“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos

de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios”

Leonardo Chicaybam Peixoto

Rio de Janeiro

Julho 2010

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSO

EM ONCOLOGIA

ii

“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos

de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios”

Leonardo Chicaybam Peixoto

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Senso do Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Oncologia.

Orientador: Martin Hernán Bonamino

Divisão de Medicina Experimental – Centro de Pesquisa – Instituto Nacional de Câncer

Rio de Janeiro

Julho 2010

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Chicaybam, Leonardo Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios Orientadora: Martin Hernán Bonamino Dissertação: Mestre em Oncologia Programa de Pós-Graduação em Oncologia 85 páginas 1 - Linfócito T 2 - Leucemia Linfóide Aguda 3 - Receptor Quimérico de Antígeno 4 - Terapia Gênica

iv

Este trabalho foi realizado na Divisão de Medicina Experimental do Centro de Pesquisa - Instituto Nacional de Câncer, sob orientação de Martin Hernán Bonamino. Contou com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação do Câncer e Ministério da Saúde/INCA, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

v

FOLHA DE APROVAÇÃO

Leonardo Chicaybam Peixoto

“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos de antígeno

(CAR) ativadores e inibitórios”

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Oncologia do

Instituto Nacional de Câncer (INCa), visando à obtenção do título de Mestre em Oncologia

___________________________________________________________________________ Dr. José Andrés Yunes, Centro Infantil de Investigações Hematológicas Dr. Domingos A. Boldrini (Membro Titular da Banca) ___________________________________________________________________________ Dra. Hilda Petrs Silva, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ (Membro Titular da Banca) ___________________________________________________________________________ Dr. Claudio Gustavo Stefanoff, Serviço de Pesquisa Clínica, INCa (Membro Titular da Banca) __________________________________________________________________________________ Dr. João P. B.Viola, Divisão de Biologia Celular, INCa (Suplente) ___________________________________________________________________________ Dra. Cinthya Sternberg, Serviço de Pesquisa Clínica, INCa (Suplente)

vi

AGRADECIMENTOS

- Aos meus pais, Vicente e Maria Emília, por todo o apoio e incentivo que me deram desde o

início. Graças à grande educação que eles me deram, consegui chegar até aqui. Obrigado

também pelo carinho e amor que recebo diariamente.

- Aos meus irmãos, Gustavo e Mariana, que apesar de todos os desentendimentos, são muito

importantes na minha vida.

- À todos os integrantes da família Chicaybam e da família Peixoto, pelas festas animadas e

cheias de comida, pelas viagens ao Sítio, pelas reuniões de domingo, pelas conversas cheias

de besteiras. Em especial, ao meu avô Nacyr Chicaybam, que sempre me incentivou a fazer

medicina, e à Tia Olívia, que sempre me incentivou a fazer biologia. Apesar de não ter feito

nenhum destes cursos, o apoio deles foi essencial para eu achar o meu caminho.

- Ao Martin, meu orientador, por estar sempre presente no laboratório e pronto a nos ajudar.

Obrigado pela enorme paciência, pela dedicação, pelos ensinamentos, pelas piadas engraçadas

e pelas piadas sem graça.

- À Carol, minha companheira de grupo, que após 5 anos de convivência diária, virou

praticamente minha irmã. Agradeço por sua enorme paciência, por aturar minhas manias e

meu jeito implicante, por estar (quase) sempre de bom humor, pelas discussões sobre

experimentos, pelas discussões sobre a vida, por me abrigar em sua casa quando preciso, pelas

festas, pelos bares. Obrigado por tudo.

- Ao MartinLab: Andressa, Bianca, Carol, Luiza, Ana Emília, Jackline e Tonho. Obrigado

pela companhia no laboratório e pela ajuda com experimentos.

vii

- Ao Gui, Rafaela Samico (Samicão), Thaís, Carol, Rômulo Galvani, Haynna e Gabi, grandes

amigos que fiz durante a faculdade. Obrigado pelas viagens, bares, festas, vôlei, conversas

jogadas fora, enfim, por estarem presentes em minha vida.

- Aos amigos de Niterói Leo Jorge, Mateus, Giulia, Leo Navarro, Leo Marafoni, Aline, Gabi,

Diogo, Nino, Tainá, Taiana, pelo companheirismo e apoio de sempre.

- Ao pessoal da MEDEX: Rômulo “Paca” Areal, João Luiz, Ana Paula, Poliana, Rômulo

Galvani, Heitor, Ana Merc, Suelen, Tatiana, Luciana, Aline. Obrigado por tornar o laboratório

um bom lugar de se trabalhar, pela ajuda em experimentos e pelas dúvidas tiradas.

- Ao pessoal da BIOCEL: Bruno Robbs, Flávia, Patrícia, Douglas, André, Giuliana, Renata.

Agradeço pela paciência, pela discussão de experimentos e por toda a ajuda que vocês me

deram.

- À Sueli, Thaís, Andréia e a todos os funcionários do INCa que sempre ajudaram com muita

boa vontade.

- Ao suporte financeiro: FAF/ INCa - Ministério da Saúde, CNPq e FAPERJ que colaboraram

para a execução do trabalho.

viii

RESUMO

O uso da transferência adotiva de linfócitos T para o tratamento do câncer tem sido dificultado

pela baixa persistência e avidez das células infundidas e pela dificuldade de isolar e expandir

linfócitos reativos contra o tumor. Além disso, as células tumorais apresentam diversos

mecanismos de escape, como a diminuição da expressão de MHC de classe I, levando a um

menor reconhecimento do tumor pelos linfócitos. A utilização de receptores quiméricos de

antígeno (CARs) permite evitar alguns desses problemas. Os CARs redirecionam a

especificidade dos linfócitos, reconhecendo o antígeno alvo com alta afinidade e de modo

MHC-independente. Esses receptores são capazes de ativar as células através de domínios

citoplasmáticos de ativação derivados de moléculas como CD3ζ ou 4-1BB, por exemplo. No

contexto da leucemia linfóide aguda de precursores B (BCP-ALL), linfócitos redirecionados

contra a proteína CD19 poderiam ser usados clinicamente, visto que os blastos leucêmicos

expressam este antígeno. No entanto, como o CD19 é expresso por toda a linhagem B, isto

poderia acarretar efeitos colaterais como a depleção de células B maduras. Como as células B

maduras expressam CD19 e CD20, nós propomos a criação de um CAR inibitório que

reconheça o antígeno CD20, permitindo que o sistema discrimine entre os blastos leucêmicos

e as células B maduras, resultando na eliminação apenas da neoplasia. Como um sistema

repórter de ativação para testar nossa hipótese, células da linhagem Jurkat expressando o

plasmídeo pGL4.30 – que expressa a proteína luciferase sobre o controle de um promotor

responsivo a NFAT – foram geradas. Como células alvo nós utilizamos a linhagem K562

modificada para expressar CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) ou CD19 e CD20 (K5-DUPLA).

Três diferentes CARs inibitórios anti-CD20 foram construídos por SOE-PCR, contendo

domínios de sinalização dos receptores inibitórios CTLA-4, PD-1 ou BTLA. Células Jurkat

ix

expressando o CAR de ativação 19BBz apresentaram alta atividade de luciferase quando co-

cultivadas com K5-19 ou K5-DUPLA. No entanto, células Jurkat expressando o CAR de

ativação 19BBz e um CAR de inibição apresentaram uma grande redução na atividade de

luciferase quando foram co-cultivadas com a K5-DUPLA, enquanto mantiveram alta atividade

quando co-cultivada com a linhagem K5-19. Além disso, os receptores contendo o domínio de

sinalização de CTLA4, PD-1 ou BTLA induzem também uma diminuição significativa do

marcador de ativação CD69 em células ativadas após interação com as linhagens alvo. Para

validar estes resultados in vivo nós estabelecemos um modelo de melanoma utilizando a

linhagem B16F10 expressando os antígenos alvo CD19 e/ou CD20. Para aumentar a

persistência e função das células infundidas tratamos os camundongos com tumores

estabelecidos com 100mg/kg de ciclofosfamida. Este tratamento resultou em uma profunda

linfopenia e depleção de células T reguladoras, podendo ser usado em conjunto com a

transferência de linfócitos T. Com isso, podemos concluir que o sistema repórter de ativação

utilizando a linhagem Jurkat foi estabelecido e foi capaz de mostrar a funcionalidade dos

CARs de ativação e inibição. A diminuição da molécula CD69 em células Jurkat ativadas

sugere que os CARs inibitórios são funcionais. Como perspectivas, iremos transduzir células

T primárias murinas, permitindo a validação dos CARs ativadores/inibitórios in vitro

(secreção de citocinas, atividade citotóxica) e in vivo (modelo B16F10).

x

ABSTRACT

Use of adoptive transfer of T lymphocytes for cancer treatment has been hampered by low

avidity and persistence of the infused cells and the difficulty of isolating and expanding

reactive lymphocytes against the tumor. Moreover, tumor cells have several escape

mechanisms, such as decreased expression of MHC class I, leading to diminished tumor

recognition by lymphocytes. The use of chimeric antigen receptors (CARs) avoids some of

these problems. The CARs redirect the specificity of lymphocytes, recognizing the target

antigen with high affinity and in a MHC-independent fashion. These receptors are capable of

activating cells through cytoplasmatic domains derived from molecules such as CD3zeta or 4-

1BB, for example. In the context of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-

ALL), lymphocytes redirected against the CD19 protein could be used clinically, as the

leukemic blasts express this antigen. However, as CD19 is expressed throughout the B

lineage, this could induce side effects such as depletion of mature B cells. Because mature B

cells express CD19 and CD20, we propose the creation of an inhibitory CAR that recognizes

the CD20 antigen, allowing the system to discriminate between leukemic blasts and mature B

cells, resulting in the elimination of only the tumor cells. As an activation reporter system to

test our hypothesis, Jurkat cell line expressing plasmid pGL4.30 - which expresses the

luciferase protein under the control of a NFAT responsive promoter - were generated. As

target cells we used the K562 cells modified to express CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) or

CD19 and CD20 (K5-DUPLA). Three different inhibitory CARs anti-CD20 were constructed

by SOE-PCR, containing the signaling domains of the inhibitory receptors CTLA-4, PD-1 or

BTLA. Jurkat cells expressing activating CAR 19BBz showed high luciferase activity when

co-cultured with K5-19 or K5-DUPLA. However, Jurkat cells expressing 19BBz CAR and

xi

one of the inhibitory CARs showed a large reduction in luciferase activity when they were co-

cultured with the K5-DUPLA, while maintaining high activity when co-cultured with the K5-

19 target. Furthermore, receptors containing the signaling domain of CTLA4, PD-1 or BTLA

also induced a significant decrease in the activation marker CD69 on activated cells after

interaction with the target cell lines. To validate these findings in vivo we established a model

using the melanoma cell line B16F10 expressing the target antigens CD19 and / or CD20. To

increase the persistence and function of the infused cells mice with established tumors were

treated with 100mg/kg of cyclophosphamide. This treatment resulted in a profound

lymphopenia and depletion of regulatory T cells, which can be used in conjunction with the

transfer of T lymphocytes. We can conclude that the activation reporter system using Jurkat

was established and was able to show the functionality of activating and inhibitory CARs. The

decrease of CD69 molecule on activated Jurkat cells suggests that the inhibitory CARs are

functional. As perspective, we will transduce primary murine T cells, allowing the validation

of activating / inhibitory CARs in vitro (cytokine secretion, cytotoxic activity) and in vivo

(B16F10 model).

xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (antibody-dependent

cellular citotoxicity)

AICD Morte celular induzida por ativação (activation induced cell death)

AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida (acquired immunodeficiency

syndrome)

APC Célula apresentadora de antígeno (antigen presenting cell)

BCR Receptor de célula B (B cell receptor)

CAR Receptor quimérico de antígeno (chimeric antigen receptor)

CD Cluster designation

CDC Citotoxicidade dependente de complemento (complement-dependent

cytotoxicity)

CDR Região determinante de complementariedade (complementarity

determining regions)

CLP Progenitor linfóide comum (common lymphoid progenitor)

CMP Progenitor mielóide comum (common myeloid progenitor)

CsA Ciclosporina A

DC Célula dendrítica (dendritic cell)

DECH Doença enxerto contra hospedeiro

DLI Infusão de linfócitos do doador (donor lymphocyte infusion)

DNA Ácido desoxirribonucléico

EAE Encefalomielite autoimune experimental

xiii

EBV Vírus Epstein-Barr

ECL Enxerto contra a leucemia

GFP Proteína verde fluorescente (green fluorescent protein)

HIV Vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus)

HLA Antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen)

HPV Vírus do papiloma humano (human papilloma virus)

HSC Célula tronco hematopoiética (hematopoietic stem cell)

IFN Interferon

IRES Sítio interno de entrada do ribossomo (internal ribosome entry site)

ITAM Motivos ativadores baseados em tirosina dos imunoreceptores

(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)

ITIM Motivos inibitórios baseados em tirosina dos imunoreceptores

(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)

ITSM Motivos de troca baseados em tirosina dos imunoreceptores

(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)

LLA Leucemia linfóide aguda

LMC Leucemia mielóide crônica

mHAgs Antígenos de histocompatibilidade menor (minor histocompatibility

antigens)

MHC Complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility

complex)

MLV Vírus da leucemia murina Moloney (Moloney murine leukemia virus)

MOI Multiplicity of infection

xiv

NK Assassino natural (natural killer)

PBMC Célula mononuclear de sangue periférico (peripheral blood mononuclear

cell)

PBS Salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline)

PCR Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)

PMA Forbol miristato acetato (phorbol miristate acetate)

RNA Ácido ribonucléico

RT Transcrição reversa (reverse transcription)

scFv Fragmento variável de cadeia única (single chain variable fragment)

SOE Splicing by overlapping extension

TAA Antígeno associado ao tumor (tumor-associated antigen)

TCR Receptor de célula T (T cell receptor)

TIL Linfócito infiltrante do tumor (tumor-infiltranting lymphocyte)

TNF Fator de necrose tumoral (tumor necrosis factor)

TPH Transplante de precursores hematopoiéticos

TSA Antígeno específico do tumor (tumor-specific antigen)

xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Taxas de recaída após TMO alogênico e singênico.

4

Figura 2 – Anticorpos.

6

Figura 3 – Gráfico ilustrando a evolução das taxas de respostas objetivas em pacientes

com melanoma metastático após tratamento com imunoterapias.

15

Figura 4 – Desenho esquemático representando a estrutura padrão do receptor

quimérico.

19

Figura 5 – Esquema simplificado da sinalização iniciada pelo complexo TCR-CD3.

21

Figura 6 – Esquema mostrando os receptores da família CD28 e TNF.

24

Figura 7 – Esquema ilustrando as principais vias ativadas por CD28.

25

Figura 8 – Esquema apresentando os principais efeitos da estimulação via 4-1BB.

