Caracterização molecular da via de modificação pós ...livros01.livrosgratis.com.br/cp076004.pdf · de Lucca e Prof. Dr. João Atílio Jorge, pela disponibilidade em participar

Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Departamento de Bioquímica e Imunologia

Caracterização molecular da via de modificação pós -

traducional de proteínas dependente de SUMO em

Schistosoma mansoni

Fernanda Janku Cabral

Tese de Doutorado apresentada ao Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP, para obtenção do título de Doutor em Ciências, área de concentração: Bioquímica

Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues

Ribeirão Preto 2007

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Cabral, Fernanda Janku Caracterização molecular da via de modificação pós - traducional de proteínas dependente de SUMO em Schistosoma mansoni. Ribeirão Preto, 2007. 154p., il., 30cm. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP- Departamento de Bioquímica e Imunologia. Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues

1. Schistosoma mansoni, 2. Modificação pós-traducional, 3. SUMO, 4. RT-PCR

Dedico este trabalho aos meus queridos pais Heloisa e Sebastião Cabral, por todo o amor, apoio e incentivo. À minha irmã Heloísa Maria, minha melhor amiga e a minha sobrinha Maria Luísa. Minha vida, nossas vidas formam um só diamante.

(Carlos Drummond de Andrade)

Agradecimentos

À Universidade de São Paulo, pela formação científica, desde a graduação em Química até o meu Doutoramento em Bioquímica. Ao Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues, pela orientação, pela oportunidade de fazer a pós-graduação estudando Schistosoma mansoni e SUMO em seu laboratório, por todos os ensinamentos recebidos durantes todos esses anos e pela amizade. Muito Obrigada. À Profa. Dra. Renata Guerra de Sá, pela co-orientação, por todo o treinamento em Biologia Molecular, e também por me encaminhar pelo estudo da via de Sumorilação como sendo um ponto interessante no desenvolvimento do parasita e pela amizade. Aos membros da banca examinadora: Prof. Dr. Marcelo D. Gomes, Prof. Dr. Luis Ricardo O. Tosi, Profa. Dra. Gloria R. Franco e Prof. Dr. Franklin D. Rumjanek, pela disponibilidade e sugestões que contribuíram muito para este trabalho. Aos professores do Departamento de Bioquímica e Imunologia, por todos os ensinamentos de Bioquímica recebidos, em especial ao Prof. Dr. Wilson Lodi, por suas observações sobre os meus resultados no exame de qualificação. Ao Prof. Dr. Fernando de Lucca e Prof. Dr. João Atílio Jorge, pela disponibilidade em participar da minha banca de qualificação. A Profa. Dra. Isis do Carmo Kettelhut, e a todos do seu laboratório, pela atenção e apoio todas as vezes que precisei. Ao Prof. Dr. Celso Rodrigues Franci, e a todos do seu laboratório, em especial Cláudia Caligioni, Fernanda Lima e Bruno Del Bianco Borges, pela oportunidade de trabalhar em colaboração no Laboratório de Neuroendocrinologia no Departamento de Fisiologia desta faculdade. À Profa. Dra. Isabel Miranda Santos, pelo apoio sempre que precisei e pelo incentivo. Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em especial aos funcionários da secretaria, Ivone, Lúcia, Ronaldo e Teia, por todo o apoio técnico recebido e pela amizade. À Olinda Mara Brigato, pela manutenção do ciclo biológico do S.mansoni. À Elenice Aparecida Macedo, pelo apoio técnico laboratorial. E também agradeço pela amizade atenção e disponibilidade. Ao Matheus Gomes, por ter gentilmente cedido uma alíquota da cultura de esquistossômulos, realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Ouro Preto, para as análises de qPCR. A todos do LBBM, pela receptividade e hospitalidade, quando estive visitando o laboratório. À Tânia Defina pela disponibilidade e auxilio técnico com a máquina de Real Time PCR, presente no Departamento de Biologia Celular e Bioagentes Patogênicos, que está sob coordenação da Dra Ângela Kaysel Cruz. Aos funcionários da Documentação Científica, em especial Maria, pelo apoio técnico.

A todos que passaram pelo Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, entre 2000 a 2006, pela convivência agradável, pelos ensinamentos e amizade. Em especial Andressa Andreoli, pela possibilidade de trabalharmos juntas; onde aprendi bastante e pela amizade. Ao Olavo Pereira Jr, pela amizade e trabalho em equipe. E, William de Castro Borges, pelo privilégio de conviver com você, pelos ensinamentos e amizade. Aos atuais estudantes do Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas: Ana Carolina, Carla, Cláudia, Enyara, Érika, Lizandra e Sérgio, pelo cotidiano alegre, discontraído e pela amizade. A todos os meus amigos de todos os tempos, aos que ainda vejo e aos que não vejo mais, muitas saudades. A todos os amigos e colegas da pós-graduação. Ao William Festuccia, pela amizade e por todo o tempo de convivência agradável que deixou saudades. À Sra. Maria Odette de Araújo Cortez, diretora da Associação de Cultura Brasil-Estados Unidos, pelo apoio em todo o meu curso de Inglês, de onde sai, para ser bem sucedida no teste de proficiência em língua Inglesa. I am also glad to my American friends who helped me to advance my English, and to Paul Pearson for things I learned with you at all. Aos meus familiares, tios, tias, primos e primas (das Famílias Janku e Cabral). Aos meus Avôs paternos Adelina e José Cabral (ambos in memorian). Aos meus Avôs maternos Elvira e Josef Janku (in memorian), por todos os momentos felizes, por todo o carinho e cuidados recebidos desde a infância e ao longo da vida. À Pró-reitoria de pós-graduação, pelo auxilio concedido, para participar do VI International Wokshop on Proteasomes, Clermont-Ferrand (França) e também no Experimental Biology 2006, São Francisco (CA), EUA. A FAPESP e a bolsa do CNPq, pelo auxilio financeiro a este trabalho

Pelo sonho é que vamos, comovidos e mudos.

Chegamos? Não chegamos? Haja ou não haja frutos, pelo sonho é que vamos.

Basta a fé no que temos. Basta a esperança naquilo

que talvez não teremos. Basta que a alma demos,

com a mesma alegria, ao que desconhecemos e ao que é do dia a dia.

Chegamos? Não chegamos? - Partimos. Vamos. Somos.

(Sebastião da Gama)

________________________________________________________ Abreviaturas i

ABREVIATURAS

αP32 ATP Adenosina trifosfato radiomarcada na posição α com fósforo 32

ATP Adenosina trifosfato

BSA Albumina sérica bovina

°C Graus Celsius

CaCl2 Cloreto de Cálcio

cDNA DNA complementar

Cm Centímetros

cpm Contagem por minuto

DEPC Dietilpirocarbonato

DNA Ácido desoxiribonucléico

DNAg DNA genômico

dNTP Deoxinucleosídeo trifosfato (N=A,C,G ou T)

DO Densidade óptica

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético (sal dissódico)

g Grama(s)

HCl Ácido Clorídrico

HEPES 2-4-(2-hidroxietil)-Piperazinil-(1)-Ácido Etanosulfônico

kDa Kilodaltons - 1kDa equivale a 1000 Daltons

kb Kilobases - 1kb equilvale a 1000 bases nucleotídicas

KCl Cloreto de Potássio

________________________________________________________ Abreviaturas ii

LB Lúria Bertani - Meio de cultura bacteriano

mA Miliampère

M Mol.L-1 (Molar)

MgCl2 Cloreto de Magnésio

MgSO4 Sulfato de Magnésio

mg Miligrama

mL Mililitro(s)

mM milimolar

mm milímetro

MOPS [Ácido 3-(N-Morfolino)Propanosulfônico]

NaCl Cloreto de Sódio

NaHCO3 Bicarbonato de Sódio

Na2HPO4 Fosfato de sódio dibásico

NaOAc Acetato de Sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

ng nanograma

pb pares de base

PBS Solução salina tamponada com fosfato

RNAse A Ribonuclease A

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro

RPM Rotações por minuto

RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase Chain Reaction

qRT-PCR Quantitative Reverse Transcriptase – Polymerase Chain reaction

________________________________________________________ Abreviaturas iii

SDS Dodecilsulfato de sódio

Taq Thermos aquaticus

Tris Tris-hidroximetilaminometano

U Unidades

Xg Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional

µCi microcuries

µg micrograma

µL microlitro

µM micromolar

v/v volume/volume

V Volts

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1 1.1 O Schistosoma mansoni....................................................................................2 1.2 O ciclo de vida do S. mansoni e a patologia da esquistossomose ....................3 1.3 O genoma do S. mansoni e a necessidade da era de descoberta de genes ......................................................................................................................6 1.4 O início de um novo tempo: a era do genoma funcional .................................10 1.5 Modificação pós-traducional de proteínas.......................................................12 1.6 A proteína Ubiquitina – símile: Small Ubiquitin Modifier (SUMO) ....................15 1.7 A via de conjugação de SUMO aos seus substratos alvo: o processo de sumorilação...........................................................................................................16 1.8 A enzima E1 ativadora ou Aos1/Uba2.............................................................18 1.9 A enzima E2 conjugadora: a Ubc9 ..................................................................18 1.10 SUMO E3 ligases ..........................................................................................20 1.11 Proteases específicas de SUMO...................................................................23 1.12 As proteínas modificadas por SUMO ............................................................24 2. OBJETIVOS ......................................................................................................27 3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................29 3.1. Manutenção do ciclo biológico do S.mansoni.................................................30 3.2. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos (Wilson & Harrop, 1993) ........................................................................................................30 3.3 Anotação da via de modificação de proteínas ubiquitina-símile dependente de SUMO em S. mansoni. .................................................................32 3.4. Extração de RNA total ....................................................................................33 3.5. Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real ........................34 3.6. Quantificação de DNA e RNA ........................................................................35 3.7 Obtenção dos cDNAs para a análise da expressão dos genes que codificam para os componentes da via de sumorilação em S. mansoni ...............35 3.8. Clonagem no vetor pGENT – easy do transcrito obtido por PCR e transformação em células competentes................................................................37 3.9. Minipreparação de DNA plasmidial ................................................................37 3.10. Sequenciamento ..........................................................................................38 3.11. Análise computational das sequências ........................................................38 3.12. Análise da expressão diferencial dos genes que codificam para alguns componentes da via de sumorilação utilizando PCR quantitativo .........................39 3.13. Análise da expressão e tamanho dos trancritos utilizando Northern Blot.....40 3.14. Preparo da sonda radioativa ........................................................................41 3.15. Reação de hibridização ................................................................................42 3.16. Autoradiografia .............................................................................................43 3.17 Obtenção dos extratos totais e nucleares de parasitas adultos e cercárias e Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1...............................43

3.18. Determinação da estrutura genômica dos genes que codificam para SUMO e Ubc9 .......................................................................................................45 3.19. Extração do DNA genômico .........................................................................45 3.20. Amplificação das seqüências de SUMO a partir do DNA genômico ............46 3.21. Estimativa do número de cópias dos genes por Southern blot.....................47 4. RESULTADOS ..................................................................................................49 4.1. Análise in silico da via de sumorilação em S. mansoni. .................................50 4.2. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do cDNA codificando para SMT3C em S. mansoni ..............................................................52 4.3. Estrutura genômica do gene SmSMT3C e número de cópias desse gene por genoma haplóide.............................................................................................55 4.4 Expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de vida do parasita. ................................................................................................................58 4.4.1- Padrão de transcrição de SmSMT3C no ciclo de vida do parasita ............58 4.4.2 Northern Blot ................................................................................................59 4.4.3 - Detecção dos conjugados sumorilados.....................................................59 4.5. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do gene que codifica para a enzima conjugadora E2 de SUMO (Ubc9). ................................................62 4.6. Estrutura genômica do gene que codifica para SmUbc9 em S. mansoni.......65 4.7. Expressão do gene que codifica para o gene SmUbc9 no ciclo de vida do parasita. ................................................................................................................67 4.7.1 - RT-PCR......................................................................................................67 4.7.2 – Northern Blot .............................................................................................68 4.7.3 – Western Blot..............................................................................................68 4.8 Caracterização do pseudogene � Ubc9 em S. mansoni.................................70 4.9 – Sequenciamento das seqüências genômica e do cDNA do gene ψ Ubc9 ...71 4.10 – Determinação do número de cópias dos genes SmUbc9 e ψUbc9 em S. mansoni ............................................................................................................73 4.11 – Expressão do ψUbc9 nos estágios de desenvolvimento do parasita .........75 4.12. Anotação das enzimas E3 ligases e das proteases específicas de SUMO ...................................................................................................................77 4.13. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase SIZ-PIAS em S. mansoni ......................................................................................78 4.14. Análise da expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de vida do parasita .....................................................................................................81 4.15. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase RanBP2 em S. mansoni ........................................................................................84 4.16. Caracterização da expressão do cDNA que codifica para RanBP2 em S. mansoni ............................................................................................................87 4.17. Caracterização da seqüência predita da protease específica de SUMO (SUSP) em S. mansoni .........................................................................................90 4.18. Caracterização da expressão do cDNA codificando para ULP1 no ciclo de vida do parasita ................................................................................................93 5. - DISCUSSÃO ...................................................................................................95 5.1 SUMO..............................................................................................................96

5.2. Ubc9.............................................................................................................104 5.3. SUMO E3 ligases .........................................................................................111 5.3.1. Siz-PIAS ....................................................................................................111 5.3.2. RanBP2.....................................................................................................115 5.4.Proteases de SUMO .....................................................................................118 6. CONCLUSÕES ...............................................................................................121 RESUMO.............................................................................................................124 SUMMARY..........................................................................................................127 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................130 APÊNDICES Apêndice 1: SmSMT3C.......................................................................................146 Apêndice 2: SmUbc9...........................................................................................147 Apêndice 3: SUMO E3 ligases ............................................................................148 Apêndice 4: Protease específica de SUMO (ULP1) ............................................151

1. Introdução

__________________________________________________________Introdução 2

“O Jeca não é assim: está assim”

"Hei de empregar toda a minha fortuna nesta obra de saúde geral, dizia ele. O meu patriotismo é este. Minha divisa: Curar

gente. Abaixo a bicharia que devora o brasileiro..."

“Um país não vale pelo tamanho, nem pela quantidade de habitantes. Vale pelo trabalho que realiza e pela qualidade da

sua gente. Ter saúde é a grande qualidade de um povo. Tudo mais vem daí.”

Jeca Tatu – Monteiro Lobato

1.1. O Schistosoma mansoni

Na classe trematoda, encontramos a família Schistosomatidae que

apresenta sexos separados e são parasitos de vasos sanguíneos de mamíferos e

aves. Essa família é dividida em duas subfamílias: Bilharzielinae e

Schistosomatinae. Na primeira encontramos os vermes sem dimorfismo sexual,

que parasitam aves e alguns mamíferos domésticos ou silvestres, portanto sem

interesse médico direto. Na segunda, estão incluídos os que apresentam um nítido

dimorfismo sexual e com espécies que parasitam o homem e animais (Neves,

2005).

A espécie Schistosoma foi descrita primeiramente por Bilharz em 1852 e

posteriormente Weinland em 1858 denominou o gênero deste helminto de

Schistosoma, uma vez que o macho apresenta o corpo fendido (schisto=fenda;

soma=corpo), mas a denominação da espécie Schistosoma mansoni foi dada por

Sambon em 1907. Os estudos de Pirajá da Silva na Bahia, que foram realizados

na mesma época contribuíram muito para a confirmação que o S. mansoni

produzia ovos, habitava as veias mesentéricas e tratava-se de uma espécie

distinta.

__________________________________________________________Introdução 3

O S. mansoni é um trematodo digenético e sendo um digenético apresenta

um ciclo vital complexo que incluem dois ou três hospedeiros. Os vermes adultos

parasitam praticamente todos os sistemas dos vertebrados. O primeiro hospedeiro

intermediário é, com poucas exceções, um molusco gastrópodo. Quando há no

ciclo um segundo hospedeiro intermediário, este faz, com freqüência, parte da

dieta do hospedeiro definitivo vertebrado. A transmissão está geralmente a cargo

de dois estágios larvais nadadores e, na sua maioria, os ciclos vitais dos

digenéticos dependem, portanto, da água para a sua realização (Wilson, RA

1979).

As três espécies principais que infectam o homem são: S. mansoni,

encontrada nas Américas Central e do Sul e na África; S. hematobium, encontrada

na África e Oriente Médio; S. japonicum (uma zoonose), encontrada na China,

Japão e nas Filipinas.

1.2. O ciclo de vida do S. mansoni e a patologia da esquistossomose

Na natureza, adaptações numerosas e complexas devem ser feitas pelos

parasitas, cujos ciclos biológicos envolvem acomodações alternadas a ambientes

tão diferentes como a água e o meio interno de seus hospedeiros. Neste contexto,

o parasita S. mansoni, que apresentando um ciclo de vida complexo, mostra uma

notável interação adaptativa entre o parasita e seus hospedeiros intermediários e

definitivos e com o ambiente natural onde o ciclo ocorre (Neves, 2005).

O ciclo de vida do parasita se inicia quando a fêmea deposita seus ovos

imaturos, espiculados na parede do intestino (Figura 1). Estes ovos se

__________________________________________________________Introdução 4

desenvolvem e atingem a luz intestinal, e posteriormente são eliminados com as

fezes e eclodem ao entrarem em contato com a água doce. O miracídio é um

estágio que não se alimenta, capaz de se movimentar através de movimentos

rápidos. Quando o miracídio encontra o molusco do gênero Biomphalaria, ocorre a

penetração através da epiderme do caramujo. Imediatamente após penetrar na

hemocele do caramujo, o miracídio sofre metamorfose, tornando-se esporocisto-

mãe. Este é um estágio em que o parasita se alimenta, porém carecendo de um

tubo digestivo, deve adquirir nutrientes por difusão ou transporte ativo. Dentro do

esporocisto, a segunda geração, que consiste de numerosos esporocistos-filhos,

desenvolve-se por multiplicação assexuada. O hépatopâncreas do caramujo fica

repleto de esporocistos filhos, que se multiplicam, dando origem à terceira

geração, as larvas denominadas, cercarias (Wilson, 1979). A cercária é a forma

infectante do homem, que ocorre por penetração ativa das cercarias na pele do

individuo. As cercarias penetram ativamente através da secreção de enzimas

digestivas. Depois de penetrarem a pele, estas perdem a cauda e algumas horas

depois, as cercarias completam a metamorfose transformando-se em

esquistossômulos. Os esquistossômulos atingem os pulmões e depois migram

através da corrente sangüínea para o sistema porta-hepático, onde ocorre a

maturação e o acasalamento dos vermes adultos e o início da ovoposição (Neves,

2005).

__________________________________________________________Introdução 5

Figura 1: Ciclo Biológico do S. mansoni. Adaptado de RA Wilson, Introdução à Parasitologia Ed. EDUSP, 1979.

A esquistossomose afeta mais de 200 milhões de pessoas em todo mundo

e estima-se que mais de 1,53 milhões de pessoas estão incapacitadas devido à

doença (WHO 2004 e Chitsulo et al, 2006). A patogenia da esquistossomose

depende de vários fatores, dos quais podemos destacar: a carga parasitária, a

linhagem do parasita, as características do hospedeiro, isto é, a imunidade, o

__________________________________________________________Introdução 6

estado nutricional e a idade. O ovo é o principal fator patogênico na

esquistossomose. Dos ovos depositados na parede intestinal, 30% são eliminados

nas fezes. O restante permanece retido nas paredes do intestino e no parênquima

hepático, sendo o responsável direto pela reação inflamatória granulatomatosa

nos tecidos. Esta reação constitui o granuloma esquistossomótico, elemento

característico na patologia da infecção.

O desenvolvimento do S. mansoni ocorre como resultado da expressão

coordenada de um conjunto de genes distintos, necessários para as alterações

bioquímicas e adaptações morfológicas observadas durante o ciclo de vida.

Desta forma, o conhecimento dos genes e dos mecanismos que controlam

as suas expressões, permitirão uma melhor compreensão, de como o parasita

está programado para viver em ambientes distintos. O conhecimento molecular

também poderá permitir, novos modelos de investigação de moléculas

importantes, que servirão de base para a estruturação de novas drogas

quimioterápicas, que reduziriam os efeitos patológicos da moléstia na sua forma

crônica, bem como, de futuras vacinas, que poderiam resultar numa ação de

desencadeamento da resposta imune protetora, ou num bloqueio do

desenvolvimento do parasita no hospedeiro vertebrado.

1.3. O genoma do S. mansoni e a necessidade da era de descoberta de

genes

O S.mansoni, apresenta um genoma estimado em 2x108 pb, organizado em

oito pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par de

__________________________________________________________Introdução 7

cromossomos sexuais com um conteúdo de GC de 34%. Os machos são

homogaméticos (ZZ) e a fêmea heterogamética (ZW) (Tanaka, 1995).

Devido ao complexo ciclo de vida do parasita, implicando em numerosas

mudanças morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, imagina-se que o seu genoma

possa ser regulado por uma expressão gênica diferencial, desta forma, além dos

genes constitutivos, pode-se esperar a existência de dois outros grupos: um

primeiro grupo, regulado por mecanismos de estresse (térmico, osmótico ou

oxidativo), e um segundo, regulado a longo do desenvolvimento do parasita,

influenciado diretamente pelo hospedeiro (vertebrado ou invertebrado) (Rollinson

& Southgate, 1987).

No Início dos anos 90 a grande questão que emergia na pesquisa sobre

esquistossomose era, qual o melhor prospecto para identificar novos alvos para

drogas, vacinas, e o desenvolvimento de diagnósticos e para dissecar a base

biológica da resistência à droga, diversidade antigênica, infectividade e patologia?

A resposta para essa questão complexa surgiu com a emergente genômica e

posteriormente a genômica funcional (El-sayed et al, 2004). Assim nascia a era de

descoberta de genes do parasita, que se deu através de uma iniciativa do

Programa de Pesquisas em Doenças Tropicais da Organização Mundial de Saúde

e de outras agências de fomento (Johnston et al, 1997).

Assim no período entre 1993 a 1995, ocorreu uma rápida expansão do

conhecimento do genoma do Schistosoma, incluindo o desenvolvimento de

bibliotecas de cDNA de várias fases do ciclo de vida do parasita, construção de

bibliotecas de cromossomos artificiais de leveduras, mapas físicos parciais dos

cromossomos, e a geração de mais que 6000 ESTs (Expressed Sequence Tags)

__________________________________________________________Introdução 8

de S. mansoni (Hillier et al 1996, Adams et al 1993b, Blaxter et al 1996 e Adams et

al 1995).

As primeiras EST´s foram depositadas por Franco et al 1995, e foram nesta

primeira etapa sequenciadas 607 ESTs de uma biblioteca de cDNA de vermes

adultos, onde foram identificados 154 novos genes. Assim, a era de descoberta de

genes do parasita S. mansoni começou, com o sequenciamento e depósito das

sequências nos bancos de dados de EST´s que são sequências parciais de cDNA

com 150-600 bp, obtidas a partir das extremidades 3' e 5' do cDNA.

Paralelamente ao sequenciamento de EST´s em larga escala, diversos

outros grupos também foram descrevendo genes importantes na biologia do

parasita. Assim, foi descrito em S. mansoni a presença de introns pequenos (30-

50 pb) (Roche et al 1994), e genes com íntrons de tamanho superior a 3 Kb, como

por exemplo, o da glutationa S-transferase (Sm28 GST) (McNair et al 1993), e

genes que não possuem íntrons, como por exemplo, aqueles que codificam as

proteínas da casca do ovo (Rodrigues et al, 1989). Apesar do grande avanço no

conhecimento da genômica e do transcriptoma do parasita, ainda não se tem

descrito, como se processa a maquinaria de remoção desses pequenos íntrons,

bem como a função de seqüências de RNAs não codificadores e também de

pseudogenes e seu papel como possíveis reguladores da expressão gênica.

Mas, o avanço no número de seqüências de Schistosoma ocorreu a partir

de 2003, como resultado de dois projetos de sequenciamento que ocorreram

simultaneamente no Brasil e na Ásia, o projeto Transcriptoma do S. mansoni,

financiado pela FAPESP, com a participação de um consórcio de laboratórios,

__________________________________________________________Introdução 9

conhecido como a rede ONSA (Organization of Nucleotide Sequence and

Analysis) e o projeto transcriptoma do S. japonicum, respectivamente.

No projeto transcriptoma do S. japonicum foram geradas 43.707 ESTs de

casais, machos, fêmeas e ovos, respectivamente (Hu et al 2003). Essas ESTs

foram agrupadas em 13,131 genes que provavelmente codificam para a maioria

das proteínas sintetizadas pelo parasita.

No projeto transcriptoma do S. mansoni foram seqüenciados 163,586 ESTs,

sendo que 151,684 foram originadas de bibliotecas do tipo ORESTES (Open

reading frames ESTs), ou seja, a região central do gene, e os 11,902 seqüências

restantes foram originadas de bibliotecas normalizadas de vermes adultos. Desta

forma o total predito de genes é aproximadamente 14,000 genes, cobrindo

aproximadamente 92% do transcriptoma do parasita (Verjovski et al 2003).

De acordo com a classificação funcional dos transcritos através do Gene

Ontology (GO), os genes do parasita identificados apresentam várias funções

importantes relacionadas com o complexo plano de vida e desenvolvimento deste

parasita (Verjovski et al 2003). Assim, foram identificados genes envolvidos em

interações célula–célula, processos de desenvolvimento, resposta ao estímulo

externo e transdução de sinal. Estes genes são específicos dos metazoários,

representando a conservação relativa desses genes em relação aos outros

metazoários.

Desta maneira, foram identificados genes que codificam para os

componentes de detecção de luz, incluindo parálogos de SmRodopsina, rodopsina

quinase, arrestina e transducina. Tanto a proteína rodopsina quanto à enzima

rodopsina quinase são transcritas em ovos e esporocistos, o que se torna

__________________________________________________________Introdução 10

consistente ao examinarmos a resposta da cercária e dos miracídios à luz. Por

outro lado, a identificação de genes que codificam para os receptores de insulina e

fatores de crescimento, reforça a idéia de que o parasita capta moléculas do

hospedeiro, para uso próprio.

