Cromatografia1

5/17/2018 Cromatografia1 - slidepdf.com

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MÉTODOS DE ANÁLISE - CROMATOGRAFIA

1

Métodos de análise

Cromatografia

UNIVERSIDADE F

EDERAL DA PARAÍBACENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEDISCIPLINA:FARMACOGNOSIA

CURSO: FARMÁCIA

PROFESSOR: JOSÉ MARIA BARBOSA FILHODOUTORANDA :GABRIELA LEMOS DE A. MAIA


2

Cromatografia é um método físico-químico deseparação dos componentes de uma mistura,realizada através da distribuição dessescomponentes em duas fases, que estão em contatoíntimo.

Fase estacionária Fase móvel

Constituintes daamostra

MIGRAÇÃODIFERENCIAL


3


4

Método moderno de análise

Facilidade de separação

Identificação

Quantificação das espécies químicas


5

Botânico russo, que inventou aprimeira técnica cromatográfica em1900.

Éter de pe

tróleo

Carbonato de cálcio

Histórico


6

Classificação

Vários critérios:

Forma física

Técnica geral

Cromatografia em coluna Cromatografia planar

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7

Fase móvel

Líquido Gás Flúido supercrítico

Classificação

Vários critérios:


8

Mecanismo de

separação

Físico Químico Mecânico

Classificação

Vários critérios:


9

Adsorção

Baseia-se na adsorção dos componentes de uma solução sobre afase estacionária sólida – o componente que for mais fortementeatraído pelo adsorvente será deslocado pela fase móvel de formamais lenta.

Classificação


10

Separação dos componentes de uma mistura com base nosseus coeficientes de partição entre dois solventes imiscíveisque constituem as fases móvel e estacionária.

Partição

Coeficiente de partição (logP)é uma medida de solubilidadediferencial de compostos

químicos em dois solventes.

Classificação


11

Troca iônica

Fase estacionária é constituída por um suporte, ou matriz,onde são adicionadas grupos funcionais ionizáveis

+

+

-

-

Classificação


12

Exclusão

Baseia-se no tamanho das moléculas do soluto que passamatravés da fase estacionária, constituída por um gel poroso: asmoléculas maiores não conseguem penetrar nos poros e sãoarrastadas pela fase móvel, enquanto que moléculas de menortamanho, capazes de entrar nos poros da fase estacionária sãoretidos por mais tempo no interior da coluna.

Classificação

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13

Cromatografia em camadadelgada


14

Consiste na separação dos componentes de uma misturaatravés da migração diferencial sobre uma camada delgadade adsorvente retido sobre uma superfície plana.

Cromatografia em camada delgada


15

Preparação das placas

Preparação por espalhamento

Limpar as placas para eliminar gordura

Tamanho da placa 20x20 cm

Espalhadores aplicador ou bastão de vidro uiniforme

Secar ao ar

Placas pequenas mergulhar a placa na solução de adsorvente.



16


17


18

Placas pré-fabricadas.





19

Ativação da placa

Depois de secar ao ar livre

As placas pré-fabricads geralmente não precisa ser ativadas

Ativação depende do adsorvente

Sílica, alumina, terra diatomáceas:105-110 0C por 30a 60minutos

Celulose: 105 0C por 10 minuros

Após ativação conservar em dessecadores ou caixas fechadas.



20


21

Fase estacionária adsorvente

Sílica (SiO2): Ácido de silício amorfo

Altamente poroso

Ácido

Diversos tipos: ‘’Merck’’ G aglutinante (gesso, amido, talco) parareter a sílica sobre a placa

H sem aglutinante

F Fluorescência

R Extrapuro

P preparativa



22

Emprego

Separação de compostos lipofílicos como aldeídos,cetonas, fenóis, ácidos graxos, alcalóides etc

Preparação

30 g de sílica em 60-70 mLde água destilada

5 placas 20x 20 cm


Sílica (SiO2): Ácido de silício amorfo


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Alumina (AL2O3) • Alcalina

• Neutra

• ÁcidaUso

Separação de compostos lipofílicos e pelo fato de poder serpreparada com características ácida, neutra ou alcalina, é bastanteútil na separação de substâncias que apresentem variações dessascaracterísticas

Ex: Alcalóides, aminas e vitaminas lipossolúveis

Preparação 30 g de alumina em 40 ml de águadestilada para 5 placas 20 x20 cm



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Outros adsorventes:

Celulose

Poliamida

Terra diatomácea





25

Processo: adsorção

Competição da fase móvel e da amostra, pela superfíciedo adsorvente.



