Citotoxicidade de Senécio em macrófagos mediada através da indução do estresse oxidativo

Priscila Raijche de Oliveira

Research in Veterinary Science Journal

SENÉCIO

Nome comum: tasneirinha, flor-das-almas e maria-mole;

Ocorrência: região centro-sul do Brasil Senecio brasiliensis;

Princípio ativo: alcalóides pirrolizidínicos – hepatotóxicos;

Partes tóxicas: Folhas (verdes/secas).

Principal causa de morte em bovinos na região Central do RS e uma das principais causas de morte em equinos na Paraíba.

ALCALÓIDESSubstância orgânica, de origem natural, cíclica, contendo um

nitrogênio em um estado de oxidação negativo e cuja distribuição é limitada entre os organismos vivos.

20% das substâncias naturais descritas; Maioria de caráter alcalino;

Alcalóides verdadeiros átomo de nitrogênio em um anel heretocíclico; Protoalcalóides átomo de nitrogênio não inserido a um anel

heterocíclico; Pseudoalcalóides Compostos nitrogenados com/sem anéis

heterocíclicos que não são derivados de aminoácidos (terpenos/ esteróides).

Cocaína

ÁLCALÓIDESLocalização nos vegetais

Tecidos com crescimento ativo; Células epidérmicas e hipodérmicas; Bainhas vasculares; Vasos lactíferos;

Localização intracelular

Retículo endoplasmático Vacúolos

Raramente estão presentes em tecidos mortos

O Local de estoque frequentemente é diferente daquele no qual são sintetizados.

ALCALÓIDES

Funções:

Proteção - gosto amargo;Reserva de Nitrogênio;Reguladores de crescimento;Manutenção do equilíbrio iônico; Proteção contra irradiação UV.

ALCALÓIDESALCALÓIDE PLANTA ATIVIDADE

Artemisina Artemísia annua Antimalárico

Atropina Atropa belladona Anticolinérgico

Capsaicina Capsicum spp. Anestésico local

Colchicina Colchicum autumnale Antigotoso

Escopolamina Datura spp. Antiparkinsoniano

Emetina Cephaelis ipecacuanha Amoebicida

Morfina Papaver somniferum Analgésico

Quinina Cinchona spp. Antimalárico

Reserpina Rauwolfia spp. Anti-hipertensor

Vimblastina, Vincristina Catharanthus roseus Antitumoral

ALCALÓIDES PIRROLIZIDÍNICOS

Ocorrência natural em cerca de 6.000 espécies de plantas de diversos gêneros e famílias;

Alguns: Fitoalexinas (proteção) Citotoxinas Distribuídos em diferentes partes/ proporções

variadas (externelidades); Derivados do aminoácido ornitina.

Descarboxilação TransaminaçãoCondensação intramolecular

INTRODUÇÃO

Radicais livres: Moléculas altamente reativas capazes de oxidar proteínas, substratos de nucleotídeos e lipídios, induzindo alterações celulares e morte Parkinson, Alzheimer, a esclerose múltipla, mutagênese, distúrbios teratogénicos.

- Espécies reativas de oxigénio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS)

INTRODUÇÃO

Óxido nítrico (NO) reage com superóxidos

Peroxynitritos Radical hidroxil

Inibição da respiração mitocondrial

Célula com déficit energético

INTRODUÇÃOSenécio spp.: Representa o maior risco para o gado e, por sua vez, para os consumidores de produtos de origem animal.

OBJETIVO

Testar se a planta S. chrysanthemoides apresenta os seus efeitos tóxicos por meio de geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio e (RNS), levando a apoptose.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Camundongos albinos suíços de ambos os sexos;

Peso: 20-25 g; Condições padrão de temperatura (25 ± 5 º C)

com manutenção de um ciclo de 12 h luz / escuridão;

Dieta padrão e água ad libitum;Sacrifício: Anestesia com éter.

MATERIAIS E MÉTODOS

Extrato da planta: Senecio chrysanthemoides

Folhas, caules e raízes das plantas foram secas e moídas em pó;

Extração com etanol a 95%;Evaporação do sob pressão a 40 °C; Dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO,

10 mg/ mL); Armazenado a 20 °C.

