Cultivo Celular aplicado à

Oncologia

Workshop do Projeto Própolis

Cultivo celular aplicado à Oncologia

1. Banco de Células GPO

2. Estrutura Laboratorial

3. Linhagens Celulares

4. Testes de Avaliação

5. Resultados Publicados

6. Trabalhos em andamento

• Infraestrutura:

Laboratório 8 – Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese

Laboratório 9 – Laboratório de Genômica Funcional

Grupo de Pesquisa em Oncologia

Laboratório de Cultivo Celular

Sala do Cultivo:

• 2 Fluxo Laminar Vertical

• 1 Estufa de CO2

• Microscópio invertido

• Banho-Maria

• Centrifuga

Sala de Experimentação:

• Citômetro de Fluxo

• Leitor de placa

• Geladeira

• Botijões de Nitrogênio

Banco de Células GPO

Linhagens de Células Humanas

A549 Carcinoma de Pulmão

5637 Carcinoma de Bexiga

HT-29 Adenocarcinoma de Colorretal

MCF-7 Adenocarcinoma de Mama

MDA-MB-231 Carcinoma de Mama

MG-63 Osteossarcoma

HeLa Adenocarcinoma Cervical

SH-SY5Y Neuroblastoma

LNCap Carcinoma de Prostata

HL-60 Leucemia Promielocítica Aguda

Outras Linhagens Celulares

CHO Ovário de Hamster Chinês

Banco de Célula do Rio de Janeiro -

BCRJ

www.bcrj.hucff.ufrj.br/

Treinamento Banco de Células do Rio de Janeiro

• estabelecida a partir do carcinoma da bexiga primário (grau II) de um paciente por Dr. G. Cannon em 1974;

• Meio: RPMI + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2

• Adenocarcinoma alveolar de células epiteliais basais

• Esta linha foi iniciado em 1972 por D.J. Giard, através da cultura de tecido de carcinoma pulmonar de um homem;

• Meio de cultivo: DMEM + 10% SFB, a 37°C em 5% CO2

A549 – Carcinoma de Pulmão

5637– Carcinoma de Bexiga

• Adenocarcinoma de Mama, retirada de mulher caucasiana de 69 anos, isolada em 1970;

• Possui expressão de receptores de estrogenio;

• Meio: RPMI + 20% SFB, 37°C em 5% de CO2

• Adenocarcinoma colorretal, retirada de mulher, caucasiana de 44 anos;

• Isolada em 1964 por J. Fogh de tumor primário;

• Meio: DMEM + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2

HT-29– Adenocarcinoma de Colorretal

MCF-7– Adenocarcinoma de Mama

Realização de Experimentos no Cultivo Celular

1. Novas drogas antitumorais:

Chalconas

2. Drogas antitumorais modificadas estruturalmente:

AZT: AZT-Se-Me e AZT-Se-CL

Disseleneto de Difenila

3. Drogas antitumorais Nanoencapsuladas:

Tretionoína

Metotrexato

4. Compostos com ação antitumoral:

Própolis Vermelha

5. Outras Estratégias:

BCG recombinante

1. Morfologia

2. Ensaio de MTT

3. Colorações

4. Citometria de fluxo

5. Expressão Gênica

6. Western blotting

Formas de avaliação da ação antitumoral

Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio

Avalia a atividade metabólica das células;

• Teste de triagem:

amplamente utilizado na avaliação do efeito antiproliferativo de drogas tumorais;

• Baseado na capacidade das células viáveis reduzirem metabolicamente o sal de MTT;

• Formação de cristais de formazan de cor azul-púrpura, que se acumulam no citoplasma celular;

Ensaio de MTT

Redução mitocondrial

Cristais de formazan

Células viáveis!!

Ensaio de MTT

Cultura de células com determinado composto

Incubação do reagente MTT

Lise das células e diluição dos

cristais com DMSO

Leitura por espectrofotometria

Ensaio de MTT

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit

• Determina a viabilidade de células de uma população com base na integridade da membrana plasmática e atividade intracelular de esterase;

Colorações para viabilidade celular

• Células discriminadas:

Vivas com coloração verde da calceína-AM (atividade esterase intracelular);

Mortas com coloração vermelha do etídio homodímero-1 (perda de integridade da membrana plasmática);

Controle Meio + Soro

∆leuD + Ag85B Pasteur + Ag85B

Controle BCG Pasteur

Cél. 5637; Aumento 20 X

Guava Nexin Reagent

Guava Cell Cycle Reagent

Guava Multi Caspase SR Kit

Guava® TUNEL Assay

Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit with YO-

PRO®-1 and PI for Flow Cytometry

Citometria de Fluxo

Guava Nexin Reagent Avaliação de apoptose inicial;

O ensaio baseia-se na translocação da fosfatidilserina para a superfície externa da membrana celular → associado ao início da apoptose;

Anexina V possui alta afinidade por fosfatidilserina;

Na Apoptóse Inicial, as moléculas de fosfatidilserina são translocadas para a superfície externa da membrana celular, então Anexina V liga-se facilmente;

O ensaio baseia-se em duas estratégias:

1) Anexina V-PE detecta fosfatidilserina na membrana de células apoptóticas;

2) 7-AAD (corante impermeável na membrana celular íntegra) penetra na membrana celular de células mortas e em apoptose tardia, indicando integridade de membrana;

Citometria de Fluxo

Guava Nexin Reagent

Céls. não apoptóticas: Annexin V(-) e 7-AAD(-)

Céls. em Apoptose Inicial: Annexin V(+) e 7-AAD(-)

Céls. em Apoptose Tardia: Annexin V(+) e 7-AAD(+)

• Gráfico:

quadrante inferior esquerdo: céls. viáveis;

quadrante inferior direito céls em apoptose inicial;

quadrante superior direito: apoptose tardia ou necrose.