O controle da expressão gênica e a diferenciação ficam evidenciados ao

analisar os genes que estão implicados no silenciamento da cromatina, bem como

também dos genes que codificam para proteínas do tipo grupo polycomb, tais como

os EZ (Enhancer of Zeste), ESC (Extra Sex Combs), que são proteínas responsáveis

pela manutenção do padrão de diferenciação celular (Verjovski et al 2003).

As iniciativas de sequenciamento do genoma completo do parasita S.

mansoni ainda estão em andamento com projetos financiados pelo National

Institutes of Health (NIH) no instituto TIGR (The Institute for Genomic Reasearch,

Rockville, MD, USA), por outra iniciativa brasileira a Minas Gerais genome

Network EST project e também pelo Instituto Sanger Centre, financiado pela

Welcome Trust, UK (El-sayed et al 2004, Brindley, 2005).

1.4. O início de um novo tempo: a era do genoma funcional

O sequenciamento do genoma e do transcriptoma do S. mansoni abrirá

com certeza, várias perspectivas para o estudo da biologia do parasita, no sentido

de manipulação de genes essenciais no desenvolvimento e manutenção do

parasitismo, no estabelecimento de novas drogas contra a parasitose e também

do estabelecimento de uma vacina para prevenção e terapêutica.

Estudos relacionados à manipulação do genoma através de RNAi, como

__________________________________________________________Introdução 11

descrito por Skelly et al 2003, mostrou que o gene que codifica para catepsina B

no estágio de desenvolvimento esquistossômulo-verme adulto, pode perfeitamente

ser silenciado.

Iniciativa relacionada ao proteoma celular tem sido extensivamente estudada

através da separação das proteínas solúveis e/ou secretáveis através de eletroforese

bidimensional. As proteínas selecionadas são digeridas com tripsina e os peptídeos

resultantes são analisados em espectrômetro de massa e são correlacionados aos

cDNAs depositados nos bancos de dados do transcriptoma (Curven et al 2004).

O transcriptoma também possibilitou a identificação de genes que podem

ser possíveis alvos para novas drogas e candidatos à vacina. Foram identificados

16 possíveis novos alvos para droga, alguns por analogia com outros alvos

anteriormente validados em outros helmintos, em particular aqueles envolvidos

com neurotransmissão, tais como o acetilcolina nicotínico e o receptor para

glutamato (Verjovski et al 2003). Entretanto, a presença de oito transcritos

codificando proteínas da família de multi-resistência a drogas (MDR) dos

transportadores ABC (Skatrud, 2002), que estão envolvidos na desintoxicação e

transporte de metabólitos, pode significar um promissor mecanismo de resistência

a drogas que o parasita pode utilizar.

Outros 28 genes analisados possuem a característica de estarem envolvidos,

na sobrevida do parasita, e também são expressos na superfície da célula ou

apresentam a característica de serem secretáveis, e são exclusivamente expressos

nos estágios intra-mamífero. Todas essas características os tornam candidatos a

vacinas. Outros genes que são expressos exclusivamente na transição cercária-

__________________________________________________________Introdução 12

esquistossômulo-verme adulto, e são essenciais para a sobrevivência do parasita se

tornam também bons candidatos à vacina (Verjovski et al 2004).

Desta forma o estudo sistemático dos bancos de dados de seqüências de

DNA deste parasita, pode levar tanto ao avanço da biologia celular quanto ao

possível controle da parasitose.

1.5. Modificação pós-traducional de proteínas

Dentro dessa perspectiva do genoma funcional, durante os últimos anos, o

Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, sob a coordenação do Prof. Dr.

Vanderlei Rodrigues, vem estudando extensivamente a via de modificação de

proteínas dependente de ubiquitina, no parasita S. mansoni.

No contexto celular, processos de modificação pós-traducional, como a

fosforilação, a glicosilação e a acetilação, controlam vários processos celulares

importantes que mantém a homeostase e o funcionamento celular. As proteínas

também participam de processos de modificação de outras proteínas.

A ubiquitina é uma proteína altamente conservada, durante a evolução das

espécies, possuindo um peso estimado de 8000 Da, com 76 resíduos de

aminoácidos. A poliubiquitinação da lisina 48 (K48) das proteínas está relacionada

com a proteólise citoplasmática dependente de proteassoma. As proteínas

monoubiquitinadas na lisina 29 (K29), estão relacionadas com a modulação de

receptores de superfície na endocitose (Ciechanover e Schwartz, 1998).

O processo de ubiquitinação ocorre através da ligação covalente (via

ligações isopeptídicas), um processo que envolve a ativação da porção C-terminal

__________________________________________________________Introdução 13

da ubiquitina, pela enzima ubiquitina ativadora (E1), e posterior transferência dos

grupos amino de resíduos lisil para o substrato protéico, catalisado pelas enzimas

conjugadoras de ubiquitina (UBCs ou E2).

Por apresentar um papel de regulação da meia vida de proteínas chaves

em células eucarióticas, o sistema de conjugação da ubiquitina tem mostrado

exercer importantes papéis numa ampla variedade de processos celulares, tais

como, o reparo do DNA (JENTSCH, 1992), controle do ciclo celular (GOEBL et

al,1988) e resposta ao estresse (SEUFERT et al 1990).

Desta forma, em nosso laboratório a atividade do proteassoma de vermes

adultos e cercárias, foi analisada depois de serem incubados com os inibidores do

proteassoma. Todos os inibidores do proteassoma mostraram uma inibição de

cerca de 80% em cercária. Em vermes adultos, a inibição foi cerca de 59% na

presença de MG-115. A proteólise endógena também foi verificada e os resultados

mostraram que em cercária, a proteólise endógena aumentou cerca de 1,4 a 2,5

vezes depois da estimulação com ATP com ou sem ubiquitina. A adição de

MG132, um peptídeo aldeído inibidor do proteassoma, causou uma redução de

90% e 75% na proteólise endógena, estimulada por ATP e ubiquitina em cercária

e vermes adultos, repectivamente (Guerra-Sá et al 2005).

Recentemente, dados bioquímicos forneceram as primeiras evidências da

relação entre a via de ubiquitinação e o CSN, quando se demonstrou a interação

do CSN com o complexo E3 ligase SCF (Lyapina et al., 2001). Algumas

evidências experimentais, também indicam que o CSN interage diretamente com o

proteassoma 26S e compete com o complexo 19S, e em excesso molar de CSN

__________________________________________________________Introdução 14

ocorre a substituição da tampa do 19S pelo CSN, o que influencia diretamente a

atividade peptidásica do proteassoma in vitro (Huang et al., 2005).

Desta forma, através da análise do banco de dados do transcriptoma e da

análise da expressão dos genes que codificam para as subunidades da tampa do

proteassoma e do complexo COP9 sigalossoma, foi possível sugerir que existe

uma regulação diferencial das subunidades da tampa do proteassoma e das

subunidades do COP9 em cercárias. Estes resultados aliados aos resultados da

diminuição da taxa de proteólise em cercária inferem que os baixos níveis de

proteólise em cercária podem sugerir uma montagem alternativa do proteassoma

em cercária comparado com os resultados de expressão diferencial dos

componentes da base e da tampa do proteassoma e do COP9 signalossoma em

cercária e em vermes adultos (Cabral FJ, et al 2006).

O perfil proteômico da via de ubiquitinação no ciclo de vida do parasita,

bem como a atividade do 20S purificado foi descrito recentemente no nosso

laboratório (Castro-Borges et al 2007). A expressão dos genes que codificam para

as subunidades da tampa e da base do proteassoma no ciclo de vida do parasita

também foram avaliadas recentemente no nosso laboratório (Pereira OSJ, Tese

de Doutorado, 2005).

As primeiras evidências em relação a SUMO em S. mansoni foram através da

presença de vários conjugados ubiquitinados, que poderiam estar associados, não

somente a substratos ubiquitinados, mas também a substratos sumorilados, obtidos

através da reação cruzada com o anticorpo anti-ubiquitina (Guerra-Sá, R. tese de

Doutorado, 2000). Outro resultado do nosso grupo aponta para a um gene que

codifica para SUMO2 (SMT3B) em S. mansoni (Cabral FJ, manuscrito em preparo).

__________________________________________________________Introdução 15

1.6. A proteína Ubiquitina – símile: Small Ubiquitin Modifier (SUMO)

Entre os sistemas que modificam proteínas, a ligação covalente da

ubiquitina-símile, SUMO, aos substratos alvo, processo denominado sumorilação,

representa depois da ubiquitinação, o exemplo mais estudado de modificação pós-

traducional que envolve interação proteína-proteína (Seeler & Dejean, 2003).

Embora a mecânica dos processos de ubiquitinação e sumorilação sejam

semelhantes, os alvos modificados, nem sempre são os mesmos, e em alguns

casos a sumorilação pode até antagonizar com a ubiquitinação.

A SUMO é uma proteína que apresenta apenas 18% em similaridade de

seqüência primária com a ubiquitina (Melchior, 2000), mas apresenta uma grande

similaridade em estrutura tridimensional, como podemos observar através da

Figura 2.

Figura 2: SUMO e Ubiquitina. (A) Comparação entre as estruturas tridimensionais de SUMO e Ubiquitina, mostrando a semelhança de estrutura dimensional entre as duas proteínas. (B) Alinhamento entre as proteínas SUMO e Ubiquitina. Adaptado de Johnson E.S., Annu. Rev. Biochem., 2004

__________________________________________________________Introdução 16

Na estrutura tridimensional de SUMO, existe uma extensão variável de

aproximadamente 22 aminoácidos, a qual não existe na estrutura da ubiquitina, e

que pode funcionar como uma interface adicional para possíveis interações

proteína-proteína. Além do mais, a SUMO possui em sua porção carboxi-terminal

um duplo motivo de Glicina (Gli-Gli), pelo qual SUMO se liga aos seus substratos

alvo. Em contraste com a ubiquitina, a SUMO1 não é capaz de se conjugar à ela

mesma e formar cadeias poli-SUMO (Johnson ES, 2004).

A via de sumorilação é conservada em diversos organismos. Os

organismos D. melanogaster e S. cerevisiae expressam apenas um gene

codificando para SUMO, enquanto que em plantas são expressos oito genes

codificando para SUMO (Kurepa et al 2002). Em mamíferos SUMO1 está em sua

maioria na forma conjugada, enquanto que as duas outras isoformas de SUMO, as

proteínas SUMO2 e SUMO3 se apresentam na forma não conjugada, e são

sujeitas à conjugação depois de situações de estresse celular (Saitoh et al, 2000).

Relatos recentes apontam para a existência de SUMO4, participando de eventos

relacionados a doenças auto-imunes (Pearce & Merriman, 2006).

1.7. A via de conjugação de SUMO aos seus substratos alvo: o processo

de sumorilação

A conjugação de SUMO aos seus substratos alvo, assim como a

ubiquitinação, depende de três enzimas, que são necessárias, para primeiramente

ativar o substrato alvo, através de uma enzima E1, com gasto de energia na forma de

ATP. A enzima E1 catalisa a adenilação do motivo Gli-Gli na porção C-teminal de

__________________________________________________________Introdução 17

SUMO. A SUMO adenilada se liga a E1 de forma não covalente, e então SUMO é

transferida ao resíduo de cisteína da enzima E1 para formar uma ligação tiól-éster

entre o grupo sulfidrila (-SH) da cisteína e o grupamento –COOH da SUMO. Assim,

SUMO é então transferida a Ubc9, a enzima E2, formando uma ligação tiól-éster com

o grupamento sulfidrila do sítio ativo de Ubc9 (Figura 3). Posteriormente as E3 ligases

ligam a SUMO ao substrato auxiliando na ligação ao substrato (Johnson e Gupta,

2001; Kagey et al 2003; Kahyo et al, 2001; Pichler et al, 2002; Sachdev et al 2001;

Takahashi et al, 2001). Desta forma, SUMO é ligada ao substrato através de uma

ligação isopeptídica entre a sua porção C-terminal (–COOH ) e um grupamento ε-

amino de um resíduo de lisina específico da proteína alvo (Chen 2004).

Como as vias de ubiquitina e SUMO são vias de conjugação semelhantes,

porém distintas, as enzimas que participam do processo de ubiquitinação não são as

mesmas que participam da sumorilação, como descreveremos nos itens seguintes.

Figura 3: A via de sumorilação. A SUMO é traduzida como uma pré-proteína e deve ser processada através da clivagem pela protease específica de SUMO ou Ulp1. Depois de processada, a proteína é conjugada através do domíno carboxi-terminal Gli-Gli, aos seus substratos alvos com o auxílio de três enzimas: E1 (Aos1/Uba2) ativadora, E2 (Ubc9) conjugadora e E3 ligases do tipo Pias, Polycomb2 ou RanBP2. Adaptado de Seeler e Dejean, Mol. Cel. Biol, 2003.

__________________________________________________________Introdução 18

1.8. A enzima E1 ativadora ou Aos1/Uba2

A enzima ativadora de SUMO é um heterodímero consistindo de duas

subunidades, ou seja, a subunidade Aos1 de 38 kDa e a subunidade Uba2 de

71kDa (Dohmen et al 1995, Johnson et al 1997). Ambas as subunidades são

conservadas entre as espécies e em S. cerevisiae, esta proteína é essencial para

a viabilidade da levedura. Em levedura a subunidade Aos1 é 29% idêntica à região

N-terminal da E1 de ubiquitina de levedura, enquanto a porção Uba2 apresenta

28% de identidade com os 561 aminoácidos da porção C-terminal da enzima E1

de ubiquitina de levedura, a enzima Uba1. Essas regiões de homologia contêm os

dois motivos de ligação a SUMO (um em Aos1 e outro em Uba2) e a seqüência

consenso do sítio ativo de cisteína, responsável pelas ligações tiól-ésteres,

realizadas por essas enzimas (Melchior, 2000), visto que E1 cataliza a adenilação

de SUMO, e então forma a ligação tiól-ester com a posterior transferência para a

enzima E2 conjugadora (Chen, 2004).

1.9. A enzima E2 conjugadora: a Ubc9

A enzima conjugadora E2 de SUMO, a proteína Ubc9 é uma proteína

bastante conservada entre as espécies, e foi primeiramente identificada em

mutantes de levedura sensíveis a temperatura (Seufert et al 1995; Watanabe et al

1996). As similaridades entre SUMO e ubiquitina são reforçadas pela notável

similaridade entre Ubc9 e a grande família de enzimas conjugadoras de ubiquitina

(Giraud et al 1998; Haas e Siepmann 1997; Tong et al 1997).

__________________________________________________________Introdução 19

Apesar de existirem semelhanças entre Ubc9 e as enzimas E2 de

ubiquitina, a diferença entre a superfície de cargas entre essas proteínas, torna-se

uma diferença muito peculiar e determinante, na especificidade da Ubc9 por

SUMO. A superfície de cargas da Ubc9 é positivamente carregada, apresentando

um ponto isoelétrico de 8.7, em contraste com o ponto isoelétrico das E2s, mais

negativamente carregadas, que apresentam um pI em torno de 6.7 (Chen, 2004).

Um recente estudo de RMN, mapeou a interface de cargas entre Ubc9 e SUMO, e

mostrou que essas proteínas apresentam uma grande complementaridade em

seus potenciais eletrostáticos e hidrofobicidade (Liu et al 1999). Esses resultados,

explicam a especificidade de Ubc9 por SUMO. Até o momento, Ubc9 é a única

enzima capaz de conjugar SUMO aos seus substratos alvo.

A sumorilação dos substratos é dependente de uma seqüência consenso

ψKxE(ψ representa um aminoácido hidrofóbico, K é uma lisina, x é qualquer

aminoácido e E representa o aminoácido Glu), esse motivo foi identificado através

da comparação dos sítios de modificação de SUMO-1 nas proteínas alvo

(Desterro et al 1997). A análise da estrutura de mutantes de substratos por

espectro de RMN, combinada com a análise da cinética de reação da modificação,

revelaram que o motivo ψKxE é onde a Ubc9 se liga aos substratos alvos (Lin, et

al 2002).

Diversos relatos indicam que a Ubc9 realiza suas funções em diferentes

compartimentos celulares. Em leveduras, experimentos utilizando a proteína de

fusão Ubc9-βgalactosidase, mostraram que a proteína de fusão estava localizada

dentro do núcleo (Seufert et al 1995). Experimentos utilizando imunoflorescência

indireta detectaram Ubc9 endógena no citoplasma e nucleoplasma e perto do

__________________________________________________________Introdução 20

envelope nuclear, de células de mamíferos (Melchior 2000). Este aglomerado de

Ubc9 perto do envelope nuclear está diretamente associado com a modificação de

RanGAP1 e RanBP2 (Mahajan et al 1997).

As outras isoformas de SUMO, ou seja, a SUMO-2 e SUMO-3 também se

ligam a Ubc9 na mesma superfície, onde se liga SUMO-1 e com a mesma

afinidade (Tatham et al 2003). Este fato está correlacionado com a conservada

superfície de ligação de Ubc9 nos três parálogos, embora SUMO-2 e SUMO-3

apresentem somente 50% de identidade em sequencia de aminoácidos com

SUMO-1 (Saitoh & Hinchey, 2000).

1.10. SUMO E3 ligases

A existência de proteínas que funcionavam como SUMO E3 ligases,

permaneceu desconhecida até a descoberta de que as proteínas Siz1 e Siz2, que

são membros da família PIAS (protein inhibitor of activated STAT), funcionavam

como enzimas que ligavam SUMO aos seus substratos (Takahashi et al 2001).

Até o momento estão caracterizadas três tipos de proteínas que funcionam como

SUMO E3 ligases: Siz-PIAS, Polycomb2 e RanBP2.

A proteína Siz1 foi inicialmente identificada interagindo geneticamente com

o complexo condensina (Strunnikov et al 2001). O nome Siz é derivado dos nomes

dos domínios SAP e Miz, e estes dois domínios estão presentes em todas as

proteínas PIAS. A proteína Siz 2 foi primeiramente descoberta como um ligante de

Cdc12 de levedura em experimentos de duplo-híbrido (Strunnikov et al 2001).

Depois de alguns meses dessa descoberta, dois grupos anunciaram que Siz1 e

__________________________________________________________Introdução 21

Siz2 apresentavam atividade SUMO E3 ligase (Johnson e Gupta, 2001; Takahashi

et al 2001).

Pelo menos cinco diferentes proteínas PIAS, codificadas por quatro genes

distintos, estão descritos em mamíferos. PIAS1 e PIAS3 foram identificadas como

ligantes específicos e reguladores negativos dos fatores de transcrição STAT1 e

STAT3, respectivamente, e PIASxα, PIASxβ ePIASy foram identificadas por

homologia e são derivadas do processamento alternativo do mRNA de PIAS1 e 3

(Johnson 2004). PIAS1 foi independentemente identificada como uma proteína

que interage com a proteína Gu/RNAII-helicase, e foi denominada GBP(Valdez et

al 1997). Até o momento não foi elucidado ao certo, quantas variantes oriundas de

processamento de RNA, são expressos para cada gene do tipo PIAS.

A função SUMOE3 ligase das proteínas PIAS depende da presença do

domínio SP-RING, que é caracterizado como um domínio de 35 aminoácidos com

o domínio conservado SAP na porção N-terminal e o outro domínio conservado

RING na porção central da proteína, sendo o domínio RING responsável pela

interação com a Ubc9 (Melchior e Pichler, 2004). O domíno RING também é

característico por possuir atividade E3 ligase na via de ubiquitina.

Outra classe de SUMOE3 ligase caracterizada é denominada Polycomb2

ou Pc2. A proteína Pc2 é uma proteína de 558 amoniácidos com um tamanho

predito de 61kDa (Satijn et al 1997). A proteína hPc1/m33 e a proteína hPc3,

possuem o domínio Chromatin organization modifier (chromo), na porção amino-

terminal e o domínio C-box, na porção carboxi-terminal, onde o domínio chromo é

responsável pela ligação à cromatina e o domínio C-box é responsável pela

repressão da expressão gênica (Melchior e Pichler, 2004). A função E3 ligase

__________________________________________________________Introdução 22

parece estar relacionada com a região da molécula que se localiza entre a região

chromo e a região C-box. Esta região não mostra nenhuma similaridade com outra

SUMO ou ubiquitina E3 ligase (Kagey et al 2003).

Os repressores transcricionais do grupo Polycomb (PcG), exercem um

importante papel na regulação da atividade dos genes na cromatina. As funções

associadas com as proteínas PcG, estão relacionadas à manutenção do padrão

de expressão dos genes homeóticos durante o desenvolvimento embrionário, à

diferenciação das células hematopoiéticas e à regulação da proliferação celular.

Essas funções podem ser antagonizadas pelo grupo de ativadores transcricionais,

da família trithorax (TRX) (revisado por Brock e van Lohuizen, 2001; Francis and

Kingston, 2001; Jacobs e Lohuizen, 2002; Orlando, 2003; Satijn e Otte, 1999).

O terceiro tipo de SUMOE3 ligase caracterizado até o momento é a

proteína RanBP2/Nup358, e consiste num resíduo de aproximadamente 300

aminoácidos que se localiza na região do complexo do poro nuclear (Pichler et al

2002, Yokoyama et al 1995; Wang et al 1999). O domínio E3 que é denominado

IR (internal repeat), contém duas repetições de um resíduo de aproximadamente

50 aminoácidos que não apresenta nenhuma similaridade de seqüência com

outras E3 ligases de ubiquitina anteriormente caracterizadas. Esse domínio IR,

tem a capacidade de sumorilar RanGAP1 e formar um composto trimérico estável,

envolvendo SUMO, Ubc9 e RanGAP1 e assim pode ser responsável pela

localização de SUMO-RanGAP1 no complexo do poro nuclear (Saitoh et al 1998;

Matunis et al 1998).

__________________________________________________________Introdução 23

1.11. Proteases específicas de SUMO

O padrão de proteínas sumoriladas é dinâmico e muda durante o ciclo

celular em resposta a vários estímulos (Li e Hochstrasser 1999). As proteases de

SUMO, também chamadas de isopeptidases, apresentam duas funções nesse

processo: elas removem SUMO das proteínas, tornando a modificação reversível,

e também fornecendo uma fonte de SUMO livre para ser usada para conjugação a

outras proteínas. A proteína SUMO em sua forma livre é gerada tanto da clivagem

do pequeno peptídeo da porção C-terminal da pré-proteína quanto da

desumorilação de conjugados de SUMO com outras proteínas. De qualquer forma,

ambas essas fontes de SUMO livre são importantes para a manutenção dos níveis

normais de SUMO intracelulares (Kurepa et al, 2002; Johnson et al 1997).

Todas as enzimas que clivam SUMO contém uma porção C-terminal de

aproximadamente 200 aminoácidos, chamado ULP (Ubiquitin-like protease),

responsável pela atividade de clivagem (Mossessova e Lima, 1999). O domínio

ULP não apresenta nenhuma similaridade de seqüência com as proteases que

clivam ubiquitina. Ao invés disso, o domínio ULP está relacionado, com proteases

virais (Li e Hochstrasser et al, 1999; Strunnikov et al 2001). As proteases de

SUMO tem uma porção N-terminal variável, as quais podem ser seqüências

regulatórias que direcionam as enzimas para diferentes partes da célula (Li e

Hochstrasser, 2003; Panse et al, 2003; Hang et al 2002; Itahana et al 2006).

__________________________________________________________Introdução 24

Tabela 01 - Proteases específicas de SUMO (adaptado de Seller e Dejean, 2003)

Nos genomas de mamíferos, sete genes codificam para proteínas com

domínio ULP (Tabela 1), mas pelo menos uma dessas cliva Nedd8 ao invés de

SUMO (Gan-Erdene et al, 2003; Mendoza et al, 2003; Yeh et al, 2000). Essas

enzimas incluem SENP3, a qual se localiza no nucleoplasma (Nishida et al, 2000);

SUSP1 encontrada no citoplasma (Kim et al, 2000); SENP1 encontrada no núcleo

(Bailey et al, 2002). A diversidade dos locais onde as proteases de SUMO podem

ser encontradas na célula, reflete como a via de sumorilação pode ser regulada

em relação à especificidade de substratos ( Seeler e Dejean 2003).

1.12. As proteínas modificadas por SUMO

Nos últimos anos, vários relatos relacionam SUMO envolvida controlando

diversos processos celulares importantes (Figura 4).

__________________________________________________________Introdução 25

Figura 4: Substratos de SUMO agrupados por função e localização. A SUMO realiza suas funções modificando importantes proteínas majoritariamente no núcleo, mas podendo sumorilar substratos também no cistoplasma. Adaptado de Seeler e Dejean, Mol. Cel. Biol, 2003.

Através da Figura 4 podemos destacar o papel de SUMO na manutenção

da integridade do genoma, em processos de transdução de sinais e controle da

transcrição.

O primeiro substrato modificado por SUMO foi descoberto por Mahajan et al

(1997), e está relacionado com o controle do transporte de moléculas do

citoplasma para o núcleo, através do complexo do poro nuclear.

Diversos relatos colocam SUMO na evidência como participante de um

mecanismo emergente que permite o controle da atividade transcricional. Estudos

envolvendo receptores nucleares, e a proteína Sp3 indicam que essas proteínas

__________________________________________________________Introdução 26

possuem um domínio chamado SC (Sinergy Control), que apresenta homologia de

seqüência com o sítio de sumorilação ΨkxE (Iniguez-Lluhi e Pearce, 2000).

Também esses estudos indicam que a mutação de cada um dos aminoácidos do

sitio de sumorilação, leva a uma abolição da repressão, sugerindo que a

sumorilação (ou ligação da Ubc9) está mecanisticamente envolvida na repressão

(Snowden et al 2000, Yang et al 2006). O mecanismo, pelo qual SUMO inibe a

transcrição, ainda não está completamente elucidado mas, um modelo possível é

que a modificação por SUMO pode promover ou inibir as interações proteína-

proteína e desta forma regular a montagem de complexos transcricionais (Verger

et al 2003).

Devido ao fato da via de sumorilação estar envolvida em importantes

aspectos da fisiologia celular, incluindo, transcrição dos genes, mitose, localização

sub-celular, transporte núcleo-citoplasma e regulação da estabilidade protéica

(Verger et al 2003), em S. mansoni, esta via pode controlar aspectos importantes,

relacionados com o complexo plano de desenvolvimento sofrido por esse parasita

bem como a manutenção do parasitismo no hospedeiro vertebrado.

2. Objetivos

___________________________________________________________Objetivos 28

Objetivo geral

Este trabalho tem como objetivo geral verificar a conservação da via de

sumorilação e suas características em S. mansoni.