MATERIAIS E MÉTODOSIsolamento de macrófagos peritoneais murinos

Macrófagos peritoneais foram lavados: solução salina gelada tamponada com fosfato (0,02 M, pH 7,2; PBS);

Centrifugação 300g por 10 min a 4 º C; Sedimento resultante ressuspenso em meio RPMI-

1640, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inativado quente, penicilina (100 unidades/ ml) e estreptomicina (100 µg/ mL) - Referido como meio A;

A viabilidade celular foi determinada a 95% por exclusão de azul de tripano; - COLORAÇÃO = MORTE;

As células foram mantidas a 37 º C, CO2 a 5%.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ensaio MTS: Efeito de Senecio sobre a viabilidade dos macrófagos

Macrófagos foram semeados em placa de cultura de tecidos de 96 poços; Individualmente incubadas com concentrações crescentes de S-EtOH (0-

25 µg/ mL) por 24 h a 37 º C, CO2 a 5%; Depois de 24 h, MTS e PMS foram misturados na proporção de 20:01; 20 µL dessa mistura foi adicionado a cada poço; Células incubadas durante 3 horas a 37 º C; Absorvâncias foram medidas a 490 nm.

MTS (sal de tetrazólio): Reduzido a formazano (cor) pelas desidrogenases mitocondriais, na presença do acoplador de elétrons (PMS).

MATERIAIS E MÉTODOS

Detecção de ROS foi medida utilizando um indicador de ROS (H2-DCFDA);

Determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) em macrófagos

H2-DCFDA H2-DCF DFC Fluorescência

Hidrólise por

esterases

Oxidação por

ROS

Célula livre,Permeável,

Não fluorescente

MATERIAIS E MÉTODOS

A produção de NO foi medida por estimativa de nitrito usando o ensaio de Griess – NO em solução aquosa = nitritos (cor).

Macrófagos foram deixados aderir em placas de 6 poços para cultura de tecidos;

Poços foram incubados com diferentes concentrações de S-EtOH (0-10 µg/ mL) durante 24 h;

Sobrenadantes recolhidos e incubados com um igual volume de reagente de Griess à temperatura ambiente durante 10 min;

Absorbâncias foram medidas a 550 nm utilizando leitor de microplacas;

Medida da produção extracelular de óxido nítrico por macrófagos

MATERIAIS E MÉTODOS

DAF-2 DA DAF 2 DAF - 2T

Determinação da produção de óxido nítrico intracelular em macrófagos

Vias dependentes

de óxido nítrico

Clivado por esterases

Concentração de S-EtOH: 0 – 10 µg/ mL;

Fluorescência medida em citômetro.

Marcador Fluorescente de

NO

MATERIAIS E MÉTODOS

Mercúrio laranja fluorescente foi utilizado como medida da glutationa intracelular

Mercúrio laranja se liga com os grupos sulfidril de tióis não protéicos como os da glutationa (GSH) e, portanto, a fluorescência é diretamente proporcional ao nível de GSH intracelular.

Determinação de tióis não protéicos em magrófagos

MATERIAIS E MÉTODOS

Macrófagos (1 X 106/mL) foram incubados na ausência (controle) e presença de S-EtOH (14 µg/ mL) durante 24 horas a 37 ºC;

Células foram centrifugadas (300 g/ 10 min);

Lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em anexina-V tampão de ligação;

A anexina V-FITC e iodeto de propídio (1 µg/ mL, PI) foram então adicionados e incubados durante 30 min - Protegido da luz à 20-25 ºC;

Leitura foi realizada com um citômetro de fluxo;

Determinação da externalização de fosfatidilserina em macrófagos

MATERIAIS E MÉTODOS

Ensaio que consegue identificar as zonas de DNA fragmentado, resultante da apoptose, pela adição de nucleotídeos marcados com corante fluorescente (FITC) nas extremidades cortadas do DNA;

Reação catalisada pela enzima de TUNEL;

Células TUNEL positivas = DNA fragmentado (presença de coloração verde do corante FITC) / TUNEL negativas = DNA íntegro.

S-EtOH: 14 µg/ mL;

Leitura em citômetro.

A detecção in situ da fragmentação de DNA pelo terminal desoxinucleotidilo transferase (ensaio de TUNEL)

RESULTADOS

Concentrações mais elevadas:

5,0 µg/ mL: 64,26 ± 1,67%

10 µg/ mL: 56,22 ± 2,31%

Tóxico

Até 1,0 µg/ mL:

89,60 ± 2,10%

Não-tóxico.

Extrato etanólico do Senécio (viabilidade celular):

SENÉCIO É CITOTÓXICO PARA MACRÓFAGOS

MURINOS

RESULTADOS

Baixa concentração de S-EtOH (1,0 µg / mL):

Aumento de 5,5 vezes a intensidade de fluorescência.

Senécio aumentou geração de espécies reativas de oxigênio em macrófagos murinos.

