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TIT: Da química biológica à biologia molecularAUT: Rogério MeneghiniREF: Centenário Heinrich Rheinboldt: 1891-1991 (P. Senise, editor). Univ. de São Paulo - Inst. de Química, 1993, São Paulo. p.159-166.CLA: Reprodução de artigo publicado TEM: Bioquímica, biologia molecular, célulaRES: Um panorama da biologia molecular é apresentado. As contribuições à elucidação dos circuitos de informação existentes nas células são destacadas e exemplificadas. Áreas de relevância atual e perspectivas futuras são enunciadas. (6 referências) ARQ: Allchemy - Série Alfa, 1995, BA56002S.DOC

DA QUÍMICA BIOLÓGICAÀ BIOLOGIA MOLECULAR

Rogério MeneghiniDepartamento de Bioquímica, Instituto de Química - USPAv. Prof. Lineu Prestes, 748, 05508-900 São Paulo, SP

A Biologia Molecular e os Circuitos de Informação

A Biologia Molecular tem sido pródiga em destrinchar circuitos de informação existentes nas células. Estes circuitos vão desde o famoso dogma central da Biologia Molecular, segundo o qual o fluxo de informações flui do DNA para o RNA e deste para as proteínas, até circuitos de controle de síntese de biomoléculas e de transdução de sinais. A figura 1 mostra, a título de ilustração, o esquema do circuito de informações responsável pelo controle da entrada de ions de ferro para o interior de uma célula. Uma proteina citoplasmática, designada por IRF, é sensora da concentração de íons de ferro intracelular. Quando esta concentração é baixa, a IRF é ativada e se liga ao RNA mensageiro da proteína receptor de transferrina, estabilizando-o e fazendo com que ele produza em maior quantidade esta proteína. Como o receptor de transferrina é responsável pela captura de íons de ferro de fora da célula, o nível intracelular destes íons tende a voltar para um valor normal. Quando o nível de íons de ferro intracelular torna-se muito alto, a IRF se desliga de um outro RNA mensageiro, o de ferritina, ativando-o e fazendo com que esta proteína seja produzida em maiores quantidades. Como esta proteína é responsável pelo armazenamento de ferro na célula, o seu aumento acarreta uma diminuição do nível intracelular de íons de ferro, o qual volta para o normal.

O que é surpreendente é que este eficiente e elegante mecanismo de homeostase de íons de ferro intracelular, envolvendo complexas interações de macromoléculas, foi descoberto por alguns grupos de pesquisa cujos pesquisadores não precisariam ter conhecimentos de Química muito superiores aos necessários para medir pH e fazer soluções tampão. Isto porque este circuito, como tantos outros da Biologia Molecular atual, é fruto de experimentos fundamentalmente genéticos, nos quais genes são isolados, introduzidos ou removidos das células, observando-se as modificações fenotípicas que isto acarreta. Soma-se a isto um conjunto de técnicas principalmente eletroforéticas, que permitem que estes genes, íntegros ou cortados, sejam separados e analisados e têm-se os resultados aí apresentados. Magicamente simples e de alcance tão profundo, poderia se dizer. Porém quão profundo são, de fato, os conhecimentos resumidos nestes circuítos ?

Na verdade, uma análise mais cuidadosa mostra que, em primeiro lugar, estes conhecimentos são fundamentalmente qualitativos. Nada se sabe, no exemplo dado,

sôbre as concentrações celulares relativas de íons de ferro, ferritina e receptores de transferrina, que permitem manter a homeostase. Não se sabe nada, tampouco, sobre a natureza dos íons de ferro intracelular, isto é, com que espécies ele estaria complexado. Isto dificulta qualquer consideração mais quantitativa sôbre os equilíbrios químicos envolvidos nestes processos. Essa é uma característica comum dos circuitos desvendados pela Biologia Molecular. Os fluxos de informação são precisamente conhecidos; porém, uma compreensão mais profunda das interações envovidas requer conhecimentos quantitativos que estão fora do alcance da abordagem experimental desta área.

Figura 1. Mecanismo de homeostase de ferro em células eucarióticas

Outra característica destes circuítos é que eles fornecem uma visão basicamente informacional e nada conformacional, empregando-se aqui a nomenclatura criada por John Kendrew, na década de 60. No exemplo fornecido, a Biologia Molecular desvendou que o circuito de informações é ligado e desligado em vários pontos pelas interações entre íons de ferro e IRF, transferrina e receptor de transferrina e IRF e RNAs mensageiros. Porém o cerne da questão, que é o de como estas interações ocorrem e tornam possível ligar e desligar o circuito não é resolvido pela Biologia Molecular informacional de manuais e kits, mas faz parte de uma outra

Biologia Molecular, a conformacional, que requer abordagens eminentemente físicas e químicas. Parece apropriada uma analogia entre a Biologia Molecular informacional e conformacional com o software e hardware de computadores. O software corresponde à linguagem e aos programas que determinam o fluxo de informações a ser obedecido. Porem, isto só é possível por estar por trás uma complexa estrutura de chips que constitue o hardware.

A Química Biológica

Os químicos tem estado relativamente afastados da Biologia Molecular desde que esta tomou prevalentemente o rumo informacional, na década de 50. De certa forma, este rumo prescindiu da Química. É interessante lembrar que algumas das lideranças desta vertente não se preocuparam em manifestar um certo menosprezo pela Química e pelos químicos, o que provavelmente contribuiu para afastá-los ainda mais da Biologia Molecular. Talvez este comportamento fosse em parte uma reação ao papel preponderante que os químicos haviam tido na Biologia desde o século passado. De fato, desde a síntese da uréia por Wholer em 1818, descoberta que marcou o inicio da queda do vitalismo, os químicos, principalmente da escola alemã, passaram a se interessar crescentemente por Biologia. É interessante notar que os seus interesses não recaiam tanto sôbre problemas biológicos quanto sôbre material biológico como fonte de inspiração para a descoberta de novas estruturas que talvez fizessem surgir novos conceitos químicos. Havia assim uma certa semelhança entre o que os químicos de então esperavam da Biologia e as expectativas de alguns físicos nas décadas de 40 e 50, como Max Delbruck, de descobrirem novas leis físicas ao investigarem problemas biológicos.

O que esse interesse gerou foi um capítulo empolgante da Química e que passou a se chamar de Química Fisiológica ou Química Biológica. É difícil para um estudante de Química atual deixar de se entusiasmar com as descobertas do final do século passado por Emil Fisher, das estruturas isoméricas espaciais de carboidratos. Muitos compostos biológicos foram estudados e suas estruturas básicas elucidadas. Friedrich Miescher, discípulo de Hoppe-Zeyler, iniciou os estudos de ácidos nucleicos em 1869 e nos anos 30 deste século já se conhecia com exatidão a estutura dos seus componentes e o seu arranjo na sequência polimérica, bem antes de se ter alguma idéia sôbre suas funções. Além da elucidação de estruturas deve-se ressaltar outro legado dos químicos biológicos que foi o fantástico arsenal de metodologias e estratégias para estudos estruturais, e que pemitiu o avanço posterior da Bioquímica e da Enzimologia. É interessante que há ainda hoje muitos químicos biológicos, usando fundamentalmente as metodologias e abordagens criadas há cerca de um século, e fazendo contribuições importantes, principalmente na área de estrutura de carboidratos, que readquiriu grande significado na Biologia moderna.

No final da década de 20 ganhou impulso um novo ramo da Química Biológica e que hoje se define como Bioquímica. Provavelmente, o conceito de Bioquímica que prevalece desde há algum tempo é o da ciência que busca compreender como flui a

energia química nos processos catabólicos e anabólicos e que recebeu grande influência da Termodinâmica nos seus rumos. Claro é que para se entender como flui esta energia foi necessário um considerável trabalho químico no sentido de elucidar a estrutura de ínumeros compostos intermediários nas rotas metabólicas. Há toda uma beleza química intrínseca na forma como os compostos vão aos poucos se modificando para liberar ou ganhar energia nas rotas metabólicas de degradação e de biossíntese. O aspecto químico da Bioquímica tem sido as vezes menosprezado. Uma visão quase caricata, mas real, deste desdém é a de professores ensinando Bioquímica e utilizando, ao invés de estruturas químicas, os nomes dos compostos, ao descreverem as rotas metabólicas e explicarem como são gastos ou formados os ATPs. Uma possível origem desta concepção aquímica da Bioquímica advém do avanço da vertente informacional da Biologia Molecular a partir dos anos 50.

A Biologia Molecular Informacional e Conformacional

Para compreender o afastamento dos químicos da Biologia é preciso entender um pouco melhor as origens da Biologia Molecular informacional e conformacional. A primeira advém fundamentalmente da Genética, e da busca da compreensão de como flui a informação do material genético para os circuitos fisiológicos. Ela teve um grande impulso quando da publicação do livro "O que é a vida" escrito por Erwin Schrodinger em 1944, e que estimulou muitos outros cientistas, principalmente físicos, a investigarem o problema biológico do fluxo de informação. Basicamente, Schrodinger buscava especular quais seriam as características estruturais do material genético. O desenvolvimento da Biologia Molecular informacional foi fundamentalmente dependente de uma abordagem genética e originou os grandes dogmas, (i) a um gene corresponde uma enzima (Beadle e Tatum), (ii) o DNA é o material genético e deve alto replicar-se, e (iii) o RNA é um intermediário no fluxo de informação do DNA para a síntese proteica. A outra Biologia Molecular, a conformacional, advém de uma preocupação distinta, muito mais geral, a de que os fenômenos biológicos podem ser compreendidos fundamentalmente pelo conhecimento das estruturas das moléculas e das interações e alterações destas estruturas. Esta concepção foi aparentemente proposta pela primeira vez em 1935 por Warren Weaver, físico-químico da Fundação Rockefeller, que foi, por sinal, quem pela primeira vez empregou o termo Biologia Molecular. O conceito primitivo de Biologia Molecular estava, portanto, associado à vertente conformacional. Sem dúvida, a primeira grande descoberta da Biologia Molecular conformacional foi a da estrutura alfa-helice e folha pregueada das proteínas, por Linus Pauling, no final da década de 40.

As duas vertentes, informacional e conformacional, se encontram na grande descoberta do século em Biologia, a da estrutura dupla-hélice do DNA, por Watson e Crick, em 1953. De certa forma Watson era o representante da linha informacional e Crick o da conformacional. Foi só a conjunção de conceitos e conhecimentos das duas

vertentes, que até então se ignoravam mutuamente, que permitiu esta descoberta. A Biologia Molecular tornou-se, de fato, uma ciência a partir de então. Na verdade seria mais correto chamar esta nova ciência de Biologia Molecular do Gene, pois ela se preocupou fundamentalmente com o material genético e foi primordialmente informacional..

Provavelmente, o depoimento dado por Watson em seu livro "a Dupla Hélice" sobre o papel dos químicos na descoberta da dupla-hélice do DNA deve ser creditado mais a seus resentimentos do que considerado seriamente. Watson se vangloriava de saber pouca Química, de não conhecer a estrutura das bases, e se deliciava em humilhar o químico Erwin Chargaff por haver descoberto que a soma adenina + timina era igual à de guanina + citosina, sem ter sabido como operar com esta descoberta. Procurou ridicularizar também a Linus Pauling por haver proposto uma estrutura helicoidal errada para o DNA, sem considerar que a pH 7,0 a hidroxila do fosfato do DNA estava dissociada. É óbvio porém que para a descoberta da dupla-hélice foi necessário que Crick, ao menos, conhecesse muito bem as estruturas das bases e as utilizasse para construir os modelos espaciais que Pauling havia desenvolvido. É óbvio tambem que a descoberta de Chargaff acabou sendo incorporada na concepção final da dupla-hélice. A Química teve assim um papel fundamental nesta descoberta, embora os químicos tivessem tenham sido atores coadjuvantes no episódio.

A Biologia Molecular de Hoje e de Amanhã

A Biologia Molecular do Gene prosseguiu, a partir de então, muito mais informacional do que conformacional, e seria de se esperar um certo afastamento dos químicos, considerando-se os rumos tomados. Claramente, porém, a situação vem se alterando nestes últimos anos. As críticas que se tem feito ao acúmulo de resultados sôbre estes circuitos de informação, como pouco quantitativos e extremamente carentes de uma visão mais conformacional tem levado a uma retomada de interesse dos químicos pela Biologia Molecular, O próprio desenvolvimento de novas técnicas de genética, como por exemplo mutação dirigida, indicam que a vertente genética-informacional da Biologia Molecular tem aberto um espaço para estudos mais conformacionais. De fato, a técnica de mutação dirigida permite obter-se genes mutados que produzem proteínas com modificaçoes específicas de amino-ácidos, permitindo investigar-se as consequências estruturais e funcionais destas modificações.

Em seaguida são discutidos brevemente alguns tópicos de grande importância, onde conceitos e métodos químicos serão absolutamente imprescindíveis na elucidação de problemas fundamentais de Biologia Molecular. Não há nenhuma intenção de esgotar todas as possibilidades da abordagem química aos problemas de Biologia Molecular.

Um deles é o do que se tem chamado de Biologia Computacional. Há atualmente uma grande discussão nos Estados Unidos sôbre se vale a pena construir

um computadores teraflop (um trilhão de cálculos por segundo, cerca de 1000 vezes mais rápido do que os atuais) para estudos de previsão de conformação química de macroestruturas. Estes computadores custariam cerca de 50 milhões de dólares e transformariam a Biologia Molecular em "big science", com evidentes repercussões na área, que é essencialmente composta por estruturas de "small science". O interesse do próprio governo americano, no entanto, é grande pois espera-se repercussão nas industrias farmacêuticas, na área de "drug design", com vendas aumentadas e maiores impostos recolhidos. Mesmo com as estruturas computacionais atuais, tem-se conseguido significativos resultados na área de "drug design". Apenas a título de exemplo, novos derivados de ciclo-fosfamida, um composto antineoplásico que degrada o DNA, tem tido grande importância na quimioterapia. Os novos derivados foram desenhados para possuirem alta constante de afinidade com o DNA e possuirem maior capacidade de degradá-lo, por reações oxidativas.

Há esperança de que o teraflop auxiliaria na compreensão de um problema que é dos mais importantes da Biologia Molecular conformacional, o de como as proteínas se dobram e adquirem estruturas secundárias, terciárias e quaternárias. Muito embora pareça ser claro agora que a regra da energia mínima não é aplicável para a maioria das proteínas, para se prever as suas conformações finais, não há dúvida que estas estruturas são, no entanto, estados de baixa energia. Desta forma seria possível obter famílias de estruturas mais prováveis, baseadas em cálculos de energia, aos quais se adicionariam parâmetros cinéticos que poderiam ser conhecidos com o avanço dos conhecimentos.

Estes conhecimentos se referem a dados mais recentes de proteínas chamadas chaperoninas que assistem às proteínas nascentes na aquisição da conformação final, evitando que interajam entre si e formem aglomerados e funcionando talvez como catalisadoras do dobramento das proteínas. Há grandes esforços para se entender como estas proteínas assistentes funcionam neste processo, almejando-se com isto uma previsão mais realista da conformação final destas proteínas. Pois, sem dúvida, neste processo estas interações chaperonina-proteína nascente acabam por pesar na conformação final alcançada pela proteína (e neste sentido a chaperonina não é um catalisador clássico). Há uma quantidade apreciável de química e de químicos envolvidos na investigação deste problema que já está em curso, graças ao isolamento de algumas chaperoninas. Tipicamente se empregam nestas investigações NMR, "pulse-hydrogen exhange" e dicroismo circular com "stopped-flow". Descoberta nesta área terão seguramente grande impacto na Biologia Molecular e na própria Química.

Um problema dos mais atraentes em Biologia Molecular conformacional é o da interação de diferentes moléculas com DNA. Referi-me, acima, ao caso de derivados de ciclofosfamida, mas há uma quantidade muito grande de compostos sendo investigados neste momento. Tem sido possível a síntese de muitas estruturas que interagem de maneira relativamente específica com DNA (por exemplo, reconhecendo certas sequências) e que podem ter ainda uma capacidade endonucleásica associada a ela. Por exemplo, complexos de EDTA-FeII são ligados a derivados fenantrolínicos e devido à posição que eles ocupam no complexo catalisam

a quebra em lugar específico do DNA via formação de radicais de hidroxila por uma reação de Fenton sítio-específica. Com o avanço de investigações será possível obter compostos cujas interações sejam cada vez mais específicas em termos de reconhecimentos de sequências maiores do DNA, podendo se conceber estruturas que reconheçam e quebrem a cadeia em sequências mais longas do que as enzimas de restrição conseguem identificar. As consequências para a pesquisa e para a medicina destas descobertas serão certamente enormes.

Como último exemplo gostaria de mencionar uma recente descoberta que tem empolgado os bioquímicos, neurologistas, fisiologistas e cardiologistas entre outros. Trata-se da evidência de que uma molécula tão simples quanto o nitróxido (NO) tem papéis fundamentais de mensageiro químico em pelo menos dois fenômenos de grande importância fisiológica. Um deles é o relaxamento da parede das artérias, fundamental na manutenção da pressão arterial. NO, que tem estrutura radical e vida média muito curta é sintetisado nas células endoteliais das paredes do vaso a partir de arginina, em resposta a sinais ainda pouco conhecidos e atua nas células da musculatura lisa da parede do vaso levando ao seu relaxamento. Esta é a base da ação de nitroglicerina, na ação vasodilatadora, em pacientes com cardiopatias, pois nitroglicerina dá origem à NO. O outro fenômeno de grande importância mediado por NO e a transmissão sináptica entre células neuronais. Aqui um mensageiro rápido e de vida curta seria necessário e a natureza escolheu também o NO. Evidentemente a forma como o NO atua, os seus receptores nos neurônios e nas células da musculatura lisa dos vasos e a natureza do sinal químico transmitido são problemas de fundamental importância a espera de abordagem química.

Em 1963, quando cursei a disciplina de Bioquímica fiquei empolgado com o estudo da estrutura do DNA e as suas consequências biológicas. Mal sabia que aquela tinha sido a primeira e uma das poucas descobertas da Biologia Molecular conformacional do gene por um bom tempo. Há agora uma nova tendência que pode ser notada pelos novos rumos tomados pela pesquisas nesta áreas. Esta tendência pode também ser verificada pelos programas de pesquisa de pós-graduação em Química em Universidades americanas, onde um percentual significativo dos mesmos se constitui em temas de Biologia Molecular conformacional. Há, sem dúvida, um novo mundo a ser descoberto pelos químicos e certamente o passado glorioso da Química na Biologia está sendo revivido.

Referências Bibliográficas

1. H.F. Judson (1979) The eighth day of creation. Simon & Schuster, Nova York.2. A. Mirnsky (1968) The discovery of DNA. Scientific American, junho , pg. 78-84.3. L. Pauling & R.B. Corey. (1950) The hydrogen-bonded spiral configuration of

polypeptide chain. J.Amer. Chem. Soc. 72, 5349.

4. E. Schrodinger (1944) What is life ? The physical aspects of the living cell . Cambridge: at the University Press.

5. J. D. Watson (1968) The double helix. A personal account of the descovery of the structure of DNA . Atheneum, Nova York.

6. W. Weaver (1970) Molecular Biology : origin of the term. Science 170, 581-582.