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LEONARDO FARIA MARTINS
CARACTERIZAÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE Penicillium
echinulatum
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós–Graduação em Química, Universidade
Federal do Paraná, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Química,
Sub-Área. Química Orgânica.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Pereira Ramos
CURITIBA
2005
ii
Aos meus irmãos, Leandro Faria Martins e Bruna Faria Martins.
Aos meus pais, José Soares Martins e Olga Maria Faria Martins.
A minha namorada, Juliana Flávia Ferreira.
iii
“... hoje o céu está pesado, vem chegando temporal
nuvens negra do passado, delirante flor do mal
cometemos o pecado de não saber perdoar
sempre olhando para o mesmo lado feito estátuas de sal
hoje o tempo escorre dos dedos das nossas mãos
ele não devolve o tempo perdido em vão
é um mensageiro das almas dos que virão ao mundo
depois de nós...”.
Carlos Maltz – Depois de Nós
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ...................................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS...................................................................................................... xiv
ABSTRACT....................................................................................................................... xv
RESUMO......................................................................................................................... xvii
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1
2 OBJETIVO................................................................................................................... 4
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 5
3.1 A PAREDE CELULAR........................................................................................ 5
3.2 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA.............................................................................. 21
3.3 CELULASES ...................................................................................................... 22
3.4 CELULASES DE Trichoderma reesei ............................................................... 30
3.5 CELULASES DE Penicillium sp........................................................................ 35
3.6 MODELOS TÍPICOS DE SUBSTRATOS PARA ESTUDO DE CELULASES
.............................................................................................................................36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 44
4.1 ENZIMAS........................................................................................................... 44
4.2 PRODUÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum ............... 44
4.3 PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS................................................................ 45
v
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO
MÉTODO DE BRADFORD (1976).............................................................................. 46
4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO
MÉTODO DE LOWRY (GHOSE, 1986)...................................................................... 47
4.6 CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL CATALÍTICO DAS ENZIMAS .............. 48
4.7 DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES..................................... 49
4.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELULÁSICA TOTAL....................... 51
4.9 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENDOGLUCANÁSICA...................... 52
4.10 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE XILANÁSICA. .................................... 54
4.11 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA .......................... 55
4.12 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIÁSICA ................................... 56
4.13 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIOIDROLÁSICA. ................... 56
4.14 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS ................................................................ 57
4.15 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS .......................................... 59
4.16 ANALISE DAS POLPAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS POR GPC. . 60
4.17 ESTUDO COMPARATIVO .............................................................................. 63
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 64
5.1 ESCOLHA DO SISTEMA TAMPONANTE..................................................... 64
5.2 DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS............................................................. 65
5.3 ATIVIDADE CONTRA SUBSTRATOS-MODELO ........................................ 67
5.4 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS .......................................... 77
vi
5.5 ADIÇÃO DE β-GLUCOSIDASE ...................................................................... 87
5.6 ESTABILIDADE DAS ENZIMAS.................................................................... 95
5.7 ESTUDOS DE ADSORÇÃO ............................................................................. 98
5.8 AVALIAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS MASSAS MOLARES................. 100
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 108
7 TRABALHOS FUTUROS....................................................................................... 110
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 111
vii
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Luiz Pereira Ramos pela orientação, amizade, conselhos, apoio e
dedicação, principalmente, nos momentos de maior necessidade.
Aos colaboradores deste projeto pertencentes a UCS (Universidade de Caxias do
Sul), Prof. Aldo J. P. Dillon, Marli Camassola e Anderson Vizentin, que foram
responsáveis pela produção do complexo celulásico utilizado neste trabalho e que me
receberam de maneira muito gentil, quando passei duas semanas na UCS conhecendo as
metodologias utilizadas pelo grupo.
À Novozymes Latin América (Araucária, PR), pelo fornecimento da preparação
celulásica denominada Celluclast 1.5 L FG®, utilizada neste trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro ao laboratório.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
A todos os amigos e colegas do Laboratório de Química de Fitobiomassas que
estiveram comigo durante essa etapa de minha vida: Emir B. Saad, Thiago A. Silva,
Anderson K. Domingos, Karla T. Kucek, Daniel Kolling, Ricardo Brugnago, Leonardo
Sabariego e Claudinei S. Cordeiro.
Aos amigos do Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise, pelo grande
companheirismo e amizade que iniciou na época em que trabalhamos juntos, quando fui
aluno de iniciação científica e comecei a me interessar pelos processos biotecnológicos, e
que dura até os dias de hoje com muitas conversas de caráter científico e, também, com
viii
momentos de muita descontração: Marcelo Muller, Alessandra Baron, Maria Luiza
Fernandes, Joel Meira e Valéria Lima, que hoje se encontra na UEL (Universidade
Estadual de Londrina).
A todos os amigos e colegas do Departamento de Química da UFPR,
principalmente o Pedro Camargo, José Villar, Cristiano Navarini, Fernando Ferraz, Sérgio
Umberto, Alexandre Kimura, Carlos Hauptman e o Prof Aluízio de Abreu Marcondes.
Amigos para toda a hora, desde música até o futebol, passando por um pouco de química,
também.
À coordenação do Programa de Pós-graduação em Química da UFPR e a todas as
outras pessoas que, de maneira direta ou indireta, fizeram parte integrante deste processo.
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA CÉLULA VEGETAL (FENGEL E
WEGENER, 1989)............................................................................................................... 6
FIGURA 2 LOCALIZAÇÃO, NA PAREDE CELULAR, DA LAMELA MÉDIA (LM), DA
PAREDE PRIMÁRIA (PP) E DA PAREDE SECUNDÁRIA (PS), COM SUAS
LAMELAS CONSTITUINTES, S1, S2 E S3 (FENGEL E WEGENER, 1989)................ 7
FIGURA 3 UNIDADES DE D-GLUCOSE NAS FORMAS LINEAR E DE ANEL
HEMIACETÁLICO, EM CONFORMAÇÃO DE CADEIRA 4C1 (SOLOMONS, 1996).. 8
FIGURA 4 FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA ENTRE DUAS UNIDADES DE β-D-
GLUCOSE, PRODUZINDO A CELOBIOSE (SOLOMONS, 1996)............. 9
FIGURA 5 REPRESENTAÇÃO DA CADEIA LINEAR DA CELULOSE, FORMADA POR
VÁRIAS UNIDADES CONSECUTIVAS DE CELOBIOSE (TÍMÁR-BALÁZSY E
EASTOP, 1998)................................................................................ 9
FIGURA 6 FORMAÇÃO DAS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ESTRUTURA
SUPRAMOLECULAR DA CELULOSE............................................................................ 11
FIGURA 7 FORMAS ALOMÓRFICAS DA CELULOSE................................................................... 12
FIGURA 8 ASSOCIAÇÃO DOS COMPONENTES DA PAREDE CELULAR. (1) ESQUELETO
DA CADEIA DE CELULOSE, COM A INDICAÇÃO DO COMPRIMENTO DA SUA
UNIDADE ESTRUTURAL BÁSICA, A CELOBIOSE; (2) ARRANJO DAS
CADEIAS DE CELULOSE NA FORMAÇÃO DA FIBRILA ELEMENTAR; (3)
CRISTALITO DE CELULOSE; (4) SECÇÃO TRANSVERSAL DA MICROFIBRILA
DA CELULOSE, MOSTRANDO CRISTALITOS DE CELULOSE EMBEBIDOS NA
MATRIZ DE HEMICELULOSE E PROTOLIGNINA (RAMOS, 2003).......................... 14
FIGURA 9 MONOSSACARÍDEOS CONSTITUINTES DAS HEMICELULOSES. D-GLUCOSE
(1), D-GALACTOSE (2), L-ARABINOSE (3), D-XILOSE (4), D-MANOSE (5), 4-O-
METIL-D-GLUCURÔNICO (6) E L-RAMNOSE (7) (SJÖSTRÖM,
1992).................................................................................................................................... 16
FIGURA 10 ESTRUTURA DA LIGNINA DE Fagus sp (FENGEL E WEGENER, 1989)............... 18
FIGURA 11 ESTRUTURA DOS ÁLCOOIS PRECURSORES DA LIGNINA (SJÖSTRÖM, 1992)... 19
x
FIGURA 12 MODO DE AÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T.
reesei.................................................................................................................................... 23
FIGURA 13 SÍTIO ATIVO EM FORMA DE CHAVE DAS ENDOGLUCANASES, QUE
PERMITE O ACESSO AO LONGO DE UMA CADEIA DE CELULOSE...................... 25
FIGURA 14 MODO DE AÇÃO PROGRESSIVA DA CELOBIOIDROLASE I (CBH I) DE T. reesei
(DIVNE et al, 1994)............................................................................................................ 26
FIGURA 15 MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A INVERSÃO
DE CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)........................ 29
FIGURA 16 MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A RETENÇÃO
DE CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)........................ 30
FIGURA 17 CELOBIOIDROLASES DE T. reesei. CBH I QUE ATUA NA EXTREMIDADE
REDUTORA DA CADEIA DE CELULOSE E A CBH II QUE ATUA NA
EXTREMIDADE NÃO REDUTORA (HARRIS, 2005).................................................... 32
FIGURA 18 SINERGISMO ENTRE AS ENDOGLUCANASES E AS CELOBIOIDROLASES DE
T. reesei. AS ENDOGLUCANASES ATUAM AO LONGO DA CADEIA, GERANDO
NOVOS SÍTIOS DE ATAQUE PARA AS CELOBIOIDROLASES (CORTESIA DE
MATTI SIIKA-AHO, VTT BIOTECHNOLOGY, FINLÂNDIA).......... 33
FIGURA 19 ESTRUTURA DO CORANTE COOMASSIE BRILLIANT BLUE BG-250.................... 46
FIGURA 20 CROMATOGRATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DOS PADRÕES DE
CARBOIDRATOS. ORDEM CRESCENTE DE ELUIÇÃO: CELOBIOSE, GLUCOSE,
XILOSE E ARABINOSE.................................................................................................... 56
FIGURA 21 REAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES COM O ÁCIDO 3,5-DINITRO-
SALICÍLICO....................................................................................................................... 58
FIGURA 22 CURVA DE CALIBRAÇÃO UTILIZADA NA DETERMINAÇÃO DAS MASSAS
MOLARES DAS POLPAS CELULÓSICAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS....... 61
FIGURA 23 COMPARAÇÃO DAS ATIVIDADES CONTRA PAPEL DE FILTRO DE
COMPLEXOS CELULÁSICOS DE T. reesei E P. echinulatum, DETERMINADAS
EM (█) TAMPÃO CITRATO 50 mmol/L, pH 4,8 (█) E TAMPÃO ACETATO 50
mmol/L, pH 4,8.................................................................................................................... 63
xi
FIGURA 24 QUANTIDADE DE CELOBIOSE (█), GLUCOSE (█), CELOBIOSE + GLUCOSE
(█) E RAZÃO CELOBIOSE/GLUCOSE (█) NOS HIDROLISADOS PRODUZIDOS
PELO (A) P. echinulatum, (B) T. reesei E (C) P. echinulatum CORRIGIDO PARA A
MESMA RAZÃO MOLAR CELOBIOSE/GLUCOSE APRESENTADA NOS
HIDROLISADOS DE T. reesei........................................................................................... 73
FIGURA 25 PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) NOS HIDROLISADOS
DO PAPEL DE FILTRO..................................................................................................... 74
FIGURA 26 HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA POR CELULASES DE P.
echinulatum (□) E DE T. reesei (○) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11
UPF/g DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE............................................................ 76
FIGURA 27 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE
DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA
KRAFT BRANQUEADA................................................................................................... 78
FIGURA 28 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM
ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA
POLPA KRAFT BRANQUEADA...................................................................................... 79
FIGURA 29 HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA POR CELULASES DE P.
echinulatum (■) E DE T. reesei (●) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11
UPF/g DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE............................................................ 80
FIGURA 30 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE
DE 11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA
KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)...................................................................... 81
FIGURA 31 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM
ATIVIDADE DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA
POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)........................................................ 82
FIGURA 32 PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) PRODUZIDAS
DURANTE A HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA (A) E NÃO 84
xii
BRANQUEADA (B) PELO T. reesei E HIDRÓLISE DE POLPAS KRAFT
BRANQUEADA (C) E NÃO BRANQUEADA (D) PELO P. echinulatum......................
FIGURA 33 HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (○) E DA SIGMACELL® TIPO 50
(□) PELO P. echinulatum A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 5,5 UPF/g E DE 6,3
UΒG/g EM RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO............................................................ 86
FIGURA 34 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆), PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A
HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v)..................................... 87
FIGURA 35 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A
HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 A 2% (m/v)..................................................... 88
FIGURA 36 HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (●) E DA SIGMACELL® TIPO 50
(■) PELO T. reesei, A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 11,5 UPF/g E DE 13,2 UΒG/g
EM RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO.........................................................................
89
FIGURA 37 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A
HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v).................................... 90
FIGURA 38 QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A
HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 A 2% (m/v) .................................................... 91
FIGURA 39 HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 EM CONCENTRAÇÃO DE 2%(m/v) POR
P. echinulatum (■) E T. reesei + NOVOZYM 188® (●), A UMA CARGA
ENZIMÁTICA DE 10 UPF/g E 11,5 UΒG/g DE SUBSTRATO SECO............................ 92
FIGURA 40 VARIAÇÃO DOS ART PRODUZIDOS NA HIDRÓLISE DO PAPEL DE FILTRO
POR P. echinulatum (■) E T. reesei (●)EM CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS DE
HIDRÓLISE........................................................................................................................ 93
FIGURA 41 VARIAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA CONTRA pNPG DAS
ENZIMAS DE P. echinulatuM (■) E T. reesei (●)............................................................. 94
FIGURA 42 VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE O
EXPERIMENTO DE HIDRÓLISE. (◊) T. reesei SUPLEMENTADO COM β-
GLUCOSIDASES EXÓGENAS E (■) P. echinulatum...................................................... 95
FIGURA 43 PERCENTAGEM DAS PROTEÍNAS REMANESCENTES NO MEIO REACIONAL
xiii
DURANTE A HIDRÓLISE A 2% (m/v) DA POLPA KRAFT BRANQUEADA. T.
reesei (□), P. echinulatum (▲) E T. reesei + β-GLUCOSIDASE (■)................................
97
FIGURA 44 SACARIFICAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v) POR
CELULASES DE P. echinulatum (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (▲), T. reesei (10 UPF/g E
3,9 UβG/g) (■) E T. reesei + NOVOZYM 188® (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (♦)............... 99
FIGURA 45 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum SOBRE O GRAU
DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A
UMA CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H
(─) E 48H (─)...................................................................................................................... 103
FIGURA 46 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SOBRE O GRAU DE
POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA
CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E
48H (─)................................................................................................................................ 104
FIGURA 47 INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SUPLEMENTADO
COM Β-GLUCOSIDASES EXÓGENAS SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO
DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA
DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─) ............... 105
xiv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS................ 66
TABELA 2 ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS ABSOLUTAS E POR UNIDADE DE PROTEÍNA. 67
TABELA 3 ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS EM RELAÇÃO À ATIVIDADE CONTRA PAPEL
DE FILTRO........................................................................................................................ 70
TABELA 4 RENDIMENTO DE HIDRÓLISE E EFEITO DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS
SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA........ 101
xv
ABSTRACT
Penicillium echinulatum has been identified as a potential cellulase producer for
bioconversion processes. However, its cellulase system has never been investigated in
detail. In this work, the volumetric activities of cellulases from P. echinulatum were
determined against substrates such as filter paper (0.27 U/mL), carboxymethylcellulose
(1.53 U/mL), hydroxyethylcellulose (4.68 U/mL), birchwood xylan (3.16 U/mL), oat spelt
xylan (3.29 U/mL), Sigmacell type 50 (0.10 U/mL), cellobiose (0.19 U/mL), and p-
nitrophenyl-glucopiranoside (0.31 U/mL). These values were then expressed in relation to
the amount of protein and compared with the activity profile of Celluclast 1.5L FG
(Novozymes). Our results have shown that both enzyme complexes have similar total
cellulase and xylanase activities. Analysis of substrate hydrolysates demonstrated that P.
echinulatum enzymes have higher β-glucosidase activity than Celluclast 1.5L FG, while
the latter enzyme system has greater cellobiohydrolase activity. Hydrolysis experiments
also demonstrated that the P. echinulatum system is advantageous for the saccharification
of cellulose substrates because it has enough β-glucosidase activity to remove the
cellobiose produced in the reaction medium. However, the cellulase complex from T.
reesei became more efficient than P. echinulatum enzymes when it was supplemented
with exogenous β-glucosidase activity (Novozym 188, Novozymes). Both cellulase
complexes displayed the same influence over the degree of polymerization of cellulose,
revealing that hydrolyses were carried out under the typical endo-exo synergism of fungal
xvi
enzymes, promoting the progressive peeling of cellulose molecules from the surface of
the substrate without accumulating any detectable short cellooligomers in the hydrolysis
mixture.