27

Figura 9 – Esquema da ontogenia da linhagem B, apresentando os principais

marcadores.

30

Figura 10 – Representação esquemática dos mecanismos de ação dos receptores

inibitórios da família CD28.

34

xvi

Figura 11 – Esquema demonstrando o princípio da eventual terapia utilizando o

sistema de CARs ativadores / inibitórios.

37

Figura 12 – Ensaio de luciferase, comprovando a funcionalidade do sistema repórter de

ativação e do receptor quimérico.

38

Figura 13 – Esquema mostrando os CARs inibitórios previamente construídos e

clonados no vetor pCR2.1.

39

Figura 14 – Clonagem dos CARs inibitórios.

48

Figura 15 - Avaliação da expressão dos CARs inibitórios após transdução com vetor

retroviral e duas semanas de seleção com G418/puromicina.

50

Figura 16 - Avaliação da expressão dos CARs inibitórios na Jurkat por western blot

utilizando o anticorpo ααααFab-biotina/estreptavidina-HRP.

51

Figura 17 – Resultado do ensaio de luciferase, demonstrando a capacidade dos CARs

inibitórios de inibir a translocação de NFAT para o núcleo.

53

Figura 18 – Avaliação da expressão do marcador de ativação CD69 após 24 horas de

incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina (P+I).

54

Figura 19 – Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A, como

esquematizado no painel A.

57

xvii

Figura 20 – Análise de citometria de fluxo das células Jurkat transduzidas com os

vetores lentivirais EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 PURO (A) ou EF1αααα-20z-2A-1941BB GFP

(B).

58

Figura 21 – Ensaio de luciferase para validação do sistema de expressão baseado no

peptídeo 2A.

59

Figura 22 – Análise da expressão de CD19 e CD20 na linhagem B16F10 após

transdução e purificação por sorting.

60

Figura 23 - Cinética de crescimento tumoral das linhagens B16 CD20 (A) e B16 CD19

(B) injetadas por via subcutânea.

61

Figura 24 - Marcação das linhagens B16-CD19 (A) e B16-CD20 (B) após passagem in

vivo.

61

Figura 25 - Avaliação da linfopenia (A) e percentual de células T reguladoras (Treg) (B)

após administração de ciclofosfamida a animais com tumores estabelecidos.

63

Figura 26 - Efeito da ciclofosfamida sobre o crescimento do tumor. 63

xviii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 Tratamento atual de Câncer 1

1.2 Imunoterapia 2

1.3 Transplante de precursores hematopoiéticos 3

1.4 Anticorpos Monoclonais 5

1.5 Transferência adotiva de células T 6

1.5.1 Importância das subpopulações infundidas 8

1.5.2 Indução de linfopenia 10

1.5.3 Abordagens para a geração de linfócitos anti-tumorais 11

1.6 Padrão de expressão de antígenos tumorais 15

1.7 Receptor de antígeno quimérico (CAR) 17

1.7.1 Domínio Extracelular 19

1.7.2 Domínio Intracelular 20

1.7.3 Testes Clínicos 28

1.8 Leucemia Linfóide Aguda – B (LLA-B) 30

1.9 Importância da resposta condicional 32

2. OBJETIVOS 40

2.1 Objetivo geral 40

2.2 Objetivos específicos 40

3. MATERIAIS E MÉTODOS 41

3.1 Plasmídeos 41

xix

3.2 Cultura de células 42

3.3 Produção de vetores virais 42

3.4 Citometria de Fluxo 43

3.5 Titulação dos vetores virais 43

3.6 Transdução e purificação das linhagens 44

3.7 Ensaio de luciferase 44

3.8 Avaliação do marcador de ativação CD69 45

3.9 Western blot 45

3.10 Modelo in vivo de melanoma 45

4. RESULTADOS 47

4.1 Clonagem dos CARs nos vetores retrovirais 47

4.2 Transdução e seleção da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs

ativadores e inibitórios

48

4.3 Validação funcional dos CARs - ensaio de luciferase 51

4.4 Validação funcional dos CARs - marcador de ativação linfocitário

CD69

53

4.5 Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A 54

4.6 Validação do vetor lentiviral EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 57

4.7 Transdução da linhagem B16F10 59

4.8 Estabelecimento do modelo in vivo 60

5. DISCUSSÃO 64

6. CONCLUSÕES 69

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Tratamento atual de Câncer:

Segundo as estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCa), em 2011

ocorrerão mais de 400.000 novos casos de câncer no Brasil. Esta doença é decorrente de

um processo de transformação, ou tumorigênese, das células normais de um indivíduo.

Estas células transformadas adquirem vantagens seletivas sobre as células normais

através de uma série de eventos genéticos e epigenéticos que incluem mutações no

DNA, mudanças na expressão de genes e, em muitos casos, perda de quantidade

significativa de material genético. De modo geral, as células cancerosas possuem

capacidade de proliferação ilimitada e de evadir os mecanismos de apoptose, além de

serem insensíveis aos sinais anti-proliferativos fisiológicos (Hanahan, 2000).

Os tratamentos atuais para os diversos tipos de câncer baseiam-se

principalmente em cirurgia, radioterapia e quimioterapia, terapias pouco específicas e

que acarretam efeitos colaterais graves para o paciente. Além disso, as taxas de cura

alcançadas com estes tratamentos são muito variáveis. Mais recentemente, o

desenvolvimento de áreas como biologia molecular e bioquímica estrutural permitiu a

elucidação de diversas vias importantes para o processo oncogênico. Isto possibilitou o

desenvolvimento racional de drogas, como os inibidores de tirosina cinases, desenhadas

para se ligarem especificamente em determinada molécula e inibir a sua atividade. Essas

drogas são capazes de induzir regressões tumorais significativas em pacientes com

leucemia mielóide crônica (LMC) e câncer de pulmão, por exemplo. No entanto, a

maioria dos pacientes eventualmente desenvolve resistência, causada pela amplificação

do gene da proteína cinase ou pela seleção de um clone que possui mutações

secundárias na proteína alvo, sendo uma terapia incapaz de curar a doença.

2

Nos últimos anos o grande avanço na compreensão da biologia do câncer

permitiu o desenvolvimento de novas drogas e novos regimes de tratamento, além de

proporcionar melhorias no diagnóstico. Ainda assim, com as terapias atuais empregadas

na clínica, 30% a 40% dos pacientes morrem da doença. Com isso torna-se evidente a

necessidade do desenvolvimento de novas terapias, de preferência direcionadas

especificamente contra o tumor, visando a diminuição dos efeitos colaterais e o aumento

da taxa de sobrevivência e da qualidade de vida do paciente.

1.2 Imunoterapia:

Recentemente, muitos trabalhos experimentais e clínicos vêm explorando o

potencial da imunoterapia para o tratamento de diversos tipos de câncer. Esta

modalidade se baseia na utilização de componentes do sistema imune para atacar o

tumor e assim controlar a doença. A maior incidência de leucemias, linfomas e

sarcomas em pacientes com imunodeficiências (AIDS, por exemplo) demonstra a

capacidade do sistema imune de retardar ou até mesmo evitar o surgimento de

neoplasias (Goedert, 2000), propriedade conhecida como imunovigilância. De fato, os

tumores induzem uma resposta imunológica, que pode ser atestada pela presença no

plasma de anticorpos contra antígenos associados ao tumor e pela presença de linfócitos

T direcionados contra células tumorais. Essas e outras evidências impulsionaram o

desenvolvimento de várias abordagens em imunoterapia utilizando-se citocinas,

anticorpos monoclonais e componentes celulares como linfócitos T, NK e células

dendríticas.

3

1.3 Transplante de precursores hematopoiéticos:

O transplante de precursores hematopoiéticos (TPH) alogênico foi desenvolvido

há mais de 35 anos com o objetivo de impedir a falência da medula óssea causada pela

quimioterapia e radioterapia. Este procedimento é amplamente utilizado no tratamento

de malignidades hematológicas, sendo atualmente a única terapia curativa para doenças

como a leucemia mielóide crônica (LMC). Inicialmente acreditava-se que o regime de

condicionamento mieloablativo era o principal responsável pela eliminação dos clones

leucêmicos e que o transplante de células tronco hematopoiéticas do doador apenas

recuperava a função da medula óssea (Appelbaum, 2001). No entanto, ainda em 1956,

foi observado por Barnes e cols. que as células leucêmicas de camundongos irradiados

eram eliminadas quando estes recebiam transplantes alogênicos, mas não singênicos. O

mesmo foi comprovado anos mais tarde em humanos, onde pacientes que recebiam

transplante alogênico (porém HLA-compatível) tinham uma menor probabilidade de

recidivas do que pacientes que receberam a medula de um irmão gêmeo. Essa

conseqüência do transplante alogênico foi chamada de efeito enxerto contra a leucemia

(ECL). No contexto do TPH alogênico HLA-compatível, as proteínas das células do

paciente e do doador apresentam diferenças devido a polimorfismos genéticos. Essas

proteínas polimórficas também são processadas e apresentadas como antígenos

(chamados antígenos minoritários de histocompatibilidade – mHAgs). Sendo assim as

células T presentes no enxerto, que não são tolerizadas contra esses peptídeos,

reconhecem esse complexo peptídeo-HLA diferente e se tornam ativadas, exercendo sua

atividade efetora. Quando esses antígenos são expressos pelos clones leucêmicos, são

alvos do reconhecimento que resulta no efeito ECL (Bleakley, 2004). No entanto, outros

tecidos do paciente também podem expressar os mesmos antígenos minoritários, ou

4

ainda um conjunto diferente de mHAgs, como a pele, trato gastrointestinal e o fígado,

sendo este alo-reconhecimento fundamental para o estabelecimento da doença enxerto

contra o hospedeiro (DECH). Estudos posteriores demonstraram que pacientes que

desenvolvem DECH tem uma menor chance de recidiva da doença, o que evidencia o

compartilhamento da expressão dos mHAgs entre o tecido normal e a leucemia

(Horowitz, 1990) (Figura 1).

Figura 1: Taxas de recaída após TMO alogênico e singênico. As menores taxas são encontradas em pacientes que desenvolveram DECH aguda e crônica e as maiores em pacientes que receberam medula depletada de linfócitos T ou de irmãos gêmeos. Adaptado de Appelbaum, 2001.

Outra evidência do importante papel que o efeito ECL tem na eliminação da

leucemia é a utilização de infusões de linfócitos do doador (DLI) para o tratamento de

pacientes que sofreram recidivas da LMC após o TPH alogênico. Este tratamento é

capaz de induzir uma nova remissão completa em aproximadamente 70% dos pacientes,

sendo menor que 20% a probabilidade de uma nova recidiva em 3 anos (Kolb, 1995)

quando a nova remissão é alcançada.

5

1.4 Anticorpos Monoclonais:

Em 1975, Kohler e Milstein desenvolveram a tecnologia do hibridoma, tornando

possível a produção de anticorpos com especificidade conhecida em larga escala. Com

isso, foi proposta a utilização de anticorpos no tratamento de câncer, direcionados

contra proteínas-chave na progressão tumoral e geralmente superexpressas pelo tumor.

No entanto, em testes clínicos iniciais os pacientes desenvolveram uma resposta

humoral contra os anticorpos infundidos, apesar da resposta antitumoral que foi

observada (Miller, 1982). Este fato ocorreu devido à origem murina destes anticorpos, o

que limitou o número de doses tolerado pelos pacientes.

Esses obstáculos foram superados com a geração de anticorpos monoclonais

quiméricos (estrutura da IgG humana com as regiões variáveis derivadas de

camundongo) e humanizados (estrutura da IgG humana com as regiões determinantes

de complementariedade – CDRs – de camundongo) (Figura 2). Os mecanismos de ação

destas moléculas estão relacionados com o isotipo de IgG. Anticorpos com a estrutura

de IgG1 são capazes de induzir citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) e

citotoxicidade dependente de complemento (CDC), induzindo diretamente a morte das

células tumorais. Outros isotipos, como IgG2, são utilizados quando o anticorpo atua

através de suas propriedades de ligação ao antígeno. Como muitos alvos são receptores

de fatores de crescimento, essas moléculas agem bloqueando fisicamente a interação

entre o ligante e o receptor ou impedindo a mudança de conformação necessária para a

dimerização e sinalização (Adams, 2005).

6

Figura 2: Anticorpos. Esquema comparando a estrutura dos anticorpos utilizados na clínica (quiméricos e humanizados) com os murinos e humanos.

Diversos anticorpos já estão sendo regularmente utilizados em clínica, alguns

com resultados promissores. O primeiro a ter seu uso aprovado foi o Rituximab,

anticorpo anti-CD20 utilizado no tratamento de linfomas não Hodgkin de células B,

onde cerca de 50% dos pacientes apresentam resposta significativa (McLaughlin, 1998).

Os efeitos adversos desta terapia estão associados à ligação do anticorpo na molécula

alvo. O tratamento com Rituximab pode causar toxicidade relacionada à rápida lise de

células CD20+ normais e tumorais, especialmente na primeira dose.

1.5 Transferência adotiva de células T:

Os linfócitos T são pertencentes ao sistema imune adaptativo, sendo os efetores

da imunidade celular. A geração destas células tem início na medula óssea, através do

processo de hematopoiese. Durante este processo, a célula tronco hematopoiética gera

7

dois precursores que vão dar origem à linhagem mielóide ou linfóide: o progenitor

mielóide comum (CMP) e o progenitor linfóide comum (CLP). O CLP por sua vez gera

precursores comprometidos com a diferenciação de linfócitos T, que migram para o

timo, gerando as células T maduras. Durante a passagem pelo timo o receptor da célula

T (TCR) sofre rearranjos, gerando a diversidade necessária para o reconhecimento de

praticamente qualquer antígeno. Além disso, este repertório recém formado é moldado

pelos mecanismos de seleção positiva e negativa, que vão eliminar as células com alta

capacidade de reconhecer o antígeno e também as incapazes de reconhecê-lo.

As células T maduras se dividem em duas grandes subpopulações: os linfócitos

CD8+ e CD4+. Os linfócitos CD8+ são células com função citotóxica, sendo

diretamente responsáveis pela eliminação da célula alvo através da liberação de

perforinas e granzimas. Estes linfócitos, após encontro com o antígeno, podem gerar

duas populações de células de memória capazes de responder rapidamente ao re-

estímulo. Os linfócitos de memória central são definidos pela presença na membrana

das moléculas CD45RO, CD62L e CCR7 e, apesar de possuírem uma grande

capacidade de proliferação e migração para o linfonodo, não possuem capacidade

efetora imediata. Os linfócitos de memória efetora são CD45RO+ e negativos para

CD62L e CCR7. Apresentam atividade efetora imediata, mas pouca capacidade de

proliferação.