Objetivos específicos

Determinar um panorama geral das seqüências que codificam para os

genes da via de sumorilação, através da análise in silico nos bancos de

dados disponíveis do parasita;

Idealizar oligonucleotídeos específicos para recuperar os genes que

codificam para a via de sumorilação, clonar e sequenciar os transcritos

obtidos e analisar as seqüências utilizando ferramentas de bioinformática;

Estudar a estrutura genômica dos genes que codificam para SUMO e Ubc9;

Determinar a expressão dos genes que codificam para SUMO, Ubc9,

SUMO E3 ligases e SUMO protease no ciclo de vida do parasita, através de

RT-PCR, qRT-PCR e Northern Blot;

Avaliar o padrão dos conjugados sumorilados em extratos de proteínas

totais e nucleares desse parasita por Western Blot. Avaliar a expressão de

Ubc9 por Western Blot utlizando anticorpo anti-Ubc9.

3. Materiais e Métodos

___________________________________________________Materiais e Métodos 30

3.1. Manutenção do ciclo biológico do S.mansoni.

O ciclo biológico do S.mansoni, linhagem LE é rotineiramente mantido no

Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, do Departamento de Bioquímica e

Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.

Os ovos do S.mansoni presentes nas fezes de camundongos das linhagens

Swiss ou Balb/C previamente infectados com o parasita foram recolhidos pelo

método de Hoffmann e expostos por aproximadamente 1 hora sob luz, para a

liberação de miracídio. Os miracídios foram utilizados para infectar o hospedeiro

intermediário, o caramujo da espécie Biomphalária glabrata, que após 38 a 43 dias

liberou a forma infectante do parasita, as cercárias, a forma infectante do

hospedeiro vertebrado. As cercárias foram inoculadas, no camundongo via

subcutânea e após aproximadamente 50 dias os vermes adultos foram

perfundidos do sistema porta-hepático (SMITHERS & TERRY, 1965).

Após a coleta, os parasitas foram mantidos em solução salina 0,9% ou no

meio RPMI (Invitrogen). Para a obtenção dos vermes (macho ou fêmea), estes

foram mecanicamente separados com o auxilio de um pincel, sendo em seguida

congelados e mantidos à -70ºC, até o momento do uso.

3.2. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos (Harrop &

Wilson, 1993)

Depois de recolhidas as cercárias, esta foram limpas de detritos

provenientes dos moluscos, com o auxilio de uma pipeta e foram permitidas


decantar em béquer autoclavado em banho de gelo por 2 horas. Decorrido esse

intervalo de tempo, o sobrenadante foi desprezado e as cercárias transferidas

para um tubo estéril. A seguir as cercárias foram lavadas com água declorada e

decantadas durante 20 minutos. Posteriormente foram transferidas para um tubo

de 15 mL, e o volume final foi completado com água declorada filtrada para 7 mL

sendo permitida a decantação das cercárias por 10 minutos. Após repetir este

procedimento por 3 vezes todo o volume de água, foi retirado e descartado.

A seguir foram adicionados 7 mL de meio RPMI suplementado com soro

bovino fetal (GIBCO). Após 10 minutos de decantação o meio foi desprezado e

sendo adicionados outros 7mL de RPMI suplementado. Os parasitas foram

submetidos à agitação com auxílio de um vortex por 90 segundos em velocidade

alta, para permitir a quebra mecânica da cauda. Os corpos cercarianos obtidos

foram incubados por 4 horas em estufa de CO2.

Decorrido este intervalo de tempo, procedemos à lavagem dos

esquistossômulos para a remoção das caudas. Para isso a 2 mL de RPMI

contendo 120.000 esquistossômulos foram adicionados 3 mL de meio RPMI e este

conteúdo de 5mL foram distribuídos em tubos eppendorfs, para o procedimento de

lavagem e retirada das caudas. Os esquistossômulos foram decantados por 10

minutos, o sobrenadante onde estavam as caudas foi retirado e foram adicionados

mais 1mL de RPMI em cada tubo e foi permitido decantar por 4 minutos. Os

esquistossômulos foram lavados até não serem detectadas caudas. A detecção da

inexistência de caudas foi feita como auxílio de um microscópio invertido. Depois

de estarem livres de caldas cercarianas, os esquistossômulos foram congelados e

estocados em –70 °C até o momento do uso.


3.3 Anotação da via de modificação de proteínas ubiquitina-símile

dependente de SUMO em S. mansoni.

Para a identificação e comparação das seqüências, foram adotados os

procedimentos descritos por Louis et al, 2001 e Birney & Durbin, 2000, constituído

de 5 etapas sucessivas, como resumidamente descritas abaixo:

1- Todas as seqüências, previamente analisadas (via BLAST) pelo grupo de

Bioinformática, do Projeto Genoma do S. mansoni, que apresentaram homologia

com genes envolvidos com a via de sumorilação;

2- Posteriormente, estas seqüências foram agrupadas em clusters, nas seguintes

categorias: SUMO, enzima E2 - Ubc9, enzimas E3 ligases e enzimas

desumoriladoras (SUSPs).

3- Em seguida, foi analizada a qualidade da montagem dos clusters, através da

avaliação de todas as corridas que foram utilizadas para obter a seqüência

consenso do respectivo cluster. Somente foram utilizados os clusters formados por

bases com qualidade maior do que 20, estimados pelo programa Phred Phrap;

4- As análises para a identificação dos domínios protéicos foram realizadas

utilizando os programas Pfam (Bateman et al., 2000) e SMART (Schultz et al.,

2000);

5- Todas as seqüências foram analisadas utilizando o banco de dados GeneDB,

Sanger Center – UK.

6- Os alinhamentos foram realizados utilizando o programa ClustalW

(www.ebi.ac.uk/clustalw), e posteriormente foram submetidos ao programa

BOXSHADE.


3.4. Extração de RNA total

Cerca de 100mg de vermes foram homogenizados em 1mL de Trizol LS

(INVITROGEN) com auxílio de um politron, até completa solubilização. Em

seguida, a mistura foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.

Decorrido este intervalo de tempo, foi adicionado à mistura 200 µL de

clorofórmio, e as amostras foram agitadas em vortex vigorosamente por 1 minuto

e incubadas a temperatura ambiente durante 20 minutos, sendo posteriormente

centrifugadas a 10000 x g por 10 minutos a 4 °C.

Após esta etapa de centrifugação, a mistura separa-se em uma fase inferior

de cor vermelha (fase fenol-clorofórmio), interfase e fase aquosa superior incolor.

O DNA fica na interfase e as proteínas na fase orgânica, enquanto o RNA

permanece exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um

tubo ésteril (tipo eppendorf) e o RNA precipitado pela adição de 500 µL de

isopropanol. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, o RNA foi

então recuperado por centrifugação a 10000 x g por 10 minutos a 4°C. O

sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com 1,0 mL de etanol 70%

em água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), e em seguida, centrifugado a

10000 x g por 8 minutos a 4°C. O precipitado final foi seco a vácuo e

ressuspendido em 50 µL de água tratada com DEPC.

Para a extração do RNA total das formas larvais do S. mansoni foram

utilizados aproximadamente 120000 cercárias, 120000 esquitossômulos e 5000


ovos. A Figura 5 mostra um gel típico do procedimento de extração que foi

conduzido como descrito acima.

3.5. Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real

Para extrairmos o RNA total utilizados nos experimentos de análise da

expressão dos genes que codificam para a via de sumorilação, utilizando PCR em

tempo real, utilizamos o kit "Purelink Micro-to-Midi Total RNA purification system"

(Invitrogen), como descrito resumidamente abaixo.

O RNA foi extraído pelo método do Trizol conforme descrito anteriormente.

Depois da extração do RNA procedemos à lavagem e eluição do ácido nucléico,

conforme o boletim técnico do fabricante, como descrito resumidamente abaixo.

Para o procedimento de lavagem, foram transferidos aproximadamente

700uL da amostra de RNA com etanol para a coluna com resina, e foi centrifugada

a 12.000xg por 1 minuto e descartado o volume eluido da coluna. Esse processo

foi repetido e foi posteriormente adicionado 700 uL do tampão de lavagem (Wash

buffer I) e foi centrifugado por 1 minuto a 12.000xg. A seguir foram adicionados

500uL do tampão de lavagem II (Wash buffer II), e foi centrifugado a 12.000xg por

Figura – 5: Análise em gel de

agarose/formaldeído a 1%, do RNA

total obtido a partir de parasitas

adultos (1), ovos (2),

esquistossômulos (3); cercárias (4)

1 2 3 4


1 minuto e descartado todo o volume. Depois disso, a coluna foi transferida para o

tubo coletor e o RNA foi eluido em 30uL de água livre de RNAse e foi incubado por

1 minuto. Para recolher o RNA foi centrifugado por 12.000xg por 2 minutos, e

mantido a -70oC até o uso.

3.6. Quantificação de DNA e RNA

As concentrações de DNA e RNA foram estimadas a partir da medida de

absorbância a 260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm corresponde

aproximadamente a 50µg/mL de DNA (fita dupla) e 40µg/mL para RNA e DNA de

fita simples. O grau de pureza da preparação foi estimado através da relação entre

as leituras a 260 e 280nm. As preparações foram consideradas boas, quando o

valor da razão A=260/280 variou entre 1,8-2,2.

3.7 Obtenção dos cDNAs para a análise da expressão dos genes que

codificam para os componentes da via de sumorilação em S. mansoni

Para a técnica do RT-PCR, a primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando

o kit ThermoScript TM RT-PCR System (Invitrogen), 5ug de RNA total obtido como

descrito e como iniciador oligodT (50nmoles), exatamente como descrito no

boletim técnico do fabricante. Posteriormente, foram realizadas amplificações

utilizando 2µL desta reação, combinados com os oligonucleotídeos específicos


para a amplificação dos genes em estudo nesse trabalho, como indicado na

Tabela 02.

Tabela 02- Oligonucleotídeos utilizados neste estudo. Os clusters foram recuperados do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma e analisados conforme descrito no item 1. A seguir, utilizamos o programa Gene Runner para a idealização dos oligos

Para a obtenção do cDNA, utilizamos um programa de amplificação com 35

ciclos, cada um composto de uma etapa de desnaturação durante 1 minuto a

95°C, uma de anelamento do iniciador durante 1 minuto (conforme indicado na

Tabela 01) e uma de extensão durante 2 minutos a 72°C, utilizando como

polimerase a enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen). Como controle endógeno

utilizamos o gene da alfa-tubulina Uma alíquota de 10uL desta reação foi

analisada em gel de agarose a 1,5%.


3.8. Clonagem no vetor pGEMT – easy do transcrito obtido por PCR e

transformação em células competentes

Os cDNA amplificados foram posteriormente clonados no vetor pGEMT

easy (Promega), utilizando o kit conforme instrução do fabricante.

Cerca de 5,0 µL da reação de ligação foram utilizados nos procedimentos

de transformação. Nestes experimentos foram utilizadas células competentes

preparadas pelo método descrito por HANAHAN (1985)

O plasmídio foi introduzido em bactéria competente Escherichia coli da

linhagem DH5α, através de choque térmico (90 segundos a 42°C; 2 minutos em

banho de gelo), crescimento sob agitação em meio SOC (SOB enriquecido com

glicose) a 200 RPM e 37°C, por 1h e 30 min. Decorrido este intervalo, a

suspensão bacteriana foi plaqueada em meio LB/ampicilina contendo X-GAL

(20µL/mL), para a seleção dos plasmídeos com inserto (colônias brancas) e sem

inserto (colônias azuis) e mantidas em estufa durante uma noite a 37°C.

3.9. Minipreparação de DNA plasmidial

Cerca de 1,5 mL da cultura bacteriana crescida em LB/ampicilina, durante

uma noite foram transferidos para tubos "eppendorf" e o precipitado bacteriano, foi

obtido por centrifugação a 10.000 x g por 2 minutos.

Em seguida, este precipitado foi solubilizado em 300 µL de solução GTE-

RNase (500 mM TRIS-HCl; 10mM EDTA; 100 µg de RNase A; pH=8.0). Após 15


minutos de incubação à temperatura ambiente foram adicionados 300 µL de

solução NaOH-SDS (200mM NaOH;1% SDS) seguido de 5 minutos de incubação

à temperatura ambiente. Logo após, adicionou-se 300 µL de KOAc (3.0 M Acetato

de potássio; pH=5.5) e centrifugou-se durante 10 minutos a 14.000g. O

sobrenadante foi transferido para um novo tubo sendo adicionado a este, 400·µL

de isopropanol. Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos

a 14.000 x g à temperatura ambiente. Decorrido este intervalo de tempo, foi

descartado o sobrenadante e o precipitado resultante lavado com 700 µL de etanol

70%. As amostras foram novamente centrifugadas a 4-5oC por 5 minutos.

Por fim, descartou-se o etanol e o precipitado seco foi ressuspendido em 23

µL de água. Uma alíquota de 3 µL foi analisado em gel de agarose 0,8%.

3.10. Sequenciamento

Os plasmídeos bem como produtos de PCR foram seqüenciados utilizando

o kit Big Dye Terminator v3.0, exatamente como descrito no boletim técnico do

fabricante. As amostras foram analisadas em sequenciador automático de DNA

ABI 3100 (Applied Biosystems), seguindo protocolos já padronizados no nosso

Laboratório.

3.11. Análise computational das sequências

As sequências obtidas foram submetidas à busca de homologia com


nucleotídeos e aminoácidos utilizando os algoritmos BLASTn e BLASTx,

respectivamente, disponíveis no site www.ncbi.nlm.nih.gov. Também foram

utilizados os algoritmos pfam e PRODOM (www.expasy.org), para identificar os

domínos conservados nas sequências de aminoácidos preditas. As seqüências

foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW (www. ebi.ac.uk) e

posteriormente foram formatadas utilizando o programa boxshade

(http://www.ch.embnet.org/).

3.12. Análise da expressão diferencial dos genes que codificam para alguns

componentes da via de sumorilação utilizando PCR quantitativo

Para análise da expressão dos genes codificando para alguns componentes

da via de sumorilação em S. mansoni foi utilizada a técnica de PCR em tempo

real. Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 03)

utilizando o programa Vector NTI (INVITROGEN). As reações da PCR foram

realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG ROX

(INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação de PCR quantitativo

foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500 Applied

Biosystems. As análises foram feitas utilizando o método do ∆∆Ct, uilizando a

fórmula 2-∆∆Ct , para calcular a expressão gênica relativa dos genes em estudo,

conforme boletim técnico do fabricante do aparelho de qPCR (Applied

Biosystems).


Tabela 03- Oligonucleotídeos utilizados para o PCR quantitativo. Os clusters foram recuperados do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma geneDB e analisados conforme descrito no item 1. A seguir, utilizamos o programa VectorNTI (Invitrogen) para a idealização dos oligos. Como controle endógeno foi utilizado o gene que codifica para alfa-tubulina.

Cluster Gene Seqüência Temperatura de

anelamento

tamanho

Smp016410 RanBP2 F5´TTGTCAGCGCGCCAAACTTTATC3´

R5´GGCACGGTTCTCAGCTGTTTGAA3´

60 391

Sm07718 PIAS1 F5´CATTCTTGAAGGTCGCATCGGTACA3`

R5´GGGTACCAATCGCCAATAACCATCT3`

60 370

Smp068320 Ulp1 F5´AGTCGGTTGGCGAGTGGTGGTT3´ R5´GCCTGAGAAGTGGATGCGATCAA3´

60 327

M80214(*) Alfa –

Tubulina

F5´ CGTATTCGCAAGTTGGCTGACCA3’ R5’ CCATCGAAGCGCAGTGATGCA´

60 377

(*) Webster et al Mol. Biochem. Parasitol. (1992)

3.13. Análise da expressão e tamanho dos trancritos utilizando Northern Blot

A confecção dos géis de agarose formaldeído 1% foi feita de acordo com

Maniatis et al., 1989. Para cada amostra de RNA total (10 a 20µg), foi adicionado

o tampão da amostra de RNA (formamida deionizada 62,5%, formaldeído 1,14M,

MOPS 1,25X, azul de bromofenol 0,25% e brometo de etídeo 0,5µg/mL de

concentração). As amostras de RNA foram desnaturadas a 65ºC por 15 minutos,

seguido de banho de gelo por 3 minutos, aplicadas nos poços de gel de agarose e

a corrida eletroforética foi ajustada para 90 a 100 volts.

Em seguida, o gel foi tratado com SSC 10X durante 1 hora, e os RNAs

transferidos para uma membrana de nylon Hybond N+(GE Healthcare) durante 16


horas. Posteriormente, o sistema de transferência foi desmontado, as membranas

lavadas durante 5 minutos em SSC 6X, colocada entre duas folhas de papel de

filtro 3mm, embrulhada em papel alumínio e incubado em estufa a 80ºC por 2

horas para permitir a imobilização dos RNA na membrana.

3.14. Preparo da sonda radioativa

Para a obtenção das sondas radioativas, utilizamos a técnica de Random

Primer Extension (FEINBERG & VOGELSTEIN, 1983), e o kit Random Primer

Labelling System (Invitrogen). Este procedimento permite obter fragmentos de

DNA marcados com 32P que podem ser empregados como sonda em

experimentos de hibridização. O método baseia-se na utilização de

hexanucleotídeos sintéticos aleatórios, como iniciadores para a polimerização de

qualquer segmento de DNA molde. Para que ocorra a síntese de uma nova fita,

são necessários uma mistura de deoxinucleotídeos e o fragmento Klenow da DNA

polimerase I. Neste caso, um dos deoxinucleotídeos, o dCTP, possui um 32P na

posição α.

Na reação de obtenção da sonda, cerca de 50-100ng do cDNA de interesse

foram desnaturadas por 5 minutos a 100°C, sendo em seguida adicionados 2µL de

cada um dos deoxinucleotídeos (dTTP,dGTP e dATP, na concentração final de

0,5mM) e 4µCi [α32P] dCTP e 1 unidade de DNA polimerase I (fragmento Klenow) e

água milli-Q estéril para completar um volume final de 50µL. A reação foi incubada a

temperatura ambiente por 1 hora, sendo posteriormente interrompida pela adição de


2µL de EDTA 0,5M. Em seguida, para a remoção dos nucleotídeos não incorporados,

a sonda foi purificada em coluna de Sephadex G-50, previamente equilibrada com

tampão NT (Tris-HCl 10mM, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM pH 8,0). A coluna foi

montada em pipeta Pasteur, contendo lã de vidro na sua extremidade e o

empacotamento feito por sedimentação. Foi adicionado à sonda, 7µL do corante blue

dextran e a mistura foi aplicada no topo da coluna. A sonda marcada, foi eluida no

mesmo tampão (NT), sendo recolhida em um tubo do tipo eppendorf.

3.15. Reação de hibridização

As membranas de nitrocelulose (contidas em saco plástico), inicialmente

foram pré-hibridizadas a 65°C, sob agitação moderada, por no mínimo 4 horas, em

uma solução previamente aquecida composta por: 6x SSC, 2x reagente de

Denhardt e 0,1% SDS (100mg/mL) e 20µg de DNA de esperma de salmão para

1mL de solução de pré-hibridização, por 4 a 6 horas sob agitação leve.

Posteriormente, foi adicionada a sonda previamente desnaturada, com uma

atividade específica de 2x108 cpm/µL. A incubação foi mantida por 16 horas. Em

seguida, para retirar o excesso de sonda não incorporada e remover os híbridos

não homólogos, as membranas foram lavadas sequencialmente, uma vez, com as

seguintes soluções:

1) Solução 1: SSC 2X, SDS 0,1X, 15 minutos a temperatura ambiente;

2) Solução 2: SSC 0,5X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com

agitação moderada;


3) Solução 3: SSC 0,1X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com

agitação moderada;

4) Solução 4: SSC 0,1X, SDS 1% por 30 minutos a 50°C, com agitação

moderada.

3.16. Autoradiografia

Para verificar as regiões de homologia, as membranas obtidas após a

reação de hibridização, foram levemente secas, em papel de filtro,

embrulhadas em filme de PVC e acondicionada em cassetes contendo

intensificador e expostas a filmes Kodak (X-OMAT-XAR-5). O período de

exposição variável de acordo com a intensidade do sinal, monitorada

previamente com contador VICTOREEN, modelo 489-110C.

As revelações foram feitas de acordo com as instruções do fabricante,

utilizando como solução reveladora o Revelador e Reforçador GBX e como

fixadora, o Fixador e Revelador GBX (KODAK).

3.17 Obtenção dos extratos totais e nucleares de parasitas adultos e

cercárias e Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1

A partir de parasitas adultos e cercárias foram preparados extratos de

proteínas totais. Os parasitas foram homogenizados no tampão (Tris 5mM pH 8,0;

glicerol 1%, EDTA 1mM; PMSF 1mM; DTT 1mM e MG132 1mM). Com o auxílio de


um politron, os parasitas foram homogenizados brevemente e centrifugados a

10.000 x g por 30 minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenandante foi

centrifugado a 40.000 x g por 60 minutos. A concentração protéica foi determinada

pelo método de Pierce (Smith, 1985). O extrato total foi analisado em SDS-PAGE

12% (Laemmli, 1970).

Para o extrato nuclear, os parasitas foram ressuspendidos no tampão RSB

(Tris 10mM pH 7,6; NaCl 10mM; MgCl2 3mM; Triton X-100 e PMSF 1mM),

homogenizados em politron e centrifugados a 2000 x g por 10 minutos a 4ºC. O

sobrenadante contendo a fração citosólica foi estocada a -70ºC. O precipitado

contendo os núcleos foi ressuspendido em tampão RSB e posteriormente

centrifugado como descrito. Finalmente os núcleos foram incubados por 45

minutos em tampão RSB acrescido de NaCl 0,8 M, para que ocorra a lise

osmótica dos núcleos, e centrifugados a 10.00 x g por 45 minutos 4ºC. O

sobrenadante foi dialisado por 3 horas em tampão E ( HEPES 20 mM pH 7,6;

MgCl2 ; EDTA 0,1 mM; DTT 1mM e PMSF 10mM). A concentração protéica foi

determinada pelo método de Pierce, conforme descrito no manual técnico do

fabricante e analisada por eletroforese SDS-PAGE.

Cerca de 20µg de proteína nucleares e citossólicas de vermes adultos bem

como as proteínas totais de cercárias, foram transferidos para uma membrana de

PVDF (Hybond –GE healthcare) e submetidas à análise por Western Blot. Após a

eletrotransferência em Mini-Protean a membrana foi bloqueada com 5% de leite

desnatado no tampão de bloqueio (Tris 1M pH 7,5; Tween 20). Depois da reação

de bloqueio as membranas foram incubadas com o anticorpo primário (diluição

1/500) anti-SUMO (Santa Cruz Biotechnologies), por 4 horas. Decorrido este


tempo as membranas foram lavadas e posteriormente incubadas com o anticorpo

secundário Anti IgG de cabra biotinilado (Calbiochem) conjugado à fosfatase

alcalina ( diluição 1/1000) por 1h e 30 minutos. A enzima foi detectada usando os

reagentes NBT/BCIP (INVITROGEN).

O procedimento acima também foi realizado utilizando como anticorpo

primário anti-Ubc9 (santa Cruz biotech) e anticorpo secundário anti-IgG de coelho

(Calbiochem).

3.18. Determinação da estrutura genômica dos genes que codificam para

SUMO e Ubc9

3.19. Extração do DNA genômico

Os parasitas adultos mantidos –70 °C foram transferidos para um cadinho

de porcelana juntamente com gotas de nitrogênio líquido, com a finalidade de

facilitar a pulverização dos vermes. Em seguida, procedeu-se a extração do DNA

genômico, conforme o seguinte protocolo simplificado por Costa (Tese de

Doutorado, 1997).

Para cada 100 mg de verme pulverizado, foram adicionados 250 µL do

tampão de lise (Tris 0,05 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, 1% de N-laurilsarcosina e 100

µg/mL de proteinase K) e mantidos a 37 °C durante 1 hora . A seguir, foi

acrescentado 100µL de NaCl 5M e a mistura incubada por 10 minutos a 65°C e


posteriormente foi adicionado 50µL de uma solução de CTAB/NaCl a 10%,

seguido por uma incubação de 20 minutos a 65°C.

O DNA foi extraído com clorofórmio (v:v) e posteriormente precipitado pela

adição (v/v) de isopropanol. Após 30 minutos de incubação à -20°C, o DNA foi

centrifugado a 12000 x g, lavado com etanol a 70%, seco, ressuspenso em água e

armazenados a 4°C.

Na Figura 6, está apresentada uma análise em gel de agarose de uma

preparação de DNA genômico, realizada como descrito acima. Este método

permite a obtenção de DNA íntegro.

3.20. Amplificação das seqüências de SUMO a partir do DNA genômico

Cerca de 50 ng de DNA genômico foram utilizados nas amplificações. Os

componentes da mistura de reação foram: água (livre RNAse); tampão para

enzima Taq DNA polimerase; MgCl2; oligos direto e reverso; dNTPs; 50 ng de

DNA genômico; Taq DNA polimerase. Como iniciadores foi utilizado o par de

Figura – 6: Análise em gel de agarose 0,7% do DNA genômico obtido através de parasitas adultos.Marcador de peso molecular λDNA-HindIII.


oligos SUMO gene específico.

A reação de amplificação consistiu de 40 ciclos de desnaturação a 95°C por

45 segundos; emparelhamento ou anneling dos oligonucleotídeos conforme a

Tabela 1 por 1 minuto e extensão a 72°C por 1min e 20 seg. O produto da reação

de PCR foi analisado em gel de agarose 1,5%.

3.21. Estimativa do número de cópias dos genes por Southern blot

Cerca de 10µg do DNA genômico foram digeridos com 5U/µL de cada

enzima de restrição, e a digestão se procedeu durante uma noite. Resultados

ilustrativos estão mostrados na Figura 9.

Os fragmentos de DNA gerados foram separados em gel de agarose 0,7%,

utilizando corrente de 60mV em tampão TAE (Tris-Acetato 0,04M,EDTA 1mM). O

padrão de peso molecular utilizado foi o de 1Kb (GIBCO-BRL).

Após a eletroforese, o gel foi tratado como segue:

1) Lavagem em solução despurinizante – HCl 0,25M

2) Lavagem em solução desnaturante – NaOH 0,5M/NaCl1,5M

3) Lavagem em solução neutralizante – Tris-HCl 0,5M/NaCl 1,5M pH=7,5.

