contribuição das microdeleções/microduplicações intersticiais para

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

CONTRIBUIÇÃO DAS

MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES

INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE

DE APRENDIZAGEM NA MATEMÁTICA

ORIENTADA: Gabriela Chadid Salazar

ORIENTADORA: Profª Drª Maria Raquel Santos Carvalho

Belo Horizonte - MG

Julho de 2013

II

GABRIELA CHADID SALAZAR

CONTRIBUIÇÃO DAS

MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES

INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE

DE APRENDIZAGEM DA MATEMÁTICA

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Genética. Orientadora: Profª. Drª. Maria Raquel Santos Carvalho Universidade Federal de Minas Gerais.

Belo Horizonte - MG 2013

III

Dedico este trabalho ao meu eterno anjo

BÁRBARA CHADID SALAZAR

IV

AGRADECIMENTOS

O meu muito obrigada.

À Deus, por todas as bênçãos em minha vida e por permitir essa conquista;

À professora Dra. Maria Raquel Santos Carvalho, pela oportunidade, confiança,

apoio e principalmente a orientação e os ensinamentos para a concretização deste;

À colega de trabalho, amiga e exemplo Izinara Rosse, pela dedicação, ajuda,

explicações, correção da dissertação, por cada palavra de apoio, carinho, incentivo e

principalmente por acreditar em mim;

Aos colegas do LGHM, Pablo, Fernanda, Laura, Pedro, Luana, Paula e

principalmente Aline, pela ajuda e apoio no dia a dia. Em especial à Marlene, que desde o

primeiro dia de laboratório tanto me ajudou e apoiou, e que com suas doces palavras me

deu força nos momentos difíceis;

Aos alunos do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase pelas coletas e os testes realizados para

triagem e diagnóstico neuropsicológico das amostras. Em especial à Flávia Neves pela

ajuda na compreensão dos testes;

À todos os professores, colegas e amigos da pós-graduação pelos ensinamentos e

que de alguma forma contribuíram para o meu aprendizado. Em especial Michelle Alves,

Raiana Silva e Raphael Steinberg;

Aos colegas do LBMM em especial a Isa e Anderson e à Elisangela Monteiro e

Mariana Eduarda Lopes da Fiocruz, pela amizade e ajuda na genotipagem das amostras;

À Silvia Costa e Carla Rosenberg do Instituto de Biociências, USP, pela ajuda com a

análise do aCGH;

Aos membros da Banca Examinadora por aceitarem meu convite;

À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro;

À minha família, em especial meus pais pelo amor incondicional. À minha mãe pelo

carinho, paciência, incentivo, apoio, ajuda, por nunca me deixar desistir e por ser meu

alicerce;

À minhas amigas Rê, Lívia, Pri e Jú pelo apoio e entenderem os momentos de

ausência;

Em especial ao Thiago Romão por compartilhar cada momento difícil, pela

compreensão, paciência, incentivo e por tornar meus dias mais alegres.

V

“Nunca existiu uma grande inteligência sem uma veia de loucura.”

Aristóteles

VI

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS VIII

LISTA DE TABELAS IX

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA X

1 INTRODUÇÃO 14

1.1 A dificuldade de aprendizagem da matemática 14

1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM 15

1.1.2 Evidências para um componente genético 17

1.1.3 A DAM em síndromes genéticas 18

1.1.4 Estudos moleculares 20

1.2 Estratégia de investigação das bases genético-moleculares em

desenvolvimento pelo grupo de pesquisa 21

1.3 A técnica de MLPA 22

1.4 Justificativa e relevância 25

1.5 Objetivos 26

1.5.1 Objetivo geral 26

1.5.2 Objetivos específicos 27

2 MATERIAIS E MÉTODOS 28

2.1 Aspectos éticos 28

2.2 A amostra 28

2.2.1 Amostra ambulatorial 28

2.2.2 A amostra de base populacional 28

2.2.3 Triagem pelo TDE 29

2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva 29

2.3 Sistemática de classificação dos pacientes 31

2.4 Métodos moleculares 33

2.4.1 Extração de DNA 33

2.4.2 A técnica MLPA 33

2.4.3 Analise dos resultados 36

2.5 Confirmação dos resultados 37

3 RESULTADOS 40

3.1 Padronização da MLPA 40

3.1.2 Redução do protocolo original 40

3.1.3 Validação do kit P245-A2 41

3.2 Genotipagem por MLPA 43


3.3.1 Técnica MLPA 45

3.3.2 Técnica de array-CGH 45

VII

4 DISCUSSÃO 48

4.1 Padronização da MLPA 48

4.1.1 Avaliação do desempenho da técnica 48

4.1.2 Redução do protocolo original 48

4.1.3 Validação do kit P245-A2 49

4.2 Genotipagem por MLPA 49


4.4 Contribuição das síndromes de microdeleção para a DAM 53

5. PERSPECTIVAS 54

6. CONCLUSÕES 55

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

ANEXO 1 - APROVAÇÃO PELA COEP/UFMG 61

ANEXO 2 - TCLE 63

ANEXO 3 - PROTOCOLO ADAPTADO PARA A TÉCNICA DE MLPA 67

VIII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo 15

Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas 16

Figura 3 - Redes de interação 17

Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA 23

Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA 23

Figura 6 - Etapa de ligação da MLPA 23

Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA 24

Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA 24

Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo 32

Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos 36

Figura 11 - Gráficos de padronização da técnica de MLPA 41

Figura 12 - Gráfico de validação da MLPA com controles positivos do kit P245-A2 42

Figura 13 - Gráfico de validação da MLPA com os controles internos 43

Figura 14 - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat 44

Figura 15 - Ideograma do cromossoma 5 46

Figura 16 - Gráficos para confirmação da deleção do indivíduo 2761 46

Figura 17 - aCGH para confirmação da deleção do indivíduo 2761 47

Figura 18 - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5 51

Figura 19 - Imagem do gene CLPTM1L e sonda do kit SALSA MLPA P245-A2 52

IX

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados 30

Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados 30

Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2 34

Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1 38

Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2 39

Tabela 6 - Descrição das sondas da síndrome Cri du Chat dos kits de MLPA 44

X

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA

aCGH Array-Based Comparative Genomic Hybridization

APA American Psichiatric Association

CCDC127 Coiled-Coil Domain Containing 127

CID Classificação Internacional Das Doenças

CLPTM1L Cleft Lip and Palate Transmembrane Protein 1-Like

COEP Comitê de Ética em Pesquisa

CRR9 Cisplatin Resistance-Related 9

DAM Dificuldade de Aprendizagem da Matemática

DD Fragmentos de Controle de Desnaturação de DNA (MLPA)

DI Deficiência Intelectual

DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th

DNA Desoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico)

DNAH5 Dynein, Axonemal, Heavy Chain 5

DQ Fragmentos de Controle de Quantidade de DNA (MLPA)

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

FISH Fluorescence In Situ Hybridization

FMR1 Fragil X Mental Retardation

GWAS Genome Wide Association Study

Kb Kilobases

LGHM Laboratório de Genética Humana e Médica

Mb Milhões de Pares De Bases

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI National Center for Biotechnology Information

NSD1 Nuclear receptor binding SET Domain protein 1

ng Nanograma

NGRL National Genetics Reference Laboratory

nm Nanomol

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man

pb Pares de Base

PCR Polymerase Chain Reaction

QI Quociente de Inteligência

qPCR PCR quantitativa

SEMA5A Semaphorin-5A

SNP Single Nucleotide Polymorphisms

SVCF Síndrome Velocardiofacial

XI

SWB Síndrome de Williams-Beuren

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TDE Teste de Desempenho Escolar

TE Tris-EDTA

TERT Telomerase Reverse Transcriptase

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

λ Lambda

μL Microlitros

XII

RESUMO

A dificuldade de aprendizagem da Matemática (DAM) é um transtorno cognitivo que afeta as

habilidades aritméticas em cerca de 7% das crianças em idade escolar. Os impactos

decorrentes do fracasso escolar na Matemática podem repercutir na autoestima, na

empregabilidade e na renda. A DAM pode ser causada por fatores ambientais, como baixo

nível sócio-econômico, má qualidade do ensino, deficiência intelectual, embriopatia fetal

alcoólica, entre outros. Entretanto, há casos nos quais nenhuma outra etiologia ambiental

pode ser identificada. Em função disto, sugere-se etiologia genética, multifatorial e

heterogênea. Uma evidência de heterogeneidade vem do surgimento da DAM como

endofenótipo de várias síndromes de microdeleções, como Síndrome de Velocardiofacial,

Síndrome de Tuner, Síndrome do X frágil, Síndrome de Williams, Síndrome NF1, Síndrome

de Sotos, entre outras. Há poucos estudos investigando a contribuição dessas e outras

síndromes para o fenótipo DAM. Este é um estudo de base populacional, caso-controle, com

o objetivo de averiguar a frequência de microdeleções/microduplicações intertisciais em

crianças de idade escolar com DAM. A pesquisa foi previamente aprovada pela

COEP/UFMG. A amostragem foi feita em duas etapas.A primeira, de rastreio, foi feita com o

Teste de Desempenho Escolar (TDE) e teste de transcodificação numérica, aplicados em

grupo na sala de aula. A segunda etapa foi uma testagem neuropsicológica completa. A

amostra foi composta pelos grupos: Controle Normal Testado, (com TDE e toda a testagem

neuropsicológica normal), DAM (TDE<P25 e QI>P15) e Controle Positivo (previamente

diagnosticados com alguma das síndromes detectadas pelo kit de MLPA usado, mas não

submetidos a testagem neuropsicológica). A extração do DNA foi realizada a partir de

sangue periférico ou saliva, no Laboratório de Genética Humana e Médica da UFMG.Todas

as crianças foram genotipadas com o kit SALSA MLPA P245-A2. Uma criança, cujos

resultados foram alterados com este kit, foi também testada com os kit SALSA MLPA P070

e SALSA MLPA P245-B1 e pela técnica de hibridização genômica comparativa baseada em

microarranjos (aCGH) com um chip de 60K. Não foram identificadas alterações entre os 90

controles normais testados. Entre os 90 indivíduos com DAM, foi detectada uma

microdeleção do cromossoma 5p, detectada pela sonda CLPTM1L. Uma outra sonda do

cromossoma 5 presente no kit SALSA MLPA P245-A2 (TERT) assim como os demais

métodos usados para confirmar e/ou avaliar a extensão desta deleção apresentaram

resultados normais. Entretanto, nenhum destes métodos apresenta sondas se sobrepondo

exatamente com a região da sonda CLPTM1L. Consequentemente, pode se tratar de uma

deleção pequena ou de um artefato. Se confirmada, trata-se de uma microdeleção entre 70

bp (o tamanho da sonda usada na MLPA) e 70 kb (a distância entre os fragmentos com sinal

positivo no aCGH). Os resultados relatados aqui, ou seja, uma frequência de 0/90

microdeleções intersticiais entre os indivíduos com DAM(ou 1/90, caso se confirme a

microdeleção em 5p), sugerem que o conjunto de síndromes de microdeleção detectadas

pelo kit SALSA MLPA P245-A2 (incluindo as síndromes Velocardiofacial, de Tuner, de

Williams, da neurofibromatose tipo 1, de Sotos, entre outras) não sejam etiologia frequente

da dificuldade de aprendizagem da Matemática não-sindrômica.

Palavras chave: genética, dificuldade de aprendizagem, dificuldade de aprendizagem da

Matemática, discalculia do desenvolvimento, microdeleção intersticial, MLPA.

XIII

ABSTRACT

Mathematical learning disability (MLD) is a disorder that affects arithmetic cognitive abilities

in about 7% of school-age children. The impacts of failure in mathematics can affect self-

esteem, employability and income. The DAM can be caused by environmental factors such

as low social and economical status, poor quality of education, intellectual disabilities, and

fetal alcohol embryopathy, among others. However, there are cases in which no

environmental etiology can be identified. Because of this, a multifactorial and heterogeneous

etiologyhas been suggested. Evidence of heterogeneity comes from the emergence of MLD

as endophenotype of several microdeletion Syndromes, such Velocardiofacial Syndrome,

Tuner Syndrome, Fragile X Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos

Syndrome, among others. There are few studies investigating the contribution of these and

other syndromes for MLD phenotype. This study is a population based, case-control, aiming

to ascertain the frequency of interstitial microdeletions/microduplications in school-age

children with MLD. This study was approved by the Ethics in Research Committee of the

Universidade Federal de Minas Gerais. Sampling was done in two stages. The first one was

a school achievement test (TDE) and a numerical transcoding test. The second stage of

sampling was a complete neuropsychological testing. The sample was composed by three

groups: Normal controls (children with both normal school development and

neuropsychological tests), MLD (children with TDE<P25 and IQ>P15) and Positive Control

(children, who have been previously diagnosed with any of the syndromes detected by the kit

used in MLPA. These children were not submitted to neuropsychological tests). DNA

extraction was performed from peripheral blood or saliva. All children were genotyped with

the SALSA MLPA kit P245-A2. One child, whose results with this MLPA kit were abnormal,

was also tested using the kit SALSA MLPA P070, SALSA MLPA P245-B1, and an array-

based comparative genomic hybridization (aCGH), with a 60K chip. No molecular changes

were identified among 90 normal controls tested. Among the 90 individuals with MLD, one

child presented a chromosome 5p microdeletion detected by the probe CLPTM1L. Another

probe mapping to 5p TERT, produced normal results, as well as the kit SALSA MLPA P070,

SALSA MLPA P245-B1, and the 60K aCGH. However, none of these methods provides

probe exactly the same region as SALSA MLPA kit P245-A2. Therefore, the deletion

detected by CLPTM1L probe may be a small deletion or an artifact of the technique. If

confirmed, this microdeletion pans less than 70 kb according to aCGH results. The results

reported here, a frequency of 0/90 interstitial microdeletions among individuals with MLD (or

1/90, considering the putative chromosome 5p microdeletion), suggest that the group of

interstitial microdeletion syndromes detected by SALSA MLPA kit P245-A2 (which includes

Velocardiofacial Syndrome, Tuner Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos

Syndrome, among others) are not common etiologies of the non-syndromic MLD.

