as duas principais medidas amplamente aplicáveis de controlo de vetor que
protegem os humanos da picada dos mosquitos portadores da doença (45).
Os mosquiteiros formam uma barreira protetora em tornos das pessoas que dormem sob eles.
Todavia, os mosquiteiros tratados com inseticida são muito mais eficientes que as redes não tratadas,
pois os inseticidas usados nos mosquiteiros matam os mosquitos, assim como outros insetos. Somente
os inseticidas piretróides estão aprovados para uso nas ITN. Estes inseticidas têm apresentado baixos
riscos para a saúde dos seres humanos e outros mamíferos, aliado a um elevado nível de toxicidade
para os insetos, mesmo em baixa concentração. Se estas redes mosquiteiras não forem lavadas, nem
expostas a radiação solar elevada, podem estar ativas até 6-12 meses, pois os piretróides não se
quebram com rapidez. Caso estas redes sejam lavadas, têm de ser retratadas com o inseticida (33).
Em áreas de alta ou moderada transmissão de malária em África, as ITN têm apresentado uma redução
na morte de crianças com menos de 5 anos de 20%, aproximadamente (46–50). Recentemente,
desenvolveram-se as LLIN que podem estar ativas até 5 anos (51), mesmo após lavagens repetidas.
A IRS é a aplicação de inseticida residual de longa duração em superfícies de repouso do vetor da
malária, tais como paredes internas, beirais, e telhados de todas as casas ou estruturas (incluindo
abrigos de animais domésticos), onde os mosquitos portadores da doença podem entrar em contacto
com o inseticida. A IRS é altamente eficiente, quando aplicada corretamente, o que exige capacidade
para desenvolver um programa a nível nacional, bem como as estruturas e sistemas que o suportem.
Sendo aplicada de forma correta, seria uma poderosa intervenção para reduzir rapidamente a
densidade e longevidade do vetor, e consequentemente, a transmissão da malária (52).
Uma diferença significativa entre o uso de IRS e de redes mosquiteiras tratadas é o ponto em que
cada um intervém no combate à malária. A IRS pode fornecer uma pequena proteção das casas
individualmente, impelindo e reduzindo o número de vetores que entram numa casa. Todavia, o grande
impacto na intervenção por IRS ocorre após a alimentação do mosquito. Após a picada, é provável que
o mosquito se desloque para uma parede pulverizada, entrando em contacto com uma dose letal do
inseticida, impedindo que transmita o parasita para outros na vizinhança. Isto significa que para que o
9
IRS seja eficaz, tem de se verificar uma elevada cobertura4 de todos os potenciais locais de repouso
para o vetor, de modo a obter-se um efeito significativo na população do mesmo. Por outro lado, as ITN
ou LLIN inibem a alimentação do mosquito, atuando antes que este possa inocular o indivíduo com os
esporozoítos, tendo assim um efeito letal no vetor. Isto proporciona proteção pessoal, bem como, a
altas taxas de cobertura, um efeito letal sobre a população do vetor (52).
A medicação contra a malária é usada para prevenir ou tratar a infeção. A maior parte destes
medicamentos atacam a fase eritrocitária, que é a fase da infeção que causa a doença sintomática. Os
medicamentos contra a malária mais comummente usados pertencem a cinco classes: quinolinas e
álcoois arilaminas, inibidores da biossíntese de ácido fólico (antifols), derivados de artemisinina,
hidroxinaftoquinona e agentes antibacterianos (Tabela 2) (53).
Tabela 2 – Exemplos dos vários tipos de medicamentos usados numa infeção por malária.
Tipos de medicamentos contra a malária Exemplos
Quinolinas e álcoois arilaminas
Cloroquina, amodiaquina, quinina, quinidina, mefloquina, halofantrina, primaquina,
tafenoquina, lumefantrina, piperaquina, pironaridina
Antifols Pirimetamina, proguanil, cloroproguanil,
trimetoprim
Derivados de artemisinina Artemisinina, diidroartemisina, arteméter,
artesunato
Hidroxinaftoquinona Atovaquona
Agentes antibacterianos com atividade contra a malária
Clindamicina, tetraciclinas
Em determinadas partes do mundo, os parasitas já desenvolveram resistência a um grande número
de agentes contra a malária. Desde 2001 que a OMS recomendou que as terapias que envolvam
artemisinina (artemisinin-bases combination therapies, ACT) fossem usadas como primeira linha de
tratamento na malária aguda causada por P. falciparum (54). Porém, criou-se o Global Plan for
Artemisinin Resistance Containment (Plano Global de Contenção de Resistência à Artemisinina) como
resposta à identificação de resistência à artemisinina na região fronteira entre Camboja e Tailândia, e
com a preocupação que poderia espalhar-se e/ou emergir espontaneamente noutro local (55,56).
A produção de medicamentos anti-infeciosos contrafeitos é um problema difundido e, contudo, pouco
reconhecido, o que contribui para a mortalidade, morbilidade e resistência aos medicamentos por parte
do parasita. Os medicamentos falsos são uma grande ameaça para o controlo da malária, pois não
contêm nenhum composto ativo e podem até conter substâncias perigosas, sendo necessária uma
legislação mais forte, bem como uma melhor vigilância, no sentido de contrariar a produção e
disseminação destes (57–59).
A prevenção da malária em viajantes para países endémicos dependerá das medidas tomadas de
proteção individual contra a picada do mosquito (uso de repelente, camisas e calças longas, dormir sob
mosquiteiras) e quimioprofilaxia. As recomendações para prevenção da malária diferem consoante o
4 Entende-se “alta cobertura” como um termo para indicar que mais de 85% das estruturas foram pulverizadas
na área alvo.
10
país de destino (33), isto é, consoante a probabilidade de infeção por malária. A quimioprofilaxia é
recomendada para os viajantes durante exposição potencial à malária. Para fármacos que não
apresentam atividade contra a fase exo-eritrocitária (fígado), a quimioprofilaxia é administrada durante
a exposição e por quatro semanas posteriores, visando atuar sobre todas as infeções do sangue que
emirjam a partir do fígado (34). Também é aconselhado começar a quimioprofilaxia uma semana antes
da viagem para permitir o atingir certas concentrações terapêuticas dos medicamentos e para
assegurar a tolerância ao medicamento (53). Nenhum medicamento contra a malária é completamente
eficaz, e há que considerar a possibilidade de interação com outros medicamentos que o indivíduo
possa estar a tomar, assim como outras contraindicações médicas (alergias, etc.). Para viajantes,
aconselha-se: atovaquona/proguanil (Malarone®), cloroquina, doxiciclina, mefloquina (Lariam®),
primaquina (33).
Devido à grande lacuna existente na compreensão da interação hospedeiro-parasita, é difícil
identificar a vacina candidata entre os milhares de antigénios potenciais do P. falciparum. As vacinas
para malária que se apresentam como atuais candidatas estão direcionadas às fases do ciclo de vida
do parasita no humano e no mosquito (Figura 6), mas até agora, o número de proteínas estudadas para
o desenvolvimento de uma potencial vacina apresenta-se reduzido (35).
Figura 6 - O desenvolvimento das vacinas de malária. Alvos no ciclo da doença que poderiam ser interrompidos pela vacina. São ilustrados três tipos de vacina candidatos que têm sido intensamente
investigados: pré-eritrocitárias (início da infeção), eritrocitárias (causa da doença) e bloqueadoras de transmissão (transmissão do parasita do mosquito infetado). Adaptado de (60).
O protótipo vacinal mais avançado é RTS,S/AS01, cuja abordagem tem como alvo a fase de
esporozoítos livres e intra-hepáticos (isto é, a fase pré-eritrocitária) do parasita. O modo de ação da
vacina é induzir a quantidade de anticorpos circulantes que reduzam a carga de esporozoítos que
cheguem ao fígado, e além disso, estimular a resposta das células T que promovam a destruição das
células do fígado infetadas e dificultar o desenvolvimento do parasita intracelular. Isto levaria a uma
diminuição significativa nas taxas de infeção em pessoas vacinadas e na carga de parasitas
emergentes a partir do fígado, com consequente impacto na taxa e na gravidade da doença (61). A
11
fase 3 dos testes clínicos de RTS,S/AS01 acabou recentemente (dezembro de 2014), envolvendo
bebés de 6 a 12 semanas e crianças de 5 a 17 semanas. Verificou-se uma maior eficiência da vacina
nas crianças do que nos bebés, mas mesmo a valores modestos de eficiência, o número de casos
revertidos de malária foram substanciais (61–63). Em julho de 2015, RTS,S/AS01, agora conhecida
também como Mosquirix, recebeu “luz verde” pela European Medicines Agency, podendo ser usada
fora da União Europeia na vacinação em crianças jovens, juntamente com medidas protetoras (64).
1.5 Diagnóstico da malária
Umas das razões do fracasso no diagnóstico de malária em países não-endémicos é a incapacidade
de considerar a doença, isto é, a hipótese de ser malária não se coloca como provável; assim, como
prática de rotina clínica, todos os pacientes com febre têm de ser inquiridos sobre viagens recentes.
Contudo, há casos reportados de malária, mesmo com histórico ausente de viagens recentes: a
denominada malária de “aeroporto” (65). Este tipo de malária é adquirida através da picada de um
mosquito Anopheles infetado de origem tropical em indivíduos cuja história geográfica exclui
firmemente a exposição a este vetor no seu habitat natural, aliada à ausência histórica de transfusões
de sangue. Por isto, a OMS recomenda métodos de desinfeção dos aviões com origem em países
endémicos (66).
A necessidade de métodos de diagnóstico eficazes e práticos é real, já que um diagnóstico eficaz
reduziria as complicações e a mortalidade associadas à doença. Uma infeção por malária não pode ser
diagnosticada clinicamente, pois os sinais e sintomas clínicos apresentados podem mimetizar outras
infeções tropicais, tendo portanto que se verificar uma confirmação por diagnóstico laboratorial. A seguir
apresentam-se alguns dos métodos usados no diagnóstico da malária.
1.5.1 Microscopia
A microscopia apresenta-se como a técnica padrão em termos de confirmação laboratorial de
malária. Os parasitas podem ser identificados através da análise ao microscópio de uma gota de
sangue do paciente, espalhado como um “esfregaço” sobre a lâmina. Antes da análise, a amostra é
corada (na maior parte das vezes com coloração de Giemsa) para dar aos parasitas uma aparência
distinta. Esta técnica dependerá da qualidade dos reagentes, do microscópio, bem como da experiência
do técnico de laboratório. Além disso, uma miríade de outros fatores podem comprometer a deteção
do parasita: as 5 formas diferentes das espécies dos parasitas, as diferentes fases no hospedeiro
(fígado e sangue), a endemicidade das diferentes espécies, a movimentação da população, a
parasitemia, a imunidade, os sinais e sintomas, a resistência a drogas, os casos de malária reincidente
(persistindo parasitemia viável ou não), o uso de quimioprofilaxia (ou mesmo o tratamento preventivo)
com base no diagnóstico clínico, podem influenciar a identificação do parasita no teste diagnóstico por
microscopia (53,67,68).
12
1.5.2 Testes por antigénios: teste de diagnóstico rápido (rapid diagnostic test,
RDT)
O RDT é uma forma alternativa de estabelecer rapidamente o diagnóstico de infeção da malária
através da deteção de antigénios específicos da malária no sangue do indivíduo. Uma amostra de
sangue do paciente é aplicada na placa de ensaio, juntamente com certos reagentes. Após certo tempo,
bandas específicas na janela do teste indicam se o paciente está infetado com P. falciparum ou uma
das outras espécies de malária humana (Figura 7) (33). Os testes, normalmente, baseiam-se na
deteção da proteína 2 rica em histidina (histidine-rich protein 2, HRP-2), a partir de P. falciparum, ou da
lactato desidrogenase (lactate dehydrogenase, LDH) específica do parasita, a partir da via glicolítica do
parasita encontrada em todas as espécies (69). O uso do RDT não elimina a necessidade de análise
de amostras por microscopia, pois o RDT pode não detetar infeções com número baixo de parasitemia
que circulam na corrente sanguínea do paciente (53).
Figura 7 – Exemplo de um RDT (Boson Biotech, China): a linha do controlo (C) permite validar o teste; S1 é o local onde se adiciona a amostra de sangue; S é onde se adiciona o tampão do teste dado pelo fornecedor.
Especificamente, este teste é positivo para P. falciparum (T2) e P. malariae (T1).
1.5.3 Testes moleculares: reação em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction, PCR)
Através de PCR, deteta-se os ácidos nucleicos do parasita, com a amplificação específica de uma
região selecionada do genoma. Apesar de esta técnica ser ligeiramente mais sensível que a
microscopia, a sua utilização é limitada, visto tratar-se de uma técnica onerosa e que requer pessoal
bem treinado e especializado. Muitas das vezes, os resultados de PCR também não estão disponíveis
em tempo útil rápido para se mostrarem de valor no estabelecimento do diagnóstico da infeção de
malária. A análise por PCR é mais útil para a confirmação da espécie do parasita após o diagnóstico
estabelecido por microscopia ou RDT (33,70). Por outro lado, em casos de baixa parasitemia e infeções
“mistas”, a análise por PCR demonstra ser um bom método de diagnóstico (71,72); e ao usar
polimorfismo de nucleótido simples, a PCR permite a deteção de resistência dos parasitas aos
medicamentos (73,74).
1.5.4 Testes serológicos
Por serologia, detetam-se anticorpos contra os parasitas da malária, usando ensaios de ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assays) ou IFAT (indirect fluorescencent antibody test). Devido ao
13
tempo necessário para o desenvolvimento de anticorpos e à persistência dos mesmos, testes por
serologia não são práticos para diagnóstico rotineiro de malária (33).
Os testes de ELISA permitem a análise de um largo número de amostras num curto espaço de
tempo. O objetivo básico desta técnica consiste na utilização de uma enzima para detetar a ligação
entre um antigénio e um anticorpo; esta enzima converte um substrato numa reação colorimétrica,
indicando a presença da referida ligação (75,76).