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Fase móvel

Devemos considerar a natureza química das substânciasa serem separadas e a polaridade da fase móvel

Série eluotrópica polaridade poder de eluição.

Se a fase móvel pura não separar usa-se misturas de solventes.



27

Teste

Fase móvel



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Cromatografia em Camada Delgada

SeparaçãoIsolamento

Identificação e Análisesde misturas e subst.

Isoladas (Rf )

Preparativa (CCDP)Analítica (CCDA)

Classificação


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Formas de aplicação das amostras nas cromatoplacas.

Soluções, em solventes voláteis

Micropipetas ou microsseringas

Capilares de vidro

Aplicadores automáticos



30


Gotas ou manchas 1 a 2 cm acimada borda inferiorEntre as gotas 1 cm

Placas analíticas


Forma incorreta de aplicação Forma correta de aplicação

http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.chemlabor.es/imagenes/htl1.jpg&imgrefurl=http://www.chemlabor.es/html/productos/htl.htm&usg=__EhqU-ktGOs44KQKaYsiTPCMzPKs=&h=347&w=216&sz=8&hl=pt-BR&start=19&um=1&tbnid=rJNBLsGTMl0fcM:&tbnh=120&tbnw=75&prev=/images%3Fq%3Dmicropipeta%26hl%3Dpt-BR%26lr%3D%26rls%3Dcom.microsoft:pt-br%26um%3D1






31


Zona de aplicação - tão pequena quanto possível.

Hexano - o ponto de aplicação ficou o menor possível.



32

Placas preparativas

Aplicação na forma de faixas ou linhas,cerca de 2 cm acima da borda inferior

Faixa horizontal uniforme

Retirar a faixa da placa



33


Chromatotron

É uma cromatografia em camada delgada preparativa e aceleradacentrifugamente.

Substitue as CCD preparativas,pequenas colunas e HPLC. Comdimensiões ~ 30 cm.


34

A amostra a ser separadaé aplicada como umasolução no centro do discogiratório umedecido com osolvente.

A eluição com solventegera bandas circulares deseparação doscomponentes que sãoremovidos juntamente como solvente para um tubo de

recepção.

Chromatotron



35

Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total. Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata. Solventes: Compatível com todos os solventes comumenteusados nas outras técnicas cromatográficas, inclusive ácido acético. Nãoapropriada para uso com ácidos minerais.

Vantagens especiais:* Não raspagem de bandas.* Separações são rápidas, cerca de 20 min.* Permite a observação direta por UV ou de compostos coloridos durantea eluição.* Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade.* Utiliza-se pouco solvente e a eluição por gradiente é fácil.* Compacta (facilmente removida de um laboratório para outro), poucoscontroles e não necessita altas pressões.* Baixo preço. Chromatotrons custam menos que um simples HPLCpreparativo

Chromatotron



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Formas de desenvolvimento

Cromatografia ascendente

Solvente deve cubrir a base da placa em regiãoinferior a aplicação da amostra

Cuba bem vedada: evaporação/condensação

Múltiplo desenvolvimento: diversas subidas





37




38

Desenvolvimento ascendente bidimensional

Sobe uma vez, retira secar e girar 90 graus e subir novamente em

outro sistema de solvente

Desenvolvimento circular

Posição horizontal

Amostra em um círculo ao redor do centro

Chromatotron

Preparativa.