Key words: genetics, learning disability, Math learning disability, developmental dyscalculia,

interstitial microdeletion, MLPA.

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 A dificuldade de aprendizagem da matemática

As dificuldades de aprendizagem afetam cerca de 10% da população e possuem um

papel fundamental nos resultados dos processos educacionais (BUTTERWORTH & KOVAS,

2013). Essa manifestação pode ser definida como “uma desordem em um ou mais processo

psicológicos básicos envolvidos na compreensão ou no uso da linguagem, falada ou escrita,

que pode manifestar-se em uma habilidade incompleta para ouvir, pensar, falar, ler,

escrever, soletrar, ou fazer cálculos matemáticos” (FEDERAL REGISTER US, 1999).

Dentre as desordens de aprendizagem mais comuns, está a dificuldade de

aprendizagem na matemática (DAM), com uma frequência que varia de 3,5 a 6,5 % entre as

crianças em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA

et al., 2004).

Apesar das divergências quanto a sua definição, de acordo com o Diagnostic and

Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition (DSM-IV, APA; 1994), a DAM é definida

pela diferença entre o resultado dos testes de desempenho na Matemática e o desempenho

esperado baseado na idade, inteligência e anos de escolarização. Entretanto, devem-se

utilizar testes padronizados para a população em estudo, pois através dessa avaliação, é

possível observar se o aluno está abaixo de um ponto de corte em relação a seus pares.

A DAM pode ocorrer em função de diversos fatores, como carências nutricionais ou

socioeconômicas de maneira geral, baixa qualidade do ensino, exposição a agentes

teratogênicos, como o álcool, déficits sensório-motor, prematuridade e gemelaridade.

Entretanto, há indivíduos com DAM nos quais os sintomas não podem ser atribuídos a

quaisquer destes fatores (SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; BUTTERWORTH, 2005). Estes

indivíduos apresentam múltiplos déficits cognitivos, afetando as funções necessárias à

aquisição da Matemática (déficit de senso numérico, estimação de magnitude simbólica e

não simbólica, subtizing, orientação especial etc). Por esses motivos essa desordem é

classificada, por diversos autores, como um transtorno de aprendizagem heterogêneo

(GEARY, 1993; MAZZOCO & MYERS, 2003; BUTTERWORTH, 2005; RUBINSTEN &

HENIK, 2009).

Considerando a heterogeneidade etiológica da DAM e sua natureza multifatorial, foi

proposta a existência de substratos neurais distintos responsáveis pelos processamentos

dos números. Dessa forma, alterações em uma ou mais redes neurais podem contribuir para

os diferentes fenótipos de déficits cognitivos (RUBINSTEN & HENIK, 2009).

Diversos estudos sobre o desenvolvimento cognitivo mostraram que essas crianças

poderiam deixar de atingir padrões aceitáveis em importantes áreas do currículo, como a

15

alfabetização e aritmética (BUTTERWORTH, 2005). O fracasso escolar na Matemática pode

gerar perda da autoestima, afetar na empregabilidade e na renda do indivíduo (JORDAN &

LEVINE, 2009).

1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM

Com o objetivo de explicar os mecanismos de cognição relacionados ao aprendizado

da Matemática, foram propostos os modelos neuro-cognitivos, Esses modelos são

importantes também porque permitem construir uma ponte entre o nível

genético/neurobiológico e a expressão comportamental (HAASE, WOOD & WILMES, 2010).

O Modelo do Código Triplo, desenvolvido por Dehaene (1992), é considerado o mais

influente e validado para a compreensão da cognição matemática (DEHAENE & COHEN,

1995). Esse modelo prevê a existência de três sistemas interligados de representação

mental numérica: duas formas de representação simbólica – a representação numérica

visual arábica (ex: 3) e a representação numérica verbal (ex: três) e uma representação

analógica, aproximativa e não simbólica (ex: •••), conforme demonstrado na figura 1.

Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo

Legenda - Modelo neurocognitivo do código triplo, com os três sistemas de representação mental numérica interligados: duas formas de representação simbólica – a representação numérica visual arábica e a representação numérica verbal e uma representação analógica não simbólica

Fonte: adaptado de Dehaene, 1992.

CÓDIGO VISUAL-ARÁBICO

3

CATEGORIAS DE REPRESENTAÇÃO MENTAL

CÓDIGO DE MAGNITUDE

•••

CÓDIGO VERBAL

TRÊS

16

Outro modelo é a Hipótese de Genes Generalistas, que pressupõe que o conjunto

dos traços cognitivos que fazem parte do fenótipo DAM seja poligênico. Neste caso, a

maioria dos genes seria expressa por toda a extensão cerebral e não apenas em uma região

específica. Além disso, esses genes poderiam ser modulados por mecanismos como a

pleiotropia e epistasia (KOVAS & PLOMIM, 2006) (Figura 2).

Um modelo etiológico geral interessante foi proposto recentemente por Butterworth &

Kovas (2013). Este modelo busca integrar os níveis genéticos, neurais, cognitivo, e

comportamental. Nesta rede de interação, pode haver diversos tipos de relações entre os

níveis. Assim, um processo cognitivo de domínio geral e um processo cognitivo de núcleo

específico podem ter efeitos sobre mais de um teste comportamental, e o desempenho no

teste comportamental pode ser afetado por mais de um processo cognitivo. Além disso, um

processo cognitivo pode depender do outro (por exemplo, a memória na atenção), e um

comportamento pode causar efeito em outro (por exemplo, uma deficiência na interpretação

da leitura pode prejudicar a resolução de problemas matemáticos) (Figura 3).

A hipótese de um componente genético tem motivado uma séria de estudos

investigando as bases genéticas da DAM.

Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas

Legenda - Contraste das três hipóteses dos mecanismos de efeitos de um único gene no cérebro, associado a diversos processos cognitivos (pleiotropia). Esta imagem pode ser estendida através da substituição do único gene por múltiplos genes, para ilustrar o efeito poligênico.

Fonte – adaptado de Kovas & Plomim, 2006

17

Figura 3 - Redes de interação

Legenda – Modelo esquemático das relações entre os níveis de explicação (genético, neural, cognitivo e comportamental) seguindo a rede de modelo causal.

Fonte: Adaptado de Butterworth & Kovas, 2013

1.1.2 Evidências para um componente genético

Uma das principais abordagens utilizadas para a investigação de fenótipos

complexos quando se desconhece a etiologia, é o estudo de agregação familiar (WILLCUTT

et al., 2010). A agregação familiar pode surgir devido ao compartilhamento de genes e de

fatores ambientais entre membros da família (FEITOSA & KRIEGER, 2002). Por exemplo,

através da estimativa do risco relativo, lambda (λ), é possível relacionar a frequência de

afetados nas famílias com o grau de parentesco e comparar a frequência do fenótipo na

população em geral. Quanto maior for o valor de λ, maior é a agregação familiar, sugerindo

um componente genético (BURTON, TOBIN & HOPPER, 2005). Agregação familiar tem sido

descrita para a DAM em diversas populações e condições socioeconômicas, o que sugere

um componente genético (BADIAN, 1983; GROSS-TSUR et al., 1996; SHALEV, 2000;

BUTTERWORTH, 2005; MIRANDA, 2011).

18

Outra abordagem utilizada são os estudos com pares de gêmeos monozigóticos e

dizigóticos. Esses estudos permitem separar fatores genéticos e ambientais responsáveis

por doenças em humanos. Através da comparação de gêmeos monozigóticos criados em

um mesmo ambiente ou em ambiente diferente é possível avaliar o efeito ambiental. Por

outro lado, a comparação da frequência do fenótipo entre gêmeos monozigóticos e

dizigóticos permite estimar a contribuição genética para o fenótipo (WILLCUTT et al., 2010).

Os estudos de gêmeos com DAM mostraram haver tanto influência genética quanto

ambiental, levando a proposição de um modelo de herança multifatorial (ALARCON et al.,

1997; RUBINSTEN & HENIK, 2009; KOVAS et al., 2007).

1.1.3 A DAM em síndromes genéticas

A compreensão dos mecanismos cognitivos subjacentes, que levam à DAM pode ser

reforçada pelo estudo de síndromes genéticas e/ou ambientais associadas a um

desempenho ruim em Matemática, tais como, a Síndrome Fetal Alcoólica, Síndrome do X-

frágil, Síndrome de Turner, a Neurofibromatose Tipo 1, Síndrome de Sotos, Síndrome de

Williams-Beuren (SWB), Síndrome do Velocardiofacial (SVCF), Síndrome de Prader-

Willi/Angelman, Síndrome de Gerstmann (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH,

1996; SOTOS, 1997; MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006;

SEMENZA et al., 2008; DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009).

A síndrome fetal alcoólica é resultante do uso do álcool durante a gravidez. A

exposição do feto ao álcool durante o período pré-natal pode comprometer o

desenvolvimento cerebral e desencadear prejuízos nas habilidades numéricas, o que gera

atraso na aprendizagem da Matemática, além de problemas comportamentais (KOPERA-

FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; KODITUWAKKU, 2010).

Síndrome de Sotos pode ser causada por uma mutação de ponto ou deleção no

gene NSD1 localizado na região 5q35. É caracterizada, dentre outros fatores, pelo

crescimento excessivo durante a infância, macrocefalia e pode apresentar diferentes graus

de dificuldade de aprendizagem. Além disso, podem ser observados atrasos no

desenvolvimento cognitivo e motor, mais especificamente déficits na linguagem e

Matemática e também problemas de coordenação motora visual (SOTOS, 1997; BAUJAT &

CORMIER-DAIRE, 2007).

Síndrome do X frágil é conhecida como a mais comum causa hereditária de retardo

mental e dificuldade de aprendizagem ocorrendo em aproximadamente 1:4.000 nascido-

vivos. É caracterizada pela mutação do gene FMR1, localizado no cromossoma X e

mulheres portadoras dessa síndrome apresentam maior dificuldade de aprendizagem na

Matemática, quando comparada à leitura e escrita. Além disso, apresentam um

19

desempenho fraco em tarefas de rotação visual mental, mas não em todas as áreas de

desempenho de habilidades visos-espaciais (MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006;

MURPHY & MAZZOCCO, 2008)

A Síndrome de Turner é causada pela perda total ou parcial de um dos

cromossomas X e ocorre em aproximadamente 1:1900 mulheres nascidas vivas. Embora

tenham inteligência normal, os indivíduos tendem a apresentar desempenho relativamente

mais baixo na Matemática, além disso, podem apresentar déficit de atenção e viso-espacial

(MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; MURPHY & MAZZOCCO, 2008).

A Neurofibromatose tipo 1 (NF1) é causada por uma mutação de um único gene no

cromossoma 17 e pode ocorrer esporadicamente ou de forma familiar. É uma das mais

comuns desordens de gene único que conduz a alterações do sistema nervoso central. A

prevalência da NF1 é de aproximadamente 1:4.000 nascido-vivos e a dificuldade de

aprendizagem é relatada em cerca de 30% a 56% dos indivíduos afetados. A NF1 tem sido

descrita como uma desordem não verbal com base nas dificuldades visos-espaciais e viso-

motoras. São relatados déficits na Matemática, escrita e linguagem (MAZZOCCO et al.,

1995; MAZZOCCO, 2001).

A SWB é causada por uma microdeleção em 7q11.23, uma região contendo

aproximadamente 28 genes. Trata-se de uma doença genética rara, que ocorre em

aproximadamente 1:10.000 nascido-vivos (STRØMME, BJØRNSTAD & RAMSTAD, 2002).

Suas características clínicas incluem várias anormalidades físicas, acompanhadas de DI

leve a moderada e um perfil de personalidade específica. Os indivíduos afetados mantêm

preservadas as habilidades de linguagem, apesar do déficit no processamento numérico e

viso-espacial (PATERSON et al., 2006; O’HEARN & LUNA, 2009).

A SVCF resulta de uma microdeleção na região 22q11.2. É considerada a mais

comum síndrome de microdeleção com uma prevalência de aproximadamente 1:6.000

nascido-vivos (DeSMEDT et al., 2009). Os indivíduos afetados frequentemente apresentam

dificuldade de aprendizagem, sendo relatado o desempenho melhor na leitura e escrita do

que na aritmética (WANG et al., 2000). Além disso, podem apresentar deficiência na

representação de magnitude (DeSMEDT et al., 2007)

As síndromes de Prader-Willi e Angelman podem ser causadas pela mesma deleção

na região 15q11-q13. Os efeitos são dependentes da origem parental do cromossoma

deletado. Na Síndrome de Prader-Willi, a grande maioria dos casos é devida à deleção no

cromossoma de origem paterna. Na Síndrome de Angelman, a etiologia é mais complexa,

podendo envolver deleção do cromossoma de origem materna (70-75% dos casos),

dissomia uniparental materna do cromossoma 15 (20-25%), ou um defeito no centro de

impressão genômica (2%) (BUTLER E THOMPSON, 2000). Ela tem uma prevalência

estimada em cerca de 1:8000-1:16,000 nascido-vivos. Todos os pacientes sofrem algum

20

grau de comprometimento intelectual. Há relatos de dificuldades desproporcionais com

tarefas matemáticas (BERTELLA et al. 2005; SEMENZA et al., 2008).