Os testes por IFAT são um procedimento fiável e reprodutível para a deteção de anticorpos contra a
malária, sendo assim um procedimento usado para determinar se um paciente esteve exposto ao
parasita no passado (77). Nesta técnica, procura-se reatividade serológica anti-Plasmodium no soro do
paciente. Caso hajam anticorpos presentes, estes ligam-se aos antigénios parasitários, formando um
complexo antigénio-anticorpo. Posteriormente, adicionam-se anticorpos anti-humanos marcados com
fluoresceína, que vão ligar-se aos anticorpos específicos de malária existentes no paciente. Ao
examinar-se a lâmina num microscópio de fluorescência, vê-se uma reação positiva se o parasita
fluorescer uma cor verde (33).
1.5.5 Quantitative buffy coat5 (QBC)
O QBC é um teste de laboratório para detetar infeções de malária ou outros parasitas do sangue. O
sangue é retirado para um tubo capilar QBC, contendo laranja de acridina (corante fluorescente) e
anticoagulante. Após centrifugação, os eritrócitos com parasitas estão concentrados numa pequena
área do buffy coat, podendo ser observados sob luz ultravioleta. O núcleo do parasita fluoresce num
verde brilhante, enquanto o citoplasma aparece amarelo-laranja (68,78). O corante laranja de acridina
cora os ácidos nucleicos de qualquer parasita de malária na amostra; contudo não é um corante
específico, corando os ácidos nucleicos de qualquer tipo de célula. Consequentemente, o técnico que
usa laranja de acridina tem de aprender a diferenciar os parasitas fluorescentes das restantes células
e outros debris contendo ácidos nucleicos corados. Uma vantagem do laranja de acridina em relação
ao corante de Giemsa é o tempo de espera entre a colheita da amostra de sangue e a apresentação
de resultados: com laranja de acridina, os resultados estão disponíveis em 3-10 minutos, enquanto a
coloração de Giemsa pode demorar mais de 45 minutos (79). A sensibilidade da coloração com laranja
de acridina para deteção de malária em infeções com baixa parasitemia tem sido reportada numa gama
de 41% a 93% (53).
1.6 Tratamento da malária
A malária aguda define-se como a malária sintomática sem evidências dos sinais de gravidade
clínicos e/ou laboratoriais descritos na Tabela 1 (Seção 1.3). Assim, o objetivo do tratamento deste tipo
de malária é curar a infeção o mais rapidamente possível, sendo a cura a eliminação total dos parasitas
causadores da doença na pessoa infetada.
5 Buffy coat é a fração de uma amostra de sangue não coagulado que contém a maior parte dos glóbulos
brancos e plaquetas, após centrifugação por densidade.
14
O tratamento de escolha para malária aguda causada por P. falciparum é a combinação de dois ou
mais medicamentos contra a malária com diferentes mecanismos de atuação, sendo as ACT o mais
recomendado. Os componentes derivados de artemisinina da referida combinação devem ser
administrados durante, pelo menos, três dias para um efeito ótimo. As ACT mais recomendadas são:
arteméter e lumefantrina, artesunato e amodiaquina, artesunato e mefloquina, artesunato e sulfadoxina-
pirimetamina, e diidroartemisinina e piperaquina. As estruturas de alguns compostos mencionados
encontram-se na Figura 8.
Figura 8 – Estruturas de alguns componentes usados no tratamento de malária: (A) arteméter, C16H26O5; (B) lumefantrina, C30H32Cl3NO; (C) artesunato, C19H28O8; (D) amodiaquina, C20H22ClN3O; (E) mefloquina,
C17H16F6N2O.
A escolha da ACT a utilizar variará consoante o nível de resistência da população de parasitas na
região em questão. Na Tabela 3, está indicado o tratamento aconselhado para malária aguda causada
por P. falciparum no caso de grupos especiais de indivíduos (80).
Tabela 3 - Tratamento aconselhado para malária aguda causada por P. falciparum em grupos especiais (80).
Condição Tratamento
Gravidez
(1) primeiro trimestre: quinina e clindamicina por 7 dias (recomenda-se artesunato e clindamicina por 7 dias, se o tratamento anterior indicado falhar); as ACT são indicadas se for o único tratamento
disponível no imediato, ou se o tratamento de quinina e clindamicina por 7 dias falhar; (2) segundo e terceiro trimestres: as ACT conhecidas por serem eficazes na região, ou artesunato e
clindamicina por 7 dias, ou quinina e clindamicina por 7 dias
Mulheres a amamentar ACT, exceto primaquina e tetraciclina
Bebés e crianças jovens ACT
Viajantes que regressem de zonas endémicas
Atovaquona e proguanil, arteméter e lumefantrina, diidroartemisinina e piperaquina, quinina e doxiciclina ou clindamicina; todos por 7 dias
15
A malária grave causada por P. falciparum apresenta-se como uma emergência médica,
necessitando de cuidados intensivos de enfermagem. O objetivo primário no caso deste tipo de infeção
é a prevenção da morte do paciente; a prevenção de repercussões físicas que levem a algum tipo de
incapacidade do indivíduo (no caso da malária cerebral) e recrudescências deverão ser considerados
objetivos secundários a este. Após a avaliação clínica e confirmação do diagnóstico, deve-se iniciar o
mais rapidamente possível o tratamento contra a malária via parenteral, com doses completas do
medicamento que estiver mais acessível.
Para crianças e adultos, administra-se 2,4mg de artesunato por quilograma de peso corporal, via
intravenosa ou intramuscular, na hora de admissão. Nas 12 e 24 horas subsequentes, há o reforço da
administração em quantidades iguais à anterior. Em seguida, recomenda-se o tratamento uma vez por
dia. Arteméter ou quinina é uma alternativa aceitável, caso artesunato por via parenteral não esteja
disponível: (1) 3,2mg de arteméter por quilograma de peso corporal, na hora de admissão; 1,6mg de
arteméter por quilograma de peso corporal por dia, (2) 20mg de quinina por quilograma de peso
corporal, na hora de admissão; 10mg de quinina por quilograma de peso corporal a cada 8 horas (80).
Estes tratamentos podem ser completados com doses de: arteméter e lumefantrina, artesunato e
amodiaquina, diidroartemisinina e piperaquina, artesunato e sulfadoxina-pirimetamina, artesunato e
clindamicina ou doxiciclina, quinina e clindamicina ou doxiciclina.
1.7 Imunologia da malária
O conhecimento da imunidade à malária é absolutamente necessário para o desenvolvimento de
vacinas eficazes contra a mesma. Devido aos diferentes antigénios parasitários expressos nos
hepatócitos e nos eritrócitos, as respostas imunitárias relevantes e a sua especificidade e regulação
não serão as mesmas para as fases pré-eritrocitária e eritrocitária da infeção. Como é o caso da
imunidade de outras infeções, a imunidade contra a malária é o resultado da combinação de resistência
genética, imunidade adquirida, e das características do próprio sistema imunitário de um indivíduo.
1.7.1 Resistência genética contra a malária
Resistência genética indica uma mudança herdada no genoma de um organismo, conferindo uma
vantagem seletiva na sobrevivência do mesmo; estas mutações podem ter efeitos prejudiciais ou
benéficos. De seguida, abordam-se alguns desses casos.
Anemia falciforme (sickle-cell disease)
A anemia falciforme é uma doença caracterizada pela malformação dos glóbulos vermelhos (que
assumem uma forma semelhante a foices), causando deficiência no transporte de oxigénio e dióxido
de carbono. Deve-se a uma mutação num único aminoácido na proteína da hemoglobina dos glóbulos
vermelhos. Caso um indivíduo herde esta mutação de ambos os pais, leva à anemia falciforme
(apresentando o sujeito, consequentemente, uma menor expectativa de vida); caso o indivíduo herde
um gene com mutação e um gene normal, tem uma certa vantagem de proteção contra a malária. Como
resultado, as frequências de portadores de anemia falciforme são altas em áreas endémicas: os
16
parasitas necessitam de se reproduzir no interior dos glóbulos vermelhos, e os glóbulos vermelhos
falciformes não são adequados para esse tipo de função, mesmo quando expostos ao vetor da doença
(33).
Deficiência em desidrogenase glucose-6-fosfato (glucose-6-phosphate dehydrogenase,
G6PD)
A deficiência em G6PD é uma doença hereditária recessiva ligada ao cromossoma X que,
frequentemente, desencadeia uma anemia hemolítica. A condição caracteriza-se por níveis
anormalmente baixos de G6PD, enzima envolvida na via da pentose fosfato, que é especialmente
importante para os glóbulos vermelhos. Nos eritrócitos, G6PD é a fonte de atividade enzimática que
protege da formação de radicais e do stress oxidativo. Embora indivíduos com esta deficiência possam
ser assintomáticos toda a vida, fatores tais como medicamentos, certos alimentos (favas, por exemplo)
ou infeções, podem causar stress oxidativo, levando à anemia hemolítica (81). Indivíduos com esta
deficiência têm resistência contra a malária, pois uma redução na quantidade de G6PD funcional torna
mais difícil a invasão dos glóbulos vermelhos pelos parasitas, verificando-se que a deficiência desta
enzima é mais acentuada em áreas do mundo onde a malária é mais comum (82). Há indícios de que
os parasitas são mais frequentemente observados em eritrócitos normais do que em eritrócitos
deficientes em G6PD (83,84).
Deficiência em piruvato cinase (pyruvate kinase, PK)
A deficiência em PK é uma doença hereditária autossómica recessiva, causada por mutações no
gene do PK. Esta enzima catalisa o passo limitante na glicólise, convertendo fosfoenolpiruvato em
piruvato, com geração de uma molécula de adenina trifosfato (ATP). Na ausência de mitocôndrias (que
faltam nos eritrócitos maduros), a enzima é crítica para a produção de energia (85). Deste tipo de
deficiência resulta que os glóbulos vermelhos não conseguem sintetizar ATP, causando morte celular.
Há indícios que eritrócitos de indivíduos com deficiência em PK são resistentes à invasão por parasitas
P. falciparum (85–87).
Também outras doenças conferem um certo grau de proteção contra a malária: talassemia (doença
hereditária caracterizada pela formação anormal da hemoglobina) (88), eliptocitose (doença hereditária
na qual um número anormalmente grande de eritrócitos do indivíduo são elípticos, em vez da sua forma
típica) (89). Por outro lado, também se postula que algumas mutações nas proteínas de membrana dos
eritrócitos conferem alguma resistência à infeção pelos parasitas (90,91).
1.7.2 Imunidade adquirida
A imunidade adquirida influencia muito como a malária afeta um indivíduo e, consequentemente, a
comunidade. Depois de repetidas infeções de malária, uma pessoa pode desenvolver uma imunidade
parcialmente protetora. Estas pessoas “semi-imunes” podem ser infetadas por parasitas da malária,
mas podem não desenvolver doença grave e, muitas das vezes, não apresentam quaisquer sintomas
típicos da doença (33).
17
Em áreas de alta transmissão de P. falciparum, os recém-nascidos estão protegidos durante os
primeiros meses de vida (presumivelmente, por anticorpos maternos). Com o tempo, esses anticorpos
maternos diminuem e as crianças tornam-se mais vulneráveis a doenças e à morte por malária. Caso
sobrevivam a infeções repetidas numa idade mais avançada (2-5 anos), terão atingido um estado de
semi-imunidade. Em áreas de transmissão baixa, as infeções são menos frequentes e uma maior
proporção de crianças mais velhas e adultos não têm imunidade protetora (33).
Admite-se que a imunidade adquirida é: (1) eficaz em adultos após exposição elevada ininterrupta
ao longo da vida; (2) perdida após o cessar da exposição; (3) específica consoante a espécie; (4)
específica consoante a fase; (5) adquirida a uma taxa dependente do grau de exposição (92).
Imunidade clínica contra a malaria (proteção contra os sintomas da doença) desenvolve-se mais
rapidamente do que a imunidade contra o parasita (Figura 9).
Figura 9 - Desenvolvimento da imunidade clínica em comparação com a imunidade contra os parasitas em
Kénia. Adaptado de (93).
O desenvolvimento de imunidade clínica depende da geração de mecanismos imunes que limitam
os processos inflamatórios da patologia. Em áreas endémicas de moderada a alta intensidade, as
crianças desenvolvem imunidade clínica durante os primeiros 5 anos de vida, mostrando sintomas
reduzidos e mantendo altas cargas de parasitemia. Contudo, as taxas de morbilidade e mortalidade
são consideráveis em crianças com menos de 5 anos, pois o seu sistema imunológico ainda está em
desenvolvimento (Casos graves/morte, Figura 9). Com o início da idade adulta, a imunidade adquirida
confere proteção contra os sinais e sintomas clínicos de malária aguda, devido à continuada exposição
ao parasita (Casos não complicados, Figura 9).
Porém, o desenvolvimento de imunidade contra o parasita é muito demorada (Prevalência
parasitária, Figura 9), passando o indivíduo a conviver com o parasita, isto é, há controlo da infeção,
mas não é totalmente evitada. A imunidade contra parasitemia efetiva depende da exposição de um
vasto reservatório de antigénios específicos de diferentes estirpes, através de um período de tempo
mais longo. Esta imunidade pode ser perdida se o indivíduo não for continuadamente exposto a
diferentes estirpes do parasita (93,94).
18
1.7.3 Antigénios de Plasmodium falciparum
A resposta imune na fase pré-eritrocitária envolve os esporozoítos, as formas intra-hepáticas, os
seus antigénios e a interação com as células hospedeiras, bem como a respetiva resposta imune. Em
1967, Nussenzweig et al. reportaram a produção de imunidade protetora em ratos através da vacinação
de esporozoítos irradiados (por raios X) de P. berghei (95,96). Desde então vários estudos têm sidos
feitos sobre a ação protetiva de esporozoítos atenuados (96,97). Apesar de não ser clara a razão pela
qual a vacinação de esporozoítos atenuados induz uma forte imunidade em comparação com a
induzida pela infeção natural, o grande número de esporozoítos utilizados (centenas de milhares por
vacinação, em vez dos 1-100 por picada na infeção natural) pode estar implicado (98).