Os linfócitos CD4+, após reconhecimento do antígeno e ativação, produzem

citocinas que são capazes de modular atividade de outras células, como linfócitos

CD8+, macrófagos e células B. Estas células podem se diferenciar em quatro

populações com funções diferentes. A população Th1 produz citocinas como IFN-γ, IL-

2 e TNF-α, tendo um papel crucial na resposta contra vírus e patógenos intracelulares,

além de aumentar a função das células CD8+. A população Th2 está envolvida em

8

processos de alergia, ativação de eosinófilos e células B através da produção de

citocinas como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. A população Th17 é caracterizada pela

produção de altos níveis de IL17A e IL17F, além de IL-9 e IL-21. Esta população está

envolvida na defesa contra organismos extracelulares, respostas autoimunes e

recrutamento de neutrófilos para os sítios de inflamação. Já as células T reguladoras

(Treg) estão envolvidas na regulação e supressão de linfócitos através da produção de

ctiocinas como IL-10 e TGF-β.

A transferência adotiva de células T consiste na infusão de vários subtipos de

linfócitos T maduros com o objetivo de eliminar o tumor e impedir recidivas da doença.

Clones de linfócitos T CD4+ e CD8+ específicos contra o tumor podem ser gerados ou

expandidos in vitro ou isolados do paciente e, após expansão para atingir o número de

células necessário para a terapia, são re-infundidos. Os estudos pré-clínicos e clínicos

definiram diversos parâmetros importantes para a eficácia deste tipo de terapia, assim

como diferentes abordagens de tratamento.

1.5.1 Importância das subpopulações infundidas:

Linfócitos T CD8+ citotóxicos têm um importante papel na defesa do

organismo, atuando contra patógenos como vírus, bactérias e parasitas. Estudos

realizados na década de 90 demonstraram que estas células também possuem a

capacidade de induzir regressão de tumores em modelos animais, sendo que o número

de células infundidas está diretamente correlacionado com o sucesso do tratamento

(Melief, 1995; Dudley, 2003). Outro parâmetro importante é o grau de diferenciação das

células infundidas. Células que apresentam um perfil menos diferenciado, com

9

marcadores de membrana da subpopulação de linfócitos T CD8+ de memória central,

são muito mais eficazes na eliminação do tumor (Gattinoni, 2005; Klebanoff, 2005).

Essa subpopulação possui uma capacidade proliferativa mais alta e é menos propensa à

apoptose devido à menor expressão de moléculas pró-apoptóticas como BID e BAD.

Além disso, as células desta sub-população expressam a molécula CD62L, importante

na migração para o linfonodo, e são capazes de responder melhor a citocinas como IL-7,

devido à alta expressão da cadeia alfa do receptor desta citocina (IL7Rα). No entanto,

estudos recentes conseguiram gerar in vitro, através da manipulação farmacológica da

via de sinalização de Wnt, células T CD8+ de memória com características de células

tronco. Para isso os autores inibiram a cinase Gsk-3β, levando a um acúmulo de β-

catenina no núcleo e conseqüentemente ativação da via. Estas células, quando

transferidas para outro animal, apresentaram capacidade de gerar todas as

subpopulações de linfócitos CD8+, além de expressarem marcadores característicos de

célula tronco como Sca1 e Bcl2. Também apresentaram um efeito antitumoral muito

maior, sendo necessária a infusão de apenas 5x104 células para induzir regressão

tumoral em todos os animais analisados (Gattinoni, 2009).

Apesar dos linfócitos CD8+ formarem a base do tratamento de transferência

adotiva, muitos estudos indicam que os problemas associados a esta terapia (baixa

persistência das células infundidas, baixo efeito antitumoral) podem ser contornados

através da co-infusão de células CD4+. As células CD4+ são essenciais para a geração

de células CD8+ de memória (Shedlock, 2003; Sun, 2003) e para sua correta função

(Bourgeois, 2002). Também são capazes de inibir a exaustão funcional dos linfócitos

citotóxicos e aumentar a infiltração nos tumores (Hunziker, 2002; Giuntoli, 2002). A

diversidade genética do HLA de classe II em qualquer população de pacientes é bem

maior quando comparada ao HLA de classe I, tornando a identificação de epítopos e

10

TCRs para a sub-população CD4+ mais complexa. Além disso, a expansão destas

células em cultura é mais difícil e existem poucos modelos animais que mimetizem o

uso destas células (Muranski, 2009). No entanto, um estudo recente comparou as

diferentes subpopulações (Th0, Th1 e Th17) de células T CD4+ TCR-transgênicas

reconhecendo o antígeno TRP-1 expresso por células próprias e tumorais em um

modelo de melanoma subcutâneo (B16F10). Neste modelo, as células Th17

apresentaram um efeito antitumoral superior às células Th1, sendo este efeito altamente

dependente de IFN-γ (Muranski, 2008). No único caso reportado na literatura, a

transferência para um paciente de melanoma de um clone de linfócitos CD4

reconhecendo o antígeno NY-ESO-1, sem regime de condicionamento para indução de

linfopenia ou administração de IL-2 exógena, induziu a regressão completa do tumor,

com o paciente permanecendo livre de doença por dois anos (Hunder, 2008).

1.5.2 Indução de linfopenia:

Estudos demonstraram que o uso de radioterapia ou quimiterapia antes da

transferência dos linfócitos T pode aumentar a persistência e a atividade antitumoral

destas células (North, 1982). As doses utilizadas para esta finalidade constituem um

regime não mieloablativo, induzindo uma severa, mas transiente, leucopenia sem dano

permanente às células tronco hematopoiéticas, permitindo assim uma recuperação

espontânea da hematopoiese do hospedeiro. Este efeito benéfico é, ao menos em parte,

dependente da depleção de células com características inibidoras, como linfócitos T

reguladores e células mielóides supressoras, além de propiciar uma menor competição

por citocinas como IL-7 e IL-15 (Gattinoni, 2005) e infiltração do tumor (Bracci, 2007).

11

Os quimioterápicos e a radiação também induzem efeitos específicos sobre os tumores,

modulando o repertório de antígenos expressos, a expressão de HLA de classe I e o tipo

de morte celular induzida, conseqüentemente aumentando o reconhecimento pelos

linfócitos infundidos (Reits, 2006; Gasser, 2005).

1.5.3 Abordagens para a geração de linfócitos anti-tumorais:

Os resultados positivos obtidos nos modelos pré-clínicos impulsionaram a

realização de diversos testes envolvendo humanos. A aplicação clínica que obteve mais

sucesso foi o tratamento de pacientes infectados pelo vírus Epstein-Barr (EBV). A

maioria dos adultos saudáveis possui uma infecção persistente, mas assintomática, de

EBV, mantida sobre controle pelo sistema imunológico. No entanto, pacientes

imunosuprimidos após o TPH têm um risco maior de desenvolver doença

linfoproliferativa ou linfoma associado ao EBV. Como esses tumores expressam

constantemente antígenos virais, são altamente suscetíveis ao reconhecimento pelos

linfócitos T. Com isso, protocolos foram desenvolvidos nos quais os linfócitos do

sangue periférico do doador são repetidamente estimulados in vitro com células B

infectadas por EBV, gerando uma população enriquecida em células anti-EBV que,

após sua expansão, é infundida no paciente. Em um estudo piloto, nenhum paciente que

foi tratado com estas células desenvolveu linfoma relacionado ao EBV, quando a taxa

de doenças esperada era de 25%, demonstrando ser um tratamento profilático efetivo e

com potente atividade antiviral (Rooney, 1998).

Diversas abordagens para aperfeiçoar a geração e seleção de células antígeno-

específicas foram testadas em modelos experimentais e em pacientes. A identificação de

antígenos associados ao tumor (Novellino, 2005), principalmente ao melanoma,

12

possibilitou o desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro utilizando células

dendríticas (DCs), APCs profissionais que expressam altos níveis de moléculas

coestimulatórias e que são capazes de induzir ativação e proliferação de linfócitos T

CD4 e CD8. Nestes sistemas as DCs são co-incubadas com o peptídeo derivado do

antígeno tumoral ou com lisados de células tumorais e depois são utilizadas para

estimular linfócitos do sangue periférico dos pacientes. Os linfócitos específicos contra

os antígenos apresentados são preferencialmente ativados e expandidos, e depois

infundidos no paciente.

Em um estudo de fase 1 para tratamento de melanoma metastático avançado,

DCs pulsadas com um peptídeo derivado do antígeno Melan-A foram utilizadas para a

geração dos linfócitos CD8 (Mackensen, 2006). Onze pacientes foram tratados com

múltiplas infusões, com três apresentando resposta antitumoral (uma regressão

completa, uma regressão parcial e uma resposta mista). O tratamento demonstrou-se

seguro e foi bem tolerado, com migração dos linfócitos infundidos para os sítios

tumorais e alta freqüência de células CD8 Melan-A específicas no sangue dos pacientes

após dois dias da infusão (média de 0,67% do total de linfócitos CD8). No entanto, após

duas semanas da infusão a freqüência destas células se mostrou muito baixa e, em dois

pacientes avaliados, uma perda seletiva do antígeno alvo nas metástases do linfonodo

foi observada. Este protocolo apresentou também dificuldade de produzir o grande

número de DCs necessário para a expansão dos linfócitos.

Outra abordagem para gerar linfócitos específicos contra o tumor envolve a

seleção de clones diretamente dos pacientes. Linfócitos do sangue periférico de

pacientes previamente imunizados com o peptídeo alvo são isolados e passam por um

primeiro ciclo de expansão. Após este ciclo, por meio de diluição limitante, os linfócitos

13

são clonados e expandidos através de estimulação com células mononucleares de

sangue periférico (PBMCs) e IL-2. Alternativamente, os clones são gerados a partir de

linfócitos infiltrantes do tumor (TILs) isolados de biopsia. Nos testes clínicos

utilizando-se esta abordagem para o tratamento de melanoma metastático, cada paciente

foi infundido com apenas um clone, que foi selecionado com base nos níveis de IFN-γ e

IL-2 liberados após estimulação in vitro com o peptídeo ou linhagens celulares de

melanoma. Respostas objetivas não foram observadas em pacientes imunocompetentes

e imunossuprimidos, mesmo quando os clones foram transferidos para pacientes

tratados com IL-2, e, na maioria dos pacientes, as células transferidas não persistiram

por mais de uma semana (Dudley, 2001; Dudley, 2002; Yee, 2002). Diversos fatores

podem explicar a falta de persistência e a relativa ineficácia da terapia utilizando-se

linfócitos clonados ou gerados com o auxílio de DCs, incluindo a necessidade de

linfócitos CD4 antígeno-específicos na infusão, exaustão proliferativa e/ou

diferenciação terminal durante o processo de expansão ou seleção in vivo de variantes

negativas para o antígeno alvo.

Um método muito eficiente para a geração de linfócitos específicos contra o

tumor foi desenvolvido utilizando-se um modelo murino de sarcoma. Linfócitos

infiltrantes do tumor (TILs) foram isolados e cultivados em altas doses de IL-2 e

apresentaram atividade lítica específica contra células tumorais murinas in vitro. Além

disso, essas células também foram capazes de mediar regressão do tumor quando

transferidas para camundongos com sarcoma (Rosenberg, 1986). Testes com células

humanas foram então realizados e culturas de TILs puderam ser geradas de pacientes

com melanoma, carcinoma renal, carcinoma de cólon, glioma e câncer de mama. O uso

de TILs se mostrou mais eficaz para o tratamento de melanoma, provavelmente porque

14

as culturas de TIL de outros tipos de neoplasia raramente produzem linfócitos capazes

de reconhecer e lisar o tumor (Joncker, 2006).

As culturas de TIL geradas a partir das biopsias de pacientes com melanoma

apresentaram alta atividade lítica, padrão oligoclonal e geralmente continham células

CD4 e CD8. O protocolo de expansão consiste em estimulação com anti-CD3, IL-2 e

PBMCs HLA-compatíveis, onde melhorias recentes nos métodos de cultura resultaram

na geração de TILs em 78% dos pacientes com melanoma. Em um teste clínico, 34%

dos pacientes imunocompetentes tratados com TIL e altas doses de IL-2 apresentaram

respostas clínicas objetivas. No entanto, a maioria das respostas observadas foi

transiente, tendo sido observada uma persistência limitada das células transferidas

(Rosenberg, 1994).

Testes clínicos recentes, impulsionados pela evidência em modelos pré-clínicos,

utilizaram a infusão de culturas de TIL e o tratamento com altas doses de IL-2 após um

regime de condicionamento (quimioterapia) não mieloablativo, mas que induz

linfodepleção. Outra modificação do protocolo foi a seleção dos TILs infundidos, onde

a liberação de IFN-γ após estímulo com o tumor autólogo atuou como parâmetro de

seleção de culturas responsivas. Este tratamento foi capaz de induzir uma resposta

clínica em 18 de 35 pacientes tratados (51%), sendo 3 respostas completas e 15

respostas parciais, com duração média de 11 meses (Dudley, 2005). As células

infundidas foram capazes de enxertar e proliferar, e 4 de 5 pacientes analisados

apresentaram alta persistência dos TILs meses após a transferência. Estudos do mesmo

grupo demonstraram que a persistência das células é crucial para o sucesso da terapia

(Robbins, 2004), e que esta característica está associada ao comprimento dos telômeros

(Zhou, 2005) e à expressão de altos níveis de CD28 (Huang, 2005). No entanto, 17

pacientes apresentaram reação autoimune contra os melanócitos (vitiligo, uveíte),

15

demonstrando que o melanoma compartilha diversos antígenos reconhecidos pelos TILs

com as células normais. Em outro teste clínico do mesmo grupo, um regime de

condicionamento mais intenso foi testado, combinando quimioterapia e radioterapia.

Com isso, a taxa de respostas objetivas chegou a 72%, constituindo atualmente o melhor

tratamento para pacientes com melanoma (Dudley, 2008) (figura 3).

Figura 3: Gráfico ilustrando a evolução das taxas de respostas objetivas em pacientes com melanoma metastático após tratamento com imunoterapias. ACT = transferência adotiva de linfócitos; NMA = regime não mieloablativo; TBI= irradiação de corpo total. Adaptado de Rosenberg, 2009.

1.6 Padrão de expressão de antígenos tumorais:

O sistema imune mantém um diverso repertório de células T com alta avidez

para um antígeno externo, enquanto limita a atividade de células que reconhecem

antígenos próprios. Sendo assim, os antígenos tumorais podem ser divididos em duas

categorias básicas, antígenos específicos do tumor (TSA) e antígenos associados ao

tumor (TAA). TSAs são geralmente imunogênicos visto que são derivados de vírus

associados a tumores humanos, como o EBV e o HPV. A ocorrência aumentada de

16

tumores induzidos por vírus em pacientes imunocomprometidos sugere que a expressão

destes antígenos pelas células transformadas promove uma resposta antitumoral,

atuando como alvos em terapias profiláticas para EBV já aplicadas em clínica.