A Síndrome de Gerstmann é um transtorno do desenvolvimento ou adquirido,

causado pela lesão do giro angular esquerdo. Os indivíduos afetados apresentam déficits

em quatro domínios funcionais distintos: cálculo, escrita, agnosia digital e orientação

esquerdo-direita (RUSCONI et al., 2009).

Considerando o fato de que a dificuldade da aprendizagem da Matemática faz parte

do fenótipo cognitivo de diversas doenças genéticas, surgiram estudos com o objetivo de

investigar as bases moleculares da DAM.

1.1.4 Estudos moleculares

Compreender a etiologia da habilidade e da dificuldade da Matemática se pode

revelar um passo essencial na luta contra o fracasso matemático, e, além disso, fornecer

novos insights sobre o funcionamento do cérebro humano (DOCHERTY et al., 2009).

O único estudo recente de associação do genoma completo (genome wide

association study, GWAS) desenvolvido até o momento para habilidades e dificuldades

matemáticas, detectou 10 polimorfismos de nucleotídeos únicos (single nucleotide

polymorphism; SNPs) significativamente associados com o desempenho na Matemática em

uma amostra de 2356 pares de gêmeos. Esses SNPs, quando combinados, foram

responsáveis por 2,9% da variância fenotípica, sugerindo que as influências genéticas para

as habilidades e dificuldades na Matemática sejam causadas por múltiplos loci de

características quantitativas de pequenos efeitos através de um espectro de habilidades

(DOCHERTY et al., 2010). Quatro dos dez SNPs de maior significância estatística,

encontrados nesse estudo, foram localizados nos genes DNAH5 (dynein, axonemal, heavy

chain 5), NRCAM (neuronal cell adhesion molecule), MMP7 (matrix metaloproteinases) e

GRIK1 (receptor de glutamate ionotropic kainate 1). Estes genes se expressam no período

do desenvolvimento e atuam nos processos de reparo de tecidos, distribuição celular e na

formação das estruturas do sistema nervoso. Desse modo, podem contribuir como genes

candidatos para as habilidades e dificuldades matemáticas. No entanto, seria necessário

para confirmar estes achados, o sequenciamento das regiões exônicas, intrônicas, dos sítios

de splicing, elementos regulatórios e sítios de ligação de moléculas de interesse, na busca

de variantes causais, e estudos de expressão em nível de RNA e proteína.

Dessa forma, vemos a necessidade de novos estudos a fim de identificar os genes

ou variações genômicas envolvidas na DAM.

21

1.2 Estratégia de investigação das bases genético-moleculares em

desenvolvimento pelo grupo de pesquisa

Com o objetivo de investigar as bases moleculares da DAM estão sendo

desenvolvidos alguns trabalhos pelo nosso grupo de pesquisa.

Vianna (2011) avaliou a contribuição das microdeleções/microduplicações em

22q11.2 para o fenótipo DAM. Foram genotipadas, com a técnica de Amplificação de

Múltiplas Sondas Dependente de Ligação (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification;

MLPA) 82 crianças com DAM e 130 controles normais, testados, pareados por sexo, idade e

turma, da população escolar de Belo Horizonte. Foi observada uma frequência de

microdeleções de 1:82 indivíduos com DAM/DAME sugerindo a SD22q11.2 como a etiologia

genética mais comum identificada até o momento para dificuldade de aprendizado da

Matemática.

Miranda (2011), com o objetivo de investigar as bases genéticas da DAM, avaliou a

história familiar de 34 crianças com DAM e 24 controles normais da amostra referida no

parágrafo anterior. Foi encontrado agregação familiar e alguns heredogramas foram

compatíveis com herança autossômica dominante com penetrância incompleta, outros com

herança recessiva ligada ao cromossoma X. Em outros, ainda, havia apenas um afetado,

não sendo possível inferir padrão de herança.

Atualmente, está sendo desenvolvido um projeto pela mestranda Aline Aparecida

Martins com o objetivo de analisar a frequência de pré-mutação e mutações completas,

caudadas pela expansão do trinucleotídeo CGG na 5’UTR do gene FMR1 em indivíduos que

apresentam DAM. Serão utilizados três métodos de diagnóstico, que foram selecionados

com o intuito de que, juntos, fossem confiáveis e pouco onerosos e permitissem detectar

mesmo alelos com expansão completa e fora da faixa de amplificação da PCR (Polymerase

Chain Reaction) convencional. O primeiro método é baseado em uma PCR gene-específica,

e permite identificar o alelo normal. O segundo método é uma tri-primer PCR, e permite a

detecção dos alelos expandidos. O terceiro e último método é uma análise de metilação

baseada em real-time PCR através do uso de TaqMan, que permite inferir o padrão

expressão do gene FMR1 e é importante para a confirmação diagnóstica em meninos,

quando as duas PCRs descritas acima não gerarem amplificação.

As evidências apresentadas acima, em conjunto, sugerem que a DAM apresente

uma base genética heterogênea. Neste trabalho, optamos por investigar a contribuição das

síndromes de microdeleções/microduplicações intersticiais para o fenótipo DAM, através da

MLPA.

22

1.3 A técnica de MLPA

A técnica denominada MLPA é um método sensível, econômico, rápido e simples.

Através da MLPA, é possível estudar mais de 50 sequências de ácidos nucléicos em uma

única reação de PCR e assim detectar, simultaneamente, microdeleções e microduplicações

de diversos genes ou mutações de ponto já conhecidas (SCHOUTEN et al., 2002;

SØRENSEN et al., 2008).

A MLPA foi descrita inicialmente por Schouten et al. (2002) e posteriormente

comercializada pela empresa holandesa MRC-Holland. A técnica descrita é constituída por

quatro passos: desnaturação, hibridização do DNA, reação de ligação, amplificação por

PCR. E para interpretação dos resultados ainda são realizadas as etapas de separação dos

produtos por eletroforese capilar e a análise dos dados pro programas específicos

(SCHOUTEN et al., 2002)..

Inicialmente, a amostra de DNA é desnaturada e em seguida hibridizada a uma

mistura de sondas específicas para cada região. Cada sonda é formada por dois

oligonucleotídeos sintéticos, que são contíguos ao se anelarem ao DNA. Esses

oligonucleotídeos são compostos por três regiões: uma que se anela ao segmento de DNA

de interesse, um segmento espaçador, que não possui homologia com o DNA alvo, e uma

cauda de M13 (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005) (Figura 4).

O oligonucleotídeo A tem tamanho variável de 50-60 pb e contém um marcador

fluorescente (para reconhecimento à eletroforese capilar), seguido de uma sequência

homóloga ao primer universal X (correspondendo à região pela qual esses primers

universais serão anelados, posteriormente) (em preto; Figura 4 ), além da sequência de

hibridização homóloga ao DNA alvo (em azul; Figura 4).

O oligonucleotídeo B, com tamanho variável entre 60-450 pb, contém um fragmento

homólogo ao primer universal Y (em cinza, Figura 4), seguido de uma sequência-coringa

(com extensão diferente para cada sonda, o que definirá o tamanho do fragmento final) (em

laranja, Figura 4) e também a sequência de hibridização homóloga ao DNA-alvo (em azul,

Figura 4).

Esses oligonucleotídeos, ao serem submetidos à temperatura de anelamento,

hibridizam-se a sequências complementares no DNA alvo e, em seguida, são unidos por

uma enzima DNA-ligase termoestável, formando um único fragmento (Figura 5)

(SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

Como resultado da reação de ligação, são obtidos fragmentos únicos, dispostos da

seguinte forma: fluoróforo – região de ligação ao primer universal – sequência complementar

ao DNA alvo – sequência coringa – região de ligação ao primer universal (Figura 6)

(SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

23

Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA

Legenda- Oligo A, em verde o marcador fluorescente seguido de uma sequência homóloga ao primer universal X em preto e de azul a sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo; Oligo B, em cinza o fragmento homólogo ao primer universal Y, seguido de uma sequência-coringa em laranja, com extensão diferente para cada sonda, e também possui uma sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo em azul

Fonte: Modificado de Willis et al., 2012

Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA

Legenda: Anelamento dos oligonucleotídeos na sequência de DNA e posterior ligação pela enzima DNA-ligase dependente de temperatura


Figura 6 - Fragmento único resultado da reação de ligação da MLPA

Legenda - Disposição do fragmento único resultado da reação de ligação, intermediada pela enzima ligase


24

Em seguida, inicia-se a fase de amplificação. Nessa etapa, os fragmentos formados

pelas duas sondas, agora unidas, são amplificados por PCR, utilizando-se o par de primers

universais, que se anelam às sequências não homólogas, situadas nas duas extremidades

dos produtos de ligação (Figura 7) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

Ao final da MLPA, os produtos amplificados são separados e visualizados em

eletroforese capilar (SCHOUTEN et al., 2002). A interpretação dos resultados é feita

comparando-se os picos obtidos nos eletroferogramas dos pacientes aos picos dos

controles, usando-se programas específicos para análise de dados de genotipagem ou

planilhas específicas, sendo possível a quantificação relativa ao número de cópias gênicas

(Figura 8) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA

Figura 7 - Resultado da amplificação de diferentes produtos de ligação, através de PCR, com a utilização de primers universais


Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA

Legenda – Exemplo da imagem dos picos do eletroferograma obtidos para um indivíduo, produzida com o Software GeneMarker . As setas indicam os picos alterados do individuo avaliado (em azul) quando comparado à média do pico dos controles (em vermelho).

Fonte: Adaptado de Softgenetics

25

A técnica de MLPA possui algumas vantagens em relação a outras metodologias já

utilizadas para detecção de alterações genômicas. Dentre elas, destacam-se: baixo custo,

alto rendimento, simplicidade e facilidade de operação, rapidez, reprodutibilidade e

sensibilidade. Além disso, o método não requer exame dos pais, pois a detecção de

deleções e duplicações é feita baseada em um sistema de controles internos (SCHOUTEN

et al., 2002; ROOMS et al., 2005).

Diversos estudos de investigação de microdeleções/microduplicações, usando a

técnica de MLPA, tiveram resultados similares àqueles baseados em outros métodos, como

PCR quantitativa (qPCR) ou hibridização genômica comparativa baseada em microarranjos

(array-based comparative genomic hybridization - aCGH) (KOOLEN et al., 2004; LAM et al.,

2006; ROOMS et al., 2006).

Um estudo com MLPA analisando 258 indivíduos com deficiência intelectual, que

apresentavam cariótipo convencional normal, identificou alterações cromossômicas em

5,8% dos casos. Entre esses pacientes, 10 apresentaram as síndromes de deleção 1p36,

deleção 22q11, síndromes de Angelman/Prader-Willi, Miller- Dieker, Smith-Magenis, Sotos e

Williams-Beurens, e outros cinco tinham duplicações. Tais resultados são indicativos de que

a técnica de MLPA quando utilizada para identificação de alterações específicas, pode ser

uma ferramenta importante na investigação diagnóstica inicial (KIRCHHOFF et al., 2006).

Outras técnicas, como o a-CGH, seguramente podem aumentar a detecção de

anomalias, mas devido ao seu alto custo, a técnica de MLPA se apresenta como a melhor

alternativa disponível na triagem de microdeleções/microduplicações (AHN et al., 2007).

1.4 Justificativa e relevância

Classificada por diversos autores como uma síndrome genética (GEARY, 1993;

RUBINSTEN & HENIK, 2009), a DAM é uma desordem que merece atenção, pois afeta

cerca de 7% das crianças e adolescentes em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV &

GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA et al., 2004). Até o momento, não se sabe ao certo quais

os genes e os mecanismo moleculares envolvidos na etiologia da doença. Compreender a

heterogeneidade genética da DAM é importante para estimar a contribuição dos diversos

fatores de risco. Além disso, os perfis encontrados podem ser úteis no auxílio de equipes

interdisciplinares para delineamento de estratégias de reabilitação dessas crianças e para o

aconselhamento genético.

O diagnóstico etiológico precoce da DAM é importante para fornecer intervenções

eficazes, como programas de reabilitação, e até mesmo para um planejamento mais

adequado do processo educativo. Além disso, permitiria aos indivíduos um

acompanhamento multidisciplinar, que pode proporcionar-lhes um impacto positivo nas

26

habilidades matemáticas e contribuir para elevar a autoestima das crianças

(BUTTERWORTH e YEO, 2004; GERSTEN, JORDAN & FLOJO, 2005).

O método de MLPA tem sido amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa e de

diagnóstico, por ser uma técnica de baixo custo, simples, rápida, sensível e de fácil

operação (SHEN, 2009). Além disso, é possível detectar tanto deleções quanto duplicações

de até 50 sequências de DNA em um único ensaio (SCHOUTEN et al., 2002; SØRENSEN

et al., 2008). Sendo assim, a MLPA pode ser considerada a técnica de melhor custo-

benefício para a identificação de alterações cromossômicas numa triagem inicial, quando

não há uma suspeita clínica específica.

Por se tratar de uma condição frequentemente encontrada na população, alguns

estudos vêm sendo realizados a fim de compreender as bases genéticas da DAM. Há

trabalhos relacionando a associação entre síndromes genéticas e as dificuldades de

aprendizagem (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; SOTOS, 1997;

MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006; SEMENZA et al., 2008;

DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009). Entretanto, nenhum deles investigou a

frequência das síndromes de microdeleção/microduplicação, que se associam a DAM, entre

indivíduos averiguados com dificuldade de aprendizagem da Matemática.