Todas as lavagens foram realizadas durante 30 minutos e sob agitação

constante. O sistema de transferência de DNA por capilaridade foi montado de

acordo com a técnica descrita por SOUTHERN, 1975. Uma membrana do

tamanho exato do gel foi umedecida com SSC10X e colocada sobre o mesmo. A

membrana, então foi recoberta com três folhas de papel de filtro Whatman 3mm e


uma pilha de 8cm de papel poroso (todos os papéis do mesmo tamanho do gel) e

por fim, um peso de aproximadamente 500 gramas. Decorridas 18 horas, o

sistema foi desmontado, a membrana foi lavada com SSC 6X e o DNA,

imobilizado na membrana no forno a 80ºC por 2 horas.

As sondas forma preparadas e marcadas conforme descrito no item 3.14. As

membranas foram hibridizadas, lavadas com solução de alta estringência e

autoradiografadas, conforme descrito nos itens 3.15 e 3.16 respectivamente.

Figura – 7: Perfil de digestão do DNAg. Aproximadamente 10µg do DNAg extraído a partir de parasitas adultos (casais) foram digeridos com as seguintes enzimas de restrição: (1) ECORI; (2) HindIII; (3) Bgl II; (4) PstI

PM 1 2 3 4

4. Resultados

SUMO (Small Ubiquitin Modifier)

__________________________________________________________ Resultados 50

4.1. Análise in silico da via de sumorilação em S. mansoni.

As seqüências correspondentes à via de sumorilação foram obtidas através

da busca por identidades de seqüência em relação aos bancos de dados da

FAPESP, geneDB (Sanger & Welcome Trust) e TIGR (The Institute for Genomic

Research). Atualmente sabe-se que já estão anotados praticamente 92% do

transcriptoma do parasita, o que corresponde a aproximadamente 14.000 genes

(Verjovski et al 2004). Diante deste fato, neste trabalho traçamos um perfil,

reconstituindo praticamente toda a via de sumorilação neste parasita. Como

podemos observar pela análise da Tabela 04, o parasita apresenta todos os genes

que codificam para as proteínas que a célula necessita para sumorilar um

substrato alvo, ou seja, a proteína SUMO, a enzima conjugadora Ubc9, as

enzimas E3 ligases dos tipos PIAS, e RanBP2, as proteases especificas de SUMO

– do termo em Inglês - SUSP, ou ULP 1 (Ubiquitin-like protease) que são

responsáveis tanto pela de-sumorilação de um substrato alvo, quanto pela

maturação de SUMO, tornando esta em sua forma ativa.

Na Tabela 04 observamos que as seqüências dos componentes da via de

sumorilação, foram montadas a partir de seqüências provenientes de vários

estágios do parasita, indicando que esta via se encontra presente e pode estar

ativa em todos estágios, salvo algumas diferenças de expressão de alguns genes

que podem ocorrer ao longo do desenvolvimento.

__________________________________________________________ Resultados 51

Tabela 04: Panorama geral das seqüências de DNA que codificam para a via de sumorilação depositadas nos bancos de dados de projetos de sequenciamento em larga escala do parasita S. mansoni. Os números de acesso na Tabela se referem aos bancos de dados da FAPESP, organizado pelo consórcio de sequenciamento do transcriptoma do parasita (São Paulo, Brasil), e aos bancos de dados GeneDB organizado pelo Sanger Centre –Welcome Trust (UK), e TIGR (US).

Biblioteca homologia Numero de acesso

Transcriptoma São Paulo

Numero de acesso GeneDB.org e

TIGR

Adultos Smt3 601278 Smp045510

esporocisto Smt3

miracideos Smt3

ovos SAE subunit 2 Sm11888

esquistossômulos SAE subunit 2

702113 710176

Adultos UBC9 604764 610543

TC17938 TC19135*

ovos 718421 604326 603621 607598 611539 700408

Sm07718

SUMOE3/PIAS SumoE3/Pias

Adultos SUMOE3/RanBP2/Nup358 Smp016400

ovos SUMOE3/RanBP2/Nup358 Smp016410

esporocistos SUMOE3/RanBP2/Nup358

miracideos SUMOE3/RanBP2/Nup358

Cercarias SUMOE3/RanBP2/Nup358

esquistossomulos SUMOE3/RanBP2/Nup358

607171 601355

Adultos SUMO specific protease Sm24864

esporocistos SUMO specific protease Sm05075

ovos SUMO specific protease Sm00592

miracideos SUMO specific protease Smp068320

esquistossômulos SUMO specific protease

612155 602232 603232 603433

(*) as TCs em asterísticos indicam as seqüências que foram retiradas do banco da Tigr.

__________________________________________________________ Resultados 52

4.2. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do cDNA codificando

para SMT3C em S. mansoni

Para a validação dos resultados in silico foram desenhados

oligonucleotídeos que compreendiam a região codificadora do gene de SMT3C ou

SUMO-1. Após o RT-PCR obtivemos um cDNA que apresentou um tamanho de

270bp e codifica para uma proteína de 90 aminoácidos e após isso passamos a

denominar esse gene de SmSMT3C (Figura 7).

O cDNA foi submetido à análise de seqüência utilizando os algoritmos

BLASTn para nucleotídeos e BLASTx para aminoácidos. Posteriormente a

seqüência predita de aminoácidos foi alinhada com as seqüências provenientes de

outros organismos utilizando o programa CLUSTALW presente no site

www2.ebi.ac.uk/clustalw. O resultado apresentado na Figura 8 representa essa

análise, e mostra que essa proteína predita de S. mansoni,é bem conservada

entre os seus ortólogos. Além disso, podemos observar que a SmSMT3C,

apresenta o domínio ubiquitina, importante para a formação da estrutura

tridimensional característica dessas proteínas e também para a conjugação

dessas proteínas aos seus substratos alvo.

Outra característica importante que podemos destacar na seqüência predita de

aminoácidos é a presença do motivo Gli-Gli na sua porção C-terminal, motivo este,

responsável pela modificação pós-traducional por SUMO das proteínas celulares. A

análise da seqüência predita da proteína também nos levou a constatar que tanto S.

mansoni quanto outros invertebrados como D. melanogaster, C. elegans e a levedura

S. pombe, não apresenta o motivo ψKXE, como circulado na Figura 8, esse motivo

__________________________________________________________ Resultados 53

pode ser reconhecido por Ubc9 levando a autosumorilação (Chen 2004). A razão

pela qual isso ocorre ainda permanece a ser elucidada.

Figura - 8: Alinhamento da seqüência predita de proteínas de SmSMT3C em relação aos outros organismos, mostrando que SmSMT3C é bastante conservada em relação aos seus ortólogos. As abreviaturas são: Rn (Rattus norvegicus ); Hs (Homo sapiens); Sc (Saccharomyces .cerevisiae ); Mm (Mus musculus); Dm (Drosophila melanogaster ); Sm (Schistosoma .mansoni); Sj (Schistosoma japonicum ); Ce (Caenorhabditis elegans) Cb (Caenorhabditis briggsae) At (Arabidopsis thaliana) Sp (Schizosaccharomyces pombe).O domínio circulado se refere ao domínio conservado de SUMO ΨKXE, onde Ψ é um aminoácido hidrofóbico, K é uma lisina, X é qualquer aminoácido e E é glutamato.

Figura 7: Amplificação do gene que codifica para SMT3C por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos.(1) cDNA SmSMT3C em vermes adultos de tamanho 270pb. (MW) Padrão de peso molecular de 100 pb (Invitrogen)

__________________________________________________________ Resultados 54

A filogenia molecular é uma forma de análise, pela qual podemos agrupar

seqüências de organismos diferentes, e desta forma avaliar as semelhanças bem

como a conservação dessas seqüências ao longo da evolução das espécies.

Através da Figura 9, podemos dizer que a seqüência de SmSMT3C é bem

conservada entre as espécies analisadas e que essas seqüências foram divididas

em dois clados distintos, onde as seqüências de S. mansoni e S. japonicum se

encontram em um ramo específico, próximo ao ramo de D. melanogaster e das

seqüências de H. sapiens e R. norvegicus.

Figura 9: Análise filogenética para SmSMT3C e seus ortólogos. A árvore filogenética foi calculada utilizando neighbor-joining contido no programa Mega 3.0. As distâncias lineares entre as seqüências homólogas são inversamente proporcionais às seqüências de aminoácidos.

Schistosoma mansoni

Schistosoma japonicum

__________________________________________________________ Resultados 55

4.3. Estrutura genômica do gene SmSMT3C e número de cópias desse gene

por genoma haplóide.

O DNA genômico do parasita S. mansoni for extraído pelo método do CTAB

e amplificado por PCR como descrito em Materiais e Métodos. Na Figura 10A,

mostramos o resultado dessa amplificação, onde obtivemos um produto de

aproximadamente 400pb. O alinhamento desse produto seqüenciado em relação

ao cDNA (Figuras 10B e 10C) mostra, que a região codificadora desse gene é

interrompida por dois pequenos íntrons de 28 e 36 pb. Além disso, também o gene

desse parasita apresenta os sítios conservados GT....AG, que são requeridos pela

maquinaria de processamento do mRNA eucariótico.

__________________________________________________________ Resultados 56

genomica ATGACTGATAGTGCCAATAAGGTAAGCATTTTTGCGATATAAATACTATTTTTCTGATGA 60 cDNA -----------------------------------------------------GGCACGA 7 * ** genomica TGGTAACCAAAGAATTTCTTAAT-TAATTCAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCA 119 cDNA GGTTTGTCGGGATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCA 67 * * * * ** * * * ****************************** genomica AAGTGCAAGGACAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCA 179 cDNA AAGTGCAAGGACAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCA 127 ************************************************************ genomica AGAAATTAATTACTGCTTACTGCGATCGATTAGTAAGCATTTGATCAGCATATACTCAAT 239 cDNA AGAAATTAATTACTGCTTACTGCGATCGATTAG--------------------------- 160 ********************************* genomica CTCCTTTAGGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGAAACAGCGTTCAT 299 cDNA ----------GCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGAAACAGCGTTCAT 210 ************************************************** genomica GAAACTGATACTCCTGGCTCGGTAAGTTAACCTTATAGTTCACATTAAAATTTATAGTTG 359 cDNA GAAACTGATACTCCTGGCTCG------------------------------------TTG 234 ********************* *** genomica GAAATGGAAGAAAATGATACCGTTGAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTG------ 413 cDNA GAAATGGAAGAAAATGATACCGTTGAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 294 ******************************************************

Figura 10: Organização genômica do gene SmSMT3C em S. mansoni. (A) Amplificação do DNA genômico por PCR usando os oligonucleotídeos específicos para o gene que codifica para SMSMT3C. (B) e (C) Organização estrutural do gene SmSMT3C. Representação esquemática da região codificadora e a localização genômica dos éxons e suas posições relativas. O primeiro íntron contém 28pb e o segundo contém 36pb. MW representa o peso molecular de 1Kb (Invitrogen). Os nucleotídeos sublinhados indicam os sítios conservados de splicing.

A B

C

DNA genômico

cDNA

__________________________________________________________ Resultados 57

O número de cópias que esse gene apresenta por genoma haplóide foi

investigado, utilizando a técnica de Southern Blot. Foram utilizadas as enzimas

EcoRI, que apresenta o sítio interno, na seqüência se SmSMT3C, e as enzimas

HindIII, BglII, PstI, que não apresentam sítio interno na seqüência de S. mansoni.

Pela análise da autoradiografia podemos sugerir, que esse gene possui duas

cópias por genoma haplóide do parasita (Figura 11).

Figura 11: Southern Blot utilizando o gene SmSMT3C como probe. O DNA genômico de S. mansoni foi digerido com EcoRI e apresenta sítio interno na seqüência de SmSMT3C; HindIII ;BglII;PstI.

Eco

RI

Hin

dIII

Bgl

II P

stI

__________________________________________________________ Resultados 58

4.4 Expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de vida do

parasita.

4.4.1- Padrão de transcrição de SmSMT3C no ciclo de vida do parasita

Através da técnica de RT-PCR podemos estudar a expressão desse gene

no ciclo de vida do parasita. Na Figura 12 podemos observar que o gene que

codifica para SmSMT3C apresenta expressão durante o ciclo de vida do parasita.

Figura 12: RT-PCR para o gene SmSMT3C no ciclo de vida do parasita. Aproximadamente 1ug de RNA foi utilizado para a síntese da primeira fita. Foram aplicados 10ul do produto da PCR no gel de agarose 1% e corados com Brometo de etídeo (Invitrogen). Como controle endógeno utilizamos o gene que codifica para α-tubulina.

PM

Ver

mes

adu

ltos

Ovo

s E

squi

stos

sôm

ulos

ce

rcár

ias

__________________________________________________________ Resultados 59

4.4.2 Northern Blot

Através da técnica de Northern Blot, utilizando RNA total, avaliamos a

expressão do gene SmSMT3C, estimamos o tamanho desse transcrito e a presença

de uma ou várias mensagens. O resultado do Northern Blot apresentado na Figura

13, mostra que coexistem dois transcritos de tamanhos 1,0 e 1,8 Kb respectivamente,

sendo o transcrito de 1,0Kb mais abundante do que o transcrito de 1,8 Kb.

4.4.3 - Detecção dos conjugados sumorilados

Para realizarmos o experimento de Western Blot, utilizamos o anticorpo

anti-SUMO 1 humano (Santa Cruz, biotechnologies). Conforme podemos verificar

na Figura 14B, S. mansoni apresenta várias bandas, o que significa a presença de

vários conjugados sumorilados tanto em extratos nucleares e citoplasmáticos de

vermes adultos (canaletas 1 e 2) quanto em extrato total de cercárias (canaleta 3).

Figura 13: Northern Blot utilizando como sonda o gene SmSMT3C em S. mansoni. A autoradiografia mostrou duas bandas de diferentes intensidades de tamanhos 1,0 e 1,8 Kb respectivamente. O gene que codifica para α-tubulina,foi utilizado como controle constitutivo.

1,8

1,0

α-tubulina

__________________________________________________________ Resultados 60

Como podemos avaliar através da Figura 14B, os conjugados sumorilados se

encontram mais expressos na fração protéica nuclear do que na fração citossólica.

A

Figura 14: Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1. Aproximadamente 20ug do extrato nuclear, citoplasmático de vermes adultos e extratos totais de cercárias obtidos como descrito em Materiais e Métodos, foram analisados através de um gel SDS-PAGE 10%, seguido por Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1. (A) Gel réplica corado com Comassie Brilliant Blue. (B) Detecção dos conjugados sumorilados. As setas indicam os conjugados sumorilados nas fases correspondentes. Como controle endógeno dos extratos citoplasmáticos e totais foi utilizado o anticorpo anti- β-actina de camundongo.

PM

nú

cleo

ci

topl

asm

a

cerc

ária

s

188

62

49

28

14

kDa

núcl

eo

cito

plas

ma

ce

rcár

ias

188kDa

28kDa

β-actina 43kDa

B

__________________________________________________________ Resultados 61

Enzima E2 conjugadora de SUMO – Ubc9

__________________________________________________________ Resultados 62

4.5. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do gene que codifica

para a enzima conjugadora E2 de SUMO (Ubc9).

Assim como anteriormente descrito para o gene SmSMT3C, foram

desenhados oligonucleotídeos específicos para a região codificadora do gene de

SmUbc9. Após o RT-PCR, verificamos a amplificação de um transcrito de 450 pb

conforme mostrado na Figura 15, que foi seqüenciado conforme descrito em

Materiais e Métodos e foi posteriormente denominado SmUbc9.

Figura 15: Amplificação do transcrito que codifica para SmUbc9 em S. mansoni. Aproximadamente 1ug de RNA total foram utilizados para a síntese da primeira fita de cDNA. Cerca de 10uL da reação de PCR foram analisados em gel de agarose 1% e corados com Brometo de etideo (Invitrogen).

O alinhamento da proteína predita de S. mansoni utilizando ClustalW,

mostrou a presença do domínio UBC (Ub- conjugating enzyme catalytic)

conservado (Figura 16). Este domínio é responsável pela atividade catalítica da

enzima, ou seja, pela ligação tiól-ester, que esta enzima realiza em seus

substratos alvo.

PM 1

450 pb

__________________________________________________________ Resultados 63

Figura 16: Alinhamento da proteína predita SmUbc9 em relação aos outros organismos. O alinhamento mostra que SmUbc9 é bastante conservada em comparação com outros organismos. As abreviaturas são: Sm (S. mansoni); Sj (S. japonicum) Hs (H. sapiens); Gg (Gallus gallus) Dm (D. melanogaster); Ce (C. elegans) At (A. thaliana); Sc (S. cerevisiae); Tb (Trypanosoma brucei); Pf (Plasmodium falciparum); Gl (Giardia lamblia). O retângulo assinalado representa o domínio cisteíno protease característico da Ubc9.

__________________________________________________________ Resultados 64

Na Figura 17, mostramos um resultado de filogenia molecular, para

reforçarmos a conservação de SmUbc9 em relação aos outros organismos e

também mostrarmos que a seqüência de proteína de S. mansoni, está

filogenéticamente próxima da seqüência do parasita S. japonicum, assim como de

outros organismos como C. elegans e D. melanogaster.

Figura 17: Filogenia molecular para a seqüência predita de aminoácidos de SmUbc9 e sua conservação em relação aos seus ortólogos. A árvore filogenética foi calculada usando o algoritmo neighbor-joining presente no programa MEGA 3. As distâncias lineares entre as seqüências homólogas são inversamente proporcional às similaridades entre as seqüências de aminoácidos.

__________________________________________________________ Resultados 65

4.6. Estrutura genômica do gene que codifica para SmUbc9 em S. mansoni

O DNA genômico foi extraído conforme descrito em Materiais e Métodos e

foi utilizado para a reação de PCR para determinarmos a estrutura genômica, ou

seja, a estrutura éxon-íntron, e também o número de cópias por genoma haplóide

correspondente ao gene SmUbc9. A reação de PCR mostrou-nos um produto

amplificado de 500 pb, que foi clonado, seqüenciado e alinhado com a seqüência

de cDNA para investigarmos a presença de íntrons. Na Figura 18 A, mostramos a

banda de 500 pb correspondente à amplificação do DNA genômico utilizando os

oligonucleotídeos específicos para o gene SmUbc9. O alinhamento da seqüência

do cDNA versus a seqüência genômica, mostrou que a seqüência genômica do

gene SmUbc9 é interrompida por dois pequenos íntrons e apresenta a seqüência

de splicing não canônico AT...AC (Figuras 18B/C).

__________________________________________________________ Resultados 66

cDNAUBC9 TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTT 59 GenomicUBC9 TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTT 60 *********************************************************** cDNAUBC9 TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGT 119 GenomicUBC9 TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGT 120 ************************************************************ cDNAUBC9 GATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT----------------------------- 150 GenomicUBC9 GATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATCTTATAGCATGTTAAAAAGGAGTTTCTTT 180 ******************************* cDNAUBC9 ------TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAG 204 GenomicUBC9 AGATACTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAG 240 ****************************************************** cDNAUBC9 ACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTT 264 GenomicUBC9 ACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTT 300 ************************************************************ cDNAUBC9 GGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTC 324 GenomicUBC9 GGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTC 360 ************************************************************ cDNAUBC9 CCACAATGT-------------------------------------GCCTTTTTTCCCAG 347 GenomicUBC9 CCACAATGTCTAAATAGCTTTAAAAAGAGTATACTATGGATCTTACGCCTTTTTTCCCAG 420 ********* ************** cDNAUBC9 GTATACTACAATTCCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400 GenomicUBC9 GTATACTACAATTCCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 473

Figura 18: Amplificação do DNA genômico utilizando os oligonucleotídeos específicos para o gene SmUbc9. (A) Produto da PCR para SmUBC-9 genômica. (B) Organização estrutural do gene SmUBC-9. Representação esquemática da região codificadora e da localização genômica dos exons e suas posições relativas. O primeiro íntron contém 37 pb e o segundo contém 35 pb. MW é o peso molecular de 100 bp (Invitrogen). (C) Alinhamento da seqüência do cDNA com a seqüência genômica para o gene SmUbc9. As seqüências sublinhadas significam as junções de splicing não-canônicas AT...AC.

C

A B

ATG STOP

1 151 187 369 409 473

DNA Genômico

cDNA

__________________________________________________________ Resultados 67

4.7. Expressão do gene que codifica para o gene SmUbc9 no ciclo de vida do

parasita.

4.7.1 - RT-PCR

Através do método do Trizol (Invitrogen) descrito em Materiais e Métodos, o

RNA das diversas fases do ciclo de vida do parasita, ou seja, vermes adultos,

cercárias, ovos e esquistossômulos foram extraídos e submetidos à reação de RT-

PCR. Na Figura 19, mostramos os transcritos resultantes, e verificamos que o gene

que codifica para SmUbc9 é expresso em todas as fases do ciclo de vida avaliadas.

Figura 19: Expressão do gene SmUbc-9 no ciclo de vida S. mansoni. Cerca de 50 nanogramas of mRNA de vermes adultos, cercárias, esquistossômulos e ovos foram utilizados para a avaliar a expressão desse gene no ciclo de vida do parasita. Aproximadamente 10uL do produto amplificado foram analisados em gel de agarose 1,0% e corados com Brometo de etídeo. Como controle endógeno foi utilizado o gene que codifica para α-tubulina.

PM

V

erm

es a

dulto

s C

ercá

rias

Esq

uist

ossô

mul

os

ovos

__________________________________________________________ Resultados 68

4.7.2 – Northern Blot

O RNA de vermes adultos, obtido como descrito anteriormente, foi

submetido à eletroforese em gel de agarose/formaldeído (Maniatis et al, 1989) e

posteriormente transferido para uma membrana de náilon e hibridizado utilizando

como sonda o cDNA que codifica para o gene SmUbc9. Na Figura 20, podemos

observar que SmUbc9 apresenta apenas um transcrito de tamanho aproximado de

1,32 Kb.

Figura 20: Northern Blot utilizando o cDNA de SmUbc9 como probe. Como controle endógeno foi utilizando o gene que codifica para α-tubulina de S. mansoni

4.7.3 – Western Blot

Para avaliar a funcionalidade da via de sumorilação em S. mansoni e

aproveitando a similaridade de seqüência entre SmUbc9 e outros organismos,

α-tubulina

Ubc9 1,32Kb

__________________________________________________________ Resultados 69

procedemos à técnica de Western Blot, utilizando o anticorpo anti-ubc9 humano

(Santa Cruz, biotechnologies). Na Figura 21 podemos observar que a proteína

Ubc9 se encontra na sua forma não conjugada tanto no extrato nuclear, quanto no

extrato citoplasmático do parasita e apresenta um peso molecular de

aproximadamente 20 KDa, conforme descrito por Kovalenko et al 1995.

Figura 21: Western blot da proteína SmUbc9 utilizando anticorpo anti-Ubc9. Aproximadamente 20ug do extrato total de vermes adultos obtido como descrito em Materiais e Métodos foram analisados através de um gel SDS-PAGE 10%, seguido por Western Blot utilizando o anticorpo anti-Ubc9 humano (Santa Cruz Biotech). (A) Gel réplica corado com Comassie Brilliant Blue. (1) núcleo (2) citoplasma. (B) Detecção da proteína Ubc9. Como controle dos extratos citoplasmáticos foi utilizado o anticorpo anti-β-actina de camundongo.

A

PM

nú

cleo

ci

topl

asm

a

188

62

49

28

14

kDa

B

20 KDa

Núc

leo

Cito

plas

ma

β-actina 43kDa

__________________________________________________________ Resultados 70

4.8 Caracterização do pseudogene ψ SmUbc9 em S. mansoni.

Através da análise dos bancos de dados, FAPESP, TIGR e geneDB, foram

selecionados duas seqüências que apresentavam homologia com as seqüências que

codificam para a enzima conjugadora de SUMO, a proteína Ubc9. Essas entradas

foram analisadas utilizando o programa ORFinder no site www.ncbi.nih.nlm.gov e

podemos verificar que o cluster 604764, apresenta uma ORF aberta, que codifica

para a proteína Ubc9 como demonstramos nos itens anteriores, através da estrutura

genômica desse gene, bem como da sua expressão no ciclo de vida do parasita .

Desta forma primeiramente foi necessário avaliar se a seqüência referente

à entrada 610543 (ou TC19135) apresentava uma ORF aberta. Conforme

podemos verificar na Figura 22, esse gene apresenta várias interrupções,

causadas por códons de parada em sua seqüência de DNA. Assim as análises “in

silico” apontam para um possível pseudogene em S. mansoni, visto que esse gene

não é capaz de codificar uma proteína funcional. Porém as análises “in silico” não

foram suficientes para afirmar se a seqüência identificada no projeto genoma,

seria um candidato a ser um pseudogene, pois interrupções muitas vezes podem

indicar erros de sequenciamento.

Figura 22: Representação esquemática da interrupção do código aberto de leitura (ORF) do ψSmUbc9 por códigos de parada. A seqüência foi submetida ao programa ORF finder, e verificamos que a ORF do ψSmUbc9 é interrompida em vários locais, impossibilitando a origem de uma proteína funcional

__________________________________________________________ Resultados 71

4.9 – Sequenciamento das seqüências genômica e do cDNA do gene

ψSmUbc9

Para confirmar a possibilidade, que o possível transcrito possa ser um

transcrito biológico e não um artefato de sequenciamento foram desenhados

oligonucleotídeos específicos e procedemos aos experimentos de RT-PCR e o PCR

genômico e posteriormente sequenciamos os produtos da PCR, utilizando o kit Big

Dye v3.0 (Applied Biosystems), conforme descrito em Materiais e Métodos. O

transcrito resultante do RT-PCR mostrou-nos um tamanho de 500 pb, conforme

indicado na Figura 23 A. Na amplificação do DNA genômico, verificamos uma banda

de 600 pb (Figura 23B)

Figura 23: Amplificação do gene ψ SmUbc9 por PCR utilizando os oligonucleotídeos específicos. Cerca de 1ug de RNA ou DNA genômico foram utilizados na reação da PCR e foram analisados 10uL de do produto da PCR e corados com Brometo de Etídeo (Invitrogen). (A) RT-PCR do transcrito de ψUbc9. O resultado da PCR amplificou um produto de 500 pb de tamanho (1). PM é o peso molecular de 100pb (Invitrogen). (B) PCR genômico. (1) Amplificação de um produto de 600 pb.