Na fase pré-eritrocitária, estão envolvidos vários antigénios, tais como, CSP (circumsporozoite
protein), LSA-1 (liver-stage antigen-1), LSA-3 (liver-stage antigen-3), TRAP (thrombospondin-related
adhesive protein ou thrombospondin-related anonymous protein), STARP (sporozoite threonine and
asparagine-rich protein) e SALSA (sporozoite and liver-stage antigen).
As CSP (40-60 kDa) revestem densamente os esporozoítos; estas proteínas desempenham um
papel crítico na invasão de esporozoítos nos hepatócitos, já que alguns anticorpos contra estas inibem
a invasão aos hepatócitos e a expressão na superfície celular de CSP correlaciona-se com a
infeciosidade do esporozoíto (99), (100).
Pouco tempo após a invasão dos hepatócitos, o parasita começa a produzir LSA-1 (240 kDa), que
se acumula dentro do vacúolo parasitóforo, em torno da massa de merozoítos em desenvolvimento
(101). O papel desta proteína parasitária ainda não está completamente determinado, mas sugere-se
que a LSA-1 esteja envolvida na interação do parasita com os eritrócitos, contribuindo para a invasão
eficiente dos merozoítos hepáticos (102). A LSA-3 (200 kDa) é expressa em esporozoítos, como em
merozoítos hepáticos maduros (103,104).
A TRAP é uma proteína transmembranar do tipo 1 que possui múltiplos domínios adesivos na sua
região extracelular (102). Esta proteína está envolvida na motilidade do esporozoíto e na invasão das
células hepáticas (105).
A STARP (78 kDa) é expressa na membrana dos esporozoítos, mas também é detetada na fase
precoce do anel (102,106). Esta proteína está envolvida na invasão dos esporozoítos a hepatócitos
(107,108).
Em 1996, estudos realizados por Bottius et al. em P. falciparum demonstraram que SALSA é uma
pequena proteína parasitária (70 kDa) localizada na membrana dos esporozoítos, e que continua a ser
expressa na fase que decorre no fígado (109). Puentes et al. sugerem que esta proteína possa ter um
papel na invasão das células hepáticas e na invasão dos merozoítos aos eritrócitos (110).
Como já foi referido anteriormente, os sintomas de malária são causados pela parasitemia na fase
eritrocitária. Sendo assim, a resposta imune do hospedeiro dirige-se contra os antigénios desta fase:
proteínas dos merozoítos e as formas parasitárias intra-eritrocitárias (42). Na fase eritrocitária, estão
envolvidos vários antigénios, tais como, MSP1 (merozoite surface protein 1), EBA-175 (erythrocyte
19
binding antigen-175), AMA1 (apical membrane antigen 1) e RH1 (reticulocyte-binding-like homologue
1).
A MSP1 é uma proteína sintetizada pelos esquizontes intracelulares e as formas hepáticas, sendo
expressa na superfície dos merozoítos libertados aquando da rutura dos glóbulos vermelhos infetados.
Esta proteína está presente em todas as espécies de Plasmodium, sendo que em P. falciparum é
sintetizada como uma proteína precursora de, aproximadamente, 190 kDa, que passa por uma série
de clivagens proteolíticas (111,112). Pensa-se que a MSP1 esteja envolvida na interação inicial do
parasita com os glóbulos vermelhos, sendo pertinente para o processo de invasão (113).
A EBA-175 é uma proteína de 175 kDa localizada nos micronemas que se liga à maior glicoproteína
encontrada em eritrócitos humanos (glicoforina A) durante a invasão, atuando assim como uma “ponte”
entra o parasita e a célula hospedeira (114,115). Deste modo, a EBA-175 está envolvida no
reconhecimento de eritrócitos pelo parasita, e participa na invasão dos eritrócitos pelos merozoítos
(116,117).
A AMA1 é uma proteína membranar do tipo 1, presente no complexo apical dos merozoítos
(acumula-se nos micronemas) (118). É sintetizada como uma molécula de 83 kDa, e processada a 66
kDa dentro do esquizonte pela perda do N-terminal, movendo-se de seguida para a superfície dos
merozoítos (119). Presume-se que esta proteína esteja envolvida no processo de invasão aos
eritrócitos (120,121).
A proteína RH1 liga-se a um recetor resistente à tripsina dependente de ácido siálico na superfície
dos eritrócitos (122,123), mostrando-se relevante no reconhecimento e invasão do eritrócito hospedeiro
(124). Estudos demonstram que a família das RH são expressas na ponta apical (nos micronemas ou
roptrias) durante a fase tardia intra-eritrocitária, o que vai de encontro ao seu papel durante a invasão
(125–128).
Perante o grande número de antigénios produzidos durante o ciclo de vida do parasita, o maior
desafio tem sido identificar antigénios imunodominantes responsáveis pela indução de imunidade
protetora. O mais provável é que uma resposta imune robusta envolva respostas celulares e humorais
a múltiplos antigénios.
1.7.4 Resposta imunológica humoral
O vetor que assegura a transmissão de malária pode também condicionar as respostas humorais.
Sarr et al. mostraram que o desenvolvimento de respostas de imunoglobulinas (Ig) anti-Plasmodium
em áreas subsarianas é diferente de acordo com a área onde a exposição é dependente de diferentes
espécies de Anopheles (vila Mboula com A. gambiae; vila Gankette Balla com A. funestus) (129). Por
outro lado, no campo das doenças transmitidas por vetores, as respostas IgG antisalivares (do mosquito
Anopheles, neste caso) podem ser usadas como marcadores de exposição. Remoue et al. mostraram
que a resposta de anticorpos IgG contra a saliva de mosquitos A. gambiae em crianças numa área de
transmissão sazonal de malária foi mais alta nas que desenvolveram malária clínica (130). As respostas
de anticorpos humanos contra proteínas salivares de Anopheles também pode ser usado para a
avaliação de intervenções de controlo do vetor (131), mas maioritariamente para estudos
epidemiológicos de malária (130,132,133).
20
A evidência mais direta que os anticorpos são mediadores importantes na imunidade contra a malária
vem de estudos de transferência em que anticorpos de adultos imunes foram utilizados com sucesso
para o tratamento de malária grave (134–136).
Os anticorpos específicos para determinado parasita são considerados marcadores de exposição à
infeção. Neste contexto, o papel esperado dos anticorpos contra infeções será ajudar na eliminação do
parasita, de modo a limitar a doença e impedir a entrada de parasitas nas células alvo (137). Deste
modo, as respostas humorais contra Plasmodium envolvem uma variedade de mecanismos: (1) inibição
da invasão de hepatócitos por anticorpos; (2) inibição da invasão de eritrócitos; (3) inibição da
replicação do parasita; (4) opsonização de merozoítos por fagocitose por células mononucleares; (5)
opsonização por fagocitose de eritrócitos infetados; (6) inibição da rotura de esquizontes (136,138).
Devido à crescente evidência do papel protetor de anticorpos anti-Plasmodium, tem-se estudado o
papel das diferentes classes de Ig humanas (IgM, IgD, IgG, IgE e IgA) e subclasses (IgG1, IgG2, IgG3
e IgG4) no desenvolvimento de uma resposta imune. Espera-se que quer os isótopos ou subclasses
de Ig produzidas contra os antigénios específicos de malária tenham uma influência marcante na
eficácia da resposta humoral. As subclasses IgG1 e IgG3 são anticorpos citofílicos, promovendo a
fagocitose, e processos de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). Ao
contrário das subclasses IgG2 e IgG4 que são anticorpos não-citofílicos, competindo pelos mesmos
epitopos que os anticorpos citofílicos, e assim bloqueando a atividade protetora destes (139,140).
Todavia, não existe uma associação clara entre as subclasses de IgG e proteção. Em áreas
endémicas, a predominância de anticorpos citofílicos está associado a baixa parasitemia (141) ou a um
baixo risco de adquisição de malária (142,143). Um estudo com indivíduos infetados com P. falciparum
demonstrou que uma predominância de anticorpos IgG1 e IgG3 estaria associada a proteção contra a
doença, enquanto uma predominância das subclasses IgG2 e IgG4 estaria associada à suscetibilidade
de incorrer num episódio de malária. Os autores deste estudo demonstraram ainda que os soros dos
indivíduos “protegidos” mediavam processos de ADCC in vitro (140). Por outro lado, Aucan et al.
demonstraram um papel protetor de IgG2 por exibir ação citofílica (provavelmente, por ser capaz de se
ligar ao recetor FcɤRIIA-H131 dos monócitos), enquanto IgG4 apresentava associado um maior risco
de infeção (144).
Convencionalmente, as respostas primárias de anticorpos a patogénicos são IgM, enquanto as
secundárias são uma combinação de IgG, IgA e IgE. Pouca informação parece também estar disponível
sobre o papel concreto da IgM em infeções por malária. Rowe et al. mostram que IgM ligam-se à
superfície de eritrócitos infetados, contribuindo para a estabilização de interações entre eritrócitos
infetados e não infetados (145). Também Clough et al. reportaram a ligação de IgM a eritrócitos que
formaram rosetas6 (146). Um estudo numa população de indivíduos do Mali sugere uma ação protetiva
de IgM (147). Estes estudos vão de encontro a outros que também sugerem uma função protetora para
os anticorpos IgM contra infeção por malária (148) ou limitando a severidade da doença (149).
Um estudo com P. chabaudi sugere que IgM tenha um papel importante na limitação da replicação
do parasita durante a fase assexuada eritrocitária (150).
6 A formação de rosetas trata-se da habilidade seletiva de eritrócitos infetados se ligarem a eritrócitos não
infetados, sendo um processo relevante em malária grave.
21
O papel dos anticorpos IgE no desenvolvimento de imunidade contra a malária também tem sido
investigado. Foi reportada a verificação de anticorpos IgE em soros maternos e do cordão umbilical na
Papua-Nova Guiné (151). Perlmann et al. demonstraram a existência de níveis elevados de IgE em
crianças com malária cerebral, sugerindo assim um papel patogénico deste isótopo. Reportaram
também que aproximadamente 85% das crianças e adultos habitantes de áreas onde a malária é
endémica (Libéria, Gâmbia, Madagáscar, Tailândia) apresentam níveis elevados de IgE no sangue
(152). Contudo, outros estudos indicam a associação de altos níveis de IgE com o risco reduzido de
desenvolvimento de malária clínica, sugerindo um envolvimento de IgE na proteção contra a doença
(153,154). Pode-se assim especular que os anticorpos IgE contra a malária, independentemente do
seu possível papel protetor (155), contribuem também para a severidade da doença (156).
Os anticorpos do tipo IgA não tem sido implicados na patologia da malária, apresentando-se mesmo
como uma Ig pouco estudada, sendo que a sua contribuição (se a houver) para a geração de imunidade
protetora contra a malária não é conhecida. Também é o caso da IgD, sendo que esta Ig nem costuma,
de resto, ser alvo de análise em estudos relacionados com a malária.
A produção de anticorpos contra os antigénios da fase pré-eritrocitária pode não prevenir
completamente a fase eritrocitária, podendo contudo controlar a densidade de parasitas reduzindo a
invasão de esporozoítos no fígado e o seu desenvolvimento.
Estudos em modelos murinos indicam que anticorpos anti-CSP diminuem a diferenciação de
esporozoítos em merozoítos no fígado (157–159). Por outro lado, John et al. demonstraram que
crianças do Quénia com altos níveis de IgG anti-CSP, anti-LSA1 e anti-TRAP apresentavam um risco
mais baixo de desenvolvimento de malária clínica do que crianças com baixos níveis desses mesmos
anticorpos. Anticorpos contra a fase pré-eritrocitária conseguem impedir a migração dos esporozoítos
para o fígado bem como a sua invasão dos hepatócitos (160,161), não permitindo a progressão da
infeção. Perlaza et al. realizaram um estudo em macacos Aotus lemurinu imunizados com péptidos
sintéticos de LSA1, LSA3, SALSA e STARP que induziram a resposta de anticorpos e mostraram ser
específicos para as proteínas nativas do parasita em esporozoítos de P. falciparum (162).
Estudos em zonas endémicas sugerem que as respostas de anticorpos contra antigénios dos
merozoítos são “short-lived”, isto é, são altas durante os períodos de transmissão intensa e baixas nos
períodos de transmissão baixa (163,164). Isto terá impacto em estudos serológicos, já que pode dar
azo a resultados “falsos”: (1) um indivíduo pode ser positivo num dado momento, mas negativo na
próxima infeção; ou (2) mesmo que um individuo seja rápido a produzir uma resposta humoral contra
esses antigénios pode ser classificado como negativo, dependendo do quão recentemente a infeção
tenha ocorrido. Kinyanjui et al. sugerem mesmo que o tempo de vida de anticorpos IgG1 e IgG3 anti-
MSP1, anti-MSP2, anti-AMA1 e anti-EBA-175 em crianças do Quénia seja muito mais curto que o
normalmente expectável para o tempo de vida dessas subclasses de anticorpos (165).
Várias evidências em modelos murinos têm demonstrado que a família de AMA1 induz respostas
imunes protetivas mediadas por anticorpos (166–168), tornando a AMA1 uma boa candidata a vacinas
contra a fase eritrocitária (169). Dutta e colaboradores mostraram que anticorpos anti-AMA1 são
22
capazes de inibir os merozoítos de procederem à invasão dos glóbulos vermelhos in vitro, ao
desregularem o processamento proteolítico da proteína (170,171).
De forma semelhante, anticorpos anti-MSP119 não só inibem o processamento de molécula
precursora de MSP1 (172), mas também se ligam a MSP1197, prevenindo assim a ligação dos
merozoítos à superfície dos glóbulos vermelhos (173). Alguns estudos relacionam anticorpos anti-
MSP119 em bebés com proteção de malária clínica (174,175), sugerindo a existência de uma
transferência destes anticorpos da mãe para o bebé. Lyon et al. mostram que anticorpos anti-MSP1 de
dadores imunes à malária formam complexos imunes, levando à aglutinação e inibição da dispersão
dos merozoítos (176).
Por outro lado, também existem várias evidências que suportam o desenvolvimento de uma vacina
contra o domínio de ligação ao recetor de EBA-175, a região F2, já que anticorpos contra esta região
bloqueiam a invasão aos eritrócitos (177–179). Daugherty et al. demonstraram que fragmentos
recombinantes de EBA-175 foram reconhecidos por anticorpos presentes em soros humanos de
indivíduos de áreas endémicas de malária (180). Anticorpos humanos contra a região 2 de EBA-175
estão também associados a proteção clínica contra a malária (181). Um teste clínico de fase I em
adultos numa região não-endémica com EBA-175 recombinante mostrou a existência de anticorpos
anti-P. falciparum funcionais; contudo, há que ter em conta certas limitações, tais como a amostragem
reduzida, a curta duração do acompanhamento e o local (182).
1.7.5 Resposta imunológica celular
Embora se pense que quer a imunidade humoral quer a celular estejam envolvidas na resposta
imune à malária, a importância de cada tipo de proteção contra a malária ainda não se encontra
perfeitamente caracterizada. A resposta imunológica celular induzida por malária protege contra ambas
as fases parasitárias, a pré-eritrocitária e a eritrocitária, sendo os linfócitos T e seus produtos essenciais
nesta regulação.
O grupo de células T CD4+ é ativado por antigénios que apresentem moléculas da classe II do
complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex, MHC), enquanto o grupo
das células T CD8+ é ativado por antigénios que contenham a classe I do MHC. As células T CD4+ são
de maior importância na indução de imunidade na fase eritrocitária, ao passo que as células T CD8+
têm mostrado ter ação citolítica contra as formas hepáticas do parasita (183,184). Feel et al.
demonstraram que células T CD4+ e CD8+ de pacientes não previamente expostos a malária podem
inibir o crescimento do parasita in vitro (185).
As células T CD4+ são classificadas de acordo com o seu padrão de produção de citocinas: as células
T helper (Th)1 produzem interleucina (IL)-2, IL-12, interferão (IFN)-α/γ e fator de necrose tumoral (tumor
necrosis factor, TNF), enquanto que as células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13.
7 Como referido anteriormente, MSP1 é uma molécula precursora de várias. Na altura da invasão dos eritrócitos,
o terminal C de 42 kDa (MSP142) é clivado, produzindo um fragmento solúvel de 33 kDa (MSP133) e um fragmento de 19 kDa (MSP119) que permanece na superfície do merozoíto durante invasão.
23
Em geral, as células Th1 são responsáveis pela imunidade mediada por células (cell-mediated
immunity, CMI); ativam macrófagos e outras células para a produção de mediadores através da
libertação de citocinas inflamatórias. As células Th2 regulam a imunidade humoral, proporcionando
ajuda às células B na produção de anticorpos. As células Th1 e Th2 também regulam a atividade de
uma e outra através das citocinas produzidas: o IFN-γ produzido pelas células Th1 inibe o
desenvolvimento e a proliferação das Th2, enquanto as IL-4 e IL-10 produzidas pelas células Th2
antagonizam o desenvolvimento das Th1 (186–188).
Há evidências que crianças com hiper-parasitemia por P. falciparum apresentem concentrações mais
baixas de IFN-γ do que crianças com malária aguda (184). Por outro lado, há evidências que apontam
um papel protetor nas respostas IFN-γ com impacto em reinfeções (189). Para indivíduos expostos à
malária, Dodoo et al. reportaram uma associação entre a produção de IFN-γ e um risco reduzido de
febre e malária clínica (190). Na fase pré-eritrocitária, o IFN-γ também tem um efeito inibitório in vitro
no desenvolvimento das formas hepáticas do parasita (191).
Respostas de IL-10 anti-LSA-1 estão associadas a resistência a reinfeções, indicando um papel
protetor desta interleucina (192). Estudos em crianças indicam que concentrações elevadas de TNF e
IL-10 estão associadas a casos de anemia causada por malária e a altos níveis de parasitemia
(193,194), mas um baixo rácio de IL-10/TNF é característico de anemia causada por malária (194,195).
Isto vai de encontro ao feedback negativo das células Th1 e Th2: dados apontam que a IL-10 promove
a inibição da produção de TNF (196,197), o que pode sugerir que uma baixa resposta de IL-10 permita
altos níveis de TNF, promovendo a anemia em casos de infeção por malária.
Em malária causada por P. falciparum, níveis altos de IL-4 foram detetados em crianças com malária
grave quando em comparação com casos de malária aguda (198). Troye-Blomberg et al. demonstraram
que a IL-4 auxilia na resposta de anticorpos direcionada contra a exposição ao parasita (199); e von
der Weid et al. mostraram que murinos deficientes no gene IL-4 conseguem controlar e eliminar a fase
eritrocitária da infeção por P. chabaudi com eficiência semelhante aos controlos, sugerindo que IL-4
não é necessária para a eliminação das fases eritrocitárias do parasita (200).
Foram detetados níveis altos de IL-6 em indivíduos com malária grave (201), encontrando-se
também associados níveis altos desta interleucina com resultados fatais (202,203). A produção de IL-
12 parece estar associada a um risco reduzido de parasitemia (190).
As células T CD8+, também conhecidas como células T citotóxicas (cytotoxic/cytolytic T lymphocyte,
CTL), eliminam células infetadas diretamente através de vários mecanismos citolíticos, para além da
libertação de linfocinas (204,205). As respostas das células T CD8+ são caracterizadas principalmente
pela produção de citocinas, tais como IFN-γ e TNF, que medeiam a eliminação de hepatócitos infetados
por via de óxido nítrico (nitric oxide, NO) (206).
Dado que os hepatócitos expressam a classe 1 de MHC, o recetor para as células T CD8+, os
parasitas da fase pré-eritrocitária são capazes de induzir respostas por CTL (186). A imunidade
protetiva conferida por células T CD8+ contra a fase eritrocitária é controversa, já que os eritrócitos
infetados não exibem moléculas do MHC. Todavia, Imai et al. mostraram que a espécie P. yoelii é capaz
de infetar eritroblastos8 que expressam a classe 1 do MHC, sendo assim reconhecidos pelas células T
8 Um eritroblasto é o precursor imediato de um eritrócito normal.
24
CD8+ (207). Posteriormente, os mesmos investigadores sugerem que a atividade citotóxica destas
células envolve a colaboração de fagócitos (208).
As dificuldades com que frequentemente os imunologistas se confrontam ao estudar as respostas
do hospedeiro a P. falciparum levam ao uso de modelos experimentais - principalmente de murinos.
Deste modo, estudos em murinos com P. berghei e P. yoelii demonstraram que a transferência adotiva
de células T CD8+ específicas para os epitopos localizados em CSP protegeu murinos não-imunes
contra infeções por estes parasitas (209,210). Weiss et al. demonstraram em murinos que as células T
CD8+ são os mediadores principais na proteção depois da imunização com esporozoítos atenuados
(211).
A transferência adotiva de clones de células T CD8+ específicos para epitopos expressos em
esporozoítos e formas hepáticas inibe fortemente o desenvolvimento intracelular do parasita
(209,210,212). Outros estudos indicam que a imunização com vacinas que expressem antigénios deste
parasita induzem uma resposta de células T CD8+ capaz de eliminar o desenvolvimento intra-hepático
(213,214). Também estudos com chimpanzés infetados com P. falciparum têm sido usados para
identificar os alvos antigénicos da imunidade por células T CD8+, tais como LSA-3 (215).
Carvalho et al. demonstraram em murinos que, na ausência de células T CD4+, as células T CD8+
iniciam um processo de diferenciação e proliferação durante os primeiros dias após imunização com
esporozoítos de P. yoelii; tendo esta resposta sido reduzida em 90% na presença de T CD4+. Para
além disto, este mesmo estudo demonstrou que a IL-4 é um mediador importante na interação entre
células T (216).
Embora a grande maioria dos estudos sobre células T CD8+ seja realizada em modelos não-
humanos, tem-se alcançado algum conhecimento no sentido de se entender o papel destas células na
infeção de malária em humanos. Todavia, há várias evidências que associam esta classe de linfócitos
à patogénese de malária grave: malária cerebral resultante de infeções por P. falciparum é uma das
complicações mais graves e a causa principal de morte em humanos (217,218). Desta forma, os
estudos em humanos sobre a resposta de células T CD8+ na fase eritrocitária são escassos devido a
questões éticas, sendo a maior parte do conhecimento baseado em modelos murinos.
Ainda assim, Aidoo et al. mostraram que células T CD8+ obtidas de indivíduos a viver em zonas
endémicas de malária reconhecem os epitopos da classe 1 de MHC derivados de antigénios da fase
pré-eritrocitária de P. falciparum e P. vivax. Estes antigénios incluem a CSP, a TRAP, a LSA-1 e a LSA-
3 (219). Alguns testes clínicos com vacinas mostraram induzir boas respostas de células T CD8+ contra
antigénios da fase pré-eritrocitária, em seres humanos (220,221).
As células natural killer (NK) são uma subpopulação de linfócitos, com funções semelhantes às
células T CD8+, mas com recetores distintos de antigénios das células T. As células NK são citotóxicas,
induzindo a apoptose das células-alvo; são capazes de modular a resposta imune através da secreção
de citocinas, tais como, IFN- γ, TNF, IL-13, e de quimiocinas (222).
A depleção de células NK num modelo murino com infeção por P. chabaudi resultou na maior
severidade da doença, com maior parasitemia e mortalidade associadas (223). Artavanis-Tsakonas et
al. demonstraram in vitro que eritrócitos humanos infetados com P. falciparum interagem com células
25
NK humanas, levando à indução de IFN-γ (224). E, quando comparado com esquizontes de P.
falciparum, eritrócitos infetados mostraram induzir uma resposta mais rápida e intensa de IFN- γ por
células NK (225). Por outro lado, estudos apontam para que células NK consigam neutralizar
diretamente eritrócitos infetados por P. falciparum (226,227).
O sistema imune é um complexo biológico extremamente diversificado. As células apresentadas
anteriormente são apenas uma fração de toda a resposta celular envolvida na doença de malária. Para
além das células T e NK, a exposição a antigénios de Plasmodium spp. também envolve células natural
killer T (NKT), células T alfa delta (αδ), macrófagos, monócitos e neutrófilos (136,228,229).
26
Capítulo 2 - Objetivos
Com este trabalho, pretende-se caracterizar as reatividades serológica e imunoquímica, envolvidas
na indução e manutenção da imunidade humoral em pacientes (mais concretamente, crianças) com
quadro clínico de malária grave, por P. falciparum.
Mais especificamente, pretende-se:
(1) Utilizar amostras de soros de pacientes com malária grave na determinação da reatividade
serológica para anticorpos anti-P. falciparum, mais concretamente, anticorpos totais (Ig G+A+M), IgM,
IgE, IgG total, subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4);
(2) Caracterizar por immunoblotting os antigénios envolvidos nesta reatividade serológica;
(3) Realizar uma análise in silico dos antigénios de P. falciparum envolvidos na indução e
manutenção da resposta de anticorpos durante a malária grave.
Os resultados obtidos com este estudo poderão contribuir para a identificação de proteínas
parasitárias durante a infeção grave com P. falciparum, além de potenciar a utilização de tais
marcadores como candidatos antigénicos para o desenvolvimento de vacinas.
27
Capítulo 3 – Materiais e métodos
3.1 Amostragem
Foram recrutadas para este estudo, após consentimento informado escrito dos pais ou adulto
acompanhante, crianças dos 0 aos 16 anos, com sintomas de malária grave ou malária com
necessidade de internamento por intolerância da via oral, observadas nas consultas de pediatria do
Hospital São José de Bor, situado na vila de Bor, a 4km de Bissau, durante os meses de Junho e Julho
de 2011. O diagnóstico de malária grave foi feito através da avaliação clínica, avaliada pelo investigador
ou por outro médico de serviço que recrutava a criança, com base nos critérios da OMS (230).
As amostras foram gentilmente recolhidas pelo Médico Pediatra Anaxore Casimiro. No Anexo 1,
encontra-se o “Parecer sobre Protocolo de Estudo” da Comissão de Ética do Instituto de Higiene e
Medicina Tropical (IHMT), bem como a aprovação do mesmo no Anexo 2.
Os critérios de inclusão e de exclusão estão indicados na Tabela 4.
Tabela 4 - Critérios de inclusão e exclusão para o recrutamento dos pacientes no estudo (230).
Critérios de inclusão Critérios de exclusão
Admissão nas consultas de pediatria do Hospital São José de Bor, durante os meses de Junho e
Julho de 2011 Crianças com diarreia e desidratação grave
Diagnóstico clínico de malária grave ou malária com necessidade de internamento por
intolerância da via oral Crianças com desnutrição grave
Idade entre os 0 aos 16 anos Crianças com pneumonia, meningite, encefalite,
tuberculose ou infeção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana conhecida
Exame microscópico positivo para Plasmodium Ausência de consentimento informado
3.2 Tratamento e conservação das amostras
As amostras de sangue utilizadas neste estudo foram colhidas por punção venosa e
temporariamente armazenadas em tubo de EDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético) K3, a -80ºC no
Projeto de Saúde de Bandim, em Bissau, tendo sido transportadas por avião em contentor refrigerado
para o IHMT, onde ficaram armazenados a -20ºC (230).
3.3 Diagnóstico de infeção por Plasmodium spp. por imunocromatografia
Devido à diferença de tempo entra a recolha das amostras no ano 2011 e a realização dos testes do
presente trabalho no ano 2015, submeteram-se as amostras de sangue de cada paciente a um RDT
(Rapid Malaria pf/pan Antigen Test, Boson Biotech, China), de modo a verificar se o diagnóstico de
infeção por Plasmodium spp. mantinha. Este teste contém uma membrana numa superfície fixa,
revestida com dois anticorpos monoclonais em duas linhas separadas. Um anticorpo é específico para
28
a HRP-2 de P. falciparum, e o outro é específico para a LDH de P. malariae. Deste modo, os antigénios
de P. falciparum e P. malariae podem ser detetados de forma distinta.