Os relatos quanto à etiologia indicam que pode haver ao menos duas formas de

DAM, uma associada a síndromes ambientais ou genéticas e outra forma etiológica é

relacionada a mecanismos multifatoriais, havendo interação de pequenos efeitos de

múltiplos genes com fatores ambientais (HAASE et al, 2012).

A principal hipótese desse projeto é de que na amostra de crianças com DAM pode

haver casos causados pelas síndromes mencionadas acima. Neste caso, o transtorno de

aprendizagem da Matemática constitui parte do fenótipo ampliado das síndromes genéticas.

As síndromes de microdeleção/microduplicação intersticial foram selecionadas para análise

porque constituem o grupo das síndromes mais frequentes na população e que apresentam

dificuldades relativamente específicas de aprendizagem da Matemática como parte do

fenótipo (Velocardiofacial/DiGeorge, Williams-Beuren, Prader-Willi/Angelman, Sotos,

Neurofibromatose tipo 1).

1.5 Objetivos

1.5.1 Objetivo geral

Averiguar, através da MLPA, a frequência de microdeleções/microduplicações

intersticiais em crianças de idade escolar com dificuldade de aprendizagem na Matemática.

27

1.5.2 Objetivos específicos

Padronizar a técnica MLPA;

Validar do kit SALSA MLPA P245-A2;

Genotipar crianças de idade escolar com DAM e controles;

Analisar os resultados através do programa GeneMarker;

Calcular a frequência de microdeleção/microduplicação intersticiais em ambas as

amostras;

Confirmar as microdeleções/microduplicações encontradas.

28

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Aspectos éticos

Este trabalho é parte de dois projetos de pesquisa intitulados: “Discalculia do

Desenvolvimento em crianças de idade escolar: triagem populacional e caracterização de

aspectos cognitivos e genéticos moleculares”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da UFMG (COEP-MG) através do parecer nº ETIC 42/08 (Anexo I) e “Avaliação de

estratégia de diagnóstico neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do

desenvolvimento cognitivo (retardo mental)”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

UFMG através do Parecer nº ETIC 0091.0.203.000-10. A participação no estudo foi

condicionada à leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo

II).

2.2 A amostra

A amostra analisada no presente estudo tem duas origens: parte dela foi averiguada

em um estudo de base populacional e parte de um ambulatório especializado em dificuldade

de aprendizagem da Matemática, conforme descrito abaixo.

2.2.1 Amostra ambulatorial

Ao longo deste estudo, foi criado um ambulatório específico para atendimento de

crianças com dificuldade de aprendizado da Matemática, o Número, na FAFICH/UFMG, sob

supervisão do Prof. Vitor Haase, do Departamento de Psicologia da UFMG. Neste

ambulatório, são atendidas crianças/adolescentes, encaminhados por psicólogos,

psicopedagogos ou professores, com a suspeita específica de dificuldade de aprendizagem

da Matemática. Esta amostra foi submetida ao mesmo conjunto de testes descrito abaixo.

Os critérios de diagnóstico usados também foram similares.

2.2.2 A amostra de base populacional

Trata-se de um estudo epidemiológico, que teve como objetivo identificar as

crianças, que apresentavam dificuldades de aprendizagem na Matemática. A fim de evitar

vieses, foi selecionada uma amostra aleatória da população de crianças matriculadas entre

a 1ª e a 6ª séries (2º ao 7º ano) do ensino fundamental de Belo Horizonte – MG. Esses

dados fizeram parte do trabalho de doutorado da Psicóloga Fernanda de Oliveira Ferreira,

29

defendido junto a Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, da Faculdade de

Medicina da UFMG, sob orientação do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase, Departamento de

Psicologia, UFMG (FERREIRA, 2010; FERREIRA et al., 2012)

A amostra foi composta por estudantes de dez escolas públicas e duas escolas

particulares de Belo Horizonte e foi coletada em duas etapas: triagem pelo Teste do

Desempenho Escolar (TDE) e avaliação cognitiva e neuropsicológica.

2.2.3 Triagem pelo TDE

Na primeira etapa, as crianças foram avaliadas quanto ao desempenho escolar em

linguagem e aritmética através de dois instrumentos de rastreio: o TDE (STEIN, 1994) e a

tarefa de transcodificação numérica (MOURA, 2010). O TDE é um teste individual de

aplicação coletiva, que compara o desempenho médio dos estudantes por série e idade. O

teste classificou as crianças em três categorias de acordo com o percentil de

aproveitamento (P). Foram elas, inferior (P<25), médio (P25<X<P75%) e superior (>P75)

(STEIN, 1994, p.19). A tarefa de transcodificação numérica tem como objetivo avaliar a

habilidade do aluno em escrever, na forma arábica, o algarismo apresentado oralmente pelo

experimentador.

2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva

Nessa etapa, foram avaliados: inteligência, habilidades somatosensoriais como

orientação direito-esquerda e percepção tátil, habilidades viso construtivas e viso espaciais,

memória e funções executivas, conforme descrito na Tabela 1. Além disso, as habilidades

numéricas foram avaliadas por uma bateria experimental (Tabela 2)

Os testes cognitivos e neuropsicológicos foram realizados pelos estudantes da Pós-

Graduação de Neurociências ou da Saúde da Criança e do Adolescente e da Graduação em

Psicologia da UFMG, em treinamento no Laboratório de Neuropsicologia do

Desenvolvimento da FAFICH-UFMG, sob supervisão do Prof. Vitor Haase.

30

Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados

DOMÍNIO AVALIADO TESTE

Inteligência RAVEN

Destreza motora 9-Hole Peg Test

Habilidades somatosensoriais Gnosias digitais e Orientação direita-esquerda

Habilidades viso construtivas Figura Complexa de Rey

Memória de curto prazo e memória de trabalho

Dígitos do WISC-III e Cubos de Corsi

Funções executivas Fluência verbal, Fluência de desenhos e TMT A e B

Processamento fonológico Repetição de pseudopalavras, Leitura de pseudopalavras e Supressão de fonemas

Fonte: Adaptado de Haase et al., 2008; Costa et al., 2011

Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados

DOMÍNIO AVALIADO TESTE

Tempo de reação Tempo de reação simples

Senso numérico Comparação de magnitudes não simbólica, Comparação de magnitude simbólica e Estimação não simbólica.

Cálculo aproximado Adição não simbólica e Subtração não simbólica

Fatos aritméticos Cálculos

Cálculos verbais Problemas matemáticos

Fonte: adaptado de COSTA et al., 2011

31

2.3 Sistemática de classificação dos pacientes

DAM

O grupo DAM foi constituído pelas crianças, que apresentaram classificação inferior

ao P25 no TDE e superior a P15 no Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven e

que, ao final da avaliação cognitiva e neuropsicológica, apresentaram dificuldades de

aprendizagem de Matemática, podendo ser também de Matemática e escrita.

CONTROLE NORMALTESTADO

O grupo controles normais testados foi composto por crianças, que apresentaram um

aproveitamento superior a P25 no subteste de aritmética do TDE e superior a P15 no Teste

das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. Essas crianças não apresentaram

dificuldade de aprendizagem e preencheram os critérios padrões para um bom desempenho

escolar, de acordo com a média esperada para a série escolar e idade nos subtestes de

aritmética do TDE. Para cada criança, que apresentava DAM, foi selecionada uma criança

controle, da mesma série, idade e preferencialmente da mesma sala de aula, sempre que

possível. Essas crianças também foram submetidas à testagem neuropsicológica completa.

CRITÉRIO DE EXCLUSÂO

Os participantes que obtiveram resultado significativamente baixo no Teste das

Matrizes Progressivas Coloridas de Raven (P15) foram classificados com deficiência

intelectual e por esse motivo foram excluídos desta amostra. Estas crianças passaram a

integrar a amostra do projeto de pesquisa “Avaliação de estratégia de diagnóstico

neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do desenvolvimento cognitivo

(retardo mental)”, referido acima. Além disto, receberam o laudo de avaliação

neuropsicológica e foram referenciados a outros profissionais, para investigação ou

assistência, conforme necessário.

CONTROLE POSITIVO DO KIT SALSA MLPA P245-A2

O grupo controle positivo foi composto por cinco pacientes de ambos os sexos

previamente diagnosticados com alguma síndrome genética detectável pelo kit Salsa MLPA

P245-A2. Assim, foram dois pacientes com SWB e a SVCF, um de cada sexo, e um menino

afetado pela síndrome de WARG.

CONTROLE INTERNO DA TÉCNICA DE MLPA

Foram selecionados cinco indivíduos de cada sexo de uma amostra sem alteração

(deleção/duplicação), já disponível no Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM)

32

da UFMG, que constituiu o grupo controle interno exigido para padronização da técnica de

exame molecular utilizada na pesquisa, a MLPA.

Na Figura 9, estão ilustrados os grupos acima descritos e as estratégias de

averiguação utilizadas.

Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo

Legenda - Das 1520 crianças avaliadas na triagem por TDE e teste de transcodificação numérica foram diagnosticadas 78 crianças com dificuldade de aprendizagem em Matemática e selecionadas 90 controles com avaliação neuropsicológica normal, pareados por sexo e idade; e excluídos os indivíduos diagnosticados com Deficiência Intelectual. Para padronização da técnica e validação do kit P245-A2 foram utilizados cinco controles internos de cada sexo e cinco controles positivos.

Fonte: Elaborada pela autora

33

2.4 Métodos moleculares

2.4.1 Extração de DNA

Foram coletados 5mL de sangue em tubo com EDTA ou saliva, para os casos em

que as crianças apresentavam resistência à coleta de sangue. A extração de DNA foi

realizada pelo método de precipitação salina (MILLER et al., 1988), método usado

rotineiramente no laboratório, para quaisquer tipos de material biológico.

Os DNA foram quantificados, utilizando-se o espectrômetro NanoDrop® ND-2000

(Thermo Scientific, Wilmington, EUA) sendo que a razão das absorbâncias 260 nm e 280

nm, assim como a razão das absorbâncias 260 nm e 230 nm foram avaliadas a fim de

verificar a qualidade do DNA e garantir que fossem utilizados em uma concentração

uniforme.

2.4.2 A técnica MLPA

Para a padronização da técnica de MLPA, foi utilizado o kit SALSA MLPA P245-A2

Microdeletion Syndromes-1 (MRC HOLLAND, Amsterdã, Holanda), e posteriormente para

detecção de microdeleções/microduplicações intersticiais foi utilizado o mesmo kit. Esse kit

permite o diagnóstico de 21 síndromes de microdeleção, sendo estas as mais comuns em

humanos. A composição do kit, em termos de sondas, posições cromossômicas e doenças

investigadas são apresentadas na Tabela 3.

34

Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2

Fonte: MRC - Holland

35

O kit SALSA MLPA P245-A2 é composto por 49 sondas, que geram fragmentos entre

130 a 484 pb. O kit inclui ainda dez fragmentos-controle, com produtos de amplificação

menores do que 120 pb: quatro fragmentos específicos para a análise da quantidade de

DNA (DQ) com 64, 70, 76 e 82 pb; três para controle de desnaturação de DNA (DD) com 88,

92 e 96 pb, um fragmento específico para o cromossoma X com 100 pb e dois fragmentos

específicos para o cromossoma Y, com 105 e 118 pb (MRC Holland b. v., Amsterdã,

Holanda).

O protocolo utilizado encontra-se em conformidade ao descrito por Schouten et al.,

2002, com mínimas modificações.

As reações da MLPA foram realizadas no termociclador (Applied Biosystems – Veriti

96-Well Thermal Cycler) e realizadas em quatro passos: desnaturação e hibridização do

DNA, reação de ligação, amplificação por PCR.

DESNATURAÇÃO E HIBRIDIZAÇÃO

Na desnaturação e hibridização cada amostra de DNA utilizada foi diluída em TE na

proporção de 120 – 200 ng para 2,5 μL e mantida em termociclador a temperatura de 98°C

por cinco minutos. Posteriormente, as amostras foram resfriadas a 25°C, e foram

acrescentados 0,75 μL de SALSA Probe-mix e 1,5 μL de MLPA buffer. Em seguida, foram

mantidas a 95ºC por um minuto e incubada a 60°C durante 16-20 horas.

LIGAÇÃO

Após a hibridização, foi realizada a etapa de ligação. A princípio foi preparado o Mix

Ligase com 1,5 μL de Ligase-65 buffer A, 1,5 μL Ligase-65 buffer B, 12,5 μL de água Milli-Q

e por último 0,5 μL da enzima Ligase-65. Logo após, a temperatura do termociclador foi

reduzida a 54°C, e acrescentados 16 μL de Mix Ligase-65 a cada amostra. Em seguida, a

mistura foi incubada a uma temperatura de 54°C por 15 min e a 98°C por 5 min.

PCR

E finalmente, em um novo tubo, foi preparado o Mix de PCR com 1,0 μL SALSA PCR

primer, 0,25 μL de SALSA DNA Polymerase e 3,75 μL de água Milli-Q e em seguida, foram

adicionados 5 μL dessa solução em cada amostra no termociclador. Por fim, foi iniciada a

reação de PCR segundo o protocolo descrito na Figura 10.

36

Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos

Fonte: Produzida pela autora

2.4.3 Analise dos resultados

As amostras foram genotipadas pela MLPA, para detecção de possíveis

microdeleções/microduplicações intersticiais, conforme a técnica descrita e posterior

padronização. Nesta etapa, também foram utilizados os controles internos, como recomenda

o fabricante.