Concentrações mais elevadas de Senecio (5,0 e 10,0 µg / ml):

Redução dose-dependente da intensidade de fluorescência (Tabela 1).

RESULTADOSSenécio aumentou a geração de óxido nítrico (NO) em macrófagos

Concentrações mais baixas(0,1, 0,5 e 1,0 µg/ mL, 24 h):

Progressivo aumento da produção ocorreu a partir de valores basais:4,90 ± 0,72 µM 8,18 ± 1,27 µM

11,45 ± 0,97 µM 18,79 ± 0,32 µM

Concentrações, superiores (5, 10 e 25 µg / mL, 24 h):

Redução da produção de NO:

6,96 ± 1,47 µM

5,27 ± 0,93 µM

4,69 ± 0,42 µM

Efeito da S-EtOH na geração de NO extracelular: testado em concentrações de 0-25 µg/ mL por 24 h:

RESULTADOSSenécio aumentou a geração de óxido nítrico (NO) em macrófagos

Usando uma sonda específica DAF-2DA para medir a produção de NO intracelular

S-EtOH (1,0 µg / mL, 24 h):

Dobrou a intensidade de fluorescência da DAF-2 em comparação com valores de linha de base.

Maiores concentrações (5,0 e 10 µg/mL):

Intensidade de fluorescência reduzida (Tabela 1).

RESULTADOS

S-EtOH (1,0 µg / mL, 6 h):

Reduziu significativamente a fluorescência do mercúrio laranja em comparação com o controle. (Fig. 2C, Tabela 1)

Senécio esgota tióis intracelulares não protéicos em macrófagos.

Maiores concentrações (5,0 e 10,0 µg / mL):

Dose-dependente diminuição da intensidade de fluorescência foi observada (Tabela 1).

RESULTADOSSenécio induz externalização de fosfatidilserina em macrófagos

Controle: Às 24 h, apenas 1,47% de células foram anexina V-FITC positivas enquanto que 0,18% PI foram positivos.

O tratamento com S-EtOH resultou em aumento de ligação de ambos: Anexina V-FITC(34,88%, fig. 3) e PI (25,88%, fig. 3).

O efeito de S-EtOH(14 µg/ mL) sobre a % de ligação de anexina V-FITC e Iodeto de propídeo foi estudado.

RESULTADOS

Avaliou-se a fragmentação do DNA induzida por S-EtOH (14 µg/ mL, 24 h, a 37 º C) em que a proporção de cortes de DNA foi quantificado através da medição da ligação de nucleotídeos marcado com corante fluorescente FITC ligado às extremidades cortadas

Consequentemente, a fluorescência obtida é directamente proporcional aos cortes de DNA induzidos

Senécio induz o corte do DNA in situ em macrófagos.

DISCUSSÃO

Alcalóides Pirrolizidínicos são capazes de interagir com diversas moléculas, tendo forte afinidade para grupos sulfidril (-SH), incluindo tióis não protéicos, causando redução do processo antioxidante celular.

S-EtOH é citotóxico para macrófagos. A citotoxicidade é mediada, em parte, pela sua capacidade de gerar ROS, como medido por um aumento na fluorescência de DCF.

DISCUSSÃO

Óxido nítrico é um importante defensor imunológico contra patógenos invasores, mas sua produção descontrolada pode ser prejudicial para os macrófagos;

Combinação com superóxidos formando peroxinitritos que podem inibir o complexo mitocondrial;

O aumento gradual em ROS e RNS contribuiu para a citotoxicidade observada.

DISCUSSÃO

Seguido de um estímulo apoptótico, fosfatidilserina presente no folheto interno da membrana plasmática vira para fora para a monocamada externa de plasma membrana e, por conseguinte, exposição de fosfatidilserina é considerado como um marcador de apoptose.

DISCUSSÃO

A anexina V, por ter uma afinidade forte para fosfatidilserina, serve como uma medida da apoptose.

Iodeto de propídio (PI): Utilizado para distinguir morte por apoptose da morte celular por necrose.

O presente estudo sugere que Senécio medeia a morte celular por apoptose e necrose por haver populações ligadas a Anexina V (população apoptótica) ou PI (população necrótico).

DISCUSSÃO

A fragmentação do DNA é uma das características da apoptose. A ocorrência do corte do DNA de S-EtOH foi detectada com o ensaio de TUNEL, em que a proporção de cortes do DNA permite uma maior ligação de nucleotídeos fluorescentes;

Senécio provoca a desestabilização do ambiente intracelular de macrófagos murinos através de uma carga aumentada de radicais reativos que conduzem a toxicidade e morte celular.