Conforme descrito acima, esses produtos foram seqüenciados e podemos

alinhar essas duas seqüências e excluir a hipótese de artefato de

PM 1

600pb

B A

500pb

__________________________________________________________ Resultados 72

sequenciamento, visto que a região do cDNA que tem identidade com a proteína,

se alinhou perfeitamente com a sequencia genômica , sem interrupções ou falhas,

exceto àquelas regiões interrompidas por íntrons (Figura 24). Desta forma, este

critério assegura que as interrupções dentro da seqüência de cDNA não

correspondem a interrupções na seqüência genômica. Portanto através dos

resultados de RT-PCR e PCR genômico, podemos sugerir que se trata mesmo, de

um gene presente no genoma do parasita que não possui código aberto de leitura,

o que por definição pode se tratar de um pseudogene, que contém 1 íntron retido

conforme mostrado na Figura 24.

ΨUbc9cDNA GCTTTTTACCCGACTGTCGTATTCTCCTTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCNTCAG 60 ΨUbc9gen --------------TGTCGTATTCTT-TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAG 45 *********** **************************** **** ψUbc9cDNA CTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTGATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT-- 118 ΨUbc9gen CTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTGATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATCT 105 ********************************************************** ψUbc9cDNA ---------------------------------TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCA 145 ΨUbc9gen TATAGCATGTTAAAAAGGAGTTTCTTTAGATACTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCA 165 *************************** ψUbc9cDNA ATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATG 205 ΨUbc9gen ATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATG 225 ************************************************************ ΨUbc9cDNA GAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTA 265 ΨUbc9gen GAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTA 285 ************************************************************ ΨUbc9cDNA CATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGT------------------------ 301 ΨUbc9gen CATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTCTAAATAGCTTTAAAAAGAGTATA 345 ************************************

Figura 24: Alinhamento do ψSmUbc9 cDNA em relação a seqüência genômica desse pseudogene. As seqüências foram alinhadas utilizando ClustalW presente no site www.ebi.ac.uk. A seqüência genômica possui íntrons, e também possui as seqüências de junção de splicing não-canônico AT...AC (sublinhadas na Figura), que caracterizam um splicing de mRNA eucariótico.

__________________________________________________________ Resultados 73

4.10 – Determinação do número de cópias dos genes SmUbc9 e ψSmUbc9

em S. mansoni

Outra questão que nos chamou atenção foi à origem do pseudogene, se ele

foi um resultado de retroposição, ou se derivava de uma duplicação gênica.

Alguns estudos que correlacionam a origem de pseudogenes por retroposição,

afirmam que esses pseudogenes, devem possuir uma cauda de poliadenilação,

não possuírem íntrons e possuírem uma ORF truncada. Através do

sequenciamento, verificamos que a seqüência genômica do gene ψSmUbc9 é

interrompida por um íntron e pelo menos nos nossos resultados de

sequenciamento, visto que a seqüência pode não estar completa, não verificamos

a presença de cauda de poliA (Figura 24). Para avaliar se esse gene poderia ser

resultado de uma duplicação gênica, avaliamos por Southern Blot o número de

cópias desse gene, comparado com o gene estrutural de Ubc9.

Para realizarmos o Southern Blot, digerimos o DNA genômico o parasita com

enzimas de restrição. O gene estrutural SmUbc9 foi digerido com quatro enzimas de

restrição KpnI (para a qual existe um sítio interno no gene de Ubc9), EcoRI, XhoI e

HindIII tranferimos para a membrana de Nylon (HybondN+) e utilizamos o gene

SmUbc9 como sonda (Figura 25). Para o pseudogene ψSmUbc9, realizamos a

digestão com cinco enzimas de restrição, ou seja, Sau3A (a qual existe sítio interno

no gene ψUbc9), EcoRI, SalI, BamHI e XhoI e hibridizamos usando o produto de

PCR ψSmUbc9 genômico como sonda (Figura 26). Os resultados da hibridização

indicaram que existe, apenas uma cópia por genoma haplóide de ambos os genes,

indicando que pode ter ocorrido uma duplicação do DNA genômico, ocorrendo a

__________________________________________________________ Resultados 74

formação de dois genes distintos: um estrutural e funcional e um outro pseudogene, e

até o momento sem função conhecida.

Figura 25: Southern Blot utilizando como sonda o gene SmUbc9. O DNA genômico do

parasita foi digerido com quatro

enzimas de restrição: (1) EcoRI, (2)

XhoI, (3) HindIII e (4) KpnI. As setas

indicam o tamanho das bandas

resultantes da hibridização do DNA

genômico com o cDNA de SmUbc9.

20,6 Kb

21,2 Kb

Eco

RI

Xho

I H

indI

I K

pnI

Figura 26: Southern Blot utilizando como sonda o pseudogene ψSmUbc9. O DNA genômico do parasita S. mansoni, foi digerido com cinco enzimas de restrição: Sau3A, EcoRI, SalI,BamHI e XhoI. As setas indicam os tamanhos das bandas resultantes da hibridização do DNA genômico.

Sau

3A

SalII

Bam

HI

Xho

I

Eco

RI

23Kb

__________________________________________________________ Resultados 75

4.11 – Expressão do ψSmUbc9 nos estágios de desenvolvimento do parasita

Foi de nosso interesse também, investigar se esse pseudogene

apresentava expressão no ciclo de vida do parasita. Para isso extraímos RNA total

de vermes adultos, cercária e de ovos. O resultado de RT-PCR indicou que esse

pseudogene se encontra expresso apenas nas formas adultas do parasita, como

está indicado na Figura 27.

PM 1 2 3 C

500 pb

Tubulina

Figura 27: Expressão do pseudogene

ψSmUbc9 no desenvolvimento do

parasita. A expressão desse mRNA foi

avaliado nos estágios de (1) Vermes

adultos, (2) Cercárias, (3) Ovos. Cerca de

1,0ug de RNA cada estágio foram

utilizados para a síntese da primeira fita de

cDNA. A expressão do gene foi avaliada

em gel de agarose 1,0 % e corada com

brometo de etídeo (Invitrogen).

__________________________________________________________ Resultados 76

SUMO E3 Ligases

__________________________________________________________ Resultados 77

4.12. Anotação das enzimas E3 ligases e das proteases específicas de SUMO

De acordo com a Tabela 04, os genes do parasita S. mansoni estão

anotados nos bancos de dados seqüências que codificam para SUMO E3 ligases

do tipo PIAS e RanBP2, e também que codificam para proteases específicas de

SUMO. Em relação às seqüências que codificam para a E3 ligase do tipo PIAS, os

grupos de seqüências foram montados com seqüências oriundas dos estágios de

esporocistos, esquistossômulos e ovos. Para a protease específica de SUMO, os

grupos de seqüências foram montados com seqüências provenientes de adultos,

esporocistos, ovos, miracídios e esquistossômulos. Para RanBP2, as seqüências

foram montadas com seqüências vindas dos seis estágios avaliados.

Diante da possibilidade de uma eventual expressão diferencial estágio-

específica de SUMO E3 ligase e protease específica de SUMO, foram idealizados

oligonucleotídeos específicos, para avaliar a possível regulação estágio-

específica desses genes durante o desenvolvimento do parasita.

Os cDNAs obtidos através do RT-PCR foram seqüenciados e as

seqüências foram submetidas aos bancos de dados utilizando os algoritmos

Blastn para nucleotídeos e Blastx para proteína, em busca de homologia com as

seqüências depositadas. Os domínios conservados também foram avaliados

utilizando pfam que está presente em www.expasy .org.

__________________________________________________________ Resultados 78

4.13. Caracterização da seqüência da proteína predita da enzima E3 ligase

SIZ-PIAS em S. mansoni

Através da busca de homologias com o domínio MIZ-zinc finger, nos

bancos de dados do parasita S. mansoni, encontramos algumas seqüências que

possuíam o domínio SAP (Tabela 4). Dessas seqüências de DNA apenas duas

apresentavam os domínios SAP e MIZ-Zinc finger. Foi escolhida para posterior

análise àquela que apresentava homologia com a proteína predita PIAS1, a qual

apresenta atividade de SUMO E3-ligase descrita em outros organismos.

O domínio Miz Zinc finger tem atividade ligase para a conjugação de SUMO

aos substratos alvo e está envolvido no reparo do DNA e na organização

cromossomal. A proteína Miz1(Msx interacting zinc finger) contém um motivo dedo

de zinco e tem atividade especifica em ligação ao DNA, agindo como fator de

transcrição que modula positivamente a expressão gênica. Assim, Miz1 se liga à

proteína Msx2, acentuando a habilidade de se ligar ao DNA (Hochstrasser 2001).

Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 2),

que amplificavam a região de domínio Zf-Miz (Figura 29 A). O cDNA de

aproximadamente 400 pb foi seqüenciado (Figura 28) e a seqüência foi traduzida

utilizando o programa ORF finder, e foi sujeita a análise utilizando os algoritmos

Blast x e Blast p e pfam para busca de homologia com outras seqüências

depositadas nos bancos de dados.

__________________________________________________________ Resultados 79

Figura 28: cDNA codificando para PIAS em vermes adultos. O cDNA apresenta um tamanho de 400pb. Gel de agarose 1,2% corado com Brometo de etideo (Invitrogen). Peso molecular de 100 pb (invitrogen).

De acordo com o alinhamento mostrado na Figura 29 A e B, podemos notar

que a PIAS de S. mansoni, apresenta grande similaridade com o motivo SP-RING

presente nas outras proteínas PIAS de outros organismos. O motivo SP-RING

apresenta uma seqüência consenso SX2CX15CX1HX2C/SX17CX2C faltando duas

cisteínas, quando comparado com o motivo RING clássico, e ainda não está

completamente elucidado se este motivo se dobra em uma estrutura

tridimensional compatível para a ligação de Zn2+ (Melchior e Pichler, 2004). No

motivo SP-RING também, nota-se a presença do aminoácido triptofano (W)

conservado no meio da seqüência SP-RING e acredita-se que esse aminoácido

seja essencial na função E3 ligase, visto que quando ocorre uma mutação nesse

triptofano, a atividade E3 ligase fica comprometida (Kotaja et al 2002).

PM

P

IAS

400 pb

__________________________________________________________ Resultados 80

A

B

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ra 2

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anso

ni

__________________________________________________________ Resultados 81

Como podemos observar, a seqüência predita de PIAS de S. mansoni,

apresenta o domínio SP-RING bastante conservado, apresentando a estrutura

característica SX2CX15CX1HX2C/SX17CX2C. Na seqüência do parasita, apenas não

se observa a presença do aminoácido triptofano conservado, mas isso também

ocorre nas seqüências de outros organismos, como a levedura S. pombe e o

nematódeo C. elegans, o que sugere, que em invertebrados esse aminoácido

pode não ser tão importante para a função E3 ligase, quanto em eucariotos

superiores.

Utilizando o programa pfam (Apêndice 1) para a análise da seqüência da

proteína predita, podemos sugerir que a seqüência de PIAS de S. mansoni se

trata da proteína PIAS 1, devido a presença do motivo Gu-binding protein,

característico das proteínas do tipo PIAS1.

4.14. Análise da expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de vida

do parasita

Para analisarmos a expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de

vida do parasita, o qual denominamos SmPIAS1, desenhamos novos

oligonucleotídeos apropriados à análise por PCR quantitativo em tempo real

(Tabela 3). Esses oligonucleotídeos apresentam a particularidade de

apresentarem um maior conteúdo de GC na porção 3’, e também apresentam um

Tm de 60°C, mais apropriado para a amplificação do transcrito, nas condições dos

ciclos da PCR e também para a análise empregando curvas de dissociação. As

reações da PCR foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR

__________________________________________________________ Resultados 82

SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação

de PCR quantitativo foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI

7500 (Applied Biosystems).

Portanto, a análise da expressão do cDNA de 350pb obtido por qPCR que

codifica para SmPIAS 1 através do desenvolvimento do parasita, aponta para uma

expressão diferencial desse gene (Figura 30). Através do gráfico da Figura 30A,

podemos verificar que esse gene apresenta um pico de expressão em zero hora,

onde a expressão praticamente dobra, em relação ao estágio de cercária.

Posteriormente, ocorre uma diminuição da expressão quase chegando à zero em

72h, quando o parasita se encontra em sua migração da pele para os pulmões.

Por fim, ocorre novamente um aumento de quase cinco vezes na expressão em

relação à cercária, desse transcrito em vermes adultos.

__________________________________________________________ Resultados 83

A

B

Figura 30: Expressão do gene SmPIAS 1 SUMO E3 ligase no desenvolvimento do parasita. (A) A expressão do mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias, esquistossômulos (0h, 8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle endógeno normalizador foi utilizado o gene da α-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-∆∆Ct , onde foi designado como calibrador da curva a expressão relativa à mensagem correspondente à fase de cercária. Os resultados foram posteriormente normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para efeito de representação gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados para a síntese da primeira fita de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel de agarose 1,5 % e corada com brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso molecular de 100 pb (Invitrogen)..

Expressao de PIAS

0.0

20.0

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60.0

80.0

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Estagios

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Ver

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ativ

o

__________________________________________________________ Resultados 84

4.15. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase

RanBP2 em S. mansoni

O domínio ligante de proteína Ran ou Ran-ligante apresenta

aproximadamente 150 resíduos de aminoácidos. A proteína Ran é uma proteína

nuclear do tipo GTPase (Ras-like nuclear small GTPase), a qual regula o

transporte de proteínas, mediado por receptor entre o núcleo e o citoplasma

(Pichler et al 2002). A hidrólise de RanGTP é estimulada por RanGAP e pelo

domínio Ran ligante, o qual também contém as proteínas acessórias RanBP1 e

RanBP2. Essas proteínas acessórias estabilizam a forma ativa e ligada a GTP da

proteína Ran. A importância deste dominio Ran-ligante é de grande extensão no

transporte núcleo-citoplasma visto que este se encontra em múltiplas cópias, em

proteínas do complexo do poro nuclear (Revisado por Johnson, 2004).

Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 2),

que amplificavam a região de domínio RanBP2 (Figura 32). O cDNA de

aproximadamente 700 pb foi seqüenciado (Figura 31) e a seqüência foi traduzida

utilizando o programa ORF finder e a seqüência do domínio predito foi sujeita a

análise utilizando os algoritmos Blastx e Blastp e pfam para busca de homologia

com outras seqüências depositadas nos bancos de dados.

PM

700pb

Ran

BP

2

Figura 31: cDNA codificando para RanBP2 em vermes adultos. O cDNA apresenta um tamanho de 700pb. Gel de agarose 1,2% corado com Brometo de etideo (Invitrogen). Peso molecular de 100 pb (invitrogen

__________________________________________________________ Resultados 85

RanBP2 é a proteína acessória que participa do transporte de proteínas

através do complexo do poro nuclear funciona também como uma proteína SUMO

E3-ligase. Como se pode observar pela Figura 32 A/B, esta proteína apresenta o

domínio IRM-1 na sua porção N-terminal, que possui o motivo SBM (SUMO

Binding Motif). Este motivo possui uma estrutura composta pelos aminoácidos V-

X-V/I-V/I, ou seja, V é o aminoácido valina e X é qualquer aminoácido. O

aminoácido valina pode ser substituído por isoleucina em alguns casos, sem

prejuízo para a função de ligação do substrato. Na seqüência de RanBP2 do

parasita S. mansoni, como podemos observar através da Figura 32 A/B, está

destacado esse motivo, indicando a importância deste para a função dessa

proteína no parasita.

Conforme podemos observar também através da Figura 32B, seqüência de

S. mansoni apresenta o domínio RanBD, o que pode refletir também na

conservação da função dessa proteína no contexto celular desse parasita. Outra

característica importante que constatamos através da análise da seqüência da

proteína predita, foi a ausência dos domínios HECT e RING, característico de

enzimas do tipo E3 ligases.

__________________________________________________________ Resultados 86

A B

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__________________________________________________________ Resultados 87

4.16. Caracterização da expressão do cDNA que codifica para RanBP2 em S.

mansoni

Em relação à expressão dessa enzima no ciclo de vida do parasita, as

análises da expressão gênica relativa foram feitas como anteriormente descrito no

item 4.14, para o gene que codifica para SmPIAS1. Desta forma, podemos

observar através da Figura 33A, que o transcrito de aproximadamente 380pb, o

qual denominamos SmRanBP2, apresenta uma expressão diferencial, sendo que

o gene começa a ser expresso quando o esquistôssomulo alcança 18.5h de

desenvolvimento, ou seja, depois de quase um dia de cultura. Depois com dois

dias de desenvolvimento, a expressão desse gene aumenta aproximadamente 35

vezes em relação à expressão inicial em 18.5h. Posteriormente quando o verme

alcança 72h, ocorre uma diminuição da expressão, a qual se mantém em níveis

acentuados de diminuição até o estágio de vermes adultos, onde o parasita

alcança a sua completa maturação.

__________________________________________________________ Resultados 88

A

B

α - Tubulina

PM

Cer

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0 h

8,5

h

18,5

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24 h

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Expressao de RanBP2

05

1015202530354045


estagios

expr

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Figura 33: Expressão do gene SmRanBP2 SUMO E3 ligase no desenvolvimento do parasita. (A) A expressão desse mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias, esquistossômulos (0h, 8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle endógeno normalizador foi utilizado o gene da α-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-∆∆Ct , onde foi designado como calibrador da curva a expressão relativa à mensagem correspondente à fase de esquistossômulos de 18.5h. Posteriormente os resultados de expressão foram normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para efeito de apresentação gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados para a síntese da primeira fita de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel de agarose 1,5 % e corada com brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso molecular de 100 pb (Invitrogen).

__________________________________________________________ Resultados 89

Protease específica de SUMO (SUSP)

__________________________________________________________ Resultados 90

4.17. Caracterização da seqüência predita da protease específica de SUMO

(SUSP) ou ULP1 em S. mansoni

Através da pesquisa pelos bancos de dados do parasita S. mansoni, foram

identificados várias seqüências que apresentavam homologia com cDNAs que

codificavam para proteases especificas de SUMO (SUSP ou ULPs). Desta forma

foram idealizados oligonucleotídeos específicos, que amplificaram um transcrito de

aproximadamente 630pb (Figura 34). Este cDNA foi seqüenciado, conforme

descrito em Materiais e Métodos e depois da análise inicial em relação aos bancos

de dados, concluímos se tratar de uma proteína do tipo ULP.

Figura 34: cDNA codificando para ULP1 em vermes adultos. O cDNA apresenta um tamanho de 630pb. Gel de agarose 1,2% corado com Brometo de etideo (Invitrogen). Peso molecular de 100 pb (invitrogen).

PM

ULP

1

630pb

__________________________________________________________ Resultados 91

O alinhamento da proteína predita de S. mansoni, com as regiões

conservadas de outras proteínas ULPs de outros organismos, mostra que o sítio

catalítico dessa protease está bem conservado neste organismo. Estudos iniciais

utilizando inibidores indicaram que esta proteína é uma cisteíno-protease (Li &

Hochstrasser, 1999). Observando o alinhamento da protease de S. mansoni

(Figura 35B) com as proteases de outros organismos, concluímos que esta

protease também é uma cisteíno protease, visto que apresenta o resíduo de

cisteína, conservado na posição C-terminal da seqüência de proteína. Os outros

aminoácidos do sítio catalítico, ou seja, o aminoácido Histidina (H) e Aspártico (D)

também estão conservados na seqüência protéicas dessa protease de S.

mansoni.

Outra característica relevante sobre a seqüência predita da protease ULP1

é pertencer à classe das peptidades C48, como anteriormente descrito por

Rawlings e Barrett, 2000. Essa classe de proteases, são bastante distintas, em

relação às suas seqüências de aminoácidos as UCHs (Ubiquitin C-terminal

Hydrolases) e também das DUBs (Deubiquitinating Enzymes).

__________________________________________________________ Resultados 92

A

B

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5 –

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soni

.

__________________________________________________________ Resultados 93

4.18. Caracterização da expressão do cDNA codificando para ULP1 no ciclo

de vida do parasita

Em relação à expressão dessa enzima no ciclo de vida do parasita, as

análises da expressão gênica relativa foram feitas como anteriormente descrito no

item 4.14, para o gene SmPIAS1. Em relação à expressão dessa enzima no ciclo

de vida do parasita, podemos observar através da Figura 36A, que o transcrito de

380pb apresenta uma expressão diferencial, onde o início da expressão ocorre em

0h do desenvolvimento. Depois, apresenta um pico de expressão acentuado,

aumentando em cerca de 120 vezes em 8.5h, em relação à expressão inicial

ocorrida em 0h. Posteriormente, ocorre uma nova diminuição em 18.5h e um

discreto aumento, até o segundo dia de desenvolvimento onde ocorreu um

aumento de até 80 vezes em relação à 0h. Em três dias de desenvolvimento,

ocorre uma diminuição da expressão, voltando a aumentar consideravelmente,

quando o verme adulto já se encontra no sistema porta-hepático.

__________________________________________________________ Resultados 94

A

Expressao de ULP1

-20.0040.0060.0080.00

100.00120.00140.00160.00


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Figura 36: Expressão do gene SmULP1 no desenvolvimento do parasita. (A) A expressão desse mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias, esquistossômulos (0h, 8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle endógeno foi utilizado o gene da α-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo método do 2-∆∆Ct , onde foi designado como calibrador da curva, a expressão relativa à mensagem correspondente à fase de esquistossômulos de 0h. Posteriormente os resultados foram normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para efeito de representação gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados para a síntese da primeira fita de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel de agarose 1,5 % e corada com brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso molecular de 100 pb (Invitrogen).

5. Discussão

___________________________________________________________Discussão 96

5.1 SUMO

Modificações pós-traducionais de proteínas são rápidas, e alteram a função

das proteínas reversivelmente, com custo baixo de energia (Johnson 2004). As

modificações pós-traducionais que podem ocorrer na célula podem ser do tipo

acetilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitinação e sumorilação. A ubiquitinação

modifica os seus substratos celulares, e dependendo do resíduo de lisina

modificado, direciona o alvo para a degradação protéica dependente do

proteassoma 26S. A modificação dos substratos por SUMO, em contraste à

ubiquitinação não direciona os substratos modificados à proteólise, ao contrário

disso, estabiliza a meia vida das proteínas (Melchior, 2000).

A sumorilação assim como a ubiquitinação, requer algumas proteínas

acessórias necessárias para o processamento de precursores de SUMO, pois esta

é traduzida em sua forma inativa necessitando de uma clivagem enzimática para a

maturação de SUMO. As enzimas E1, E2 e E3 são responsáveis pela cascata

bioquímica dependente de ATP levando à conjugação dos substratos alvo. Por fim

as proteases dependentes de SUMO são responsáveis pela desconjugação de

SUMO e a liberação de SUMO livre no meio celular (Seeler and Dejean, 2003).

A SUMO é uma proteína bastante conservada entre a evolução das

espécies. Os membros da família SUMO, estão presentes em organismos

protozoários, metazoários, plantas e leveduras. As análises de ESTs em bancos

de dados de genomas indicam a presença de pelo menos um membro da família

SUMO em Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea, Disctyostelium discoideum e

Candida albicans. O primeiro relato da presença de SUMO, a qual foi denominada

___________________________________________________________Discussão 97

SMT3 foi em S. cerevisiae, em experimentos envolvendo o gene MIF2. Esse gene

quando sofre mutação, compromete a viabilidade da levedura (Meluh e Koshland,

1995; Johnson et al, 1997). Em C. elegans também foi descrito um gene que

codifica para SUMO 1 (Choudhury e Li, 1997).

Em metazoários as proteínas do tipo SUMO podem ser divididas em duas

famílias: uma família que compreende a proteína SUMO-1, e a outra família que

engloba os membros da família SUMO 2/3 (Saitoh e Hinchey, 2000). Atualmente

já se tem caracterizado uma nova proteína chamada SUMO4, que participa de

processos relacionados a doenças autoimunes (Pearce e Merriman, 2006).

Durante os últimos anos, os processos de modificação pós-traducional de

proteínas dependente de ubiquitina e de vias ubiquitina-símile, vêm sendo

extensivamente estudado, no nosso laboratório. A primeira evidência da existência

de SUMO em S. mansoni, vem de experimentos de western blot, utilizando

anticorpo anti-ubiquitina, onde a presença de várias bandas poderia indicar uma

reação cruzada com SUMO. Mas, o primeiro relato definitivo, aconteceu com o

sequenciamento de um cDNA codificando para SUMO, posteriormente

denominado SmSMT3B neste parasita, onde ocorre a sumorilação sem efeito

proteolítico (Cabral FJ, Dissertação de Mestrado, 2002). Estes resultados em

conjunto com o sequenciamento do transcriptoma vieram alterar o panorama

sobre o conhecimento existente sobre essa via de modificação pós-traducional no

parasita S. mansoni.

Devido à via de sumorilação ser muito conservada durante a evolução das

espécies, e apresentar funções importantes na célula, neste estudo através de

seqüências depositadas nos bancos de dados de genoma do S. mansoni, foi

___________________________________________________________Discussão 98

permitido caracterizar os componentes do sistema de sumorilação, tanto in silico,

quanto utilizando técnicas de biologia molecular. Os resultados in silico

apresentados na Tabela 04, listam os 20 componentes da via de sumorilação

seqüenciados pelo consórcio do transcriptoma, correspondente a 0.15% do total

de genes expressos pelo parasita S. mansoni. A família de proteínas SUMO,

apresenta uma nomenclatura passível de muita confusão. Este nome foi atribuído,

de acordo com a nomenclatura proposta por Saitoh (2004), o qual propõe que

SUMO 1, SUMO2 e SUMO3, são denominadas SMT3C, SMT3B e SMT3A,

respectivamente

A partir da entrada SmAE601278, depositada no banco de dados do Projeto

Transcriptoma do S. mansoni, foram idealizados oligonucleotídeos específicos

para validarmos os resultados obtidos in silico, bem como determinar a sua

estrutura genômica, através de PCR e Southern Blot. Na Figura 7, mostramos o

resultado do RT-PCR para o gene que codifica para SMT3C em S. mansoni. Na

Figura, mostramos o resultado de amplificação de uma banda de 270 pb,

correspondente ao gene, que então passamos a denominar de SmSMT3C (S.

mansoni SMT3C).