Keywords: Penicillium echinulatum, Celluclast 1.5L FG, cellulases, activity
xvii
RESUMO
O fungo filamentoso Penicillium echinulatum foi recentemente identificado como um
bom produtor de celulases. No entanto, o seu complexo celulásico jamais foi estudado em
detalhes. Neste trabalho, as atividades das celulases de P. echinulatum foram
determinadas e comparadas ao complexo celulolítico de Trichoderma reesei (Celluclast
1.5L FG, Novozymes), empregando substratos como papel de filtro, carboximetilcelulose,
hidroxietilcelulose, xilana de madeira de vidoeiro, xilana de endoderma de aveia,
Sigmacell tipo 50, celobiose e p-nitrofenil-glucopiranosídeo. Além disso, foram
realizados experimentos de hidrólise com diferentes tipos de substratos para avaliar
comparativamente a eficiência de sacarificação dos complexos celulásicos, a importância
da presença de β-glucosidases, a estabilidade das enzimas nas condições operacionais, o
perfil de adsorção protéica durante a hidrólise e, também, a influência da hidrólise sobre o
grau de polimerização (GP) do substrato. Em linhas gerais, estes complexos apresentaram
atividades celulásica total e xilanásica semelhantes. Porém, a análise dos hidrolisados
enzimáticos demonstrou que o complexo de T. reesei possui maior atividade
celobioidrolásica, enquanto o complexo de P. echinulatum apresenta atividade β-
glucosidásica superior. Experimentos de hidrólise também demonstraram que o complexo
de P. echinulatum é vantajoso para a sacarificação de substratos celulósicos, pois possui
atividade β-glucosidásica suficiente para remover a celobiose produzida no meio
reacional. Porém, o complexo celulásico de T. reesei tornou-se um sistema mais completo
xviii
e eficiente quando foi suplementado com atividade β-glucosidásica exógena (Novozym
188, Novozymes). Finalmente, a determinação do efeito da hidrólise enzimática sobre o
GP da celulose demonstrou que os dois complexos celulásicos exercem suas atividades
hidrolíticas sobre o substrato de forma semelhante, através de um mecanismo progressivo
e sinérgico, removendo camadas de celulose da superfície do substrato sem permitir o
acúmulo de oligômeros de massa molar intermediária.
1 INTRODUÇÃO
A celulose é o composto orgânico mais abundante da Terra e a maior parte da
celulose utilizada na indústria provém da madeira (40% a 50% de celulose) e das fibras
do algodão (98% de celulose) (Medve, 1997). É o principal elemento estrutural da parede
celular das plantas superiores e ocorre em forte associação com os outros dois principais
componentes da parede celular, a hemicelulose e a lignina. Essa forte associação faz com
que sejam limitadas as aplicações de materiais lignocelulósicos como fonte renovável
para a produção de biomoléculas e produtos químicos. Por isso, é de vital importância a
identificação das razões que justificam a alta resistência destes materiais a processos
biológicos como a hidrólise enzimática e a fermentação (Ramos, 2003).
A celulose é sintetizada por todas as plantas superiores, por certas bactérias e por
alguns protozoários. Estima-se que somente as plantas superiores produzam anualmente
cerca de 4x1010 toneladas deste biopolímero, o que representa cerca de 2,5% das 7x1011
toneladas de carbono produzidas na biosfera. Portanto, a biodegradação da celulose tem
um enorme impacto sobre o equilíbrio natural do ciclo do carbono (Medve, 1997).
Nas últimas décadas, o emprego de recursos renováveis tem aumentado
significativamente em uma grande variedade de processos industriais. Como resultado
destas atividades, a quantidade de resíduos industriais derivados da fitobiomassa tem
aumentado, a ponto de atingir 40% dos detritos sólidos gerados em municípios norte-
americanos. Portanto, encontrar um destino apropriado para estes resíduos tem se tornado
2
prioritário para economias em desenvolvimento e, dentre uma variedade de alternativas
propostas até o momento, muita atenção tem sido dada ao aproveitamento de hidrolisados
de fitobiomassa (celulose) para a produção de etanol e solventes orgânicos (Medve,
1997). Nesse caso, estudos têm sido conduzidos para verificar a viabilidade da
sacarificação via hidrólise enzimática, utilizando majoritariamente os complexos
celulásicos produzidos por fungos filamentosos como o Trichoderma reesei (Palonen et
al, 2004; Sharma et al, 2002; Pere et al, 2001; Ortega et al, 2000; Ramos, 1993a, 1999).
Atualmente, as celulases vêm sendo aplicadas como biocatalisadores em uma
série de processos industriais, como na clarificação de sucos (indústria de alimentos), na
formulação de ração para animais e na produção de detergentes e amaciantes para roupas.
Porém, estas enzimas encontram aplicações ainda mais interessantes nas indústrias têxtil e
de papel e celulose, em substituição à estonagem e/ou biopolimento de denim (Cavaco-
Paulo, 1997; Andreaus et al, 2000), na modificação das propriedades processuais das
fibras celulósicas comerciais (Mansfield et al, 1996) e na reciclagem de papel ofício, onde
atuam eficientemente na remoção de tintas e "toners" de impressão da superfície de fibras
recicláveis (Jeffries et al, 1994). Nestes casos, não é obviamente desejada a sacarificação
extensiva da celulose, mas sim a ação superficial que gere o efeito desejado. Por esta
razão, a investigação da composição centesimal de preparações celulásicas comerciais
e/ou experimentais é de suma importância.
Outros fungos de ocorrência natural também apresentam complexos enzimáticos
capazes de degradar eficientemente a celulose, quer nativa ou pré-tratada. Dentre eles
3
podem ser citados o Humicola insolens, H. grisea, T. viride, Aspergillus niger,
Penicillium brasilianum e P. echinulatum. Os fungos do gênero Penicillium, embora
pouco estudados, têm apresentado propriedades interessantes em comparação a outras
fontes destas enzimas, principalmente no que diz respeito à distribuição quantitativa dos
componentes enzimáticos no complexo celulásico. Neste contexto, o P. echinulatum
(Dillon et al, 1999; Camassola et al, 2004) é uma espécie que tem apresentado título
enzimático elevado em termos de atividade celulásica total. No entanto, este complexo
enzimático, jamais foi estudado em detalhes e a sua utilização na hidrólise enzimática de
substratos pré-tratados constitui um dos parâmetros de originalidade deste projeto.
4
2 OBJETIVO
O objetivo principal deste projeto foi o de caracterizar o complexo celulásico
derivado de Penicillium echinulatum como um modelo alternativo para a condução de
processos de bioconversão de fitobiomassa residual via hidrólise enzimática.
Tal objetivo foi atingido através do desenvolvimento de um planejamento
experimental fundamentado nas seguintes etapas:
1. Determinação da atividade do complexo enzimático de P. echinulatum contra
diferentes substratos específicos;
2. Investigação do modo de ação catalítica do complexo enzimático sobre substratos
celulósicos quimicamente definidos;
3. Determinação do efeito da ação das hidrolases de P. echinulatum sobre as
propriedades e composição química de fibras celulósicas comerciais;
4. Desenvolvimento de um estudo comparativo entre os sistemas celulásicos de P.
echinulatum e de T. reesei, tomando como referência a preparação comercial
Celluclast 1.5L FG (Novozymes, Araucária, Brasil).
5
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Para uma melhor compreensão de como os complexos celulásicos agem, é
necessário conhecer a origem, composição química e organização estrutural dos materiais
que podem ser empregados como substratos para estas enzimas. Esta revisão bibliográfica
pretende mostrar a localização da celulose na parede celular vegetal, juntamente com os
outros dois componentes majoritários desta estrutura, a lignina e a hemicelulose.
Posteriormente, será descrito em detalhe o modo de ação das enzimas que compõem o
sistema celulásico de fungos filamentosos, particularmente os referentes aos fungos
Trichoderma reesei e Penicillium sp.. Finalmente, serão apresentados os diversos tipos de
substratos celulósicos e descritas as características químicas e supramoleculares que
influenciam o modo de ação e o sinergismo observado entre os diferentes tipos de
celulases.
3.1 A PAREDE CELULAR
Os tecidos vegetais são primariamente constituídos por células de parede celular
espessa, cujos formatos e dimensões variam entre as diferentes espécies de madeira
(Figura 1). A integridade estrutural do tecido da planta é atribuída à existência de uma
camada intermediária que une as células como um agente cimentante. Essa camada,
chamada de lamela média, é quase que inteiramente composta de lignina e, junto com
6
duas paredes primárias adjacentes, forma a lamela média composta (Fengel e Wegener,
1989).
FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA CÉLULA VEGETAL (FENGEL E
WEGENER, 1989)
MEMBRANA CELULARCITOPLASMALAMELA MÉDIAPAREDE PRIMÁRIA
MEMBRANA CELULARCITOPLASMALAMELA MÉDIAPAREDE PRIMÁRIA
Em geral, a parede celular das plantas é subdividida em parede primária e
secundária. A distribuição de celulose, hemicelulose e lignina nessas camadas varia
consideravelmente. A parede primária é uma camada delgada, permeável e flexível em
tecidos fisiologicamente ativos (alburno), mas pode tornar-se altamente lignificada em
células do cerne. A parede secundária é formada por uma seqüência de três lamelas, S1,
S2, e S3, onde a camada central é normalmente mais espessa do que as outras. Como
resultado, a maioria das propriedades das fibras, particularmente aquelas que interessam à
indústria de papel e celulose, são derivadas das propriedades e integridade física dessa
camada (Fengel e Wegener, 1989) (Figura 2).
7
FIGURA 2 - LOCALIZAÇÃO, NA PAREDE CELULAR, DA LAMELA MÉDIA (LM), DA PAREDE
PRIMÁRIA (PP) E DA PAREDE SECUNDÁRIA (PS), COM SUAS LAMELAS
CONSTITUINTES, S1, S2 E S3 (FENGEL E WEGENER, 1989)
3.1.1 Celulose
O principal componente das fibras vegetais é a celulose, que é o constituinte
básico da parede celular. Trata-se de um homopolissacarídeo de ocorrência natural,
composto por unidades de D-glucose (D-glucopiranose) unidas através de ligações
glicosídicas do tipo β-(1→4) (β-D-glucana), que é encontrado tanto em vegetais
primitivos quanto em plantas evoluídas.
A liberdade rotacional da cadeia linear da D-glucose permite que o carbono 1 seja
atacado pela hidroxila do carbono 5, em reação intramolecular que resulta na formação de
um hemiacetal. Após a reação de fechamento do anel, as hidroxilas do carbono anomérico
8
(quiral) podem se encontrar na posição axial (α) ou equatorial (β), gerando o importante
princípio da anomericidade. Em solução aquosa, ocorre uma rápida e dinâmica
interconvenção entre essas duas formas, denominada de mutarrotação, mediante o qual é
atingido um equilíbrio entre as duas formas anoméricas da D-glucopiranose, sendo a β-D-
glucopiranose correspondente 62%, a α-D-glucopiranose a 38% e a forma aberta, a menos
de 0,5%. A Figura 3 apresenta a estrutura linear da D-glucose e os anômeros α e β da D-
glucopiranose.
FIGURA 3 - UNIDADES DE D-GLUCOSE NAS FORMAS LINEAR E DE ANEL
HEMIACETÁLICO, EM CONFORMAÇÃO DE CADEIRA 4C1 (SOLOMONS, 1996)
O
OHOH
OHOH
OH
O
OHOHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
anômero α anômero β
cadeia aberta
A celulose é biossintetizada a partir da união de unidades de D-glucose. A
hidroxila glicosídica do carbono 1 de uma unidade sofre reação de condensação com a
hidroxila do carbono 4 de outra unidade, formando a ligação glicosídica do tipo β-(1→4)
(Figura 4). Durante a biossíntese, diversas cadeias de celulose são sintetizadas
H2O H2O
9
simultaneamente e de forma ordenada, buscando um arranjo supramolecular que confira
maior estabilidade ao agregado e, portanto, menor energia potencial. Este arranjo depende
de uma rede de ligações de hidrogênio cuja otimização provoca uma rotação de 180º da
segunda unidade de glucose em relação à primeira, e assim por diante. Portanto, a
celobiose é definida como unidade conformacional mínima da celulose, enquanto a
glucose representa tão somente a unidade fundamental das cadeias do homopolímero
(Tímár-Balázsy e Eastop, 1998; Medve, 1997) (Figura 5).
FIGURA 4 - FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA ENTRE DUAS UNIDADES DE β-D-
GLUCOSE, PRODUZINDO A CELOBIOSE (SOLOMONS, 1996)
O
OHOH
OH
OHO
OHOOH
OH
OH
O
OHOHOH
OH
OH
+O
OHOH
OH
OHHO O
OHOH
OH
OHO
OHOOH
OH
OH
O
OHOHOH
OH
OH
+O
OHOH
OH
OHHO
FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO DA CADEIA LINEAR DA CELULOSE, FORMADA POR
VÁRIAS UNIDADES CONSECUTIVAS DE CELOBIOSE (TÍMÁR-BALÁZSY E
EASTOP, 1998)
O
OOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
OH
O
OHOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
celobiosen
O
OOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
OH
O
OHOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
O
OOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
OH
O
OHOH
OH
OHO
OHOOH
O
OH
O
OH
OH
OHO
OHOOH
OH
celobiosen
10
A cadeia macromolecular da celulose assume uma disposição linear devido a dois
fatores: a hidroxila no carbono anomérico possui orientação equatorial porque a
conformação em cadeira do anel piranosídico assume a disposição 4C1 e as ligações de
hidrogênio intra e intermoleculares estabilizam a orientação da cadeia (Fengel e Wegener,
1989). O tamanho ou extensão da cadeia de celulose é medido através de seu grau de
polimerização (GP), que representa o número de unidades de glucose que formam cada
cadeia polimérica. O GP da celulose varia de acordo com a fonte, o grau de maturação da
parede celular, o processamento a que as fibras foram submetidas e o seu envelhecimento.
O GP da celulose nativa na madeira é de cerca de 2500 unidades de anidroglucose,
enquanto que o GP do algodão é de aproximadamente 11000 unidades. Para o uso têxtil,
sugere-se que a celulose deva ter um GP maior do que 2000 unidades (Tímár-Balázsy e
Eastop, 1998).
Em sua estrutura supramolecular, a celulose apresenta regiões altamente
ordenadas, estabilizadas por numerosas ligações de hidrogênio intra e intermoleculares
(Figura 6), e áreas menos ordenadas ou amorfas, onde as cadeias apresentam uma
orientação randomizada (Fan et al., 1987). A proporção da parte cristalina em cadeias de
celulose é normalmente expressa em porcentagem (índice de cristalinidade ou CrI) e
depende da origem e processo de obtenção da celulose. A celulose produzida pela alga
Valonia macrophysa é praticamente 100% cristalina. Por outro lado, o substrato
considerado 100% amorfo (CrI = 0%) pode ser preparado pelo tratamento de celulose
microcristalina com ácido fosfórico xaroposo. Outras celuloses têm CrI intermediários,
11
como, por exemplo, a celulose bacteriana (76%), o algodão (70%), a Avicel (46%) e
polpas alvejadas largamente utilizadas para a confecção do papel (50 a 60%) (Medve,
1997). Vários autores têm sugerido que a celulose amorfa, devido a sua maior área
superficial, é mais suscetível à hidrólise enzimática do que a forma ordenada ou cristalina.
Estudos de modelagem desenvolvidos por Coughlan (1985) demonstraram que sítios de
menor organização molecular, localizados na superfície da estrutura cristalina, são mais
suscetíveis ao ataque enzimático. No entanto, complexos enzimáticos produzidos por
vários microrganismos têm se demonstrado capazes de catalisar a hidrólise de celulose,
tanto cristalina quanto amorfa, em açúcares solúveis de baixa massa molar como a
glucose e a celobiose.
FIGURA 6 - FORMAÇÃO DAS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ESTRUTURA
SUPRAMOLECULAR DA CELULOSE
12
A celulose nativa cristalina é constituída por duas formas alomórficas: a celulose
Iα (triclínica) e a celulose Iβxy (monoclínica) (Figura 7). As ligações de hidrogênio são
diferentes para cada forma, refletindo em diferentes propriedades físico-mecânicas
(Fengel e Wegener, 1989; Åkerholm et al, 2004).
FIGURA 7 - FORMAS ALOMÓRFICAS DA CELULOSE
Celobiose
Monoclínico Iβ
Triclínico Iα
0,62 nm / 0,53 nm
67º / 63º
Vários modelos têm sido propostos para explicar a estrutura interna da celulose
na parede celular. Devido à linearidade do esqueleto celulósico, cadeias adjacentes
formam um conjunto de agregados insolúveis em água de vários comprimentos e larguras,
13
denominadas fibrilas elementares (D’Almeida, 1988). As forças latentes, responsáveis
pela estabilidade das regiões cristalinas, são basicamente o resultado de um grande
número de ligações de hidrogênio inter e intramoleculares. De acordo com Fengel e
Wegner (1989), diversas fibrilas elementares, com uma espessura média de 3,5 nm, se
associam uma com as outras formando cristalitos de celulose cujas dimensões dependem
da origem e do tratamento da amostra. Posteriormente, quatro desses agregados
cristalinos se unem através de uma monocamada de hemiceluloses, gerando estruturas de
25 nm que são envolvidas por uma matriz amorfa de hemicelulose e protolignina. O
composto natural que resulta dessa associação é chamado de microfibrila de celulose
(Figura 8).