Outra classe de TSAs são os antígenos únicos, resultado de mutações somáticas

ocorridas durante o processo de tumorigênese (Parmiani, 2007). Muitas destas mutações

ocorrem em genes cruciais para o fenótipo maligno, como RAS ou CDK4, sendo alvos

atrativos para a imunoterapia, pois seriam resistentes à seleção de variantes. No entanto,

enquanto algumas mutações são encontradas em vários tumores, freqüentemente elas

são unicamente encontradas nos tumores na qual elas foram identificadas, e novas

mutações podem ser geradas durante a progressão da doença. Com isso, a aplicação

clínica destes antígenos tem sido limitada pela falta de métodos rápidos de identificação

e caracterização molecular no nível individual.

TAAs são antígenos próprios, não mutados, derivados de proteínas expressas

pelos tumores e pelo tecido normal. TAAs podem ser caracterizados pelo seu padrão de

expressão como antígenos tecido-específicos ou antígenos ubiquamente expressos

(Kessler, 2007). Os antígenos de câncer/testículo (MAGE, BAGE, NY-ESO-1) são

importantes exemplos de antígenos tecido-específicos. Esses antígenos são

normalmente expressos nos testículos e placenta, mas são reativados em células

tumorais. O baixo nível de expressão de MHC nestes tecidos impede o reconhecimento

destes antígenos pelo sistema imune, tornando-os alvos atrativos para a imunoterapia.

Outro exemplo são os antígenos de diferenciação, presentes tanto no tecido tumoral

quanto no tecido normal do qual o tumor se originou, mas não em outros tecidos. Os

antígenos deste tipo mais estudados são os relacionados ao melanoma, como o gp100,

Mart-1/Melan-A, pMel-17. Já os antígenos ubiquamente expressos são encontrados na

maioria dos tecidos normais, mas estão freqüentemente superexpressos nas células

17

transformadas, como hTERT, survivina e PRAME. A superexpressão destes antígenos

aumenta a quantidade de peptídeos apresentados pelas moléculas de MHC na superfície

celular, aumentando também o reconhecimento da célula tumoral pela célula T.

No entanto, devido à expressão em tecidos normais, imunoterapias direcionadas

contra estes antígenos podem induzir uma resposta autoimune, como vista no teste

clínico para tratamento de melanoma já mencionado. Além disso, como os TAAs são

antígenos próprios, os clones de linfócitos reativos presentes nos pacientes são de baixa

avidez (resultado dos mecanismos de tolerância central) e estão submetidos aos

mecanismos de controle da tolerância periférica (células T reguladoras, indução de

anergia), o que muitas vezes afeta a qualidade da resposta antitumoral obtida.

1.7 Receptor de antígeno quimérico (CAR):

Como mencionado, com exceção do melanoma, as estratégias imunoterapêuticas

para geração e utilização de linfócitos antitumorais tem falhado em induzir respostas

clínicas nos pacientes. Células específicas contra o tumor geralmente não estão

presentes nos pacientes ou estão em baixa freqüência, resultado da baixa

imunogenicidade da neoplasia e dos mecanismos de tolerância. Além disso, diversos

mecanismos de evasão tumoral dificultam a atividade das células infundidas. As células

tumorais comumente apresentam defeitos na maquinaria de processamento de

antígenos, como diminuição da expressão de TAP e β-2-microglobulina, e diminuição

da expressão do MHC de classe I, resultando em uma menor quantidade de antígenos

apresentados. Moléculas com função imunossupressora secretadas pelo tumor, como IL-

10, induzem a diminuição da expressão de moléculas coestimulatórias em DCs, de

modo que a apresentação de antígenos por estas células pode levar à anergia das células

18

T. Além destes mecanismos de evasão, complexos sistemas de cultura são necessários

para a expansão e seleção dos clones reativos. As doses terapêuticas podem ultrapassar

109 células T/Kg, necessitando assim de diversos ciclos de estimulação (Dudley, 2002).

Esta cultura prolongada das células T, no entanto, apresenta o risco de perda dos clones

reativos e diminuição da funcionalidade das células. (Yee, 2002)

Com o objetivo de superar algumas destas limitações, Eshhar e colaboradores

desenvolveram, em 1993, o conceito de receptor de antígeno quimérico (CAR) (Eshhar,

1993). Este receptor é composto de um domínio extracelular de reconhecimento de

antígeno, um espaçador, uma região transmembrana e um domínio intracelular de

sinalização (Figura 4). Geralmente a porção extracelular é derivada de um anticorpo

monoclonal murino, mas receptores ou ligantes (CD4, CD8, heregulina) também podem

ser utilizados. As células T que expressam estes receptores tornam-se ativadas após o

reconhecimento do antígeno na célula alvo, sendo então capazes de produzir citocinas e

exibir atividade citotóxica independente da ligação do receptor de célula T (TCR)

endógeno com o complexo MHC/peptídeo. Sendo assim, a expressão desta molécula na

membrana dos linfócitos permite o redirecionamento da especificidade da célula,

constituindo um novo método de geração de linfócitos antitumorais. Além disso, como

o reconhecimento do antígeno não é restrito ao MHC, um importante mecanismo de

evasão tumoral é evitado e permite que esta molécula seja utilizada em pacientes com

qualquer haplótipo de HLA. Com o advento de métodos efetivos de transferência gênica

para linfócitos, baseados principalmente em retrovírus e lentivirus, tornou-se possível a

modificação genética de um grande número de células, o que diminui a necessidade de

longos protocolos de expansão e seleção (Sadelain, 2003).

19

Figura 4: Desenho esquemático representando a estrutura padrão do receptor quimérico. VH: cadeia pesada variável; VL: cadeia leve variável; scFv: fragmento variável de cadeia única. Adaptado de Pule, 2003.

1.7.1 Domínio Extracelular:

O CAR conecta a especificidade dos anticorpos à maquinaria celular do sistema

imune adaptativo. O fragmento Fab de um anticorpo é uma unidade estruturalmente

independente que contém o sítio de ligação ao antígeno, composto de 4 domínios:

cadeia pesada variável (VH), cadeia pesada constante (CH), cadeia leve variável (VL) e

cadeia leve constante (CL). A especificidade da ligação é dada pelas duas regiões

variáveis. Com isso, a porção de reconhecimento de antígeno do CAR consiste na

expressão dos domínios VH e VL separados por um conector flexível em uma única

cadeia polipeptídica, chamada também de scFv (fragmento variável de cadeia única). O

conector aproxima os dois domínios e forças não covalentes proporcionam a correta

orientação, preservando o sítio de ligação (Pule, 2003). Essas regiões podem facilmente

ser amplificadas a partir do cDNA de hibridomas por RT-PCR, tornando possível o

redirecionamento dos linfócitos contra qualquer molécula da superfície celular para a

20

qual haja um anticorpo monoclonal identificado. Com isso, diferentemente do TCR,

CARs podem reconhecer não somente antígenos protéicos como antígenos derivados de

carboidratos e glicolipídeos, ampliando o conjunto de moléculas que podem ser

utilizadas como alvo. Além disso, esses receptores apresentam alta avidez pelo

antígeno, uma vez que não foram modelados pelos mecanismos de tolerância central do

sistema imune, como ocorre com o TCR.

Entre a região de reconhecimento de antígeno e a região transmembrana existe

um espaçador, que parece ser necessário para a função ótima de algumas construções.

De fato, um estudo demonstrou que espaçadores são necessários para CARs anti-5T4 e

anti-NCAM, mas não anti-CD19 (Guest, 2005). Acredita-se que a presença do

espaçador forneça mais flexibilidade à porção de reconhecimento para se ligar a

epítopos perto da membrana plasmática. A região espaçadora hinge-CH2-CH3, derivada

de IgG, é a mais comumente utilizada, e parece ser superior em termos de expressão,

estabilidade, ativação da célula T e função efetora. A região transmembrana conecta a

parte extracelular à parte intracelular, sendo importante para a dimerização dos

receptores e conseqüente amplificação do sinal de ativação, além de contribuir para a

co-localização do receptor com a sinapse imunológica.

1.7.2 Domínio Intracelular:

A parte intracitoplasmática do CAR é responsável pela sinalização do receptor e,

quando ativada, deve ser capaz de induzir as funções efetoras do linfócito. Estudos

iniciais desenvolveram CARs que possuíam apenas um domínio de sinalização, sendo

chamados de CARs de primeira geração. Nestes receptores, os domínios derivados da

cadeia ζ do complexo CD3 (parte sinalizadora do TCR) e da cadeia γ do FcεRI (receptor

21

de alta afinidade para IgE) são os mais utilizados. No entanto, estudos comparativos

demonstraram a superioridade do receptor com a cadeia ζ, tanto in vitro (Heuser, 2003;

Roberts, 1998) como in vivo (Haynes, 2001). Acredita-se que esta característica possa

ser explicada pela presença de 3 motivos ativadores baseados em tirosina dos

imunoreceptores (ITAMs) na cadeia ζ do complexo CD3, contra apenas 1 ITAM na

cadeia γ do FcεRI, gerando um sinal de ativação mais forte (Figura 5).

Figura 5: Esquema simplificado da sinalização iniciada pelo complexo TCR-CD3. Após a ligação do antígeno, os motivos ITAM são fosforilados e passam a recrutar a proteína cinase ZAP-70. A tirosina cinase Lck fosforila e conseqüentemente ativa a ZAP-70, que fosforila uma série de alvos incluindo LAT e SLP-76. Essas duas proteínas ativam duas vias de sinalização importantes, a via da PLC-γ e a via da Ras. A ativação destas vias culmina na ativação dos fatores de transcrição NFAT, AP-1 e NFkB, resultando em diferenciação, proliferação e ações efetoras das células T. Adaptado de Razzaq, 2004.

22

Diversos estudos desenvolveram receptores direcionados contra importantes

antígenos tumorais, como PSMA (câncer de próstata), GD3 (melanoma), CD20

(linfoma de célula B) e CAIX (carcinoma renal). As células T transduzidas com estes

receptores foram capazes de secretar IL-2 e lisar as células tumorais in vitro. Além

disso, a eficácia in vivo das células T murinas CAR+ foi demonstrada para os antígenos

Erbb2, FBP (câncer de ovário) e CEA (câncer de cólon), onde regressões tumorais

significativas foram observadas (Sadelain, 2003). No entanto, evidências recentes

mostram que as células T naive precisam de mais de um estímulo para uma eficiente

ativação. A estimulação apenas através da via do TCR não induz proliferação da

maioria das células T primárias, além de tornar estas células insensíveis a um

reestímulo, característica conhecida como anergia. A coestimulação da célula T é um

importante aspecto da transferência adotiva de células antígeno-específicas, visto que os

sinais fornecidos são cruciais na determinação do limiar de ativação, do tipo da resposta

e na sobrevivência das células. Como as células tumorais geralmente não expressam

moléculas coestimulatórias, o desenvolvimento de uma resposta antitumoral pode ser

comprometido. De fato, em um estudo utilizando um camundongo transgênico

expressando o CAR em todas as suas células, os receptores de primeira geração não

foram capazes de induzir proliferação em células naive (Brocker, 1995).

As funções efetoras demonstradas nos trabalhos publicados se devem ao

fenótipo pré-ativado dos linfócitos, resultado do processo de transdução retroviral que

requer a proliferação das células alvo. A importância da coestimulação para a expansão

das células T CAR+ foi demonstrada em um estudo in vitro de Gong e cols (Gong,

1999). Apenas os linfócitos que foram co-cultivados com células que expressavam o

antígeno alvo (PSMA) e CD80 proliferaram. As células que expressavam apenas PSMA

não foram capazes de induzir a secreção de altos níveis de IL-2 e de sustentar a

23

expansão dos linfócitos, mas foram capazes de induzir atividade citotóxica. Resultados

semelhantes foram obtidos em modelos in vivo, onde a expressão de CD80 pelo tumor

foi necessária para a completa erradicação do tumor pelos linfócitos T modificados

(Brentjens, 2003).

Esses fatores levaram ao desenvolvimento de CARs com capacidade

coestimulatória, chamados de segunda geração, através da fusão do domínio

citoplasmático de moléculas da família CD28 e TNF com o domínio de sinalização da

cadeia ζ. Uma grande variedade de moléculas coestimulatórias modula a resposta

imune, exercendo seu papel sobre uma subpopulação específica ou em determinado

momento do programa de diferenciação do linfócito. Conseqüentemente, os sinais

transmitidos podem diferir, resultando na indução de diferentes fenótipos que podem ser

utilizados de acordo com o tipo de resposta desejada e assim aumentar a eficácia da

terapia. Além de moléculas coestimulatórias, o fenótipo do linfócito pode ser controlado

por moléculas inibitórias expressas após a ativação, limitando e controlando a resposta

imune (Figura 6).

24

Figura 6: Esquema mostrando os receptores da família CD28 e TNF. Enquanto a família TNF (B) apresenta apenas receptores coestimulatórios, a família CD28 (A) possui receptores coestimulatórios e inibitórios. A: adaptado de Parry, 2007; B: adaptado de Watts, 2005.

A molécula CD28 apresenta um papel crucial na ativação de células naive

através da interação com membros da família B7 (CD80, CD86) nas APCs, sendo o

principal receptor coestimulador expresso pelos linfócitos T (Figura 7). Os estudos in

vitro utilizando células primárias murinas e humanas transduzidas com o scFv-CD28-ζ

25

mostraram uma liberação de IL-2 e proliferação significativamente maior quando

comparada ao receptor scFv-ζ (Hombach, 2001; Finney, 1998). Os estudos in vivo

também demonstraram uma atividade antitumoral superior deste receptor de segunda

geração (Kowolik, 2006; Haynes, 2002), com uma maior persistência das células

infundidas.

Figura 7: Esquema ilustrando as principais vias ativadas por CD28. O domínio citoplasmático desta molécula apresenta um motivo YMNM capaz de ser fosforilado, provavelmente pelas cinases Lck ou Fyn. Este motivo fosforilado é capaz de recrutar proteínas que contenham o domínio SH2, como a PI3K e o adaptador GRB2. A via de PI3K produz mediadores lipídicos como PIP3, que induz a co-localização na face interna da membrana plasmática das cinases PDK-1 e PKB-Akt através da interação com os domínios de homologia a pleckstrina (PH) presentes nestas proteínas. PDK-1 fosforila e ativa PKB-Akt, que possui um papel crucial na produção de IL-2 e IFN-γ. Essa via também apresenta um importante efeito antiapoptótico, induzindo a expressão de Bcl-xL (não mostrado). Adaptado de Rudd, 2003.

