Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia ...livros01.livrosgratis.com.br/cp133931.pdfPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Danilo Chorfi

UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Danilo Chorfi Berton

Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia

Bioanalítica para Quantificação de Risedronato em

Plasma Humano Utilizando a Técnica de

Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria

de Massas (LC-MS/MS)

BRAGANÇA PAULISTA

2010

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Ficha catalográfica elaborada pelas bibliotecárias do Setor de Processamento Técnico da Universidade São Francisco.

QV 38 Berton, Danilo Chorfi. B462d Desenvolvimento e validação de uma metodologia bioanalítica para quantificação de Risedronato em plasma humano utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) / Danilo Chorfi Berton. -- Bragança Paulista, 2010. 59 p. Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco. Orientação de: Silvana Aparecida Calafatti Carandina. 1. Risedronato. 2. Validação. 3. Cromatografia líquida. 3. Espectrometria de massas. 1. Carandina, Silvana Aparecida Calafatti. 2. Título.

DANILO CHORFI BERTON




Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de

Massas (LC-MS/MS)

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde, da Universidade São Francisco, como

parte dos requisitos para a obtenção do título

de Mestre em Ciências da Saúde. Área de

Concentração: Farmacologia Clinica e Geral.

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Aparecida Calafatt i Carandina

BRAGANÇA PAULISTA

2010

DANILO CHORFI BERTON




Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de

Massas (LC-MS/MS)

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde, da Universidade São Francisco, como

parte dos requisitos para a obtenção do título

de Mestre em Ciências da Saúde. Área de

Concentração: Farmacologia Clinica e Geral.

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________

Profa. Dra. Silvana Aparecida Calafatti Carandina

_______________________________________________________

Prof. Dr. Eduardo César Meurer

_______________________________________________________

Prof. Dr. Luiz Alberto Moraes

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho, com todo amor e carinho, à

minha mãe Áurea e ao meu pai Luiz Edward, que tanto

me incentivaram e me deram exemplos de dignidade e

honestidade.

Ao meu irmão Luiz Henrique, pela ajuda e apoio

científico e também pelo companheirismo de todos

esses anos.

À minha amada esposa Maíra, que nunca me

abandonou nos momentos de angustia e que sempre

me trouxe alegria e conforto nas etapas difíceis da

vida...

AGRADECIMENTO

Agradeço principalmente à Deus e a Nossa

Senhora por me iluminarem e me protegerem em todos

os momentos de minha vida.

Meus sinceros agradecimentos à Professora

Doutora Silvana Calafatti, pela orientação científica

desta tese, pela amizade e confiança. .

Ao Professor Doutor Fabio Alessandro Proença

Barros, por toda a disponibilidade e apoio concedido,

pela amizade e incentivo.

Aos meus colegas e amigos dos laboratórios

Core Pesquisas Clinicas e Unifag, que de uma forma ou

outra, deram suas contribuições.

EPÍGRAFE

"...pedras no caminho, guardo todas, um dia vou

construir um castelo." [Fernando Pessoa]

vi

Lista de Tabelas

Tabela 3.1 - Descrição dos equipamentos e materiais utilizados..............

22

Tabela 3.2 - Descrição dos componentes do CLUE.................................. 23

Tabela 3.3 - Valores do preparo da curva de calibração Risedronato...... 24

Tabela 3.4 - Preparo dos controles de qualidade...................................... 25

Tabela 4.1 - Equações da curvas de calibração e do respectivo

coeficiente de correlação linear (R)............................................................

43

vii

Lista de Figuras

Figura 1.1 - Diferença de lacunas e cavidades entre um osso com

osteoporose e outro normal.......................................................................

04

Figura 1.2 - Estruturas químicas dos ácidos pirofosfórico e bifosfônico,

respectivamente.........................................................................................

