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[email protected]/2004
O Que é?
• Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots.
[email protected]/2004
Tipos
• SYBR Green
• TaqMan/FRET
• Molecular Becons
• LUX
• Scorpions
• outros
[email protected]/2004
Vantagens
• Rápida ciclagem• Alto Throughput• Baixo risco de contaminação• Muito sensível• Larga faixa dinâmica• Reprodutibilidade• Quantificável• Não é mais caro que PCR convencional
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Atividade da Taq
5’ nuclease5’ nucleaseSínteseSíntese
Nucleotídeo
Taq 5’ 3’
Direção da síntese
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TaqMan utiliza FRET
Fluorescent Resonant Energy TransferFluorescent Resonant Energy Transfer
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Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação
Número de ciclosNúmero de ciclos
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SYBR Green I
Corante Minor GrooveCorante Minor GrooveBinding.Binding.
Sem probe; Custo mais baixoSem probe; Custo mais baixoque TaqManque TaqMan
Não aceita multiplex.Não aceita multiplex.
Menos que 0.5Menos que 0.5g de DNAg de DNAna amostra.na amostra.
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Especificidade
TaqManTaqMan
Alta especificidade, inerenteAlta especificidade, inerente a química.a química.
SYBR GreenSYBR Green
Baixa especificidade. Espec. Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”observada apenas no “Melt Curve”
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Fases da PCR
Log [DNA]Log [DNA]
# ciclos# ciclos
GeométricaGeométrica
PlateauPlateauLinearLinear
Gel EtBrGel EtBr
[email protected]/2004
0
200000000
400000000
600000000
800000000
1000000000
1200000000
1400000000
1600000000
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA
110
1001000
10000100000
100000010000000
1000000001000000000
10000000000
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA
CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512
10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000
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Problemas nas fases linear e plateau
Fase linearFase linear Efeito PlateauEfeito Plateau
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PCR Qt tradicionais
Uso de competidores Uso de competidores
Compartilha mesmos primers.Compartilha mesmos primers.
Compartilhar mesmas condições.Compartilhar mesmas condições.Competidor = tamanhos diferentes.Competidor = tamanhos diferentes.
Métodos radio / ELISA.Métodos radio / ELISA.
Gráfico conc.Gráfico conc.Limite de número de ciclos.Limite de número de ciclos. ..
.
..
[email protected]/2004
O Que faz o Real Time?
A tecnologia Real Time tem acesso a fase A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade.Geométrica maior qualidade.
São evitadas as fases linear e plateau.São evitadas as fases linear e plateau.
[email protected]/2004
Calibração externaDNA/RNA são amplificados como uma curva DNA/RNA são amplificados como uma curva separada para compensar a eficiência e fornecerseparada para compensar a eficiência e fornecerunidades de quantificaçãounidades de quantificação
# ciclos# ciclos
Detectionthreshold
target A
target B
Log [DNA]Log [DNA]
[email protected]/2004
Log [DNA]Log [DNA]
Cycle #Cycle #
PlateauPlateau
Y=X(1+e)n
GeometricGeometric Y=X2n
Real-Time PCRCaracterísticas do gráfico Real Time
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Número de ciclos PCR
Baseline
Threshold
C T
Controle sem Template
Amostra
Fluo
resc
ênci
a N
orm
aliz
adad
a ”r
epor
ter”
(Rn)
Fase geométrica
Alta CV baixa CVRn
CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA
