Compostos Voláteis associados a defeitos de cortiça de Quercus suber L

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005

Paula Maria da Costa Vieira Neto

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.: Estudo dos efeitos de matriz por micro-extraco em fase slida na regio de espao de cabea

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005

Paula Maria da Costa Vieira Neto

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.: Estudo dos efeitos de matriz por micro-extraco em fase slida na regio de espao de cabea.dissertao apresentada Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Mtodos Instrumentais e Controlo da Qualidade Analtica, realizada sob a orientao cientfica do Doutor Armando Silvestre, Professor Associado do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro e da Doutora Slvia M. Rocha, Professora Auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro

Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Dulce e Ado, e aos meus filhos Filipa, Rita e Ricardo

o jripresidenteprofessor Catedrtico da Universidade de Aveiro Prof. Dra. Ana Maria Costa Freitas Drumond Ludovice professora Associada com Agregao da Universidade de vora

Prof. Dr. Armando da Costa Duarte

Prof. Dr. Armando Jorge Domingues Silvestreprofessor Associado da Universidade de Aveiro

Prof. Dra. Slvia Maria Rocha Simes Carrioprofessora Auxiliar da Universidade de Aveiro

agradecimentos

Ao Doutor Armando Silvestre e Doutora Slvia M. Rocha pela orientao cientfica, sugestes, incentivo e confiana demostradas. Ao Marco Tavares e ao Sr. Alberto Tavares pela recolha da cortia e sua transformao industrial. Ao Sr. Fernando Oliveira e Dra Susana Santos pelo apoio na realizao dos ensaios cromatogrficos (GC/MS) Ao Sr. Emlio Campos (Emlio de Azevedo Campos, SA) pela cedncia graciosa das fibras e septos de micro-extraco em fase slida. A todos os colegas e amigos que sempre me incentivaram e motivaram na realizao deste trabalho. A toda a minha famlia, em especial ao meu irmo Pedro Cosme, Professor Auxiliar da Faculdade de Economia da Universidade do Porto, pelo apoio na anlise estatstica.

palavras-chave

Cortia, HS-SPME, efeito de matriz, cortia normal, cortia bolor, cortia mancha amarela, off-flavours, compostos volteis, A. Mellea. A cortia o material de eleio para o fabrico de vedantes para garrafas de vinho. No entanto, sendo um produto natural, a cortia pode ser contaminada e atacada de diferentes formas, o que pode promover alteraes nas suas propriedades. Um dos problemas mais crticos o aparecimento de alteraes organolpticas em vinhos, cujas causas tm vindo a ser atribudas migrao de compostos de aroma indesejvel, existentes na cortia. Estes compostos, na sua maioria relacionados com a actividade microbiolgica, podem ter a sua origem no facto da cortia, desde a floresta at ao engarrafamento, ser susceptvel de sofrer degradaes microbiolgicas com consequente formao de metabolitos secundrios volteis, alguns dos quais com aromas indesejveis. A grande maioria dos estudos sobre este problema tem incidido na quantificao do 2,4,6-tricloroanisole (TCA), considerado um marcador de defeito pois ocorre em cerca de 80% dos casos de alterao organolptica. A tcnica de microextraco em fase slida na regio de espao de cabea (HS-SPME) tem vindo a ser utilizada na anlise da fraco voltil de vinhos e no controlo da qualidade das rolhas de cortia. Esta tcnica tem sido, ainda, utilizada na anlise de vinhos e cortias com defeitos organolpticos, especialmente na deteco e quantificao do TCA. Considerando que so conhecidos outros compostos, associados cortia, susceptveis de provocar defeitos de aroma em vinhos ser importante estudar a aplicabilidade da tcnica de HS-SPME na sua anlise. Assim, com este trabalho pretendeu-se desenvolver uma metodologia de HSSPME para identificar e quantificar compostos volteis da cortia susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos: 3-metil-1-butanol (3-MB), 1-octeno3-ol (1-Oct-3), 1-octanol (1-Oct), guaiacol (Gua), 2-metilisoborneol (MIB), 2,4,6tricloroanisole (TCA) e geosmina (Geo). O estudo de optimizao da metodologia incidiu sobre: i) temperatura de extraco, ii) linearidade global, iii) linearidade e reprodutibilidade relativamente a cada padro e estimativa dos Factores Relativos de Resposta da metodologia de SPME e iv) avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz. Aps a fase de optimizao procedeu-se pesquisa destes compostos padro em simulantes de vinho que estiveram em contacto durante treze meses com cortia normal (N) e cortia com defeitos: bolor (B) e mancha amarela (MA). Foram preparadas solues padro em simulantes de vinho em gamas de concentrao que incluem os limites de percepo sensorial (LPS) dos diversos compostos: 3-MB (47,7-191,0 mg/L), 1-Oct-3 (10,7-42,7 g/L), 1-Oct (20,8-208,0 g/L), Gua (5,2-51,6 g/L), MIB (8,0-80,0 ng/L), TCA (2,0-19,8 ng/L) e Geo (8,4-84,0 ng/L). As amostras foram analisadas em modo espaode-cabea usando uma fase estacionria do tipo absorvente, a polidimetilsiloxano (PDMS), de 100 m de espessura.

resumo

Do trabalho realizado, destacam-se como principais concluses: i) Os compostos estudados tm comportamentos distintos em HS-SPME, o que pode ser observado atravs dos diferentes valores de Log(FRR), que dependem das suas caractersticas fsico-qumicas (solubilidade em gua, volatilidade, presso de vapor e coeficiente de partio fase lquida vs fase gasosa); ii) Apesar de se ter trabalhado numa gama de concentraes em que se verifica uma resposta linear da fibra relativamente concentrao total da matriz , verificou-se que a variao da concentrao do 1-Oct (20,8 208,0 g/L) interfere na quantificao dos restantes componentes, com excepo do 1-Oct-3. Este efeito ocorre de forma positiva para o 3-MB e negativa para o Gua, MIB, TCA e Geo. O 1-Oct apresenta o maior valor de Log(FRR) (4,9), e causa interferncia em todos os compostos com valores de Log(FRR) menores mas no naquele que tem um valor de Log(FRR) prximo do seu, no caso o 1Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). A variao da concentrao de 1-Oct levou observao de erros de determinao dos restantes compostos, com coeficientes de variao de 13,8, 39,5, 53,7, 67,1, 62,2% para o 3-MB, Gua, MIB, TCA e Geo, respectivamente. Uma vez que o 1-Oct faz parte da composio qumica, quer de vinhos quer da cortia, em quantidades que variam entre 3 e 250 g/L, o efeito observado pode explicar a existncia de discrepncias entre a anlise sensorial de determinado composto e a sua quantificao por HS-SPME. iii) Finalmente, os compostos em estudo foram pesquisados em simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA, de acordo com a metodologia desenvolvida. O nico composto identificado, foi o TCA, com concentraes de 0,6, 0,4 e 2,4 ng/L, para os simulantes rolhados com a cortia N, B e MA, respectivamente. Verifica-se que 25% dos simulantes rolhados com cortia N e 35% dos rolhados com cortia B apresentam TCA, encontrando-se todos os valores abaixo do LPS (4 ng/L). Estes resultados indicam que nenhum dos simulantes rolhados com cortia N e B seria susceptvel de apresentar defeitos de aroma associados aos descritores de aroma dos sete compostos estudados. No caso dos simulantes rolhados com cortia MA, foi detectada a presena de TCA em 65% dos simulantes, dos quais 35% apresentavam concentraes superiores ao LPS. Assim, 35 % dos simulantes rolhados com cortia MA so susceptveis de apresentar defeitos de aroma.

keywords

Cork, HS-SPME, matrix effect, normal cork, mould cork, yellow stain cork, Mancha amarela, off-flavours, cork volatiles, A. mellea.

abstract

Cork is the premium raw material used to produce wine-bottling stoppers; however, being a natural product, cork can be contaminated and attacked in different ways that could promote modifications in its proprieties. One of the most critical problems of the cork industry is that wine may be organoleptically affected, due to off-flavours migration from cork. These compounds, mostly related with microbiological activity, may have its origin in the fact that cork is susceptible of microbiological attack during cork processing from the forest to the bottle, with production of off-flavours metabolites. Most studies on this problem are dedicated to 2,4,6-trichloroanisole (TCA) quantification, once it is present in around 80% of the organoleptically deviation cases. The headspace solid phase microextraction methodology (HS-SPME) has been used in the analysis of wines with organoleptic deviations, and in cork stoppers quality control, with particular emphasis on the detection of TCA. Considering wine organoloeptic deviations can be due to other cork off-flavours components, it is important to implement this technique to their determination.The present study aims to develop an HS-SPME methodology to identify and quantify cork volatile components that could produce a wine organoleptic deviations, namely: 3-methyl-1-butanol (3-MB), 1-octen-3-ol (1Oct-3), 1-octanol (1-Oct), guaiacol (Gua), 2-methylisoborneol (MIB), 2,4,6trichloroanisole (TCA) and geosmine (Geo). The methodology optimization study has considered the following aspects: i) extraction temperature, ii) global linearity, iiii) linearity and reproducibility to each compound and estimative of SPME Relative Response Factors and iv) analysis of interference effects of the concentration of each compound over the chromatographic areas of the other compounds. After the optimization step, the studied compounds were searched in wine simulants stoppered with standard (N) and defective cork: moulds (B) and yellow stain (MA). Standard solutions in wine simulants were prepared, in concentration ranges including the sensorial perception limits (LPS) of the studied compounds: 3-MB (47,7-191,0 mg/L), 1-Oct-3 (10,7-42,7 g/L), 1-Oct (20,8-208,0 g/L), Gua (5,251,6 g/L), MIB (8,0-80,0 ng/L), TCA (2,0-19,8 ng/L) and Geo (8,4-84,0 ng/L), using a polidimethylsiloxane (PDMS) fiber, with 100 m thickness. The main conclusions arising from the experimental results are: i) The studied compounds have different HS-SPME behaviour, observed by the different Log(FRR) values, which depend on the physical and chemical properties (water solubility, volatility, vapour pressure and liquid phase vs gaseous phase partition).

ii) Although the work was carried out in a concentration range in which it is observed a global linearity in fiber response in relation to the total concentration, the variation of the 1-Oct concentration (from 20,8 to 208,0 g/L) interferes in the quantification of the other components, with exception of 1Oct-3. This effect is positive to 3-MB, and negative to Gua, MIB, TCA and Geo and is related with changes in headspace composition and sorption in the fibre 1-Oct is the component with the higher Log (FRR) value (4,9), interfering with all compounds with lower Log(FRR) values, with no interference in the component with a similar Log(FRR) value, 1-Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). The variation of 1-Oct concentration causes errors in the determination of the other components with variation coefficients of 13,8, 39,5, 53,7, 67,1, 62,2% to 3-MB, Gua, MIB, TCA and Geo, respectively. Since 1-Oct is found in the composition of wine and cork in concentrations between 3 and 250 g/L, the observed effect may explain the existence of discrepancies between sensorial analysis of a compound and its quantification by HS-SPME. iii) Finally, the studied compounds were searched in wine simulants, stoppered with N, B and MA cork stoppers, according to the studied methodology. Only TCA was detected, with a concentration of 0,6, 0,4 and 2,4 ng/L, in the wine simulants stoppered with N, B and MA cork stoppers, respectively. TCA was detected in 25% of the simulants stoppered with N cork and 35% of the simulants stoppered and B cork, with all determinations below TCA LPS (4 ng/L). These results indicate that none of the simulants stoppered with N and B cork will be susceptible of present off-flavour defects associated to the seven studied compounds. In the case of simulantes stoppered with MA cork, TCA was detected in 65% of the wine simulants, 35% of them with values higher than the TCA LPS. Thus 35% of wine simulants stoppered with MA cork are susceptible to present off-flavours.