O sucesso obtido com a incorporação do domínio intracitoplasmático de CD28

levou diferentes grupos a testar outros domínios de ativação. Um dos domínios de

sinalização testados deriva da molécula 4-1BB (CD137), membro da família TNF de

receptores. Esta molécula tem a sua expressão induzida pela ativação do TCR e produz

respostas como proliferação, secreção de citocinas do tipo Th1, aumento da

citotoxicidade e maior sobrevivência, tanto em células CD4 como CD8 (Watts, 2005)

26

(Figura 8). A estimulação através deste receptor pode substituir os sinais de CD28 na

expansão in vivo de células T CD8, apesar de induzir menores níveis de IL-2. Estudos

demonstraram que este receptor apresenta um efeito preferencial sobre células CD8 e

tem a capacidade de inibir a morte celular induzida por ativação (AICD). Em um

trabalho recente, utilizando uma população de linfócitos CD8 de sangue periférico

previamente estimulado com um antígeno, foi demonstrado que 4-1BB induz uma

expansão preferencial das células de memória, resultando em um enriquecimento das

células antígeno-específicas (Zhang, 2007). Estas propriedades levaram os

pesquisadores a incorporar o domínio de sinalização desta molécula no CAR. Estudos in

vitro com células T CD8 e células NK demonstraram maior proliferação e atividade

efetora das células transduzidas com o scFv-4-1BB-ζ quando comparado com scFv-ζ

(Imai, 2004). No entanto, este receptor apresentou uma menor eficácia quando

comparado com scFv-CD28-ζ em um modelo de leucemia linfóide aguda (LLA) in vivo

(Brentjens, 2007).

27

Figura 8: Esquema apresentando os principais efeitos da estimulação via 4-1BB. Estes efeitos são decorrentes da sinalização via TRAF2, que em última análise ativa AKT, NFκB e AP-1. Adaptado de Croft, 2003.

Outros domínios de sinalização, como os derivados das moléculas ICOS e OX40

(CD134), foram testados in vitro (Finney, 2004) e in vivo (Brentjens, 2007), mas não

foram eficazes. Esses CARs apresentaram taxas de proliferação e liberação de citocinas

menores do que os receptores com CD28 e 4-1BB. Recentemente, na tentativa de

melhorar ainda mais a ativação dos linfócitos T, pesquisadores desenvolveram CARs

com três domínios intracelulares, scFv-CD28-41BB-ζ (Wang, 2007; Carpenito, 2009) e

scFv-CD28-OX40-ζ (Pule, 2005). Nos testes in vitro estes receptores induziram uma

maior proliferação dos linfócitos e maior secreção de citocinas como IL-2 e IFN-γ, além

de aumento da citotoxicidade. Esses resultados podem se traduzir em uma maior

atividade antitumoral in vivo e em um menor tempo de expansão ex vivo dos linfócitos.

28

Acredita-se que este efeito possa ser explicado pelas diferentes vias de sinalização

ativadas por estes domínios, visto que CD28 atua principalmente via PI3K e OX40/4-

1BB via TRAF2.

1.7.3 Testes Clínicos:

O primeiro teste clínico utilizando a abordagem do CAR foi para tratamento de

pacientes infectados com HIV (Mitsuyasu, 2000). Neste estudo, 24 pacientes receberam

uma única infusão de linfócitos CD4 e CD8 modificados para expressar o CAR CD4-ζ.

Com isso, as células infectadas pelo HIV seriam eliminadas devido à expressão de

proteínas do envelope viral, que se ligam na molécula CD4. Apesar das células

infundidas terem persistido por até um ano e terem migrado para os tecidos que atuam

como reservatórios de células infectadas, não houve diminuição nos níveis plasmáticos

de RNA e DNA viral. Alguns pacientes apresentaram diminuição do RNA viral no

tecido retal por até 14 dias, sugerindo uma atividade antiviral compartimentalizada.

Em outro estudo, 14 pacientes com câncer de ovário foram tratados com IL-2 e

células T anti-FBP, proteína expressa por este tipo de câncer, acoplado à cadeia γ

(Kershaw, 2006). Desses, 6 pacientes receberam células com dupla especificidade,

reagindo também contra células alogênicas, seguido de imunização com PBMCs

alogênicas. Nenhum paciente apresentou regressão do tumor e não houve evidências de

migração das células para os sítios da doença. Além disso, após 2 semanas as células já

não foram mais detectadas no sangue periférico e alguns pacientes desenvolveram

anticorpos contra o scFv, que é de origem murina. Estes anticorpos presentes no plasma

dos pacientes inibiram a liberação de IFN-γ em um ensaio in vitro, provavelmente

impedindo a interação do CAR com o ligante na célula tumoral. Em teste clínico para

29

tratamento de pacientes com neuroblastoma, resultados semelhantes foram obtidos

(Park, 2007). Os linfócitos com o CAR anti-CD171-ζ apresentaram baixa persistência

quando infundidos e não secretaram IL-2 após estimulação in vitro, apesar da alta

citotoxicidade contra a linhagem Be-2. Os clones infundidos apresentavam fenótipo de

células diferenciadas (CD62L-, CD27-, CD28-), mas baixos níveis de PD-1, molécula

associada à exaustão funcional do linfócito. Nenhum paciente tratado apresentou

resposta clínica significativa.

Em um teste clínico para tratamento de pacientes com neuroblastoma, a

utilização de uma nova abordagem melhorou significativamente a resposta observada.

Neste estudo, linfócitos específicos contra antígenos do EBV ou linfócitos do sangue

periférico foram modificados para expressar um CAR anti-GD2 contendo a cadeia

CD3ζ. Os linfócitos anti-EBV persistiram in vivo por muito mais tempo, provavelmente

devido à constante coestimulação recebida através do TCR endógeno. Esta maior

persistência se traduziu em melhores resultados, com 3/6 pacientes apresentando

regressão tumoral (Pule, 2008).

Os resultados obtidos com estes estudos iniciais apontam as características

cruciais para o sucesso deste tipo de terapia e sugerem abordagens para a sua

otimização. A utilização de CARs de segunda (ou terceira) geração aliada ao regime de

condicionamento não-mieloablativo pode resultar em uma maior persistência das

células e um maior efeito antitumoral. A humanização dos scFvs ou a geração de scFvs

a partir de anticorpos humanos pode eliminar as respostas humorais contra o CAR

observadas em alguns pacientes. Por último, a utilização de linfócitos com o fenótipo de

memória pode melhorar a proliferação in vivo destas células e suas funções efetoras.

30

1.8 Leucemia Linfóide Aguda – B (LLA-B):

A hematopoiese é um processo guiado por mudanças seqüenciais na expressão

gênica de progenitores multipotentes induzidas por microambientes como o fígado fetal,

medula óssea e timo. A manutenção deste sistema requer células tronco hematopoiéticas

(HSC), que continuamente geram na medula óssea os progenitores mielóides comuns

(CMP) e os progenitores linfóides comuns (CLP), através de divisão assimétrica. O

CLP dá origem aos precursores de células NK, T, e B. O desenvolvimento dos linfócitos

B acontece na medula óssea e no baço, e cada estágio pode ser identificado através de

uma combinação de marcadores de membrana e rearranjos dos segmentos gênicos que

codificam a parte variável do receptor da célula B (BCR) (Pui, 2006) (Figura 9).

Figura 9: Esquema da ontogenia da linhagem B, apresentando os principais marcadores. Adaptado de Pui, 2006.

Apesar de sujeito a inúmeros mecanismos de controle, translocações e mutações

podem ocorrer nas diferentes etapas do desenvolvimento da linhagem B, resultando na

indução do fenótipo maligno característico da LLA-B. Aproximadamente 70% das

LLAs pediátricas e 50% das LLAs adultas envolvem o compartimento de precursores B

iniciais, que pode ser definido através da expressão dos marcadores CD10, CD19,

CD24, CD34 e TdT. A proliferação e o acúmulo de células leucêmicas resultam na

31

supressão da hematopoiese normal e envolve vários sítios extramedulares, como o

fígado, baço e linfonodo. As mudanças na regulação gênica, induzidas por translocações

como TEL-AML1, alteram a capacidade de auto-renovação e diferenciação das HSC,

levando ao desenvolvimento do quadro leucêmico.

Os tratamentos atuais baseados em quimioterápicos atingem uma taxa de cura de

mais de 80% em crianças (Pui, 2006). Os pacientes de alto risco (BCR-ABL+, por

exemplo) são submetidos ao TPH. No entanto, muitos pacientes desenvolvem sérias

complicações devido aos efeitos adversos do tratamento, especialmente os que são

submetidos ao transplante. Além disso, as taxas de sobrevivência de adultos com LLA-

B são muito baixas (~40%) e os pacientes que sofrem recidivas não respondem bem aos

tratamentos disponíveis, como a DLI. Em um estudo retrospectivo multicêntrico, 75%

(n=44) dos pacientes tratados com DLI não alcançaram remissão completa (Collins,

2000). Acredita-se que características associadas aos blastos leucêmicos, como

apresentação de antígeno defeituosa e baixa expressão de moléculas coestimulatórias e

de adesão, sejam responsáveis por tal resultado (Cardoso, 1996; D´Amico, 2004). Com

isso, torna-se necessário o desenvolvimento de novas terapias com o objetivo de

aumentar as taxas de cura e melhorar a qualidade de vida dos pacientes.

Neste contexto, o uso de CARs direcionados contra antígenos expressos pelos

blastos leucêmicos é uma alternativa promissora. A molécula CD19 representa um bom

alvo, visto que é expressa por todos os subtipos de LLA e apenas pela linhagem B,

poupando os outros tecidos em uma eventual terapia. Além disso, a subpopulação de

LLA-B com potencial clonogênico, ou seja, que sustenta o crescimento do tumor,

expressa este antígeno. Testes clínicos utilizando anticorpos monoclonais contra CD19

não revelaram uma alta incidência de variantes de escape negativas para este antígeno

(Ma, 2002). Com isso diversos estudos in vitro e in vivo foram realizados, apresentando

32

resultados promissores e demonstrando o potencial da terapia (Cooper, 2003; Cooper,

2005). No entanto, um efeito adverso desta terapia seria a eliminação de todos os

progenitores e células B maduras, poupando apenas os plasmócitos.

1.9 Importância da resposta condicional:

Com a escassez de TSAs caracterizados, os protocolos de imunoterapia têm

utilizado como alvo TAAs. Apesar de serem expressos nos tumores, a expressão destes

antígenos nos tecidos normais pode induzir respostas autoimunes, diminuindo a eficácia

da terapia e podendo provocar sérios efeitos colaterais nos pacientes. De fato, em testes

clínicos para tratamento de pacientes com melanoma utilizando infusão de TIL foi

observada a destruição de melanócitos normais, com desenvolvimento de vitiligo e

uveíte. Resultados semelhantes foram reportados em um teste clínico utilizando CARs

anti-CAIX para o tratamento de carcinoma renal (Lamers, 2006). Neste estudo foi

observada uma grave toxicidade hepática decorrente da expressão inesperada do

antígeno alvo nos ductos biliares. Estes efeitos exigiram medidas como suspensão da

terapia, redução da dose de células T ou administração de corticosteróide, limitando o

sucesso da terapia.

Mais recentemente foi reportado na literatura um estudo que apresentou um

grave efeito adverso. Neste teste clínico, um paciente com câncer de cólon metastático

foi tratado com um regime de condicionamento não mieloablativo e com infusão de 1010

linfócitos expressando um CAR anti-Erbb2 de terceira geração contendo os domínios de

sinalização de CD28, 4-1BB e CD3ζ. No entanto, apenas 15 minutos após a infusão a

paciente apresentou edema e infiltrado pulmonar, e cinco dias depois a paciente veio a

óbito. A análise do soro da paciente demonstrou altos níveis de citocinas inflamatórias

33

(IL-6, TNF-α, IFN-γ) 4 horas após a infusão, consistente com o processo de intensa

liberação de citocinas. Os autores postularam que a morte desta paciente foi devido ao

reconhecimento do antígeno alvo expresso em baixos níveis pelas células epiteliais do

pulmão, e à migração inicial das células infundidas pelo pulmão, levando à liberação de

altas quantidades de citocinas e conseqüentemente falha de múltiplos órgãos (Morgan,

2010). Este estudo deixa clara a limitação dos protocolos atuais de transferência adotiva,

sendo necessário o desenvolvimento de mecanismos capazes de direcionar a resposta

especificamente contra células tumorais.

Fisiologicamente, a resposta imune mediada pelos linfócitos T é regulada por

um balanço entre os receptores coestimulatórios e inibitórios. Os receptores inibitórios

possuem um importante papel na homeostasia do sistema imune, sendo que alterações

nestas vias de regulação podem estar relacionados à progressão do câncer e a doenças

autoimunes (Chen, 2004). A utilização dos domínios de sinalização destas moléculas

inibitórias nos CARs poderia proporcionar um importante mecanismo de controle,

direcionando a resposta efetora apenas contra as células do tumor e poupando os tecidos

normais. Uma maneira de obter estes resultados seria a utilização de um sistema com

dois CARs, onde o receptor de ativação seria específico contra um TAA compartilhado

pelo tumor e pelo tecido alvo e o receptor inibitório específico para um antígeno

expresso somente pelo tecido normal. Dentre os receptores inibitórios descritos, os mais

estudados são os da família CD28, como o CTLA-4, PD-1 e BTLA (Figura 10).

34

Figura 10: Representação esquemática dos mecanismos de ação dos receptores inibitórios da família CD28. Esses receptores são capazes de suprimir a proliferação e secreção de citocinas por meio do recrutamento de fosfatases como SHP-1 e SHP-2, que inibem a ativação de proteínas-chave (por exemplo, PI3K) da via de sinalização do TCR. Adaptado de Murphy, 2006.

A molécula CTLA-4 tem a sua expressão induzida logo após a ativação da célula

T. Este receptor interage com os mesmos ligantes da molécula CD28, porém apresenta

uma maior afinidade por eles. A função inibitória desta molécula é crucial para a

manutenção da homeostase do sistema imune, como comprovado nos experimentos

utilizando camundongos CTLA4-knockout (Tivol, 1995). Esses animais, apesar de

nascerem sadios, desenvolvem um fenótipo linfoproliferativo após 5-6 dias,

caracterizado pela ativação de um grande percentual de células T e pela maciça

infiltração destas em órgãos não linfóides, resultando em morte após 3-4 semanas.

Como esta proteína não apresenta atividade enzimática, sua função é exercida através

do recrutamento de moléculas de sinalização pelos domínios de tirosina fosforilados

presentes no domínio citoplasmático. Moléculas como SHP-2, PP2A e PI3K já foram

35

descritas como sendo recrutadas por CTLA-4, mas o papel destas proteínas na inibição

dos linfócitos é controverso (Teft, 2006). Recentemente, um novo modelo de ação foi

proposto, onde a ligação de CTLA-4 induziria um aumento na mobilidade da célula T.

Esse aumento de mobilidade impediria o estabelecimento de interações estáveis entre o

linfócito e a APC, conseqüentemente inibindo a sua ativação (Rudd, 2008).