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Revelação

Consiste em tornar visível as substâncias incolores presentesna amostra

Métodos :

Físicos

QuímicosBiológicos



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Lâmpada de Ultra-violeta – compostos

que absorvem (cromóforos) tornam-se

fluorescentes quando excitados por essas

radiações, comprimento de onda

selecionado (254 a 360 nm) emitemmanchasescuras (arroxeadas).

Físicos

Reativos Universais: reagem com a maioria dos compostos orgânicos,indiferente`a classe ou a função química.



41

Vapores de iodo- formam complexos com os compostos orgânicos,

geralmente de cor marrom.

Vantagem: é que o iodo pode ser eliminado por aquecimento da placa,podendo-se borrifar a placa com outro revelador.

Isso é possível porque o iodo se une apenas fisicamente àssubstâncias, exceto em compostos insaturados , pode se somar asinsaturações



42

Ácido sulfúrico/metanol- oxida todos os compostos orgânicos,

produzindo manchas coloridas após aquecimento(~1000

C)


http://est.ualg.pt/est/index2.php?option=com_jce&task=popup




43

Reativos específicos

Anisaldeído sulfúrico- usado na detecção de esteróides eterpenóides. Apresentam manchas rosadas após aquecimento

(~100 oC).

Cloreto férrico (FeCl3)- detecção de grupo hidroxila (OH)

aromático, como compostos fenólicos em geral ( flavonóides,

taninos, fenóis, etc.). Produz manchas coloridas (azul, verde,

marrom,etc).



44

Reativo de Dragendorff- usado para detecçãode alcalóides. Produz manchas alaranjadas

intensas.

OBS: Devido este reativo dar falso positivo com sesquiterpenos e

outros compostos, deve-se confirmar a presença de alcalóides usando

outros reativos( p. ex. Mayer, Wagner, etc.)


Reativos específicos


45

DETERMEINAÇÃO DO FATOR DE RETENÇÃO (RF)

Rf= distância percorrida pela mancha desde a origem (b)distância percorrida pelo solvente desde a origem (a)

Rf adequado~ 0,4 - 0,6



46

Linha do solvente

Origem

a

Rf= distância percorrida pela mancha desde a origem (b)distância percorrida pelo solvente desde a origem (a)

b1

b3

b2



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Vantagens

Fácil compreenção e execuçãoSeparações em breve espaço de tempo

Repetitividade

Baixo custo

Aplicações

Presente em todos os laboratórios de química ou biologia

Análise de substâncias orgânicas e inorgânicas

Acompanhamento de reações de síntese e de processos depurificações



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Usada em:

Reações orgânicas

Pureza

Acompanhamento rx

Fitoterapia Controle de qualidade

Fitoquímica

Pureza dos compostos

Natureza química

Identificação





49

10 min. 30 min. 1 hora 2 horas

1) Um acadêmico realizou uma reação entre os

compostos A e B, procurando obter C. Verificou

experimentalmente os seguintes perfis em CCD,

visualizados por lâmpada de UV. Discuta os

resultados.


50

2) Foram realizados estudos visando o controlede qualidade de fitoterápicos disponíveis nomercado. A equipe adquiriu 4 amostras detintura de camomila produzidas por distintasindústrias. Após o tratamento adequado dasamostras, a equipe obteve os perfiscromatográficos mostrados abaixo. Discuta osresultados.

UV FeCl3 Dragendorff Anisaldeídosulf.


51

Cromatografia em papel


52

É um método fisico-quimico de separação doscomponentes de uma mistura, em função dodeslocamento diferencial do soluto arrastadospor uma fase móvel, sendo retidosseletivamente por uma fase estacionárialíquida.



53

A separação: relaciona-se com as diferentes

solubilidades na fase móvel e na faseestacionária.

A celulose: mais de 2000 unidades de açúcaranidro ligadas por Oxigênio.

A água tem afinidade pelo oxigênio e formapontes de hidrogênio com o açúcar, ficandoretido e funcionando como fase estacionária.