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.

NDICEPrembulo Parte I. Introduo 1.1. Cortia1.1.1. Produo subercola 1.1.2. Caracterizao econmica da indstria da cortia em Portugal 1.1.3. Estrutura celular 1.1.4. Composio qumica 1.1.5. Ataques microbiolgicos 1.1.6. Influncia da cortia sobre as caractersticas organolpticas do vinho

5 7 99 11 12 12 23 27

1.2. Micro-extraco em fase slida1.2.1. Fundamentos tericos 1.2.2. Dispositivos de extraco 1.2.3. Modos de extraco 1.2.4. Fases estacionrias 1.2.5. Influncia das condies experimentais

3131 33 34 37 38

1.3. Metodologias SPME na anlise de 2,4,6-tricloroanisole em cortia e em vinho 1.4. Enquadramento e objectivos do trabalho Parte II. Materiais e Mtodos 2.1. Materiais2.1.1. Reagentes e padres 2.1.2. Preparao de rolhas de cortia (N, B e MA) e posterior engarrafamento 2.1.3. Equipamentos

40 43 45 4747 48 50

2.2. Optimizao da metodologia de HS-SPME2.2.1. Efeito da temperatura de extraco 2.2.2. Linearidade global da metodologia de HS-SPME

5252 53

2.2.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia e estimativa dos Factores Relativos de Resposta (FRR) 54 2.2.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 54

2.3. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA 2.4. Tratamento de dados 55 56

1


2.4.1. Temperatura de extraco 2.4.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME 2.4.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME 2.4.4. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta

56 56 57 57

2.4.5. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 57 2.4.6. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA 58

Parte III. Resultados e Discusso 3.1. Optimizao da metodologia HS-SPME3.1.1. Efeito da temperatura de extraco 3.1.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME

59 6164 69

3.2. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME 3.3. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta 3.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz

71 74

77

3.4.1. Anlise do efeito da variao individual da concentrao de cada um dos compostos sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 77 3.4.2. Anlise do efeito da variao da concentrao dos compostos constituintes da matriz sobre a rea individual de cada um dos compostos 87

3.5. Pesquisa dos compostos padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA Parte IV. Concluses Parte V. Bibliografia 93 97 103

2


Lista de abreviaturas e siglas 1-Oct: 1-Octanol 1-Oct-3: 1-Octeno-3-ol 3-MB: 3-Metil-1-butanol APCOR: Associao Portuguesa de Cortia B: Bolor CAR: Carboxen CAS: Chemical abstract service CV: Coeficiente de variao CW: Carbowax DA: Descritor de aroma DHS-TD: Dinamic headspce-thermal desorption (Espao de cabea dinmico - desoro trmica) SDE: Simultaneously Distillation Extraction (Destilao e extraco simultneas) DVB: Divinilbenzeno FRR: Factor Relativo de Resposta Geo: Geosmina Gua: Guaiacol HACCP: Hazard Analysis and Control of Critical Points (Anlise de perigos e controlo dos pontos crticos) HS: Headspace (espao de cabea) INE: Instituto Nacional de Estatstica LD: Limite de deteco LLE: Liquid-Liquid Extraction (Extraco lquido-lquido) Log(FRR): Logaritmo do FRR LogP (oct/ag): Logaritmo do coeficiente de partio octanol/gua

3


LPS: Limite de percepo sensorial LQ: Limite de quantificao MA: mancha amarela MHS-SPME: Multiple headspace-solid phase microextraction (mltipla microextraco em fase slida) MIB: 2-Metilisoborneol MS: Espectrometria de Massa m/m: massa/massa MM: Massa molecular N: Normal p.e: Ponto de ebulio PA: Poliacrilato PAH: Polycyclic aromatic hydrocarbons (hidrocarbonetos aromticos policclicos) PDMS: Polidimetilsiloxano PI: Padro interno r.p.m. rotao por minuto SBSE: Stir bar sorption extraction (Soro em barra agitadora) SPME: Solid phase microextraction (microextraco em fase slida) TCA: 2,4,6-Tricloroanisole tr: Tempo de reteno v/v: volume/volume

4


PrembuloA rolha de cortia o vedante de eleio para garrafas de vinho. Do ponto de vista fsicomecnico, as suas propriedades de impermeabilidade e elasticidade conferem-lhe caractersticas mpares, no havendo substituto que permita conciliar um mximo de estanquecidade com um to longo prazo de aplicao, que chega a ser de dcadas1. O facto de ser um produto natural torna-a susceptvel de sofrer alteraes, desde a floresta at ao momento do engarrafamento, as quais podem causar desvios organolpticos de impacto negativo nas bebidas. Estes desvios tm vindo a ser atribudos a compostos resultantes da actividade microbiolgica2,3 ou ainda de compostos qumicos utilizados no acabamento das rolhas. A contaminao pelo meio ambiente envolvente4,5 igualmente uma das vertentes a considerar. Os compostos volteis susceptveis de provocar defeitos apresentam normalmente baixos limites de percepo sensorial, bastando assim a sua presena em concentraes muito baixas, da ordem dos ng/L, para causarem alteraes organolpticas nas bebidas que so rolhadas com cortia, particularmente no vinho. Os processos de migrao destes compostos a partir da cortia e os eventuais efeitos de interaco entre estes na matriz, podem afectar a sua deteco, a nvel sensorial e instrumental. A microextraco em fase slida (SPME) tem sido amplamente usada para anlise de compostos volteis em vrios produtos, nomeadamente a quantificao, em cortia e vinho, de compostos associados a defeitos, especialmente o 2,4,6-tricloroanisole (TCA). No entanto, por vezes verificam-se algumas discrepncias entre os dados obtidos por esta metodologia e os da anlise sensorial. A tcnica de SPME, comparada com as tcnicas clssicas de anlise de compostos volteis, especialmente com a extraco por solventes orgnicos (LLE e SLE), tem como vantagens o facto de no recorrer a solventes, de no necessitar de preparao prvia da amostra, ser facilmente automatizada e ainda permitir a anlise dos compostos presentes no espao de cabea, os quais so responsveis pelo aroma dos produtos6,7. O presente trabalho tem 2 objectivos principais:

5


i)

Desenvolver uma metodologia de HS-SPME para identificar e quantificar compostos volteis susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos em contacto com cortia;

ii)

Pesquisar os compostos padro estudados em simulantes de vinho que estiveram em contacto com cortia normal e cortia com defeitos (bolor e mancha amarela).

6

Parte I Introduo


1.1. CortiaA cortia um tecido vegetal, constitudo de clulas mortas dispostas em parnquima suberificado, originado pelo meristema sbero-felodrmico que constitui o revestimento do tronco e ramos do sobreiro, Quercus suber L.. O felogene (tecido merismtico com capacidade de diviso celular) tem uma espessura unicelular e gera clulas de cortia (felema, ou sber) para o exterior. Para o seu interior o felogene origina um outro tecido, a feloderme (clulas semelhantes s da madeira), que normalmente constituda por poucas fiadas de clulas e quantitativamente menos significativa. O felema, felogene e a feloderme constituem no seu conjunto a periderme, constituda quase na totalidade pelo sber8. O interesse industrial da cortia deve-se a um conjunto de caractersticas invulgares que este tecido apresenta face a outros materiais naturais. Propriedades, tais como, baixa condutibilidade trmica, relativa impermeabilidade a lquidos e elasticidade, e pelo facto de se tratar de um tecido homogneo suficientemente espesso que naturalmente regenerado aps cada extraco, tem permitido a sua longa explorao9. Actualmente a principal aplicao como vedante (nos sectores vincola e automvel) ou como isolante e decorativo (no sector da construo civil). Em termos econmicos, Portugal tem uma posio de liderana mundial em vrios domnios10, nomeadamente: na produo de matria-prima, com a maior taxa de produo por hectare e mais de metade da produo mundial de cortia em bruto (Tabela 1); na produo industrial, com mais 60% do valor da produo de produtos de cortia transformados;

1.1.1. Produo subercola Em termos de produo subercola, apesar do sobreiro se conseguir desenvolver em vrias zonas do mundo, s na regio mediterrnica apresenta a capacidade de regenerao de cortia aps sucessivas extraces. A zona de produo de cortia restringe-se assim a 7 pases: Portugal, Espanha, Frana, Itlia, Arglia, Tunsia e Marrocos (Figura 1).

9


Figura 1. Distribuio actual da rea de plantao do sobreiro9.

Portugal o maior produtor subercola do mundo, verificando-se no ano 2000 uma rea de plantao de 730 000 hectares com produo de 185 000 toneladas de cortia, o que representa mais de 50% de toda a cortia extrada anualmente (Tabela 1). As condies edafo-climticas e as tcnicas de produo utilizadas permitem que se consiga, em Portugal, a maior taxa de produo mundial por hectare.

Tabela 1. Distribuio da rea de plantao de sobreiro e produo de cortia a nvel mundial rea de sobreiro Hectares 730 000 500 000 410 000 340 000 100 000 99 000 90 000 2 269 000 % 33 22 18 15 4 4 4 100 Produo mdia anual Toneladas 185 000 88 000 20 000 15 000 5 000 9 000 18 000 340 000 % 54 26 6 4 1 3 5 100 Taxa de produo Ton/Ha 25,3 17,6 4,9 20,0 4,4 9,1 5,0 15,5

Pas Portugal Espanha Arglia Marrocos Frana Tunsia Itlia Total

Fonte: APCOR dados de 2002.

10


1.1.2. Caracterizao econmica da indstria da cortia em Portugal A organizao do sector industrial da cortia em Portugal reparte-se em ramos de actividade, com um processo de transformao faseado e classificado nos seguintes subsectores: Preparao, que integra as operaes de seleco, cozedura e estabilizao e

triagem (seleco) da cortia que, sob a forma de prancha, segue o ciclo de produo como matria-prima do sub-sector seguinte: a transformao; Transformao, que visa a elaborao de produtos por simples corte da prancha e

onde se inclui a fabricao de rolhas de cortia natural; Granulao, com operaes de triturao de cortia de calibre/qualidade inferior e

desperdcios resultantes do fabrico natural (apara), produzindo as diferentes matriasprimas para a indstria de aglomerados; Aglomerao, que corresponde produo de diferentes tipos de aglomerados

conforme envolva ou no produtos estranhos cortia. Como se pode depreender, h uma elevada interdependncia entre os diferentes ramos da indstria, uma vez que correspondem a fases sequenciais de transformao de um mesmo material. Segundo dados do INE, os valores finais para o ano de 2002 indicam um valor total de exportao de 903 milhes de euros, relativos a mais de 138 mil toneladas dos diversos produtos. O sector vincola o principal mercado, representando 68% em valor dos produtos fabricados, seja a rolha cortia natural como a de cortia aglomerada, com 57% e 11% do valor, respectivamente. Segue-se o sector de matrias de construo civil e o sector da indstria automvel, com 19% e 11%, respectivamente. Em termos socio-econmicos, caracterizado pela existncia de mais de 900 unidades em todos os ramos sectoriais, localizadas na sua grande maioria no distrito de Aveiro, que representam mais de 10 000 postos de trabalho. O tecido industrial constitudo por micro e pequenas empresas, em que mais de 70% delas tm menos de 20 trabalhadores. Este sector integra um elevado nmero de unidades certificadas (com sistemas de Gesto da Qualidade: ISO9001, Ambiental: ISO14001, HACCP: Segurana Alimentar:

11


DS3027 e Systecode11), que utiliza tecnologias de produo avanadas e apresenta sinais de crescentes esforos de investigao e de controlo.