06

Figura 1.3 - Estruturas representativas das classes dos bisfosfonatos.... 08

Figura 1.4 - Ácido Risedrônico.................................................................. 09

Figura 1. 5 - Representação esquemática de um sistema de

cromatografia líquida..................................................................................

12

Figura 1.6 - Foto de um sistema de cromatografia líquida de ultra

eficiência.....................................................................................................

13

Figura 1.7 - Fotografia de um Espectrômetro de Massas.......................... 14

Figura 1.8 - Esquema de um filtro quadrupolar......................................... 15

Figura 1.9 - Demonstração esquemática do espectrômetro de massas

triplo quadrupolar........................................................................................

16

Figura 1.10 - Ilustração da fonte de electrospray...................................... 17

Figura 4.1 - Reação do p-toluil-sulfonil-nitrosamida com hidróxido de

potássio para a formação do diazometano e reação do ácido fosfônico

com diazometano para formação do produto metilado..............................

30

Figura 4.2 - Reação do Risedronato com Diazometano gerando

produtos tetra e pentametil derivados .......................................................

31

Figura 4.3 - Espectro Risedronato e Risedronato D4 em modo MS/MS...

Figura 4.4 - Proposta de fragmentação para a molécula de Risedronato

com m/z 354 (íon precursor). As rotas a,b,c e d sugerem íons produtos

correspondentes à fragmentação do íon precursor....................................

Figura 4.5 - Estrutura molecular do Risedronato D4..................................

33

34

35

Figura 4.6 - A) Plasma branco normal lote 3869/6, cromatograma

referente ao Risedronato. B) Plasma branco normal lote 3869/6,

cromatograma referente ao padrão interno................................................

38


viii



38

Figura 4. 8 - A) Plasma branco normal lote 37647/4, cromatograma



39



cromatograma referente ao padrão interno.

39

Figura 4.10 - A) Plasma branco lipêmico lote 26210/7, cromatograma

referente ao Risedronato. B) Plasma branco lipêmico lote 26210/7,


40

Figura 4. 11 - A) Plasma branco hemolisado lote 4056/9, cromatograma

referente ao Risedronato. B) Plasma branco hemolisado lote 4056/9,


40

Figura 4. 12 - A) Solução aquosa de Risedronato na concentração de

0,5 ng/mL (concentração do LQ)................................................................

41

Figura 4.1 3 - A) Solução aquosa de Risedronato D4 na concentração

de 31,2 ng/mL (concentração final de padrão interno na amostra

extraída)......................................................................................................

41

Figura 4.1 4 - Representação gráfica da média das curvas de calibração. 43

Figura 4.15 - Resultados obtidos das análises intra-lote dos controles

de qualidade e do LQ para matriz (plasma) normal...................................

44

Figura 4.1 6 - Resultados obtidos das análises intra-lote dos controles

de qualidade e do LQ para matriz (plasma) lipêmica.................................

45

Figura 4.1 7 - Resultados obtidos das análises intra-lote dos controles

de qualidade e do LQ para matriz (plasma) hemolisada............................

45

Figura 4.1 8 - Resultados obtidos das análises inter-lote........................... 46

Figura 4.1 9 - Resultados das análises intra-lote dos controles de

qualidade de diluição..................................................................................

47

Figura 4.20 - Resultados das análises intra-lote dos controles de

qualidade de diluição..................................................................................

47

ix

Figura 4.21 - Resultados obtidos para a recuperação do fármaco e do

padrão interno............................................................................................

48

Figura 4.22 - Resultados obtidos para as análises de estabilidade em

função do tempo e condição de exposição................................................

49

Figura 4.2 3 - Resultados obtidos para as análises de estabilidade nos

ciclos de degelo..........................................................................................

50

Figura 4.2 4 - Resultados obtidos para as análises de estabilidade para

as amostras não-processadas...................................................................

51

Figura 4.25 - Resultados obtidos para as análises de estabilidade da

solução padrão...........................................................................................

