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Embrionárias•Definição•Propriedades
Adultas•Definição•Propriedades
Embrionárias X AdultasAbordagens experimentais Questões éticas
CÉLULAS-TRONCO: ABORDAGENS EXPERIMENTAISBeatriz Longo
2003 2004 2005
4.450.000 6.070.000 10.400.000
Palavra chave: STEM CELL
Célula com capacidade para se dividir por um longo período de tempo (auto-replicação/proliferação), e dar origem a diferentes tipos celulares com função mais especializada como célula muscular, sanguínea ou neural (diferenciação).
Célula-tronco: conceitos
Fonte:> Blastocistos (embriões de 5 dias)> Feto> Cordão umbilical e placenta> Tecidos e orgãos (ex: medula óssea)
Tipos: > embrionárias> fetais> adultas
Plasticidade:> totipotente> pluripotente> multipotente
(http://stemcells.nih.gov/info/scireport)
Tipos e fontes
2 células 4 células .... mórula
fecundação
zigoto
• oriundas do blastocisto ~5° dia do desenvolvimento do embrião
• pluripotentes com alta capacidade de proliferação e diferenciação em todos os tiposcelulares
• podem ser mantidas in vitro por longosperíodos
Células-tronco embrionárias
feto
blastocisto
cultura de células tronco embrionárias
mesênquima fígado pele neurônios vasos etc
Células-tronco embrionárias
mórula
1998: James Thomson(U.Wisconsin)
imortalizou células ES de embriões humanos.
Embrionárias
Células-tronco adultas
• Células indiferenciadas presentes em um tecido diferenciado, multipotentes
• Mecanismo de renovação celular/tecidual (manutenção e reparo)
• Fontes: medula óssea, sangue, retina, musculo esquelético, polpa dentária, fígado, pele, pancreas, cérebro.
Células-tronco adultas
Células-tronco adultas
Hematopoéticas: glóbulos vermelhos do sangue (hemácias), os glóbulos brancos e as plaquetas. Fígado, baço, cordão umbilical,placenta.
mesenquimais ou estromais
Células-tronco adultas
Mesênquima: tecido conjuntivo não-diferenciado do embrião. Medula óssea, tendões, polpa dentária, músculos e gordura. • aderentes• proliferam• formam colônias• capazes de se diferenciar em vários tipos celulares.
Embrionárias X Adultas
São mais raras;
Baixo potencial de proliferaçãoe diferenciação (multipotentes);
Mais seguras (risco menor de mutação, câncer, anomalias);
Sem risco de rejeição oucomplicações imunológicas –transplante autólogo;
40 anos de utilização emtransplantes para tratamento de leucemia e linfoma);
Sem problemas éticos
Mais abundantes;
Maior potencial de proliferaçãoe diferenciação (pluripotentes);
Aparecimento de tumores emodelos animais;
m
Risco de rejeição emtransplante;
Ainda não é utilizada emtransplantes;
Complicações éticas
Terapia celularTerapia celular
SNCSNC
DoençasDoençasautoauto--imunesimunes
CoraçãoCoraçãoParkinsonParkinson
AVC Traumamedular
IAMIAM
ICIC
Diabetes
ELA
EM
Epilepsia
FigadoFigado
Cirrose
Obtenção
célulasmononucleares
Ficoll
Visualização
Células tronco mesenquimaisin vitro
Animais transgênicos
heart bone marrow mononuclear cells
600 rads
Quimera
Modelos Experimentais
DoençaDoença de de ChagasChagas
Brasil: 6 milhões de chagásico, 2 milhões com cardiopatia
BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS
C57BL/6 EGFP MICE
T. CRUZIINFECTION
C57BL/6 WT
Colombian Strain
DoençaDoença de de ChagasChagasexperimentalexperimental
ANALYSIS OF HEART TISSUE IN CHRONIC PHASES
OF INFECTION
Desenho Experimental
Cepa ColombianaCepa Colombiana
BALBBALB/c/c
Fase crônicaFase crônicaInjeção de células Injeção de células
mononucleares mononucleares de medula ósseade medula óssea
Infecção com 10Infecção com 1022 formas formas tripomastigotastripomastigotas 1-6 meses
após o transplante
Avaliação dos animais