54

Cromatografia ascendente

Utiliza tira de papelMarca-se com lápis o ponto de aplicação da amostra (2cm da margem) e o ponto de chegada da fase móvel.

A tira de papel deve ser suspensa na vertical dentro deuma cuba, com solvente que deve ficar abaixo ponto deaplicação da amostra e estar bem vedada.

A fase móvel move-se por capilaridade

Verifica-se o Rf.





55

PapelSuporte

Deve ser uniforme em composição e superfície.Existem vários tipos e a escolha depende dascaracterísticas da amostra.

Também podem ser modificados:

Papel acetilado: útil para separar substâncias hidrofóbicas

Papel impregnado ; Com silicona, parafina etc. Paraseparação de substâncias moderadamente hidrófobas



56

Fase móvel

Influencia muito na separaçãoDeve ser escolhida de acordo com a naturezaquímica das substâncias da amostra, assim compela viscosidade e polaridade da fases móvel.

Ex: éter de petróleo, hexano, tolueno, acetonaetc



57

Fases estacionária

Fase estacionária normal

Fase aquosa: o papel é saturado com vapor de água ouvapor de água mais outro solvente, no interior de umacuba fechada antes de iniciar o desenvolvimento.

Fase estacionária não-aquosa: trata-se o papel emsolução de acetona e dimeti lformamida, por 10 a 15min e depois deixa-se secar.



58

Fases estacionária fase reversa

O papel é tratado com substâncias hidrofóbicas(parafina líquida, óleo etc)


Fases estacionária


59

AplicaçõesIdentificação e separação de compostos polares,substâncias hidrofóbicas como antibióticoshidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos

Mais pratica que cromatografia em camadadelgada e de fácil reprodução do Rf paracaracterização.

Útil para acompanhar a seqüência de uma reaçãoquímica



60

Cromatografia em Coluna




61

Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico,preenchida com um adsorvente adequado.



62

Coluna

Vidro

Torneira

Extremidade aberta



63

Dimensões

Depende da quantidade do material a ser cromatografado

Diâmetro interno

Preparativas (6- 50 mm)

Análiticas (2-6 mm)

Microdiâmetro (1-2 mm)

Capilares (< 1 mm)

Coluna

Cromatografia em Coluna MÉTODOS DE ANÁLISE - CROMATOGRAFIA

64

Adsorventes

Os mesmos da cromatografia plana:

A diferença está no tamanho das partículas (63 a 200 μm)enquanto que na cromatografia planar ( 5 a 40 μm)

Ex: sílica , a lumina

Silicato de magnésiopropriedades intermediárias entre a sílicae a alumina; separação de esteróides, lipídios e derivados deaçúcar.

Carvão é uma mistura de carvão grafitizado, cuja superfícies é

polar, e carvão ativo obtido pela oxidação de material orgânico àbaixa temperatura, que contém grupos funcionáis apolares.



65

Processo de adsorção

As substâncias eluirão da coluna segundo a polaridade.

Sílica e alumina: polares

retém substâncias polaresCO2H > OH > NH2>SH > CHO >C=O > CO2R > OCH3> CH=CH


Apolar

POLAR


66

Deve-se evitar que o movimento da substânciaadsorvida na coluna seja lento e que a banda se tornelarga

Processo de adsorção


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67

Reações na coluna

Adsorventes podem catalizar reações

Exemplo: alumina alcalina condensação de aldeídos e cetonas

Sílica pode levar a isomerização de terpenos e esteróides


68

Fase móvel

Função do solvente: devem ser levadas em consideração asrelações de solubil idade dos componentes da mistura a ser

cromatografada.

Função de eluente: promover o desenvolvimento da mistura nacoluna e remover esses componentes do adsorventeseletivamnete.

Devem ter baixo ponto de ebulição ( 35-85 C) para que sejamevaporados facilmente.