O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante: (1) adicionar 5µL de sangue
no poço adequado, (2) adicionar duas gotas do tampão do teste no poço adequado, (3) ler o resultado
do teste após 20 minutos.
3.4 Parasitas (Plasmodium falciparum)
Para a realização das análises serológicas e immunoblotting, utilizou-se a estirpe Dd2 de P.
falciparum, cedida pela Investigadora Doutora Fátima Nogueira da Unidade de Ensino e Investigação
de Parasitologia Médica, IHMT.
O cultivo in vitro de clones de P. falciparum Dd2 foi realizado de acordo com os métodos descritos
por Costa e colaboradores em (16). A cultura consistia na manutenção de eritrócitos, num meio de
cultura RPMI 1640 completo, com hematócrito de 5%, a 37ºC, e atmosfera com 5% de CO2.
3.5 Extração de proteínas totais de Plasmodium falciparum
A extração de proteínas totais de P. falciparum baseou-se no método descrito em (16), com alguns
ajustes.
As culturas de parasita foram transferidas para tubos de 15mL, centrifugadas (centrifuge 5810R,
eppendorf, Alemanha) a 2500g, durante 2 minutos, à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi
descartado.
O pellet foi ressuspenso em tampão de lise (fosfato de sódio 5mM, pH 8 + inibidor de protéases
(cOmplete ULTRA Tablets, Roche, Suíça)), em 5 vezes o volume do pellet. Os tubos foram colocados
em gelo, durante 15 minutos; e depois centrifugados a 3220g, a 4°C, durante 20 minutos. Descartou-
se o sobrenadante.
Posteriormente, lavou-se o pellet três vezes com tampão fosfato salino (phosphate buffered saline,
PBS) frio, centrifugando-o a 18000g, durante 10 minutos, a 4°C, e descartou-se o sobrenadante.
Para a lise dos parasitas e extração das proteínas, adicionou-se 4 vezes o volume do pellet de
tampão de lise com inibidor (0,1% Triton X-100 em PBS + inibidor de protéases (cOmplete ULTRA
Tablets, Roche, Suíça)). Os tubos foram colocados em gelo, durante 30 minutos, sob agitação,
homogeneizando-se a cada 10 minutos no vortex.
Colocaram-se os tubos a -70ºC, durante 5 minutos, e de seguida, a 37ºC, durante 5 minutos. Repetiu-
se este processo mais duas vezes. Após este ciclo, centrifugou-se a 18000g, durante 10 minutos, a
4°C. O sobrenadante foi recuperado, descartando-se a hemozoína.
3.6 Quantificação de proteínas totais de Plasmodium falciparum
A quantificação das proteínas totais de P. falciparum foi realizada segundo o método Bicinchoninic
Acid Protein (Sigma, EUA). A curva de calibração utilizada neste ensaio foi feita com albumina de soro
bovino (bovine serum albumin, BSA), nas concentrações de 200 a 1000µg/mL.
29
Nos poços da placa (BRANDplates microplates, Brand, Alemanha) para a curva de calibração,
adicionou-se 225µL das soluções preparadas consoante a concentração pretendida. Nos poços da
placa para as amostras a quantificar, adicionou-se 200µL do reagente de trabalho (fornecido pelo
fabricante) e de 25µL de amostra, e homogeneizou-se. Incubou-se a placa durante 30 minutos, a 37°C.
Procedeu-se à leitura dos resultados num leitor de microplacas (microplate reader model 680, Biorad,
EUA) a 562nm.
3.7 Determinação de anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-Plasmodium
falciparum
O protocolo para a verificação da presença de anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-P. falciparum
nas amostras analisadas foi adaptado de (231).
Deste modo, adsorveu-se 100µL/poço de extrato total P. falciparum, preparado na concentração
2ng/µL em tampão bicarbonato (0,1M, pH 8,5), em cada poço de uma placa ELISA (Thermo Fisher
Scientific, EUA) de 96 poços. A placa ficou posteriormente a incubar durante a noite, a 4°C.
Lavou-se a placa três vezes com 200µL/poço de tampão de lavagem (0,05% (v/v) Tween-20 em
PBS), para a remoção do excesso de antigénio que não foi adsorvido à placa. Adicionou-se 200 µL/poço
de tampão de bloqueio (5% (m/v) leite em pó em PBS). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à
temperatura ambiente, com agitação orbital, de modo a evitar ligações inespecíficas.
De seguida, lavou-se a placa três vezes, 200µL/poço, com o tampão de lavagem; e adicionou-se
100µL/poço de anticorpo primário (amostra) diluído (1/100 (v/v)) em tampão de anticorpo (1% tampão
de bloqueio em tampão de lavagem). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com
agitação orbital, de modo a permitir a ligação dos anticorpos presentes nos soros.
Lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem, de modo a remover o excesso
de anticorpos que não ficaram ligados ao antigénio adsorvido à placa. Adicionou-se 100µL/poço dos
seguintes anticorpos secundários, diluídos (1/1000 (v/v)) em tampão de anticorpo: anticorpos (do tipo
Ig G+A+M) conjugados com fosfatase alcalina (Zymed, EUA) e anticorpos do tipo IgM conjugado com
fosfatase alcalina (Calbiochem, EUA). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura ambiente,
com agitação orbital.
De novo, lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem; e adicionou-se 100
µL/poço de substrato (1 pastilha (20mg) de 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (Sigma,
EUA)) diluído em 20mL de água. Incubou-se a placa, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, com
agitação orbital, ao abrigo da luz solar. Este substrato produz um produto final solúvel (amarelo).
Finalmente, adicionou-se 50µL/poço de solução stop (hidróxido de sódio (NaOH) 3N) e procedeu-se
à leitura dos resultados num leitor de microplacas (microplate reader model 680, Biorad, EUA) a 405nm.
Para a determinação de anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-P. falciparum, foram usados
controlos negativos (soros de crianças sem qualquer historial de malária) e positivos (soros de
indivíduos com malária aguda).
30
3.8 Determinação de anticorpos IgG total e IgE anti-Plasmodium falciparum
A determinação de anticorpos IgG total e IgE anti-P. falciparum foi realizada de acordo com o método
descrito em (16).
Sendo assim, adsorveu-se 100µL/poço de extrato total de P. falciparum, preparado na concentração
de 2ng/µL em tampão de bicarbonato (0,1M, pH 8,5), em cada poço de uma placa de ELISA (Thermo
Fisher Scientific, EUA) de 96 poços.
Incubou-se a placa, durante a noite, a 4ºC. Lavou-se a placa três vezes com 200µL/poço do tampão
de lavagem (0,05% (v/v) Tween-20 em PBS), para a remoção do excesso de antigénio que não foi
adsorvido à placa. Adicionou-se 200µL/poço de tampão de bloqueio (5% (m/v) leite em pó em PBS).
Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação orbital, de modo a evitar
ligações inespecíficas.
De seguida, lavou-se a placa três vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem; e adicionou-se
100µL/poço de anticorpo primário (amostra) diluído (1/200 (v/v) para IgG total, 1/100 (v/v) para IgE) em
tampão de anticorpo (1% tampão de bloqueio em tampão de lavagem). Incubou-se a placa, durante 1
hora, à temperatura ambiente, com agitação orbital, de modo a permitir a ligação dos anticorpos
presentes nos soros.
Lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem, de modo a remover o excesso
de anticorpos que não ficaram ligados ao antigénio adsorvido à placa. Adicionou-se 100µL/poço dos
seguintes anticorpos secundários, diluídos (1/10000 (v/v)) em tampão de anticorpo: anticorpo anti-IgG
humano conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Biorad, EUA), anticorpo anti-IgE humano
conjugado com HRP (AbD Serotec, Reino Unido). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura
ambiente, com agitação orbital.
Posteriormente, lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem, de modo a
remover o excesso de anticorpo conjugado que não ficou ligado ao anticorpo primário. Adicionou-se
100µL/poço de substrato (10mg O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD), Sigma-Aldrich, EUA)
diluído em 10mL de tampão citrato (ácido cítrico 0,1M; fosfato dissódico 0,1M; 0,0001% (v/v) peróxido
de hidrogénio 30%, pH 5,0) e 10µL de peroxidase de hidrogénio (Sigma, EUA). Incubou-se a placa,
durante 30 minutos, à temperatura ambiente, com agitação orbital, ao abrigo da luz solar. A enzima
HRP na presença de peróxido de hidrogénio catalisa a reação do OPD, produzindo uma substância
cromófora que absorve a 490nm.
Finalmente, adicionou-se 50µL/poço de solução stop (ácido sulfúrico (H2SO4), 4N) e procedeu-se à
leitura dos resultados num leitor de microplacas (microplate reader model 680, Biorad, EUA) a 490nm.
Para a determinação de anticorpos IgG anti-P. falciparum, foram usados controlos negativos (soros
de crianças e adultos sem qualquer historial de malária) e positivos (soros de indivíduos com malária
aguda).
31
3.9 Determinação de subclasses de anticorpo IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) anti-
Plasmodium falciparum
O protocolo para a verificação da presença de subclasses de anticorpo IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4) anti-P. falciparum nas amostras analisadas foi adaptado de (16,231).
Deste modo, adsorveu-se 100µL/poço de extrato total P. falciparum, preparado na concentração
2ng/µL em tampão bicarbonato (0,1M, pH 8,5), em cada poço de uma placa ELISA (Thermo Fisher
Scientific, EUA) de 96 poços. A placa ficou posteriormente a incubar durante a noite, a 4°C.
Lavou-se a placa três vezes com 200µL/poço de tampão de lavagem (0,05% (v/v) Tween-20 em
PBS), para a remoção do excesso de antigénio que não foi adsorvido à placa. Adicionou-se 200 µL/poço
de tampão de bloqueio (5% (m/v) leite em pó em PBS). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à
temperatura ambiente, com agitação orbital, de modo a evitar ligações inespecíficas.
De seguida, lavou-se a placa três vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem; e adicionou-se
100µL/poço de anticorpo primário (amostra) diluído (1/100 (v/v)) em tampão de anticorpo (1% tampão
de bloqueio em tampão de lavagem). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com
agitação orbital, de modo a permitir a ligação dos anticorpos presentes nos soros.
Lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem, de modo a remover o excesso
de anticorpos que não ficaram ligados ao antigénio adsorvido à placa. Adicionou-se 100µL/poço dos
seguintes anticorpos secundários, diluídos (1/1000 (v/v)) em tampão de anticorpo: anti-IgG1 conjugado
com biotina (Sigma, EUA), anti-IgG3 conjugado com biotina (Sigma, EUA), e anti-IgG4 conjugado com
biotina (Sigma, EUA). Incubou-se a placa, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação
orbital.
De seguida, lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem, de modo a
remover o excesso de anticorpo conjugado que não ficou ligado ao anticorpo primário. Adicionou-se
100µL/poço do conjugado peroxidase-estreptavidina (R&D Systems, EUA), diluído em tampão de
anticorpo. Incubou-se a placa, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, com agitação orbital, ao
abrigo da luz solar.
De novo, lavou-se a placa cinco vezes com 200µL/poço do tampão de lavagem; e adicionou-se 100
µL/poço de substrato comercial (R&D Systems, EUA). Incubou-se a placa, durante 30 minutos, à
temperatura ambiente, com agitação orbital, ao abrigo da luz solar.
Finalmente, adicionou-se 50µL/poço de solução stop (H2SO4 4N) e procedeu-se à leitura dos
resultados num leitor de microplacas (microplate reader model 680, Biorad, EUA) a 450nm.
3.10 Imunodeteção de proteínas de Plasmodium falciparum por immunoblotting
Para a deteção das proteínas de P. falciparum envolvidas na reatividade serológica nas amostras
analisadas, recorreu-se à técnica de immunoblotting.
Separaram-se as proteínas presentes no extrato total de proteínas de P. falciparum por eletroforese
em gel de poliacrilamida. Para tal, preparou-se o gel de corrida, com 10% de poliacrilamida, e o gel de
empilhamento, com 4% de poliacrilamida, cujas composições encontram-se descritas na Tabela 5.
32
Tabela 5 - Composição do gel de corrida (10% poliacrilamida) e do gel de empilhamento (4% poliacrilamida).
Gel de corrida
(10% poliacrilamida) (mL) Gel de empilhamento
(4% poliacrilamida) (mL)
Água deionizada 4,1 6,1
Solução de acrilamida (30% (m/v) acrilamida +
0,8% (m/v) bis-acrilamida) 3,3 1,3
Tris-HCl 0,5M pH 6,8 - 2,5
Tris-HCl 1,5M pH 8,8 2,5 -
Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% (m/v)
0,1 0,1
Persulfato de amónia 30% (m/v)
100 100
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
10 10
O extrato proteico foi preparado de modo a obter-se 23μg de extrato proteico total/poço, de acordo
com o descrito em (232), e diluído (1:1) em tampão de amostra (água; Tris-HCl 0,5M pH 6,8; glicerol;
SDS 10% (m/v); azul de bromofenol 0,5% (m/v); β-mercaptoetanol). De seguida, a preparação foi
incubada a 97ºC, durante 5 minutos.
Após polimerização dos géis, aplicou-se 7µL de um marcador de massa molecular (HyperPAGE
Prestained Protein Marker, Bioline, Reino Unido) e o extrato diluído em tampão de mostra previamente
preparado. Após aplicação das amostras, os géis foram submersos em tampão de corrida (250M Tris;
1,92M glicerina; SDS 1% (m/v); água) e submetidos a uma corrente elétrica constante de 80V. Depois
de as amostras entrarem no gel de corrida, aumentou-se a voltagem para 120V, durante o tempo
necessário até a frente da corrida se aproximar do fim.
