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Como Purificar Proteínas?
Marcius S. Almeida; Eleonora Kurtenbach;
Introdução
Importância da Purificação
Estudo da atividade de uma enzima frente a substâncias passíveis de serem usadas em terapêutica;
Uso direto como medicamento (tratamento de doenças decorrentes da modificação da estrutura e/ou atividade de proteínas);
Proteoma, análise e caracterização das proteínas expressas em uma situação;
Análise da estrutura tridimensional para inferir sua atividade através de análise de homologia estrutural;
Processos de purificação
O que é: distinção das proteínas com base na seqüência de aminoácidos, no conteúdo de carboidratos e lipídios, estrutura tridimensional, e atividade biológica;
Mais utilizados: o Cromatografia em coluna de gel;o Filtração;o Adsorção;
Processos de purificação
Problema: mudança na estrutura das proteínas por ser imprevisível o seu comportamento no decorrer do processo;
Desafios hoje: o Encontrar melhores estratégias;o Adequação da metodologia;o Custo, velocidade e pureza;
Considerações Iniciais
Considerações Iniciais
Proteínas são macromoléculas frágeis e sofrem alterações físico-quimicas facilmente que levam a modificação ou perda de sua atividade;
Exemplos: o Temperatura adequar o ambiente;o Oxidação adicionar agentes redutores
(β-mercaptoetanol) ou evitar a formação de bolhas;
o Soluções muito diluídas ou concentradas;
Requerimento Inicial
Consiste na liberação dessa proteína de sua fonte natural EXTRATO BRUTO;
Obtenção do Extrato Bruto:o Trituração dos tecidos;o Lise das bactérias, das leveduras ou das
células animais provenientes da cultura;
Requerimento Inicial
Processos de Lise Celular:o Sonicação;o Variações repentinas de pressão;o Osmolaridade;o Forte agitação na presença de esferas de
vidro ou por enzimas citolíticas;
Requerimento Inicial
A proteína desejada pode estar restrita a uma organela em particular;
Purificação substancial dessa proteína:o Isolamento dessas estruturas celulares;o Centrifugação diferencial em gradiente de
sacarose;
A liberação das proteínas pode ser facilitado pelo uso de detergentes não iônicos;
Requerimento Inicial
Pode ocorrer acidentalmente a degradação química ou enzimática da proteína de interesse;
Como evitar:o São incluídos diversos aditivos:
•Agentes redutores β-mercaptoetanol;•Estabilizantes glicerol;•Inibidores de proteases EDTA;
Requerimento Inicial
Em alguns casos, esse passo inicial não é necessário;o Exemplo:
•Proteínas recombinantes levedura Pichia pastoris;
•São secretadas para o meio de cultura;
Clarificação da Amostra
Representa um grande problema;o Técnicas utilizadas são centrifugação e
filtração;
Exemplos de transtornos:o Obtenção de uma solução ainda
particulada;o Entupimento das membranas de filtração;o Manipulação de um grande volume num
tempo excessivamente longo;o Custo elevado;
Clarificação da Amostra
Solução: Resinas Cromatográficas:
o Permitem a adsorção de amostras contendo materiais particulados e/ou células;
o Sistema de Leito Expandido;
Sistema de Leito Expandido
1. Equilibrar a fase estacionária na forma expandida, com o tampão de equilíbrio;
2. Aplicar a amostra de células, no sentido de baixo para cima, no leito estabilizado;
3. Lavar a resina de baixo para cima, com o tampão de lavagem;
4. Eluir a proteína de interesse invertendo-se o fluxo pela coluna, com o leito sedimentado;
5. A coluna é limpa e regenerada para um novo uso;
Métodos de Purificação
A Escolha dos Métodos de Purificação
Planejamento de estratégias;
Esquema ideal de purificação de proteínas não depende apenas das características da proteína de interesse;
Escolha do Procedimento
A escolha do Procedimento deve considerar vários aspectos:o Estabilidade da proteína;o Aplicação final do produto;o Escala de manufatura necessária;o Eficiência do processo;o Viabilidade econômica;o Existência de facilidades;o Adequações à farmacopéia;
Processo de purificação
Linha geral de se seguir divisão em 3 fases;Fase I:
o Baixo poder de resolução;o Duas vantagens:
•Aumentar a concentração da proteína na amostra;
•Preparar amostra para cromatografia;o Utiliza-se: diálise, precipitação ou
precipitação fracionada;
Processo de purificação
Fase II:o Fase mais eficiente;o Explora as características físico-químicas
da proteína de interesse;o Compreende o uso de diferentes técnicas
de cromatografia;
Cromatografia
É a passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.
Cromatografia
Cromatografia de troca iônica:o Fase estacionária é altamente carregada
(sinal contrário da fase móvel);o Separação pela afinidade iônica;
Cromatografia de fase reversa:o Fase estacionária grupamentos
hidrofóbicos (hidrocarbonetos);o Separação pela interação com a fase
móvel; Cromatografia de afinidade:
o Fase estacionária ligantes específicos;o Separação pela ligação específicas;
Processo de Purificação
Fase III: Fase Final;o Retira contaminantes:
•Liofilização;•Diálise;•Ultracentrifugação;
o Psd1 e Psd2 -> defensinas liofilizadas - acetonitrila e ác. Trifluoracético
Deve-se considerar
Técnicas: o Diferentes propriedades físico-químicas
das proteínas;Atividade:
o Método + simples e sensível; Quantidade:
o Absorção de luz (faixa UV);o Azul de Coomassie;o Sulfato de cobre II;
Deve-se considerar
Purificação:o Pode ser acompanhada usando-se Ac.
Específicos;o Dot Blotting e Western Blotting;
Aumentar a seletividade e resolução no decorrer do processo;
Manter o processo simples;
Quantificação da Pureza
Quantificação da pureza
Sequênciamento peptídico automático;
Espectrometria de massa;
Ressonância magnética nuclear de alta resolução;
Procedimento mais comum
Eletroforese - Impregnação de prata:o Separação por peso molecular
Eletroforese Bidimensional:o Peso molecular e ponto isoelétrico
Cromatografia em coluna: o Ótima confiabilidade
Conclusão
Não existe um protocolo definido para purificação de proteínas;
É preciso desenvolver um protocolo específico – diversos métodos;
Obrigada!!!
Obrigada!!!
Hesther Bousquet; Maína Terra; Mayara Martins; Nígela RodriguesBiomedicina – 6º Período