14
FIGURA 8 - ASSOCIAÇÃO DOS COMPONENTES DA PAREDE CELULAR. (1) ESQUELETO DA
CADEIA DE CELULOSE, COM A INDICAÇÃO DO COMPRIMENTO DA SUA
UNIDADE ESTRUTURAL BÁSICA, A CELOBIOSE; (2) ARRANJO DAS CADEIAS
DE CELULOSE NA FORMAÇÃO DA FIBRILA ELEMENTAR; (3) CRISTALITO DE
CELULOSE; (4) SECÇÃO TRANSVERSAL DA MICROFIBRILA DA CELULOSE,
MOSTRANDO CRISTALITOS DE CELULOSE EMBEBIDOS NA MATRIZ DE
HEMICELULOSE E PROTOLIGNINA (RAMOS, 2003)
15
3.1.2 Hemiceluloses
As hemiceluloses são genericamente caracterizadas como uma família de
polissacarídeos presentes na parede celular vegetal. O termo hemicelulose foi
primeiramente utilizado para designar polissacarídeos precursores da celulose. Com a
evolução do conhecimento, constatou-se que isso não era verdadeiro e que as rotas
envolvidas na síntese desses dois polissacarídeos são distintas. Outra alternativa foi a de
considerar as hemiceluloses como polissacarídeos isolados da madeira em meio alcalino,
mas essa hipótese acabou apresentando pouca sustentação porque a água quente também
pode solubilizar polissacarídeos que não correspondem quimicamente às hemiceluloses.
Atualmente, as hemiceluloses são genericamente definidas como polissacarídeos não-
amiláceos e não-celulósicos que podem ser extraídos da parede celular dos vegetais
superiores (Sjöström, 1992; Fengel e Wegener, 1989).
As hemiceluloses são formadas por uma ampla variedade de blocos construtivos
incluindo pentoses (por exemplo, xilose, ramnose e arabinose), hexoses (por exemplo,
glucose, manose e galactose) e ácidos urônicos (são exemplos os ácidos 4-Ο-metil-
glucurônico e galacturônico) (Figura 9). São estruturalmente mais parecidas com a
celulose do que com a lignina e são depositadas na parede celular em um estágio anterior
à lignificação. Sua estrutura apresenta ramificações e cadeias laterais que interagem
facilmente com a celulose, dando estabilidade e flexibilidade ao agregado (Ramos, 2003).
16
As hemiceluloses presentes em folhosas e coníferas diferem significativamente
entre si. As hemiceluloses de folhosas são compostas majoritariamante por heteroxilanas
altamente acetiladas, geralmente classificadas com 4-Ο-metil-glucuronoxilanas.
Hexosanas também estão presentes, mas em quantidades muito pequenas como
glucomananas. Devido a sua característica ácida e as suas propriedades químicas, as
xilanas de folhosas são mais lábeis à hidrólise ácida e podem sofrer auto-hidrólise sob
condições relativamente brandas. Ao contrário, as coníferas têm uma grande proporção de
glucomananas acetiladas e galactoglucomananas, e xilanas correspondem apenas a uma
pequena fração. Como resultado disso, as hemiceluloses de folhosas (praticamente
pentosanas) são mais lábeis à hidrólise ácida do que as hemiceluloses de coníferas
(praticamente hexosanas) (Ramos 2003).
FIGURA 9 - MONOSSACARÍDEOS CONSTITUINTES DAS HEMICELULOSES. D-GLUCOSE (1),
D-GALACTOSE (2), L-ARABINOSE (3), D-XILOSE (4), D-MANOSE (5), 4-O-METIL-
D-GLUCURÔNICO (6) E L-RAMNOSE (7) (SJÖSTRÖM, 1992)
O
OHOHOH
CH3
OHO
O OHOH
OH
OHO
OHOHOH
OH
OH
O
OH
OH
OHOH
OH
O
OHOHOH
OH OOH
OHOHOH
OH
1 23
4 5 6
O
OH
OH
OH
OH
CH3
7
17
3.1.3 Lignina
A lignina está presente na madeira em cerca de 20% a 30%, agindo como
material adesivo, como agente de enrijecimento e como barreira contra degradação
enzimática e/ou microbiana da parede celular (Fengel e Wegener, 1989)
A lignina é uma macromolécula amorfa com estrutura tridimensional muito
complexa (Figura 10) e baseada em três precursores monoméricos: os álcoois coniferílico,
sinapílico e p-cumarílico (Figura 11). A proporção desses monômeros varia entre
diferentes espécies de plantas e estas diferenças podem ser utilizadas com propósitos
taxonômicos. Dependendo do grau de metoxilação, o grupo aromático é o p-hidroxibenzil
(derivado do álcool p-cumarílico), guaiacil (derivado do álcool coníferilico) ou siringil
(derivado do álcool sinapílico). A propriedade física mais importante dessa
macromolécula orgânica é a sua rigidez, que não só confere estrutura ao tecido da planta,
mas, também, previne o colapso de elementos condutores de água.
18
FIGURA 10 - ESTRUTURA DA LIGNINA DE FAGUS SP (FENGEL E WEGENER, 1989)
HO
HOCH 2
HOCH 2
[
O
C H C H C HO
H 3 C O OC H 3
[
HOCH 2
[
C H C H 2 OH
C H
OH H 3 C O
C H C H
C H 2 OH
H 3 C O OC H 3 O [
C C H O
C H 2 C O
H 2
H
[ [
H H 2
1
2
3
4 5 6
7
8
9 10 11
12
13 14
15
16 17
H 3 C O O
OC H 3
C HOH
C H 2 OH C H
O C H C
O H
C H 2
18
HO
OC H 3 H 3 C O OH
OH OC H 3 H 3 C O
C HOH C H O
H 3 C O
O C HC O
H 3 C O
C HOH
C H 2 OH C H
H 3 C O O
H 3 C O
OC H 3 OC H 3 OH
C H
C H C H C H 2 OH
C H C H 2 OH
C HOH
OC H 3 C H
O C H
OC H 3 H 3 C O O
C H 2 OH
HC C H 2 OH
C HOH
OC H 3 H 3 C O O HC
C H O
OC H 3 O
C H C H 2 OH
C H
H 3 C O OC H 3 O
O H 3 C O
C H O C C
C H
O C H 2
OH OC H 3
19
FIGURA 11 - ESTRUTURA DOS ÁLCOOIS PRECURSORES DA LIGNINA (SJÖSTRÖM, 1992)
As ligninas de coníferas são quase que exclusivamente compostas por resíduos
derivados do álcool coniferílico (lignina do tipo G), enquanto as ligninas das folhosas
contêm resíduos derivados dos álcoois coniferílico e sinapílico (lignina tipo GS). Em
contraste, as ligninas derivadas de gramíneas contêm os três precursores básicos citados
acima (lignina tipo HGS). Como conseqüência, as ligninas das folhosas possuem alta
quantidade de grupos metoxílicos, são menos condensadas e são mais suscetíveis à
conversão química do que as ligninas derivadas das coníferas (Ramos, 2003).
3.1.4 Extrativos
Os componentes de menor massa molar, presentes na fitobiomassa, incluem uma
variedade de compostos orgânicos cuja presença relativa é governada por uma série de
fatores, entre os quais os de natureza genética e climática. Esses componentes não
Álcool p-cumarílico
Álcool coniferílico
Álcool sinapílico
20
residem na parede celular da planta e dividem-se, basicamente, em duas classes. A
primeira classe engloba materiais conhecidos como extrativos por serem extraíveis em
água e solventes orgânicos neutros ou volatilizados por arraste de vapor. A segunda classe
engloba materiais que não são comumente extraíveis com os agentes mencionados, como,
por exemplo, compostos inorgânicos (cinzas), proteínas e substâncias pécticas (Ramos,
2003).
O teor de extrativos em folhosas corresponde a cerca de 3 a 10%, estando esse
valor em torno de 5 a 8% para as coníferas. Esses constituintes são freqüentemente
responsáveis por determinadas características da planta, como a cor, o cheiro, a
resistência natural ao apodrecimento, o sabor e suas propriedades abrasivas (D'Almeida,
1988). É comum a denominação de resina para uma determinada classe de extrativos.
Porém, este termo aplica-se a um conjunto de substâncias químicas que inibem a
cristalização e, portanto, caracteriza mais a condição física do que a composição química
da fração. Deste modo, os seguintes compostos podem ser encontrados em resinas de
madeiras: terpenos, lignanas, estilbenos, flavonóides e outros aromáticos. Além dessas
substâncias, outros compostos orgânicos podem também estar presentes nos extrativos,
como gorduras, ceras, ácidos graxos, álcoois, esteróides e hidrocarbonetos de elevada
massa molar (Ramos, 2003).
21
3.2 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
A sacarificação da celulose representa uma alternativa interessante para a
destinação de fitobiomassas residuais como o bagaço de cana e resíduos de atividades
florestais. No entanto, apesar de muitos estudos, não estão totalmente compreendidos
quais as características do substrato que atribuem maior eficiência à taxa de hidrólise da
celulose. Algumas das características mais influentes incluem a acessibilidade, o grau de
cristalinidade, o grau de polimerização e a distribuição da lignina (Palomen et al, 2004).
Além disso, bioprocessos baseados na hidrólise enzimática requererão substratos
produzidos com a qualidade adequada, a partir de fitobiomassa residual. Diferentes tipos
de pré-tratamento podem ser aplicados para promover a conversão destes materiais em
substratos susceptíveis à hidrólise enzimática e, dentre estes, o pré-tratamento a vapor tem
sido descrito como um dos mais eficientes (Ramos, 1992; Wyman et al, 2005; Mosier et
al, 2005; Negro et al, 2003; Söderström et al, 2003). Paralelamente, estudos têm sido
realizados na busca de enzimas capazes de hidrolisar a celulose de maneira cada vez mais
efetiva, seja pela otimização de processos fermentativos, pela combinação de enzimas
para a obtenção de complexos celulásicos mais eficientes ou pelo melhoramento de
espécies através de métodos de engenharia genética (Jørgensen et al, 2004; Imai et al,
2004; Kang et al, 2004).
22
3.3 CELULASES
Atualmente, sabe-se que o complexo celulásico secretado por fungos
filamentosos é formado por três componentes enzimáticos majoritários, as
endoglucanases, as celobiohidrolases (exoglucanases) e as β-glucosidases, que não são
consideradas com celulases legítimas. De acordo com o modelo de sinergismo “endo-
exo”, essas enzimas cooperam da seguinte maneira: as celobiohidrolases (CBH) agem
como exo-enzimas (e. g., no fim das cadeias) e liberam celobiose como produto principal;
as endoglucanases (EG) agem randomicamente ao longo da cadeia produzindo novos
sítios de ataque para as celobiohidrolases; e as β-glucosidases completam o processo
através da hidrólise da celobiose e de outros oligossacarídeos à glucose (Medve, 1997;
Zandoná Filho, 2001) (Figura 12).
23
FIGURA 12 - MODO DE AÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei
OO OO
OOOHO
O O
OO
O
OOO O OOO
Endoglucanases
Sinergismo Endo-Exo
Celobiases
Exoglucanases
glucose n
celobiose
OOO
OO O
OOO
OO
OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO O
O O
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO
OO
OHO OO
OO
OO
OH
O O O
O
O
O
OHHO
HO O OO
OHHO
HO O OOOH
HOHO O O
O
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO
OO OOO
O OOH
OOOO
O O
OO OO OH
OO O
OOH
OO
OO O
OO
OOO OOO O O
O OO
OHHOHO
OO
OOH
HOHO
O OO
OO O OO O OOOOO
OO O
OO OHO O
O O
OO OHHO OOHO O OOO
O OO
OO
OH
O
O
OHHO
HO OO
O
O O
OO OHHO O
OH
HOHO
OO
O
O OO
OH
HOHO
O OO
O
O
O
O
O
O
OOO
O
O
O
O
O
O OOO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
( )OHHO
HO O
H2COH
HO
OHHO
HO O OOHO H2COH
HOH2COH
HO
OO OO
OOOHO
O O
OO
O
OOO O OOO
OO OO
OOOHO
O O
OO
O
OOO O OOO
Endoglucanases
Sinergismo Endo-Exo
Celobiases
Exoglucanases
glucose n
celobiose
OOO
OO O
OOO
OO
OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO O
O O
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO
OO
OHO OO
OO
OO
OH
O O O
O
O
O
OHHO
HO O OO
OHHO
HO O OOOH
HOHO O O
O
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO
OO OOO
O OOH
OOOO
O O
OO OO OH
OO O
OOH
OO
OO O
OO
OOO OOO O O
O OO
OHHOHO
OO
OOH
HOHO
O OO
OO O OO O OOOOO
OO O
OO OHO O
O O
OO OHHO OOHO O OOO
O OO
OO
OH
O
O
OHHO
HO OO
O
O O
OO OHHO O
OH
HOHO
OO
O
O OO
OH
HOHO
O OO
O
O
O
O
O
O
OOO
O
O
O
O
O
O OOO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
( )OHHO
HO O
H2COH
HO
OHHO
HO O OOHO H2COH
HOH2COH
HO
Endoglucanases
Sinergismo Endo-Exo
Celobiases
Exoglucanases
glucose n
celobiose
Endoglucanases
Sinergismo Endo-Exo
Celobiases
Exoglucanases
glucose n
celobiose
OOO
OO O
OOO
OO
OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO O
O O
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
O OOO
OO O
OOO
OO O
O OO
OOO
OO O
OOO
OO O
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HO O OOHO H2COH
HOH2COH
HO
Muitas celulases são compostas por dois domínios distintos: o domínio de ligação
ao substrato (DLS), ou “celulose binding domain (CBD)”, e o domínio catalítico (DC),
que abriga o sítio ativo (SA). Estes domínios estão ligados um ao outro através de uma
cadeia polipeptídica flexível. O sítio ativo possui como função a hidrólise das ligações
glicosídicas da celulose e cada classe de celulase possui uma forma diferente de sítio
ativo, permitindo a hidrólise de ligações localizadas em regiões distintas do substrato (e.
g., ligações internas e ligações terminais, localizadas nas extremidades das cadeias). A
função do domínio de ligação ao substrato está associada à adsorção, que permite o
24
aumento da concentração das celulases na superfície da celulose através de interações
não-covalentes, envolvendo ligações de hidrogênio, forças eletrostáticas e interações
hidrofóbicas. Palonen (2004) demonstrou que sítios ativos separados dos DLS são
capazes de hidrolisar substratos até mesmo insolúveis, embora com menor eficiência. No
entanto, em concentrações enzimáticas muito altas, o DLS promove a adsorção não
produtiva da enzima ao substrato
3.3.1 Endoglucanases
As endo-1,4-β-D-glucanases hidrolisam as cadeias de celulose de modo aleatório.
Estas enzimas hidrolisam a celulose amorfa e celuloses modificadas quimicamente
(solúveis), como carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC). A celulose
cristalina e o algodão, ambos substratos com elevado grau de cristalinidade, são menos
hidrolisados devido ao maior grau de organização molecular que apresentam.
O sítio ativo das endoglucanases possui a forma de uma chave, possibilitando a
ação da enzima ao longo da cadeia de celulose e reduzindo o seu grau de polimerização
de maneira considerável. As regiões de menor organização estrutural são mais facilmente
atacadas, pois possuem cadeias que não estão envolvidas em interações de hidrogênio
intermoleculares tão fortes quanto as que ocorrem nas regiões cristalinas, levando,
conseqüentemente, a uma maior exposição das ligações glicosídicas mais internas das
cadeias de celulose (Figura 13).
25
FIGURA 13 - SÍTIO ATIVO EM FORMA DE CHAVE DAS ENDOGLUCANASES, QUE PERMITE O
ACESSO AO LONGO DE UMA CADEIA DE CELULOSE
3.3.2 Exoglucanases
As exo-1,4-β-D-glucanases (celobioidrolases, CBHs) atuam nas extremidades
redutoras e não redutoras da cadeia de celulose, produzindo majoritariamente celobiose,
além de glucose e celotriose (Zandoná, 2001). Estas enzimas não atuam sobre celuloses
solúveis por haver um impedimento estereoquímico causado pelos grupos substituintes,
seja carboximetílico (CMC) ou hidroxietílico (HEC). As exoglucanases atuam sobre
celulose cristalina (Avicel®), produzindo uma redução lenta e gradual do seu grau de
polimerização. Assim, ensaios de atividade sobre CMC são característicos para as
26
endoglucanases (EGs), enquanto que a atividade contra Avicel® caracteriza as CBHs,
tornando possível a diferenciação entre essas enzimas.
O sítio ativo das celobioidrolases possui a forma de um túnel por onde a cadeia de
celulose penetra e sofre hidrólise de suas ligações glicosídicas terminais, liberando
majoritariamente celobiose. O DLS é constituído por aproximadamente 40 aminoácidos
(aa) e possui a importante função de promover a adsorção da proteína ao substrato,
conferindo estabilidade ao agregado e permitindo a melhor aproximação da cadeia de
celulose ao sítio ativo. A adsorção ocorre através da interação de resíduos de tirosina
(TYR) presentes no DLS com as unidades de glucopiranose presentes na superfície da
celulose (Figura 14).