O protocolo de immunoblotting foi seguido de acordo com o método descrito em (232). Assim, o
conteúdo proteico do gel de poliacrilamida foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (GE
Healthcare, Reino Unido) sobre a qual se executaram as reações de Western Blot. Deste modo, a
membrana foi lavada duas vezes, durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação
orbital, com solução de lavagem (0,05% (v/v) Tween-20 em PBS).
A membrana foi bloqueada com solução de bloqueio (3% (m/v) leite em pó em PBS), durante 1 hora,
com agitação orbital, à temperatura ambiente. Posteriormente, a membrana foi lavada três vezes,
durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação orbital: duas vezes com solução de
lavagem e uma vez com PBS.
A membrana foi cortada em tiras e cada tira foi colocada numa placa. Adicionou-se a cada tira o
anticorpo primário (amostras dos pacientes) diluído (1/100 (v/v)) em tampão anticorpo (1% tampão de
bloqueio em tampão de lavagem), e incubou-se as tiras durante 1 hora, à temperatura ambiente, com
agitação orbital.
De novo, a membrana foi lavada três vezes, durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente, com
agitação orbital: duas vezes com solução de lavagem e uma vez com PBS. Adicionou-se o anticorpo
secundário (anticorpo anti-IgG humano conjugado com HRP) (AbD Serotec, BioRad) a cada tira, diluído
(1/10000 (v/v)) em tampão de anticorpo, e incubaram-se as tiras, durante 1 hora, à temperatura
ambiente, com agitação orbital.
33
Posteriormente, as tiras foram lavadas seis vezes, durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente,
com agitação orbital: cinco vezes com solução de lavagem e uma vez com PBS. Adicionou-se a solução
de desenvolvimento que consiste em tabletes de DAB (3,3’-Diaminobenzidine) (Sigma-Aldrich, USA)
em PBS, e incubaram-se as tiras à temperatura ambiente até ao desenvolvimento de cor (geralmente,
10 minutos). A reação foi terminada com água desionizada e deixou-se a membrana secar ao ar.
34
Capítulo 4 – Resultados e discussão
4.1 Caraterização da população estudada
A média de idades das crianças internadas no âmbito deste trabalho foi de 6,75 anos (mínimo 2
anos; máximo 14 anos), com uma predominância do sexo feminino, representando 58% dos doentes
(n=7). Num estudo anterior, as amostras da população analisada foram caracterizadas clinicamente e
laboratorialmente, tendo-se utilizado para o diagnóstico de malária microscopia ótica, RDT, PCR, e
para deteção serológica ELISA comercial para anticorpos totais (Ig G+A+M) específicos para
Plasmodium spp (Tabela 6) (230).
Tabela 6 - Resumo dos métodos de diagnóstico e de serologia utilizados previamente. Adaptado de (230).
Paciente Microscopia ótica por gota espessa (IHMT)
RDT PCR (P.
falciparum)
Serologia: ELISA comercial, anticorpos totais anti-
Plasmodium spp. (Abs/cut-off)
P1 + + + 13,24
P2 + + + 5,07
P3 + + + 17,23
P5 + + + 0,57
P6 + + + 10,93
P7 + + + 0,45
P8 + + + 21,25
P9 + + + 10,48
P10 + + + 20,39
P11 - +/- + 0,43
P12 + + + 17,40
P13 + + + 0,48
Legenda: (+) positivo; (-) negativo; (+/-) fracamente positivo.
Pela Tabela 6, podemos ver que 66,7% (n=8) da amostra estudada revela presença de anticorpos
totais anti-Plasmodium spp. (valores de Abs/cut-off superiores a uma unidade). Destas amostras, a
amostra P2 é serologicamente positiva para Plasmodium spp. mas com resultados mais baixos que as
restantes (P01, P03, P06, P08, P09, P10 e P12). As amostras P05, P07, P11 e P13 apresentaram
valores de Abs/cut-off inferiores a uma unidade, sendo consideradas serologicamente negativas para
Plasmodium spp. Além disso, a infeção por P. falciparum foi confirmada em todas as amostras através
dos três testes efetuados (microscopia ótica, RDT, PCR) (230).
4.2 Diagnóstico de infeção por Plasmodium spp. por imunocromatografia
Para confirmar a infeção por Plasmodium spp. nas amostras, efetuou-se um RDT a cada uma (Figura
10).
35
Legenda: controlo (C), infeção por P. malariae (T1), infeção por P. falciparum (T2).
Figura 10 – Resultado dos RDT realizados às amostras (nT=12).
Como podemos verificar pela Figura 10, todos os testes efetuados foram validados (linha de controlo
presente em todos). Na Tabela 7, está indicado a reatividade de cada amostra para as espécies
analisada pelo teste.
Tabela 7 - Resultados dos RDT efectuados (Figura 10) com as amostras em estudo.
Amostras P. malariae (T1) P. falciparum (T2)
P1 N S
P2 N S
P3 S S
P5 S S
P6 N S
P7 N S
P8 N S
P9 N S
P10 N S
P11 S N
P12 N S
P13 N S
Legenda: (N) não, (S) sim.
Das doze amostras, todas revelaram presença de, pelo menos, uma espécie de Plasmodium (das
duas dadas pelo teste), sendo P. falciparum a mais predominante. Curiosamente, os indivíduos P3 e
P5 mostram ter infeção quer por P. falciparum, quer por P. malariae.
36
A amostra P11 é a única amostra que deu um resultado positivo mais fraco: na Figura 10, não é
possível ver a banda em T1, mas de fato, o resultado do RDT mostrou que o paciente estava infetado
com P. malariae. Poderá haver várias explicações para este resultado, tais como, baixa carga
parasitária, infeção recente, ou baixa qualidade da amostra (processos de descongelamento podem ter
afetado a mesma).
Este teste específico verifica a existência nas amostras de HRP-2 de P. falciparum e a LDH de P.
malariae, que são os antigénios-alvo mais comuns em RDT. A proteína HRP-2 de 30kDa, sintetizada
apenas por P. falciparum, é libertada aquando a rutura dos esquizontes, sendo portanto encontrada em
sobrenadantes de culturas do parasita ou no sangue de indivíduos infetados com o parasita. A LDH é
uma enzima produtora de energia essencial e é a última enzima na via glicolítica do parasita. É solúvel
e produzida quer nas fases sexuais e assexuais do ciclo de vida do parasita, incluindo os gametócitos
maturos das espécies de Plasmodium que infetam humanos (233).
Contudo, como está indicado na Tabela 6, os ensaios de PCR realizados anteriormente detetaram
infeção por P. falciparum em todas as amostras, incluindo P11. Esta contradição entre os dois testes
de diagnóstico pode dever-se ao polimorfismo no gene de HRP-2 de P. falciparum. A variação na
sequência do gene HRP-2, em certas repetições de aminoácidos, pode afetar a sensibilidade de RDT
baseados em HRP-2. Vários estudos indicam a existência de polimorfismos em Madagáscar (234),
região Ásia-Pacífico (235,236), Índia (237).
Relativamente a LDH, não parece haver nenhum polimorfismo associado a LDH de P. malariae.
Contudo, a deteção deste antigénio também pode falhar, devido à baixa sensibilidade do teste em
casos de infeções com baixa parasitemia.
A variabilidade na especificidade e sensibilidade de RDT está geralmente associada ao processo de
manufaturação dos kits (238). Não foram encontrados outros ensaios na literatura que utilizassem o
mesmo kit de RDT usado nesta dissertação, para analisar a performance do mesmo noutras condições.
O cálculo da sensibilidade e especificidade do RDT usado teria de ter como comparação um outro
teste de diagnóstico, como por exemplo PCR e microscopia.
A sensibilidade de um teste é a proporção de indivíduos com teste positivo na população em estudo
e que possuem a doença:
𝑉𝑃
𝑉𝑃 + 𝐹𝑁 [𝟏]
onde VP são os verdadeiros positivos (pacientes com a doença e cujo teste de diagnóstico deu
positivo) e FN os falsos negativos (pacientes com a doença e cujo teste de diagnóstico deu negativo).
A especificidade de um teste é a proporção de indivíduos com teste negativo na população em estudo
e que não possuem a doença:
𝑉𝑁
𝑉𝑁 + 𝐹𝑃 [𝟐]
Onde VN são os verdadeiros negativos (pacientes sem a doença e cujo teste de diagnóstico deu
negativo) e FP os falsos positivos (pacientes sem a doença e cujo teste de diagnóstico deu positivo).
No caso presente, dado o tamanho reduzido da amostra, estas duas variáveis teriam percentagens
muito altas, o que não seria uma representação fidedigna da realidade.
37
4.3 Determinação de anticorpos anti-Plasmodium falciparum
4.3.1 Determinação de anticorpos totais (Ig G+A+M) e anticorpo IgM anti-
Plasmodium falciparum
Primeiramente, as amostras foram analisadas quanto à reatividade serológica de anticorpos totais
(Ig G+A+M) e IgM anti-P. falciparum. O protocolo foi ajustado no que toca à concentração de extrato
proteico e à diluição do anticorpo primário (amostras), de modo a obter-se uma boa reatividade
serológica. A concentração de extrato proteico escolhida foi de 2ng/µL, de acordo com os resultados
apresentados em (232). Esta concentração não limita a reação antigénio-anticorpo e permite uma boa
diferenciação entre as amostras serologicamente positivas e negativas. A diluição dos soros usada foi
de 1:100, de acordo com os resultados apresentados em (232). Esta diluição permite uma boa
separação entre a reatividade serológica dos controlos negativos e a reatividade serológica dos
controlos positivos.
Além destes parâmetros, também foi necessário determinar um ponto de referência (cut-off) para ser
possível diferenciar um soro serologicamente positivo de um negativo.
O cut-off é dado pela soma da média dos valores de absorvância (Abs) dos soros negativos com o
desvio padrão (SD) a uma dada diluição. Assim, realizou-se um ensaio com controlos negativos e
controlos positivos, para se calcular o valor de SD. A partir da média de Abs dos controlos negativos,
foram calculados cinco pontos de cut-off (+1SD a +5SD). Para cada um desses pontos de cut-off, foram
calculadas a sensibilidade e a especificidade do ensaio, de modo a obtermos a ponderação de SD a
aplicar ao cut-off de cada ensaio, tornando possível a comparação dos ensaios entre si. Desta forma,
escolheu-se a ponderação de +2SD, nos dois casos, pois consegue-se uma sensibilidade e
especificidade de 100%.
O cálculo do cut-off é dada assim pela seguinte fórmula (equação [3] e [4]):
𝑐𝑢𝑡 − 𝑜𝑓𝑓 (𝐼𝑔𝑀) = 𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 ± 2𝑆𝐷 [𝟑]
𝑐𝑢𝑡 − 𝑜𝑓𝑓 (𝐼𝑔𝐺 + 𝐴 + 𝑀) = 𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 ± 2𝑆𝐷 [𝟒]
Ainda para a análise dos resultados foi usado o critério do ELISA comercial (teste Malária EIA,
Biorad, EUA): amostras cuja razão Abs/cut-off seja inferior a 1 são consideras serologicamente
negativas; caso seja superior a 1 são consideradas serologicamente positivas. Contudo, razões
Abs/cut-off que se encontrem entre 0,9 e 1,1 terão de ser analisadas com precaução, sendo
denominadas de indeterminadas.
Os resultados serológicos relativos a anticorpos totais e IgM anti-P. falciparum encontram-se
apresentados na Figura 12 e Tabela 8 (Seção 4.3.4).
4.3.2 Determinação de anticorpos IgG total anti-Plasmodium falciparum
Os ensaios para determinação de anticorpos IgG total anti-P. falciparum foram realizados sob as
mesmas condições de extrato proteico (2ng/µL) descritas na Seção 4.3.1.
38
Na Figura 11, encontra-se o resultado de um ensaio de ELISA realizado com várias diluições de
anticorpo primário na pesquisa de anticorpos IgG total anti-P. falciparum, na concentração fixa de
extrato proteico de 2ng/µL. A diluição dos soros escolhida foi de 1:200, pois certas amostras
ultrapassaram o limite de Abs que o leitor de placas suporta na diluição de 1:100 (Figura 11). Neste
ensaio, foram usados 5 controlos negativos (A, B, C, C16, C17) e 3 positivos (I33, I229, I148). De
realçar que os controlos negativos A, B, C são soros de crianças que nunca tiveram contacto com
malária.
0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0
0
1
2
3
4
Ig G t o t a l
1 /d i lu iç ã o
Ab
s (
49
0n
m)
P 1
P 2
P 3
P 5
P 6
P 7
P 8
P 9
P 1 0
P 1 1
P 1 2
P 1 3
A
B
C
C 1 6
C 1 7
I3 3
I2 2 9
I1 4 8
Figura 11 - Determinação da diluição de anticorpo primário a utilizar nos ensaios para determinação da reatividade serológica de anticorpos IgG total anti-P. falciparum, na concentração fixa de extrato proteico de
2ng/µL.
Para o cálculo do cut-off, seguiu-se o método descrito acima, assim como os mesmos critérios. A
fórmula do cut-off para o ensaio realizado foi então a seguinte (equação [5]):
𝑐𝑢𝑡 − 𝑜𝑓𝑓 = 𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 ± 3𝑆𝐷 [𝟓]
Da mesma forma, foi usado o critério do ELISA comercial (teste Malária EIA, Biorad, EUA) na análise
dos resultados: amostras cuja razão Abs/cut-off seja inferior a 1 são consideras serologicamente
negativas; caso seja superior a 1 são consideradas serologicamente positivas. Razões Abs/cut-off que
se encontrem entre 0,9 e 1,1 terão de ser analisadas com precaução, sendo denominadas de
indeterminadas.
Os resultados serológicos relativos a IgG total anti-P. falciparum encontram-se apresentados na
Figura 12 e Tabela 8 (Seção 4.3.4).
39
4.3.3 Determinação de subclasses de anticorpo IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e do
anticorpo IgE anti-Plasmodium falciparum
Os ensaios para determinação das subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e classe IgE anti-P. falciparum
foram realizados sob as mesmas condições de extrato proteico descritas anteriormente, e a diluição
dos soros usada foi de 1:100.