69

A escolha do eluente pode ser baseada em CCD

Eluentes : ordem crescente de polaridade

Hexano

Éter de petróleo

Cicloexano

Tolueno

Diclorometano

Clorofórmio

Éter etílico

Acetato de etila

Piridina

Acetona

Etanol

Metanol

Ácido acético


70

Enchimento da coluna

Uniformidade= eficiência

Dificuldades ar retido forma canais

Para evitar agitar o adsorvente num frasco com a fase móvel atéformar uma pasta

Coloca-se a pasta na coluna contendo pelo menos um terço desolvente sob vibração

As partículas da fase estacionária devem ser o mais homogêneopossível

Evitar deixar a coluna secar



71

Aplicação da amostra

Colocada no topo da coluna

Sólida ou líquida

Após adiciona-se fase móvel

E fase estacionária

Proporção de faseestacionária no mínimo 25/1da amostra



72

Eluição

•Conveniente fixar a coluna na posição vertical

Ação da gravidade e evita canais de ar

A fase móvel passa pelo adsorvente e trás consigo oscomponentes da amostra.

Quanto mais fracamente o componente for adsorvido maisrapidamente passará pela coluna





73


74

Cromatografia

em Coluna


75

Para ocorrer uma completa separação, a fase móveldeve ser :

Fracamente adsorvida

Não ser afetada quimicamente

Possibilitar realmente o desenvolvimento de uma corridacromatográfica, ocasionando por um determinado grau deadsorção.

Vizualização


76

Vantagens

Tecnicamente simples

Facilmente aplicada para fins preparativos

Desvantagens:

Produção de caudas

Não totalmente reprodutível



77

Aplicações:

Laboratório de química orgânica: separação e purificação dereagentes e materiais obtidos por síntese

Laboratórios de produtos naturais: escala preparativa

Laboratório de análise clínicas: para separa esteróides daurina ou do sangue


78

Cromatografia por exclusão

http://ube-164.pop.com.br/repositorio/4488/meusite/qorganicaexperimental/cromatografia_arquivos/image001.png



http://www.geocities.com/Vienna/Choir/9201/coluna_cromatografica.jpg





79

A cromatografia por exclusão

promove uma seletiva e dinâmicadistribuição das moléculas do

soluto entre duas fases líquidas

separadas, dependentes de uma

estrutura estacionária contendo

poros de tamanho controlado.


80

O recheio ou gel é constituído por macromoléculas quetem ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas quenele são insolúveis.

Fase estacionária gel,não-carregado, e inchadocom o mesmo líquido.

Uma molécula dentro dafase estacionária não semove na direção do fluxo dolíquido.



81

Fases

O gel não é realmente uma fase estacionária, ele apenasfornece os poros nos quais se dá o mecanismo dedistribuição, essa distribuição é do soluto entre a fase móveldentro e fora dos poros.

Gel material elástico, contendo água, com estruturatridimensional contendo ligações cruzadas.

Homogêneomais moles e permitem entrada de partículascom baixo peso molar

Heterogêneo

regiões concentradas e outras quase vazias,entrada de moléculas maiores.

Cromatografia por exclusão MÉTODOS DE ANÁLISE - CROMATOGRAFIA

82

Características de um gel adequado

Inércia química

Estabilidade

Baixo teor de íons

Quimicamente definido, permitindovariações para o fracionamento de diferentesintervalos de massa molar.

Deve conter partículas de tamanho edistribuição controlados

Rig idez mecânica para não se deformarpelas forças do fluxo



83

Tipos de gel

Gel de dextrana

É um polissacarídeo com unidades de glicose, obtido porfermentação da sacarose.

Em contato com a água incha e forma um gel.


84

Sephadex (PHARMACIA)


Quimicamente estável;

Vários graus de ligaçõe

scruzadas;

G-10 ou G-25 peptídeos;

LH-20pode ser usado comsolventes polares,fracionamento de pequenasmoléculas.




85

Gel de ágar e agarose

Indicados para separação de substâncias de alta massamolar, com vantagem de apresentar estabilidademecânica.

Ágar Obtido de algas, contémgrupos carregados negativamente.