Os produtos amplificados na MLPA foram separados e visualizados em aparelho de

eletroforese capilar ABI 3130 ou ABI 3137 (Applied Biosystems-Applera Corporation,

Estados Unidos). Foi adicionado 0,5 µL do padrão de peso molecular ROX 500 (ABI 3130)

ou LIZ 500 (ABI 3137) e 8,5 µL de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems-Applera

Corporation, Estados Unidos) para 1,0 µL dos produtos amplificados. Essa mistura foi

submetida a choque térmico a 95oC por 3 min e resfriada rapidamente a 4oC antes da

eletroforese capilar.

A interpretação dos perfis gerados foi feita com o software GeneMarker V2 2.0

(Softgenetics, LLC, EUA). Os dados foram normalizados dividindo-se o valor da altura do

pico de cada sonda pela soma dos picos de todas as sondas presentes em cada amostra.

Esta etapa é denominada de normalização intra-amostral. Em seguida, o valor pré-

normalizado é dividido pela média da altura do pico da sonda correspondente nas amostras

controles. Esta segunda etapa é denominada de normalização inter-amostral. Para valores

de picos entre 0,7 e 1,3 foram considerados normais. Valores superiores a 1,3 foram

considerados indicativos de microduplicação cromossômica nas regiões cobertas pelas

sondas e valores inferiores a 0,7 foram considerados indicativos de microdeleção.

37

2.5 Confirmação dos resultados

De acordo com o fabricante, para confirmação dos resultados é indicado utilizar outro

kit de MLPA confirmatório ou outra técnica de biologia molecular. Sendo assim, para a

confirmação, foi usado a versão atualizada do mesmo kit, o kit SALSA MLPA P245-B1

MICRODELETION SYNDROMES-1 (Tabela 4) e também o kit SALSA MLPA P070-B2

HUMAN TELOMERE-5 (MRC – Holland, Amsterdã, Holanda), que contém uma sonda para

cada região subtelomérica dos cromossomas autossômicos 1 ao 22, além das regiões

pseudo-autossômicas dos cromossomas X e Y (Tabela 5).

Outro método utilizado para confirmação foi o aCGH. Essa técnica foi realizada pelo

Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de Biociências – Universidade de São

Paulo, utilizando a plataforma Human Genome CGH Microarray 60K (Agilent Technologies,

Santa Clara – CA, EUA), contendo cerca de 60.000 oligonucleotídeos distribuídos pelo

genoma humano).

38

Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1

Fonte: MRC – Holland

39

Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2

Fonte: MRC – Holland

40

3 RESULTADOS

3.1 Padronização da MLPA

Em virtude da dificuldade em encontrar-se na literatura dados, que pudessem

fornecer informações para a otimização da técnica, foi optado pelo uso do protocolo

elaborado pelo fabricante para em seguida testar algumas modificações.

3.1.1 Avaliação do desempenho da técnica

Inicialmente, foram avaliados a qualidade da extração, o tempo e condições de

armazenamento das amostras e a quantidade de DNA utilizado. Para verificar a qualidade

da extração do DNA, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria. Os DNAs que

não apresentaram níveis de pureza entre 1,8 a 2,0, para as duas razões 260/280 e 260/230

nm, foram descartados da amostra para garantir a confiabilidade dos resultados.

Considerando que as coletas do material genético foram realizadas desde 2008 até o

ano de 2012, seria necessário verificar se o tempo e a qualidade do armazenamento

poderiam interferir no resultado. Entretanto, na dissertação de Mestrando da Bióloga

Gabrielle Souza Vianna (VIANNA, 2011) esses pontos foram avaliados nessa mesma

amostra apresentando resultados satisfatórios.

Em relação à quantidade de DNA utilizado, o fabricante recomenda uma

concentração entre 20 a 500 ng. Para o kit P245-A2, não houve diferença entre os

resultados de concentrações no intervalo de 75 e 150 ng. Sendo assim, essa faixa de

concentração de DNA foi adotada.

3.1.2 Redução do protocolo original

O produto final da reação de MLPA corresponde a um volume de 50 μL, mas apenas

1µL são utilizados na eletroforese capilar. Apesar de a técnica ter um custo relativamente

baixo por paciente, quando comparada a outros métodos, seria ideal reduzir os volumes

preconizados no protocolo recomendado pelo fabricante, com o objetivo de aumentar o

rendimento do kit e diminuir o volume descartado.

Para padronizar o uso das reações em 25 µL, foram feitos experimentos,

comparando-se esta quantidade de reagentes com a quantidade recomendada pelo

fabricante (50 µL). O protocolo com 25 µL foi denominado P½, e o protocolo recomendado

pelo fabricante de PO, para protocolo original. Foram utilizadas, como parâmetro, duas

amostras controles positivos de ambos os sexos e três controles negativos de cada sexo

41

para cada experimento. Em seguida, esses dados foram comparados. Não foram

observadas diferenças entre os protocolos P½ e o PO (Figura. 11).

Figura 11 - Gráficos de padronização da técnica de MLPA

Legenda - A Comparação dos controles negativos (3527, 4850, 4851) e controle positivo (5399) do sexo feminino. B Comparação dos controles negativos (3584, 4006, 4018) e controle positivo (5517) do sexo masculino. A primeira e a segunda linha (tanto para a parte A quanto para a parte B mostram o resultado para o protocolo reduzido à metade (P½) e o controle original (PO), respectivamente.

Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker

3.1.3 Validação do kit P245-A2

De acordo com as recomendações do fabricante, qualquer kit MLPA a ser usado

deve ser inicialmente validado, testando-se indivíduos apresentando qualquer alteração

detectada pelo kit e controles sem alterações (microdeleções/microduplicações).

Dessa forma, foram selecionados controles com alterações (controles positivos)

identificadas por outros métodos moleculares, como a Hibridização In Situ com

42

Fluorescência (fluorescent in situ hydridisation FISH), qPCR ou microssatélites. São eles,

dois pacientes com SVCF, dois pacientes com SWB e um paciente com síndrome de

WARG. Na Figura 12, é mostrado o gráfico de resultado final gerado pelo software

GeneMarker, mostrando os resultados dos controles positivos da MLPA. É possível observar

que as anormalidades antes detectadas por outros métodos foram confirmadas pela MLPA.

Além dos controles positivos, é igualmente importante a escolha de amostras de

controles internos de reação, que serão utilizadas como referência para comparar o

tamanho dos picos e estimar o número de cópias nos indivíduos teste. Essas amostras de

DNA foram obtidas de indivíduos normais não testados já disponíveis no LGHM (controles

internos de reação).

Considerando-se isso, foram selecionados cinco controles internos de cada sexo,

cujo padrão de amplificação é mostrado abaixo (Figura 13). Essa seleção foi feita também,

com o objetivo de padronizar um pequeno grupo de controles internos, que posteriormente

serão utilizados ao longo de todo o estudo.

A partir dos resultados obtidos com a padronização do kit reduzido à metade e da

sua validação, foi possível demonstrar que a redução dos reagentes não altera os

resultados da MLPA com este kit (Figura 12 e 13). Dessa forma, deu-se continuidade ao

estudo.

Figura 12 - Gráfico de validação da MLPA com controles positivos do kit P245-A2

Legenda - Gráfico de resultado final, gerado com o software GeneMarker, mostrando os resultados dos controles positivos usados para validação da técnica MLPA com o kit P245-A2. Estes controles positivos são indivíduos afetados por algumas das síndromes detectadas por este kit,previamente diagnosticados por outros métodos. As amostras 5511 e 5604 apresentam deleção das 3 sondas de SVCF; 5501, a deleção de uma sonda da síndrome de WARG; e, 5399 e 5517, deleção das 3 sondas da SWB.


43

Figura 13 - Gráfico de validação da MLPA com os controles internos

Legenda – Em A, estão apresentados os controles do sexo masculino e em B, do sexo feminino.


3.2 Genotipagem por MLPA

Foram genotipados 180 indivíduos através da técnica MLPA. Nos indivíduos do

grupo controle normal testado neuropsicologicamente, não foram observadas diferenças

entre as amplificações das 49 regiões analisadas, ou seja, nenhum deles apresentou

evidência de microdeleção ou microduplicação. No grupo DAM, das 90 crianças

investigadas, foi encontrada alteração em um indivíduo (1,1%).

Esta alteração é uma microdeleção e foi detectada com a sonda CRR9, que identifica

o gene CRR9, na região da Síndrome de Cri du Chat (Figura 14). Trata-se de uma

microdeleção heterozigótica, pois o valor de razão do pico é próximo a 0,5. A presença

desta microdeleção foi confirmada por repetição desta MLPA.

O gene CRR9 é mais conhecido como CLPTM1L, e por esse motivo, a partir de

agora a sonda e gene serão referidos como CLPTM1L.

O kit utilizado possui duas sondas para identificação da Síndrome do Cri du Chat, a

sonda CLPTM1L e a sonda TERT (Tabela 6). Porém, esta última, que mapeia

proximalmente à CLPTM1L, a uma distância de 0,62 Mb, apresentou padrão normal à

MLPA.

44

Figura 14 - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat

Legenda - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat. A) Histograma de dosagem descriminando as 49 sondas e suas respectivas razões de pico entre a amostra testada (2761) e a média dos controles internos, onde se observa a redução da razão na sonda CLPTM1L destacada pela seta vermelha. B) Gráfico de ponto com a disposição das sondas dentro do intervalo normal, exceto pela sonda CLPTM1L que está circulada de vermelho.


Tabela 6 - Descrição das sondas da síndrome Cri du Chat dos kits de MLPA

COMPRIMENTO

(NT) GENE KIT

POSIÇÃO

CROMOSSÔMICA

DISTÂNCIA DA

PRÓXIMA SONDA SÍNDROME

337 CCDC127 P070-B2 5p15.33 1Mb Cri du Chat

437 TERT P245-A2 5p15.33 0,62 Mb Cri du Chat

283 CLPTM1L P245-A2 5p15.33 8Mb Cri du Chat

283 SEMA5A P245-B1 5P15.31 --- Cri du Chat

Fonte: adaptado de MRC Holland

45


3.3.1 Técnica MLPA

Na tentativa de confirmar a deleção encontrada no indivíduo 2761, foi realizado um

novo ensaio de MLPA com o kit SALSA MLPA P245-B1 (versão atualizada do SALSA MLPA

P245-A2). Essa nova versão passou a ser comercializada desde 11/2012 e teve alteração

de onze sondas. A sonda CLPTM1L foi retirada e em seu lugar foi inserida a SEMA5A.

Localizada também na região 5p15.33 (Figura 15), a sonda SEMA5A fica aproximadamente

8 Mb distal da sonda CLPTM1L. Sendo assim, foi feita a MLPA com essa nova versão do kit,

a fim de verificar o tamanho mínimo da deleção.

Além disso, foi utilizado um dos kits recomendados pelo fabricante (MRC

HOLLAND), o SALSA MLPA P070-B2, para confirmação de alterações nas sondas da

síndrome Cri du Chat. Esse kit possui uma sonda subtelomérica para a região 5p, CCDC127

(Tabela 4). Como mostrado na Figura 15, a sonda CCDC127 fica localizada na região

5p15.31 proximal a sonda deletada CLPTM1L, a distância aproximada de 1 Mb.

Na Figura 16, são mostrados os resultados da MLPA do indivíduo portador da

microdeleção de CLPTM1L, com os kits SALSA MLPA P245-B1 e P070-B2. Observe que as

sondas presentes em 5p tem resultado normal. Nessa situação, segundo o fabricante é

indicado confirmar o dado por outro método.

3.3.2 Técnica de array-CGH

Outro método utilizado para confirmação foi o a-CGH. Uma amostra do DNA do

indivíduo 2761 foi enviada ao Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de

Biociências – Universidade de São Paulo. Foi utilizada a plataforma Human Genome CGH

Microarray 60K que contém cerca de 60.000 oligonucleotídeos distribuídos pelo genoma

humano. A plataforma utilizada não cobre a região exata da sonda CLPTM1L, porém na

Figura 17 é possível observar que os dois oligonucleotídeos, que cercam o gene CLPTM1L,

apresentam padrão normal.

Não foi possível confirmar a deleção da sonda CLPTM1L através das técnicas

utilizadas. No caso, a microdeleção pode ser pequena, entre 0,72 Kb (tamanho da sonda

deletada) e 70 Kb (distância dos oligonucleotídeos com padrão normal no aCGH) e ter

escapado à detecção por estes métodos.

46

Figura 15 - Ideograma do cromossoma 5

Legenda - em A, as regiões do cromossoma 5 e destacado com o retângulo vermelho a região

cromossômica ampliada na Figura B. Em B a posição das sondas CCDC127, TERT, CLPTM1L e SEMA5A e suas distâncias aproximadas.

Fonte: Produzida pela autora

Figura 16 - Gráficos para confirmação da deleção do indivíduo 2761

Legenda - em A gráfico da MLPA com o kit P245-B1 e sonda SEMA5A, circulada, com padrão normal; em B gráfico da MLPA com o kit P070-B2 e sonda CCDC127, circulada, com padrão normal.


47

Figura 17 - aCGH para confirmação da deleção do indivíduo 2761

Legenda - Imagem do aCGH do indivíduo 2761 com a região próxima ao gene CLPTM1L. As setas vermelhas indicam os dois oligonucleotídeos, que cercam o gene em estudo, com distância aproximada de 70 Kb.