1.1.3. Estrutura celular Macroscopicamente, a cortia apresenta uma colorao castanha clara com linhas relativas aos anis de crescimento anual e canais lenticulares. Trata-se de um material leve e elstico, apresentando como caracterstica mpar a capacidade de ser comprimido sem expanso lateral. Microscopicamente constituda por camadas consecutivas de clulas mortas de aspecto alveolar (Figura 2). Apresenta uma estrutura regular com clulas de forma aproximadamente prismtica, empilhadas em camadas na direco radial do tronco da rvore, ligadas entre as bases. Na seco tangencial as clulas de cortia apresentam a forma de polgonos com 5, 6 ou 7 faces num arranjo de aparncia alveolar em forma de favo de mel12. A espessura da parede de 1,1-1,4 m (Figura 2).

A: ampliao de 500 vezes

B: ampliao de 5000 vezes.

Figura 2. Fotografias de microscopia electrnica de varrimento. Clulas de cortia de reproduo. A: corte da seco tangencial, mostrando o arranjo em forma de favo de mel; B: Parede celular de cortia normal, com espessura 1,1-1,4 m12.

1.1.4. Composio qumica A constituio qumica das paredes celulares da cortia pode ser dividida em dois tipos de componentes: os componentes estruturais e os componentes no-estruturais. Os

12


componentes estruturais so macromolculas de natureza polimrica, que conferem s clulas a sua forma e grande parte das suas propriedades fsico-qumicas. A remoo de um dos componentes estruturais s possvel atravs de ataques qumicos ou mecnicos com intensidade suficiente para promover a sua despolimerizao parcial e solubilizao, alterando as caractersticas fsico-qumicas da cortia. Os componentes estruturais maioritrios da cortia so a suberina (ca. 40%), lenhina (ca. 20%) e polissacardeos (ca. 20%)8. Os componentes no estruturais classificam-se em compostos extractveis e compostos inorgnicos. Os compostos extractveis podem ser retirados das paredes celulares sem alterao significativa as propriedades mecnicas da cortia. Representam cerca de 15%, dividindo-se em fraco cerosa e fraco fenlica3. Os componentes inorgnicos so englobados no que geralmente se denomina por cinzas (ca. 1,2%)8, ou seja, o resduo da combusto completa da matria orgnica, sendo constitudos principalmente por clcio (60% m/m das cinzas), seguindo-se o fsforo, o sdio, o potssio e o magnsio. Tem surgido um crescente interesse no estudo e caracterizao dos compostos constituintes da cortia, nomeadamente a suberina13,14,15 como fonte de polmeros e por ter actividade anti-mutagnica16 e os triterpenos, como a betulina, o cido betulnico e a friedelina, com actividade anti-cancergena17. 1.1.4.1. Fraco voltil A composio voltil da cortia tem sido pouco estudada. Os primeiros estudos publicados foram baseados em tcnicas de extraco e concentrao da fraco voltil da cortia considerada normal usando Freon 113, Chromosorb 101 e Freon 11, seguida de separao e identificao dos compostos por GC/MS18, tendo sido identificando o terpineol, a cnfora, o furfural, a vanilina, o acetato de etilo o n-hexanol, o 5-metilfurfural, o cido butanico, o 1,2-dimetioxibenzeno, o benzotiazole, o pentanol, o pentanal e o 2pentilfurano. Em estudos posteriores procedem anlise da fraco voltil da cortia recorrendo a tcnicas de anlise de espao de cabea dinmico com desoro trmica (DHS-TD)19 e extraco-destilao simultneas (SDE) pelo mtodo de Lickens-Nickerson modificado20. No primeiro, aps se proceder remoo da camada exterior da rolha de cortia (cerca de 4 mm de espessura em toda a superfcie), estas so trituradas. O p de cortia

13


resultante submetido a um fluxo de hlio e os compostos volteis libertados so adsorvidos em Tenax. A remoo no GC efectuada por um sistema de desoro trmica, tendo sido identificados 90 compostos (Tabela 2). Este mtodo de extraco s permite a remoo dos compostos volteis. A introduo de artefactos pela degradao trmica do sorbente utilizado a maior dificuldade desta metodologia, pois a interaco de vapor de gua, compostos volteis e o material sorbente utilizado pode produzir artefactos durante a anlise de compostos volteis21. No segundo estudo procede-se recolha de pranchas de cortia consideradas normais (sem cheiros anormais ou defeitos visuais), que so cortadas em pedaos e colocadas no sistema de Lickens-Nickerson modificado, extradas durante 24 horas com n-pentano, sendo o extracto concentrado e analisado por GC/MS, tendo sido identificados 74 compostos (Tabela 2). Esta metodologia apresenta algumas desvantagens: uma metodologia muito morosa e podem ocorrer artefactos formados por degradao trmica de componentes da cortia, nomeadamente o furfural e 5-metilfurfural 20,21,22. Os compostos detectados em cada um dos estudos apresentam-se na tabela 2, por classe qumica, sendo colocados dentro de cada classe por ordem alfabtica, indicando a deteco em cada um dos mtodos com (+) e no deteco com (-). Os cidos carboxlicos alifticos identificados, unicamente pelo mtodo de DHS-TD, resultam provavelmente da degradao de compostos cidos da fraco cerosa dos compostos extractveis da cortia, composta por cidos, dicidos e hidroxicidos gordos, com cadeia longa de C20 a C26. A degradao dos cidos gordos, seja por auto-oxidao seja por actividade enzimtica, resulta no aparecimento de cidos de cadeia mais curta, seguindo-se a reduo aos correspondentes compostos carbonlicos alifticos, aldedos e cetonas, lcoois e alcanos e alcenos. Estes cidos (hexanico, octanico e decanico), apresentam aromas intensos e com descritores de aroma a cera e rano (Tabela 3). A causa para a no deteco de cidos volteis por SDE poder estar relacionada com o facto de no serem solveis em n-pentano. A produo de compostos carbonlicos alifticos, como aldedos e cetonas, resulta assim da degradao de cidos gordos (peroxidao lipdica). As ceras e a suberina contm quantidades de cidos gordos livres susceptveis de degradao. Esta degradao pode ocorrer por auto-oxidao dos cidos gordos ou por actividade enzimtica, promovendo a primeira a formao de aldedos volteis, caracterizados por apresentarem aromas excepcionalmente fortes, mesmo que presentes em pequenas quantidades, e a segunda

14


a produo de metilcetonas que em parte so reduzidas aos correspondentes lcoois secundrios20. Os lcoois primrios encontrados foram o 1-butanol, o 1-pentanol,o 1-hexanol,o 1-octanol e o 1-dodecanol, cuja origem pode estar na reduo de aldedos alifticos. A origem dos hidrocarbonetos alifticos (maioritariamente alcanos), embora ainda no completamente conhecida, parece resultar de actividade microbiolgica, uma vez que cortia sujeita a condies de actividade microbiolgica mais intensa sua superfcie apresenta maiores nveis de alcanos e cicloalcanos3. Verifica-se que os compostos que so comuns nos dois estudos so o n-octano, o n-undecano e n-tridecano. Na classe dos cicloalcanos alifticos, detectados unicamente por SDE, foram identificados 6 derivados substitudos de ciclo-hexano e 1 biciclo-heptano. Vrios derivados de furanos foram identificados, nomeadamente furfuraldeidos (furfural e 5-metilfurfural), lcool furfurlico e 2-pentilfurano, presentes em grande percentagem relativa em ambos os mtodos. A presena destes compostos est normalmente associada ocorrncia de reaces de degradao de acares (do tipo reaco de Maillard) provavelmente por aco da temperatura no processo de transformao industrial da cortia (cozedura, autoclavagem e secagem)22. O seu limite de percepo sensorial alto sendo por isso fraca a sua contribuio para o aroma da cortia19. Os furanos, como o 2-pentilfurano e o acetilfurano, so produtos resultantes da autooxidao do cido linolico20. Os principais compostos aromticos presentes so os alquilbenzenos, sendo a fonte mais provvel para o seu aparecimento a degradao da lenhina e da componente polifenlica da suberina, no havendo evidncia para ser resultante de actividade microbiolgica ou degradao trmica. Os cidos fenlicos e a lenhina so degradados termicamente ou decompostos por microrganismos resultado assim fenis: guaiacol, benzaldeido, vanilina e lcool benzlico. Os compostos com estruturas bifenlicas como naftaleno e naftaleno substitudo podem estar presentes na cortia como contaminantes qumicos de pela exposio a atmosfera contendo hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs)19.

15


Tabela 2. Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica cidos alifticos Composto cido actico cido butanico cido 2-etil-hexanico cido heptanico cido hexanico cido 3-metilbutanico cido 2-metilpropanico cido nonanico cido octanico cido pentanico cido propanico Acetona Butanal 2-Butanona 2,4-Decadienal Decanal 2-Decenal 9-Deceno-2-ona 2,6-Dimetil-2,6-undecadieno-10-ona 6,10-Dimetil-5,9-undecadieno-2-ona 2-Dodecanal Heptanal 2-Heptanal 2-Heptanona Hexanal 3-Metilbutanal 6-Metil-3,5-heptadieno-2-ona 6-Metil-5-hepteno-2-ona 2-Metilpentanal 3-Metil-2-pentanona 2,4-Nonadienal Nonanal 2-Nonenal Octanal 2-Octenal Pentanal 2-Tridecenal 2-Undecanona Mtodo de extraco DHS-TD 19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Compostos carbonlicos alifticos

16


Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica lcoois alifticos Composto 1-Butanol 2-Butoxietanol 5,9-Dimetil-9-deceno-3-ol 1-Dodecanol 2-Etil-1-hexanol 1-Hexanol 3-Metil-1-butanol 1-Octanol 1-Pentanol 1-Undeceno-4-ol 2,3-Dimetil-1,3-butadieno Dimetil-heptano 3,5-Dimetil-1,6-octadieno n-Dodecano Etilmetil-hexano 3-Etil-2-metil-1,3-hexadieno 2-Metil-heptano 3-Metil-heptano 3-Metiloctano 2-Metil-1-penteno Metil-propeno Nonano n-Octano 1-Octino n-Tridecano n-Undecano 1,2-Dimetilciclo-hexano 1,3-Dimetilciclo-hexano 2,2-Dimetil-3-biciclo-heptano Etil-ciclo-hexano 1-Etil-2-metilciclo-hexano 1-Etil-3-metilciclo-hexano Isopropil-ciclo-hexano 2-Acetilfurano lcool furfurlico Furfural 5-Metilfurfural 2-Pentilfurano Mtodo de extraco DHS-TD19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Alcanos, alcenos e alcinos