52

Figura 4.26 - Resultados obtidos para as análises de estabilidade da

longa duração.............................................................................................

53

x

Lista de Abreviaturas

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Ar - Argônio

atm - Atmosfera

BFs - bisfosfonatos

B - Branco

Ca2+ - íon Cálcio

Cl - Cloro

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-EM - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de

Massas

CLAE-EM/EM - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de

Massas seqüencial

CLUE - Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

CLUP - Cromatografia Líquida de Ultra Performance

cm - centímetro

Cmáx - Concentração Máxima

CQ - Controle de Qualidade

CQA - Controle de Qualidade Alto

CQB - Controle de Qualidade Baixo

CQD - Controle de Qualidade Diluído

CQM - Controle de Qualidade Médio

CRM - charged residue mode

CV% - Coeficiente de Variação oC - graus Celsius

DC - direct current

DP - Desvio Padrão

DRP - Desvio Padrão Relativo

EFS - Extração em Fase Sólida

EM/EM - Espectrometria de Massas seqüencial

ESI - Ionização por Electrospray

xi

eV - eletronvolts

g - grama

h - hora

HCl - Ácido Clorídrico

He - Hélio

HPLC - High Performance Liquid Cromatrography

HUSF - Hospital Universitário São Francisco

IEM - íon evaporation mode

K - Fator de Retenção

KV - Kilovolts

KOH - Hidróxido de Potássio

LC-EM - Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massas

LC/MS/MS - Liquid chromatography-mass spectrometry -mass spectrometry

LD - Limite de Detecção

LQ - Limite de Quantificação

M - Molar

MeCN - Acetonitrila

MeOH - Metanol

min - minuto

mg - miligrama

mL - mililitro

µL - Microlitro

µm - Micrometro

mM - milimolar

MRM - Monitoramento de Reações Múltiplas

MS - Mass spectrometry

MS/MS - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry

m/z - razão massa/carga

NBR - Norma Brasileira

ng - nanograma

N2 - Nitrogênio Gasoso

xii

OH - Hidroxila

OMS - Organização Mundial de Saúde

Pa - Pascal

pg - picogramas

pH - Potencial Hidrogeniônico

PI - Padrão Interno

R - Coeficiente de Correlação

RDC - Resolução da Diretoria Colegiada

rpm - Rotação por Minuto

RE - Resolução (Legislação)