Fonte: Adaptado de Human Genome CGH Microarray 60K

48

4 DISCUSSÃO

4.1 Padronização da MLPA

4.1.1 Avaliação do desempenho da técnica

De acordo com o fabricante, a MLPA é mais sensível à contaminantes do que um

simples ensaio de PCR. Dessa forma, para garantir o sucesso da técnica é importante

avaliar entre outros fatores, a qualidade da extração, o tempo e condições de

armazenamento das amostras e a quantidade de DNA utilizado.

Concentrações elevadas de contaminantes, como sal e resíduos da extração do

DNA, e a degradação do material genético devido ao tempo e qualidade de armazenamento,

podem causar o não anelamento de algumas sondas. Esses fatores podem resultar em um

viés de normalização ou de análise e contribuir para resultados falso-positivos. Dessa forma,

o fabricante recomenda que as amostras de DNA sejam avaliadas quanto a sua pureza e

integridade através de espectrofotometria ou por eletroforese em gel.

Em relação à quantidade de DNA utilizada, o fabricante recomenda uma

concentração entre 20 a 500 ng (SCHOUTEN et al., 2002). Esses valores seriam suficientes

para o anelamento das sondas no DNA e a posterior ligação através da enzima ligase.

Como já descrito anteriormente, além dos fragmentos controle de desnaturação de DNA

(DD), existem os fragmentos controle específicos para a quantidade de DNA (DQ). A

inclusão desses fragmentos DQ serve para sinalizar se a quantidade de DNA utilizada está

correta. Quando são usados menos de 20 ng, necessários para gerar resultados confiáveis,

os fragmentos DQ amplificam. Quando a quantidade de DNA está correta, a amplificação

dos quatro fragmentos DQ é quase imperceptível.

A presença de alterações no ensaio pode ser justificada pelas diferentes quantidades

de DNA utilizado. Essa variação pode levar a uma normalização incorreta dos dados e,

portanto, a resultados errôneos. Dessa forma, recomenda-se que, para cada kit seja

estimada a faixa de concentração de DNA em que são produzidas as amplificações mais

satisfatórias, para que a normalização e a análise posterior sejam corretas (MRC Holland b.

v., Amsterdã, Holanda).

4.1.2 Redução do protocolo original

Encontramos apenas dois estudos relatando o uso de quantidades menores de

reagentes na MLPA. Em um estudo realizado por Carvalho (2009), foram testados

protocolos com 1/3 e ½ dos reagentes. Porém, para os dois casos, os resultados não foram

confiáveis. As amostras testadas, controles sem alteração, apresentaram deleções e

duplicações em várias regiões. Tais resultados foram justificados pelo autor em função dos

49

volumes dos reagentes serem pequenos e que poderia haver alguma dificuldade em se

conduzir o experimento ocasionando em resultados falso-positivos.

Outra tentativa, sem sucesso de redução de protocolo, foi realizada por Vianna

(2011). Os testes realizados com a diminuição do volume de todos os reagentes do kit não

foram satisfatórios, porém, foi indicada a redução dos volumes apenas na etapa da PCR.

Isto, do ponto de vista prático, não é uma vantagem real, sendo necessária aquisição de

novos kits para repor os reagentes das etapas de hibridação e ligação.

Como nossos resultados foram consistentes, optamos por usar o kit com o volume

de 25 µL, tomando o cuidado de repetir resultados alterados com o kit em volume normal.

Vale ressaltar, que este é o primeiro trabalho a descrever sucesso na redução do kit de

MLPA.

4.1.3 Validação do kit P245-A2

Além dos cuidados para garantir o sucesso da técnica de MLPA, é importante

considerar a especificidade de cada kit. De acordo com o fabricante, antes de iniciar o uso

de um kit é fundamental a etapa de validação através de controles internos e controles

positivos.

Como a técnica da MLPA se baseia na análise de quantificação relativa à

amplificação das sondas, é necessária uma reação de referência para comparar e estimar

as alterações com relação ao número de cópias. São consideradas reações de referências,

aquelas que as amostras de DNA obtidas correspondem a indivíduos normais (controles

internos). Recomenda-se a utilização de pelo menos três controles por ensaio, a fim de

estimar a reprodutibilidade de cada sonda no experimento.

Além disto, no caso específico do kit SALSA MLPA P245-A2, existem sondas de

controle interno no cromossoma X (em negrito na Tabela 2, acima). Assim, se são testados,

na mesma reação, indivíduos do sexo masculino e feminino, os indivíduos do sexo

masculino, que tem apenas uma cópia do cromossoma X, aparecem como deletados. Em

função disto, para o uso deste kit, cada ensaio deve ser feito apenas com indivíduos de um

sexo e os controles internos devem ser do mesmo sexo.

4.2 Genotipagem por MLPA

Com o kit SALSA MLPA 245-A2 foi possível genotipar todos os indivíduos da

amostra. Apenas um indivíduo, da amostra das crianças com DAM, apresentou uma

microdeleção. A microdeleção detectada com a sonda CLPTM1L está localizada no braço

curto do cromossoma 5, na região da Síndrome do Cri du Chat. Sendo assim, foram

50

avaliadas a correlação dessa região deletada e os endofenótipos da Síndrome. Na Figura

18, estão demarcadas as regiões responsáveis pelos principais endofenótipos, que estão

agrupados na região crítica, a 5p15.2.

A Síndrome do Cri du Chat está associada à haploinsuficiência de múltiplos genes

localizados na região crítica 5p15.2 e também do TERT na região 5p15.33 (OVERHAUSER

et al., 1994; CHURCH et al., 1997; MAINARDI et al, 2001; ZHANG et al., 2003).

Como apresentado nos resultados, a sonda que cobre o gene TERT teve padrão

normal, porém a sonda do gene CLPTM1L foi deletada. Apesar de não sabermos ao certo o

tamanho da deleção, sabemos que a sua localização fica fora do intervalo crítico onde estão

relatadas as principais manifestações fenotípicas da Síndrome, particularmente as regiões

relacionadas à deficiência intelectual. Além disso, há o relado de apenas atraso na fala para

a região deletada, sem complicações maiores como descrito na Figura 18 (OVERHAUSER

et al., 1994; CHURCH et al., 1997; MAINARDI et al, 2001; ZHANG et al., 2003).

O gene CLPTM1L codifica a proteína cleft lip and palate transmembrane protein 1-

like e recebeu esse nome em função de uma mutação neste gene identificada em uma

família com fissura de lábio e palato (YOSHIURA et al.,1998). Além disto, esse gene se

associa à apoptose induzida pela cisplatina (YAMAMOTO et al., 2001) e está localizado

dentro de um locus de susceptibilidade para o câncer no cromossoma 5, região 5p15.33

(OMIM:612585).

Com um tamanho de 27 Kb, o CLPTM1L possui 17 exons e está a uma distância de

aproximadamente 1,3 Mb do telômero. Na Figura 19, é mostrada a sonda da MLPA

desenhada para esse gene localizada no exon 2 com a cobertura de 70 pb.

Uma vez detectada esta microdeleção, veio a primeira hipótese: se haveria relação

desse gene com a DAM.

Para isso, buscamos na literatura se esta região já havia sido identificada em outros

estudos sobre a DAM. Docherty e colaboradores (2010) detectaram 10 SNPs

significativamente associados com o desempenho na Matemática. Entre os 10 SNPs de

maior significância encontrados nesse estudo, um está localizado na região 5p15.2, dentro

do gene DNAH5. Fora esta evidência, não há registro de associação do gene CLPTM1L ou

de outros genes próximos com a DAM. A distância entre os genes DNAH5 e CLPTM1L é de

cerca de 12 MB, uma distância grande. Portanto, é possível que os dois achados (a possível

deleção de CLPTM1L e o mapeamento por GWAS próximo ao gene DNAH5) não sejam

correlacionados.

51

Figura 18 - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5

Legenda - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5, com a localização das regiões responsáveis pelas principais características fenotípicas da Síndrome Cri du Chat. A seta indica a localização aproximada da região deletada no indivíduo 2761.

Fonte: Adaptado de Overhauser et al., 1994; Church et al., 1997; Mainardi et al, 2001; Zhang et al., 2003

52

Figura 19 - Imagem do gene CLPTM1L e sonda do kit SALSA MLPA P245-A2

Legenda – na parte superior, estão destacados os exons numerados de 1 a 17. Na parte inferior o exon 2 foi ampliado e a região sombreada em verde é o local, que a sonda CLPTM1L do kit SALSA MLPA P245-A2 cobre do gene.

Fonte: Adaptado de Genome Browser, NCBI


Em relação a região deletada, surgiu outra hipótese: se existe realmente uma

deleção na região ou trata-se de um artefato.

É importante ressaltar que as sondas de MLPA são sensíveis a pequenas alterações

na sequência de anelamento ao DNA genômico (MRC HOLLAND). Dessa forma, quando há

mudanças nucleotídicas muito próximas, a uma distância de até 10 pares de base, ao sítio

de anelamento ou dentro do mesmo, essas podem inibir ou desestabilizar o anelamento dos

oligonucleotídeos na região. Isso afetaria a posterior ligação dos oligonucleotídeos pela

enzima ligase, não havendo então a amplificação por PCR. Nesses casos, o resultado do

teste seria sugestivo de uma deleção da região estudada, porém, na realidade, se trataria de

um resultado falso-positivo (ROOMS et al., 2004; MONFORT et al., 2006; AHN et al., 2007).

Diante disto, ao buscar informações sobre a sonda investigada, o fabricante informa

que a sonda CLPTM1L possui um SNP próximo ao sítio de ligação, que poderia influenciar o

anelamento da sonda. E, por esse motivo, essa sonda foi substituída na versão atualizada

do kit. Isto sugere que a deleção identificada neste paciente possa ser um artefato.

Entretanto, os resultados obtidos até agora, nos métodos usados para tentar refinar esta

alteração (MLPA com outro kit que cobre 5p e aCGH), permitem descartar grandes deleções

em 5p, mas a hipótese de uma pequena deleção na região coberta pela sonda CLPTM1L

ainda não pode ser completamente descartada.

53

4.4 Contribuição das síndromes de microdeleção para a DAM

Este é o primeiro estudo investigando a contribuição das

microdeleções/microduplicações intersticiais para o fenótipo dificuldade de aprendizagem da

Matemática. A justificativa para esse estudo foi o fato de que pacientes com as Síndromes

de Sotos, SWB, SVCF/DiGeorge, NF1, entre outras, apresentarem frequentemente

dificuldade de aprendizagem da Matemática, ou, nos pacientes acometidos por estas

síndromes e que tem deficiência intelectual, um comprometimento maior na aritmética

quando comparada à linguagem. Em muitas destas síndromes, a deficiência intelectual é

frequente. Na verdade, estes pacientes são diagnosticados por apresentarem deficiência

intelectual ou malformações congênitas graves. Como pacientes com dificuldade de

aprendizado isolada não são alvo de investigação molecular, se existem pessoas com estas

microdeleções e dificuldade de aprendizagem (sem DI), estas são subaveriguadas.

Portanto, não se sabe qual o cenário mais provável: 1. A deficiência intelectual

nestas síndromes é a porção mais severa de um espectro de manifestações cognitivas, e a

fração de indivíduos que recebe diagnóstico é uma ponta de iceberg; 2. Estas condições

causam deficiência intelectual na maioria dos casos e casos com manifestações mais

brandas são a exceção. Por outro lado, estas síndromes não formam um grupo homogêneo.

Algumas têm deficiência intelectual mais frequentemente (por exemplo, SWB ou

SVCF/DiGeorge), outras menos (por exemplo, NF1, Síndrome de Sotos). Portanto, ao

iniciarmos o estudo, não podíamos estimar frequências esperadas destas condições entre

as crianças com DAM.

Encontramos um caso de microdeleção na região 5p15.3 entre 90 crianças com

DAM, ou seja, 1,1%. Entretanto, esta deleção pode ser um artefato, o que ainda será alvo

de investigação futura.

Assim, nossos resultados sugerem que, embora a DAM seja descrita em algumas

das Síndromes cobertas pelo kit SALSA MLPA 245-A2, estas entidades aparentemente não

contribuem importantemente para a DAM não sindrômica. Este achado favorece, portanto, o

cenário 2, proposto acima.

54

5. PERSPECTIVAS

Apesar de não ter sido possível confirmar a microdeleção encontrada pelos métodos

utilizados, não podemos descartar a possibilidade de uma pequena deleção na região

coberta pela sonda CLPTM1L. Portanto, será feita uma PCR quantitativa para averiguar a

existência desta microdeleção na amostra com alteração e nos controles normais.

Além disto, embora tenha sido encontrada apenas uma microdeleção intersticial,

esse resultado aponta para novas investigações quanto às outras regiões não estudadas

desses indivíduos. Nesse caso, o projeto continua, com averiguação de

microdeleções/microduplicações subteloméricas através do kit SALSA MLPA P070 e com o

aCGH.

55

6. CONCLUSÕES

A padronização da MLPA com o protocolo reduzido com metade dos reagentes foi

bem sucedida, tornando a MLPA uma técnica ainda mais econômica. Esse protocolo poderá

ser estendido para os outros kits, desde que seja validado adequadamente, sem esquecer a

confirmação dos casos positivos com o protocolo normal.