Ricardo S. de Lima, dissertação de Mestrado, FIOCRUZ, Salvador, 2004
0
100
200
300
400
500
0 2 4 6 8
Meses após tratamento
Cel
sinf
lam
tóri
as/m
m2
SalinaBMC
INFLAMAÇÃOINFLAMAÇÃO
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8
Meses após tratamento
Áre
a de
fibr
ose/
mm
2
SalinaBMC
FIBROSEFIBROSE
Redução de miocardite em camundongos transplantados com CTMO
Ricardo S. de Lima, dissertação de Mestrado, FIOCRUZ, Salvador, 2004
> 50 milhões de pessoas portadoras de epilepsia no mundo> 40 milhões em países em desenvolvimento > Brasil: ~2% da população> Alta incidência em regiões pobres e zona rural:> Alta incidência na infância> muitos casos de abandono do tratamento, mau controle das crises ou efeitos colaterais -> candidatos à cirurgia
(WHO Bulletin, 2001)
Epilepsia: cenário atual
1- Epilepsy can result from a wide variety of acquired lesions such as head trauma, stroke and infections
2- These lesions appear to transform a normal neural network into one that has a predilection for abnormal excitability
3- Very little is known about the true mechanistic role these changes may have in the pathogenesis of epilepsy
4- There is an incredible need for strategies developed for preventing or reversing epileptogenesis
Field problems:
(Lowenstein D., SFN Workshop 2003)
célula tronco!
MRI: sinais indicativos de esclerose hipocampal - redução de volume do hipocampocom possível aumento de sinal T2, e perda da configuração normal da estruturainterna hipocampal. Atrofia do LT como um todo (em geral assimétrica).
IAC-USCN/IBRO, Lowenstein NDW 2003
Diagnóstico - ELT
Perda neuronal
5 Não foram encontrados estudos que utilizam transplante de células tronco de medula óssea em epilepsia.
3 Transplante de células de medula óssea pode ser utilizado comoveículo para introduzir genes terapêuticos no SNC (Vallières and Sawchenko 2003; Yagi et al 2004)4 Apenas 1 estudo utilizando o transplante de células tronconeurais fetais humanas em ratos epilépticos como estratégia parareduzir as crises (Chu et al 2004)
5 bons motivos:
1 Células tronco podem migrar para o tecido lesado recuperando a função neurológica (Azizi et al 1998; Kopen et al 1999; Lee et al 2003)2 Células tronco adultas podem ser convertidas em neurônios e/ouglias in vivo (Eglitis and Mezey 1997; Brazelton et al 2000; Mezey et al 2000; Li et al 2001; Nakano et al 2001; Priller et al 2001; Akiyama et al 2002; Zhang et al 2002; Schilling et al 2003; Mezeyet al 2003; Weimann et al 2003; Simard and Rivet 2004; Silani te al 2004; Zhang et al 2004; Bossolasco et al 2005; Pluchino et al 2005; Bonilla et al, 2005; Kopen, et al., 1999; Wright et al 2001)
Epilepsia experimental – dois modelos clássicos
Jaborandi (Pilocarpus pennatifolius)
Pilocarpina: extraído do Jaborandi, planta típica da região Norte e Nordeste do Brasil. Tratamento de glaucoma.
Eletrochoque convulsivo máximo(ECM): Modelo de crises únicasque causa pouco ou nenhum danoneuronal.
Eletrochoque Convulsivo Máximo-EMC
Desenho experimental
Transp.M.O. GFP
Pilo/SEECM
6h 30-60 dias 2h/24h/48h72h/96h/7dias
600 rads
IFL
Schilling et al, 2003
Tursky et al, 1983Swinyard, 1952
Priller et al, 2001
ventrículoPlexo coróide
Quantificação
tálamohipocampocórtex
Córtex piriforme
Imunofluorescência
DAPI + GFP
A B
C D
24h 48h
72h 7 days
Imunofluorescência
Desenho experimental - ECM
~30min
IFL
~2h
GFP+
ECM
fase tônica
CTRL tratamento0
5
10
15
Grupos
tôni
ca (s
eg)
***
Resultados preliminares- ECM
PNAS May 13, 2003 vol. 100 no. 10 5807–5812
SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teethMasako Miura*, Stan Gronthos†, Mingrui Zhao‡, Bai Lu‡, LarryW. Fisher*, Pamela Gehron Robey*, and Songtao Shi.