FIGURA 14 - MODO DE AÇÃO PROGRESSIVA DA CELOBIOIDROLASE I (CBH I) DE T. reesei
(DIVNE et al, 1994)
27
Devido a suas propriedades e especificidade ao substrato, as celobiohidrolases
podem ser facilmente isoladas e purificadas por cromatografia de afinidade, razão pela
qual seus domínios catalíticos e de ligação ao substrato ("binding domain") já foram
cristalizados e parcialmente caracterizados em relação a sua estrutura tridimensional
(Divne et al., 1994). Por outro lado, as celobioidrolases, apesar de apresentarem
similaridades em seus modos de ação catalítica, podem ser separadas por métodos
eletroforéticos como a isoeletrofocalização (Coughlan, 1985) por possuírem diferenças
significativas em seus teores de carboidratos (glicosilação) e de aminoácidos, pontos
isoelétricos e respectivos raios hidrodinâmicos.
3.3.3 β-glucosidases
As β-glucosidases, também denominadas celobiases, possuem a função de
desdobrar a celobiose gerada pelas celobioidrolases e endoglucanases em glucose.
Estritamente falando, β-glucosidases não são celulases legítimas, uma vez que elas agem
sobre substratos solúveis, mas sua contribuição é muito importante para a eficiência da
hidrólise da celulose pela remoção da celobiose do meio reacional, que é um potente
inibidor competitivo das celobiohidrolases (Medve, 1997).
28
3.3.4 Mecanismo de hidrólise
O mecanismo de catálise da hidrólise das ligações glicosídicas ocorre de maneira
semelhante para as endoglucanases e para as celobioidrolases, através de uma reação
ácido-base onde os aminoácidos constituintes do sítio ativo atuam como ácidos e bases de
Brönsted. Existem duas vias de catálise passíveis de se ocorrer e dependendo do espaço
disponível dentro do sítio ativo, uma delas será favorecida em detrimento à outra.
Em sítios ativos com 0,65 nm a 0,95 nm, se faz necessária a presença de uma
molécula de água que vai atuar como doadora de um próton para o aminoácido básico,
gerando uma hidroxila que vai atuar como nucleófilo e atacar o carbono anomérico, ao
mesmo tempo em que o par de elétrons da ligação glicosídica retira um próton do
aminoácido ácido. Nessa via catalítica, a ligação glicosídica é hidrolisada em apenas uma
etapa e ocorre a inversão da configuração do carbono anomérico, gerando um anômero
α. (Figura 15).
29
FIGURA 15 - MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A INVERSÃO DE
CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)
Em sítios ativos com 0,55 nm, a catálise ocorre sem a necessidade da participação
da molécula de água. O aminoácido básico ataca diretamente o carbono anomérico,
enquanto o par de elétrons da ligação glicosídica remove um próton do aminoácido ácido;
nessa etapa, forma-se o intermediário enzima-carboidrato. No restabelecimento do sítio
ativo, o aminoácido ácido desprotonado ataca uma molécula de água do meio, formando
uma hidroxila que vai atacar o carbono anomérico e liberar o carboidrato com a
configuração original, ou seja, o anômero β.
0,65 – 0,95 nm
30
FIGURA 16 - MECANISMO DA HIDRÓLISE DA LIGAÇÃO GLICOSÍDICA COM A RETENÇÃO
DE CONFIGURAÇÃO DO CARBONO ANOMÉRICO (RÄTTÖ, 1997)
3.4 CELULASES DE Trichoderma reesei
O complexo celulásico secretado pelo Trichoderma reesei é o mais estudado em
toda a literatura e, como conseqüência, muitos detalhes sobre o seu modo de ação são
conhecidos atualmente.
0,55 nm
31
Sabe-se que o complexo celulásico de T. reesei possui pelo menos cinco enzimas
com atividade endoglucanásica (EG I, II, III, IV e V). Tal multiplicidade tem sido
justificada por alguns autores como decorrente de modificações pós-translacionais como e
a glicosilação. No entanto, existem fortes evidências de que estas enzimas sejam
biomoléculas não relacionadas e que, como tal, possuam funções distintas durante o
processo de sacarificação da celulose (Claeyssens e Tomme, 1989; Goyal et al., 1991).
A EG I é a endoglucanase produzida em maior quantidade pelo T. reesei,
chegando a cerca de 5% do total de proteínas liberadas no meio de cultura, enquanto a EG
II chega a 0,5% e as endoglucanases restantes (EG III, IV e V) apresentam-se como
componentes minoritários.
Pelo menos dois tipos de celobiohidrolases (CBH I e CBH II) já foram
identificadas no complexo celulásico secretado por T. reesei (Figura 17). Estas
exoglucanases são produzidas em maior quantidade do que as outras enzimas celulásicas
do complexo. A CBH I responde por cerca de 60% do total de proteínas liberadas no meio
de cultura, enquanto que a CBH II chega a 20%.
32
FIGURA 17 - CELOBIOIDROLASES DE T. reesei. CBH I QUE ATUA NA EXTREMIDADE
REDUTORA DA CADEIA DE CELULOSE E A CBH II QUE ATUA NA
EXTREMIDADE NÃO REDUTORA (HARRIS, 2005)
DLS C-Terminal
DLS N-Terminal
Peptídeo de ligação com 35 aa
Peptídeo de ligação com 44 aa
Extremidade não redutora Extremidade redutora
CBH I
CBH II
3.4.1 Sinergismo
Dos sistemas celulásicos melhor estudados, as celobiohidrolases, particularmente
a CBH I de T. reesei, têm sido consideradas como as enzimas mais importantes à
sacarificação eficiente da celulose. Evidências experimentais indicam que a remoção do
gene que codifica para a produção de CBH I reduz em 70% a atividade do complexo
sobre a celulose cristalina (Suominen et al., 1993; Karhunen et al., 1993). Além disso, as
celobiohidrolases apresentam grande interação sinergística com outras celulases,
33
principalmente aquelas de atividade reconhecidamente endoglucanásica (Beldman et al.,
1988). Dos vários tipos de sinergismo descritos na literatura, a cooperação entre CBH I e
CBH II de T. reesei é certamente um dos mais curiosos (Figura 18).
FIGURA 18 - SINERGISMO ENTRE AS ENDOGLUCANASES E AS CELOBIOIDROLASES DE T.
REESEI. AS ENDOGLUCANASES ATUAM AO LONGO DA CADEIA, GERANDO
NOVOS SÍTIOS DE ATAQUE PARA AS CELOBIOIDROLASES (CORTESIA DE
MATTI SIIKA-AHO, VTT BIOTECHNOLOGY-FINLÂNDIA)
CBH IIENDOGLUCANASES
CBH ICBH IIENDOGLUCANASES
CBH I
Wood et al. (1989) interpretaram o sinergismo exo/exo postulando que a CBH I
tem estereo-especificidade diferente da CBH II e que essas enzimas atacam dois grupos
não redutores estereoquimicamente distintos na superfície da celulose cristalina. A
remoção seqüencial de unidades de celobiose do terminal não redutor da cadeia, pela ação
da CBH I, pode expor numa cadeia vizinha um grupo terminal não redutor com
34
configuração correta para ser atacado pela CBH II e vice-versa. No entanto, a concepção
atualmente aceita para este sinergismo é a de que a CBH I atua no terminal não redutor da
molécula, enquanto que a CBH II restringe-se aos terminais redutores (Beldman, 1988;
Nidetzki, 1993).
Estudos envolvendo a utilização de substratos-modelo também indicaram que as
CBHs podem exercer alguma atividade endoglucanásica (Claeyssens e Aerts, 1992;
Ramos et al., 1999) e esses resultados têm comprometido a classificação até hoje vigente
para estas enzimas. Por outro lado, sabe-se que, mediante ação proteolítica, a CBH I pode
ser dividida entre os seus domínios catalítico (DC) e de ligação ao substrato (DLS), sendo
que o domínio catalítico livre não apresenta a propriedade de adsorver ao substrato e, por
conseguinte, não atua como uma CBH legítima (Zandoná, 2001). Portanto, a existência de
quaisquer atividades proteolíticas residuais pode comprometer o modo de ação de
preparações fundamentalmente celobiohidrolásicas (Teeri et al, 1998).
Nidetzky et al. (1993) demonstraram que a ação sinergística de celulases
purificadas de T. reesei diminui com o aumento da concentração do substrato e que essa
diminuição depende fortemente do tipo de celulose testado, sendo máximo para a celulose
microcristalina. Foi também comprovado que a atividade dessas celulases purificadas
aumentava quando substratos “amorfos” eram utilizados e que combinações binárias do
tipo CBH I/EG III e CBH I/CBH II exibiram os mais notáveis graus de sinergismo sobre a
celulose microcristalina.
35
3.5 CELULASES DE Penicillium sp.
Além do amplamente estudado complexo celulásico de T. reesei, existem outros
fungos filamentosos capazes de produzir sistemas celulásicos eficientes, como Humicola
sp., Aspergillus sp. e Penicillium sp. Estes fungos também têm sido propostos como
alternativas interessantes na busca por novas preparações comerciais e por processos que
apresentem maior eficiência na hidrólise de substratos celulósicos.
Alguns autores têm se dedicado ao estudo desses complexos celulásicos e
semelhanças ao complexo de T. reesei já foram evidenciadas. A composição enzimática
destes complexos enzimáticos é semelhante, ou seja, ambos possuem endoglucanases,
exoglucanases e β-glucosidases, embora difiram na proporção, na quantidade e na
especificidade ao substrato de enzimas que apresentam a mesma função (endo ou exo).
Bhat et al (1989) encontraram 8 endoglucanases em culturas do P. pinophilum e a maior
parte da atividade endoglucanásica foi atribuída a 5 destas enzimas, as quais foram
isoladas e caracterizadas. Jørgensen et al (2003) encontraram 2 celobioidrolases (CBHa e
CBHb), 3 endoglucanases (EGa, EGb1 e EGb2) e 1 xilanase (XYL) em culturas do P.
brasilianum. A CBHb apresentou propriedades semelhantes à CBHI de T. reesei,
enquanto a CBHa apresentou semelhanças com a CBHII deste mesmo microorganismo. A
EGa também apresentou similaridades com a massa molecular e o modo de ação catalítica
da EGIII de T. reesei, pois ambas não adsorvem ao substrato durante a hidrólise.
36
As principais diferenças apresentadas dizem respeito à atividade β-glucosidásica
e à estabilidade sob as diferentes condições de processo. Jørgensen et al (2005) encontrou
atividade β-glucosidásica suficiente para a remoção da celobiose, produzida pelas
celulases durante a hidrólise de substratos celulósicos, em três espécies de Penicillium: P.
pinophilum, P. brasilianum e P. persicinum. Devido a essa alta atividade, não foi
necessária a adição de β-glucosidases exógenas a estes complexos celulásicos para
garantir altas taxas de conversão. Castellanos et al (1995) demonstrou que um complexo
celulásico de Penicillium sp. foi mais eficiente na hidrólise de celulose microcristalina do
que Cytolase® 300 (Genencor) e atribuiu a maior eficiência às β-glucosidases, presentes
em maior quantidade, e também à maior estabilidade operacional do sistema celulásico de
Penicillium sp.
3.6 MODELOS TÍPICOS DE SUBSTRATOS PARA ESTUDO DE CELULASES
Em muitos estudos, substratos modelo são utilizados para facilitar a diferenciação
entre atividades enzimáticas, como endo- ou exoglucanásicas e celobiásica ou β-
glucosidásica. Em seguida, alguns desses substratos serão descritos.
37
3.6.1 Avicel®, Sigmacell® (celulose microcristalina ou hidrocelulose)
A Avicel® e a Sigmacell® são tipos de celulose microcristalina que podem ser
preparados a partir de fibras de celulose por hidrólise com HCl 2,5 mol/L, seguida de
neutralização e várias etapas de lavagem e secagem com solvente (água, acetona, etanol).
Através desse processo, a região amorfa da celulose é atacada preferencialmente pelo
tratamento ácido, produzindo partículas cristalinas com GP de 100 a 250 unidades de
anidroglucose. O índice de cristalinidade da Sigmacell ® e da Avicel® é de
aproximadamente 47% (Medve, 1997).
O baixo GP da celulose microcristalina significa que este substrato possui muitas
extremidades de cadeia, o que a define como um substrato apropriado para medir
atividade exoglucanásica. No entanto, a Avicel® tem se tornado um substrato amplamente
utilizado em estudos sinergísticos e de cinética de adsorção de enzimas celulásicas
(Medve, 1997).
3.6.2 Papel de filtro
O papel de filtro é um substrato tradicionalmente utilizado em pesquisas de
celulases. As fibras de celulose que constituem o papel têm uma estrutura complexa e,
para a sua hidrólise substancial, é necessário um sistema celulásico completo
(celobiohidrolases e endoglucanases). O papel de filtro é recomendado pela Comissão de
38
Biotecnologia da IUPAC para se avaliar a atividade celulásica total de um sistema
celulásico (Medve, 1997; Ghose, 1987).
3.6.3 Algodão
O algodão é a forma mais pura e natural da celulose, ainda que contenha
pequenas quantidades de impurezas (pectinas, proteínas, ceras) que podem ser removidas
por extração alcalina e/ou orgânica a quente, seguida por várias etapas de lavagem e
secagem. Sendo, aproximadamente, 70% a 80% cristalino, o algodão é pouco suscetível à
hidrólise enzimática e a presença tanto de celobiohidrolases quanto de endoglucanases é
necessária para que sua hidrólise seja eficiente. No entanto, espera-se que endoglucanases
não apresentem grande acessibilidade ao substrato porque essas enzimas têm preferência
à regiões amorfas da estrutura supramolecular da celulose (Medve, 1997; Tímár-Balázsy e
Eastop, 1998).
3.6.4 Solka Floc (α-celulose)
A Solka Floc é preparada a partir de madeira moída em moinho de martelo,
através de várias etapas de extração orgânica, ácida ou alcalina. As hemiceluloses e a
lignina são parcialmente removidas durante estas etapas, mas a celulose permanece
aparentemente intacta. Kothari (2002) demonstrou que o GP da celulose de Solka Floc
39
corresponde a apenas 700 unidades, o que sugere que a celulose sofre uma considerável
perda em sua massa molecular. Este material pode ainda conter uma quantidade
significativa de xilanas, mas uma preparação mais rica em celulose poderia ser alcançada
através do aumento da severidade da extração que, inevitavelmente, também causaria uma
degradação ainda maior da celulose.
Fragmentos maiores de Solka Floc são rapidamente degradados por celulases,
mas à medida que a parte mais acessível é hidrolisada, a taxa de hidrólise é
gradativamente reduzida. A Solka Floc é freqüentemente utilizada como fonte de carbono
para a produção de celulases e, também, para estudos de adsorção e sinergismo (Medve,
1997).
3.6.5 Celulose de Valonia sp.
Valonia sp. é uma alga verde que produz microfibrilas de celulose de alta
cristalinidade (perto de 100%). A forma cristalina dominante (60-70%) é a Iα. As
microfibrilas são grossas e têm secção transversal retangular, com dimensão lateral de 20
nm. A celulose de Valonia tem sido um substrato popular no estudo de adsorção e
sinergismo, tanto pela sua cristalinidade como pela sua grande homogeneidade (Medve,
1997).
40
3.6.6 Celulose bacteriana
A celulose altamente cristalina produzida pelo Acetobacter xylinum também tem
se tornado um substrato freqüentemente utilizado para o estudo das propriedades
catalíticas de celulases. Os microcristais da celulose bacteriana são mais espessos (3,0 x
6,8 nm) do que os presentes na parede celular e, por essa razão, exigem modos de ação
catalítica fundamentalmente baseados na erosão gradativa da superfície do agregado
(Medve, 1997).
3.6.7 Celulose obtida por tratamento com ácido fosfórico
Este substrato é obtido através do tratamento de celulose microcristalina com
ácido fosfórico xaroposo (85%) a 1°C durante 1 h. Esta celulose, considerada 100%
amorfa, é muito importante para estudos das propriedades catalíticas de celulases. Mesmo
celulases purificadas atacam este substrato rapidamente e o seu GP médio depende do
material de partida (normalmente, Avicel) e do controle do processo de produção (Medve,
1997).
41
3.6.8 Derivados solúveis da celulose (CMC, HEC)
Ao substituir a celulose com suficiente quantidade de grupos carboximetílicos ou
hidroxietílicos, é possível torná-la solúvel em água. Esses substratos são produzidos
comercialmente com diferentes GP e GS (grau de substituição), e têm sido usados há
muito como substratos-modelo para ensaios de atividade endoglucanásica. Tal atividade
pode ser medida tanto pelo aumento da concentração de açúcares redutores no meio
quanto através da redução da viscosidade da solução. Esses tipos de celuloses
modificadas (ou substituídas) são bons substratos para endoglucanases porque apresentam
grande solubilidade em água e não podem ser hidrolisados extensivamente por
celobioidrolases, devido a sua baixa organização estrutural e/ou caráter amorfo
pronunciado, além do impedimento estérico causado pelos grupos substituintes
(carboximetil ou hidroxietil), que impedem que a cadeia da celulose penetre no sítio ativo
das celobioidrolases. A carboximetilcelulose de viscosidade média (CMC) foi escolhida
pela Comissão de Biotecnologia da IUPAC (Ghose, 1987) como o substrato recomendado
para medir a atividade endoglucanásica e a hidroxietilcelulose (HEC) é utilizada como
substrato alternativo para este mesmo fim (Medve, 1997).