Foi possível verificar entre as crianças com DAM, um caso sugestivo de

microdeleção de uma sonda, a CLPTM1L, que mapeia em 5p15.33. Entretanto, esse

indivíduo apresenta um padrão normal para outras sondas do braço curto do cromossoma 5,

tanto proximais quanto distais. Além disto, não é possível ter-se certeza de que se trate de

uma deleção, pois esta sonda pode gerar resultados falso-positivos. Os outros métodos

usados (SALSA MLPA P070-B2, P245-B1 e aCGH) para confirmar esta deleção/avaliar sua

extensão apresentaram resultados normais. Portanto, podemos concluir que, se confirmada,

trata-se de uma microdeleção entre 70 bp (o tamanho da sonda usada na MLPA) e 70 kb ( a

distância entre os fragmentos com sinal positivo no aCGH. Não foi encontrada relação entre

o gene da sonda possivelmente deletada e os demais genes candidatos para a DAM.

Os resultados apresentados aqui, ou seja, uma frequência de 0 (ou 1, se se

confirmar o caso com deleção em 5p15.33) microdeleção intersticial entre 90 indivíduos com

DAM, sugerem que estas condições não sejam uma etiologia frequente da dificuldade de

aprendizagem da Matemática não sindrômica.

56

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AHN, J. W. et al. Detection of subtelomere imbalance using MLPA: validation, development of an analysis protocol, and application in a diagnostic centre. BMC Med Genet, v. 8, p. 9, 2007. ALARCÓN, M. et al. A twin study of mathematics disability. J Learn Disabil, v. 30, n. 6, p. 617-23, 1997 Nov-Dec 1997. AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition. Washington, D.C.: American Psychiatric Association, 1994 BADIAN, N. A.; GHUBLIKIAN, M. The personal-social characteristics of children with poor mathematical computation skills. J Learn Disabil, v. 16, n. 3, p. 154-7, Mar 1983. BAUJAT G.; CORMIER-DAIRE, V. Sotos syndrome. Orphanet J Rare Dis, v. 7, n. 2, p.36, 2007. BERTELLA, L.; GIRELLI, L.; GRUGNI, G.; MARCHI, S.; MOLINARI, E.; SEMENZA, C. Mathematical skills in Prader-Willi syndrome. Journal of Intellectual Disability Research, v. 49, n. 2, p. 159–169, 2005. BURTON, P. R.; TOBIN, M. D.; HOPPER, J. L. Key concepts in genetic epidemiology. Lancet, v. 366, n. 9489, p. 941-51, 2005 Sep 10-16 2005. BUTLER, M.; THOMPSON, T. Prader-Willi syndrome: Clinical and genetical findings. The Endocrinologist, v. 10, p. 3–16, 2000. BUTTERWORTH, B. The development of arithmetical abilities. J Child Psychol Psychiatry, v. 46, n. 1, p. 3-18, Jan 2005. BUTTERWORTH, B.; KOVAS, Y. Understanding neurocognitive developmental disorders can improve education for all. Science, v. 340, n. 6130, p. 300-5, Apr 2013. BUTTERWORTH, B.; YEO, D. Dyscalculia guidance. Helping pupils with specific learning difficulties in math. London: NFER Nelson, 2004. CARVALHO, C. R. L. Técnica de MLPA: uma alternativa para a investigação de rearranjos subteloméricos em indivíduos com atraso do desenvolvimento neuromotor ou deficiência mental idiopática. Dissertação (Mestrado em Genética) - Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, 2009. CHURCH, D. M. et al. A high-resolution physical and transcript map of the Cri du chat region of human chromosome 5p. Genome Res, v. 7, n. 8, p. 787-801, Aug 1997. COSTA, A. J.; SILVA, J. B. L.; CHAGAS, P. P.;, KRINZINGER H.; LONNEMAN, J.; WILLMES, K.; WOOD, G.; HAASE, V. G. A hand full of numbers: a role for offloading in arithmetics learning? Frontiers in psychology, v. 2, n. 368, 2011. DE SMEDT, B. et al. Mathematical disabilities in children with velo-cardio-facial syndrome. Neuropsychologia, v. 45, n. 5, p. 885-95, Mar 2007. DE SMEDT, B.; SWILLEN, A.; VERSCHAFFEL, L.; GHESQUIÈRE, P. Mathematical learning disabilities in children with 22q11.2 deletion syndrome: a review. Dev Disabil Res Rev, v.

57

15, n. 1, p. 4 – 10, 2009. DEHAENE, S. Varieties of numerical abilities. Cognition v. 44, p. 1-42, 1992. DEHAENE; S, COHEN, L.Towards an anatomical and functional model of number processing. MathCognition; v.1, p. 83-120, 1995. DOCHERTY, S. J. et al. A genome-wide association study identifies multiple loci associated with mathematics ability and disability. Genes Brain Behav, v. 9, n. 2, p. 234-47, Mar 2010. DOCHERTY, S. J.; DAVIS, O. S. P.; KOVAS, Y.; MEABURN, E. L.; DALE, P. S.; PETRILL, S. A.; SCHALKWYK, L. C.; PLOMIN, R. A genome-wide association study identifies multiple loci associated with mathematics ability and disability. Genes, Brain and Behavior, v.9, p. 234–247, 2009. FEDERAL REGISTER, vol. 34 CFR 300.7(c) (10) (U.S. Government, Washington, DC, 1999). FEITOSA, M. F.; KRIEGER, H. Future of genetic epidemiology in complex traits. Ciência e Saúde Coletiva. São Paulo - Brazil. 7: 73 - 83 p. 2002. FERREIRA, F, O.; WOOD, G.;PINHEIRO-CHAGAS, P.; LONNEMANN, J.; KRINZINGER, H.; WILLMES, K.; HAASE, V. G. Explaining school mathematics performance from symbolic and nonsymbolic magnitude processing: similarities and differences between typical and low-achieving children. Psychology & Neuroscience, v. 5, n. 1, p. 37-46, 2012. FERREIRA, F. O. Transtorno de aprendizagem da matemática: mecanismos cognitivos subjacentes. 162 f. Tese (Doutorado em Psicologia) – Faculdade de Filosofia e Ciências Humanas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2010. GEARY, D. C. Mathematical disabilities: cognitive, neuropsychological, and genetic components. Psychol Bull, v. 114, n. 2, p. 345-62, Sep 1993. GENEMARKER, Human Identify Software – (Disponível em http://www.softgenetics.com, ultimo acesso 30/07/2013) GENOME BROWSER, NCBI. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/81037,(ultimo acesso 30/07/2013) GERSTEN, R.; JORDAN, N.; FLOJO, J. R. Early identification and interventions for students with mathematics difficulties. J Learn Disabil, v. 38, n. 4, p. 293-304, Jul-Aug 2005. GROSS-TSUR, V.; MANOR, O.; SHALEV, R. Developmental dyscalculia: prevalence and demographic features. Dev Med Child Neurol, v. 38, n. 1, p. 25-33, Jan 1996. HAASE, V. G.; CARVALHO, M. R. S.; WOOD, G.; WILLMES, K.; FERREIRA, F. O.; PINHEIRO-CHAGAS, P. Discalculia do desenvolvimento em crianças em idade escolar: triagem populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genéticos-moleculares. Pesquisa de cooperação internacional - CAPES - PROBAL, 2008. HAASE, V. G.; COSTA, A. J.; ANTUNES, A. M.; ALVES, I. S. Heterogeneidade cognitiva nas Dificuldades de Aprendizagem da Matemática: uma revisão bibliográfica. Psicologia em pesquisa, v. 6, n. 2, p. 139-150, 2012.

58

HAASE, V. G; WOOD, G; WILLMES, K. Matemática. In Malloy-Diniz, L. F., D. Fuentes, D., P. Mattos & N. Abreu (Orgs.) Avaliação neuropsicológica (pp. 123-132). Porto Alegre: ARTMED, 2010 JORDAN, N. C.; LEVINE, S. C. Socioeconomic variation, number competence, and mathematics learning difficulties in young children. Dev Disabil Res Rev, v. 15, n. 1, p. 60-8, 2009. KIRCHHOFF, M. et al. MLPA analysis for a panel of syndromes with mental retardation reveals imbalances in 5.8% of patients with mental retardation and dysmorphic features, including duplications of the Sotos syndrome and Williams-Beuren syndrome regions. Eur J Med Genet, v. 50, n. 1, p. 33-42, 2007. KODITUWAKKU, P. W. A neurodevelopmental framework for the development of interventions for children with fetal alcohol spectrum disorders. Alcohol, v.44, n. 7-8, p. 717-28, 2010. KOOLEN, D. A. et al. Screening for subtelomeric rearrangements in 210 patients with unexplained mental retardation using multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA). J Med Genet, v. 41, n. 12, p. 892-9, Dec 2004. KOPERA-FRYE, K.; DEHAENE, S.; STREISSGUTH, A. P. Impairments of number processing induced by prenatal alcohol exposure. Neuropsychologia, 34 (12):1187-1196, 1996 KOUMOULA, A.; TSIRONI, V.; STAMOULI, V.; BARDANI, I.; SIAPATI, S.; GRAHAM, A., et al.: An Epidemiological Study of Number Processing and Mental Calculation in Greek Schoolchildren. J Learn Disabil, 37:377-88, 2004. KOVAS, Y.; PETRILL, S. A.; PLOMIN, R. The origins of diverse domains of mathematics: Generalist genes but specialist environments. Journal of Educational Psychology, v. 99, n. 1, p. 128-139, 2007. KOVAS, Y.; PLOMIN, R. Generalist genes: implications for the cognitive sciences. Trends in Cognitive Sciences, v. 10, n. 5, p. 198-203, May 2006. LAM, A. C. et al. High rate of detection of subtelomeric aberration by using combined MLPA and subtelomeric FISH approach in patients with moderate to severe mental retardation. Clin Biochem, v. 39, n. 3, p. 196-202, Mar 2006. MAINARDI, P. C. et al. Clinical and molecular characterisation of 80 patients with 5p deletion: genotype-phenotype correlation. J Med Genet, v. 38, n. 3, p. 151-8, Mar 2001. MAZZOCCO, M. M. Math learning disability and math LD subtypes: evidence from studies of Turner syndrome, fragile X syndrome, and neurofibromatosis type 1. J Learn Disabil, v. 34, n. 6, p. 520-33, 2001 Nov-Dec 2001. MAZZOCCO, M. M.; MYERS, G. F. Complexities in Identifying and Defining Mathematics Learning Disability in the Primary School-Age Years. Ann Dyslexia, v. 53, n. 1, p. 218-253, Jan 2003. MAZZOCCO, M. M.; TURNER. J. E.; DENCKLA, M. B.; HOFMAN, K. J; SCANLON, D.; VELLUTINO, F. Language and reading deficits associated with Neurofibromatosis Type 1: Evidence for a not-so-nonverbal learning disability. Developmental Neuropsychology, v. 11, p. 503–522, 1995.

59

MILLER, S. A.; DYKES, D. D.; POLESKY, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, v. 16, n. 3, p. 1215, Feb 1988 MIRANDA, M. As bases genéticas da dificuldade de aprendizagem da Matemática. Dissertação (Mestrado em Genética) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2011. MONFORT, S. et al. Evaluation of MLPA for the detection of cryptic subtelomeric rearrangements. J Lab Clin Med, v. 147, n. 6, p. 295-300, Jun 2006. MRC-HOLLAND b.v. (Disponível em http://www.mrc-holland.com, último acesso em 30/07/2013). MURPHY, M. M.; MAZZOCCO, M. M. Mathematical learning disabilities in girls with fragile X or Tuner syndrome during late elementary school. J Learn Disabil. V. 4, n.1, p. 29-46, 2008. MURPHY, M. M.; MAZZOCCO, M. M.; GERNER, G.; HENRY, A. E. Mathematics learning disability in girls with Turner syndrome or fragile X syndrome. Brain and Cognition, v. 61, n2, p.195–210, 2006 O’ HEARN, K.; LUNA, B. Mathematical skills in Williams syndrome: insight into the importance of underlying representations. Dev Disabil Res Rev. v. 15, n. 1, p. 11-20, 2009. ON LINE MENDELIAN INHERITANCE IN MAN, OMIM (TM), (Disponível em: http://www.omim.org/entry/612585 , ultimo acesso 30/07/2013). OVERHAUSER, J. et al. Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region for the cri-du-chat syndrome. Hum Mol Genet, v. 3, n. 2, p. 247-52, Feb 1994. PATERSON, S. J. et al. Are numerical impairments syndrome specific? Evidence from Williams syndrome and Down's syndrome. J Child Psychol Psychiatry, v. 47, n. 2, p. 190-204, Feb 2006. ROOMS, L. et al. Subtelomeric deletions detected in patients with idiopathic mental retardation using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Hum Mutat, v. 23, n. 1, p. 17-21, Jan 2004. ROOMS, L.; REYNIERS, E.; KOOY, R. F. Subtelomeric rearrangements in the mentally retarded: a comparison of detection methods. Hum Mutat, v. 25, n. 6, p. 513-24, Jun 2005. ROOMS, L.; REYNIERS, E.; WUYTS, W.; STORM, K.; VAN LUIJK, R.; SCHEERS, S. et al. Multiplex ligation dependent probe amplification to detect subtelomeric rearrangements in routine diagnostics. Clin Genet, v. 69, p. 58-64, 2006. RUBINSTEN, O.; HENIK, A. Developmental dyscalculia: heterogeneity might not mean different mechanisms. Trends Cogn Sci, v. 13, n. 2, p. 92-9, Feb 2009. RUSCONI, E.; PINEL, P.; EGER, E.; LEBIHAN, D.; THIRION, B.; DEHAENE, S.; KLEINSCHMIDT, A. A disconnection account of Gerstmann syndrome: functional neuroanatomy evidence. Ann Neurol, v. 66, n. 5, p. 654–662, 2009. SCHOUTEN, J. P. et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res, v. 30, n. 12, p. e57, Jun 2002. SEMENZA, C. et al. Genetics and mathematics: evidence from Prader-Willi syndrome.