RF - Radio Frequência

Rs - Resolução

Tmax - Tempo Máximo

Tr - Tempo de Retenção

T0 - Tempo Zero

UNIFAG - Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia

UPLC - Ultra Performance Liquid Cromatrography

USP - United States Pharmacopeia

UV - Ultra Violeta

V - Volts

v/v - Volume/Volume

WAX - Weak Anion e-Xchange

Z - Zero

xiii

SUMÁRIO

RESUMO xvi

ABSTRACT xvii

1. INTRODUÇÃO TEÓRICA 01

1.1 ABORDAGEM GERAL 01

1.1.1 OSSOS 01

1.2 DOENÇAS OSTEOMETABÓLICAS 03

1.2.1 OSTEOPOROSE 03

1.2.2 DOENÇAS DE PAGET 05

1.3 BISFOSFONADOS 05

1.4 RISENDRONATO 08

1.4.1 FARMACOCINÉTICAS 09

1.5 GENÉRICOS 10

1.6 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) E ULTRA

EFICIÊNCIA (CLUE) 11

1.7 ESPECTROMETRIA DE MASSAS 13

1.7.1 ANALISADOR DE MASSAS QUADRUPOLO 15

1.8 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA A

ESPECTROMETRIA DE MASSAS (LC-EM) 16

1.8.1 IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY 17

1.9 TRATAMENTO DA AMOSTRA 18

2. OBJETIVO 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS 22

3.1 PRINCÍPIOS DO MÉTODO BIOANALÍTICO 22

xiv

3.1.1 EQUIPAMENTOS E MATERIAIS 22

3.1.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÃO 23

3.1.3 PREPARO DA FASE MÓVEL 23

3.1.4 PREPARO DOS PADRÕES DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E DAS

AMOSTRAS CONTROLE DE QUALIDADE 23

3.1.5 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS 25

3.1.6 PARÂMETROS DE DETECÇÃO NO ESPECTRÔMETRO DE

MASSAS SEQUÊNCIAL MS/MS 25

3.2 PREPARO DA AMOSTRA 26

3.2.1 PREPARO DO REAGENTE DE DERIVAÇÃO DO DIAZOMETANO

26

3.2.2 TRATAMENTO DA AMOSTRA 26

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29

4.1 PRÉ-DESENVOLVIMENTO 29

4.1.1 DERIVATIZAÇÃO QUÍMICA COM DIAZOMETANO 30

4.2 DESENVOLVIMENTO DA METODOLOGIA BIOANALÍTICA 31

4.2.1 OBTENÇÃO DO ESPECTRO DE MASSAS (MS) 31

4.2.2 OBTENÇÃO DO ESPECTRO DE MASSAS (MS/MS) 32

4.2.3 EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DA MATRIZ BIOLÓGICA:

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS) E SIMULTÂNEA DERIVATIZAÇÃO

35

4.3 VALIDAÇÃO DE MEODOLOGIA BIOANALÍTICA 36

4.3.1 VALIDAÇÃO DO PRÉ-ESTUDO 37

4.3.2 ESPECIFICIDADE 37

4.3.3 DETERMINAÇÃO DO LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO 42

xv

4.3.4 LINEARIDADE 42

4.3.5 PRECISÃO E EXATIDÃO 43

4.3.5.1 PRECISÃO E EXATIDÃO INTRA-LOTE 44

4.3.5.2 PRECISÃO E EXATIDÃO INTER-LOTES 46

4.3.6 VALIDAÇÃO DA DILUIÇÃO 46

4.3.7 RECUPERAÇÃO 48

4.4 ESTABILIDADES 48

4.4.1 ESTABILIDADE DE CURTA DURAÇÃO 48

4.4.1.1 ESTABILIDADE NO TEMPO E CONDIÇÕES DE ANÁLISE

(ETABILIDADE PÓS-PROCESSAMENTO) 48

4.4.1.2 ESTABILIDADE DO FÁRMACO EM CICLOS DE

CONGELAMENTO E DEGELO 49

4.4.1.3 ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS DE PLASMA NÃO-

PROCESSADAS 50

4.4.1.4 ESTABILIDADE DE SOLUÇÃO PADRÃO 51

4.4.2 ESTABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO 52

5. CONCLUSÃO 54

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 55

xvi

RESUMO

A crescente expectativa de vida populacional têm gerado na conduta dos

profissionais da área de saúde uma grande preocupação com a qualidade de vida dos

idosos. O elevado número de indivíduos com faixa etária acima dos 65 anos torna

necessário o investimento em prevenção de patologias presentes e caracteristicas do

processo de envelhecimento.

As terapias farmacológicas de reposição hormonal ou com substâncias

estabilizadoras do processo reabsortivo, representam importantes estratégias no campo

da saúde pública, tendo por objetivo impedir a perda adicional de osso e diminuir a

probabilidade de fraturas. Os bisfofonatos (BFs) são extensivamente utilizados no

tratamento de doenças osseas, destacando-se a de Paget, a hipercalcemia maligna e

a osteoporose, atuando como potentes inibidores da reabsorção ossea mediada por

osteoclastos.

A inserção de medicamentos genéricos no mercado mundial amplia –

principalmente aos países de economia emergente – o acesso à medicamentos de

qualidade por menores preços (em média de 30 a 50% mais baratos que os

medicamentos referência). Contudo, para uma intercambialidade segura entre produtos

terapeuticamente equivalentes, é necessária a comprovação da eficácia do

medicamento genérico através de testes específicos, e posterior validação da

metodologia aplicada, para que dessa forma tenha sua confiabilidade, reprodutibilidade

e segurança comprovadas.