A molécula PD-1, originalmente descrita como um transcrito preferencialmente

expresso em células apoptóticas, possui um importante papel na manutenção da

tolerância periférica. Todos os estudos realizados até o momento demonstraram que a

ligação de PD-1 bloqueia a ativação da célula T. Camundongos knockout para PD-1

desenvolvem glomerulonefrite e artrite (linhagem C57BL/6) e cardiomiopatia

autoimune (linhagem BALB/c), sustentando ainda mais o papel desta molécula como

um regulador negativo da ativação do linfócito T (Chen, 2004). A cadeia citoplasmática

deste receptor possui duas tirosinas, que estão localizadas em motivos conservados

chamados ITIM (motivos inibitórios baseados em tirosina dos imunoreceptores) e ITSM

(motivos de troca baseados em tirosina dos imunoreceptores). Esses motivos, quando

fosforilados, são capazes de recrutar proteínas fosfatases e assim inibir a ativação do

linfócito. No entanto, um estudo utilizando linfócitos T CD4 humanos demonstrou que

apenas o motivo ITSM é crucial para a função do receptor, mediando o recrutamento

das fosfatases SHP-1 e SHP-2 e inibindo a proliferação e produção de citocinas

induzidas pela coestimulação por CD28 (Chemnitz, 2004).

O receptor BTLA é o mais recente membro da família CD28 descrito, sendo

expresso por células T ativadas, mas não por células naive. Experimentos in vitro e in

vivo confirmaram a sua função inibitória, sendo capaz de inibir a proliferação e secreção

de IL-2 em células murinas e humanas. Além disso, camundongos deficientes em

BTLA apresentam uma maior suscetibilidade de desenvolver encefalomielite autoimune

36

experimental (EAE) (Tao, 2005). A região citoplasmática de BTLA apresenta

similaridade com PD-1, também possuindo os dois motivos baseados em tirosina ITIM

e ITSM. Além disso, possui dois sítios (YXN) de ligação de proteínas adaptadoras

como Grb2/Grap. Apesar disso, mutações direcionadas nestes motivos não tiveram

efeito na habilidade do BTLA de inibir a ativação de linfócitos. A molécula perdeu sua

função inibitória apenas quando as quatro tirosinas da porção citoplasmática foram

mutadas. Apenas a fosfatase SHP-1 foi recrutada após ligação deste receptor, e

mutações que impediram esta interação não comprometeram a função inibitória

(Chemnitz, 2006).

No contexto da LLA de precursores B iniciais, os receptores quiméricos

inibitórios poderiam ser usados para direcionar a resposta especificamente contra os

blastos leucêmicos, poupando as células B maduras. Para isso, um receptor de ativação

seria direcionado contra o antígeno CD19, expresso nos blastos leucêmicos e nas B

maduras, e o receptor inibitório seria direcionado contra o antígeno CD20, expresso

apenas nas B maduras (Figura 11). Este tipo de abordagem pode possibilitar uma

diminuição dos efeitos colaterais de uma eventual terapia com CARs anti-CD19.

37

Figura 11: Esquema demonstrando o princípio da eventual terapia utilizando o sistema de CARs ativadores / inibitórios. As células T são modificadas ex vivo, expandidas e infundidas. Estas células migram para o sítio da doença, onde encontram células B normais e malignas. As células T reconhecem as células B normais, mas não se tornam ativadas devido à expressão de CD20 pela célula alvo, que interage com o CAR inibitório. Já a célula B maligna não expressa CD20, tornando-se alvo da célula T infundida pois apenas o receptor de ativação (anti-CD19) é ligado. Adaptado de Sadelain, 2003.

Para verificar se tal resposta condicional pode ser alcançada, utilizamos um

sistema de co-cultura in vitro entre a linhagem de linfócito T CD4+ humano Jurkat e a

linhagem mielóide K562. A linhagem Jurkat foi modificada para expressar um

plasmídeo que codifica a proteína luciferase sob o controle de um promotor responsivo

a NFAT, atuando como repórter da ativação da célula quando o NFAT é translocado

para o núcleo. Com isso, podemos avaliar o nível de ativação ou inibição induzido pela

ligação dos CARs expressos pela Jurkat. Neste modelo, a linhagem K562 atua como

38

alvo, expressando os antígenos CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) ou CD19 e CD20 (K5-

19/20). Estas proteínas não são expressas pela linhagem selvagem, tornando esta célula

o alvo ideal neste tipo de experimento. Resultados anteriores do nosso grupo

demonstraram a capacidade deste sistema de avaliar a translocação do fator de

transcrição NFAT para o núcleo após estímulo da linhagem Jurkat 4.30 20BBz com as

linhagens derivadas da K562 (Figura 12) e a construção dos CARs inibitórios por meio

da técnica de SOE-PCR (Figura 13).

Figura 12: Ensaio de luciferase, comprovando a funcionalidade do sistema repórter de ativação e do receptor quimérico. A linhagem Jurkat 4.30 transduzida ou não com o receptor ativador anti CD20 (20BBz) foi estimulada com PMA e Ionomicina ou co-cultivada com a linhagem K562 e suas derivadas expressando os antígenos alvo(K5-19, K5-20 ou K5-DUPLA) por 8 horas. Após este período, as células foram lisadas, o substrato foi adicionado e a atividade de luciferase foi medida no luminômetro. Os valores foram normalizados de acordo com o controle J 20BBz. J = Jurkat4.30; P+I = PMA + Ionomicina; CsA = ciclosporina A.

39

Figura 13: Esquema mostrando os CARs inibitórios previamente construídos e clonados no vetor pCR2.1. Estes receptores foram completamente seqüenciados, não apresentando alterações nas seqüências previstas.

40

2. OBJETIVOS:

2.1 Objetivo Geral:

Construção e validação funcional de um sistema de CARs de ativação e

inibição capazes de induzir uma resposta celular funcional contra uma célula que

expresse uma combinação específica de antígenos.

2.2 Objetivos Específicos:

• Clonagem dos CARs inibitórios anti-CD20 em vetores retrovirais e lentivirais.

• Transdução da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs ativadores e inibitórios.

• Validação funcional dos CARs inibitórios através do ensaio repórter de ativação

baseado em luciferase e de marcadores de ativação (CD69).

• Transdução de linfócitos primários murinos e validação funcional dos CARs

através de ensaio de citotoxicidade.

• Estabelecimento de um modelo in vivo de tumor utilizando a linhagem de

melanoma murino B16F10 modificada para expressar os antígenos alvo CD19,

CD20 ou ambos.

41

3. MATERIAIS E MÉTODOS:

3.1 Plasmídeos:

Os plasmídeos 19BBz e 20BBz foram cedidos pelo Dr. D. Campana (St. Jude

Children´s Research Hospital, Tennessee, EUA). Ambos codificam receptores

quiméricos de ativação que reconhecem respectivamente as proteínas CD19 e CD20

(que utilizaremos como protótipo de antígenos de membrana no nosso sistema) e

contém o domínio intracelular do receptor 4-1BB e do CD3ζ. Além disso, estas

construções possuem uma seqüência chamada IRES que possibilita o início da tradução

de uma segunda proteína a partir do mesmo RNA, neste caso a proteína verde

fluorescente GFP. Os plasmídeos pQCXIN e pQCXIP (Clontech) foram utilizados pra

clonar os CARs ativadores e inibitórios, respectivamente. Estes plasmídeos possuem a

seqüência IRES seguida de um gene que confere resistência ao antibiótico G418

(pQCXIN) ou puromicina (pQCXIP). Todos estes plasmídeos são desenhados para o

sistema de vetores virais derivados do MLV (Moloney Leukemia Vírus). O plasmídeo

pGL4.30 (Promega) codifica a proteína luciferase sobre o controle de um promotor

responsivo ao fator de transcrição NFAT, expresso por linfócitos ativados. Além disso,

codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina B. O plasmídeo

EF1α-CD20, para o sistema lentiviral, codifica a proteína CD20 humana sobre o

controle do promotor EF1α e já está disponível no nosso laboratório (Serafini, 2004). O

plasmídeo EF1α-CD19-IRES-GFP codifica a proteina CD19 humana e o reporter GFP,

encontrando-se disponível em nosso laboratório. Os plasmídeos pEF-ENTRB (vetor de

entrada), pLenti CMV GFP DEST e pLenti CMV PURO DEST (vetores lentivirais de

destino) foram obtidos da empresa AddGene. Neste plasmídeos, o inserto é clonado no

42

vetor de entrada e, após uma reação de recombinação mediada pela enzima LR Clonase

(Invitrogen), é inserido nos vetores de destino.

3.2 Cultura de células:

A linhagem mielóide humana K562 e suas derivadas K5-19 (CD19+), K5-20

(CD20+) e K5-19/20 (CD19+, CD20+) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco)

suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado, L-glutamina (2mM) e

antibióticos (penicilina e estreptomicina). As linhagens humanas Jurkat e suas derivadas

(linfócito T CD4+), 293T e a linhagem murina B16F10 e suas derivadas foram

cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB inativado, L- glutamina

(2mM) e antibióticos (penicilina e estreptomicina). Todas as linhagens foram mantidas

em uma atmosfera contendo 5% de CO2 a 37°C e com saturação de umidade.

3.3 Produção de vetores virais:

Para a produção de vetores virais derivados do MLV, 3x106 células

empacotadoras 293T foram transfectadas pelo método de precipitação por fosfato de

cálcio com os plasmídeos GAGPOL (proteínas estruturais - 10µg) e VSV (envelope -

6µg), além do plasmídeo contendo o gene de interesse (20µg). Para a produção de

vetores virais derivados do HIV (lentivirus), 3x106 293T foram transfectadas pelo

mesmo método com os plasmídeos RRE, REV (proteínas estruturais - 10µg e 5µg),

VSV (6µg) e o plasmídeo contendo o gene de interesse (20µg). Em ambos os casos o

meio de cultura das células empacotadoras foi trocado no dia seguinte (d+1) e os

sobrenadantes contendo o vírus foram recolhidos nos d+2 e d+3 após a transfecção.

Estes sobrenadantes foram filtrados em filtros de 0,22µm (Millipore) e armazenados em

alíquotas de 1 ml a -70ºC.

43

3.4 Citometria de Fluxo:

O citômetro de fluxo FacsCalibur (BD Biosciences) foi utilizado para a titulação

dos vetores virais, avaliação da transdução das linhagens Jurkat4.30 e B16F10 e

avaliação do marcador de ativação na Jurkat. Os anticorpos contra proteínas humanas

utilizados foram: αCD19-FITC (eBiosciences), αCD19-PECy5 (eBiosciences), αCD20-

FITC (BD Biosciences), αCD20-APC (BD Biosciences), αCD69-PE (eBiosciences),

αFab-Biotina (Jackson Laboratories). Os anticorpos contra proteínas murinas utilizados

foram: αCD4-FITC (eBiosciences), αFoxp3-APC (eBiosciences). As células foram

lavadas duas vezes com PBS+1% soro humano e depois incubadas com o anticorpo na

devida diluição por 20 minutos no gelo. Após a incubação, as células foram lavadas

duas vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% e analisadas no citômetro.

3.5 Titulação dos vetores virais:

O título dos vetores foi determinado através da transdução das células 293T e

análise da expressão do transgene por citometria de fluxo. Em cada poço de placas de 6

poços foram plaqueadas 5x105 células 293T, que foram incubadas com o vetor viral no

dia seguinte. Para cada vetor, dois volumes diferentes de sobrenadante foram utilizados.

A transdução foi realizada na presença do policátion Polibrene (8µg/ml). Além disso,

duas centrifugações de 1800rpm durante 45 minutos foram efetuadas, com intervalo de

3 horas entre as duas. Dois dias após a infecção as células 293T foram tripsinisadas e

analisadas por citometria de fluxo para avaliar o nível de expressão dos transgenes. O

título foi calculado utilizando-se a fórmula: título = (F x N)/V; onde F é a freqüência de

células positivas, N é o número de células 293T no dia da transdução, e V é o volume

(em mL) de sobrenadante utilizado.

44

3.6 Transdução e purificação das linhagens:

A razão do número de partículas virais para cada célula alvo (MOI) variou

conforme o título obtido para cada vetor. A linhagem B16F10 (3x104) foi transduzida

com o vetor lentiviral EF1α-CD20 (MOI=50) e/ou com o vetor EF1α-CD19-IRES-GFP

(MOI=30). A linhagem Jurkat 4.30 (2x105) foi transduzida com o vetor pQCXIN-

19BBz ou pQCXIP-CAR Inibitório (MOI=5). Para potencializar as transduções, duas

centrifugações de 450g por 45 minutos foram realizadas, com intervalo de 3 horas entre

uma e outra. Além disso, Polibrene foi utilizado na concentração de 8µg/ml. As

linhagens resultantes B16-CD19, B16-CD20 e B16-CD19/CD20 foram expandidas e

depois purificadas por sorting utilizando o citômetro de fluxo MoFlo (Dako

Citomation). Já as linhagens Jurkat19BBz/20CTLA4, Jurkat 19BBz/20PD1 e Jurkat

19BBz/20BTLA foram selecionadas in vitro por meio da adição dos antibióticos G418

(1mg/mL) e Puromicina (1ug/mL) ao meio de cultura.

3.7 Ensaio de luciferase:

As células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas expressando um dos CARs

inibitórios (1x105) foram ativadas com PMA 20µM + Ionomicina 1µM (controle

positivo) ou co-incubadas na proporção de 1:1 com as linhagens K562, K5-19, K5-20

ou K5-19/20. Como controle de ativação da via do TCR, utilizamos a droga

Ciclosporina A (CsA) na concentração de 1µM, 15 minutos antes da ativação. Após 8

horas de incubação, as células foram lavadas com PBS e o pellet foi ressuspendido em

PBL (tampão de lise). Ao lisado de cada condição experimental foi adicionado o

substrato luciferina e os resultados foram obtidos utilizando-se um luminômetro

Veritas® (Turner Biosystems).

45

3.8 Avaliação do marcador de ativação CD69:

As células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas expressando um dos CARs

inibitórios (2,5x105) foram ativadas com PMA 20µM + Ionomicina 1µM (controle

positivo) ou co-incubadas na proporção de 1:1 com as linhagens K562, K5-19, K5-20

ou K5-19/20. Após 24 horas de incubação as células foram marcadas com o anticorpo

αCD69-PE e analisadas por citometria de fluxo.

3.9 Western blot:

A extração de proteína total das células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas

expressando um dos CARs inibitórios foi realizada com tampão de lise RIPA, na

presença de coquetel de inibidores de protease (Sigma). A dosagem protéica foi obtida

utilizando-se do método de Lowry. A separação protéica foi feita em gel de

bisacrilamida 12% contendo Tris 1M (pH 8,8), H2O destilada, perssulfato de amônio

10% e Temed. Utilizou-se o método de transferência semi-seca do gel para membrana

de nitrocelulose, e bloqueio inespecífico com leite 5% e PBS-T 0,1%. O anticorpo goat

anti-mouse IgG 1:1000 conjugado a peroxidase (KPL) foi incubado overnight à 4ºC.

Para a revelação foi utilizado o kit ECL (GE Healthcare).