42
3.6.9 Celodextrinas e seus derivados cromogênicos
Os substratos citados anteriormente são usados para investigar processos globais
de hidrólise enzimática, mas não são aplicáveis a estudos bioquímicos clássicos como a
determinação do número de domínios de ligação, investigação de modos de associação
molecular e de cinética enzimática. Celodextrinas (GP inferior ou igual a 8 – as maiores
são praticamente insolúveis em água) e especialmente seus derivados cromogênicos ou
fluorogênicos, são substratos que podem ser aproveitados para este objetivo. Os
cromóforos mais usados são os para- ou orto-nitrofenóis, enquanto que a 4-
metilumbeliferona é o substrato fluorogênico mais empregado. Glucosídeos como o p-
nitrofenil-β-(1,4)-celobiosídio tem sido largamente utilizados para a determinação de
atividade de celulases. A hidrólise de ligações glicosídicas nesses substratos pode ser
facilmente observada pela diferença das propriedades espectrais entre as agliconas livres e
em sua forma conjugada aos carboidratos (Medve, 1997).
3.6.10 Xilanas
Os sistemas celulásicos podem freqüentemente apresentar atividade
hemicelulásica e esta atividade pode ser detectada utilizando substratos naturais como a
xilana de casca de aveia, que contém cerca de 10% de arabinose e 15% de glucose, sendo
também um substrato mais ramificado e acetilado. Outro substrato que pode ser utilizado
43
é a xilana de madeira de vidoeiro, com cerca de 90% de xilose. A xilana de madeira de
vidoeiro é menos ramificada e, por isso, recomendada por Bailey (1992) para a
determinação de atividade xilanásica em preparações enzimáticas.
44
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ENZIMAS
Foi utilizada neste estudo uma preparação enzimática derivada de P. echinulatum,
produzida pelo grupo do Prof. Aldo José Pinheiro Dillon na Universidade de Caxias do
Sul (Caxias do Sul, RS) (Dillon et al, 1999; Camassola et al., 2004). As outras
preparações enzimáticas utilizadas neste trabalho foram uma cortesia da Novozymes
Latin América (Araucária - PR) e da Novozymes A/S Dennmark (Bagsvaerd, Dennmark).
Celluclast 1.5L FG (Novozymes Latin América) é uma preparação celulásica produzida
pelo fungo T. reesei, enquanto que Novozym 188 (Novozymes A/S Dennmark)
corresponde a uma β-glucosidase produzida por Aspergillus niger.
4.2 PRODUÇÃO DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum
O complexo enzimático utilizado foi produzido no Instituto de Biotecnologia da
Universidade de Caxias do Sul (Camassola, 2004). Os micronutrientes utilizados para o
cultivo do fungo foram: KH2PO4 (0,2 g/L); (NH4)2SO4 (0,13 g/L); CO(NH2)2 (0,03 g/L);
MgSO4.7H2O (0,03 g/L); CaCl2 (0,03 g/L); FeSO4.7H2O (0,5 mg/L); MnSO4.H2O (0,156
mg/L); ZnSO4.7H2O (0,14 mg/L); e CoCl2 (0,14 mg/L). Como fonte de carbono, foi
utilizada a celulose microcristalina a 1% (m/m), enquanto que peptona microbiológica
45
(Oxoid L85) a 0,1 % (m/m) foi utilizada como fonte de nitrogênio. O farelo de trigo a 0,5
% (m/m), além de servir como fonte adicional de carbono, foi também utilizado para
aumentar a taxa de crescimento (aumento da biomassa) do inóculo, que foi iniciado a uma
concentração de 105 esporos/mL. Foram preparados 4 L de meio de cultivo e a
fermentação foi realizada a 150 rpm, 37ºC por 8 dias, quando ocorre a lise celular e a
quantidade de β-glucosidases em solução é maior. O caldo fermentativo foi filtrado e ao
sobrenadante foram adicionados 6 L de etanol. A mistura foi deixada em repouso por 24
h, após o repouso, a solução foi filtrada e o precipitado, sem nenhum outro procedimento
de purificação, foi armazenado para análise no Departamento de Química da
Universidade Federal do Paraná.
4.3 PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS
As proteínas foram precipitadas antes de serem submetidas às análises
quantitativas. Alíquotas de 1 mL da solução protéica foram misturados com 1 mL de uma
solução de ácido trifluor acético 10% (m/v) (TCA). Após repouso por aproximadamente
60 minutos no refrigerador, a mistura foi centrifugada por 25 minutos a 2000 rpm. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi solubilizado em tampão citrato, 50
mmol/L pH 4,8 e a análise das proteínas foi realizada pelos métodos de Bradford e de
Lowry.
46
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO
DE BRADFORD (1976)
O método de Bradford utiliza o corante “Coomassie Brilliant Blue” BG-250
(Figura 19) para a determinação de proteínas totais. O BG-250 interage com proteínas que
contenham aminoácidos com cadeias laterais aromáticas ou básicas. No pH da reação, a
interação entre a proteína e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do
corante para a forma aniônica, que absorve fortemente 595 nm.
FIGURA 19 - ESTRUTURA DO CORANTE COOMASSIE BRILLIANT BLUE BG-250
O reagente de Bradford foi preparado pela diluição de 100 mg do corante
Coomassie Brilliant Blue BG-250 em 50 mL de etanol, em seguida foram adicionados
100 mL de ácido fosfórico 85% (m/v) e a mistura foi diluída até 1 L e armazenada a 4ºC.
47
Para a determinação das proteínas, adicionou-se 1 mL do reagente de Bradford a
100 µL da solução protéica. Em seguida, a absorvância da solução foi medida no
comprimento de 595 nm. O equipamento utilizado foi um espectrofotômetro Varian
modelo Carry 100. A concentração das proteínas foi determinada contra uma curva de
calibração baseada em soro albumina bovina como padrão.
4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO
DE LOWRY (GHOSE, 1986)
O princípio do método baseia-se na reação de uma mistura de ácido
fosfomolibdênico e ácido fosfotungstênico, o reagente de Folin-Ciocalteau, que sofre uma
redução quando reage com proteínas na presença de cobre (II) e produz um composto
com forte absorvância em 750nm. A redução ocorre através das cadeias laterais de alguns
aminoácidos (tirosina, triptofano, cisteína, asparagina e histidina) que contribuem com 4
elétrons, ou através da retirada de 2 elétrons de cada unidade tetrapeptídica que é
facilitada com a formação do quelato com o cobre (II).
Os reagentes utilizados por este método foram preparados da seguinte maneira:
Reagente A – dissolveu-se 20 g de Na2CO3 e 4 g de NaOH em água destilada e, em
seguida, completou-se o volume até 1 L; Reagente B-1 – dissolveu-se 1 g de CuSO4 em
água destilada e, em seguida, completou-se o volume até 100 mL; Reagente B-2 –
dissolveu-se 2 g de tartarato de sódio e potássio (sal de Rochelle) em água destilada e, em
48
seguida, o volume foi completado até 100mL; Reagente C – preparado pela mistura de 1
mL do Reagente B-2 a 1 mL do Reagente B-1, seguido da adição de 100 mL do Reagente
A.
Inicialmente, foram adicionados 5 mL do Reagente C a 0,5 mL da solução
protéica. Após 10 minutos, 0,5 mL do reagente de Folin Ciocalteau diluído em água na
proporção de 1:1 foi adicionado à mistura. Depois de 30 minutos, a absorvância da
solução foi medida em 750 nm e as proteínas foram quantificadas contra uma curva de
calibração contendo soro albumina bovina como padrão.
4.6 CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL CATALÍTICO DAS ENZIMAS
Todos os ensaios de atividade foram conduzidos em tampão citrato 50 mmol/L,
pH 4,8, com exceção do experimento onde a atividade contra papel de filtro é comparada
também em tampão acetato, pH 4,8, e comparados com o complexo celulásico de T.
reesei. Uma unidade internacional (UI) foi definida como a atividade enzimática
necessária para a liberação de 1 micromol de equivalentes de glucose por minuto de
reação.
49
4.7 DETERMINAÇÃO DOS AÇÚCARES REDUTORES
A quantificação dos açúcares redutores totais (ART) foi procedida pelo método
do ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS), conforme recomendação da IUPAC (Ghose, 1986).
De acordo com este método, o DNS sofre redução de um de seus grupos nitro ao
reagir com os carboidratos, formando um composto que apresenta forte absorção em 540
nm (Figura 21).
FIGURA 21 - REAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES COM O ÁCIDO 3,5-DINITRO-SALICÍLICO
COOH
O2N OH
O2N
COOH
O2N OH
NH2
Açúcar
redutor+ +
Produtos
de
oxidação
540 nm
O reagente DNS foi preparado com a dissolução de 7,49 g de ácido 3,5-dinitro-
salicilico e 14 g de NaOH em 1000 mL água destilada. Após a dissolução, foram
adicionados 216,10 g de tartarato duplo de sódio e potássio (Sal de Rochelle), 5,37 mL de
fenol (fundido a 50ºC) e 5,86 g de metabissulfito de sódio. O reagente foi rotineiramente
armazenado na temperatura ambiente.
50
Para o procedimento analítico, foram adicionados 3 mL do reagente DNS a
amostras com 1 ou 2 mL em tubos de ensaio. O meio reacional permaneceu em água
fervente por exatamente 5 minutos e, em seguida, foi resfriado em banho de água à
temperatura ambiente. Após a homogeneização do meio mediante inversão dos tubos,
quando necessário, uma alíquota de 1 mL foi retirada e diluída para possibilitar a medição
da absorvância. A absorvância das amostras em 540 nm foi medida e a quantificação foi
realizada através de uma curva de calibração, utilizando o açúcar redutor de interesse
como padrão. A curva de calibração baseada em soluções-padrão, que foram submetidas
ao mesmo procedimento das amostras.
51
4.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELULÁSICA TOTAL
A IUPAC recomenda a utilização do papel de filtro Whatman #1 como substrato
ideal para a determinação da atividade celulásica total. O método foi realizado segundo
Ghose (1986), com algumas pequenas modificações.
Tiras de aproximadamente 1 x 8 cm (70 mg) de papel de filtro Whatman #1,
recortadas e enroladas, foram adicionadas a tubos de ensaio pré-incubados a 50ºC
contendo 1 mL de tampão e 1 mL da solução enzimática em, no mínimo, três diluições
diferentes e suficientes para produzir em torno de 1 mg/mL de açúcares redutores. Após 1
h de incubação, a hidrólise foi interrompida com a adição de 3 mL de DNS e seguiu-se a
quantificação por este método, como descrito no item 4.14. Antes da realização da leitura,
todas as amostras, padrões e soluções de referência (brancos) foram diluídos quatro vezes
com água destilada. A absorvância da solução foi medida em 540 nm e a concentração de
açúcares redutores foi determinada contra uma curva de calibração onde a glucose foi
utilizada como padrão.
A atividade enzimática foi calculada através da seguinte equação:
(1)
ART (mg/mL) . Edil . VT (mL)
Tempo (min) . 1 µmol glucose (0,18 mg) . VE (mL)
UFP/mL =
52
4.9 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENDOGLUCANÁSICA
A IUPAC recomenda a utilização da carboximetilcelulose de viscosidade média
(CMC) como substrato ideal para a determinação da atividade endoglucanásica e sugere a
hidroxietilcelulose (HEC) como um substrato alternativo para este mesmo objetivo.
No procedimento que empregou CMC, foram preparadas três diluições diferentes
da solução enzimática, sendo estas suficientes para produzir em torno de 0,5 mg/mL de
açúcares redutores. Alíquotas de 0,5 mL destas amostras foram incubas a 50ºC e a reação
foi iniciada com a adição de 0,5 mL de uma solução de CMC de viscosidade média,
preparada em uma concentração de 2% em tampão citrato. Antes de ser utilizada, a
solução de CMC foi deaerada em dessecador sob vácuo. Após 30 minutos, a reação foi
interrompida com a adição de 3 mL da solução de DNS, procedendo-se então ao
procedimento descrito no item 4.14. A absorvância das amostras foi medida e comparada
a uma curva de calibração constituída com padrões de glucose em concentrações de 0,25
mg/mL a 2,0 mg/mL. Para a análise do branco e dos padrões, foram incubados 0,5 mL da
solução de CMC por 30 minutos a 50ºC, seguida da adição de 3 mL de DNS e em
seguida, a adição de 0,5 mL de tampão para o branco ou da solução contendo glucose
para a curva e então prosseguiu-se pelo procedimento descrito no item 4.14. Todos as
amostras, padrões e branco foram diluídos cinco vezes para medição da absorvância, afim
de ajustá-la a níveis compatíveis com a Lei de Lambert-Beer.
53
A atividade enzimática foi calculada através da seguinte equação:
(2)
No procedimento para a hidrólise de HEC, 1,8 mL de uma solução do substrato a
1% (m/v) em tampão citrato foram inicialmente incubados a 50ºC em banho-maria. Após
a estabilização da temperatura, 0,2 mL da solução enzimática foi adicionada ao meio em
diluição apropriada. Após 10 minutos de incubação, a reação foi interrompida com a
adição de 3 mL de solução de DNS para a determinação dos ART como descrito no item
4.14. A absorvância das amostras foi medida e comparada a uma curva de calibração
baseada em padrões de glucose com concentrações de 0,25 mg/mL a 2,0 mg/mL. Para a
análise do branco e dos padrões, foram incubados 1,8 mL da solução de HEC por 30
minutos em 50ºC, seguida de adição de 3 mL de DNS e, em seguida, foram adicionados
0,2 mL de tampão para o branco ou da solução contendo glucose para a curva e então
prosseguiu-se pelo procedimento descrito no item 4.14.
A atividade enzimática foi calculada com base na velocidade inicial, através da
determinação do número de unidades de xilose produzidas por minuto de reação.
ART (mg/mL) . Edil . VT (mL)
Tempo (min) . 1 µmol glucose (0,18 mg) . VE (mL)
UCMC/mL =
54
4.10 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE XILANÁSICA.
A atividade xilanásica foi determina segundo Bailey (1992). Dois substratos
xilanásicos foram utilizados neste experimento: a xilana de madeira de vidoeiro (XMV) e
a xilana da endoderma de aveia (XEA).
Em ambos os casos, foi homogeneizado 1 g de substrato em 80 mL de tampão
citrato a 60ºC e, em seguida, a solução foi aquecida até ferver em uma chapa de
aquecimento com agitação magnética. A solução foi então resfriada em banho de água à
temperatura ambiente e nela permaneceu sob agitação lenta durante uma noite. O volume
foi completado até 100 mL com tampão citrato.
Para a determinação da atividade xilanásica, 1,8 mL de uma solução de xilana a
1% (m/v) em tampão citrato foram inicialmente incubados a 50ºC. Após a estabilização
da temperatura, 0,2 mL da solução enzimática foi adicionado ao meio em diluição
apropriada. Após 5 minutos, a reação foi interrompida com a adição de 3 mL de solução
de DNS, seguindo-se à determinação de ART como descrito no item 4.14. A absorvância
das amostras foi medida e comparada a uma curva de calibração baseada em padrões de
xilose com concentrações de 0,25 mg/mL a 2,0 mg/mL. Para a análise do branco e dos
padrões foram incubados 1,8 mL da solução de xilana por 30 minutos em 50ºC, seguida
de adição de 3 mL de DNS e em seguida, adicionou-se 0,2 mL de tampão para o branco
ou da solução contendo glucose para a curva e então prosseguiu-se pelo procedimento
descrito no item 4.14.
55
A atividade enzimática foi calculada com base na velocidade inicial, através da
determinação do número de unidades de xilose produzidas por minuto de reação.
4.11 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA
A atividade β-glucosidásica foi determinada através da hidrólise do p-nitrofenil-
β-D-glucosídeo. Adicionou-se 0,25 mL da solução enzimática a tubos de ensaio, em
diluições apropriadas, juntamente com 0,5 mL de uma solução tempão citrato. O meio foi
previamente incubado a 42ºC e, em seguida, adicionou-se 0,25 mL de uma solução 4
mmol/L de p-nitrofenil-β-D-glucosídeo em tampão citrato. Após 10 minutos, adicionou-se
1 mL de uma solução 1 mol/L de carbonato de sódio, interrompendo a reação por deslocar
o pH para o meio básico, onde as enzimas não apresentam mais atividade e por ser o pH
onde o p-nitrofenol exibe coloração amarela. A concentração de glucose produzida foi
determinada indiretamente pela medida da concentração de p-nitrofenol no meio
reacional, por espectroscopia na região do ultravioleta e do visível (UV-vis) a 410 nm. A
curva de calibração foi construída com soluções padrão de p-nitrofenol. A atividade
enzimática foi calculada com base na velocidade inicial, através da determinação do
número de unidades de glucose produzidas por minuto de reação.
56
4.12 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIÁSICA
A atividade celobiásica foi determinada segundo as recomendações da IUPAC
(Ghose, 1986). Alíquotas de 1 mL da solução enzimática, preparada em três diluições
diferentes com capacidade para produzir em torno de 1 mg/mL de glucose foram pré
incubadas a 50ºC e a reação foi iniciada com a adição de 1 mL de uma solução de
celobiose a 15 mmol/L em tampão citrato. Após 30 minutos, reação foi terminada com a
imersão dos tubos em água fervente por 5 minutos. Depois de resfriadas até a temperatura
ambiente, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 10000 rpm, diluídas
apropriadamente e os açúcares solúveis produzidos foram analisados por cromatografia de
troca iônica, como descrito no item 4.13.
A atividade enzimática foi calculada através da seguinte equação:
(3)
4.13 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CELOBIOIDROLÁSICA.
A atividade celobioidrolásica foi estimada através da hidrólise da Sigmacell® tipo
50 (Sigma), cujo procedimento foi realizado segundo Wood e Bhat (1988). Para este
propósito, foram utilizadas diluições com atividades equivalentes contra papel de filtro
[Glc] (mg/mL) . Edil . VT (mL)
Tempo (min) . 2 µmol glucose (0,36 mg) . VE (mL)
UCB/mL =
57
(0,27 UI/mL) para os dois complexos celulásicos. A 0,5 mL de tampão e 1 mL de
suspensão de Sigmacell a 1% (m/m), foram adicionadas alíquotas de 0,5 mL de solução
enzimática e Após 2 horas de hidrólise a 50ºC, os carboidratos liberados em solução
foram analisados por CLAE.
A atividade enzimática foi calculada através da determinação do número de
ligações glicosídicas clivadas por minuto de reação.
4.14 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi utilizada para análise dos
carboidratos produzidos em experimentos de hidrólise. Os métodos empregados foram de
troca iônica, para a análise de mono e dissacarídeos, e de permeação em gel (CPG), para a
determinação da distribuição de massas molares de substratos parcialmente hidrolisados.
As análises cromatográficas de troca iônica foram realizadas em eluição
isocrática. O sistema cromatográfico empregado foi o da Shimadzu Scientific Instruments
Inc., composto por um sistema de bombeamento de fase móvel modelo LC10AD,
amostrador automático modelo SIL10A, desgaseificador de fase móvel modelo DGU14A,
forno de aquecimento de coluna modelo CTO10A, detector de índice de refração modelo
RID10A e sistema de aquisição de dados CLASS 10. A coluna cromatográfica empregada
foi uma Aminex HPX-87H (Bio-Rad), operada a 65ºC e precedida por uma pré-coluna
Cátion-H (Bio-Rad) para remoção de cátions interferentes. A fase móvel utilizada foi
58
ácido sulfúrico 0,8 mmol/L, a uma vazão de 0,6 mL/min. Mono e dissacarídeos eluídos da
coluna foram identificados e quantificados por refratometria diferencial, através da
comparação com padrões primários de carboidratos (Figura 20).
FIGURA 20 - CROMATOGRATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DOS PADRÕES DE
CARBOIDRATOS. ORDEM CRESCENTE DE ELUIÇÃO: CELOBIOSE, GLUCOSE,
XILOSE E ARABINOSE
0,0E+00
2,0E+04
4,0E+04
6,0E+04
8,0E+04
1,0E+05
1,2E+05
1,4E+05
1,6E+05
1,8E+05
2,0E+05
4 6 8 10 12 14
Tempo de Retenção (min.)
Respo
sta do
Detector
As análises cromatográficas de permeação em gel também foram realizadas em
eluição isocrática. O sistema cromatográfico utilizado foi o mesmo descrito acima, exceto
59
pelo detector que, neste caso, foi o de espectrometria no ultravioleta (Shimazu modelo
SPD-10A). Foram utilizadas quatro colunas cromatográficas TSK Gel (7,8 x 300 mm)
dispostas em série, com limites de exclusão de 4x107, 105, 104 e 103 Da, respectivamente.
A temperatura de operação foi de 45ºC e o tetraidrofurano (THF) foi empregado como
fase móvel a uma vazão de 1,0 mL/min. A detecção foi realizada nos comprimentos de
onda de 240 nm e 254 nm. Os resultados foram calculados contra uma curva de calibração
com padrões monodispersos de poliestireno com massa molecular entre 2,5 e 8420 kDa.
4.15 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS
Os substratos utilizados foram: Sigmacell® tipo 50 (Sigma®), polpa kraft
branqueada e polpa kraft não branqueada. As polpa kraft utilizadas neste trabalho foram
uma cortesia da Klabin®.
A hidrólise enzimática de substratos celulósicos foi realizada segundo Ramos e
Fontana (2004) a uma concentração de 2 e 4% (m/v) em relação à massa seca do
substrato. Os experimentos foram conduzidos em uma incubadora com agitação orbital
sob a 150 rpm, por 48 ou 72h, dependendo do experimento. Quando se realizou o
experimento para avaliar a distribuição das massas molares no material parcialmente
hidrolisado, utilizou-se um banho Dubnoff com agitação reciprocante cuja capacidade
permitiu a acomodação de uma quantidade maior de frascos do que a incubadora com
agitação orbital. A temperatura utilizada foi de 45ºC e a liberação de açúcares durante o
60
processo hidrolítico foi monitorada por CLAE, utilizando uma coluna Aminex HPX-87H
nas condições descritas no item 4.13 (Ramos, 1992). As cargas enzimáticas utilizadas
dependeram do objetivo do tratamento enzimático.
O rendimento de hidrólise foi calculado a partir da determinação da massa total de
carboidratos solúveis produzidos. Esses valores foram convertidos nos polissacarídeos
que originaram esses carboidratos, através da multiplicação por um fator correspondente à
remoção de uma molécula de água para a formação de ligação glicosídica. O valor obtido
é comparado com a quantidade inicial de substrato adicionada e o rendimento percentual
é calculado.
4.16 ANALISE DAS POLPAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS POR GPC.
Os resíduos parcialmente hidrolisados, obtidos dos experimentos de hidrólise
enzimática, foram lavados exaustivamente com água e liofilizados. Cerca de 15 mg do
material foram então suspensos em 3 mL de sulfóxido de dimetila e depois carbamilados
através da reação com 300 µL de isocianato de fenila por 48h a 80ºC em um bloco de
aquecimento, com agitação ocasional (Ramos et al., 1993b, 1999b). A reação foi
interrompida pela adição de 10 mL de metanol:água (80:20), que ocasionou a precipitação
do derivado carbamilado. O material foi filtrado, lavado três vezes com metanol e, depois
de seco, solubilizado em tetraidrofurano para analise por cromatografia de permeação em
gel, como descrito no item 4.13.
61
O cálculo da massa molecular da celulose per-carbamilada foi procedido pelo
método de calibração universal, conforme com a equação proposta por Ramos et al.
(1993b).
(4)
Nesse cálculo foram utilizados os valores das constantes de Mark-Houwink
propostos por Valtasaari e Saarela (1975), que correspondem a αc = 0,92 e Kc= 2,01x10-5
para a celulose per-carbamilada e αp = 0,74 e Kp = 1,18x10-4 para o poliestireno, ambos
em THF. Assim, baseados na curva de calibração dos padrões de poliestireno (Figura 22),
foi possível calcular o número molecular médio (ou média aritmética das massas
moleculares, MMN) e a massa molecular média (ou média ponderada das massas
moleculares, MMM) da celulose per-carbamilada, sendo que o grau de polimerização (GP)
foi determinado pela relação de GP = MM/519, onde o denominador corresponde à massa
molecular de uma unidade de anidroglucose per-carbamilada. Por fim, a razão
MMM/MMN foi utilizada como medida da polidispersidade da polpa, que representa o
desvio padrão da distribuição em torno de seu ponto central.
(1 + αp) ln Mp + ln (Kp/Kc)
1 + αc
ln Mc =
62
FIGURA 22 - CURVA DE CALIBRAÇÃO UTILIZADA NA DETERMINAÇÃO DAS MASSAS
MOLARES DAS POLPAS CELULÓSICAS PARCIALMENTE HIDROLISADAS
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
20 22 24 26 28 30 32 34
Tempo de Eluição (min)
log (M
M)
63
4.17 ESTUDO COMPARATIVO
Todos os ensaios foram realizados para o complexo celulásicos de P.
echinulatum, juntamente com a Celluclast 1.5L FG®, que serviu como controle dos
experimentos, pois o complexo celulásico de T. reesei já foi amplamente estudado e
muito já se sabe sobre o seu modo de ação catalítica. A realização simultânea de
experimentos com os dois sistemas celulásicos permite assegurar bons critérios de de
validação analítica para os procedimentos utilizados neste projeto, além disso os
resultados foram comparados também com dados já reportados em literatura, aumentando
a base de comparação entre os dois complexos celulásicos.
64
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESCOLHA DO SISTEMA TAMPONANTE
Os tampões citrato e acetato são amplamente citados na literatura para o estudo
de celulases e a escolha do sistema tamponante a ser utilizado neste trabalho foi
determinada através da comparação da atividade celulásica nestes dois sistemas (Figura
23).
FIGURA 23 - COMPARAÇÃO DAS ATIVIDADES CONTRA PAPEL DE FILTRO DE COMPLEXOS
CELULÁSICOS DE T. reesei E P. echinulatum, DETERMINADAS EM (█) TAMPÃO
CITRATO 50 mmol/L, pH 4,8 (█) E TAMPÃO ACETATO 50 mmol/L, pH 4,8
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
T. reesei P. echinulatum
UPF
/mL
Os complexos celulásicos exibiram atividade superior quando o sistema
tamponante utilizado foi o citrato, efeito também observado anteriormente por Camassola
65
et al (2004). Além de a atividade ter sido superior em tampão citrato, esse sistema
tamponante também apresenta vantagens operacionais, já que não oferece perdas nas
temperaturas utilizadas nos ensaios (50ºC) e é de fácil preparação, uma vez que o ácido
cítrico é um sólido e sua manipulação é mais simples. Portanto, o sistema tamponante
citrato/ácido cítrico 50 mmol/L pH 4,8 foi selecionado para a utilização em todos os
experimentos realizados neste trabalho.
5.2 DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS
A determinação da concentração de proteínas nem sempre é uma tarefa simples,
pois vários fatores podem gerar erros na medida final (Zaia et al, 1998; Adney et al,
1995). Três são os principais fatores que influenciam estas medidas:
1) Cada método de dosagem de proteínas está baseado em um princípio
diferente de identificação e quantificação.
2) A presença de componentes não protéicos na solução enzimática ou no
meio reacional pode ser uma fonte de erro, caso estes interferiram com
os resultados do método quantitativo;
3) Outras proteínas não celulásicas presentes na preparação enzimática
podem comprometer a interpretação dos resultados de atividade
especifica.
66
Para tentar solucionar parte destas questões, dois métodos foram utilizados para a
determinação da concentração das proteínas, neste trabalho: o método de Lowry, que é
recomendado pela IUPAC para celulases (Ghose, 1986), e o método de Bradford
(Bradford, 1976), cuja praticidade e rapidez tem justificado o seu uso em pesquisas com
tecnologia enzimática. As proteínas foram precipitadas segundo o item 4.3 e em seguida
foram solubilizadas em tampão citrato 50 mmol/L, pH 4,8 para a determinação das
proteínas solúveis.
A Tabela 1 apresenta os valores de concentração de proteínas encontrados para os
complexos enzimáticos de P. echinulatum e T. reesei. Como esperado, a concentração de
proteínas no complexo de T. reesei foi muito superior, pois as enzimas de P. echinulatum
foram produzidas em fermentação de bancada e não foram concentradas, enquanto que a
Celluclast 1.5L FG® é um produto comercial concentrado em que são incorporados
aditivos para garantir a estabilidade de uma grande quantidade de proteína em solução.
Em geral, para uma mesma enzima, os valores determinados pelo método de
Lowry foram 2 vezes superiores aos obtidos pelo método de Bradford. Por outro lado, de
acordo com o método de Lowry, a concentração de proteínas da Celluclast 1.5L FG® foi
315 vezes superior ao de P. echinulatum, enquanto que, para o método de Bradford, esse
valor correspondeu a 404. Tais diferenças se devem ao fato de que as enzimas estudadas
apresentam estrutura primária distinta, além de diferentes graus de glicosilação. Portanto,
esses fatores refletem na resposta das proteínas do T. reesei e do P. echinulatum para cada
um dos métodos analíticos empregados neste trabalho.
67
Os dados da Tabela 1 também indicaram um menor desvio padrão relativo para o
método de Lowry, demonstrando que este procedimento apresenta maior confiabilidade
analitica.
TABELA 1 - CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS
Proteínas, mg/mL
Enzima Lowry Bradford
T. reesei 114,344 ± 1,267 60,049 ± 2,457
P. echinulatum 0,363 ± 0,003 0,149 ± 0,016
5.3 ATIVIDADE CONTRA SUBSTRATOS-MODELO
A atividade volumétrica dos dois complexos celulásicos foi medida contra os
seguintes substratos-modelo: papel de filtro (PF), carboximetilcelulose de viscosidade
média (CMC), hidroxietilcelulose (HEC), Sigmacell® tipo 50 (SIG), xilana de madeira de
vidoeiro (XMV), xilana de endoderma de aveia (XAE), p-nitrofenil-glucopiranosídio
(pNPG) e celobiose. Devido à alta concentração de proteínas existente no complexo
celulásico de T. reesei, que é um preparado industrial, a comparação direta das atividades
volumétricas não foi capaz de evidenciar quaisquer diferenças entre os sistemas, pois
todos os valores foram muito superiores para o T. reesei. A alternativa imediata para a
comparação desses dados seria a atribuição desses valores com base na concentração de
68
proteínas, ou seja, a atividade enzimática volumétrica expressa por unidade de proteína
(UI/mg) (Tabelas 2). No entanto, esta medida não está livre da influência dos fatores
listados no item anterior.
TABELA 2 - ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS ABSOLUTAS E POR UNIDADE DE PROTEÍNA
69
Celobiose
p-Nitrofenil-
glucopiranosídeo
Sigmacell ®
tipo 50
Xilana de endoderm
a de aveia
Xilana de m
adeira de vidoeiro
Hidroxietilcelulose
Carboxim
etilcelulose
Papel de filtro
Substratos
Enzim
a
17,6 ± 0,11
43,3 ± 0,40
40,40 ± 0,39
1367,1 ± 3,51
1232,88 ± 43,92
1390,3 ± 1,42
766,67 ± 6,52
110,2 ± 3,01
UI/m
L
0,15 ± 0,01
0,38 ± 0,01
0,35 ± 0,01
11,95 ± 0,14
10,80 ± 0,32
12,16 ± 0,14
6,70 ± 0,06
0,96 ± 0,03
Low
ry*
0,29 ± 0,01
0,72 ± 0,03
0,67 ± 0,01
22,76 ± 0,91
20,53 ± 0,53
23,15 ± 0,93
12,76 ± 0,11
1,83 ± 0,09
Bradford**
Atividade em
UI/m
g com base em
:
T. reesei
0,19 ± 0,01
0,31 ± 0,01
0,10 ± 0,01
3,29 ± 0,18
3,16 ± 0,07
4,68 ± 0,13
1,53 ± 0,01
0,27 ± 0,02
UI/m
L
0,52 ± 0,03
0,85 ± 0,05
0,27 ± 0,02
9,02 ± 0,50
17,02 ± 0,11
12,88 ± 0,37
4,25 ± 0,03
0,74 ± 0,05
Low
ry*
* Método de L
owry: T
. reesei = 114,34 ± 1,28 mg/m
L; P
. echinulatum = 0,363 ± 0,003 m
g/mL
** Método de B
radford: T. reesei = 60,04 ± 2,45 m
g/mL; P
. echinulatum = 0,149 ± 0,016 m
g/mL
1,28 ± 0,06
2,08 ± 0,15
0,67 ± 0,07
22,05 ± 1,10
21,07 ± 0,18
31,45 ± 2,52
10,20 ± 0,05
1,81 ± 0,07
Bradford**
Atividade em
UI/m
g com base em
:
P. ech
inulatum
70
Após a realização dos cálculos das atividades por unidade de proteína, foi
observada uma maior proximidade entre os valores obtidos para T. reesei e para P.
echinulatum e algumas comparações puderam então ser realizadas com dados disponíveis
na literatura. Com base na determinação de proteínas pelo método de Lowry, Castellanos
(1995) demonstrou que a atividade específica de uma cepa de Penicillium sp.
correspondeu a 0,35, 0,92 e 0,11 U/mg para a hidrólise do papel de filtro, pNPG e
celobiose, respectivamente, enquanto que, neste trabalho, os valores para o P.
echinulatum foram de 0,74, 0,85 e 0,52 U/mg. Portanto, o complexo de P. echinulatum
possui maior atividade contra papel de filtro e celobiose, enquanto que o Penicillium sp.
possui maior afinidade pelo pNPG. Este autor também encontrou valores de 0,32 U/mg e
0,0021 U/mg para as atividades contra papel de filtro e celobiose em uma cepa de T.
reesei produzida pela Privolzhski Fermentation Plant – PFP (Rússia), e de 0,41 U/mg e
0,037 U/mg para uma cepa de T. reesei produzida pela Genencor (CA, USA),
demonstrando a baixa atividade β-glucosidásica nos complexos enzimáticos de T. reesei
em relação às cepas do gênero Penicillium. Estes valores foram inferiores aos encontrados
neste trabalho para a Celluclast 1.5L FG®, que corresponderam a 0,96 e 0,15 U/mg,
respectivamente.