A validação de uma metodologia para a quantificação de Risedronato através da

técnica de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de

massas consiste em um processo de alta confiabilidade, devido à seletividade e

sensibilidade elevadas na quantificação de fármacos que a metodologia apresenta. A

comprovação da bioequivalência entre medicamentos teste e referência, permite a

produção de medicamentos classificados como genéricos, com qualidade, segurança e

eficácia comprovada perante a Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

Palavras-Chave: Risedronato, Validação e Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

acoplada a espectrometria de massas (CLUE-MS/MS).

xvii

ABSTRACT

The increasing life expectancy have led to population in the conduct of health

professionals is great concern about the quality of life for seniors. The high number of

individuals aged over 65 years makes the necessary investment in prevention of

pathologies and characteristics of the aging process.

Pharmacologic therapies for hormone replacement or with substances stabilizing

the resorptive process, are important strategies in the field of public health, aiming to

prevent the further loss of bone and decrease the likelihood of fractures. The

Bisphosphonates (BFs) are extensively used in the treatment of bone diseases,

especially in Paget, hypercalcemia malignancy and osteoporosis, acting as potent

inhibitors of bone resorption mediated by osteoclasts.

The introduction of generic drugs in the world market expands - particularly the

emerging countries - access to quality medicines for lower prices (on average 30 to 50%

cheaper than the reference drug). However, for a safe interchangeability between

products therapeutically equivalent, is required to confirm the efficacy of generic drugs

through specific tests and validation of the methodology applied, to thereby have its

reliability, proven reliability and safety proven.

The validation of a methodology for quantification of Risedronate by the technique

of ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry is a process

of high reliability due to high selectivity and sensitivity in the quantification of drugs that

the methodology presented. Proof of bioequivalence between test and reference drug,

allows the production of drugs classified as generic, with quality, safety and

effectiveness proven before the National Health Surveillance Agency (ANVISA).

Keywords: Risedronate, Validation and Ultra Efficiency Liquid Chromatography coupled

to mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

1

1- INTRODUÇÃO TEÓRICA

1.1- Abordagem Geral

Para ficar em pé e caminhar, o homem necessita de diferentes e complexos

materiais que o constituem.1

O sistema esquelético, que inclui os ossos do esqueleto, as articulações onde

eles se encontram e a cartilagem, faz parte da complexa composição do corpo

humano, sendo ele um dos mais importantes dos materiais.2

Sem o esqueleto, seria impossível a locomoção, visto que os músculos não

teriam ossos como suporte para movimentar-se e todas as partes moles se

amontoariam no chão, sem forma definida.3

Mecanicamente, o sistema esquelético pode ser idealizado como um arranjo

de elos rígidos conectados uns aos outros por articulações para permitir movimentos

específicos. O sistema esquelético também possui funções metabólicas. A medula

óssea produz, em alguns ossos, glóbulos vermelhos, brancos e plaquetas. Além

disso, os ossos armazenam cálcio e fosfato.

Portanto pode-se dizer que o sistema esquelético desempenha duas funções

essenciais para o organismo: mecânica (sustentação, proteção e movimento) e

fisiológica (produção de células sanguíneas e reserva mineral).2

1.1.1- Ossos

O esqueleto humano adulto é constituído por tecido ósseo metabólicamente

ativo, sofrendo processo contínuo de remodelação com fases subseqüentes de

reabsorção e formação óssea.

