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Conceitos básicos da cultura de células
Carmo Ornelas Responsável do Laboratório Virologia
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Futuro passa pela cultura de células e já vamos com dois anos de atraso.
Está na altura de avançar.
Todos sabemos que a mucosa olfactiva e rica em celulas nervosas do
tipo estaminal com enormes capacidades regenerativas.
Continuou…
Estudo “não teve continuidade, pois o conceito de medicina regenarativa, a
utilizaçao de celulas estaminais e a investigação translacional eram
demasiado revolucionárias.
Anos 80
Conceitos básicos da cultura de células
Expresso revista 15 Novembro 2014, assunto transplante da mucosa olfactiva para a medula
espinal desenvolvida há treze anos no hospital Egas Moniz.
Dr. Pratas Vital
Pensei...
É a medicina regenerativa no seu esplendor (auto transplante de condrócitos
e de mucosa olfactiva)
Logo um “bichinho”, não a “Legionella” não o “Ébola, me atacou”
Portugal tens excelentes profissionais nesta área.
Excelentes profissionais, uma sala branca e muito muito trabalho,
Dobramos o cabo Bojador.
Conceitos básicos da cultura de células
Mas pensei na deusa Aurora que se apaixonou por Títono um simples mortal,
belo, que o raptou e casou. Implorou a Zeus que o tornasse imortal. Tal
aconteceu, mas Aurora cometeu um erro fatal. Esqueceu-se de pedir a
juventude eterna.
Resto todos sabem…
Titono envelheceu,
ensandeceu e acabou
transformado em
grilo.
Temos uma imortalidade sonhada e uma juventude desejada.
Conceitos básicos da cultura de células
• Motoo Kimura:
– 1924-1994
– Teoria da Evolução Molecular Neutra
A nossa vida é construída sobre um edifício dealeatoriedade, ou seja, no interior das nossas células,fragmentos e pedaços de ácidos nucleicos e proteínasflutuam sem destino, esperando para interagir.
Nós somos genoma, epigenoma, transcriptoma, proteinoma e microbioma…..
E ter em atenção os mecanismos estocásticos na expressão genica.
Conceitos básicos da cultura de células
Microbioma
Corpo humano adulto abriga 10x mais microrganismos (bacteria, virus, etc..)
do que as células humanas….
Cujo o genoma combinado é muito maior que o genoma humano.
Segundo Lita Proctor o nosso microbioma produz compostos como
vitaminas e anti-inflamatorios que o nosso próprio genoma não produz.
Conceitos básicos da cultura de células
La science est la l’âme de la
prospérité des nations e la source
vive de tout progrès
Louis Pasteur
A
estória
da
Historia
Cultura de células – 1900 …
• Um pouco de História:
– Ross Harrison (1907) A cultura de células começou em 1907, com umaexperiência para resolver um controvérsia emNeurobiologia. A hipótese examinada eraconhecida como “
e não o produto da fusaode muitas células. Para resolver esta controvérsia,pequenas pedaços de medula (fibras nervosas)foram colocadas sobre linfa, em câmara húmida eaquecida. Após observação regular, célulasnervosas individualizadas poderem ser vistasalongando-se para dentro da linfa.
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Cultura de células – 1900 …
Cultura de células – 1900 …
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Alexis Carrel: Um pioneiro da cultura de células
Estudou:
•Formulação do meio de cultura, substituindo o soro coagulado por plasma normal, suplementando
com extracto de embrião ou de musculo.
•Introduziu técnicas de assépsia rigorosas.
•Controlou a temperatura das culturas.
1911 J.E. M. volume XIII
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• Desenvolveu um frasco em vidro, pyrex que substituiria os vidros
de relógio e as placas, que eram usadas em culturas.
