RT-PCR em Tempo Real Especificidade Sensibilidade Reproductibilidade Robustez

Problemas inerentes à PCR Amplificação inespecífica Dímeros de primer Eficiência da amplificação Formação de hetero-duplex

Estes problemas podem ser evitados fazendo um BOM desenho de primers

Desenho de primers Avaliem sua seqüência:>20 phred, exon-exon Padronizar tamanho do amplicon: 95-105 bp Padronizar Tm: 60º C (59-61) ou %GC 5% maior

do que a média do genoma (High GC) Padronizar tamanho do primer (19-21 nt) Até 2 G+C nos últimos 5 nt da 3’ do primer Máximo de homopolímeros de G ou C = 3 nt Para genes normalizadores pegar junção exon-

exon

Problemas inerentes à RT Qualidade do RNA:

Extração em paralelo usando mesmo protocolo

Verificar em gel e nanodrop Qualidade do sscDNA:

preparar imediatamente após extração do RNA de boa qualidade

Usar random primer Confirmar qualidade amplificando um gene de

referência Fazer quantidade suficiente para todo o

experimento Não esperem meses para começar

Expressão gênica relativa Relativa a que?

Gene de referência (normalizador): Gene que não sofre regulação nas condições do experimento. É necessário para padronizar a quantidade de sscDNA das diferentes amostras.

Condição de referência (controle): É a condição que serve de “zero” para saber se nosso gene de interesse é induzido ou reprimido nas condições problema.

Gene normalizador Referência bibliográfica não é suficiente! Escolher vários genes (3-12) envolvidos

com metabolismo basal: Ribossomais, fatores de elongação, processamento do DNA, citoesqueleto, etc.

Avaliar esse genes nas condições do experimentos através do GeNORM

Dados de fluorescência

Threshold

Threshold: fixa na fase exponencial, numa região aonde as curvas estão parelas umas as outras e acima do baseline indicado pelo NTCCt ou CP: número de ciclos aonde a amplificação atinge o thresholdExperimentos em múltiplas placas: fixar o threshold

Curva padrão e eficiência

Pool de RNA Usar um intervalo amplo de concentrações => 5 concentrações FD10 em triplicata R2 ~0,99 E = [10^(-1/slope)] - 1, deve estar entre 0,65 e 1

Curva padrão

Curva padrão

Curva de melting

Permite verificar especificidade da reaçãoFazer sempre!

Modelos matemáticosMétodo do Delta CtExpressão relativa do gene A na condição

X:

CP= CPA – CPR

Modelos matemáticos O método presupõe que eficiência de

amplificação é eqüivalente para o gene alvo e o gene normalizador

É necessário um ensaio de validação: Gráfico log de input amount (ng RNA) vs.

Ct deve ter uma inclinação ~0 Diferença de 3% na eficiência da um

erro de 47% (Et<Er) ou de 209% (Et>Er) após 25 ciclos!

Modelos matemáticosMétodo Pfaffl:Corrige pela eficiência de amplificação

Aceita apenas um gene normalizador

Modelos matemáticosMétodo da curva padrão: Para gene A na amostra X corrige o valor da

média de Ct pelo dados da curva padrão

Input amountA,X= 10^[(CtA,X – valor-Y)/slope]

O input amount deve ser normalizado pelo input amount do gene normalizador (R) em X, ou pelo valor do GeNORM para X

RazãoA,X = Input AmountA,X/Input amountR,X

Modelos matemáticos Finalmente, o input amount normalizado é expresso

em valores relativos à condição de referência (controle) em fold change

RazãoA,C = input amountA,C/input amountR,C

Razão = RazãoA,X/RazãoA,C

Se Razão < 1, expressa -1/Razão (fold change)

Uso do GeNORM Avalia a estabilidade dos genes

normalizadores Calcula a média geométrica dos input amount

para os melhores genes normalizadores em cada condição

Para cada condição dá um valor de normalização que pode ser usado diretamente

Uso do GeNORM dá maior robustez aos dados

Uso do GeNORM Fazer uma tabela com colunas para cada gene e

linhas para cada condição Calcular o input amount para cada gene em cada

condição Substrair dos valores em cada coluna o maior valor Usar os valores resultantes como expoentes da

base 2 Eliminar os genes com valores muito diferentes de 1 Calcular a média geométrica dos genes aceitos

Bibliografia Anonymous. 1997. ABI Prism 7700 Sequence detection

system. User Bulletin #2: Relative quantitation of gene expression. 1-36 p.

Vandesompele. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3(7): 0034.1-0034.11

Pfaffl. 2004. Chapter 3. Quantification strategies in real-time PCR. In: A-Z of quantitative PCR (Editor: SA Bustin). International University Line, La Jolla, CA: 87-112 p.

Wong. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39(1): 1-11

Guidelines: http://www.rdml.org/guidelines Glossário: http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html