Cicloalcanos alifticos

Furanos

17


Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica Compostos Aromticos Composto Acetofenona (1-feniletanona) lcool ,-dimetilbenzlico lcool benzlico Alcool tert-butilbenzilico Benzaldeido Benzeno 3,8-Di-hidroxi-3,4-di-hidronaftaleno-1-ona 1,2-Dimetilbenzeno 1,3-Dimetilbenzeno 1,4-Dimetilbenzeno Dimetilnaftaleno 1,2-Dimetoxibenzeno (veratrole) 1,3-Dimetoxibenzeno (resorcinol) Etilbenzeno Etil-dimetilbenzeno 1-Etil-3-metilbenzeno Fenol 2- Hidroxibenzaldeido 2-Hidroxi-5-metilacetofenona Isopropilbenzeno 4-Metilacetofenona 1-Metil-4-isopropilbenzeno 3-Metil-isopropilbenzeno 1-Metilnaftaleno 2-Metilnaftaleno 1-Metilvinilbenzeno 2-Metoxi-4-metil-1-propilbenzeno 4-Metoxifenol (guaiacol) Naftaleno Propilbenzeno 1,2,3,4-Tetrametilbenzeno Tolueno 1,2,3-Trimetilbenzeno 1,2,4-Trimetilbenzeno 1,3,5-Trimetilbenzeno Vanilina Vinilbenzeno 1-Vinil-2-metilbenzeno Mtodo de extraco DHS-TD19 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

18


Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica Terpenides Composto Borneol Canfeno Cnfora 1,8-Cineole Copaeno Fencol Geranilcetona Geraniol Isoborneol Isopinocanfona Limoneno Linalol -Ocimeno -Terpineol 1,3,3-Trimetilbiciclo[2.1.1]heptano-2-ol Benzotiazole Clorobenzeno 1,3-Diclorobenzeno Etilisotiocianato 1,1,1-Tricloroetano Triclorometano Acetamida Acetato de etilo 2-Butoxietanol 1,1-Dietoxietano N,N-Dimetilformamida ter dietlico Tetrametiltioureia 2,4,6-Trimetil-1,3,5-trioxano Mtodo de extraco DHS-TD19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Compostos clorados e sulfurados

Outros

Os terpenides so comuns em plantas, tambm podendo surgir como metabolitos de microrganismos. Na cortia foram identificados na fraco dos compostos extractveis23. Apresentam um vasto espectro de aromas, sendo a maioria muito agradvel19. Na classe de compostos clorados e sulfurados foram detectados clorofilinos (2 compostos), 2 clorobenzenos (2 compostos) e compostos sulfurados: o benzotiazole,

19


comum nos dois mtodos, e o etilisotiocianato. Os compostos clorados, detectados unicamente por DHS-TD, com base na informao disponvel, no podem ser indicados como tendo causa natural (seja enzimtica seja degradao qumica dos componentes da cortia) parecendo tratar-se de resduos de tratamento qumico das rolhas analisadas19. Os compostos sulfurados podem ser metabolitos secundrios da degradao microbiolgica de aminocido, nomeadamente metionina24. Outros compostos identificados so aminas, teres e steres. As aminas, acetamida e N,N-dimetilformamida, podem resultar da reaco de aminocidos e acares redutores, por aco trmica (reaco de Maillard)19. Na classe dos teres foram identificados pelo mtodo DHS-TD o ter dietilico e o 2,4,6-trimetil-1,3,5-trioxano. Na classe dos steres, unicamente o acetato de etilo foi identificado por DHS-TD. A maioria dos compostos volteis identificados apresenta um aroma caracterstico (descritor de aroma- DA) a partir de uma dada concentrao (Limite de percepo sensorial-LPS). Assim, o aroma da cortia normal (N) depende do tipo de compostos volteis presentes e da sua concentrao. Na Tabela 3 apresentam-se alguns dos compostos volteis detectados na cortia considerada normal, agrupados de acordo com a respectiva classe qumica, o seu descritor aroma e o LPS em gua ou vinho. No sentido de clarificar o significado do gosto a rolha, e a afastar desta classificao desvios organolpticos que podem ter uma origem distinta, advir por exemplo, de acidentes de natureza enolgica, ou de contaminao da rolha por compostos de aroma nos locais de armazenamento do vinho2, e por outro lado normalizar a terminologia utilizada nos descritores de aroma dos resultados obtidos em ensaios de anlise sensorial de rolhas de cortia (aps contacto com gua ou soluo simulante de vinho ou mesmo vinho), foi elaborada uma roda de aromas da cortia25 (Tabela 4). Esta roda resulta da compilao de resultados de anlise sensorial de vinho, efectuada por 2 painis de provadores treinados. As amostras de vinho forma recolhidas com indicao e confirmao de existncia de alteraes em relao ao aroma caracterstico do vinho25. O vinho foi acompanhado na sua fase de fabrico para garantir que no apresentava defeitos ao nvel de aroma, as alteraes observadas deveriam ser associadas exclusivamente cortia.

20


Tabela 3. Compostos volteis identificados na cortia e respectivos descritores de aroma e limites de percepo sensorial (LPS). Classe qumica Terpenides Composto Borneol Isoborneol Limoneno Linalol -Terpeniol lcoois alifticos 1-Butanol 1-Hexanol 3-Metil-1-butanol 1-Octanol cidos alifticos cido 3-metilbutanico cido octanico Compostos aromticos Acetofenona lcool benzilico Benzaldeido Guaiacol Vanilina Furanos lcool furfurlico Furfural 5-Metilfurfural Compostos carbonlicos alifticos Decanal Hexanal 2-Nonenal 2-Undecanona Outros Benzotiazole Descritor de aroma Pimenta Cnfora Frutado Floral Floral Farmacutico Herbceo Whisky, malte Cera, sabo Rano Cera, farmacutico Floral Frutado Amndoa amarga Fumado, madeira Baunilha Feno Caramelo Tostado, amndoa Mofo, marinho, pepino Verde, erva Metlico, oleoso, gernio Rosa, citrino Borracha LPS em vinho ou *gua19 60 g/L * 100 g/L * 280 g/L* 5 mg/L 5 mg/L 300 mg/L 700 g/L 15 mg/L 50 mg/L 3 mg/L 20 g/L 100 g/L * 52 mg/L 65 mg/L 35 mg/L 4,5 mg/L -

21


De acordo com a roda de aromas da cortia, os descritores de aroma foram agrupados em famlias, que por sua vez se reuniram em 5 grupos principais: confero, vegetal, qumico, musgo e bolor (Tabela 4). Estes descritores de aromas podem ser associados a compostos qumicos volteis presentes na cortia (Tabelas 2 e 3).

Tabela 4. Grupos, famlias e descritores de aroma de acordo com a roda dos aromas da cortia25. Grupo Musgo Famlia Cogumelo fresco Hmus Terroso Qumico Sulfureto Pirognico Fenlico Hidrocarbonetos Vegetal Madeira Herbceos Balsmico Especiarias Confero Agressivo Terpnico Bolor Bolorento Descritor de aroma Cogumelo; Trufa Ptrido/Cogumelos Cortia hmida; Terra fresca; Beterraba vermelha; Batata Choco; Ptrido; Plo molhado; L molhada Alcatro; Borracha queimada; Cinza Farmacutico; Couro; Fumo Petrleo; Gasleo; Gasolina Cortia fresca; Madeira; Poeira Erva; Feijo verde; Madeira verde Caramelo; Baunilha; Feno Aromtico; Pimenta; Paprika Cnfora; Eucalipto Pinheiro; Resina Bolor; Bafio; Ptrido (frutos); Mofo de cortia; Mofo de cave

Pode-se assim constatar que o gosto a rolha foi decomposto em vrios descritores, podendo vrios compostos ser considerados como responsveis pela ocorrncia deste defeito no vinho, resultando muitas vezes da aco cumulativa de vrios compostos, sendo contudo o mais fortemente associado, e pelo seu baixo limite de percepo

22


sensorial (4 ng/L) o 2,4,6-tricloroanisole. A concentrao necessria de cada compostos voltil, ou mesmo a concentrao resultante da aco sinergtica de diferentes compostos, necessria para induzir defeito num vinho depende ainda das prprias caractersticas deste ltimo, como o tempo de envelhecimento, o teor em lcool e as castas de uvas intervenientes2. Uma vez que uma grande maioria dos compostos volteis de aroma identificados na cortia (Tabelas 2 e 3) resulta de actividade microbiolgica ou degradao trmica, a cortia pode apresentar perfis de aromas que so dependentes das caractersticas de processamento industrial e dos ataques microbiolgicos sofridos.

1.1.5. Ataques microbiolgicos A cortia um produto natural susceptvel de sofrer ataques microbiolgicos, desde a floresta, durante o processamento industrial, at fase de engarrafamento. Estes ataques podem conduzir a alteraes na sua composio qumica e consequentemente nas suas propriedades mecnicas, aspecto visual e odor. Em 19901 surgem as primeiras referncias a defeitos em vinhos associados a metabolitos secundrios provenientes da cortia. Os bolores do gnero Streptomyces, Aspergillus e Penicillium, que se podem desenvolvem superfcie das rolhas de cortia, podem provocar a degradao qumica dos seus constituintes e originar a formao de metabolitos secundrios susceptveis de provocar defeitos ao nvel sensorial. Os mais estudados tm sido o guaiacol26 e alguns compostos organoclorados, tais como o 2,4,6tricloroanisole27. Muitos outros compostos tm sido referidos como resultantes da actividade de fungos sobre alimentos, tais como 2-metilisoborneol, geosmina, 1-octeno-3ol, 1-octeno-3-ona e metilcetonas24. A microflora da cortia, bem como do ambiente fabril, ao longo do processo de transformao tem vindo a ser objecto de vrios estudos28,29. Verifica-se que a cortia um meio muito complexo, que pode suportar o desenvolvimento de grandes e variadas populaes de microrganismos sendo os bolores os mais frequentes, seguindo-se as bactrias e por fim as leveduras26. Estes podem-se encontrar nas lenticelas, desenvolvendo-se superfcie do tecido suberoso quando as condies de temperatura e humidade forem favorveis.

23


Dentro das situaes de ataques microbiolgicos consideram-se duas particularmente relevantes, dadas as consequncias nefastas que da podem advir: cortia contaminada com bolor (B) e cortia com mancha amarela (MA). Estes tipos de cortia apresentam composio qumica distinta (Tabela 5).