Alexis Carrel: Um pioneiro na cultura de células
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Todas as culturas de células eram realizadas em salas negras
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Sala dos Relatórios da TAC - Serviço de RadiologiaAntiga sala de Cultura de Tecidos (Drª Maria Teresa Furtado Dias, Lab. Patologia Experimental)
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Cultura de células – 1900 …
Cultura de células – 1900 …
Cultura de células – 1900…
A enzima que foi utilizada a partir de 1952 como rotina na
cultura de células – A tripsina
• George Otto Gey:
– 1952: Estabelecimento da primeira “linha celular” humana, a
partir de uma biópsia de um adenocarcinoma do colo de
Henrietta Lacks (são células que sofreram uma mudança
genética que as torna imortais);
Células HeLa com genoma do HPV 18
integrado (aneuploidia)
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• Assim, em 6 meses consegue,
de facto, uma linha celular que
serviu para estudar o vírus da
Polio
• O padrão seguro de exposição
aos Raios X, ao plutónio, ouro
e fósforo radioactivo, onde
foram estudados mais de 300
produtos químicos, extractos
de plantas como taxol, foram
determinados em células
HeLa.
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Células HeLa
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– 1980: A linha celular HeLa imortalizada por um virus oncogénico HPV 18
Harald zur Hausen
Só na decada de 80, o Professor Harald zur Hausen identifica o agente que imortalizou as celulas.
30 anos depois
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• Henry Eagle:
– Publicou na Science, em
1959, a constituição do
meio para cultura de
células (meio MEM), em
que todos os constituintes
eram quimicamente
definidos;
– Condecorado em 1987
pelo Presidente Ronald
Reagan, com a medalha
da Ciência;
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– 1965: Demonstrou que os fibroblastos
humanos, em cultura, tinham um número
limitado de divisões;
MRC5: Fibroblastos pulmão
de embrião humano
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Limite de Hayflick´s
Leonard Hayflick
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• John Littlefield:
– 1964: Técnica de fusão de células.
Trabalho original publicado na Science 145: 709, 1964
Meio HAT: Meio que permite selecção artificial das células
Meio do
Chapéu
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• H. Harris e Watkins:
– 1965: Heterocario
Fusão de duas células afim de formar uma célula
combinada com dois núcleos separados.
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• George Kohler e Cesar Milstein:
1975: Descoberta dos anticorpos monoclonais (anticorpos
especificos);
Prémio Nobel em 1984
George Kohler
Cesar Milstein
Máquina de fazer anticorpos monoclonais
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• Martin Evans:
– 1986: Cultivou e Isolou células estaminais de embrião de ratinho
(células pluripotenciais);
• Em 1989 nasceram os primeiros ratinhos em que 1 gene
podia ser desactivado;
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• James Thompson e John Gearhart:
– 1998: Cultura e Isolamento de células estaminais humanas
(células imortais e pluripotenciais)
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• Olivier Smithies (Bioquímico)
• Martin Evans (Embriologista)
• Mario Capecchi (Biofísico)
– Prémio Nobel 2007
Descoberta “ dos princípios que permitem
introduzir alterações nos genes de ratinho
através da utilização de células estaminais
embrionárias”
Comité Nobel sueco
Jornal Público, 09-10-2007
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A Shinya Yamanaka:
– 2007
– Células estaminais induzidas a partir de pele
humana
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DO LABORATÓRIO À CLÍNICA
• Quais são as ferramentas necessárias:1. Assépsia
2. Enzimas (tripsina, colagenase)
3. Meios de Cultura
4. Reagentes diversos: Antibióticos, Soro Fetal
5. Frascos (vidro, plástico)
• O que obtemos:
• Explantados (obtenção de células a partir de pequenos
fragmentos de tecidos);
• Linhas celulares secundárias com crescimento limitado;
• Linhas continuas (obtidas por imortalização das células)
fixadas ou em suspensão;
• Definição de Cultura de Células:
– Esterilidade
– Esterilidade
– Esterilidade
– Muito engenho
– Paciência
Carmo Ornelas
Transplante autologo de
condrócitos
Preparação da biopsia
Transplante autologo de
condrócitos
• Isolamento enzimático dos condrócitos da biópsia
• Cultura/expansão in vitro dos condrócitos (primocultura ou sub
cultura) em meio rico em nutrientes a 37º C e com atmosfera de 6%
de CO2
Cultura primária
Transplante autologo de
condrócitos
Transplante autologo de
condrócitos
Preparação do fragmento
Transplante autologo de
condrócitosFragmento em meio de transporte
Transplante autologo de
condrócitos
A todos um coração agradecido
Willow Song cantado por Maria Calas em Otello
Ao meu amigo João Salgueiro
Carmo Ornelas