Durand (1984) demonstrou que as enzimas de Penicillium sp. apresentam
atividade β-glucosidásica 4,7 vezes superior à observada em celulases de T. reesei. Outros
autores também demonstraram resultados similares para diferentes espécies de
Penicillium (Jørgensen et al, 2005; Wyk, 1999). Os resultados obtidos neste trabalho
71
estão de acordo com os citados acima quando se conclui que a atividade β-glucosidásica é
superior em complexos celulásicos do gênero Penicillium. Porém, diferenças também
foram encontradas na relação numérica entre as atividades, ou seja, a afinidade das
enzimas pelos substratos testados não conserva a mesma proporção.
Quando os complexos celulásicos de P. echinulatum e de T. reesei foram
comparados, utilizando os dados exibidos nas Tabela 2, conclusões muito diferentes
podem ser obtidas dependendo do método de dosagem de proteínas fixado como
referência. Por exemplo, considerando-se a hidroxietilcelulose como substrato, o P.
echinulatum apresentou atividade endoglucanásica 6% maior do que T. reesei quando a
dosagem de proteínas foi feita pelo método de Lowry, mas quando esta mesma
comparação foi realizada com base no método de Bradford, a atividade do P. echinulatum
apresentou-se 34% superior. Portanto, para poder comparar as respectivas atividades
volumétricas, todos os valores foram indexados em relação à atividade contra papel de
filtro, que representa a atividade celulásica total (Tabela 3).
72
TABELA 3 - ATIVIDADES VOLUMÉTRICAS EM RELAÇÃO A ATIVIDADE CONTRA PAPEL DE
FILTRO
Enzima P. echinulatum T. reesei
Razão
P. echinulatum /
T. reesei
PF/PF 1 1 1
CMC/PF 5,68 6,97 0,81
HEC/PF 17,34 12,64 1,37
SIG/PF 0,37 0,37 1
XMV/PF 11,69 11,20 1,04
XEA/PF 12,17 12,43 0,98
pNPG/PF 1,14 0,39 2,92
Celobiase/PF 0,69 0,16 4,31
Os dados apresentados na Tabela 3 têm como destaque a atividade β-
glucosidásica contra celobiose e pNPG. A atividade celobiásica do P. echinulatum foi
4,31 vezes maior do que a determinada para ao T. reesei, enquanto que a atividade contra
o pNPG apresentou uma diferença menor, de 2,92 vezes. O pNPG é um substrato
específico para β-glucosidases e, por esta razão, era esperado que fosse hidrolisado em
maior quantidade do que a celobiose, pois o p-nitrofenol é um bom grupo abandonador e
a enzima não precisa ser especifica para ligações β-(1→4) para conseguir hidrolisar este
73
substrato, enquanto que a celobiose é um substrato mais estável e será somente
hidrolisada por enzimas que apresentem esta especificidade. Jørgensen et al (2005)
encontrou uma razão pNPG/PF de 0,4 para o T. reesei contido na Celluclast FG 1.5L®
(Novozymes) e valores de 4,1, 1,9 e 7,6 para três diferentes espécies de Penicillium (P.
pinophilum, P. persicinum e P. brasilianum, respectivamente). O razão pNPG/PF para o
P. echinulatum foi de 1,14. Portanto, o P. echinulatum apresentou uma razão pNPG/PF
mais baixa do que todos os outros complexos celulásicos de Penicillium relatados por
estes autores, mas ainda assim é superior a razão encontrada para a Celluclast 1.5L FG®
de T. reesei.
As atividades contra xilanas de madeira de vidoeiro e de endoderma de aveia
foram equivalentes para os dois complexos celulásicos. No entanto, as enzimas de T.
reesei apresentaram maior atividade contra CMC, enquanto que o complexo de P.
echinulatum apresentou maior atividade contra HEC. Ambos os substratos são indicados
como modelo para se avaliar a atividade endoglucanásica, mas suas diferentes
propriedades estruturais podem interferir na ação das enzimas, gerando comportamentos
distintos. Estas interferências podem ser parcialmente atribuídas ao tipo de substituinte
ligado à cadeia de celulose, hidroxietílico ou carboximetílico. No entanto, a interpretação
destes resultados experimentais não constitui o objetivo deste trabalho, porque exigiria o
isolamento e a purificação de cada uma das principais endoglucanases presentes nos
complexos enzimáticos envolvidos neste estudo.
74
A atividade contra Sigmacell® tipo 50 (celulose microcristalina) também foi
determinada porque este substrato apresenta alta organização estrutural, baixo grau de
polimerização e grande disponibilidade de grupos terminais redutores e não redutores, o
que já o caracteriza como substrato ideal para avaliação da atividade celobioidrolásica.
Surpreendentemente, a atividade contra esse substrato, considerando-se a quantidade de
ligações glicosídicas hidrolisadas, foi equivalente para os dois complexos celulásicos aqui
estudados. Porém, a análise dos carboidratos solúveis produzidos durante a hidrólise
(Figura 24) mostra que as β-glucosidases do P. echinulatum podem ter sido as grandes
responsáveis por este resultado, pois, ao converterem uma grande quantidade de celobiose
em glucose, causaram um aumento considerável do poder redutor do meio reacional. A
prova disso é que, para o complexo celulásico de P. echinulatum, a concentração de
glucose nos hidrolisados foi superior à concentração deste carboidrato nos hidrolisados de
T. reesei. Na tentativa de refinar o estudo comparativo entre as atividades dos complexos
celulásicos de P. echinulatum e de T. reesei contra Sigmacell® tipo 50, foi utilizado como
referência o modelo do T. reesei, onde a razão molar entre a celobiose/glucose foi de
0,76. Ao simular o produto de hidrólise de P. echinulatum para uma razão molar
celobiose/glucose de 0,76, a atividade volumétrica relativa do complexo celulásico
(SIG/PF) foi reduzida para 0,28, demonstrando que o complexo celulásico de T. reesei
definitivamente possui uma atividade celobioidrolásica maior.
75
FIGURA 24 - QUANTIDADE DE CELOBIOSE (█), GLUCOSE (█), CELOBIOSE + GLUCOSE (█) E
RAZÃO CELOBIOSE/GLUCOSE (█) NOS HIDROLISADOS PRODUZIDOS PELO (A)
P. echinulatum, (B) T. reesei E (C) P. echinulatum CORRIGIDO PARA A MESMA
RAZÃO MOLAR CELOBIOSE/GLUCOSE APRESENTADA NOS HIDROLISADOS DE
T. reesei
0,000,501,001,502,002,503,003,50
T.r. P.e. P.e. corrigido
Carbo
idrato (mmol)
O maior título de atividade β-glucosidásica em P. echinulatum também foi
caracterizado pela análise cromatográfica dos hidrolisados produzidos pela ação
enzimática sobre o papel de filtro.
76
FIGURA 25 - PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) NOS HIDROLISADOS DO
PAPEL DE FILTRO
0%
20%
40%
60%
80%
100%
P. echinulatum T. reesei
Carbo
idrato (%
)
A Figura 25 demonstra que o P. echinulatum produziu, após uma hora de
hidrólise, 57% de açúcares redutores na forma de glucose e 43% na forma de celobiose,
enquanto que o T. reesei produziu apenas 27% de glucose e 73% de celobiose sob as
mesmas condições experimentais. Esta observação reitera o fato de que as enzimas de P.
echinulatum possuem maior atividade β-glucosidásica que as de T. reesei (Celluclast 1.5L
FG®).
77
5.4 HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS CELULÓSICOS
Vários experimentos de hidrólise foram realizados para comparar a capacidade
dos complexos celulásicos de P. echinulatum e T. reesei em sacarificar substratos
celulósicos. No primeiro experimento, foi selecionada uma polpa branqueada obtida pelo
processo kraft por ser este um substrato de baixo grau de organização estrutural e,
conseqüentemente, mais susceptível à hidrolise enzimática. O experimento foi realizado
utilizando-se polpas em uma suspensão a 4% (m/v) e com uma carga enzimática de 15
UPF/g de substrato para o P. echinulatum e de 11 UPF/g substrato para o T. reesei (Figura
26).
78
FIGURA 26 - HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA POR CELULASES DE P.
echinulatum (□) E DE T. reesei (○) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11 UPF/g
DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%
)
O rendimento de hidrólise com celulases de P. echinulatum foi
consideravelmente superior (aproximadamente 12% após 72h de hidrólise), produzindo
maior quantidade de açúcares durante o processo. No entanto essa diferença foi
provavelmente devida à carga enzimática utilizada para cada um dos experimentos, pois o
sistema com P. echinulatum apresentou 4 UPF/g de substrato a mais do que aquele que
empregou celulases de T. reesei. Por outro lado, o P. echinulatum possui uma maior
79
quantidade de β-glucosidases que, ao converterem celobiose em glucose, diminuem a
repressão catabólica do meio reacional, particularmente sobre as exoglucanases. As
Figuras 27 e 28 apresentam a variação da quantidade de glucose e celobiose durante a
hidrólise de polpa kraft deslignificada. Os hidrolisados de P. echinulatum foram
compostos majoritariamente por glucose e os de T. reesei apresentaram uma quantidade
considerável de celobiose. Portanto, a soma da quantidade dos dois açúcares (em unidades
de massa) teve pouca influência sobre o rendimento final de hidrólise com celulases de P.
echinulatum, mas para o T. reesei, o cômputo da celobiose como produto de reação foi
muito mais significativo.
80
FIGURA 27 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE
11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT
BRANQUEADA
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Carbo
idrato (g)
81
FIGURA 28 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE
DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT
BRANQUEADA
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Carbo
idrato (g
)
Uma polpa não branqueada obtida pelo processo kraft, contendo cerca de 5% de
lignina residual, também foi hidrolisada sob as mesmas condições empregadas no
experimento anterior (Figura 29). Com a utilização deste substrato, foi possível avaliar o
efeito da lignina sobre o comportamento das enzimas durante a hidrólise. O P.
echinulatum apresentou, novamente, o maior rendimento, mas a diferença entre os
rendimentos caiu para aproximadamente 10%, enquanto que na hidrólise da polpa
82
branqueada, o P. echinulatum apresentou conversão 15% superior ao T. reesei em 48 h de
hidrólise. Este resultado indica uma provável influência da lignina sobre o
comportamento das enzimas presentes no complexo de P. echinulatum, uma vez que
houve uma redução na diferença entre os rendimentos quando o substrato utilizado
continha lignina.
FIGURA 29 - HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT NÃO BRANQUEADA POR CELULASES DE P.
echinulatum (■) E DE T. reesei (●) A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE 15 E 11 UPF/g
DE SUBSTRATO, RESPECTIVAMENTE
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%)
83
A variação da quantidade de glucose e celobiose também foi acompanhada
durante a hidrólise da polpa kraft não branqueada (Figuras 30 e 31), para que se pudesse
inferir alguma conclusão sobre o efeito da lignina sobre as β-glucosidases. O
comportamento do P. echinulatum foi semelhante à hidrólise da polpa branqueada, mas o
T. reesei apresentou uma porcentagem de celobiose maior do que na hidrólise anterior,
indicando uma possível inativação das β-glucosidases por influência da lignina.
FIGURA 30 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (□), CELOBIOSE (○) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei COM ATIVIDADE DE
11 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT NÃO
BRANQUEADA A 4% (m/v)
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Carbo
idrato (g)
84
FIGURA 31 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (■), CELOBIOSE (●) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum COM ATIVIDADE
DE 15 UPF/g DE SUBSTRATO SECO DURANTE A HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT
NÃO BRANQUEADA A 4% (m/v)
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (h)
Carbo
idrato (g
)
A Figura 32 compara a porcentagem de glucose e celobiose produzidas durante a
hidrólise de polpas kraft branqueadas e não branqueadas pelos dois complexos
celulásicos. O P. echinulatum apresentou um pequeno decréscimo na produção de glucose
durante a hidrólise da polpa kraft não branqueada, quando comparada com a polpa kraft
branqueada. Já o T. reesei apresentou uma diferença maior entre as duas hidrólises,
principalmente a partir de 11 horas de reação, quando há um aumento na taxa de produção
85
de glucose durante a hidrólise da polpa kraft branqueada que não é detectado durante a
hidrólise da polpa kraft não branqueada. Por interação hidrofóbica, as enzimas podem
adsorver na lignina, resultando na redução da atividade celulásica. Foi relatado que as β-
glucosidases adsorvem fortemente na lignina e esse fato pode ser observado
principalmente no caso da hidrólise realizada com as enzimas de T. reesei. Breuil et al
(1992) demonstraram que a influência das β-glucosidases no ensaio de atividade contra
papel de filtro é baixa, pois a sua cinética é lenta e o experimento dura apenas 1 h, mas
quando se avalia seu efeito em experimentos mais longos como a sacarificação da
celulose, estas enzimas exercem grande influência no rendimento final, pois sua ação é
efetiva em experimentos de longa duração. Esse fato pode ser observado também na
Figura 32, pois a proporção entre glucose e celobiose aumenta em favor de glucose ao
longo do experimento.
Como houve uma aproximação entre os rendimentos de hidrólise dos dois
complexos celulásicos e apenas o T. reesei apresentou redução na atividade β-
glucosidásica, é provável que outras enzimas (celobioidrolases e endoglucanases) do
complexo celulásicos de P. echinulatum tenham sido parcialmente adsorvidas na lignina
residual.
86
FIGURA 32 - PORCENTAGEM DE GLUCOSE ( █ ) E CELOBIOSE ( █ ) PRODUZIDAS DURANTE
A HIDRÓLISE DE POLPA KRAFT BRANQUEADA (A) E NÃO BRANQUEADA (B)
PELO T. reesei E HIDRÓLISE DE POLPAS KRAFT BRANQUEADA (C) E NÃO
BRANQUEADA (D) PELO P. echinulatum
0%
25%
50%
75%
100%
6 11 25 48
Tempo (h)
% G
luco
se/C
elob
iose
0%
25%
50%
75%
100%
6 11 25 48
Tempo (h)
0%
25%
50%
75%
100%
6 11 25 48
Tempo (h)
% G
luco
se/C
elob
iose
0%
25%
50%
75%
100%
6 11 25 48
Tempo (h)
A B
C D
87
5.5 ADIÇÃO DE β-GLUCOSIDASE
Experimentos de hidrólise também foram realizados para comparar a capacidade
dos complexos celulásicos de P. echinulatum e T. reesei em sacarificar substratos
celulósicos sob as mesmas condições de inibição retroativa ou repressão catabólica.
Foram utilizados como substratos uma polpa branqueada obtida pelo processo kraft, por
ser este um substrato de baixo grau de organização estrutural e, conseqüentemente, mais
susceptível à hidrolise enzimática, e a Sigmacell® tipo 50, que corresponde a um substrato
de maior índice de cristalinidade (CrI) (Medve, 1997). Os experimentos foram realizados
em suspensão do substrato a 2% (m/v) e, para igualar a atividade β-glucosidásica nos dois
complexos celulásicos, a Celluclast 1.5L FG® foi suplementada com β-glucosidases
comerciais de A. niger (Novozym 188®, Novozymes).
A Figura 33 apresenta a hidrólise da polpa kraft branqueada e da Sigmacell ® tipo
50 pelo P. echinulatum. A carga enzimática empregada foi de 5,5 UPF/g e de 6,3 UβG/g
em relação ao substrato seco, sem suplementação de β-glucosidases.
88
FIGURA 33 - HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (○) E DA SIGMACELL® TIPO 50 (□)
PELO P. echinulatum A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 5,5 UPF/g E DE 6,3 UΒG/g EM
RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%)
O complexo celulásico de P. echinulatum apresentou maior rendimento de
hidrólise quando a polpa kraft branqueada foi utilizada, uma vez que este substrato possui
menor organização estrutural, permitindo maior acessibilidade das enzimas às ligações
glicosídicas.
As Figuras 34 e 35 apresentam a variação na quantidade de glucose e celobiose
produzidas no meio reacional durante a hidrólise. Foi, portanto, demonstrado que a
89
quantidade de β-glucosidases presentes no complexo celulásico de P. echinulatum é
suficiente para remover toda a celobiose presente no meio reacional, permitindo que as
celulases trabalhassem sem os efeitos inibitórios desse carboidrato.
FIGURA 34 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆), PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A
HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Carbo
idrato (g
)
90
FIGURA 35 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (○), CELOBIOSE (□) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (∆) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO P. echinulatum, DURANTE A
HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 A 2% (m/v)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Carbo
idrato (g
)
As enzimas de T. reesei suplementadas com β-glucosidases apresentaram um
comportamento semelhante, quando hidrolisaram estes substratos a uma carga enzimática
de 11,5 UPF/g e 13,2 UβG/g de substrato seco (Figura 36).
91
FIGURA 36 - HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA (●) E DA SIGMACELL® TIPO 50 (■)
PELO T. reesei, A UM CARGA ENZIMÁTICA DE 11,5 UPF/g E DE 13,2 UΒG/g EM
RELAÇÃO AO SUBSTRATO SECO
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%)
As curvas de produção de glucose e celobiose, para os experimentos onde foi
utilizado o complexo celulásico de T. reesei suplementado com β-glucosidases, estão
apresentados nas Figuras 37 e 38. Estes dados demonstraram que os níveis de β-
glucosidase adicionados foram suficientes para remover praticamente toda a celobiose do
meio reacional.
92
FIGURA 37 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A
HIDRÓLISE DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Carbo
idrato (g
)
93
FIGURA 38 - QUANTIDADE LIBERADA DE GLUCOSE (●), CELOBIOSE (■) E GLUCOSE +
CELOBIOSE (▲) PELO COMPLEXO ENZIMÁTICO T. reesei, DURANTE A
HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 A 2% (m/v)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Carbo
idrato (g)
Após a avaliação da eficiência com que cada complexo celulásico hidrolisou os
substratos testados, foram realizados experimentos onde o desempenho das enzimas foi
comparado frente à hidrólise de um mesmo substrato.
A Figura 39 apresenta a hidrólise da Sigmacell® tipo 50 pelo complexo celulásico
de P. echinulatum e pelas celulases de T. reesei suplementadas com Novozym 188®, a
uma carga enzimática de 10 UPF/g e 11,4 UβG/g em relação ao substrato seco.
94
FIGURA 39 - HIDRÓLISE DA SIGMACELL® TIPO 50 EM CONCENTRAÇÃO DE 2%(m/v) POR P.
echinulatum (■) E T. reesei + NOVOZYM 188® (●), A UMA CARGA ENZIMÁTICA DE
10 UPF/g E 11,5 UΒG/g DE SUBSTRATO SECO
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%)
Os dois complexos apresentaram um comportamento semelhante durante o
experimento, mas o rendimento de hidrólise foi mais alto para o complexo celulásico de
T. reesei ao longo de toda a curva. Como as atividades β-glucosidásica e celulásica total
foram equivalentes para os dois complexos celulásicos, este experimento permitiu
verificar, ainda que indiretamente, a influência das celobioidrolases no processo.
95
5.6 ESTABILIDADE DAS ENZIMAS
A estabilidade dos complexos celulásicos à agitação (150 rpm), na temperatura de
45ºC, foi acompanhada nas mesmas condições de hidrólise, sem a presença de substrato
no meio, para se avaliar o comportamento das enzimas quanto a estabilidade à agitação e
temperatura. Foram retiradas alíquotas em diferentes intervalos de tempo e estas tiveram
seu potencial hidrolítico testado contra papel de filtro e pNPG, além de ter sido dosada a
concentração de proteínas.
FIGURA 40 - VARIAÇÃO DOS ART PRODUZIDOS NA HIDRÓLISE DO PAPEL DE FILTRO POR
P. echinulatum (■) E T. reesei (●) EM CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS DE HIDRÓLISE
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
[ART]
/mL
96
FIGURA 41 - VARIAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA CONTRA pNPG DAS ENZIMAS
DE P. echinulatum (■) E T. reesei (●)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
pNPG
(mmol/m
L)
A produção de ART na hidrólise do papel de filtro e a atividade contra pNPG
acompanhadas durante o período de hidrólise estão apresentados nas Figuras 40 e 41.
Não foi possível calcular a atividade contra papel de filtro com precisão porque a
concentração das enzimas foi inferior à mínima necessária para que o cálculo
recomendado pela IUPAC fosse realizado. Por essa razão, a [ART] (definir) produzida
durante a hidrólise do papel de filtro foi utilizada para a construção do perfil de
estabilidade das enzimas durante o processo de hidrólise. A [ART] apresentou uma
97
variação semelhante para os dois complexos celulásicos. Houve uma grande queda até
24h que, posteriormente, passou a ser constante. A atividade contra pNPG apresentou o
mesmo perfil para os dois complexos, mas com valores superiores para o P. echinulatum,
com uma queda em 24h e um ascensão em 48h, até recuperação de quase 100% da
atividade inicial. Essa queda em 24h também foi observada na concentração de proteínas
(Figura 42). (reescrever)
FIGURA 42 - VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DURANTE O EXPERIMENTO
DE HIDRÓLISE. (◊) T. reesei SUPLEMENTADO COM β-GLUCOSIDASES
EXÓGENAS E (■) P. echinulatum
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Proteína
s (m
g/mL)
98
5.7 ESTUDOS DE ADSORÇÃO
Foram realizados estudos de adsorção das enzimas ao substrato, comparando três
sistemas enzimáticos: P. echinulatum, T. reesei e T. reesei + β-glucosidase (Novozym
188®). As alíquotas foram retiradas do meio durante a hidrólise de uma polpa kraft
branqueada e as proteínas foram medidas, sem nenhuma etapa de purificação prévia, pelo
método de Bradford (1976), já que este método não sofre qualquer interferência dos
açúcares redutores presentes no meio reacional (Zaia et al, 1998). Estes resultados estão
apresentados na Figura 43.
99
FIGURA 43 - PERCENTAGEM DAS PROTEÍNAS REMANESCENTES NO MEIO REACIONAL
DURANTE A HIDRÓLISE A 2% (m/v) DA POLPA KRAFT BRANQUEADA. T. reesei
(□), P. echinulatum (▲) E T. reesei + β-GLUCOSIDASE (■)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Tempo (h)
Proteina
s (%
)
Os complexos celulásicos de P. echinulatum e de T. reesei apresentaram o mesmo
perfil de adsorção onde, após 12 h de hidrólise, 25% das proteínas contidas no meio
reacional adsorveram ao substrato, enquanto que o meio reacional com celulases de T.
reesei suplementadas com β-glucosidases exógenas apresentou uma adsorção de 50% das
proteínas contidas no meio reacional. Através de cálculos relacionados à quantidade de β-
glucosidases adicionadas no sistema, foi possível observar que a quantidade de proteínas
100
adsorvidas correspondeu à somatória das proteínas presentes no complexo celulásico de
T. reesei puro com aquelas adicionadas ao meio na forma de β-glucosidases. Portanto, é
provável que a diferença observada na Figura 43 corresponda unicamente ao suplemento
de β-glucosidases que, de alguma forma, permaneceu adsorvido no substrato.
5.8 AVALIAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS MASSAS MOLARES
Um experimento foi realizado com a mesma polpa kraft branqueada empregada
nos experimentos anteriores com a intenção de se avaliar o efeito dos complexos
celulásicos sobre a distribuição das massas molares do material parcialmente hidrolisado
e, devido a necessidade de se utilizar um grande número de frascos, este experimento foi
realizado em um banho Dubnof com agitação reciprocante. A hidrólise do substrato foi
realizada a 2% (m/v) com atividade celulásica total ajustada em 10 UPF/g em relação ao
substrato seco. No entanto, a atividade β-glucosidásica variou em cada procedimento de
hidrólise, sendo de 3,9 UβG/g para Celluclast 1.5L FG® (T. reesei) e de 11,4 UβG/g para
as enzimas de P. echinulatum e de Celluclast 1.5L FG® (T. reesei) suplementada com
Novozym 188® (Figura 44).
101
FIGURA 44 - SACARIFICAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA A 2% (m/v) POR
CELULASES DE P. echinulatum (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (▲), T. reesei (10 UPF/g E 3,9
UβG/g) (■) E T. reesei + NOVOZYM 188® (10 UPF/g E 11,4 UβG/g) (♦)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Tempo (h)
Ren
dimen
to (%)
As curvas de hidrólise produzidas pelo P. echinulatum e por Celluclast 1.5L FG®
(T. reesei) foram semelhantes, embora o P. echinulatum tenha apresentado uma eficiência
um pouco superior. Porém, quando foram adicionadas β-glucosidases exógenas às
celulases de T. reesei, o rendimento de hidrólise superou os resultados apresentados pelo
P. echinulatum. Isso pode ser atribuído ao fato de que as enzimas de T. reesei atuam sob
condições inibitórias, já que possuem um sistema endo-exo de alta eficiência e não
102
contam com a presença de β-glucosidases em quantidade suficiente para remover toda a
celobiose gerada. Portanto, como observado anteriormente, a adição de β-glucosidases
aperfeiçoou o sistema celulásico de T. reesei.
Polpas kraft branqueadas parcialmente hidrolisadas, recuperadas nos tempos de 2,
10, 24 e 48 h de reação, foram lavadas exaustivamente com água e, então, carbamiladas
segundo o procedimento descrito por Ramos (1993b, 1999) (vide item 4,16) para a
posterior análise por GPC (vide item 4,13). A Tabela 4 apresenta os rendimentos de
hidrólise e a variação do grau de polimerização observados durante experimentos em que
foram empregadas enzimas de P. echinulatum, T. reesei (Celluclast 1.5L FG®) e T. reesei
suplementada com β-glucosidases de A. niger (Celluclast 1.5L FG® + Novozym 188®).
103
TABELA 4 - RENDIMENTO DE HIDRÓLISE E EFEITO DOS COMPLEXOS CELULÁSICOS
SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA
Tempo (h) Rendimento (%) GPM GPN GPM/GPN
controle - 739 152 4,86
P. echinulatum *
2 14,16 987 142 6,95
10 29,26 1013 134 7,56
24 43,94 928 143 6,49
48 46,81 1000 199 5,03
T. reesei (Celluclast 1.5 L FG®) **
2 7,95 964 140 6,89
10 20,16 945 128 7,38
24 32,15 916 148 6,19
48 42,60 948 189 5,02
T. reesei (Celluclast 1.5 L FG®) + Novozym 188® ***
2 12,48 943 143 6,59
10 32,04 973 145 6,71
24 46,71 1005 203 4,95
48 64,77 925 154 6,01
*** Suspensão a 2 % (m/v) e atividade de 10 UPF/g e 11,4 UβG/g de substrato seco
*** Suspensão a 2 % (m/v) e atividade de 10 UPF/g e 3,9 UβG/g de substrato seco
*** Suspensão a 2 % (m/v) e atividade de 10 UPF/g e 11,4 UβG/g de substrato seco
Os complexos celulásicos estudados (P. echinulatum, T. reesei e T. reesei
suplementada com β-glucosidases exógenas) não só apresentaram o mesmo efeito sobre o
104
grau de polimerização (GP) da polpa kraft branqueada, como também ocasionaram uma
variação equivalente no perfil cromatográfico que descreve a sua distribuição em massas
moleculares. Por conseguinte, a polidispersidade da polpa também variou de forma
equivalente nos três experimentos de hidrólise (Figuras 45, 46 e 47).
Foi observado que, depois de apenas 2h de hidrólise, houve um rápido consumo do
ombro da distribuição que correspondia à população de macromoléculas de menor massa
molar. Estes componentes, presentes em quantidade apreciável na polpa original, podem
ser atribuídos às hemiceluloses e oligômeros de celulose que foram formados durante as
etapas de polpação e branqueamento da polpa e que, provavelmente, se encontravam
dispersos na superfície das fibras. Tal hipótese justificaria a sua rápida sacarificação pela
ação sinérgica das celulases de P. echinulatum e T. reesei, com a subseqüente liberação
de açúcares redutores no meio reacional. É importante ressaltar que os cromatogramas
apresentados nas Figuras 45, 46 e 47 foram normalizados em relação à área; portanto, o
aumento aparente da contribuição de componentes de maior massa molar à distribuição
foi interpretado como sendo um artifício gerado pela forma como os dados
cromatográficos foram apresentados.
Em suma, a determinação do efeito da hidrólise enzimática sobre o GP da celulose
demonstrou que os dois complexos celulásicos exerceram suas atividades hidrolíticas
sobre o substrato de forma semelhante, através de um mecanismo de “peeling-off” em que
a sacarificação é realizada de forma progressiva e sinérgica, removendo camadas de
105
celulose da superfície do substrato sem permitir o acúmulo de oligômeros de massa molar
intermediária.
FIGURA 45 - INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE P. echinulatum SOBRE O GRAU DE
POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA
CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E
48H (─)
102 103 104 105 106 107 108-5,0x106
0,05,0x106
1,0x107
1,5x107
2,0x107
2,5x107
3,0x107
A (2
40 nm)
Massa Molecular
106
FIGURA 46 - INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SOBRE O GRAU DE
POLIMERIZAÇÃO DA POLPA KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA
DE 2% (m/v). POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─)
102 103 104 105 106 107 108-5,0x106
0,05,0x106
1,0x107
1,5x107
2,0x107
2,5x107
3,0x107
A (2
40 nm)
Massa Molecular
107
FIGURA 47 - INFLUÊNCIA DO COMPLEXO CELULÁSICO DE T. reesei SUPLEMENTADO COM
Β-GLUCOSIDASES EXÓGENAS SOBRE O GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA POLPA
KRAFT BRANQUEADA, HIDROLISADA A UMA CONSISTÊNCIA DE 2% (m/v).
POLPA ORIGINAL (─), 2H (─), 10H (─), 24H (─) E 48H (─)
102 103 104 105 106 107 108-5,0x106
0,05,0x106
1,0x107
1,5x107
2,0x107
2,5x107
3,0x107
A (2
40nm
)
Massa Molecular
108
6 CONCLUSÃO
O complexo enzimático de P. echinulatum apresentou uma quantidade de β-
glucosidases superior ao de T. reesei. Este fato demonstra a sua potencialidade em
processos onde a sacarificação total da celulose seja desejada, pois a manutenção da
celobiose em baixos níveis evita o efeito inibitório desta sobre as celulases. Por outro
lado, a atividade xilanásica dos dois complexos foi semelhante para os dois substratos
testados (XEA e XMV).
As diferenças estruturais dos derivados solúveis de celulose, CMC e HEC,
influenciaram na determinação da atividade endoglucanásica dos complexos celulásicos.
As enzimas de T. reesei apresentaram atividade superior contra CMC, enquanto que o
complexo de P. echinulatum apresentou maior atividade contra HEC. As razões desta
discrepância ainda deverão ser elucidadas. A atividade contra Sigmacell® tipo 50 também
foi equivalente para os dois complexos celulásicos, mas a análise dos carboidratos
solúveis produzidos durante a hidrólise indicou que, para uma mesma razão
celobiose/glucose, o complexo celulásico de T. reesei possui atividade celobioidrolásica
superior.
No estudo da hidrólise de substratos celulósicos, verificou-se que ambos os
complexos celulásicos hidrolisaram a polpa kraft em maior extensão por ser este um
substrato de menor organização estrutural, enquanto a celulose microcristalina
(Sigmacell® tipo 50) foi hidrolisada em menor extensão.
109
O complexo celulásico de P. echinulatum mostrou-se mais eficiente do que o
complexo celulásico de T. reesei, sendo capaz de alcançar maiores rendimentos quando
utilizada a mesma atividade celulásica total inicial para os dois sistemas. No entanto,
quando o complexo de T. reesei foi suplementado com β-glucosidases exógenas, a sua
eficiência foi superior ao P. echinulatum, pois passou a constituir um complexo celulásico
mais completo. Apesar disto, nossos resultados demonstraram que o complexo celulásico
de P. echinulatum representa uma alternativa à sacarificação da celulose por não
necessitar de suplementação para alcançar um bom desempenho.
Finalmente, a investigação do efeito das enzimas de P. echinulatum e de T. reesei
sobre o grau de polimerização de uma polpa kraft branqueada permitiu concluir que os
dois complexos celulásicos apresentam praticamente o mesmo modo de ação catalítico,
agindo no substrato através da remoção progressiva de camadas de celulose dispostas na
superfície, e que a presença de β-glucosidades no meio reacional aumenta a eficiência de
hidrólise, mas não altera o sinergismo endo-exo que caracteriza o modo de ação destas
enzimas.
110
7 TRABALHOS FUTUROS
Além dos resultados incorporados neste trabalho, novos experimentos serão
realizados para melhor caracterizar o complexo celulásico de P. echinulatum. Estes
experimentos incluem a investigação de seu perfil de hidrólise contra substratos-modelo
ainda não testados, como glucomananas, xiloglucanas, celulose amorfa e celulose
bacteriana, além de uma investigação mais aprofundada sobre a atividade
endoglucanásica contra carboximetilcelulose e hidroxietilcelulose. Novos experimentos
de sacarificação também serão importantes para ampliar o leque de informações obtido
sobre o modo de ação e eficiência catalítica das enzimas. Finalmente, estudos
cromatográficos e eletroforéticos sobre as proteínas constituintes dos complexos
celulásicos de P. echinulatum deverão ser realizados, em parceria com instituto finlandês
VTT Biotechnology (Espoo, Finlândia), para caracterizar os componentes enzimáticos do
complexo (endoglucanases, celobioidrolases e β-glucosidases) e eventualmente isolá-los
para a condução de ensaios de atividade específica.
111
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