Tabela 5. Composio qumica de cortia normal (N), bolor (B) e mancha amarela (MA)3. Parmetro Cortia normal (N) Suberina Lenhina Polissacardeos Acares livres20 Extractveis Diclorometano Etanol gua Substncias pcticas12 Extractveis em soluo etanol/gua (12%) a) Pranchas de cortia colocadas em lugar hmido, durante 2 meses. 37,3 22,9 25,9 1,43 13,4 7,3 4,0 2,1 1,5 2,9 % (m/m) Cortia bolora) (B) 40,2 22,8 19,4 0,26 11,5 6,3 3,5 1,7 2,1

Cortia mancha amarela (MA) 38,0 20,0 20,4 1,13 17,0 6,6 4,7 5,7 0,5 5,5

Apesar de ser uma rea pouco estudada, verifica-se que a diferena entre a cortia N e B se situa mais ao nvel dos polissacardeos, acares livres e compostos extractveis, com alteraes ao nvel da fraco voltil, enquanto que em relao cortia MA, alm das alteraes ao mesmo nvel se verificam ainda indcios de alteraes suplementares ao nvel da lenhina. Este facto responsvel pela alterao da estrutura celular observada para a cortia MA (ponto 1.1.5.2.).

24


1.1.5.1. Cortia contaminada com bolores O crescimento dos bolores nas pranchas de cortia pode causar diferenas significativas no seu aroma, dependendo das espcies que se desenvolvem, pois diferentes espcies levam produo de diferentes metabolitos secundrios20. A anlise comparativa de placas de cortia recolhida em condies normais de fabrico e outras colocadas durante dois meses em local hmido promovendo assim o crescimento de bolores, conclui que a actividade dos bolores sobre a cortia acentuada ao nvel dos polissacardeos e de uma fraco dos compostos extractveis, principalmente nos polifenlicos3, 20. A fraco voltil da cortia contaminada altera-se, apresentando uma menor quantidade de aldedos alifticos e, pelo contrrio, uma maior quantidade de lcoois alifticos, nomeadamente: o 1-butanol, o 3-metil-1-butanol, o 1-pentanol e o 1-undeceno-4-ol. Isto ocorre por aco de dehidrogenases, reduzindo os aldedos derivados dos cidos gordos aos lcoois correspondentes. Este tipo de cortia apresenta igualmente uma maior proporo de hidrocarbonetos alifticos, sendo notrio o incremento em metilalcanos, nomeadamente o 2-metil-heptano, o 3-metil-heptano, o 3-metiloctano, e, igualmente, uma maior proporo de terpenides, sendo formado o 2-metilisoborneol, que apresenta aroma desagradvel a terra/mofo20. O aparecimento de compostos aromticos clorados, nomeadamente o 1,4-

diclorobenzeno e o 2,4,6-tricloroanisole (TCA), parece ter origem na metilao microbiolgica de clorofenis25,30,31,36, cuja presena poder igualmente estar associada a actividade microbiolgica, uma vez que existem referncias para a biognese de compostos aromticos clorados em ambientes naturais32. Os compostos organoclorados pertencem ao mais importante grupo de poluentes prioritrios da agncia americana de proteco ambiental (EPA), tendo a Unio Europeia estabelecido j limites para a concentrao destes analitos em gua destinada ao consumo humano. A sua presena em cortia pode ter diferentes origens, incluindo o uso de fungicidas, herbicidas, preservantes de madeira ou produtos de lavagem contendo 2,4,6-triclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol e pentaclorofenol, seja no ambiente de desenvolvimento transformao. do sobreiro seja por contaminao durante o processo de

25


Estudos anteriores25,33 efectuados em pranchas de cortia concluram que, apesar dos nveis se encontrarem abaixo do LPS, a presena de TCA resulta de uma contaminao ambiental externa durante o perodo de crescimento da cortia (9 anos), uma vez que as quantidades detectadas na regio junto ao solo e na parte exterior da prancha foram significativamente maiores do que nas partes superiores da rvore e na parte junto ao tronco. A identificao dos compostos formados por cada uma das espcies que fazem parte da microflora da cortia ou quais as espcies que produzem determinado compostos qumico, tm sido as duas formas de abordagem dos efeitos da actividade microbiolgica sobre a cortia. No primeiro pode-se referir o isolamento de 10 espcies de microrganismos dos gneros: Penicillium (3 estirpes), Trichoderma (2 estirpes), Aspergillus (2 estirpes), Mucor, Monillia e Streptomyces (1 estirpe de cada) de pranchas de cortia sem qualquer processamento industrial, que foram cultivados num meio de cultura de extracto de malte e outro com p de cortia esterilizado, sendo os compostos volteis produzidos analisados por DHS-TD, sendo identificados por GC-MS34. Os compostos volteis produzidos por crescimento das estirpes em cortia foram: sesquiterpenos (-santaleno, cariofileno, e -bergamoteno, isocariofileno, -bisaboleno e -curcumeno) com aromas balsmico, floral ou frutado, anisole, compostos aromticos clorados (clorobenzeno e 1,3-diclorobenzeno), 1-octeno-3-ol, com aroma a cogumelos, e 3-octanona, que apresenta descritores de aroma: floral, verde, frutado e a mofo. Em relao a compostos qumicos especficos produzidos pela microflora da cortia, os estudos tm sido orientados para a produo de TCA27,30 e guaiacol26. Em termos de estrutura celular, e por anlise por microscopia electrnica de varrimento, no se verificam diferenas entre clulas de cortia N e cortia B, seja ao nvel da degradao por bolores das lamelas da parede celular seja na alterao da sua espessura12.

1.1.5.2. Cortia classificada como mancha amarela O ataque por fungos, como a Armillaria mellea, provoca na cortia alteraes qumicas e fsicas, e consequentemente modificaes nas suas propriedades mecnicas e caractersticas visuais. Este tipo de cortia pode estar na origem do aparecimento de aromas indesejveis em vinho em contacto com esta cortia. A A.mellea pode

26


desenvolver-se nos solos das florestas e actua como parasita em plantas vivas e como saprfita em tecido mortos. Como parasita, este fungo causa a reduo do crescimento, a decrepitude e fragilizao, predispondo-as para o ataque por outros fungos e insectos, podendo mesmo provocar a sua morte. Como saprfita, o microrganismo presente na podrido branca dos troncos e cascas. Na cortia, aps uma fase inicial em que se desenvolve um miclio de cor branca, comea a aparecer zonas com colorao amarela, e que se verifica principalmente na produo de cortia do Norte de Africa2,20,35. A cortia com desenvolvimento de colorao amarelada industrialmente separada e classificada como defeituosa, com mancha amarela11. Estudos sobre cortia com sinais evidentes de mancha amarela (MA)3,20 indicam a presena de maior quantidade de terpenides do que as registadas em cortia N. Verificou-se igualmente um incremento dos teores de benzaldeido, lcool benzlico, 2hidroximetil-acetofenona e vanilina na cortia MA, o que dever estar associado degradao da fraco fenlica da cortia. Neste tipo de cortia foram igualmente identificados compostos organoclorados, nomeadamente o TCA 20. A cortia MA apresenta um aroma diferente da cortia N. Quando seca apresenta um aroma adocicado que dever estar relacionado com os compostos fenlicos volteis, quando hmida tem um aroma a bolor, podendo neste caso revelar os descritores de aroma associados ao TCA. Esta cortia apresenta uma estrutura celular heterognea, apresentando zonas com estrutura celular irregular. Na zona das manchas, as clulas tornam-se enrrugadas, apresentando separao ao nvel da lamela mdia, com diminuio da espessura da parede celular (0,6-0,9 m de espessura)12. Estes efeitos devem-se ao facto dos fungos solubilizarem e removerem a fraco pctica de polissacardeos da lamela mdia e atacarem a lenhina.

1.1.6. Influncia da cortia sobre as caractersticas organolpticas do vinho A aplicao mais comum da rolha de cortia a vedao de vinho. A rolha completamente introduzida no gargalo de garrafas de vidro, que so de seguida deitadas ou invertidas, estando assim o vinho em contacto com a cortia. A sua utilizao remonta a pocas anteriores ao nascimento de Cristo mantendo-se ainda actualmente como o vedante de eleio, especialmente para vinhos de qualidade e aqueles que vo estar em

27


garrafa durante perodos longos36, que por vezes podem chegar aos 30 anos, e at mais. Em todo o mundo so anualmente vendidas 12 a 13 mil milhes de garrafas de vinho com rolha de cortia19. As caractersticas de teor em lcool, tipicamente entre 8 e 13%, e de acidez, com pH entre 3,2 e 4, tornam o vinho uma soluo de extraco, ocorrendo a migrao de compostos da cortia para o vinho. Utilizando uma soluo etanol/gua a 12 %, os compostos extractveis de cortia normal (N) representam um valor da ordem dos 2,9% m/m (Tabela 5), podendo ser solubilizados compostos aromticos derivados de substncias fenlicas, acares livres, triterpenos, n-alcanos, n-alcois e cidos gordos. Estudos de migrao efectuados em vinho37,38 indicam que os compostos volteis que podem migrar de cortia normal para vinho pertencem ao grupo dos lcoois (o 2butoxietanol, o 4-vinilguaiacol, o guaiacol, 2-feniletlico, lcool benzilico, carbitol, 2fenoxietanol e butilcarbitol), dos terpenides (-terpineol e linalol) cidos (com um nmero de tomos de carbono entre C6 e C9) e compostos carbonlicos (furfural, 5metilfurfural, benzaldeido, vanilina, acetovanilona, etilvanilina e cnfora. Por outro lado, uma das caractersticas da cortia apresentar alguma permeabilidade ao vapor de gua e a outras molculas em estado de vapor. Assim, os compostos volteis, sejam metabolitos sejam contaminantes ambientais, penetram atravs dos buracos da estrutura celular e so adsorvidos pela superfcie interna da cortia, reduzindo assim a sua presso de vapor. A sua posterior difuso da cortia para o vinho est condicionada pela presso de vapor dos compostos adsorvidos. Ao ser introduzida no gargalo da garrafa, a rolha sofre uma compresso, que ir aumentar a presso das substncias gasosas dentro das clulas. Por outro lado, as molculas de gua ou etanol que penetram na rolha vo competir com os compostos volteis para os mesmos locais de adsoro, favorecendo a sua passagem para o exterior. Assim, a difuso de compostos volteis para o exterior continuar at que as suas actividades no interior da cortia e no vinho, sejam as mesmas3. Os compostos volteis podem ser formados na cortia ou adsorvidos durante o perodo de tempo em que a cortia processada, fica armazenada ou est em contacto com o vinho, podendo ocorrer alteraes que podem levar ao aparecimento de problemas que vo influenciar a composio qumica da cortia e, em consequncia as caractersticas organolpticas do vinho.