Não foi possível calcular o cut-off relativamente aos resultados IgE anti-P. falciparum por falta de
uma amostragem verdadeiramente representativa de controlos negativos. Os resultados referentes às
subclasses de IgG anti-P. falciparum foram apresentados em termos de Abs, e não Abs/cut-off, pois
são apenas uma representação da prevalência de cada tipo, e não uma representação quantitativa.
Assim, a Tabela 9 e Figura 13 (Seção 4.3.4) apresentam apenas o valor de Abs lida na determinação
das subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e classe IgE anti-P. falciparum.
4.3.4 Resumo dos resultados serológicos específicos de Plasmodium falciparum
Na Tabela 8, encontram-se os valores da razão Abs/cut-off para IgG total, anticorpos totais (Ig
G+A+M) e IgM anti-P. falciparum das amostras analisadas.
Tabela 8 - Valores da razão Abs/cut-off para IgG total, anticorpos totais (Ig G+A+M) e IgM anti-P. falciparum das amostras analisadas.
Paciente
IgG total Anticorpos totais
(Ig G+A+M) IgM
Abs/cut-off (490nm) Diluição dos soros 1:200
Abs/cut-off (405nm) Diluição dos soros 1:100
P1 12,77 11,05 6,12
P2 3,47 2,22 0,681
P3 8,23 7,56 3,28
P5 0,247 0,688 0,764
P6 3,47 2,19 1,03
P7 0,358 0,374 0,541
P8 14,20 13,46 4,86
P9 7,77 8,37 4,84
P10 7,39 5,56 3,02
P11 0,175 0,323 0,469
P12 7,17 6,96 4,96
P13 0,443 1,46 1,62
Os resultados serológicos relativos a anticorpos IgG total, anticorpos totais (Ig G+A+M) e anticorpo
IgM anti-P. falciparum encontram-se na Figura 12.
40
Ig G+ A + M Ig M Ig G to ta l
0
5
1 0
1 5
Ab
s/c
ut-
off
1
Figura 12 - Resultado do ensaio serológico para determinação da reatividade a anticorpos totais (Ig G+A+M), IgM e IgG total anti-P. falciparum (a cada ensaio, nT=12).
Pela Tabela 8, das 12 amostras totais, verificou-se que 8 são serologicamente positivas para
anticorpos IgG total anti-P. falciparum e 4 negativas. Relativamente aos anticorpos totais (Ig G+A+M)
anti-P. falciparum, verificou-se que 9 amostras são serologicamente positivas e 3 negativas. Para
anticorpos IgM anti-P. falciparum, verificou-se que 7 amostras são serologicamente positivas, 4
negativas, e 1 indeterminada.
Há que salientar que o RDT fornece evidências da presença do parasita nas amostras de sangue
dos indivíduos, e que o método ELISA deteta anticorpos contra antigénios específicos de malária.
Assim, o fato de algumas amostras serem negativas na pesquisa de certos anticorpos não vai contra
os resultados do RDT. Dado que todas as amostras indicaram a presença do parasita da malária, os
dados serológicos sugerem uma “janela” imunológica entre a infeção e a ativação da resposta imune
humoral contra a mesma. Pela Tabela 8, podemos inferir que os pacientes P5, P7 e P11, apesar de
terem dado positivos por RDT, no momento da colheita da amostra de sangue, estes pacientes ainda
não tinham despoletado resposta humoral perante a infeção do parasita.
É necessário ter especial atenção ao paciente P11. Pela Tabela 7 (Seção 4.2), podemos verificar
que este era o único que estava apenas infetado por P. malariae. Ao realizarem-se ensaios serológicos
para a deteção de anticorpos anti-P. falciparum, será previsível que os mesmos ensaios deem
negativos, como se pode verificar pela Tabela 8. Contudo, pela Tabela 6 (Seção 4.1), o teste de PCR
realizado anteriormente deu positivo para infeção por P. falciparum: a ocorrência de contaminações
durante a realização do PCR poderá estar na origem desta contradição de resultados.
Relativamente à importância deste estudo, será de destacar que muitos estudos são feitos sobre a
imunologia da malária em adultos, pessoas que já tiveram várias exposições ao parasita, e deste modo
têm um sistema imune mais robusto. Ao caracterizar-se a resposta imune em crianças que foram
sujeitas à primeira ou a poucas exposições ao parasita, tem-se a oportunidade de caracterizar a
primeira resposta imune humoral de pacientes nestas condições. Através dos níveis de resposta de
anticorpos totais, é possível ver se há reatividade serológica anti-P. falciparum, e a intensidade da
mesma. Com anticorpos IgM e IgG, podemos especular se a infeção é recente ou não.
41
Pela Tabela 8, dado que a IgM é a primeira classe de Ig a ser produzida após infeção, os resultados
do paciente P13 sugerem que, aquando da colheita da amostra, o paciente em questão estava num
processo de resposta humoral muito recente (IgM positiva e IgG total negativa). Os resultados do
paciente P2 sugerem uma resposta mais tardia, com IgG total positiva e IgM negativa.
Pela Figura 12, pode-se observar que os perfis de anticorpos totais e IgG total são semelhantes,
inferindo que os anticorpos totais são praticamente IgG total. Daqui poder-se-ia implicar uma
associação entre altos níveis de IgG e a severidade da doença; o que também vai de encontro ao facto
de IgG conferir proteção contra a malária, com estudos feitos de transferência de Ig de dadores imunes
a pacientes com P. falciparum (135).
Um fator de virulência na patogénese de malária grave por P. falciparum é a formação de rosetas.
Estudos apontam para a ligação de anticorpos IgM à superfície de eritrócitos infetados através do
recetor Fc, que tem demonstrado uma correlação positiva com a formação de rosetas (145,239).
Uma outra evidência para o papel desempenhado por anticorpos IgM em infeções por malária
encontra-se descrito num estudo por Brown et al., onde se sugere que células mononucleares e IgM
de crianças infetadas inibem mais eficientemente o crescimento de P. falciparum in vitro do que IgG
(240).
Vários estudos com antigénios da fase eritrocitária mostram resultados semelhantes. Richards et al.
também mostraram níveis altos de IgG num estudo com crianças (n=206 crianças) em Papua-Nova
Guiné, associando-os a uma proteção contra malária sintomática e altos níveis de parasitemia (241).
Também Nebie et al. associam IgG e IgM a um risco reduzido de malária (n=286 crianças) (242).
É de realçar que o reduzido tamanho da amostra utilizada neste estudo (apenas 12 pacientes) não
invalida os resultados, sendo, contudo, preferível um tamanho maior de amostra para uma melhor
comparação com outros estudos.
Na Tabela 9, encontram-se os valores de Abs para IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgE anti-P. falciparum
das amostras analisadas.
Tabela 9 - Valores de Abs para IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgE anti-P. falciparum das amostras analisadas.
Paciente
Ig1 IgG2 IgG3 IgG4 IgE
Abs (450nm) Diluição dos soros 1:100
Abs (490nm) Diluição dos soros 1:100
P1 0,583 0,023 0,015 0,015 0,004
P2 0,258 0,010 0,011 0,008 0,001
P3 0,180 0,010 0,011 0,007 0,006
P5 0,115 0,007 0,010 0,006 0,001
P6 0,109 0,007 0,009 0,005 0,002
P7 0,103 0,006 0,007 0,005 0,001
P8 0,034 0,005 0,006 0,004 0,005
P9 0,024 0,005 0,006 0,004 0,003
P10 0,007 0,004 0,006 0,003 0,001
P11 0,005 0,003 0,005 0,002 0,001
P12 0,004 0,010 0,011 0,006 0,004
P13 0,002 0,005 0,006 0,004 0,002
42
Os resultados serológicos relativos às subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e classe IgE anti-P.
falciparum encontram-se na Figura 13.
Ig G1 Ig G2 Ig G3 Ig G4 Ig E
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
Ab
s
Figura 13 - Resultado do ensaio serológico para determinação da reatividade a IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgE anti-P. falciparum (a cada ensaio, nT=12).
Com os dados apresentados na Figura 13 e Tabela 9, pretende-se avaliar a qualidade de resposta
das subclasses de IgG, e a partir daí, especular sobre o mecanismo envolvido na resposta humoral.
Com os resultados elevados de IgG total anti-P. falciparum obtidos, poder-se-ia esperar resultados
também “elevados” em termos dos níveis das várias subclasses de IgG. Contudo, há que salientar que
os métodos usados para deteção de IgG total e subclasses de IgG anti-P. falciparum foram diferentes
(questão abordada mais à frente). Além disso, não são métodos quantitativos (leitura de Abs em vez
de valores de concentrações); dão apenas perfis de anticorpos. Deste modo, pode-se afirmar que a
IgG total é predominantemente IgG1, pela avaliação do padrão de resposta de subclasses de IgG
presente na Figura 13.
Uma situação curiosa que se pode verificar é que o paciente que apresentou a resposta mais alta de
IgG total anti-P. falciparum (P8) não é o mesmo que apresentou a resposta mais alta de IgG1 (P1), ao
contrário do que se poderia esperar. A explicação para este resultado poderá provir de características
intrínsecas do sistema imune de cada paciente. A idade, características sociodemográficas, clínicas e
laboratoriais destes pacientes, descritos em (230), podem também afetar o resultado da resposta
humoral dos pacientes (Tabela 10); para além da diferença dos métodos mencionados acima.
43
Tabela 10 – Características sociodemográficas, clínicas e laboratoriais das amostras que foram avaliadas previamente. Adaptado de (230).
Características Exemplos avaliados
Sociodemográficas
Região, escolaridade, cartão de saúde, vacinação atualizada, aleitamento materno no primeiro ano de vida, número de divisões da casa, tamanho do agregado, número de crianças no agregado, água canalizada, uso de rede
mosquiteira e inseticida.
Clínicas
Duração da doença, tempo decorrido desde a última refeição, toma anterior de medicação, peso, historial de febre, de vómitos, de convulsões, de perda
de consciência, de cefaleias, de dores articulares, de diarreia, de tosse, malária cerebral, respiração acidótica, desidratação, prostração, icterícia,
dispneia.
Laboratoriais Hemoglobina, hematócrito, leucócitos, plaquetas, glicémia, creatinina
Tendo em conta que as subclasses específicas de IgG podem determinar o tipo de resposta humoral,
neste estudo, mostrou-se haver uma predominância de IgG1 (subclasse citofílica), o que sugere que
tais anticorpos estejam envolvidos na opsonização de eritrócitos infetados com o parasita, como
sugerido em estudos já publicados (243,244).
Apenas com os ensaios realizados não é possível ter certezas sobre qual a ação que anticorpos do
tipo IgG1 anti-P. falciparum poderá ter na resposta humoral dos pacientes. Poder-se-á apenas sugerir
com base em estudos já publicados. Tal como foi referido anteriormente, anticorpos citofílicos
promovem a fagocitose, e processos ADCC. Além disso, também há evidências que indicam que estas
subclasses de anticorpos agem em conjunto com monócitos, em processos de inibição celular
dependente de anticorpos (ACDI) (245,246). Estudos de ADCI indicam que anticorpos IgG1 e IgG3 de
dadores imunes inibem fortemente o crescimento do parasita na presença de monócitos (247,248).
Curiosamente, Pinto et al. também reportam resultados semelhantes com condições do estudo muito
similares às presentes nesta dissertação. Ao avaliar a resposta das subclasses de anticorpo IgG anti-
P. vivax, em 34 crianças de 0 a 15 anos de idade, os investigadores reportam uma predominância de
anticorpos citofílicos sobre os não-citofílicos. Mais concretamente, os pacientes mostraram uma
resposta predominantemente de IgG1, sendo que 28 das crianças envolvidas no estudo nunca tiveram
qualquer historial anterior de malária e 6 apresentaram um ou dois episódios de malária (249).
Egan et al. indicam que anticorpos contra MSP119 são predominantemente IgG1 (250). Neste estudo
(250), o perfil das subclasses de IgG é muito semelhante ao representado na Figura 13, obtido no
presente trabalho.
Como se pode verificar pela Figura 13 e Tabela 9, não foram detetados anticorpos IgE anti-P.
falciparum. Desta forma, não se pode concluir nada com certeza, relativamente à grande controvérsia
entre o papel protetor (153–155) ou não (152,156) desta Ig numa infeção por malária, tal como já foi
dito anteriormente.
Além de que, poder-se-ia questionar até que ponto a reatividade serológica IgE anti-P. falciparum
não poderá estar subestimada, na medida em que o método de ELISA usado nesta determinação
serológica não recorreu ao uso do complexo biotina-estreptavidina, ao contrário da determinação das
subclasses de IgG anti-P. falciparum. Normalmente, o complexo biotina-estreptavidina é utilizado
quando o alvo de interesse é expresso em níveis baixos e pode não ser detetado usando apenas os
anticorpos secundários. Assim, conjugando-se muitas moléculas de biotina ao anticorpo secundário, e
44
através da vantagem adicional de a estreptavidina ter uma alta afinidade com a biotina, tem-se um
passo de amplificação. Com a estreptavidina ligada a HRP, proteínas que são expressas a baixos
níveis estão mais propensas de serem detetadas (Figura 14) (251).
Figura 14 - Representação esquemática do complexo estreptavidina-biotina no método ELISA. Adaptado de (252).
Deste modo, põe-se em questão se os níveis de IgE anti-P. falciparum na população analisada são,
de fato, baixos, ou o sistema não tem sensibilidade suficiente para a deteção de níveis baixos deste
anticorpo.
Perante a hipótese da população analisada mostrar níveis elevados de IgE anti-P. falciparum, o
número reduzido de elementos na amostra também não permitiria tirar conclusões fiáveis sobre o
assunto. Tratando-se de crianças com malária grave, colocar-se-ia a questão se esses anticorpos IgE
estariam a ajudar ou não no combate à infeção. Neste caso, seriam necessários testes in vitro para
esclarecer essa questão, para além de ser indispensável repetir o ensaio com uma amostragem maior
nas mesmas condições.