Guava Cell Cycle Reagent

• Determina a percentagem de células em: G0/G1, S e G2/M com base no conteúdo de DNA;

• Através da coloração do DNA celular com iodeto de propídio (PI);

Células em repouso (G0/G1) contêm duas cópias de cada cromossomo, assim como as em S: permitindo intercalação PI com intensidade 1x de fluorescência;

Células em Fase G2/M possuem o DNA duplicado, portanto com intensidade 2x de fluorescência;

Citometria de Fluxo

Guava Cell Cycle Reagent

• Histograma:

M1: células em G0/G1

M2: células em S

M3: células em G2/M

Guava Multi Caspase SR Kit

• Diferencia células apoptóticas de células não-apoptóticas;

• As caspase desempenham um papel central na morte celular por apoptose;

• Caspases iniciadoras: -2, -8, -9, -10; Caspases efetoras: -3, -6, -7;

• Fluorocromos:

sulforrodamina-valil-alanil—aspartilfluoromethylketone (SR-VAD-FMK); a intensidade de fluorescência vermelha é proporcional a atividade de caspases;

7-AAD é um indicador da integridade da membrana;

Citometria de Fluxo

Guava Multi Caspase SR Kit

• Céls. vivas: SR-VAD-FMK (-) e 7-AAD (-) → verde-azulado

• Apotose inicial: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (-) → azul

• Apoptose tardia: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (+) → rosa

• Céls. mortas: SR-VAD-FMK (- ou fraco) e 7-AAD (+) → roxo

Guava® TUNEL Assay

Distingue duas populações: células não apoptóticas (TUNEL-negativo) de células apoptóticas (TUNEL-positivo), através da fragmentação da cromatina nuclear;

cadeias de DNA com a extremidade 3'-hidroxila exposta são enzimaticamente marcadas, Desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) catalisa a incorporação de bromo-desoxiuridina (BrdU), TRITC conjugado anticorpo anti-BrdU marca estas fragmentações;

M1: céls não-apoptóticas; M2: céls. apoptóticas;

Citometria de Fluxo

PCR em Tempo Real

1. Genes relacionados a apoptose

2. Genes relacionados ao ciclo celular

3. Genes de enzimas antioxidantes

Expressão Gênica

qRT-PCR1. Genes apoptóticos: Bax Bcl-2 Survivin

2. Genes relacionados ao ciclo celular: p53 p21

3. Genes de enzimas antioxidantes: CAT (Catalase) GPx (Glutationa Peroxidase) TRX (Thioredoxina redutase-1) GST (Glutationa-S-transferase) CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase) Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)

AIF Endo G Caspases 3, 8 e 9

qRT-PCR1. Genes apoptóticos:

Bax

Bcl-2

AIF

Endo G

Survivin

Caspase 8

Caspase 9

Caspase 3

Via de ativação

mitocondrial

Proteína Inibidora

de Apoptose

Caspases

Iniciadoras

Caspase

Efetora

qRT-PCR

2. Genes relacionados ao ciclo celular:

p53

p21

qRT-PCR3. Genes de enzimas antioxidantes:

CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase)

Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)

CAT (Catalase)

GPx (Glutationa Peroxidase)

TRX (Thioredoxina redutase-1)

GST (Glutationa-S-transferase)

• Detecta as proteínas de uma amostra através de anticorpos específicos

Bcl-2

Bax

p53

Western blotting

Trabalhos publicados e em andamento do Cultivo de Células -GPO

• Avaliação do efeito antitumoral de disseleneto de difenila e duas modificações deste composto em adenocarcinoma de cólon (HT-29);

• As modificações propostas, 3-(trifluorometil)- disseleneto de difenila e 4-metoxi difenil diseleneto, induziram citotoxicidade por apoptose nas céls HT-29.

• Objetivo: testar uma cepa auxotróficas de BCG recombinante superexpressando

Ag85B (BCG ΔleuD /Ag85B) na citotoxicidade em carcinoma de bexiga (5637);

• Resultados: sugerem que esta modificação aumenta a citotoxicidade do BCG

recombinante in vitro;

• Objetivo: sintetizar e testar a citotoxicidade de seis derivados de

chalcona em células de adenocarcinoma do cólon humano (HT-29);

Nanobiotecnologia

A aplicação da Nanotecnologia na liberação de drogas possibilita a criação de novas estratégias terapêuticas, capazes de alterar o cenários

das indústrias farmacêutica e biotecnológica.

Biotecnologia Médica

Metotrexato Alta toxicidade

Nanoformulação contendo diéster etilíco de metotrexato

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Doutoranda Virginia Yurgel

Avaliação da atividade antitumoral in vitro de tretinoinananoencapsulada em linhagem tumoral de

adenocarcinoma de pulmão (A549)

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Doutoranda Eduarda Schultze

• Delineamento experimental

• Resultados Preliminares

Avaliação da atividade antitumoral in vitro da Própolis Vermelha

Profa. Fabiana K Seixas

Pós-doutoranda Priscila M. M. de Leon

Doutoranda Karine R. Begnini

Priscila Marques Moura de Leonprimleon@gmail.com

www.ufpel.edu.br/cenbiotPPGB (Programa de Pós - graduação em Biotecnologia)- UFPel

Obrigada pela atenção!