60

Neuropsychologia, v. 46, n.1, p. 206–212, 2006. SHALEV, R. S. et al. Developmental dyscalculia: prevalence and prognosis. Eur Child Adolesc Psychiatry, v. 9 Suppl 2, p. II58-64, 2000. SHALEV, R.; GROSS-TSUR, V. Developmental dyscalculia. PediatrNeurol, v. 24, n. 5, p. 337-42, 2001.

SHEN, Y.; WU, B. L. Designing a simple multiplex ligation-dependent probe amplification

(MLPA) assay for rapid detection of copy number variants in the genome. J. Genet.

Genomics, v. 36, p. 257-265, 2009.

SØRENSEN, K. M. et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification technique for copy number analysis on small amounts of DNA material. Anal Chem, v. 80, n. 23, p. 9363-8, Dec 2008. SOTOS, J. F. Overgrowth. Clin Pediatr 1997; 36:89-103 STEIN, L. M.TDE:Teste de desempenho escolar. Manual para aplicação e interpretação. São Paulo: Casa do Psicólogo, 1994 STRØMME, P.; BJØRNSTAD, P. G.; RAMSTAD, K. Prevalence estimation of Williams syndrome. J Child Neurol. v. 17, n. 4, p. 269-71, 2002. VIANNA, G. S. Contribuição das deleções em 22q11.2 para os fenótipos Dificuldade de Aprendizagem da Matemática, Dificuldade de Aprendizagem da Matemática e escrita e Distúrbios de Fonação. Dissertação (Mestrado em Genética) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2011. WANG, P. P. et al. Research on behavioral phenotypes: velocardiofacial syndrome (deletion 22q11.2). Dev Med Child Neurol, v. 42, n. 6, p. 422-7, Jun 2000a. WILLCUTT, E. G. et al. Understanding the complex etiologies of developmental disorders: behavioral and molecular genetic approaches. J Dev Behav Pediatr, v. 31, n. 7, p. 533-44, Sep 2010. WILLIS, A. S.; VAN DEN VEYVER, I.; ENG, C. M. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and prenatal diagnosis. Prenat Diagn, v. 32, n. 4, p. 315-20, Apr 2012. YAMAMOTO, K. et al. A novel gene, CRR9, which was up-regulated in CDDP-resistant ovarian tumor cell line, was associated with apoptosis. Biochem Biophys Res Commun, v. 280, n. 4, p. 1148-54, Feb 2001. YOSHIURA, K. et al. Characterization of a novel gene disrupted by a balanced chromosomal translocation t(2;19)(q11.2;q13.3) in a family with cleft lip and palate. Genomics, v. 54, n. 2, p. 231-40, Dec 1998. ZHANG, A. et al. Deletion of the telomerase reverse transcriptase gene and haploinsufficiency of telomere maintenance in Cri du chat syndrome. Am J Hum Genet, v. 72, n. 4, p. 940-8, Apr 2003.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Str%C3%B8mme%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12088082

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bj%C3%B8rnstad%20PG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12088082

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ramstad%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12088082

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12088082

61

ANEXO 1 - APROVAÇÃO PELA COEP/UFMG

62

63

ANEXO 2 - TCLE

Título da Pesquisa:

Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem populacional e

caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares

Prezado (a) responsável,

Este é um convite para você participar voluntariamente em uma pesquisa que irá avaliar

algumas das habilidades cognitivas de seu filho. Estamos à disposição para esclarecer

quaisquer dúvidas em relação à pesquisa antes e durante a execução da mesma.

Leia as informações abaixo antes de expressar ou não o seu consentimento para

participar da pesquisa.

1. Objetivos do estudo

A pesquisa objetiva avaliar as habilidades matemáticas de seu filho e os fatores que podem

influenciar em seu aprendizado. Acreditamos que esses dados podem contribuir para o

conhecimento do estado atual da aprendizagem da matemática entre as crianças de Belo

Horizonte, e para a obtenção de informações acerca da recorrência familiar das dificuldades

de aprendizagem aritmética. Os resultados do estudo contribuirão para a realização de um

planejamento educacional que favoreça a aprendizagem das crianças com dificuldade de

aprendizagem.

2. Procedimentos da avaliação

Caso você autorize a participação de seu filho na pesquisa, a criança será avaliada quanto

ao seu desempenho escolar, além de realizar testes que investigam funções relacionadas à

aprendizagem como inteligência, atenção, memória, percepção, destreza motora,

velocidade de realização das tarefas, linguagem, planejamento e leitura em

aproximadamente uma sessão de 1 hora. As tarefas serão propostas procurando-se

promover e manter a motivação da participante. Adicionalmente, acontecerá uma coleta de

sangue simples (10 ml de sangue de uma veia do braço) para realização de análise

genética, com o objetivo de investigar as bases genéticas da discalculia.

64

2.1 Coleta e análise do material genético A coleta de sangue será realizada por

profissional de saúde habilitado e com experiência na coleta de sangue, inclusive de

crianças. O sangue será utilizado para análises genéticas no Laboratório de Genética

Humana e Molecular do ICB-UFMG. As análises genéticas têm o objetivo de verificar se

existe algum padrão de variação nos genes que se associa com dificuldades de

aprendizagem na matemática. O sangue será armazenado em um banco de material

biológico sob a responsabilidade da Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho,

regulamentado pelo Conselho de Ética em Pesquisa (COEP) da UFMG e poderá ser

utilizado em outras pesquisas eventualmente aprovadas pela COEP.

3 Realização da Pesquisa

A pesquisa está sendo conduzida pelo Programa de Pós Graduação de Saúde da Criança e

do Adolescente da Faculdade de Medicina da UFMG, pelo Laboratório de Neuropsicologia

do Desenvolvimento da UFMG e pelo Laboratório de Genética Humana e Molecular da

UFMG.

4 Participação voluntária e sem compromisso financeiro

Como sua participação é voluntária, não implica em nenhum compromisso financeiro entre

você e a equipe da UFMG.

5 Liberdade de recusa e de desistência

Você poderá negar o consentimento ou mesmo retirar seu filho em qualquer fase da

pesquisa sem nenhum prejuízo para este. Ele também participa voluntariamente em todas

as etapas da pesquisa, tendo a liberdade de se recusar a participar em qualquer momento.

6 Garantia de sigilo

Os resultados da pesquisa serão utilizados em trabalhos científicos publicados ou

apresentados oralmente em congressos e palestras sem revelar sua identidade e da criança

ou adolescente.

7 Riscos

O risco biológico envolvido é mínimo. A coleta de sangue pode doer um pouco e deixar uma

mancha no local, mas como numa escoriação rotineira, desaparece com o passar do tempo.

Todo o material utilizado para coleta é estéril e descartável, não existindo nenhum risco

de contrair doenças.

65

8 Benefícios em participar da pesquisa

Ao final, você obterá oralmente e por escrito, sob a forma de aconselhamento e de um

relatório, os resultados da análise dos dados de seu filho realizada por profissionais das

áreas da neurologia, genética e psicologia. Caso seja identificado algum problema de saúde

ou alguma necessidade educacional, a família será orientada e o participante encaminhado

para os serviços disponíveis na comunidade com o objetivo de otimizar a saúde , o bem-

estar e as capacidades de aprendizagem deste. Assim, você receberá informações sobre o

desenvolvimento de seu filho e níveis de aprendizagem, identificando pontos positivos e

limitações que podem ser trabalhadas.

Agradecemos sua atenção e valiosa colaboração, subscrevendo-nos.

Atenciosamente,

_______________________________________________

Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase CRM-MG 29960-T Coordenador da Pesquisa Professor Adjunto do Departamento de Psicologia da UFMG Av. Antônio Carlos, 6627, FAFICH-UFMG,Sala 4060 Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento Tel: (31)34096295, (31)91059589/ E-mail: [email protected]

_______________________________________________

Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho Pesquisadora responsável pela parte genética da pesquisa Professora Adjunta do Departamento de Biologia Geral da UFMG Av. Antônio Carlos, 6627, ICB-UFMG Laboratório de Genética Humana e Molecular Tel: (31)34092598/ E-mail: [email protected]

_______________________________________________

Fernanda de Oliveira Ferreira CRP 04/22247 Doutoranda em Ciências da Saúde pela Faculdade de Medicina da UFMG Av. Antônio Carlos, 6627, FAFICH-UFMG,Sala 4060Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento Tel: (31)34096295/ E-mail: [email protected]

Para maiores esclarecimentos você pode consultar também o Comitê de Ética em Pesquisa

(COEP-UFMG), na Av. Antônio Carlos, 6627 – Unidade administrativa II, 2º andar/ Campus

Pampulha- UFMG

Tel: (31)34094592/ E-mail: [email protected]

66

Responsável

Eu,______________________________________________________________________,

responsável pela participante_________________________________________________,

abaixo assinado (a), declaro ter sido informado (a) sobre os procedimentos e propostas da

pesquisa “Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem

populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares” e concordo

em participar voluntariamente na mesma.

Belo Horizonte, ________ de _________________de __________

__________________________________________________________________

Assinatura

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Participante

Eu, ______________________________________________________________________,

abaixo assinado, declaro ter sido informada sobre os procedimentos e propostas da

pesquisa “Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem

populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares” e concordo

em participar voluntariamente na mesma.

Belo Horizonte, ________ de _________________de _____________

__________________________________________________________________

Assinatura

Contato telefônico (Preenchimento não-obrigatório): (____) _____________________

67

ANEXO 3 - PROTOCOLO ADAPTADO PARA A TÉCNICA DE MLPA

Kit lote nº _______________ Data: ___/___/___

1. DESNATURAÇÃO

- Diluir as amostras de DNA em TE para uma concentração desejada entre 20 – 200ng.

- Colocar 2,5 µl de cada amostra de DNA em tubos novos

- Acionar o programa MLPA - COMPLETO no termociclador

- Desnaturar as amostras a 98ºC por 5 min.

Preparar o mix para hibridização (5 % a mais)

Reagentes Cor Número de tubos

1

*MLPA Amarelo 0,75µl

Probe Preto 0,75µl

TOTAL - 1,5µl

*vortexar o tampão antes de usar

- Antes de abrir - Resfriar amostras no termociclador - 25ºC (Pausar o programa)

2. HIBRIDIZAÇÃO

- Homogeneizar bem o mix

- Abrir o termociclador e adicionar 1,5 µl do mix hibridização, e homogeneizar gentilmente

com a pipeta. (Reiniciar o programa)

- Incubar 95ºC por 1min, em seguida, 60ºC por 16 a 20horas (colocar no infinito)

3. LIGAÇÃO

- Preparar o mix de ligação

Preparar o mix para ligação (5 % a mais)


1

*Buffer A Transparente 1,5µl

*Buffer B Branco 1,5µl

Água milliQ - 12,5µl

TOTAL - 15,5 µl

*vortexar os tampões antes de usar e homogeneizar bem o mix com pipeta.

68

- Adicionar a Ligase

Reagente Cor Número de tubos

1

Ligase Verde 0,5 µl

*Homogeneizar gentilmente o mix com pipeta

- Abaixar a temperatura para 54ºC e aguardar até o bloco atingir 54ºC. (Pausar o programa)

- Adicionar a cada amostra 16µl do mix de ligação já com a Ligase e homogeneizar com a

pipeta.

4. PCR

- Continuar a incubação: 15min – 54ºC; 5min – 98ºC e Pausar o programa a 20ºC ou

armazenar este produto por até uma semana a 4ºC, no escuro. Neste momento os tubos

podem ser retirados do termociclador.PCR

- A PCR deve iniciar a temperatura ambiente

Preparar o mix para PCR (5 % a mais)


1

*PCR primer Marrom 1,0 µl

**Polimerase Laranja 0,25 µl

Água - 3,75 µl

TOTAL - 5,0 µl

* vortexar o PCR primer antes de usar. **Segurar a polimerase por 10 seg na mão para reduzir a viscosidade.

- Homogeneizar bem o mix com pipeta.

- Abrir o termociclador e adicionar 5µl do mix PCR e homogeneizar bem com pipeta (deixar

o mix no gelo até usar).

- Reiniciar o programa no termociclador para a etapa da PCR

35 ciclos 95˚C 30 segundos 60˚C 30 segundos 72˚C 60 segundos

1 ciclo 72˚C 20 minutos 15˚C pausar

69

- Retirar os tubos do termociclador.

- Estocar as reações em refrigerador protegidas contra a luz a 4˚C por uma semana ou a -

25˚C e -15˚C por períodos maiores.

- Preparar a solução de corrida em placa própria de corrida no ABI (para separação dos

fragmentos de amplificação por eletroforese):

1,0μl de reação de PCR

9,0μl de formamida

0,5μl de ET ROX 500 ou LIZ 500

Programa MLPA COMPLETO

1. Desnaturação 98˚C 5 minutos

25˚C pause

2. Hibridização 95˚C 1 minuto

60˚C pause

3. Ligação 54˚C pause

54˚C 15 minutos

98˚C 5 minutos

20˚C pause

4. PCR

35 ciclos

95˚C 30 segundos

60˚C 30 segundos

72˚C 60 segundos

72˚C 20 minutos

15˚C pausar

- Estocar as reações em refrigerador.

- Realizar a análise das corridas utilizando programa GeneMarker.

Documents

contribuição das microdeleções/microduplicações intersticiais para