28


Uma destas alteraes a ocorrncia de uma falha na vedao, quer seja causada por problemas de processamento da cortia, quer pela existncia de defeitos estruturais ou erros de engarrafamento, que leva introduo anmala de ar no interior da garrafa com consequentes fenmenos de oxidao do vinho. Estes problemas podem ainda levar sada de vinho do interior da garrafa e sua deposio no topo exterior da rolha, criando um substrato favorvel ao ataque por bolores, quando as condies ambiente (humidade e temperatura) forem favorveis, com a consequente degradao de compostos e aparecimento de compostos de aroma anmalo. Outra deve-se ao facto da cortia poder estar sujeita ao ataque por microrganismos durante o processamento industrial: cortia B e cortia MA, levando alterao da sua composio qumica normal, especialmente na fraco de compostos volteis e compostos extractveis (Tabela 5), com evidncias de alterao organolptica de vinhos3. A cortia MA industrialmente considerada de elevado risco e eliminada durante o processamento industrial11. Desde que foi estabelecida uma ligao entre o aparecimento de gostos estranhos em bebidas e o TCA39 que este tem sido referido como sendo o grande e nico problema, como metabolito secundrio de aco de microrganismos aparecendo como contaminante em diversos materiais, alimentos e bebidas, incluindo gua de consumo40. Ao longo do tempo, um nmero limitado de outros compostos (Figura 3) tem vindo a ser associado em casos de vinho identificados com problemas de gostos estranhos26,41 sendo o guaiacol, a geosmina, o 1-octeno-3-ol, a 1-octeno-3-ona, o 2-metilisoborneol e, mais recentemente derivados de metoxipirazina42, nomeadamente a 2-isopropil-3metoxipirazina, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2,5-dimetil-3-metoxipirazina43, e ainda o 2,4,6tribromoanisole44. O tipo de aromas apresentado (mofo, terra, bolor) leva a concluir que a sua origem est relacionada com actividade fngica, nomeadamente o 1-octeno-3-ol, o metilisoborneol e a geosmina24. O guaiacol um composto formado a partir da degradao microbiolgica da vanilina por microrganismos normalmente encontrados na microflora da cortia26. As pirazinas so compostos igualmente referidos como causadores de aromas indesejveis em vinhos, surgindo devido a problemas de vinificao42. O 2,4,6-tribromoanisole surge como potencial causa para o aparecimento de aromas a mofo em vinhos, mas com uma provvel origem relacionada com a contaminao ambiental dos locais de armazenamento de garrafas de vinho44.

29


Como se pode verificar na Figura 3, os limites de percepo sensorial dos compostos referidos so muito baixos (de 2 ng/L a 20 g/L), o que leva a que as correspondentes metodologias analticas necessitem de ter sensibilidade adequada quantificao destes compostos em to baixos nveis.

OHO

CH3

CH3

CH3

OCl Cl Br

OBr

Cl

Br

Guaiacol DA: fumado, madeira LPS: 20 g/LH3C O

2,4,6-Tricloroanisole DA: mofo LPS: 4 ng/LCH2 H3C

2,4,6-Tribromoanisole DA: mofo LPS: 4 ng/LCH2 OH

1-Octeno-3-ona DA: cogumelos LPS:H3C CH3

1-Octeno-3-ol DA: cogumelos LPS: 20 g/LCH3

H 3C CH3

OH

OH CH3

2-Metilisoborneol DA: terra, mofo, bolor LPS: 30 ng/LCH3

Geosmina DA: terra, mofo LPS: 25 ng/L

N NO

CH3

N NO

CH3 CH3

H3C

N N

CH3 O CH3

CH3

CH3

2-Isopropil-3-metoxipirazina DA: terra, vegetal, batata LPS: 2 ng/L

2-Isobutil-3-metoxipirazina DA: vegetal, pimenta verde LPS: 2 ng/L

2,5-dimetil-3-metoxipirazina DA: bolor, mofo LPS: 2 ng/L

Figura 3. Compostos qumicos susceptveis de provocar defeitos em vinhos, associados cortia. DA: Descritor de aroma; LPS: Limite de percepo sensorial.

30


1.2. Micro-extraco em fase slidaA micro-extraco em fase slida (SPME) foi introduzida no final dos anos 80 para anlise de poluentes em gua45. Apresentou-se como uma alternativa aos mtodos tradicionais de extraco em espao de cabea dinmico, extraco lquido-lquido e outras tcnicas de extraco46. Trata-se de uma tcnica de extraco e pr-concentrao simultnea de compostos volteis e semi-volteis, sem solvente. Envolve a exposio de uma fase estacionria amostra e a partio dos analitos entre fases. Posteriormente so termicamente desorvidos no injector de um instrumento analtico, como por exemplo um cromatgrafo. A tendncia actual de evoluo da tcnica o desenvolvimento de fases estacionrias altamente selectivas e novas metodologias de micro-extraco capilar em sol-gel (sol-gelCME: capillary microextraction) que permitem atingir limites de deteco de partes por quatrilio (pg/L), por cromatografia com detector de ionizao de chama47.

1.2.1. Fundamentos tericos O modelo de fundamentao terica da extraco dos analitos por SPME depende do processo de soro envolvido. No caso de se tratar de uma fase estacionria lquida (extraco por absoro), o princpio base a partio do analito entre fases6. No caso de revestimentos slidos (por adsoro) o modelo baseado na isotrmica de adsoro de Langmuir48. A tcnica de SPME pode funcionar segundo um sistema de 2 fases6 (amostra - fase estacionria) ou 3 fases7 (amostra - espao de cabea - fase estacionria), como esquematizado na Figura 4. A fase estacionria colocada em contacto com a matriz da amostra durante um determinado tempo e sob condies especficas. Se o tempo for suficiente ocorre o equilbrio entre a fase estacionria e a amostra, no caso de um sistema de 2 fases, ou entre a fase estacionria, a regio de espao de cabea e a amostra, no caso de um sistema com 3 fases. Assim, a quantidade de analito sorvida na fase estacionria, pode ser relacionada com a concentrao de equilbrio dos analitos nas fases do sistema.

31


fase 1 fase 3 fase 2

fase 1

fase 2

Figura 4. Sistemas de extraco por SPME com 3 fases e 2 fases. Fase 1: fase estacionria de SPME, fase 2: amostra slida ou lquida, fase 3: regio de espao de cabea.

Considerando um sistema de trs fases, no equilbrio, a quantidade total de analito acumulada na fase estacionria igual quantidade de analito em equilbrio nas trs fases: C0V2 = C1V1 + C2 V2 + C3 V3

(eq.1) so a

em que C0 a concentrao inicial de analito na amostra, C1 , C2 , C3

concentrao de equilbrio do analito na fase estacionria, amostra e espao de cabea, respectivamente, e V1, V2, V3 o volume de fase estacionria, soluo amostra e espao de cabea, respectivamente. Utilizando o conceito de coeficiente de partio entre fase estacionria - espao de cabea, K1=C1 /C3 , e entre espao de cabea - soluo aquosa K2=C3 /C2 , a quantidade de analito acumulada pela fase estacionria, denominada capacidade do revestimento, n= C1 V1, pode ser expressa como:

n=

K 1K 2V 1V 2 C0 K 1K 2V 1 + K 2V 3 + V 2

(eq.2)

Assim, dependendo dos coeficientes de partio entre as fases e dos volumes de cada fase, pode ser traada uma relao de proporcionalidade entre a concentrao inicial do analito na amostra e a quantidade de equilbrio do analito acumulada na fase estacionria.

32


No caso de um sistema de 2 fases, no equilbrio, a quantidade total de analito acumulada na fase estacionria igual quantidade de analito em equilbrio nas duas fases:

n=

KV 1V 2 C0 KV 1 + V 2

(eq.3)

Sendo K o coeficiente de partio entre a fase estacionria e a amostra, podemos estabelecer uma relao entre K e a constante de Henry do analito na fase estacionria KF e na soluo aquosa KH.

K = K1 K 2 =

KH KF

(eq.4)

A equao 3 descreve a massa sorvida aps o sistema ter atingido o equilbrio. Na maioria das determinaes analticas o coeficiente de partio entre a fase estacionria e a amostra, K, relativamente pequeno quando comparado com razo entre os volumes da amostra e de revestimento (V1 90 atm.cm3/mol) e solubilidade em solventes orgnicos (logaritmo do coeficiente de partio octanol/gua< 4), a extraco deve ser efectuada na regio de espao de cabea. A superfcie de interface entre a matriz lquida e a fase gasosa grande e os coeficientes de difuso de compostos na regio de espao de cabea so maiores do que num sistema de duas fases, tipicamente por um incremento superior a 4 ordens de grandeza7. A extraco na regio de espao de cabea apresenta vantagens em relao proteco da fase estacionria de efeitos adversos causados por compostos no volteis de peso molecular elevado existentes na matriz da amostra, conferindo maior durabilidade na utilizao e ainda a possibilidade de se proceder ao ajuste das condies de extraco da amostra (pH, fora eluotrpica, fora inica) sem causar efeitos nefastos na fase estacionria. As fases estacionrias encontram-se comercialmente disponveis em suporte de slica fundida com comprimento de 1 ou 2 cm. A sua seleco deve ser efectuada de forma a haver uma forte afinidade para os compostos que se pretende extrair. Comercialmente, classificam-se de acordo com o mecanismo de extraco (absoro ou adsoro), e a polaridade: podendo ser polares, apolares ou bipolares (Tabela 6. ).

Tabela 6. Fases estacionrias comercialmente disponveis por tipos (Supelco, Inc). Tipo Absorventes Polaridade Apolares Polares Adsorventes Bi polares Fase estacionria PDMS: Polidimetilsiloxano PA: Poliacrilato DVB/PDMS: Divinilbenzeno em polidimetilsiloxano CAR/PDMS: Carboxen em polidimetilsiloxano DVB/CAR/PDMS: Divinilbenzeno/Carboxen polidimetilsiloxano Polares CW/DVB: Divinilbenzeno em Carbowax em

35


Implicitamente escolha da fase estacionria adequada para o analito est um processo de soro6: adsorvente ou absorvente. As fibras do tipo absorvente extraem por partio do analito na fase estacionria lquida, por vezes como efeito de uma esponja (Figura 6A). Os analitos migram para dentro e para fora do revestimento sendo a capacidade de reteno e libertao do analito dependente da sua espessura e tamanho do analito49. Regra geral, quanto maior for a espessura maior ser a capacidade de absoro da fibra. As propriedades de extraco da fase estacionria no se alteram substancialmente at que a quantidade extrada seja aproximadamente cerca de 1% da massa de fase estacionria, pelo que, a temperatura constante, a relao entre concentrao da amostra e massa extrada linear numa grande gama de concentrao de analitos e interferentes, sendo cerca de 4 ordens de grandeza superior ao tipo adsorvente. Esta caracterstica torna este tipo de fase estacionria aconselhvel para a anlise de analitos de pequena dimenso e em gamas de concentrao esperada com grande amplitude, desde algumas partes por milho a alguns pontos percentuais.

A- Extraco por absoro

B- Extraco por adsoro, com micro e meso poros*

C- Extraco por adsoro, com meso e macro poros*

Figura 6. Representao esquemtica de um corte de uma fibra de SPME durante o processo de extraco, usando fibras do tipo absorvente (A) e adsorvente (B e C)48. * Micro-poros (2-20), meso-poros (20-500 ) e macro-poros (> 500).

No caso de utilizao de polmeros slidos como fase estacionria, as interaces que representam o papel mais importante so intermoleculares e fracas (e interaces hidrofbicas quando a extraco efectuada a partir de matriz aquosa)48, ocorrendo a extraco por um mecanismo do tipo adsorvente. O nmero de stios superficiais onde a adsoro ocorre limitado, pelo que quando todos so ocupados nenhum analito pode posteriormente ser captado (Figura 6). Desta forma, a relao entre a concentrao de

36


analito extrado de uma amostra por um revestimento slido pode no ser linear numa gama alargada de concentraes. A sua vantagem em relao s de absoro a elevada selectividade e capacidade para compostos polares e compostos volteis48,49,50.