Desta forma, o gene SmSMT3C foi clonado e seqüenciado e a seqüência

foi analisada nos bancos de dados, utilizando BLASTx e BLASTn, ou seja, nos

bancos correspondentes a proteínas e nucleotídeos respectivamente. Através da

análise da seqüência de aminoácidos podemos concluir que a proteína SmSMT3

apresenta os seus domínios relacionados à sua função, bem conservados.

O resultado da análise da seqüência primária de aminoácidos (Figura 8)

mostrou que o gene SmSMT3C codifica para uma proteína de 90 aminoácidos,

___________________________________________________________Discussão 99

que apresenta um duplo resíduo de glicina na porção C-terminal responsável pela

conjugação dessa proteína aos seus alvos, e também verificamos que esta

proteína predita apresenta uma extensão N-terminal flexível, a qual se mostra

ausente, quando comparada com a proteína ubiquitina (Apêndice). Até o

momento, não se sabe ao certo, a função dessa extensão N-terminal, mas

acredita-se que esta extensão possa ser uma boa candidata a interações proteína-

proteína (Melchior, 2000).

Ainda, em relação à seqüência de aminoácido, nota-se a presença de uma

leucina, após o motivo Gli-Gli, na porção C-terminal SmSMT3C predita. Como

acontece em outros organismos (Johnson 2004), este aminoácido pode ser

presumivelmente removido pelas proteases específicas de SUMO, para gerar

SUMO em sua forma madura, para que ocorra a cascata bioquímica de

conjugação.

Através da análise filogenética, podemos sugerir que SmSMT3C é bem

conservada em relação aos outros organismos, e que se encontra próxima à

seqüência de S. japonicum, e também próxima de eucariotos superiores, desta

forma podemos sugerir que a SmSMT3C, em S. mansoni pode estar envolvida

nos mesmos processos biológicos, como os descritos para outros modelos

experimentais.

A primeira função descrita para SUMO, por Mahajan e colaboradores está

relacionada ao tráfego de proteínas do citoplasma para o núcleo. Nesse estudo,

estabeleceu-se que SUMO pode modificar a proteína RanGAP1 no complexo do

poro nuclear e desta forma internalizar essa proteína no núcleo (Melchior 2000).

De acordo com o modelo estabelecido para o transporte de proteínas entre o

___________________________________________________________Discussão 100

núcleo e o citoplasma, é sugerido que Ubc9 conjuga SUMO, ainda na parte

citoplasmática do complexo do poro nuclear, e desta forma internalizando as

proteínas que estão sumoriladas (revisado por Seeler e Dejean, 2003). Desta

forma, além da importância da modificação por SUMO no núcleo, esta modificação

apresenta a sua importância na face citoplasmática da célula.

Diversos relatos apontam para a importância da sumorilação no núcleo,

através das HDACs, levando a repressão da expressão gênica através da

modificação das histonas (revisado por Gill, 2005). Também estudos de

imunoflorescência, relacionados com o fator de transcrição nuclear Sp3, indicam

que a forma reprimida de Sp3, ou seja, modificada por SUMO, se localiza na

periferia nuclear (Di Bacco, 2004).

A estrutura genômica para o gene SmSMT3C foi caracterizada, através da

PCR do DNA genômico utilizando os oligonucleotídeos específicos cobrindo a

ORF inteira, permitindo a determinação da organização éxon-íntron do gene.

Desta forma, o alinhamento da seqüência de cDNA versus a seqüência genômica

(Figura 10C), mostrou que a seqüência genômica do gene SmSMT3C é

interrompida por dois íntrons pequenos de tamanhos 28 e 36pb respectivamente e

apresenta pelo menos uma cópia por genoma haplóide (Figura 11).

Os íntrons possuem a seqüência consenso de processamento do mRNA

eucariótico, GT...AG dependente do spliceosoma U2, encontrado em todos os

eucariotos (Will & Luhrmann, 2005). Enquanto que a maquinaria de

processamento exige uma seqüência mínima de 50pb (Wieringa et al 1984;

Thompson e Domdey, 1987), os genes de S. mansoni apresentam introns

menores, do que àqueles requeridos pela maquinaria anteriormente descrita.

___________________________________________________________Discussão 101

Estes íntrons pequenos são característicos de S. mansoni, tais como ao

anteriormente descrito para o gene que codifica para GAPDH (Charrier-Ferrara et

al 1992), glutationa peroxidase (Mei e LoVerde, 1995), Sm23 (Lee et al 1995) e

RhoI (Vermeire et al 2003). Apesar de possuir as seqüências consenso de

processamento do mRNA, ainda, o mecanismo pelo qual a maquinaria U2 retira

esses pequenos íntrons, ainda permanece a ser elucidado.

O número de cópias por genoma haplóide do gene SmSMT3C, também foi

investigado, utilizando a técnica de Southern Blot. A Figura 11 mostra a presença

de duas cópias por genoma haplóide. Diversos genes de múltiplas cópias por

genoma têm sido investigados em vários organismos. Em Arabidopsis, vários

genes que codificam para SUMO, ou seja, SUMO 1 a 8 foram determinados.

Esses genes codificam para várias isoformas de SUMO, algumas relacionadas ao

controle do mecanismo de estresse osmótico, oxidativo e/ou térmico. Outros

genes foram denominados como pseudogenes, pela sua incapacidade de codificar

uma proteína funcional (Vierstra et al 2003).

Em relação à expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de

vida do parasita (Figura 12), podemos concluir através do RT-PCR, que este gene

é expresso de forma constitutiva durante o desenvolvimento do parasita. Durante

o desenvolvimento de C. elegans, a modificação pós-traducional dependente de

SUMO, exerce um papel importante relacionado à modificação das histonas, e

também via modificação de fatores de transcrição levando a repressão

transcricional.

Diversos relatos em S. mansoni apontam para a importância dos fatores de

transcrição para o desenvolvimento, crescimento e diferenciação do parasita.

___________________________________________________________Discussão 102

Durante o desenvolvimento dos metazoários, o controle da expressão gênica

implica na coordenação precisa entre a ativação e a repressão de conjuntos de

genes. Esses mecanismos envolvem numerosos fatores de transcrição que se

ligam ao DNA, como por exemplo, a família dos receptores nucleares (Robinson-

Rechavi et al 2003). Os receptores nucleares regulam a expressão gênica se

ligando aos seus elementos de resposta correspondentes e recrutando proteínas

associadas, desta forma ativando ou reprimindo a expressão gênica (Kumar et al

2004).

A subfamília dos receptores nucleares órfãos fushi tarazu (FTZ),

desempenha papéis importantes no desenvolvimento e na diferenciação sexual

dos vertebrados e invertebrados, sendo também detectado em S. mansoni, onde

se observou, que enquanto os níveis do mRNA permaneciam praticamente

constantes quando comparado com os estágios larvais e adulto, a proteína era

mais abundante em adultos do que em miracídios, sugerindo uma regulação ao

nível traducional (de Mendonça et al 2002).

Outra característica importante relacionada à função desse receptor está

relacionada à ligação da proteína ao elemento de resposta monomérico SF1, o

que sugere que essa interação em Schistosoma está relacionada com a regulação

da transcrição durante o desenvolvimento, assim como ocorre, nos outros

metazoários (de Mendonça et al 2002). É visto também que SmFTZ interage com

o homólogo de RXR (Receptor X Retinoic), potencializando a atividade

transcricional de SmFTZ (Bertin, 2005). Relatos anteriores indicam que a via de

sumorilação modifica RXRα (Wu et al, 2004). Em S. mansoni, o mRNA desse

receptor esta presente em todas as fases do ciclo, porém apresenta elevados

___________________________________________________________Discussão 103

níveis em fases de miracídio e cercária, quando comparado com verme adulto. Em

contraste, a proteína apresenta um alto nível de expressão na fase de

esquistôssomulo, mesmo apresentando seqüências PEST, que usualmente

determina à meia vida curta das proteínas (de Mendonça et al 2000). Devido ao

fato de SUMO prolongar a meia vida dos seus substratos alvo, neste caso, a meia

vida do receptor pode ser prolongada para desempenhar suas funções na

diferenciação e desenvolvimento do verme jovem para o verme maduro.

Ainda em relação ao controle da expressão gênica, o S. mansoni,

apresenta as proteínas do tipo CBP (Creb binding protein) e p300 que são

coativadores transcricionais com atividade de histona acetilase, que modifica a

cromatina, levando esta ao seu estado relaxado (Bertin et al 2006). Até o

momento, sumorilação dessas proteínas está relacionada à atividade de reparo do

DNA (Mohan et al 2006).

Desta forma, através dos resultados de expressão dos transcritos de SUMO

no ciclo de vida do parasita S. mansoni, podemos especular que a via de

sumorilação pode estar atuando, no sentido de regular o desenvolvimento desse

parasita, através do seu papel no controle da expressão gênica (Verger, 2003).

Através de experimentos utilizando o anticorpo anti-SUMO-1 humana,

podemos verificar que a via de sumorilação está funcionalmente ativa no parasita

(Figura 14B). O anticorpo anti-SUMO-1 humano foi utilizado, devido à

conservação da seqüência de S. mansoni relacionado à proteína humana (Figura

8). De uma forma semelhante, na Figura 14B podemos verificar que o perfil de

sumorilação em vermes adultos é maior em proteínas nucleares do que em

citoplasmáticas. Além disso o perfil de conjugados sumorilados em cercárias

___________________________________________________________Discussão 104

também se mostrou bastante evidente. Esses resultados analisados em conjunto

com os níveis de expressão do mRNA (Figura 12) sugerem, que SUMO pode

participar de mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento durante a

transição de cercária para verme adulto. Futuros experimentos para analisar a

transição miracídio-cercária poderão dar novas pistas sobre os mecanismos

moleculares que o parasita utiliza na transição de vida livre aquática, para o

interior do hospedeiro invertebrado.

5.2. Ubc9

A enzima E2 conjugadora de SUMO, denominada de Ubc9, pertence à

família UBC (Ub-conjugating enzyme catalytic), e apresenta um domínio catalítico

específico para a conjugação de SUMO aos seus numerosos substratos (Johnson,

2004). Além disso, diversos relatos mostram que sistemas biológicos cujo gene

Ubc9 é silenciado ocorre uma interrupção do ciclo celular o que reforça a hipótese

da sumorilação de proteínas específicas para a viabilidade celular (Seufert et al

1995; Schwarz, 1998).

No nosso estudo foi demonstrada a presença de dois genes que codificam

para Ubc9 em S. mansoni. Esses dois genes foram identificados a partir de

análises in silico dos bancos de seqüência de DNA disponíveis para este parasita

(Tabela 4). Como descrito em Resultados, S. mansoni apresenta um gene

estrutural o qual foi denominado SmUbc9 e outro pseudogene, o qual foi chamado

ψSmUbc9.

___________________________________________________________Discussão 105

O gene estrutural foi clonado, seqüenciado e de acordo com a análise da

seqüência podemos afirmar que esse gene codifica para uma proteína de 130

aminoácidos, que apresenta o aminoácido Cisteína 93, conservado e posicionado,

para a catálise da formação da ligação tiól-ester, responsável pela conjugação de

SUMO aos seus substratos alvo. O alinhamento da proteína predita de S. mansoni

(Figura 16) e a análise filogenética (Figura 17) mostraram que esta proteína é bem

conservada entre os outros organismos. Na árvore filogenética também podemos

constatar que esta proteína está bastante próxima evolutivamente do parasita S.

japonicum e de outros vermes, como C. elegans e também dos eucariotos

superiores como H. sapiens.

A estrutura genômica do SmUbc9 utilizando alinhamento do fragmento

genômico versus o cDNA foi determinada (Figura 18), e concluímos que SmUbc9

é interrompido por dois pequenos íntrons de 37 e 35pb respectivamente. A análise

da região flanqueadora desses íntrons evidencia a presença de sítios de splicing

não canônicos AT...AC (Figura 18C). A maioria dos íntrons nas células

eucarióticas são removidos pelo spliceosoma dependente da enzima U2. A

remoção dos íntrons desse tipo raro de splicing, que apresentam a seqüência

AT...AC, ocorre através da atividade de enzima U12, através de um mecanismo

idêntico ao anteriormente descrito para os íntrons dependente de U2 (Tarn &

Steitz, 1997).

A presença de dois spliceosomas distintos em alguns eucariotos, dentre

eles o parasita S. mansoni, leva à abertura de questões intrigantes, relacionadas à

origem e evolução desses mecanismos de remoção de íntrons (Will & Luhrmann,

2005; Tarn & Steitz, 1997). O íntrons dependentes de U12, já foram identificados

___________________________________________________________Discussão 106

em plantas e animais, indicando que os spliceosomas dependentes de U2 e U12,

coexistem nas células a bilhões de anos (Will & Luhrmann, 2005). O gene

prospero conhecido pela sua importância no desenvolvimento do sistema neural

de Drosophila, também apresenta AT-AC íntrons (Yuh & Steitz, 1997). Acredita-se

que esses íntrons que possuem a seqüência AT...AC dependente de U12, sejam

fósseis moleculares, por isso se tornaram raros atualmente, e os que existiram no

passado foram gradualmente se convertendo em íntrons do tipo U2 (Burge et al

1998,Will & Luhrmann 2005). Os genes que possuem esses íntrons possuem

importantes funções no desenvolvimento e regulação de vias importantes nos

metazoários (Tarn & Steitz, 1997). Também gostaríamos de ressaltar a anotação

de várias seqüências relacionadas à montagem de spliceosomas funcionais no

banco de dados do genoma do S. mansoni. Dentre elas destacamos a 612184 e

612353, supostamente codificadoras de snRNAs similares aos encontrados nos

spliceosomas encontrados na regra não-canônica AT-AC.

O gene que codifica para SmUbc9 é expresso em todas as fases do ciclo

de vida do parasita (Figura 19), e experimentos de Northern Blot indicam que o

parasita apresenta apenas um transcrito expresso de tamanho 1,32Kb (Figura 20).

Resultados de expressão do mRNA humano, também indicou que o gene HsUbc9

é expresso em vários tecidos humanos e apresenta um tamanho de 1,3Kb e está

envolvido em processos de divisão celular (Kovalenko et al 1995). Desta forma

podemos especular sobre a importância desse gene na diferenciação e

viabilidade, pois se sabe que a proteína Ubc9 é importante para a progressão do

ciclo celular da fase G2 para M, em leveduras. A mutação desse gene causa a

___________________________________________________________Discussão 107

acumulação de células mal formadas, possuindo um apenas um núcleo (Seufert,

1995).

Apesar de apresentar uma estrutura similar a outras enzimas da famíla E2,

que atuam na via de ubiquitina (Chen 2004), até o momento Ubc9 é a enzima

conjugadora de SUMO para todos os exemplos estudados. Em S. mansoni, a

proteína Ubc9 é expressa tanto no citoplasma quanto no núcleo, conforme

evidenciado pela banda de 20kDa, obtida utilizando anticorpo anti-Ubc9 e em

fração de proteínas nucleares e citoplasmáticas (Figura 21).

Além de um gene estrutural também detectamos um pseudogene, o qual

passará a ser discutido nos parágrafos seguintes.

Para certificarmos que o possível pseudogene ψSmUbc9, não se tratava de

um artefato de sequenciamento, recuperamos a seqüência do banco de dados,

que está depositada no banco do Transcriptoma do S. mansoni sob o número

610543 (ou TC19135 – entrada depositada pelo projeto genoma do TIGR), e

desenhamos oligonucleotídeos específicos, que amplificou um produto por RT-

PCR de 500pb (Figura 23 A). O PCR genômico revelou um produto de 600pb

(Figura 23B). Esses dois produtos de PCR foram seqüenciados, alinhados e

utilizando ClustalW podemos verificar a presença de íntrons na seqüência

genômica do pseudogene (Figura 24).

Pseudogenes são definidos como cópias de genes que não são capazes de

produzir uma proteína funcional. Esses genes apresentam interrupções em sua

região codificadora causadas por mudanças na posição do ATG inicial

(frameshifts) e/ou códigos de parada prematuros (Harrison et al 2003). Os

pseudogenes podem ser classificados como pseudogenes processados, ou seja,

___________________________________________________________Discussão 108

aqueles que são originados de transcrição reversa de um mRNA, ou pseudogenes

duplicados, ou seja, aqueles que surgiram da duplicação do DNA genômico e a

posterior disabilitação (Zhang .et al 2004).

No genoma humano foram identificados aproximadamente 8.000

pseudogenes processados, localizados em regiões pobres em GC (Zhang et al

2003). Os pseudogenes processados se caracterizam por (i) não possuírem

íntrons, (ii) apresentam sítios de poliadenilação e (iii) representam a seqüência

completa do cDNA do gene funcional e não apresentam seqüências promotoras

(Tsytsykova, et al 1998). Os grandes grupos de pseudogenes identificados no

genoma humano compreendem as proteínas ribossomais, seguido dos

pseudogenes dos receptores olfatórios (Zhang et al 2003).

Através da análise in silico do genoma murino também foram identificados

aproximadamente 5000 pseudogenes, sendo que estes pseudogenes tendem a

ser representados por proteínas ribossomais e genes de manutenção. Os

pseudogenes são denominados de “fósseis moleculares”, devido a sua

importância na genômica evolutiva e comparativa (Zhang et al 2004).

Em Drosophila também foram feitos estudos na tentativa de se identificar

possíveis pseudogenes. No estudo feito por Harrison e colaboradores (2003)

foram identificados 110 pseudogenes sendo que desses, 19 eram processados,

outros 34 não tinham evidencia de serem processados e 6 poderiam ter surgido de

duplicação gênica.

Em S. mansoni ainda não se tem um estudo completo utilizando bancos de

dados listando os possíveis pseudogenes. O único relato existente até o momento

trata-se do gene SGTP2 relacionado com o transporte de glicose. O pseudogene

___________________________________________________________Discussão 109

SGTP2 contém um íntron mal processado, apresenta mutações no código aberto

de leitura e, portanto não codifica uma proteína funcional. Os resultados de

expressão deste pseudogene, utilizando Northern Blot mostraram que este gene

apresenta uma expressão diferencial durante o desenvolvimento do parasita,

sendo apenas expresso em fêmeas adultas (Skelly et al 1994). Devido ao parasita

possuir um baixo conteúdo de GC (Johnston 1999), muitos outros pseudogenes

podem estar contidos no genoma do parasita, esperando para serem descobertos.

De acordo com os experimentos de Southern blot foi constatado que no

genoma de S. mansoni, o gene ψSmUbc9 possui apenas uma cópia (Figura 25).

Sendo que esse gene não possui nenhuma das características citadas acima

como sendo um pseudogene processado, os nossos resultados sugerem que

ψSmUbc9 pode ser um pseudogene resultante de uma duplicação gênica.

Pseudogenes duplicados surgem da duplicação do DNA genônico ou mesmo de

um erro durante o processo de crossing over, durante a divisão celular. Desta

forma os pseudogenes duplicados conservam a estrutura éxon-íntron dos genes

funcionais, embora muitas vezes incompletas, o que determina o silenciamento

desses genes (Zhang et al 2003).

No genoma de camundongos, foi relatada a presença de quatro cópias para

o gene Ubc9, sendo que três dessas são pseudogenes não-processados. O gene

estrutural apresenta uma estrutura contendo sete éxons, codifica para uma Ubc9

funcional. Os pseudogenes ψUbc9 1 e ψUbc9 2, apresentam um código de leitura

aberto, mas codificam uma proteína incapaz de se ligar ao seu substrato alvo. O

___________________________________________________________Discussão 110

pseudogene ψUbc9 3, apresenta vários códigos de parada em sua seqüência,

desta forma não codifica para uma proteína ( Tsytsykova et al 1998).

O gene ψSmUbc9 em S. mansoni é expresso apenas nos vermes adultos,

conforme mostrado na Figura 27. Estudos recentes relacionam os ncRNAs (non-

coding RNAs), como um mecanismo para aumentar a complexidade da regulação

da expressão gênica, e juntamente com o processamento alternativo do RNA

aumentam a variedade e complexidade do transcriptoma. Os resultados também

sugerem que a razão de seqüências de RNA que não codificam para proteína

aumenta com a complexidade do organismo (Mattick e Makunin, 2006). Desta

forma, o parasita S. mansoni por apresentar um ciclo de vida complexo, sendo as

formas larvais mais simples, os nossos resultados sugerem que a presença de

pseudogenes pode ser perfeitamente plausível na forma adulta, se consideramos

a complexidade do verme adulto em relação às formas larvais.

As larvas miracídio e cercária dos trematódeos digenéticos são adaptadas

para uma existência de natação ativa, sem se alimentar. A penetração no

hospedeiro é acompanhada por uma importante reorganização dos tecidos e da

fisiologia do parasita, que pode ser adequadamente descrita como metamorfose.

Parece provável que as condições físicas e químicas, fornecidas por esse

hospedeiro, atuem como desencadeantes desse crescimento. Em Schistosoma, o

início do crescimento está separado do processo de metamorfose (Wilson, 1979).

Assim, apesar de ainda não estar elucidado os mecanismos do estímulo, pelo qual

isso ocorre, o transcriptoma fornece várias pistas moleculares que podem estar

envolvidas nesse processo (Verjovski et al 2003).

___________________________________________________________Discussão 111

Diante dessas evidências os ncRNAs, assim como os pseudogenes podem

estar relacionados, exercendo um papel de regulação da expressão gênica na

diferenciação, como por exemplo, em embriões de Drosophila, onde o bxd ncRNA,

reprime a transcrição gênica da proteína ubx, através de um mecanismo de

elongação dos ncRNA do tipo bxd (Petruk et al 2006).

A modulação da estabilidade do mRNA consiste num método bastante

eficiente de controle da expressão gênica durante o crescimento celular e

diferenciação, bem como outras transições fisiológicas (Jacobson et al, 1996;

Ross, 1995). Os pseudogenes processados participam desse processo,

protegendo o mRNA codificante da possível degradação (Hirotsume et al 2003).

Os mecanismos pelo quais os pseudogenes não processados exercem os seus

papéis na célula, ainda permanecem a serem elucidados.

5.3. SUMO E3 ligases

5.3.1. Siz-PIAS

De acordo com as análises in silico e a caracterização molecular realizada

até o momento pode-se constatar que o S. mansoni apresenta a maquinaria

indispensável para a sumorilação dos substratos alvo. Desta forma, também

procedemos à análise das moléculas que são capazes de atuar como SUMO E3

ligases.

De acordo com a Figura 29, podemos verificar que o S. mansoni possui o

domínio SP-RING, bastante conservado em relação aos outros organismos. O

___________________________________________________________Discussão 112

domínio RING foi primeiramente descrito como sendo responsável pela

dimerização de várias proteínas (Joazeiro e Weissman, 2000). Depois, vários

trabalhos foram publicados, que levaram a conclusão de que o domínio RING

exercia um papel fundamental, mediando à transferência da ubiquitina aos

substratos alvo. De acordo com Hershko e Ciechanover (1998), as ubiquitina E3

ligases são enzimas que se ligam diretamente ou indiretamente aos substratos

protéicos específicos e promove a transferência da ubiquitina, diretamente ou

indiretamente, de um intermediário ligado por ligação tiól-éster para a ligação

amida com as proteínas ou cadeias de poliubiquitina.

Ao contrário dos domínios HECT de ubiquitina, que catalisam diretamente a

ligação isopeptídica, o domínio RING, funciona como um adaptador, e não forma

uma ligação tiól-éster com a ubiquitina (Fang et al 2003; Freemont, 2000;

Hatakeyama e Nakayama; Joazeiro e Weissman, 2000). O domínio RING acentua

a ubiquitinação e contribui para dirigir a especificidade da ligação, embora não se

saiba ainda, se RING funciona como uma simples ponte ou contribui

alostéricamente influenciando a enzima E2 (Jackson e Eldridge, 2002; Lima, 2002;

Pickart, 2001).

As proteínas do tipo Siz-PIAS possuem o domínio RING bastante

conservado e isso levou a interpretação de que essas proteínas podem funcionar

como ligases. Experimentos de duplo-híbrido de levedura levaram a identificação

de Siz-PIAS como interagindo com SUMO, e a semelhança do domínio RING de

PIAS com o domínio das E3 ligases de ubiquitina, levaram a dedução que essas

proteínas podem participar da via de sumorilação (Hochstrasser, 2001). Depois

outros relatos confirmaram que SUMO e PIAS participam da modificação pós-

___________________________________________________________Discussão 113

traducional de fatores de transcrição, reprimindo a transcrição na periferia do

núcleo (Jackson, 2001; Verger, 2003; Gill, 2005).

A família de fatores de transcrição Sp1, Sp2 e Sp3, são proteínas que se

ligam aos promotores do tipo GC-boxes, com grande afinidade e especificidade,

possuindo três motivos dedo de zinco altamente conservados e localizados na

região C-terminal da proteína. O nocaute do gene que codifica para Sp3 em

camundongos levou a defeitos nos ossos e no desenvolvimento dos dentes,

sugerindo um papel importante na diferenciação desses tecidos (Bowman et al

2000; Gollner et al, 2001). Estudos indicam que a sumorilação de Sp3 dependente

de PIAS e Ubc9 leva a regulação da atividade do fator transcricional, e desta

forma reprimindo a expressão gênica (Sapetschnig, 2002; Ross, 2002). Outros

cofatores transcricionais como, por exemplo, o receptor de androgênio (AR), o co-

ativador transcricional GRIP e as HDACs (histonas deacetilases), são todos

modificados por SUMO via proteínas do tipo PIAS (Seeler e Dejean, 2003).

Um dos objetivos desse trabalho foi avaliar a expressão do gene SmPIAS

durante a transição cercária-esquistossômulos-vermes adultos, e para isso

desenvolvemos uma cultura de esquistossômulos recuperadas com quatro horas

após a infecção, a qual denominamos zero hora, depois 8.5h, 18.5h, 24h, 48h, e

72h de cultivo in vitro. Esta fase temporal mimetiza o período correspondente aos

três dias de infecção no hospedeiro mamífero.

De acordo com a Figura 30, a o gene que codifica para a SUMO E3 ligase

SmPIAS1 apresenta uma expressão diferencial durante o desenvolvimento do

parasita. Após a penetração da cercária, o desenvolvimento do esquistôssomulo

pode ser dividido entre a migração da pele até os pulmões e deste para o fígado.