Agarose é um componente doágar, sem grupos carregados.

São sensíveis a temperatura.


86

Equipamento

Coluna cromatográfia

Amostra líquida (1 a 5% do volume da coluna)Não empacotar a coluna

Sistema de solvente



87

Vantagens

Aplicações

Separação de moléculas que diferem no tamanho

Remoção de fenol de preparações de ácidos nucléicos

Remoção de substâncias radio ativas

Determinação da massa molar

Simplicidade técnica

Insensibilidade a temperatura e solvente

Versatilidade


88

Cromatografia por Bioafinidade


89

Baseia-se nas propriedades biológicas ou funcionais dasespécies que interagem: a substância a ser separada e a fase

estacionária.

Princípio do método

Isolamento seletivo de macromoléculas, através daspropriedades dessas substâncias de unirem-sereversivelmente a ligantes específicos



90

Suporte insolúvel ou matriz

Propriedades

Ser mecânica e quimicamente estáveis

Uniformes

Rígidas

Esféricas

Porosas

Interagir fracamente com as macromoléculas

Exemplos: celulose, agarose, dextrana etc





91

Preparação das fases estacionárias

Ativação da matriz ligação de grupos reativos a matriz inerte

M-OH + A-R-B M-OH-B + HA

Acoplamento do ligante à matriz ativada.

Tempo de acoplamento é de poucas horas, a temperaturaambiente.

M-OR-B +H-Ligante M-OR-Ligante + HB



92

Preparação da coluna

Montagem igual aos demais

Preferir plástico ou aço inox

Colunas pequenas (seletiva) 3x 0,8 cm

Preparação da amostra

Dissolvida no eluente que iniciará o processo

Se específica a ligação o volume não é crítico, se não deve-seusar 5 % do volume da coluna

Vazão alta pode diminuir a eficiência

A temperatura diminui a afinidade



93

Métodos de eluição

Agentes de eluição específicos l igação preferencial dasubstância nesse agente, em vez de ligar-se a fase estacionária

Agentes não específicos variação de pH e /ou força iônica dotampão de eluição pode provocar alterações no complexomacromolécula-ligante, por ionizar ou modificar estruturalmentemoléculas que participam do processo.



94

Aplicações

Puri ficação de macromoléculas ( proteínas, enzimas,anticorpos, receptores)

Purificação de micromoléculas (peptídeos)



95

Cromatografia de troca iônica


96

A fase estacionáia é altamente carregada, e solutos comcargas de sinais contrários a esta são seletivamente

adsorvidos da fase móvel.

Os solutos adsorvidos podem ser subsequentemente eluídos,por deslocamento com outros íons, com o mesmo sinal, masmaior força de interação com a fase estacionária

A diferença de afinidade entre os íons da fase móvel e amatriz é devido a diferença de cargas e pode ser controladautilizando fatores como o pH e a força iônica





97

Cromatografia de troca iônicaMÉTODOS DE ANÁLISE - CROMATOGRAFIA

98

Matriz

Material poroso

InerteInsolúvel em água e em solventes orgânicos

Apresentando ligações covalentes a grupos trocadoresiônicos

Podem ser inorgânica, orgânica , naturais ou sintéticas

Ex:Celulose, dextrana, agarose etc



99

Liga-se covalentemente a matriz

Aniônico trocam ânions e apresentam grupos positivos ligadosa matriz

Catiônicotrocam cátions e apresentam grupos negativosligados a matriz

Trocadores

Cromatografia de troca iônicaMÉTODOS DE ANÁLISE - CROMATOGRAFIA

100

Aplicações

Laboratórios de pesquisa

Desionização da água e de muitos licores açucarados defrutos e sua despigmentação

Analise e eliminação de íons quando estes estãointerferindo na dosagem de determinada substância

Laboratórios bioquímicos: dosagem deaminoácidos

Separação de fármacos



101

Referências

COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentosde Cromatografia. Editora Unicamp. 2007.

OBRIGADA!!!

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