1.2.4. Fases estacionrias A sensibilidade melhorada por uma rigorosa seleco do tipo de fase estacionria (Tabela 7) e modo de extraco (directa ou em espao de cabea). No caso de analitos volteis e semi-volteis no polares dever sempre optar-se por anlise em espao de cabea pois, alm dos analitos se poderem difundir mais rapidamente, conseguem eliminar-se interferncias de matriz e uma maior durabilidade dos dispositivos de extraco. Para compostos semi-volteis, a relao de polaridade com a fase estacionria crtica.

Tabela 7. Fases estacionrias SPME comercialmente disponveis para GC (de Supelco, Inc, Bellefonte, PA, EUA). Fase estacionria PDMS Espessura do filme (m) 100 30 7 Uso recomendado Compostos volteis. Compostos semi-volteis no polares. Compostos no polares ou moderadamente polares com elevado peso molecular. PDMS/DVB PA CAR/PDMS 65 85 75 Compostos volteis polares, aminas e nitroaminas. Compostos semi-volteis polares. Gases e compostos de baixo peso molecular, em quantidades vestigiais. 85 CW/DVB 65 65 DVB/CAR/PDMS 50/30 Compostos de natureza bipolar. lcoois e compostos polares. Compostos moderadamente polares. Aromas (compostos volteis e semi-volteis).

37


Assim, para se desenvolverem metodologias de SPME importante conhecer as caractersticas fsico-qumicas dos analitos (como a polaridade, grupos funcionais, presso de vapor, estrutura e massa molecular) e os efeitos de matriz. Para assegurar nveis adequados de reprodutibilidade, importante manter fixos os parmetros experimentais que influenciam a extraco do analito.

1.2.5. Influncia das condies experimentais 1.2.5.1. Na extraco Estimando a influncia dos parmetros que afectam a termodinmica do processo de extraco, podemos optimizar os parmetros e, assim, controlar a sensibilidade e reprodutibilidade da tcnica. Conceitos tericos podem ser usados para optimizar as condies de extraco, permitindo igualmente a sua correco. Os parmetros que afectam a constante de distribuio so o pH, a temperatura de extraco, a fora inica, a fora eluotrpica, a agitao e a razo (volume de espao de cabea/volume de amostra). O tempo para atingir o equilbrio afectado igualmente pela constante de distribuio e ainda pela agitao, pela espessura da fase estacionria e pela forma como o suporte colocado na amostra (imerso ou na regio de espao de cabea). semelhana do que se verifica na extraco lquido-lquido, para garantir que, pelo menos 99% da forma neutra de um composto extrada, o pH da soluo deve ser ajustado a, pelo menos, 2 unidades inferior ou superior ao pKa do analito, caso se trate de um cido ou de uma base, respectivamente6. Mais importante o ajuste e controlo do pH de forma a manter-se constante em todas as amostras em anlise. O efeito da temperatura sobre a rea cromatogrfica dos compostos presentes na matriz est relacionado com 3 factores. Por um lado, e uma vez que o processo de absoro dos compostos pela fase estacionria exotrmico, o aumento da temperatura provoca a difuso das molculas de compostos absorvidas pela fase estacionria para a fase gasosa, o que contribui para a reduo do coeficiente de partio fase estacionria/fase gasosa (k1). Por outro lado, o aumento da temperatura tambm aumenta a solubilidade dos compostos na matriz o que causa uma reduo no coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (K2). Por outro lado o aumento de temperatura pode levar a um aumento da volatilidade dos compostos presentes na matriz, o que contribui para o

38


aumento do coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (K2)51. O equilbrio entre os diversos factores faz com que prevalea um deles, contribuindo assim para um efeito positivo ou negativo sobre a quantidade de composto extrada. Em relao fora inica, e de um modo geral, a presena de um electrlito pode influenciar o processo de extraco de duas formas, alterando as propriedades de interface situada na fronteira entre a fase lquida e o espao de cabea e pela diminuio da solubilidade dos compostos hidrofbicos na fase aquosa, promovendo a deslocao do equilbrio da fase aquosa (amostra) no sentido da fase de espao de cabea ou para a fase estacionria do suporte SPME7. Normalmente, os compostos volteis polares em matrizes polares (amostras aquosas) sentiro maiores efeitos no coeficiente de partio aps adio de sal amostra. A alterao da fora eluotrpica resulta da existncia de solventes orgnicos na matriz aquosa da amostra, como etanol. Estes provocam uma alterao significativa na fora eluotrpica da soluo6, funcionando como co-solventes relativamente s fases estacionrias de SPME. Variaes da ordem de 0,5% do volume causam uma reduo significativa (mais de 60%), na recuperao de compostos polares semi-volteis52, pelo que ao analisar compostos em matrizes alcolicas, como vinhos, deve ser tido especial cuidado com o teor em lcool quando se comparam resultados. Relativamente razo , como o volume de fase estacionria constante, a alterao do volume de amostra altera directamente a quantidade de composto extrada. A observao da equao 2 permite verificar que, ao diminuirmos o volume do espao de cabea, V3, a quantidade de analito extrada pela fase estacionria aumenta, aumentando a sensibilidade do mtodo, dentro de uma concentrao correspondente gama de linearidade do mtodo. O modo como a extraco efectuada tem tambm um impacto elevado na cintica do processo. Quando se usa o modo de espao de cabea, o tempo para os compostos atingirem a fase estacionria depende muito da sua volatilidade e capacidade de passagem fase gasosa (constante de Henry). A agitao e a temperatura podem ter um efeito favorvel no processo6,7, com reduo no tempo necessrio para se atingir condies de reprodutibilidade.

39


Uma vez que a anlise das amostras extradas por SPME pode ser efectuada por cromatografia gasosa (GC), cromatografia lquida de alta presso (HPLC) e electroforese capilar (CE), os analitos so desorvidos nos sistemas de injeco dos equipamentos, tratando-se de desoro trmica no GC ou por solvente no HPLC e CE.

1.2.5.2. Na desoro Na desoro trmica em GC, os parmetros analticos a considerar so o ponto de ebulio do analito, a espessura da fase estacionria e a temperatura do injector. Assim, do ponto de vista instrumental, os parmetros a controlar so a temperatura do injector, a posio e profundidade de insero da fibra no injector e o tempo de desoro6. A utilizao de sistemas automticos de injeco permite um maior controlo das condies de injeco (posio e profundidade da fibra) e o tempo, melhorando a reprodutibilidade da metodologia.

1.3. Metodologias SPME na anlise de 2,4,6-tricloroanisole em cortia e em vinhoA maioria dos estudos sobre defeitos de aroma associados rolha de cortia tem incidido quase exclusivamente sobre o TCA. Isto porque o TCA tem vindo a ser reconhecido como sendo o principal problema da rolha de cortia, presente em mais de 80% dos casos de desvio organolptico25,53. Assim, os esforos de controlo da qualidade da cortia, tm vindo a ser investidos essencialmente no desenvolvimento de metodologias nesta rea, incluindo na normalizao de mtodos de ensaio em rolhas de cortia pela Organizao Internacional de Normalizao (ISO)54. Na Tabela 8 apresenta-se a evoluo das metodologias SPME para a anlise de TCA. A primeira publicao sobre anlise de TCA por SPME, procedeu extraco directamente a partir de pedaos de cortia55. Os resultados foram considerados pouco animadores, com baixa reprodutibilidade. Pelo contrrio em vinho55,56 os resultados demonstram que a tcnica de SPME apresentava bons resultados ao nvel da reprodutibilidade e linearidade, com limites de deteco (entre 0,5 e 2,9 ng/L) inferior ao limite de percepo sensorial (LPS de 4 ng/L).

40


Assim, devido s caractersticas da cortia e da sua utilizao, tm surgido dois conceitos: TCA total e TCA que potencialmente pode migrar para o vinho57,58. Da que a anlise de TCA na cortia possa ser realizada directamente sobre a cortia ou ento aps a extraco prvia da cortia com uma matriz lquida simulante de vinho. A anlise faz-se sobre a matriz lquida, sendo o resultado definido como TCA libertvel (TCA releasable).

Tabela 8. Metodologias de SPME aplicadas a vinho e cortia para anlise de compostos volteis presentes ou transmitidos pela cortia (TCA e cloroanisis). Ano de publicao 1997 Metodologia Extraco Anlise Limite deteco 2,9 ng/L

Matriz

Ref. 55

Vinho e Vinho: SPME-PDMS. Rolhas: fraca GC-MS, Mtodo de Cortia reprodutibilidade adio padro Vinho HS-SPME, com PDMS a 45C. GC-MS, PI: TCA deuterado.

0,5-2 ng/L LQ 5ng/L 1-5 ng/L

56

1999

Cortia As rolhas em soluo 24 horas GC-ECD, PI: TCA em deuterado. sendo o extracto analisado por soluo HS-SPME com fibra PDMS100m. Vinho Vinho SBSE: Extraco por soro em barra HS-SPME. Melhor fase estacionria PDMS em reprodutibilidade e DVB/CAR/PDMS em sensibilidade. HS-SPME-PDMS. Extraco por soro em barra agitadora (SBSE) HS-SPME: Comparao de fibras, selecciona a DVB/CAR/PDMS HS-SPME: Comparao de fibras, selecciona a PDMS MHS-SPME Mltiplo HS-SPME com fibra DVB/CAR/PDMS GC-MS GC-ECD, PI: 2,3,6triclorotolueno. Mtodo de adio padro. GC-ECD, PI: 2,4,6tribromoanisole. GC-ECD GC-MS GC-MS GC-MS

57

2000 2002

1-5 ng/L 1ng/L

59 61

2003 2004

Vinho Vinho Vinho Vinho

0,15 - 5,4 ng/L LQ= 1,08 pg/L. 2,5 ng/L 0,1 ng/L 2,5 ng/L

58 60 62 63 64

2005

Cortia

LQ: limite de quantificao; PI padro interno

41


As publicaes que se seguiram tm-se centrado na optimizao das condies para a sua anlise em vinho, de modo a conhecer a influncia de diferentes dispositivos de extraco, por exemplo SBSE59,60, novas fases estacionrias (DVB/CAR/PDMS)61,62 e diferentes condies experimentais58,60,63. Muito recentemente surgiu a metodologia de mltipla extraco na regio de espao de cabea, MHS-SPME64, aplicvel para a anlise directa de cortia como matriz slida, que consiste na extraco sucessiva dos analitos do mesmo vial, por HS-SPME, que, por aplicao de modelos tericos desenvolvidos, apresenta uma estimativa da concentrao total dos analitos.

42


1.4. Enquadramento e objectivos do trabalhoOs estudos de caracterizao sensorial de cortia e do vinho, no sentido de verificar a sua qualidade organolptica, tm assentado quase exclusivamente na deteco do TCA, seja do ponto de vista instrumental seja sensorial. A presena de TCA tem sido mundialmente aceite como indicador de contaminao sensorial sendo estabelecidos critrios de aceitao/rejeio de lotes de rolhas entre as partes interessadas, com base neste critrio. conhecido, tanto do ponto de vista de anlise de lotes industriais de rolhas53 como atravs de estudos cientficos36, que a correlao entre o defeito sensorial e a quantidade de TCA detectada aps extraco completa da rolha relativamente baixa. Assim, importante desenvolver metodologias que permitam quantificar em simultneo o TCA e outros compostos susceptveis de provocar defeitos sensoriais associados cortia, e identificar potenciais factores que interfiram na quantificao do TCA. No presente trabalho ser utilizada a metodologia de HS-SPME-GC-MS, uma vez que actualmente o mtodo internacional em fase final de normalizao para anlise de TCA na cortia. O presente trabalho tem 2 objectivos principais: i) Desenvolver uma metodologia de HS-SPME para identificar e quantificar compostos volteis susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos em contacto com cortia; ii) Pesquisar os compostos padro estudados em simulantes de vinho que estiveram em contacto com cortia normal e cortia com defeitos (bolor e mancha amarela).

A seleco dos compostos a analisar baseou-se num estudo de identificao de compostos encontrados em vinhos que apresentavam desvios organolpticos causados pela cortia41: o 2,4,6-tricloroanisole (TCA), o 1-octeno-3-ol (1-Oct-3), o guaiacol (Gua), o 2-metilisoborneol (MIB) e a geosmina (Geo), e outros encontrados na cortia sujeita a ataque por microorganismos20: o 3-metil-1-butanol (3-MB) e 1-octanol (1-Oct).

43


No estabelecimento de uma metodologia de SPME muito importante a escolha da fase estacionria, uma vez que a quantidade e tipo de compostos que so extrados da amostra depende da espessura e caractersticas fisico-qumicas do filme. A opo de seleco de uma fase estacionria no polar de 100 m de PDMS teve a ver com o facto de esta ser indicada para analitos no polares, nomeadamente compostos volteis, sendo utilizada na anlise de aromas em alimentos e bebidas65,66 e fragncias21, tendo vindo a ser utilizada na determinao de TCA em vinho e em rolhas (Tabela 8), sendo igualmente esta fase a indicada no mtodo internacional normalizado para anlise de TCA na cortia54. Relativamente ao modo de extraco, seleccionou-se a extraco na regio de espao de cabea dadas as caractersticas da matriz relativamente ao valor de LogP (oct/ag) dos compostos a analisar e pelo facto de ser o mtodo de referncia em normalizao pela ISO. Os compostos volteis tm coeficientes de difuso na fase gasosa tipicamente de 4 ordens de grandeza superiores aos registados nos lquidos7, encontrando-se grande parte dos mesmos na fase gasosa antes do incio da extraco. Alm disso, esta tcnica protege a fibra do efeito adverso de substncias no volteis de elevado peso molecular que possam estar na matriz. Relativamente aos parmetros experimentais: razo 1/55,61, adio de sal 55, agitao51 e tempo de desoro56,61, foram utilizados valores da literatura obtidos na optimizao de metodologias HS-SPME para anlise de TCA em vinho. O estudo de optimizao da metodologia incidiu sobre: i) temperatura de extraco, ii) linearidade global, iii) linearidade e reprodutibilidade relativamente a cada padro e estimativa dos Factores Relativos de Resposta da metodologia de SPME e iv) avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz.

44

Parte II Materiais e Mtodos


2.1. Materiais2.1.1. Reagentes e padres Foram utilizados os seguintes padres: 3-metil-1-butanol (98,5%), guaiacol ( 98%), 1octeno-3-ol (98%) e 1-octanol (99%) (Sigma-Aldrich, EUA), 2,4,6-tricloroanisole (99%) (Sigma-Aldrich, Alemanha), geosmina (98%) e 2-metilisoborneol (98%) (Wako, Alemanha), encontrando-se na Figura 7 as respectivas frmulas e estruturas qumicas, nmeros CAS, descritores de aroma e limites de percepo sensorial. Usou-se, ainda, cloreto de sdio (Merck, Alemanha), etanol p.a. (Riedel-deHaen) e cido L-(+) tartrico (Panreac, Barcelona).

H3CH3C CH3 OH

CH2 OH

H3C

OH

3-Metil-1-butanol (3-MB) CAS 123-51-3 C5H12O DA: whisky LPS: 300 mg/LCH3

1-Octeno-3-ol (1-Oct-3) CAS 3391-86-4 C8H16O DA: cogumelos LPS: 20 g/LCH3CH3

1-Octanol (1-Oct) CAS 111-87-5 C8H18O DA: cera LPS: H3C CH3

OHO

OCl Cl

OH

Cl

CH3

H3C CH3

OH

Guaiacol (Gua) CAS 90-05-1 C 7 H 8 O2 DA: fumado, madeira LPS: 20 000 ng/L

2,4,6-Tricloroanisole (TCA) CAS 87-40-1 C7H5Cl3O DA: bolor, mofo LPS: 4 ng/L

Geosmina (Geo) CAS 19700-21-1 C12H22O DA: terra, mofo LPS: 25 ng/L

2-Metilisoborneol (MIB) CAS 2371-42-8 C11H20O DA: terra, mofo, bolor LPS: 30 ng/L

Figura 7. Estrutura e frmula qumica, nmero CAS, descritor de aroma (DA) e limite de percepo sensorial (LPS) dos padres em estudo.

47


Tabela 9. Dados fisico-qumicos dos padres em estudo67. MM p.e. (C) 131,1 174,5 195,1 205 241 270 Presso de vapor* (10-3 mmHg) 2370 79,4 103 32,0 22,8 2,14 Constante de Henry* (atm.cm3/mol) 14,0 24,5 1,2 8,9 130 11,8 Solubilidade em gua* (mg/L) 2,67x104 Insolvel 540 1,87x104 305 10 (20C) 157 LogPa) (oct/ag) 1,16 3,00 1,32 3,31 4,11 3,57

Composto 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo

88,15 128,21 130,23 124,14 168,28 211,47 182,31

a) Log P octanol/gua: coeficiente de partio do composto entre octanol e gua * a 25C

A soluo simulante de vinho foi sempre preparada antes da realizao dos ensaios, consistindo numa soluo etanol/gua a 10% (v/v), com adio de cido tartrico at pH 3,5.

2.1.2. Preparao de rolhas de cortia (N, B e MA) e posterior engarrafamento As rolhas de cortia foram fabricadas numa unidade industrial, encontrando-se o esquema de preparao representado na Figura 8. Seleccionaram-se duas pranchas de cortia provenientes da regio do Alto Alentejo, com calibre marca (31/40 mm) e classe de qualidade visual de 1/3. Uma das pranchas no apresentava qualquer tipo de defeito visual, sendo industrialmente classificada como normal (N), e a outra classificada industrialmente como cortia com mancha amarela (MA). Estas pranchas foram cozidas separadamente, sendo a primeira (N) cozida junto com o 1 lote de cortia da semana, tendo assim gua renovada, e a segunda (MA) junto com o lote seguinte, de forma a no haver contaminao cruzada. Aps a cozedura foram deixadas em repouso na zona industrial de estabilizao, mas separadamente das outras pranchas de cortia em curso de produo.

48


Ao fim de duas semanas iniciou-se a fabricao, utilizando as especificaes tcnicas para produo de rolhas de calibre 45X24 mm, ou seja, na operao de rabaneao foram cortadas em bandas de 47,0 mm de largura, seguindo-se a brocagem com tubos cilndricos ocos de 24,7 mm de dimetro interno. As rolhas fabricadas a partir da prancha MA apresentavam manchas amarelas, caractersticas do defeito localizadas nos topos.

Cortia de provenincia conhecida (Alentejo) Classe: 1/3 Calibre: Marca 31/40 mm

Prancha sem defeito

Prancha com defeito: mancha amarela

1 Cozedura da semana

2 Cozedura da semana

Rabaneao

Rabaneao

Brocagem

Brocagem

Secagem 4).

74


Tabela 22. Caractersticas fsico-qumicas dos compostos, agrupados de acordo com os respectivos Factores Relativos de Resposta (FRR). Grupo 1 Log(FRR)=1H3C CH3 OH

3-MB Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 2 Log(FRR) de 2 a 3 2,67 x104 mg/L 1,16 2370 x10-3mmHg 14,0 atm.cm3/molCH3

CH3

OCl Cl

H3C

CH3

OH CH3

Cl

H3C CH3

OH

Geo Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 3 Log(FRR)= 4 157 mg/L 3,57 2,14 x10 mmHg 11,8 atm.cm3/molCH3-3

TCA 10 (20C) mg/L 4,11 22,8 x10 mmHg 130 atm.cm3/mol-3

MIB 305 mg/L 3,31 32,0 x10-3mmHg 8,9 atm.cm3/mol

OHO

Gua Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 4 Log(FRR)>4H3C OH

1,87x104 mg/L 1,32 103 x10-3mmHg 1,2 atm.cm3/molCH2

H3C

OH

1-Oct-3 Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Ins. -

1-Oct 540 mg/L 3,00 79,4 x10-3mmHg 24,5 atm.cm3/mol

75


Verifica-se que no grupo 1 se encontra o composto de menor massa molecular, com volatilidade (2370x10-3mmHg) e solubilidade em gua (2,67x104mg/L) elevadas. Neste caso, do equilbrio entre o efeito da volatilidade vs solubilidade, parece ser o efeito da solubilidade a ter um papel preponderante. Estudos anteriores49 indicam existir uma relao linear entre a MM e o Log(FRR), o que pode explicar o valor de Log(FRR) determinado para o 3-MB. No Grupo 2 esto contidos os compostos com menor volatilidade (presso de vapor de 2x10-3 a 32x10-3 mmHg), o que faz com que possam necessitar de maior tempo para que ocorra a sua passagem para o espao de cabea, com excepo do TCA que por apresentar um valor de constante de Henry elevado (130 atm.cm3/mol) apresenta elevada afinidade para a fase gasosa. Estes compostos apresentam baixa solubilidade em gua (de 10 a 305 mg/L), e os valores de LogP(oct/ag)4 indicam relativa solubilidade em solventes orgnicos. Assim, o etanol pode funcionar como co-solvente. Este facto associado sua baixa volatilidade pode explicar o valor de FRR determinado para este grupo. No grupo 3 encontra-se o Gua, composto mais voltil (presso de vapor 103x10-3 mmHg) e mais solvel (1,87x104mg/L) que os compostos do grupo 2. Neste caso, do equilbrio entre o efeito da volatilidade vs solubilidade, parece ser o efeito da volatilidade a ter um papel preponderante. A este h a acrescentar a afinidade para a fase estacionria o que se traduz por um valor relativamente elevado de Log(FRR). No grupo 4 encontram-se o 1-Oct-3 e 1-Oct, compostos com maior afinidade para a fase gasosa, evidenciada por terem valores de solubilidade em gua relativamente baixo (insolvel e 540 mg/L para o 1-Oct-3 e 1-Oct, respectivamente), o que est de acordo com anteriores estudos51 que indicam que a maior afinidade com a fase estacionria se verifica para compostos com menor solubilidade em gua e menor volatilidade.

76


3.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matrizNo sentido de avaliar os efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz foi preparada uma soluo base

Documents

Compostos Voláteis associados a defeitos de cortiça de Quercus suber L