4.4 Imunodeteção de proteínas de Plasmodium falciparum
Realizou-se a deteção de antigénios de P. falciparum por immunoblotting nas amostras da
população estudada. A concentração proteica de extrato total de P. falciparum foi escolhida com base
em estudos efetuados anteriormente (232), tendo-se utilizado 23μg de extrato proteico total/poço. Esta
concentração proteica é a que permite uma melhor resolução do gel e melhor visualização das
proteínas de P. falciparum na membrana de nitrocelulose. A diluição dos soros foi escolhida de acordo
com a Figura 11 (Seção 4.3.2). Através da Figura 11, é possível estabelecer o valor limite a partir do
qual temos reatividade serológica (1:200). Logo, no immunoblotting, escolheu-se uma diluição ainda
mais concentrada (1:100), para garantir bons resultados.
Neste teste, utilizou-se um controlo positivo, tratando-se de amostras de reatividade elevada para
anticorpos IgG total anti-P. falciparum de malária aguda em adultos, de modo também a ser possível a
validação do ensaio e a avaliação do perfil proteico de P. falciparum. Recorreu-se também a um
controlo negativo, tratando-se de amostras de crianças sem qualquer historial de malária.
Na Figura 15, é possível ver o perfil de immunoblotting para cada amostra.
45
Legenda: (M) marcador de massa molecular, (C+) amostra de soro positivo; (C-) amostra de soro negativo.
Figura 15 – Perfis de immunoblotting das amostras estudadas.
Pela Figura 15, no controlo negativo, é possível constatar que não há reatividade antigénica com
proteínas de P. falciparum, o que vai se encontro ao esperado, tratando-se de amostras de crianças
sem qualquer historial de malária.
Por ELISA, as amostras dos pacientes P5, P7, P11 e P13 eram serologicamente negativas
relativamente a anticorpos IgG total anti-P. falciparum. Pela Figura 15, pode-se ver que as tiras dos
pacientes P11 e P13 apresentam perfis iguais ao controlo negativo; não se verificou qualquer deteção
de proteínas específicas de P. falciparum. Nas tiras dos pacientes P5 e P7, é possível ver-se algumas
bandas, contudo o perfil proteico não é tão acentuado como o controlo positivo, vendo-se apenas uma
fraca imunoreatividade nos soros dessas amostras ao serem expostos a antigénios de P. falciparum.
Não se pode comparar de forma absoluta os resultados obtidos pelos dois métodos, pois não se
encontram nas mesmas condições (por exemplo, diluição dos soros). Por serologia, utilizou-se uma
diluição dos soros de 1:200, enquanto por immunoblotting foi de 1:100. Daí que presumivelmente se
tenha detetado antigénios que reagiram com anticorpos IgG anti-P. falciparum, que possivelmente não
foram detetados por ELISA, nas amostras P5 e P7. Além de que a sensibilidade e a especificidade dos
testes de ELISA e de immunoblotting diferem. Os resultados proporcionados pelo método ELISA
tendem a ter menor sensibilidade e menor especificidade que por immunoblotting (253,254).
Ao analisar os perfis de immunoblotting das amostras de pacientes com malária grave, é possível
identificar um padrão consistente relativamente à imunoreatividade de antigénios com pesos
moleculares na gama de 190 a 80kDa (Figura 15, zonas 1 e 2). Estes resultados são semelhantes aos
obtidos num estudo com 321 indivíduos, com idade média de 48,47 anos, com estadia prévia em zona
endémica (232).
Também existe um padrão de imunoreatividade, apesar de não ser tão consistente em todas as tiras,
entre os pesos moleculares na gama de 50 a 40kDa (Figura 15, zona 4). Um estudo com 227 indivíduos
com malária importada apresenta um padrão semelhante ao detetado neste ensaio (16).
46
Através do marcador de massa molecular utilizado, é possível estimar o peso molecular dos
antigénios de P. falciparum que reagiram com anticorpos IgG anti-P. falciparum. De realçar também
que o peso molecular determinado é uma aproximação do valor real.
Na Tabela 11, podemos ver a frequência das proteínas detetadas em cada amostra por
immunoblotting. De realçar que a representação esquemática do perfil proteico é pessoal e subjetivo.
Pela Tabela 11, é possível ver as zonas 1, 2, 3, 4 e 5 indicadas na Figura 15.
Tabela 11 – Frequência de bandas antigénicas para cada amostra analisada.
Pesos moleculares calculados
(kDa)
Paciente Zonas
P1 P2 P3 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13
182 × × × × × × × ×
1
158 × × × × × × ×
149 × × × × × × ×
137 × × × × × × ×
125 × × × × × × ×
119 ×
2 117 ×
103 × × × × × × × × ×
97 × × × × × × × × × ×
78 × × × ×
3
75 × × × × ×
73 × × × × × × ×
65 × ×
61 × × ×
58 × × × ×
4
53 × × ×
50 × × × × × × ×
45 × × × × ×
42 × × × × × ×
33 × × ×
5 26 × × × × × ×
25 × × × × × × ×
20 × × × × × × ×
Nota: as colunas a rosa indicam as amostras que foram serologicamente negativas para anticorpos IgG total anti-P. falciparum por ELISA.
Alerta-se para a possibilidade de as bandas de menor peso molecular (como, por exemplo, as de
26, 25 e 20kDa) representarem frações degradadas das proteínas de maior peso molecular. A
degradação pode ter acontecido aquando do processo de extração de proteínas totais de P. falciparum,
ou mesmo devido a processos de descongelamento do extrato, apesar de terem sido tomadas
precauções adequadas.
Na Tabela 12, estão indicadas as proteínas mais frequentes detetadas nas amostras analisadas.
Com base nos pesos moleculares calculados indicados na Tabela 12, é possível sugerir possíveis
proteínas envolvidas na resposta humoral dos pacientes estudados, com base em estudos já
publicados.
47
Tabela 12 – Frequência das proteínas detetadas nas 12 amostras analisadas na imunodeteção de antigénios de P. falciparum por immunoblotting e possível associação com proteínas já descritas na literatura.
Pesos moleculares calculados (kDa)
Percentagem (%)
Referências na literatura
182 67 -
158 58
A proteína RH4, de 160kDa, está envolvida na ligação à superfície dos eritrócitos, e Tham et al. indicam que anticorpos de indivíduos expostos à malária mostram reatividade contra RH4 (255).
149 58
Barale et al. descreveram um antigénio de P. falciparum, proteína 2 rica em asparagina e aspartato (AARP2) de 150kDa, que é sintetizada primeiro na fase anel, e acumulada subsequentemente nos trofozoítos e esquizontes (256).
137 58 -
125 58
Uma proteína rica em serina (SERP) de 126kDa tem sido alvo de diferentes estudos: Banic et al. reportam boas respostas humorais contra este antigénio em adultos numa zona endémica (257), e Soe et al. demonstraram que a ação conjunta de anticorpos anti-SERP com monócitos inibem o crescimento in vitro de P. falciparum (258).
103 75 -
97 83
Jouin et al. reportam um grupo de três antigénios com ponto isoelétrico (pI) distinto, mas com um peso molecular de 96kDa, como alvo de imunidade protetora quer em humanos, quer em macacos (259). Uma dessas proteínas com um pI de 5,25 é termoestável, e é produzida na fase dos trofozoítos, sendo mais ativa nos esquizontes (260). Uma ressalva a fazer é que o fracionamento proteico do extrato total de P. falciparum através do gel de poliacrilamida apenas separou as proteínas com base no seu peso molecular, e não se teve em conta o seu pI.
75 42
P. falciparum produz uma proteína de 75kDa, presente na superfície dos merozoítos, que segundo um estudo realizado por Richman et al. estimulava a produção de anticorpos IgG (261).
73 58 -
50 58
Epping et al. demonstraram que anticorpos contra um antigénio de 51kDa localizado na superfície da membrana de P. falciparum inibia o crescimento do parasita in vitro (262).
45 42 -
42 50
Com um peso exato de 42kDa, existe o antigénio MSP142: MSP1 é secretada como um precursor de 195kDa, sendo posteriormente processada por protéases, produzindo fragmentos de 83, 28-30, 30-45 e de 42kDa (263). MSP142 está envolvida no processo de invasão dos merozoítos nos eritrócitos (264).
26 58 -
25 58 -
20 58 Em dada altura, a proteína MSP142 é clivada de novo, formando dois fragmentos (MSP133 e MSP119) (265).
Estes resultados, ainda que sejam apenas sugestões na identificação de proteínas que reagiram
com anticorpos IgG específicos de P. falciparum, podem mostrar-se relevantes no desenvolvimento de
novos alvos proteicos como candidatos a vacinas.
48
4.5 Sequenciação para posterior análise in silico de antigénios envolvidos na
reatividade imunoquímica
Para a análise in silico dos antigénios envolvidos na reatividade imunoquímica, foi feito de novo um
gel de poliacrilamida, de acordo com o método descrito na Secção 3.10. As proteínas de interesse
foram cortadas e enviadas para sequenciação por espectrometria de massa, no Institute for Molecular
and Cellular Biology, University of Strasbourg, França.
As proteínas de P. falciparum foram escolhidas de acordo com a sua percentagem de deteção por
immunoblotting (Figura 16).
Figura 16 - Percentagem de deteção das proteínas de P. falciparum por immunoblotting.
Deste modo, selecionaram-se quatro grupos de proteínas para sequenciação por espectrometria de
massa: grupo 1 com gama de pesos moleculares de 200-160kDa, grupo 2 com 120-70kDa, grupo 3
com 60-40kDa e grupo 4 com 30-15kDa. Dentro destes grupos, as proteínas de P. falciparum foram
cuidadosamente cortadas em pequenas frações, por forma a serem enviadas para sequenciação as
proteínas com maior percentagem de detecção por immunoblotting, conforme os dados da Figura 16.
Os grupos 2 e 4 apresentam-se de extrema relevância, pois é nessas gamas de pesos que se
encontram as proteínas detetadas por immunoblotting em pacientes serologicamente negativos por
ELISA, isto é, identificam os antigénios para os quais o indivíduo produziu anticorpos nos primeiros
estágios de infeção por malária. Os grupos 1 e 3 tratam-se de frações de proteínas detetadas com
alguma frequência ao analisar o perfil de immunoblotting de todos os pacientes.
Até à data da entrega do presente trabalho, os resultados de sequenciação ainda não tinham
chegado.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
182 158 149 137 125 119 117 103 97 78 75 73 65 61 58 53 50 45 42 33 26 25 20
Per
cen
tage
m d
e d
eteç
ão (
%)
Pesos moleculares detetados (kDa)
49
Capítulo 5 - Conclusões e perspetivas futuras
A infeção por malária é uma das principais causas de mortalidade e morbidade no mundo, sendo
desta forma necessário a produção duma vacina eficaz. O ciclo de vida de P. falciparum é complexo,
uma vez que a sua natureza requer a expressão de múltiplas proteínas, especializadas, necessárias
para a invasão de diferentes tipos de células, bem como para sobreviver quer no hospedeiro
invertebrado (mosquito), quer no vertebrado (humanos).
Em áreas endémicas de malária, as pessoas adquirem a imunidade clínica de forma gradual através
da exposição frequente às picadas de mosquitos infetados. As crianças tendem a apresentar altas
densidades de parasita e ataques de malária grave, enquanto os adultos desenvolvem uma imunidade
funcional, mas não estéril, com níveis de parasitemia consideráveis e sem ataques de malária.
Neste trabalho, foram analisadas amostras de 12 crianças dos 0 aos 16 anos, residentes numa zona
endémica, com sinais de malária grave. Todos os pacientes estavam infetados com o parasita
Plasmodium, como se verificou pelos RDT.
É de realçar a importância deste estudo ao caracterizar a reatividade serológica e antigénica em
crianças, isto é, pacientes com o sistema imune imaturo. Aquando a recolha das amostras, as crianças
estavam perante a primeira, ou primeiras, infeções por Plasmodium, proporcionado a possibilidade de
determinar que tipo de resposta imune humoral ocorre em malária. O número reduzido de elementos
da amostra apenas limita, não invalida de todo, os resultados obtidos.
Com a investigação desenvolvida, através do método ELISA anti-P. falciparum, foi possível
determinais quais amostras eram serologicamente positivas, negativas e indeterminadas, consoante
as classes de anticorpos analisadas (IgG total, IgM, IgE, Ig G+A+M), bem como a qualidade das
subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Verificou-se uma predominância de anticorpos IgG1 na
resposta humoral, nos pacientes analisados, aquando de infeção grave por P. falciparum.
Pela análise dos perfis de immunoblotting, verificou-se um padrão consistente na imunoreatividade
a antigénios de P. falciparum com massas moleculares na gama dos 190 a 80kDa, e um padrão menos
consistente na gama dos 50 a 40kDa, valores estes que vão de encontro a trabalhos já realizados.
Como perspetivas futuras, tendo em conta os resultados obtidos, seria importante alargar a
população (crianças com malária grave) do estudo, para validação do presente estudo e também para
se compreender melhor o papel das Ig numa infeção de malária (principalmente, IgE) na resposta imune
humoral.
Futuramente, também se pretende completar o trabalho, com os resultados da análise in silico dos
antigénios detetados envolvidos na reatividade imunoquímica, para a potencial identificação de novas
proteínas-alvo para vacinas anti-Plasmodium., importantes no desenvolvimento de estratégias de
prevenção e controlo da malária.
50
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Anexos
Anexo 1 - Parecer sobre Protocolo de Estudo
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Anexo 2 - Aprovação do Protocolo de Pesquisa
![Análise serológica e imunoquímica de potenciais antigénios ...repositorio.ul.pt/bitstream/10451/8733/1/ulfc104186_tm_Rita_Costa.pdf · segunda causa de morte no mundo [1] (Figura](https://img.document.onl/doc/110x75/5c0f967509d3f26c2d8b954b/analise-serologica-e-imunoquimica-de-potenciais-antigenios-segunda-causa.jpg)