3.10 Modelo in vivo de melanoma:

Células da linhagem B16F10 (5x105) modificada para expressar os antígenos

alvo foram injetadas por via subcutânea no flanco direito de animais C57BL/6. A cada

dois dias as dimensões do tumor eram obtidas utilizando-se um paquímetro e o volume

do tumor foi calculado segundo a fórmula V = A2 x B / 2, onde A é o menor diâmetro

do tumor, B é o maior diâmetro do tumor e V é o volume. Os animais foram

46

sacrificados quando o tumor atingiu entre 1500-2000mm3 ou quando o tumor

apresentou sinais de ulceração.

47

4. RESULTADOS:

4.1 Clonagem dos CARs nos vetores retrovirais:

A construção dos CARs inibitórios 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA já havia sido

realizada por nosso grupo utilizando a técnica de SOE-PCR. Estes seqüências foram

clonadas no vetor pCR2.1 e completamente seqüenciadas, não apresentando erros. Para

permitir a validação destes receptores em linfócitos o CAR ativador e os CARs

inibitórios foram clonadas nos vetores retrovirais pQCXIN e pQCXIP, respectivamente.

Estes vetores possuem um gene de resistência aos antibióticos G418 e puromicina,

permitindo a seleção em cultura de células que expressem os dois receptores. As

seqüências correspondendo aos receptores foram retiradas do vetor pCR2.1 com a

enzima EcoRI e clonados no vetor pQCXIN ou pQCXIP abertos com a mesma enzima.

Como pode ser visto na figura 14, após digestão controle com a enzima de restrição, as

colônias mostradas apresentaram o inserto na orientação certa.

48

Figura 14: Clonagem dos CARs inibitórios. Em A e B estão mostrados os esquemas dos plasmídeos retrovirais utilizados, com as enzimas usadas para clonagem (EcoRI) e controle (BmgBI ou BamHI) destacadas. Em C, o gel mostrando a digestão controle com BamHI dos CARs inibitórios 20CTLA4 (1), 20PD1(2) e 20BTLA (3) apresentando a banda de 200pb e com BmgBI do CAR ativador 19BBz (4) com a banda de 900pb. As setas indicam as bandas do marcador molecular. MM = marcador molecular de 1kb (Invitrogen).

4.2 Transdução e seleção da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs ativadores

e inibitórios:

Como já foi mostrado, a linhagem Jurkat 4.30 é capaz de indicar o nível de

translocação de NFAT pro núcleo após um estímulo, sendo então uma medida de

ativação da célula. Sendo assim, com o objetivo de validar a funcionalmente os CARs

inibitórios esta linhagem foi transduzida com o vetor retroviral pQCXIN-19BBz e com

um dos receptores inibitórios. Dois dias após transdução foram adicionados os

antibióticos G418 (1mg/mL) e puromicina (1ug/mL) ao meio de cultura para a seleção

49

de células duplo-positivas. Duas semanas após o início da seleção a expressão dos

CARs inibitórios foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se o anticorpo αFab-

biotina e estreptavidina-PE. Este anticorpo reconhece a porção extracelular apenas do

CAR anti-CD20 (Altvater, 2009), não reconhecendo o CAR anti CD19. A figura 15

mostra que 98% das células Jurkat 4.30 expressam o CAR 20PD1 (figura 15C) e que

93% expressam o 20BTLA (figura 15D), demonstrando uma eficiente transdução e

seleção in vitro. No entanto apenas 8% das células expressavam 20CTLA4 (figura

15B), mesmo estas permanecendo vivas após o tratamento com as drogas.

50

Figura 15: Avaliação da expressão dos CARs inibitórios após transdução com vetor retroviral e duas semanas de seleção com G418/puromicina. O controle negativo corresponde a Jurkat 4.30 não transduzida marcada com αFab-biotina/estreptavidina-PE.

51

A expressão dos CARs inibitórios também foi avaliada por western blot,

especialmente para determinar se o receptor 20CTLA4 estava sendo expresso. Como

pode ser visto na figura 16 os receptores apresentam peso molecular condizente com o

previsto (38KDa para 20CTLA4, 45KDa para 20PD1 e 46KDa para 20BTLA). Isto

demonstra que os três receptores construídos são eficientemente expressos na linhagem

Jurkat.

Figura 16: Avaliação da expressão dos CARs inibitórios na Jurkat por western blot utilizando o anticorpo ααααFab-biotina/estreptavidina-HRP. Como controle positivo foi utilizado um extrato protéico de baço de camundongo, contendo a cadeia leve (25KDa) e pesada (52KDa) da IgG. Como controle negativo foi utilizado um extrato de Jurkat não transduzida.

4.3 Validação funcional dos CARs - ensaio de luciferase:

Como mostrado na introdução, para a detecção do NFAT nuclear como

indicativo da ativação celular utilizamos como sistema repórter o plasmídeo pGL4.30,

que codifica a proteína luciferase sobre o controle de um promotor responsivo a NFAT.

52

Desta forma podemos utilizar as células Jurkat expressando as diferentes combinações

de CARs ativador/inibitório para quantificar o nível de ativação/inibição mediado por

estes após a interação com os ligantes. A linhagem Jurkat e suas derivadas foram

ativadas mediante adição de PMA/Ionomicina (controle positivo) ou co-incubação com

as linhagens K562 expressando os antígenos alvo e, após 8 horas, foram lisadas e a

atividade de luciferase medida com o auxílio de um luminômetro. Como pode ser visto

na figura 17, quando as células Jurkat são co-incubadas com a linhagem K5-19 uma alta

atividade de luciferase é observada, correspondendo à atividade do receptor 19BBz. No

entanto, quando as células contendo os dois CARs (19BBz e um CAR inibitório) são

co-incubadas com a K5-DUPLA, ocorreu uma grande diminuição da atividade de

luciferase, sendo este um forte indício de que estes receptores são capazes de inibir a

ativação induzida pelo CAR 19BBz. É importante ressaltar que a incubação das células

Jurkat com a K5-20 não alterou a atividade de luciferase, permanecendo similar ao sinal

obtido com a co-incubação com a K562 selvagem.

53

Figura 17: Resultado do ensaio de luciferase, demonstrando a capacidade dos CARs inibitórios de inibir a translocação de NFAT para o núcleo. O sinal foi avaliado após 8 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina e foi normalizado em relação à condição K562.

4.4 Validação funcional dos CARs - marcador de ativação linfocitário

CD69:

A molécula CD69 é considerada um marcador inicial de ativação de linfócitos T,

não sendo expressa por linfócitos não ativados. Diversos trabalhos na literatura apontam

uma regulação similar desta molécula na linhagem Jurkat (Aussel, 1996; Fernández-

Riejos, 2008). Sendo assim, para verificar se os CARs inibitórios são capazes de

modular a expressão deste marcador, as linhagens Jurkat foram co-cultivadas com as

linhagens alvo K562 e suas derivadas por 24 horas. Após este período a presença desse

marcador foi avaliada por citometria de fluxo. A figura 18 mostra que a expressão de

CD69 aumenta quando os linfócitos são ativados por PMA/Ionomicina ou K5-19, mas

esta molécula se mantém em níveis basais quando os linfócitos são co-cultivados com a

54

K562 WT (selvagem) ou K5-20. No entanto, quando as Jurkat são co-cultivadas com a

K5-DUPLA o percentual de células expressando CD69 permanece parecido com o

controle (K562 selvagem), o que constitui um forte indício da capacidade inibitória dos

CARs 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA sobre a atividade do CAR 19BBz e,

conseqüentemente, sobre a ativação dos linfócitos.

Figura 18: Avaliação da expressão do marcador de ativação CD69 após 24 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina (P+I). As células foram marcadas com o anticorpo anti-CD69PE e analisadas por citometria de fluxo. As células K562 não expressam esta molécula (dados não mostrados). CsA = ciclosporina A.

4.5 Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A:

A linhagem Jurkat foi escolhida para estes ensaios iniciais pois, além de ser um

linfócito CD4+, é imortalizada e possui alta capacidade de proliferação, características

que favorecem a transdução com vetores retrovirais e a posterior seleção com

antibióticos. No entanto, a transdução de linfócitos primários se mostra mais difícil,

55

uma vez que estas células são mais sensíveis à apoptose. Além disso, a transdução com

retrovírus requer constante ativação via TCR e proliferação dos linfócitos, o que pode

prejudicar a sobrevivência e induzir a exaustão funcional dos linfócitos, inversão da

razão CD4/CD8, perda da subpopulação de linfócitos naive e diminuição do repertório

de TCRs (Sauce, 2002). Com isso, protocolos recentes vêm empregando vetores

lentivirais para a transdução deste tipo celular. Esses vetores requerem apenas que o

linfócito esteja na fase G1b do ciclo celular, condição alcançada mediante estímulo com

baixas doses de citocinas como IL-2 e IL-7 (Cavalieri, 2003), levando à preservação da

capacidade funcional destas células. Esses vetores também parecem ter um perfil de

sítios de integração mais seguro, diminuindo as chances de tumorigênese. (Montini,

2006).

O sistema de CARs proposto implica na expressão de dois receptores diferentes

na mesma célula, sendo tecnicamente preferível a utilização de apenas um vetor viral.

Classicamente o elemento viral IRES (internal ribosomal entry site) é utilizado para

obter a expressão de duas proteínas a partir do mesmo transcrito e sobre o controle do

mesmo promotor. Este elemento é posicionado entre os insertos e assume uma estrutura

secundária que mimetiza o 5’cap, permitindo o acoplamento do ribossomo e a tradução

da segunda proteína. No entanto, este mecanismo não apresenta uma alta eficácia,

fazendo com que a proteína situada após o IRES tenha uma expressão

consideravelmente mais baixa (Mizuguchi, 2000).

Trabalhos recentes vêm utilizando a seqüência 2A (derivada de um picornavirus)

para a expressão de duas proteínas no mesmo vetor. Este pequeno peptídeo (18

aminoácidos), durante a sua tradução, interage com o túnel de saída do ribossomo,

impedindo a formação da última ligação peptídica no C-terminal do 2A. O mesmo

ribossomo continua a tradução da segunda proteína e a primeira proteína é liberada com

56

o 2A fusionado no C-terminal. A segunda proteína permanece apenas com o último

aminoácido (prolina) do 2A fusionado ao seu N-terminal. A grande vantagem deste

sistema é a expressão das duas proteínas de forma equimolar, permitindo um maior

controle da estequiometria dos transgenes (Szymczak, 2004).

Resolvemos utilizar este sistema para expressar o receptor 19BBz juntamente

com um CAR inibitório em linfócitos T primários. A figura 19A mostra o esquema da

construção, desenhada seguindo os parâmetros definidos por Yang e colaboradores

(Yang, 2008). As seqüências V5 e SGSG servem como espaçadores, aumentando a

eficiência do processo. O sítio para a protease furina (expressa no complexo de Golgi)

permite a eliminação dos peptídeos residuais do 2A no primeiro receptor quimérico. O

cassete de expressão contendo os dois receptores foi clonado no vetor de entrada pEF-

ENTRB, que possui o promotor EF1α e os sítios de recombinação attL1 e attL2. Estes

sítios permitem a recombinação com os respectivos sítios attR1 e attR2 presentes nos

vetores lentivirais pLenti CMV GFP DEST e pLenti CMV PURO DEST através da

utilização da enzima LR Clonase (figura 19B). O gel da figura 19C representa os clones

obtidos após o processo de recombinação da seqüência EF1α-19BBz-2A-20PD1,

demonstrando que as clonagens foram realizadas com sucesso.

57

Figura 19: Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A, como esquematizado no painel A. Os elementos estão descritos no texto. Em B estão representados os mapas dos plasmídeos lentivirais de destino, que possuem os sítios de recombinação attR1 e attR2. O gel no painel C representa a clonagem do cassete EF1α-19BBz-2A-20PD1 no vetor pLenti CMV GFP DEST (1) ou pLenti CMVPURO DEST (2) após controle com a enzima de restrição EcoRV (bandas de aproximadamente 8500, 2500, 1600 e 430 pb). M = marcador molecular de 1kb (Invitrogen).

4.6 Validação do vetor lentiviral EF1αααα-19BBz-2A-20PD1:

Com o objetivo de verificar a funcionalidade desta nova construção, a linhagem

Jurkat 4.30 foi transduzida com o vetor lentiviral EF1α-19BBz-2A-20PD1 PURO e

selecionada com puromicina durante uma semana. No entanto, como podemos ver na

figura 20A, as células não apresentavam marcação para o receptor 20PD1, mesmo após

extensa morte celular observada durante o período de seleção com antibiótico. Apesar

58

deste resultado, células Jurkat que foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo

uma configuração de receptores invertida (EF1α-20z-2A-1941BB GFP) apresentaram

marcação de cerca de 20% (Figura 20B).

Figura 20: Análise de citometria de fluxo das células Jurkat transduzidas com os vetores lentivirais EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 PURO (A) ou EF1αααα-20z-2A-1941BB GFP (B). As células foram marcadas com o anticorpo primário αFab-biotina e com estreptavidina-PECy5. O controle negativo utilizado foi a Jurkat negativa marcada com o anticorpo/estreptavidina (coluna da esquerda).

O ensaio repórter de ativação baseado em luciferase também foi realizado com

as células Jurkat 4.30 19BBz-2A-20PD1. Como podemos ver na figura 21, a co-cultura

com a linhagem K5-19 resultou em uma pequena atividade de luciferase, enquanto que

o controle positivo PMA/Ionomicina apresentou uma atividade 200 vezes superior à

condição K562 (atividade basal). Além disso, quando co-incubada com a K5-DUPLA, o

receptor 20PD1 não foi capaz de inibir a baixa atividade do 19BBz.

59

Figura 21: Ensaio de luciferase para validação do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A. O sinal foi avaliado após 8 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina e foi normalizado em relação à condição NEG (não estimulada).

4.7 Transdução da linhagem B16F10:

Os dados obtidos até o momento sugerem que os CARs inibitórios são

funcionais e que a utilização destes receptores juntamente com o 19BBz pode ser útil na

eliminação preferencial das células tumorais. Com o objetivo de validar este sistema in

vivo utilizaremos a linhagem murina B16F10. Esta linhagem apresenta baixa

imunogenicidade e baixa expressão de MHC de classe I, além de um grande potencial

de invasão de tecidos normais quando implantada de forma subcutânea, tornando-se um

atrativo modelo para o teste de terapias baseadas em transferência de células T. Sendo

assim, esta linhagem foi transduzida com vetores lentivirais EF1α-CD20 e/ou EF1α-

CD19-IRES-GFP codificando as proteínas alvo CD20 ou CD19 e as células positivas

foram purificadas por sorting. A figura 22 mostra que, após a purificação, foram obtidas

células com alto nível de expressão destas proteínas, todas cima de 80%.