Células tronco de polpa de dente de leite
Desenho experimental
90 dias- 5h/dia, 5Xsem
CER(crises espont. recorr.)
Pilo
SE(status epilepticus)
80-90 min
tratamento com células tronco do dente de leite(Kerkis, I. -Butantan, SP)
+Histologia
IFL
crises observadas
05
101520253035404550
tratados nao tratados
nº d
e cr
ises
*
Mann Whitney test P value 0,0379
Resultados preliminares
1510615144410
00000
não tratadostratados
62,5%
16,5%
12 3969%
Resultados preliminares
Cérebro
Alexa 488DAPI
embrião GPP+ – E14
*
MGE
Modificadi de Wilson SW & Rubenstein JRL,Neuron, 2000
Camundongo transgênico P3-P4
GFP+/
Dissociação
Maria Elisa Calcagnotto, Neurofisiologia, UNIFESP-SP
Células-tronco neurais fetais e neurônios inibitórios
mIP
SCsI
PSC
sIPSC mIPSC
MGE Grafted Cells Increase the Inhibitory
Synaptic Transmission in the Cortex of Dlx1-/- mice
J. Neurosc. 2006
MGE Grafted CellsExhibit Molecular
Properties of Interneurons in the
Cortex
Trauma medular (5 dias pós transplante)
Trauma medular (120 dias pós transplante)
MAS POR QUE RAIOS ISSO É TÃO POLÊMICO?
Limites AtuaisLimites Atuais
TecnológicosTecnológicos ReligiososReligiosos ÉticosÉticos
BiológicosBiológicos
ProliferaçãoProliferação
diferenciaçãodiferenciação
Células-tronco adultas
Limites AtuaisLimites Atuais
TecnológicosTecnológicos ReligiososReligiosos ÉticosÉticos
BiologiaBiologia
CompatibilidadeCompatibilidade
ManipulaçãoManipulaçãogênicagênica
EmbriõesEmbriões
Coleta deColeta detecido fetaltecido fetal
DestruiçãoDestruiçãode embriõesde embriões
Células-tronco embrionárias
• Clonagem terapêutica: produzir células-tronco embrionáriaspara diversos tratamentosblastocisto é destruído
• Clonagem reprodutiva: gerar um novo indivíduoblastocisto é implantado no útero
Clonagem
Clonagem reprodutiva
Clonagem terapêutica
Reproduced by permission of Gary Markstein and Copley News Service
Destroi vida?Quando começa a vida? Salvar uma vida justifica destruiroutra?
Courtesy of Kevin Siers, The Charlotte Observer © 2001
Embriõesdescartados …Comércio de células tronco?
APROVADA LEI DE BIOSEGURANÇA
Pesquisa com célula-tronco em embriões estocados no mínimo por três anos (até data publicação)
(clonagens terapêutica e reprodutiva são proibidas)
SenadoSenado
06/OUTUBRO/200406/OUTUBRO/2004
Câmara dos DeputadosCâmara dos Deputados
03/MARÇO/200503/MARÇO/2005
Próximos passos
> Investigar a funcionalidade;
> Entender os mecanismos de proliferação ediferenciação de diferentes linhagens;
> Resolver questões técnicas e metodológicas
Links interessantes
http://www.dnalc.org/cloning.htmlhttp://www.cnn.com/interactive/health/0107/stem.cellhttp://www.molbio.princeton.edu/courses/mb427/2001/projectshttp://science.nhmccd.edu/biol/bio1int.htmhttp://stemcells.nih.gov/http://www.stemcellresearchfoundation.org/http://www.cnn.com/SPECIALS/2001/stemcell/http://www.isscr.org/http://www.comciencia.br/reportagens/celulas/09.shtmlhttp://portal.saude.gov.br/portal/aplicacoes/noticias/http://www.scielo.br/scielo
Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunopatologia - LETICPqGM FIOCRUZ, Salvador-BahiaCoordenador: Ricardo Ribeiro dos SantosD. Brustolim, J. Senra, L. Bahia, M. Soares, FIOCRUZ- BAZ. Costa e J. Costa da Costa, PUC-RSM. Blanco e L. Mello, UNIFESP-SP Apoio: CNPq-Institutos do Milênio; FAPESB and ICTP
MUITO OBRIGADA!!!!