___________________________________________________________Discussão 114

A fase de crescimento se inicia ao final da migração dos pulmões, quando o

parasita recebe estímulos do hospedeiro (Lawson e Wilson, 1980). Outros estudos

ainda indicam que a fase de migração compreende desde o dia zero pós-infecção,

quando o parasita ainda está alojado na pele, chegando ao fígado no oitavo dia

(Crabtree e Wilson 1980). As divisões celulares, também só acontecem quando o

parasita chega ao sistema porta-hepático (Clegg 1965). Neste processo de

migração o parasita passa por um estado metabólico semi-dormente, havendo

apenas mudanças na morfologia do verme, possivelmente para se adequar em

tamanho aos capilares das veias, que compreendem a rota de migração do

esquistôssomulo (Wilson et al 1978). Várias evidências indicam que a síntese de

proteínas é bastante diminuída no dia zero de infecção e depois ocorre um

aumento até alcançar o pico máximo no oitavo dia (Yuckenberg et al 1987, Harrop

e Wilson, 1993), quando o verme recebe o estímulo para crescer e também

terminar de formar o seu tegumento heptalaminado, característico de vermes

adultos totalmente diferenciados (Hockley e McLaren, 1973). Além disso, durante

a migração, o esquistôssomulo pode utilizar no processo de transformação,

proteínas pré-sintetizadas na fase de cercária (Harrop e Wilson, 1993).

Visto que PIAS1 exerce um papel na diferenciação celular e no

desenvolvimento, então os baixos níveis de expressão deste gene nos períodos

estudados em relação aos vermes adultos, sugerem que este gene, pode

participar no processo de diferenciação que o parasita sofre até o sétimo dia do

seu desenvolvimento. Entretanto a detecção dos níveis de PIAS por Western Blot,

neste mesmo período de tempo estudado, poderá revelar a existência de tradução

acoplada aos níveis de transcritos detectados neste estudo. Futuros experimentos

___________________________________________________________Discussão 115

envolvendo proteoma, imunoprecipitação e Western blot utilizando um anticorpo

anti-PIAS, em culturas de 5, 7 e 21 dias contribuirão na elucidação esta hipótese.

5.3.2. RanBP2

A proteína Ran é requerida para o transporte nuclear, controle do ciclo

celular, formação das fibras do fuso mitótico e pela formação do núcleo pós-

mitótico (Azuma e Dasso, 2002). A modificação de RanGAP1 por SUMO1,

promove a sua associação a RanBP2, uma proteína de 358 kDa, que está

localizada na face citoplasmática do complexo do poro nuclear (Yokoyama et al

1995). Outros estudos indicaram também que RanGAP1 e outras proteínas se

tornam covalentemente ligados a SUMO1, de uma maneira bastante similar a

ubiquitina (Melchior, 2000). Pichler e colaboradores (2002) revelaram que a

nucleoporina RanBP2 tem atividade SUMO E3 ligase e através da interação direta

com a Ubc9, RanBP2 transfere SUMO1 para o substrato Sp100. O domínio E3

ligase tem 33 kDa de tamanho e não se assemelha ao domínio RING, presente

nas E3 ligases do tipo PIAS (Pichler et al 2002).

O domínio responsável pela atividade ligase de RanBP2 é o domínio IR

(Yokoyama et al 1995). Como podemos observar na Figura 32, o parasita S.

mansoni apresenta o domínio IR e RanDB, conservados, sugerindo que o parasita

pode apresentar a atividade SUMO E3 ligase de RanBP2.

O gene SmRanBP2 que codifica para RanBP2, apresenta um aumento real

de transcrição de aproximadamente 40 vezes em esquistossômulos obtidos após

48 horas de cultura in vitro, quando comparados a cercarias e vermes adultos,

___________________________________________________________Discussão 116

sugerindo que o transporte núcleo-citoplasma mediado por SUMO seja importante

tanto para os processos de migração, como para as mudanças morfológicas

sofridas pelo verme nos primeiros dias de desenvolvimento, no interior do

hospedeiro vertebrado(Figura 33).

O processo de diferenciação em células eucarióticas requer mudanças na

maquinaria do transporte nuclear em resposta ao estímulo da própria

diferenciação, bem como do crescimento. Estas mudanças ocorrem em paralelo

com modificações críticas e estágio-especificas na localização de fatores de

transcrição e também de proteínas que participam em processos de

remodelamento de cromatina que no momento da diferenciação devem estar

obrigatóriamente dentro do núcleo (revisado por Hogarth et al 2005).

Por outro lado este perfil de expressão nos primeiros 3 dias de

desenvolvimento pode indicar que este gene é expresso de forma temporal, ou

seja, ocorre um pico de expressão inicial seguido de um decaimento constante até

o silenciamento parcial, detectado no estágio de verme adulto, conforme indicado

na Figura 33A.

De acordo com os estudos realizados, o possível modelo para o transporte

consiste em primeiramente SUMO1 se ligar ao complexo RanBP2-Ubc9. Depois o

substrato ligado é transferido para SUMO e então ambos são transferidos para o

interior do núcleo através do poro (Figura 37). Possivelmente, após o translado,

RanGTP promove a liberação do substrato do receptor (Pichler et al 2002;Matunis

et al 1998, Melchior, 2000).

___________________________________________________________Discussão 117

(1) (2) (3) (4) Figura 37: Possível mecanismo de translado de proteínas através do poro nuclear dependente de Sumorilação. (1) Formação do complexo SUMO-RanBP2; (2) Transferência do substrato a RanBP2; (3) Transporte através do poro; (4) Liberação do substrato no núcleo. Possivelmente SUMO proteases podem atuar nesse mecanismo. Adaptado de Azuma e Dasso, Dev. Cell. (2002).

Embora SUMO modifique os seus substratos alvos através do conjunto E1-

E2-E3 ligase, também é possível a interação direta de Ubc9 com o substrato alvo

(Seeler e Dejean 2003). A expressão diferencial dos genes de SmPIAS e

SmRanBP2 durante o ciclo de vida do parasita sugere que durante o seu

desenvolvimento, S. mansoni pode utilizar diferentes plataformas de sumorilação.

Baseado nos resultados obtidos até o momento de expressão dos genes

que codificam para SUMO-1, Ubc9, PIAS e RanBP2 em S. mansoni, juntamente

com o padrão de sumorilação sugerem que em cercárias esta modificação pode

ocorrer através do reconhecimento direto do motivo ψKxE do substrato, pela Ubc9,

e posteriormente ocorre a ligação de SUMO mediada pela E2 conjugadora, num

processo independente de SUMO E3 ligases. Ao contrário, em vermes adultos, a

ligação pode ocorrer através da plataforma SUMO-E1-E2-E3 (Figura 38). Futuros

experimentos estão sendo delineados para tentarmos responder estas questões.

___________________________________________________________Discussão 118

Figura 38: Possível interação entre as enzimas que promovem a sumorilação dos substratos alvo. (A) Os resultados de expressão dos genes que codificam para o sistema de sumorilação, sugerem uma interação direta entre a enzima Ubc9, SUMO e os substratos. (B) Regulação da sumorilação por E3 ligases do tipo RING em vermes adultos, que proporciona maior especificidade de substratos.

5.4.Proteases de SUMO

As proteases desempenham um papel central na célula através da

manutenção da integridade celular (Takeichi, 1991; Gumbiner 1996), regulação da

adesão célula-célula e regulação da expressão gênica no núcleo (Reiss et al,

2005).

As proteases de SUMO ou Ulps (Ubiquitin –like proteases) foram

denominadas SENPs (Sentrin especific protease) (1 a 7) em humanos (Gong et al

2000; Hang e Dasso, 2002; Kim et al 2000). Várias isoformas de Ulps forma

detectadas também em camundongos, e sabe-se que a isoforma de SENP2, ou

seja, a proteína SuPr1 (SUMO protease 1) desempenha um papel fundamental na

regulação do fator de transcrição Sp3, ao catalisar a reação de remoção de SUMO

(Gill 2004). Sendo a reação de sumorilação reversível e fortemente controlada

Ubc9

SUMO

Substrato

A

RING E3

Ubc9

SUMO Substrato

B

___________________________________________________________Discussão 119

durante o processo, os exemplos acima ilustram a importância de proteases

específicas para a via de sumorilação.

O parasita apresenta uma diversidade de proteases de SUMO durante o

seu ciclo de desenvolvimento, como mostra a Tabela 4. Diversos estudos indicam

que a porção N-terminal dessas proteínas é quem determina a localização e,

portanto o reconhecimento dos seus respectivos substratos (Watts, 2004).

As Ulps são definidas como cisteíno proteases, possuindo tanto a

habilidade de gerar de SUMO madura, bem como de desconjugar SUMO, clivando

a ligação isopeptídica de substratos específicos (Watts, 2004). A seqüência da

proteína predita para o S. mansoni apresenta os resíduos de His, Cis e Asp do

sitio catalítico conservados, pertencendo à classe das peptidases C-48, assim

como as enzimas desubiquitinadoras (Figura 35).

Os resultados obtidos até o momento sugerem uma expressão diferencial

de SmULP1 durante o desenvolvimento (Figura 36). Em cercárias, não fomos

capazes de encontrar expressão desse transcrito. A expressão dessa protease se

inicia depois de 8.5h de cultivo in vitro, voltando a níveis quase indetectáveis após

3 dias de cultivo. Além disso, esse perfil de expressão sugere que a taxa de

desumorilação em cercarias é baixa e que o seu aumento progressivo transcrição

em esquistossômulos com 8.5 h, 18.5 h, 24 h e 48 h de cultivo pode estar

relacionado com um aumento da desumorilação de substratos específicos neste

estagio de vida do parasita. Esta hipótese colabora com a teoria que a

sumorilação tem um efeito estabilizador de proteínas (Melchior 2000). Futuros

experimentos de expressão dessa protease em esquistôssomulos de 5 e 7 dias,

bem como do proteoma da via de sumorilação, podem confirmar qual o papel da

___________________________________________________________Discussão 120

sumorilação na biologia celular do parasita. Por outro lado, como o genoma deste

parasita ainda não está completo, ainda podem ser encontradas outras enzimas

que escaparam dos métodos de predição utilizados neste trabalho.

Portanto, os nossos resultados sugerem que a via de modificação pós-

traducional dependente de SUMO em S. mansoni, pode estar relacionada, com

esse intrigante e ainda molecularmente pouco esclarecido processo de

metamorfose desacoplada do crescimento, que esse parasita experimenta. Desta

forma, essa via pode representar um dos vários sinais moleculares que este

parasita recebe, para seguir essa rota migratória, que desencadeia várias

mudanças morfológicas, desde movimentos de alongamento e retração,

desenvolvimento de um tegumento mais complexo e reorganização do sistema

nervoso (Lawson e Wilson, 1980; Crabtree e Wilson, 1980; Hockley e McLaren,

1973), para no final se desenvolver completamente no sistema porta-hepático do

hospedeiro e completar o seu ciclo de parasitismo.

6. Conclusões

__________________________________________________________ Conclusões 122

• Através dos dados do projeto transcriptoma, podemos sugerir que o

sistema de sumorilação é conservado nesse parasita.

• Os genes que codificam para a proteína SmSMT3C e SmUBC9,

apresentam todos os domínios conservados em relação aos outros

organismos.

• Os genes apresentam uma estrutura genômica contendo íntrons,

característica comum a alguns genes de S. mansoni. O gene que codifica

para SmSMT3C apresenta as sequências consenso de junção de splicing

GT...AG, enquanto que o gene que codifica para SmUbc9 obedece a regra

não – canônica de splicing AT...AC.

• A complexidade do genoma do parasita fica ressaltada pela identificação de

um pseudogene para Ubc9, podendo exercer importantes funções na

regulação da transcrição estágio específica.

• Os nossos resultados apontam para a existência de duas SUMO E3 ligases

no genoma do parasita sendo expressas principalmente em vermes adultos

e esquistossômulos. A baixa expressão de SUMO E3 ligases em cercarias

juntamente com a presença de conjugados sumorilados sugere que a

plataforma de sumorilação em cercárias pode se dar diretamente através

da ligação de Ubc9 ao domínio ψKXE e posterior transferência de SUMO

ao substrato alvo.

• A regulação da sumorilação através da ação das proteases de SUMO ou

ULP1 também pode ser um mecanismo importante na biologia do parasita.

Devido ao fato dessas proteases serem expressas de uma forma estágio-

__________________________________________________________ Conclusões 123

específicas, também reforça a idéia de que a sumorilação estabiliza a meia

vida de proteínas, nos diversos tipos de ambientes e estresses que este

parasita experimenta durante o seu ciclo de vida.

• Em S. mansoni o padrão de sumorilação é preferencialmente de proteínas

nucleares não histonas.

• Devido ao fato da via de sumorilação estar envolvida em importantes

aspectos da fisiologia celular, incluindo, transcrição dos genes, mitose,

localização sub-celular, transporte núcleo-citoplasma e regulação da

estabilidade protéica em S. mansoni, esta via também pode contribuir com

aspectos importantes, relacionados à manutenção do parasitismo, e

também com o complexo plano de desenvolvimento sofrido por esse

parasita durante um ciclo de vida completo.

Resumo

__________________________________________________ Resumo 125

Os parasitas do gênero Schistosoma são agentes causadores da

esquistossomose, uma doença crônica, que desabilita os indivíduos portadores e

afeta milhares de pessoas em vários locais do planeta. O S. mansoni apresenta

um ciclo de vida complexo dependente de dois hospedeiros: um invertebrado, o

caramujo, do gênero Biomphalária; e o definitivo, o homem. Recentemente, o

consórcio de sequenciamento do transcriptoma do parasita, liberou cerca de

14.000 ESTs, representando cerca de 92% dos genes expressos pelo parasita.

Essas seqüências incluem genes responsáveis pelo metabolismo, integridade

celular e vias de modificação pós-traducionais. Até o momento, poucas

informações são conhecidas sobre o papel das modificações pós-traducionais no

desenvolvimento do parasita. A SUMO, da sigla em inglês Small ubiquitin modifier,

é covalentemente ligada a um amplo espectro de substratos e pode regular a

atividade de várias proteínas eucarióticas.

Na tentativa de entender os aspectos da sumorilação no desenvolvimento

do parasita, foi realizada uma busca através dos bancos de dados de seqüências

de DNA disponíveis para o parasita, baseando-se na identidade de seqüências

relacionadas à via de sumorilação dos outros organismos. Desta forma de posse

das seqüências e utilizando ferramentas de biologia molecular foi possível

caracterizar a via de sumorilação em S. mansoni. A análise da estrutura genômica

para o gene que codifica SmSMT3C, mostrou que a região codificadora é

interrompida por dois pequenos íntrons. A ORF codifica para uma proteína de 90

aminoácidos, bastante conservada durante a evolução. A expressão deste

transcrito foi avaliada através de RT-PCR e podemos constatar que esse expresso

durante todas as fases do desenvolvimento estudadas.

__________________________________________________ Resumo 126

Em relação ao gene SmUbc9, podemos constatar através do alinhamento

do cDNA e da seqüência genômica, que este gene é interrompido por dois

pequenos íntrons. Também evidenciamos a presença de um pseudogene, o qual

denominamos de ψSmUbc9. O resultado do Western Blot, utilizando anticorpo

anti-ubc9 e extratos nucleares e citoplasmáticos do parasita, revelou uma proteína

de 20KDa. A expressão do transcrito de SmUbc9 foi avaliada, e constatamos que

o gene é expresso em todas as fases do ciclo analisadas. Através do perfil de

expressão das SUMO E3 ligases (Siz-PIAS e RanBP2) e da enzima

desumoriladora ULP1, podemos contatar que esses transcritos são

diferencialmente expressas durante as fases do desenvolvimento estudadas.

Portanto, os nossos resultados sugerem que a via de sumorilação pode ser

importante para o entendimento de vários aspectos da biologia do parasita, como

a regulação da expressão gênica, a integridade do genoma e transdução de

sinais.

Summary

___________________________________________________________ Summary 128

Schistosomes are parasitic blood flukes which causes the chronic

debilitating disease schistosomiasis, affecting hundreds of millions of people

worldwide. The S. mansoni presents a complex life cycle dependent of two hosts:

an invertebrate – the Biomphalaria snail, and a vertebrate – the man. Recently was

released by Transcriptome Sequencing Project about 14,000 sequences covering

92% of total of the expressed genes of the parasite, including genes responsible

for metabolism, cell integrity and posttranslational modification pathways. To date

little is known about the roles of post translational pathways in the development of

S. mansoni. SUMO, the small ubiquitin modifier, is covalently attached to a broad

spectrum of substrates and is well-known that the covalent linkage of SUMO to its

targeted substrates may regulate protein activity in eukaryotes.

In the attempt to understand the role of SUMO modification in S. mansoni

development we assembled a list of potential components of the SUMO pathway

from genome draft of the parasite. Our searches were based on the similarity of

these pathway components related to other organisms. The genomic structure was

evaluated for SmSMT3C (SUMO-1) and our results suggest that the coding region

is interrupted by small introns. The ORF for SmSMT3C codes a protein of the 90

amino acids presenting high degree of similarity and conserved motifs related to

SUMO from other organisms. RT-PCR for gene expression evaluation was

performed and SmSMT3C transcript is highly expressed through life cycle.

Immunoblot analysis using an isoform-specific antibody detected SUMO

conjugates in crude S. mansoni extracts.

The ORF analysis for SmUbc9 has shown a predicted protein which is

highly conserved through organisms analyzed. The alignment of cDNA and

___________________________________________________________ Summary 129

genomic sequences has shown that SmUbc9 is interrupted by small introns and we

evidenced the presence of ψSmUbc9 pseudogene on genome of the parasite.

Furthermore Western blot using human anti-ubc9 has detected a protein of 20kDa.

In addition mRNA expression of SmUbc9 gene was also evaluated in the

developmental stages of the parasite. Resulting transcripts were expressed in adult

worms, cercariae, schistosomula and eggs. qRT-PCR was also performed using

primers designed for E3 ligases (Siz/PIAS and RanBP2), and desumoylating

enzyme (ULP1), suggesting these genes are differentially expressed. Taken

together our results suggest that SUMO pathway may be crucial for understanding

several unclear aspects of S. mansoni biology regards to the regulation of gene

expression, genome maintenance, and signal transduction.

Referências Bibliográficas

______________________________________________ Referências Bibliográficas 131

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Apêndices

_________________________________________________ Apêndice

146

Apêndice 1: SmSMT3C Alinhamento dos cDNAs de SMT3C no ciclo de vida do parasita CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment adulto ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60 cercaria ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60 ovos ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60 esquistossomulos ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60 ************************************************************ adulto CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120 cercaria CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120 ovos CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120 esquistossomulos CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120 ************************************************************ adulto ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180 cercaria ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180 ovos ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180 esquistossomulos ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180 ************************************************************ adulto AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240 cercaria AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240 ovos AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240 esquistossomulos AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240 ************************************************************ adulto GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276 cercaria GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276 ovos GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276 esquistossomulos GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276 ************************************

Alinhamento de SmSMT3C e SmUbiquitina Smubiquitina 1 -------------MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAG 47KQLEDGR SmSMT3C 1 MTDSANKEAPSEHINIKVQGQEGSIIHFKIRKSTPFKKLITAYCDRLGVNQSAVRFFFDG 60NSVHETD Smubiquitina 55 TLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG- 76 SmSMT3C 68 TPGSLEMEENDTVEVFQAQTGGL 90 Análise dos domínios da proteína predita SmSMT3

Descriptions

Title PssmId Multi-Dom E-value cd01763, Sumo, Small ubiquitin-related modifier (SUMO) proteins are conjugated to nume... 29166 No 6e-27 COG5227, SMT3, Ubiquitin-like protein (sentrin) [Posttranslational modification, prote... 34824 No 2e-17 smart00213, UBQ, Ubiquitin homologues; Ubiquitin-mediated proteolysis is involved in t... 47543 No 0.000004 pfam00240, ubiquitin, Ubiquitin family. This family contains a number of ubiquitin-lik... 40338 No 0.0001

_________________________________________________ Apêndice

147

Apêndice 2: SmUbc9 Alinhamento do cDNA de SmUbc9 no ciclo de vida do parasita CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment adulto TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60 cercaria TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60 ovos TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60 esquistossomulos TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60 ************************************************************ adulto TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120 cercaria TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120 ovos TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120 esquistossomulos TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120 ************************************************************ adulto ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180 cercaria ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180 ovos ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180 esquistossomulos ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180 ************************************************************ adulto TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240 cercaria TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240 ovos TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240 esquistossomulos TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240 ************************************************************ adulto TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300 cercaria TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300 ovos TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300 esquistossomulos TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300 ************************************************************ adulto TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360 cercaria TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360 ovos TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360 esquistossomulos TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360 ************************************************************ adulto CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400 cercaria CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400 ovos CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400 esquistossomulos CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400 ****************************************

_________________________________________________ Apêndice

148

Apêndice 3: SUMO E3 ligases Seqüência do cDNA que codifica PIAS 1 CGAAACTTGAATGAAGACGGTAGCGTAACTCGGAATACAATGTCTGGACCTTCTCAAACA 60 61 CCTGTTATTGCTGAATTGAATTTAGTATGTCCAGTATTTCGTACGAGAATGCGTATACCT 120 121 GGTCGTATTGCAGGTTGTCAACATGTAGAGGCATTTGATATGGAAGCTTTTCTACGTAGA 180 181 GAGGTTCTTTGGCCCAGGCTGAATTGTCCAATTTGTGGACATAAAAGCCCTGCTGGGCTG 240 241 GATGGATTATGCATTGATACCACCATATTGTATGCTTCGCAATTAGTACCTCAGTCAGCT 300 301 GAAAGTATTCTTGTACGCTCAGATGGTTATTGGCGATTGGTACCCCCATTATGTTTAGAT 360 361 CTGCCTAATGAAGTTGATCAATGGCAACCTTTAATTGGTCCACTGACAGAAGTAGTATCT 420 421 CAGGCTTTTAATCAGATCTCGTCAAAAGGTTCACTTCGTGGACAAAATCCCAGCAGTGTT 480 481 GGAGTACGACAAATTACTACTCATTGCCATACAAATGTCTCTCAAACAATACCTGATTGG 540 541 AATCAATCGCCTTTACAAAGAATTTCACCTCAGCAACAACGACAACCACC-----------590 PIAS ORF:

>lcl|Sequence 1 ORF:16..996 Frame +1 MSFVVIXYQNHLQXGHWPPDAVQIRFNDYLLRLDRSSVNGGQPAHKVACVKQLCRPGRNQLEIAILGLGE DPNQPSTMAKRRATAQTLEAHRFAAFMAHMPALNVLLDGLQRRRPAGVNTLCDILEGRIGTRNLNEDGSV TRNTMSGPSQTPVIAELNLVCPVFRTRMRIPGRIAGCQHVEAFDMEAFLRREVLWPRLNCPICGHKSPAG LDGLCIDTTILYASQLVPQSAESILVRSDGYWRLVPPLCLDLPNEVDQWQPLIGPLTEVVSQAFNQISSK GSLRGQNPSSVGVRQITTHCHTNVSQTIPDWNQSPLQRISPQQQRQP

Análise do domínio conservado utilizando Pfam

MIZ zinc finger This domain has SUMO (small ubiquitin-like modifier) ligase activity and is involved in DNA repair and chromosome organisation [2].

_________________________________________________ Apêndice

149

RanBP2 Sequência do cDNA que codifica para RanBP2 1 ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55 56 TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115 116 AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175 176 CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235 236 CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295 296 TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355 356 GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415 416 GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475 476 GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535 536 CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595 596 TCTGAGCAGCCTGA-----------------------------------------------609

Alinhamento RanBP2 expresso durante o ciclo de vida do parasita: adultos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55 ovos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55 esquistossomulos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55 ************************** ************ **** ************* adultos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115 ovos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115 esquistossomulos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115 ************************************************************ adultos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175 ovos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175 esquistossomulos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175 ************************************************************ adultos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235 ovos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235 esquistossomulos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235 ************************************************************ adultos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295 ovos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295 esquistossomulos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295 ************************************************************ adultos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355 ovos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355 esquistossomulos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355 ************************************************************ adultos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415 ovos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415 esquistossomulos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415 ************************************************************ adultos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475 ovos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475 esquistossomulos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475 ************************************************************ adultos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535

_________________________________________________ Apêndice

150

ovos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535 esquistossomulos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535 ************************************************************ adultos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595 ovos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595 esquistossomulos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595 ************************************************************ adultos TCTGAGCAGCCTGA 609 ovos TCTGAGCAGCCTGA 609 esquistossomulos TCTGAGCAGCCTGA 609 **************

ORF: >S.m MPQKIKVVTGEENDDVIFCQRAKLYRWDNNTWHERGVGDLKLLRSTITGVIRCVMRXDHVITSEFAAACRSSIWEGTQRVXP Análise do domínio conservado utilizando Pfam:

_________________________________________________ Apêndice

151

Apêndice 4: Protease específica de SUMO (ULP1) 1 GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60 61 TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120 121 ATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180 181 GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240 241 ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300 301 ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360 361 ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420 421 ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480 481 CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540 541 GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591

alinhamento da seqüência no ciclo de vida: adulto GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60 ovos GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60 esquistossomulos GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60 ************************************************************ adulto TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120 ovos TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120 esquistossomulos TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120 ************************************************************ adulto TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180 ovos TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180 esquistossomulos TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180 ************************************************************ adulto GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240 ovos GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240 esquistossomulos GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240 ************************************************************ adulto ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300 ovos ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300 esquistossomulos ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300 ************************************************************ adulto ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360 ovos ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360 esquistossomulos ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360 ************************************************************ adulto ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420 ovos ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420 esquistossomulos ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420 ************************************************************ adulto ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480 ovos ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480 esquistossomulos ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480 ************************************************************ adulto CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540 ovos CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540 esquistossomulos CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540 ************************************************************ adulto GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591 ovos GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591 esquistossomulos GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591 ***************************************************

_________________________________________________ Apêndice

152

Analise da ORF: >Sm MVIKFLLTIYYNVRSQHQTNLPRIAVLSTFFYAKLTAPIGGGYSGVRRWTRQIKLFDQDIILIPIHDRGM HWCLSCIDLRVKTITYYDSMGSGNMKCLNQLMDYLKNESLDKRNVELKDPDSWKLVNTEDTVPQQYNGSD CGVFLCTFGEFISRDASFKSNSRGRHGGREHATTGPIRP

Detalhes da interação do domínio peptidase C48 com as proteínas que apresentam esse domínio depositado no banco de dados Pfam Valores de confiança do alinhamento da seqüência primária de ULP1 utilizando Pfam: Alinhamento cruzado da proteína de S. mansoni com a proteína de S. japonicum no banco Pfam:

_________________________________________________ Apêndice

153

Conservação do domínio C48 entre os filos artropoda, plathelmintos e fungi | | | | | +---Arthropoda(19) | | | | | | | +---Hexapoda(19) | | | | | | | +---Insecta(19) | | | | | | | +---Pterygota(19) | | | | | | | +---Neoptera(19) | | | | | | | +---Endopterygota(19) | | | |

| | | +---Diptera (19) | | | | | | | +---Nematocera(3) | | | | | | | | | +---Culicoidea(3) | | | | | | | | | +---Culicidae(3) | | | | | | | | | +---Anophelinae(3) | | | | |

| | | | +---Anopheles gambiae str. PEST (3) | | | | | | | +---Brachycera(16) | | | | | | | +---Muscomorpha(16) | | | | | | | +---Ephydroidea(16) | | | |

| | | +---Drosophilidae (16) | | | |

| | | +---Drosophila pseudoobscura (3) | | | |

| | | +---Drosophila grimshawi (1) | | | |

| | | +---Drosophila melanogaster (12) | | | | | +---Platyhelminthes(3) | | | | | +---Trematoda(3) | | | | | +---Digenea(3) | | | | | +---Strigeidida(3) | | | | | +---Schistosomatoidea(3) | | | | | +---Schistosomatidae(3) | | |

| | +---Schistosoma japonicum (3) | | | +---Mycetozoa(4) | | | | | +---Dictyosteliida(4) | | |

| | +---Dictyostelium discoideum AX4 (4) | |

| +---Fungi (47) | | |

| | +---Ascomycota (39) | | | |

| | | +---Pezizomycotina (18) | | | | | | | | | +---Eurotiomycetes(9) | | | | | | | | | | | +---Eurotiales(9) | | | | | |

| | | | | +---Trichocomaceae (9) | | | | | | | | | | | +---Emericella(3) | | | | | | |

| | | | | | +---Aspergillus nidulans FGSC A4 (3) | | | | | |

| | | | | +---Mitosporic trichocomaceae (6)

_________________________________________________ Apêndice

154

| | | | | |

| | | | | +---Aspergillus oryzae (3) | | | | | |

| | | | | +---Aspergillus fumigatus (3) | | | | |

| | | | +---Sordariomycetes (9) | | | | | | | | | +---Hypocreomycetidae(3) | | | | | | | | | | | +---Hypocreales(3) | | | | | | | | | | | +---Nectriaceae(3) | | | | | |

| | | | | +---Gibberella zeae (3) | | | | | | | | | +---Sordariomycetidae(6) | | | | |

| | | | +---Sordariales (6) | | | | | | | | | +---Chaetomiaceae(3) | | | | | |

| | | | | +---Chaetomium globosum CBS 148.51 (3) | | | | | | | | | +---Sordariaceae(3) | | | | |

| | | | +---Neurospora crassa (3)

Schistosoma mansoni encodes SMT3B and SMT3C molecules responsible for

posttranslational modification of cellular proteins.

Fernanda J. Cabral, Olavo dos S. Pereira Jr., Camila S. Silva, Renata G. Sá, Vanderlei

Rodrigues*

Department of Biochemistry and Immunology, School of Medicine, University of São Paulo

Av Bandeirantes 3900, Monte Alegre, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil

Key words: S.mansoni, SMT3, post-translational modification

Abstract

The sumoylation pathway is a posttranslational modification of nuclear proteins

widespread among several organisms. SMT3C is the main protein involved in this process and

it is covalently conjugated to a diverse assortment of nuclear protein targets. Ubiquitin and

SUMO pathways are both biochemically similar but substrates modified posttranslationally by

SMT3C are not targeted to proteasome degradation. To date 3 SUMO paralogues (SMT3C,

A/B) have been characterized in mammals and plants. In this work we characterized two SUMO

related genes, named SMT3B and SMT3C throughout the parasite life cycle.

Abbreviations: mRNA, messenger RNA; RT-PCR, reverse transcription – polymerase chain

reaction; CTAB, hexadecyltrimethylammonium.

*Corresponding Author. Tel: +55-16-3602-3235; Fax: 55-16-3633-6840

E-mail address: [email protected] (V. Rodrigues)

2

1.Introduction

The posttranslational protein modification process plays an important role on protein

function by altering its activity, sub cellular localization and/or ability to interact with other

proteins. SUMO (Small ubiquitin modifier) is the best-characterized member of a growing family

of ubiquitin-like proteins. This protein resembles ubiquitin in a structure but it does not target its

substrates to proteolysis by 26S proteasome (Melchior, 2000). In mammalian cells, SUMO

modification system plays a role such as modulation of protein-protein interactions,

transcriptional control, and stabilization of proteins by blocking of ubiquitination sites (Gotissa et

al, 1999).

There are three SUMO paralogues SUMO 1, SUMO 2 and SUMO3 described in human

and mice also named SMT3C, SMT3B and SMT3A respectively. Whereas the mature forms of

SUMO 2 and SUMO 3 are 95% identical to each other at the amino acid level, SUMO2/3

subfamily proteins are only 47% identical to SUMO 1 (Saitoh and Hinchey 2000). Very limited

data are available at the moment with regard to the abundance of SUMO 2 versus SUMO 3 at

the protein level, since there is no tool to distinguish between SUMO 2 and 3 proteins (Saitoh,

2004).

The SUMO 2/3 conjugation or sumoylation process is identical and requires the same

enzymes of the SUMO 1 conjugation process, first of all depending of an enzymatic complex

called AOS1/UBA2 heterodimer for SUMO activation (E1) and a single E2 enzyme (UBC9) for

conjugation (Jentsch and Pyrowolakis, 2000). In contrast to SUMO–1, SUMO 2/3 is able to form

poly-SUMO chains (Tatham et al, 2001).

Schistosoma mansoni is the agent of schistosomiasis, a parasitic disease affecting 300

million people around tropical and subtropical areas of the world (WHO, 2004). Schistosomes

are trematodes sexually dimorphic, and through its development the parasite undergoes several

morphological and biochemical changes to adapt itself to different habitats and hosts

(vertebrate and invertebrate). Posttranslational pathways may play an important role in

development of parasites. Over the years several groups have been identified important targets

to suffer posttranslational modifications such as SmRK1 a novel protein member of the TGFβ

3

receptor family, which is expected to promote the target and cellular sub-localization of the

modified substrates (Beall et al, 2000)

However in parasites little is known about SUMO pathway or the nature of its targets,

here we report the molecular characterization of transcripts encoding S. mansoni SUMO-2

(SMT3B) and SmSUMO-1 (SMT3C), respectively. The profile expression of both genes was

investigated through the biological cycle of the S. mansoni, and the analysis of the sequences

shows the clear evidence of the conserved modification system in this parasite.

2. Materials and Methods

2.1. Identification and analysis of SMT3B and SMT3C in S. mansoni. A cDNA encoding the

open reading frame of Schistosoma mansoni SMT3B (SmSMT3B) was obtained by RT-PCR,

using the forward primer 5’-TCTAATTCGTTTCAGAGAGACTCCCGC-3’ and reverse primer 5’-

CGAAAACGAAGAGTTTATTTGTAAGATAA-3’ as idealized from Caenorhabditis elegans

sequence (Choudhury et al, 1997). The S. mansoni gene encoding SMT3C, was identified by

BLAST searches using the S. mansoni transcriptome database at http://bioinfo.iq.usp.br/schisto,

deposited under the number 601278 (Verjovski-Almeida, 2003). The corresponding predicted

ORFs were aligned using the ClustalW algorithm available at www2.ebi.ac.uk/clustalw. The

primers were: fw 5´-ATGACTGATAGTGCCAATAA-3´ / rv 5´-CAATCCACCAGTTTGTGCCT-3´.

The PCR reactions for both genes were conducted as follows: initial desnaturation for 5

minutes, following 35 cycles of desnaturation at 95°C for 1 minute, annealing at 55°C and

extension at 72°C for 1 minute and the final extension at 72°C for 10 minutes. Negative controls

were performed using all PCR reagents less cDNA. All PCR products were cloned in pGEMT-

easy cloning vector (PROMEGA) and were sequenced in ABI 3100 automated sequencer

(Applied biosystem), using dye terminator kit.

2.3. Construction of phylogenetic trees and analysis of the sequences. The ClustalW alignments

of the SmSMT3B and SmSMT3C predicted proteins sequences were used for generation of the

trees as a requirement for the utilization of the Mega software (version 3.0) described by Kumar

et al 2004. The confidence of the branches was evaluated by bootstrap analysis using 1,000

samplings. Phylogenetic trees were visualized using Treeview v16.6 (Page et al, 1996). The

GenBank proteins sequences and accession numbers used in these analyses were as follows:

SMT3B ortologues from Bombix mori, GB access ABD36355; Drosophila melanogaster, GB

4

access NP477411; Saccharomyces cerevisiae, GB access NP010798; Arabidopsis thaliana,

GB access NP200327. SMT3C orthologs from Rn (Rattus norvegicus gi|19424298); Hs (Homo

sapiens gi|1770519); Sc (Saccharomyces cerevisiae gi|30584365); Mm (Mus musculus

gi|4091893); Dm (Drosophila melanogaster gi|6934292); Sj (Schistosoma japonicum

gi|28341405); Ce (Caenorhabditis elegans gi|2501447); Cb (Caenorhabditis briggsae

gi|39589515); At (Arabidopsis thaliana gi|1707372); Sp (Schizosaccharomyces pombe

gi|11279016). The alignment of SmSMT3B proteins sequences was done with the ortologs from

databanks as follow: AAX30012 Schistosoma mansoni; NP200327 Arabidopsis thaliana;

XP001256201 Bos taurus; NP 001003422 Danio rerio; XP521229 Pan troglodytes; spQ6GPW2

Xenopus laevis; NP579932 Mus musculus. The searche for DNA and protein identity was done

using BLAST algorithm at www.ncbi.nlm.nih.gov. The analyses of the predicted proteins were

done using expasy at www.expasy.org using LAlign, PRODOM and Prosite algorithms. The

alignment of predicted SmSMT3B and SmSMT3C were performed using BOXSHADE.

2.4.mRNA isolation and Northern blot analysis. Ten micrograms of total RNA from adult worms

were electrophoresed in a 1% agarose gel and transferred to nylon Hybond N+ (GE

Healthcare). Specific SmSMT3B and SmSMT3C radiolabeled probes were constructed by using

Random Primers DNA Labelling System (Invitrogen) and hybridization procedures were

executed as described (Maniatis, 1989).

2.5. Preparation of protein extracts. B. glabrata infected snails were induced to shed cercariae

under light exposure for 2h and the cercariae were recovered by sedimentation on ice. Adult

worm parasites were obtained by liver perfusion of Balb/c mice after 50 days of infection. Crude

cytosolic lysates were prepared from both stages of the parasite. Briefly, the parasites were

suspended in buffer A (5mM Tris-HCl pH 8,0; 1% glycerol; 1mM EDTA; 1mM PMSF; 1mM DTT

and 1mM MG132), homogenized in Polytron®, and centrifuged at 10,000xg for 30 minutes. The

pellet was discarded and the supernatant centrifuged at 40,000xg for 60 minutes. The protein

content was estimated by the Pierce method (Smith et al 1985).

The nuclear protein extract from adult worms was prepared by homogenization of the

parasites in buffer B (10 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl2; 0.1% Triton X-100 and

1 mM PMSF), followed by centrifugation at 2000xg for 10 minutes at 4ºC. The supernatant

containing the cytosolic fraction was stored at -70ºC. The pellet containing the nuclei was

5

resuspended in 2 ml of buffer B and centrifuged as described above. Finally, the nuclei were

incubated for 45 minutes in buffer B plus 0.8 M NaCl and centrifuged at 10,000xg for 45 minutes

at 4ºC. The supernatant was dialyzed for 3 hours in buffer C (20mM HEPES pH 7.6; 5mM

MgCl2; 0.1mM EDTA; 1mM DTT and 10mM PMSF). The protein content was determined as

before described and 20 µg of both cytosolic and nuclear fractions were loaded onto a 10%

SDS-PAGE (Laemmli, 1970); separation was followed by staining with Comassie Brilliant blue.

2.6.Immunoblot analysis. Nuclear and total protein extracts from adult worms and cercariae

were transferred to a PVDF membrane (Hybond – Amersham Biosciences) (Towbin et al,

1992). Following an overnight blocking step in TBST buffer (10mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM

NaCl, 5% non-fat milk and 0.05% Tween 20), the blotted proteins were submitted to

hybridization with an anti-SUMO antibody (Santa Cruz Biotech) at 1:500 dilution for 4h in the

same buffer. Biotinylated anti-goat IgG conjugated to alkaline phosphate at 1:1000 dilution was

used as the secondary antibody during a 90 min incubation. SUMO-conjugated proteins were

visualized after incubation of the membrane with the alkaline phosphatase substrates

NBT/BCIP (Invitrogen) as described by the manufacturer.

3. Results

3.1. Sequencing and analysis of cDNAs coding for SmSMT3C and SmSMT3B proteins

The full-length cDNA sequence of SmSMT3B presents a 742-bp size, and the sequence

was deposited on GENBANK under the number AY817504. The position of the ATG start codon

was inferred at position 327 and encodes a protein of 94 amino acids presenting a theoretical

molecular mass of 10KDa and a pI equal to 8,82.

Amino acids sequence comparison showed that SmSMT3B, shares the Ub-fold motif

important for folding and conjugation to the protein to its targets, as well as the conserved

residues of C-terminal Gly-Gly important for conjugation (Figure 1). As a result, it is likely that

SmSMT3B assume a similar shape to human SUMO-1 despite substantial sequence

divergence. Otherwise the comparison of amino acid sequence of SmSMT3B with SmUbiquitin

(Guerra-Sá, personal communication) has also shown that SmSMT3B and Ubiquitin shares

approximately 16% of amino acid sequence. SmSMT3B also present an extended N-Terminal

tail and two amino acids more at C-terminal region after Gly-Gly motif, which is necessary to be

processed by proteolytic enzymes in order to become active (Melchior, 2000).

6

In the effort to analyze the similarity of SmSMT3B sequence compared to others

organisms we performed searches of the predicted protein sequences, and we have found that

SmSMT3B is conserved through metazoans (Figure 1A). Afterwards using phylogenetic tools

we have found that SMT3B subfamilies should have arisen after an evolutionary split of insects

and yeast (Figure 1B). This finding suggest that subfamily SUMO 2/3 polypeptides are present

in at least some invertebrates species, although their function, abundance and nature of its

targets is less understood than their mammalian homologues.

In order to validate the in silico predictions of the SMT3C gene we have used the

molecular reconstitution approach described before (Material and Methods) and allow us to

obtain a 270 bp cDNA fragment of the SmSMt3C gene from adult worms total RNA. This cDNA

contains an open reading frame encoding a protein of 90 amino acid residues, and presents all

protein sequence features that we have already been described for SmSMT3B sequence.

Furthermore the analysis using LAlign on Expasy website, we have showed that SmSMT3C and

its paralogue in S. mansoni SmSMT3B (Figure 2) present 48.8% of similarity of sequence, in

agreement with data in other organisms (Saitoh and Hinchey, 2000).

In addition the alignment of predicted protein sequence and philogenetic analysis from

plants, worms, human, fruit fly and yeast, showed that SMT3C protein predicted sequence is

well conserved (Figure 3A). The phylogenetic analysis showed that SmSMT3C is closely related

to S. japonicum orthologs, as expected from the evolutionary proximity between these parasites

(Figure 3B). Even though C. elegans is considered closely related to S. mansoni, an ancient

splitting of the SUMO–1 gene is evident when comparing these organisms (Figure 3B).

3.2. Genomic structure of the SmSMt3C gene

Genomic DNA amplification using SmSMT3C specific primers (the same used for RT-

PCR), showed a DNA amplification transcript with 400 bp (Fig. 3C1). The alignment of predicted

aminoacids sequences from cDNA and genomic transcript showed that the coding region of

SmSMT3C is interrupted by two small introns with 28 and 36 bp respectively (Fig. 3C2).

3.3. Expression profile of SmSMT3B and SmSMT3C genes during the parasite life cycle

The endogenous mRNA expression of SmSMT3C/B genes through parasite stages of

adult worms, eggs, schistosomula and cercariae were compared by semi-quantitative RT-PCR

using α-tubulin gene as internal control (Figure 4A). The results showed both genes are

7

expressed in all stages and the SmSmT3B gene showed a constitutive expression in all stages

and the SmSMT3C gene showed an expression level 7 to 9 times higher than SmSMT3B

approximately. Interesting the SmSMT3C gene showed a very low expression level in cercariae

stage.

3.4 Northern blot analysis

The SmSM3Tb and SmSM3TC probes recognized messages with 1.3 Kb and 1.0 Kb

respectively and also another message with 1.8 kb was recognize with SmSMT3C probe (Fig.

4B). Since this gene showed the existence of introns, this last message probably is a immature

form of the SmSM3TC mRNA.

3.5 The SMT3C conjugation pathway is present in S. mansoni

To confirm that S. mansoni may potentially conjugate SMT3C to other proteins, we used

immunoblot analysis with an anti-SUMO-1 antibody to detect the free and conjugated forms in

crude cytosolic and nuclear extracts from adult worms and cercariae. As shown in Figure 5B,

immunoreactive proteins could be observed in cercariae and adult parasites and the level of

conjugated proteins were more intense in the nuclear fraction of adult worms

4. Discussion

The SUMO conjugation pathway is biochemically similar to ubiquitin, but its

substrates it is not targeted for proteolitic degradation by ATP-ubiquitin-proteasome pathway

(Melchior, 2000). Several studies have shown that SUMO is a nuclear protein related to control

important cellular processes such as genome integrity (Johnson 2004), transcriptional

regulation by modification of transcription factors such as c-Jun and c-Fos (Bossis, et al 2005),

regulation of gene expression by modification of repression complexes (Girdwood et al 2004),

and trafficking of proteins from nucleus to cytoplasm through modification of RANGAP-1 protein

(Matunis et al, 1996).

Based on evolutionary proximity of C.elegans and S.mansoni we idealized primers to

amplify the related SMT3B gene in S. mansoni, and a 600-bp fragment corresponding to

SMT3B cDNA was amplified, and showed an ORF with 282 nucleotides, coding a protein with

94 amino acids (Figure 1A). Amino acids sequence analysis showed the C-terminal Gly-Gly

8

conserved motif responsible for attachment and conjugation of SUMO on its substrates and the

presence of a flexible N-terminal extension which is absent on ubiquitin sequence. As the same

way as ubiquitin, SMT3B has a C-terminal extension of two amino acids (Figure 1A) that might

be processed by SMT3 specific proteases in order to become SUMO mature (Johnson, 2004).

Using the strategy of molecular phylogeny, we grouped our SMT3B sequence with

ortologues from other organisms and we have found that SmSMT3B is well-conserved

throughout the invertebrates. Thus, SmSMT3B is closest of plant SMT3B and it seems to be a

recent aquisition of invertebrates after a split of yeast and insects (Figure 1B). The search for

homologues of SmSMT3B on S. mansoni databanks such as TIGR (The Institute for Genomic

Research), S. mansoni Transcriptome Project, and S. mansoni geneDB was recently performed

and the SmSMT3B sequence is annotated on TIGR database as a mature transcript under the

number NP1435753, and we have not evidenced the presence of introns.

The existence of two paralogs for SMT3 was not expected for invertebrates, but during

our in silico analysis through genome databases of S. mansoni, we have found another paralog

for SMT3 identified as SMT3C. The new paralog was characterized and the genomic structure

of SmSMT3C gene was determined. SmSMT3C gene contains two very small introns of 28 and

36 base pair, respectively. All two introns contain the consensus GT...AG splice junction

sequences (Figure 3C). While the general requirement for the splicing machinery is a minimum

of 50 bp (Wieringa et al 1984; Thompson and Domdey, 1987), all the introns of this gene are

smaller than this requirement. These small introns are characteristic of genes from S. mansoni,

such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Charrier-Ferrara et al 1992), gluthationa

peroxidase (Mei and Lo-Verde 1996), Sm23 (Lee et al 1995). Details of how these small introns

are spliced remain to be elucidated.

SmSMT3C exhibits a C-terminal double glycine, responsible for SUMO-1 conjugation to

the targeted substrate (Jentsch and Pyrowolakis, 2000). The philogenetical analysis of

SmSMT3C, have shown that this gene is conserved through the evolutive scale, and

SmSMT3C sequence belongs the same branch of S. japonicum SMT3 sequence (Figure 3B).

According to Figure 2, both paralogs of SMT3 present 48.8% of identity as previously described

for other organisms (Saitoh 2004).

9

The expression profile of SmSMT3B/C genes in the life cycle of S. mansoni was

evaluated using RT-PCR (Figure 4A). The profile of expression of SMT3C is very similar to

other organisms such as Arabidopsis and mouse, which SMT3C is more abundant than

SMT3B. Because the key role of SMT3B/C genes are posttranslational modification of proteins

then the presence of two paralogs may suggest a variety of targeted substrates to these

modifications. Even though we have not detected the protein levels for SMT3B, our results

using specific antibody for SMT3C show the presence of sumoylated conjugates in nuclear as

well as cytosolic fractions of proteins from adult worms. Previous studies in other organisms,

suggest that the modification SMT3B dependent is related with several kinds of cellular stresses

(Kurepa 2002). In fact during its development S. mansoni cross-talk with different environments

and temperatures as for example 25°C when the parasite is an infective larvae form (cercariae)

or 37°C in the intra mammalian stages, suggesting that the parasite may modify its substrates

through sumoylation pathway to adapt to its environments conditions.

Because S. mansoni presents all genes necessary to conjugate SMT3 to its targeted

substrates, and the presence of nuclear proteins conjugates (Figure 5B), our results suggest

that this posttranslational pathway may be potentially involved on gene expression regulation.

Several studies have shown that SMT3 playing a role on transcription factors modifications (Di

Bacco, 2003) as well as histone modifications, which are associated to transcriptional

repression (Shiio and Eisenman, 2003). The whole mechanism about SMT3 inhibits

transcription is not absolutely clear, but some results suggest that through SMT3 modification

may occur a regulation of assembly of transcriptional complexes (Verger, 2003).

Taken together our results may reinforce the importance of SUMO post-translational

pathway in S.mansoni, and natural targets of this post-translational modification pathway in S.

mansoni constitute the subject of our further investigation

Acknowledgements

This work was supported by Brazilian agencies of research, FAPESP (Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), CAPES (Coordenação de Apoio ao Pessoal de

Nível Superior) and CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico).

We also thank Ms. Elenice A. Macedo and Ms. Olinda M. Brigato for technical assistance.

10

Figures and Legends

Figure 1: Identification and characterization of SmSMT3B gene. (A) Local alignment between

the SmSMT3B amino acids predicted sequence and its ortologues, using CLUSTALW program

at www.ebi.ac.uk and BOXSHADE. Identical residues are shaded in black and similar

residues in grey. (B) Phylogenetic tree for SmSMT3B and its orthologs in others organisms. The

neighbor-joining tree was calculated using Mega 3.0. Linear distances between homologue

sequences are inversely proportional to their amino acid sequence similarity.

Figure 2: Amino acid sequence comparison of the S. mansoni SmSMT3B and SmSMT3C

genes. Identical amino acids residues are shaded in black and similar residues in grey

Figure 3: Organization of S. mansoni SMT3C gene.

(A) Alignment of SmSMT3C protein with other organisms. The alignment shows that the

SmSMT3C amino acids sequence is conserved in comparison to other organisms. The

abbreviations are: Rn (Rattus norvegicus ); Hs (Homo sapiens); Sc (Saccharomyces

cerevisiae); Mm (Mus musculus); Dm (Drosophyla melanogaster ); Sm (Schistosoma mansoni);

Sj (Schistosoma japonicum ); Ce (Caenorhabditis elegans) Cb (Caenorhabditis briggsae) At

(Arabidopsis thaliana) Sp (Schizosaccharomyces pombe).

(B) Phylogenetic tree for SmSMT3C and its orthologs. The neighbor-joining tree was calculated

using Mega 3.0. Linear distances between homolog sequences are inversely proportional to

their amino acid sequence similarity. (C) Amplification of the genomic DNA by PCR using

SmSMT3C gene-specific primers (1). Schematic representation of the SmSMT3C coding region

and the genomic localization of exons with their relative positions (2). The first intron contains

28 bp and the second 36 bp. MW is 1Kb molecular weight markers.

Figure 4: Expression profile of SmSMT3B and SmSMT3 genes.

(A) Expression of SmSMT3B and SmSM3TC genes in four developmental stages of S.

mansoni. Fifty nanograms of mRNA from adult worms, eggs, schistosomula, and cercariae,

were used for semi-quantitative RT-PCR using the α-tubulin gene as a internal control.

Densitometry was performed using Gene Quantity software (Biorad). (B) Ten micrograms of

total RNA from adult worms were used for Northern blot analysis. Specific SmSM3TB and

11

SmSMT3C probes were used to show specific messages. The α-tubulin gene was used as

control of mRNA expression.

Figure 5: Immunoblot of SmSMT3C.

Twenty micrograms of crude preparations obtained as described in section 2.6 were analyzed

by 10% SDS-PAGE followed by immunoblotting with the anti-SUMO-1 antibody. (A) Replica gel

stained with Coomassie Brilliant blue. Nuclear (1) and cytosolic (2) proteins from adult worms

and cytosolic proteins of cercariae (3). (B) Detection of SUMO conjugates for the corresponding

lanes. The arrows indicate SUMO conjugates in both adult worms and cercariae. MW,

molecular weight markers.

12

Figure 1

Figure 2

13

Figure 3

14

Figure 4

Figure 5

15

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Caracterização molecular da via de modificação pós ...livros01.livrosgratis.com.br/cp076004.pdf · de Lucca e Prof. Dr. João Atílio Jorge, pela disponibilidade em participar