60

Figura 22: Análise da expressão de CD19 e CD20 na linhagem B16F10 após transdução e purificação por sorting. Em A está mostrado a B16 selvagem marcada com o anticorpo αCD20-APC como controle negativo. Em B a linhagem B16 CD19, com 91% de positividade avaliada através do marcador GFP. Em C a linhagem B16 CD20, apresentando 99% de marcação utilizando o anticorpo αCD20-FITC. Em D a linhagem B16-Dupla apresentando 82% de positividade para CD19 (avaliado através de GFP) e CD20 (através de marcação com o anticorpo αCD20-APC).

4.8 Estabelecimento do modelo in vivo:

As linhagens B16 geradas através de transdução lentiviral foram injetadas por

via subcutânea em animas C57BL/6, configurando um modelo singeneico.

Primeiramente foram injetadas 3 doses diferentes de células, sendo 105, 5x105 e 106,

buscando uma maior uniformidade em relação ao aparecimento e crescimento do tumor.

A dose escolhida foi de 5x105 células para as três linhagens. A figura 23 mostra a

cinética de crescimento tumoral para as linhagens B16 CD20 (Figura 23A) e B16 CD19

(Figura 23B). Não foi possível estabelecer uma cinética para a linhagem B16 duplo-

61

positiva devido ao padrão heterogêneo de surgimento dos tumores. É importante

ressaltar que as células tumorais retêm a expressão dos antígenos alvo após passagem in

vivo (figura 24).

Figura 23: Cinética de crescimento tumoral das linhagens B16 CD20 (A) e B16 CD19 (B) injetadas por via subcutânea. Cada linha do gráfico representa um animal.

Figura 24: Marcação das linhagens B16-CD19 (A) e B16-CD20 (B) após passagem in vivo. Os tumores foram retirados, macerados e colocados em cultura. Após cinco dias as células aderentes foram marcadas com os respectivos anticorpos e analisados por citometria de fluxo.

62

A indução de um estado linfopênico no hospedeiro antes da infusão de linfócitos

T cria um ambiente proprício para a proliferação e função efetora dos mesmos, sendo

esta uma abordagem já incorporada a diversos protocolos clínicos. Este efeito está

basicamente ligado à depleção de células com atividade supressora (linfócitos T

reguladores e células mielóides supressoras) e uma menor competição por citocinas

como IL-15 e IL-7. Uma das drogas que vem sendo utilizada com este objetivo é a

ciclofosfamida, um agente alquilante que, quando usado em baixas doses, induz a

depleção de linfócitos. Para testar este regime de condicionamento no nosso modelo,

camundongos com tumores estabelecidos (entre 150-200mm3) foram tratados com

100mg/kg ou 200mg/kg de ciclofosfamida. Dois, três ou quatro dias após a

administração da droga foi avaliada a contagem de células no sangue periférico e o

percentual de células CD4+Foxp3+ (linfócitos T reguladores) no tumor, baço, linfonodo

drenante (linfonodo inguinal direito) e não drenante (linfonodo inguinal esquerdo).

Como pode ser observado na figura 25A, tanto a dose de 100mg/kg quanto a dose de

200mg/kg induziram uma profunda linfopenia, com a maior queda sendo observada

quatro dias após a administração da droga. O percentual de linfócitos T reguladores

(células FoxP3+) no compartimento de células CD4+ , que antes do tratamento os

chegam a ser mais de 20% das células CD4+ infiltradas no tumor, também apresentou

uma grande queda em todos os locais avaliados, sendo que a dose de 200mg/kg mostrou

os resultados mais expressivos (figura 25B).

Em outro experimento, realizado da mesma forma, o volume do tumor ao longo

do tempo foi medido, para assegurar que a ciclofosfamida não estava tendo um efeito

inibitório sobre o crescimento tumoral. A figura 26 mostra que as duas doses de

ciclofosfamida não são capazes de afetar o crescimento do tumor de forma significativa,

permitindo assim que o efeito dos linfócitos transferidos seja avaliado de forma precisa.

63

Figura 25: Avaliação da linfopenia (A) e percentual de células T reguladoras (Treg) (B) após administração de ciclofosfamida a animais com tumores estabelecidos. A linfopenia foi determinada através da contagem das células do sangue periférico após lise de hemácias. Em B, os órgãos foram retirados, macerados e as células marcadas com os respectivos anticorpos. Os percentuais apresentados são dentro da sub-população CD4+. Ciclo = ciclofosfamida; LN dren = linfonodo drenante; LN n-dren = linfonodo não drenante.

Figura 26: Efeito da ciclofosfamida sobre o crescimento do tumor. Animais com tumores estabelecidos (150-200mm3) foram tratados ou não (ctrl) com as doses indicadas de ciclofosfamida e o tamanho do tumor foi avaliado a cada 2-3 dias. Ciclo = ciclofosfamida.

64

5. DISCUSSÃO:

A criação de um sistema de receptores quiméricos ativadores e inibitórios capaz

de direcionar a resposta de células T especificamente contra o tumor pode encontrar

grande utilidade no campo da imunoterapia. Uma vez que a grande maioria dos

antígenos-alvo é compartilhada pelo tumor e por tecidos normais, esta abordagem

permitiria uma diminuição dos possíveis efeitos colaterais oriundos do ataque a células

não transformadas, proporcionando um aumento na eficácia do tratamento.

Os dados apresentados constituem um importante passo na validação deste

sistema. Os vetores retrovirais construídos se mostraram eficientes na transdução da

célula Jurkat, sendo possível a derivação de linhagens expressando estavelmente o CAR

19BBz e um dos CARs inibitórios. Apesar de apenas 8% das células apresentarem

marcação para o receptor 20CTLA4 através de citometria de fluxo (figura 15B), o

western blot demonstrou que este CAR está presente em altos níveis nas células (figura

16). De fato, estudos anteriores demonstraram que em linfócitos não ativados a proteína

AP-2 interage com as tirosinas não fosforiladas da cauda citoplasmática de CTLA-4 e

promove o seu redirecionamento para endossomos e lisossomos. Após ativação das

células as tirosinas são fosforiladas por proteínas como Lck e Zap-70, impedindo a

interação com AP-2 e mantendo a molécula na membrana plasmática (Shiratori, 1997).

Este fenômeno pode explicar a baixa detecção da molécula de CTLA4 nas células não

estimuladas, como observamos neste trabalho. Pretendemos analisar a expressão do

CAR de inibição baseado em CTLA4 logo após o estímulo pelo CAR de ativação para

verificar se há um aumento na expressão desta molécula na membrana.

O sistema repórter de ativação da célula T baseado na atividade de luciferase já é

bem descrito na literatura, inclusive como ferramenta para a caracterização de

65

receptores quiméricos (Schaft, 2003). Este método se mostrou rápido e eficaz, podendo

ser utilizado juntamente com outros testes in vitro capazes de atestar a ativação

antígeno-específica do linfócito, como liberação de citocinas e ensaio de citotoxicidade.

Como mostrado na figura 17, os três CARs inibitórios construídos são capazes de

impedir a translocação de NFAT para o núcleo, sugerindo que estes CARs possuem a

capacidade de inibir a ativação de linfócitos T. Além disso, esses CARs inibem o

aumento de expressão do marcador de ativação CD69 (figura 18), outra forte evidência

da funcionalidade destes receptores. Evidências na literatura apontam que as funções

inibitórias de CTLA-4, PD-1 e BTLA podem ser mediadas por fosfatases que inibiriam

eventos inicias da via de sinalização do TCR. Estudos relatados na literatura de

imunoprecipitação destas moléculas inibitórias demonstraram interação da fosfatase

SHP-1 com PD-1 e BTLA, e da fosfatase SHP-2 com CTLA-4 e PD-1 (Chemnitz,

2006). De fato, um estudo recente demonstrou que a ausência de atividade citotóxica

dos TILs em um modelo murino de adenocarcinoma é devida à superexpressão de SHP-

1 (Monu, 2007), mostrando que esta fosfatase pode ter um papel importante na

regulação da ativação de linfócitos T. No entanto, a fosfatase SHP-2 parece não ter um

efeito crucial, uma vez que células T superexpressando uma forma inativa desta

proteína apresentavam receptores CTLA4 e PD-1 funcionais (Salmond, 2005). Outra

proteína que pode estar envolvida com a atividade inibitória de receptores com motivo

ITIM (PD-1, BTLA) é o adaptador Crk. Foi demonstrado que a fosforilação deste

adaptador é crucial para a função inibitória de KIR2DL1, um receptor de células NK

com motivo ITIM (Peterson, 2008).

Uma das preocupações durante o desenho da abordagem proposta com CARs

inibitórios é o balanço entre o nível de expressão do CAR de ativação e o de inibição.

No contexto do sistema de CARs proposto, a utilização de um método de expressão

66

baseado no peptídeo 2A consiste na melhor opção. Os dados obtidos em relação à

sinalização de células NK sugerem que o balanço de sinais provenientes de diferentes

receptores define a ativação da célula (Lou, 2000). Evidências de estudos realizados in

vitro sugerem que o mesmo acontece em linfócitos T (Nurieva, 2006). Sendo assim, a

expressão dos CARs ativadores e inibitórios em níveis semelhantes pode ser crucial

para a correta função do sistema. O dado mostrado na figura 20 sugere que o peptídeo

2A não está funcional, uma vez que as células apresentam marcação para o CAR anti-

CD20 apenas quando este está posicionado antes da seqüência do 2A. O resultado do

ensaio de luciferase (figura 21) mostra uma baixa capacidade do receptor 19BBz de

induzir a translocação de NFAT para o núcleo quando comparado ao controle positivo

PMA/Ionomicina, o que pode sugerir uma baixa expressão do receptor na membrana ou

inabilidade de recrutamento das proteínas que medeiam a sinalização, sendo que estas

duas hipóteses podem ser explicadas por uma falha do sistema contendo o peptídeo 2A

em expressar corretamente os dois CARs. Além disso, após co-cultura com a K5-

DUPLA, o CAR 20PD1 não foi capaz de inibir a baixa atividade do receptor 19BBz. De

fato, um artigo publicado recentemente mostrou que seqüências que apresentam um

peptídeo sinal no N-terminal, como no caso dos CARs, podem inibir a função do 2A (de

Felipe, 2010), o que poderia explicar nossos resultados.

Um ponto importante do sistema de CARs proposto é o fenótipo induzido nos

linfócitos T após interação com os receptores. O modelo apresentado de terapia (figura

11) implica a constante estimulação do linfócito pelo receptor inibitório. Neste contexto,

diversos trabalhos vêm demonstrando o papel de moléculas inibitórias, como PD-1, na

indução de anergia (Tsushima, 2007) e exaustão funcional do linfócito (Barber, 2006), o

que poderia impossibilitar o uso destes receptores. No entanto, evidências na literatura

sugerem que estes efeitos são reversíveis. Em um modelo in vivo de indução de anergia

67

por administração de antígenos solúveis, a infusão de anticorpos agonistas α4-1BB foi

capaz de impedir e reverter o estabelecimento de anergia (Wilcox, 2004). Em outro

trabalho, o bloqueio da interação entre PD-1 e o ligante PD-L1 recuperou a função

efetora dos linfócitos previamente não responsivos (Barber, 2006). Estes dados sugerem

que o CAR 19BBz seria capaz de reverter este fenótipo e conseqüentemente ativar o

linfócito T mesmo que esta célula tenha sido previamente estimulada pelo CAR

inibitório.

Outro fenótipo que pode ser induzido é o de linfócito Treg. Em linfócitos T

reguladores humanos, a expressão de CTLA-4 foi associada a uma maior atividade

supressora e maior expressão de Foxp3 quando comparada com Tregs CD4+ CD25+

CTLA-4neg. Além disso, o bloqueio de CTLA-4 resultou em uma perda significativa da

atividade supressora, mostrando que este receptor está envolvido na função desta célula

(Birebent, 2004). Avaliaremos, portanto a presença de células CD4+/FoxP3+ na

população estimulada com ligantes dos CARs inibitórios, especialmente quando estes

ensaios forem realizados com linfócitos T primários.

Além da aplicação no tratamento de LLA, este sistema de receptores

ativadores/inibitórios poderia ser utilizado para o tratamento de diversos tipos de câncer.

Freqüentemente, ao longo do processo de transformação e aquisição de um fenótipo

indiferenciado, os tumores perdem a expressão de inúmeras proteínas, muitas delas

moléculas de membrana, enquanto o tecido normal mantém estes marcadores. Sendo

assim, a utilização de um receptor inibitório direcionado contra um antígeno não mais

expresso pelo tumor, combinado com um receptor de ativação direcionado contra um

antígeno compartilhado entre o tecido normal e o tumoral permitiria a eliminação

seletiva das células neoplásicas pelos linfócitos T. Além do teste clínico citado na

introdução, em que um paciente morreu devido o reconhecimento do antígeno no tecido

68

normal (Morgan, 2010), recentemente foi publicado um editorial reiterando a

necessidade de CARs mais seguros (Heslop, 2010). O sistema proposto neste trabalho

consiste em uma potencial solução para estes problemas. Devido à estrutura do CAR,

praticamente qualquer antígeno de membrana pode ser utilizado como alvo, bastando a

amplificação da região VH e VL de um hibridoma que produza anticorpos específicos

contra o antígeno e sua subseqüente clonagem no receptor quimérico. Esta abordagem

seletiva possibilitaria a diminuição dos efeitos nocivos decorrentes da destruição de

células normais, característica ausente na maioria dos tratamentos atuais.

Como perspectivas, iremos transduzir células primárias murinas com vetores

codificando os CARs ativadores e inibitórios e avaliar a atividade efetora destas células

após interação com as linhagens expressando os antígenos alvo. Estes linfócitos

transduzidos serão também utilizados em ensaios in vivo, onde verificaremos a

capacidade destas células de eliminar tumores estabelecidos utilizando o modelo animal

de melanoma B16F10. Além disso, iremos transduzir linfócitos humanos anti-EBV e

avaliar a função destas células in vitro através de ELISA e ensaios de citotoxicidade e in

vivo em um modelo que utiliza as células leucêmicas humanas NALM-6 em

camundongos SCID imunodeficientes.

69

6. CONCLUSÕES:

• Os CARs inibitórios 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA são eficientemente expressos

pela linhagem Jurkat.

• Os CARs inibitórios, após interação com antígeno alvo, são capazes de inibir a

translocação de NFAT para o núcleo induzida pelo CAR de ativação 19BBz em

células Jurkat.

• A expressão do marcador de ativação CD69, induzida pelo receptor 19BBz, é

diminuída após interação dos CARs inibitórios com a proteína CD20 em células

Jurkat.

• O modelo in vivo de melanoma foi estabelecido utilizando a linhagem murina

B16F10 expressando os antígenos-alvo humanos CD19 e CD20. O tratamento

dos animais possuindo tumores estabelecidos com ciclofosfamida permitiu a

indução de linfopenia e depleção de linfócitos T reguladores CD4+ Foxp3+.

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