O tecido ósseo é bastante complexo e especializado em relação ao

esqueleto, relacionado às funções de manutenção e integridade estrutural, e

também servindo de reservatório de minerais (cálcio e fosfato).4

Os ossos e as articulações são os componentes básicos do sistema

esquelético. Juntos somam 16% do peso total do corpo adulto.2

O osso é um tecido vivo formado por duas porções: uma orgânica e outra

mineral.3,5

A porção orgânica do osso é composta fundamentalmente por colágeno

(95%). Esta proteína contém dois aminoácidos de grande importância: hidroxiprolina

2

e hidroxilisina. O colágeno contribui muito para a resistência e a elasticidade do

osso.3,6

A porção mineral que inclui fosfato de cálcio (85%), carbonato de cálcio (10%)

e pequenas quantidades de fluoreto de cálcio e de magnésio, confere dureza e

rigidez aos ossos.3

Para manter a estrutura normal, a matriz óssea tem uma reserva suficiente de

proteínas e minerais, sendo os minerais armazenados na forma de hidroxiapatita.5

Microscopicamente os ossos são formados por dois tipos de tecidos, um com

componentes densos e compactos (cortical) e outro com esponjosos (trabeculares).

O osso trabecular apresenta maior metabolismo, sendo este mais suscetível às

alterações e remodelamento de massa óssea.2,7

O remodelamento ósseo é um processo contínuo de absorção da matriz

óssea e retirada de íon cálcio para o sangue, com consequente formação de uma

nova matriz. Através do remodelamento, o tecido ósseo substitui células velhas por

novas e o organismo pode dispor de elementos que são armazenados nos ossos.

Neste processo duas células estão envolvidas: os osteoblastos e osteoclastos.7,8

Os osteoclastos são células responsáveis pela reabsorção da matriz óssea

através da remoção de cristais de fosfato de cálcio do osso. No início de cada ciclo

de remodelamento os osteoblastos escavam o osso, formando lacunas na sua

superfície. Os osteoblastos, por sua vez, são responsáveis pela síntese da parte

orgânica da matriz óssea.7,8

Quando a homeostasia do processo de formação e reabsorção óssea é ideal,

espera-se que a quantidade de osso no início e no fim do ciclo de remodelagem seja

igual. Contúdo, quando este equilíbrio é afetado, a estrutura dos ossos é prejudicada

resultando no aparecimento de doenças como osteoporose e doença de Paget.9,10,11

Devido ao desequilíbrio de formação e reabsorção dos ossos, a massa óssea

muda consideravelmente durante as várias fases da vida. Na infância, adolescência

e até os 35 anos de idade a massa óssea está em contínua e acelerada formação.

Nessa fase de crescimento, a atividade dos osteoblastos é intensificada e atinge-se

o pico de massa óssea. No entanto, a partir dos 35 anos, inicia-se um lento balanço

negativo de perda óssea.9

Uma série de condições como: idade, doenças osteometabólicas, mobilidade

diminuída, ação de drogas, entre outras, pode alterar esse equilíbrio entre a

3

formação e a reabsorção, levando ao predomínio de um sobre o outro.11

1.2- Doenças Osteometabólicas

Atualmente, a expectativa de vida da população tende a aumentar, sobretudo

nas próximas décadas. O crescente número de indivíduos na faixa de idade acima

dos 65 anos, ao contrário do que ocorre com outros grupos etários, tem gerado, na

conduta dos profissionais da área de saúde, uma grande preocupação com a

qualidade de vida dos idosos, e conseqüentemente, com a prevenção de patologias

presentes e características do processo de envelhecimento.12

As doenças crônico-degenerativas destacam-se como fator limitante da

qualidade de vida dos idosos. Dentre essas doenças, as osteometabólicas, com sua

elevada freqüência, tem fundamental importância em saúde pública.13

Das doenças osteometabólicas, a osteoporose é a mais freqüente e o seu

estudo tem sido especialmente motivado em decorrência das importantes

repercussões em relação à morbidade e mortalidade de indivíduos portadores dessa

condição.14

Outra doença ósteometabólica é a doença de Paget óssea (osteíte

deformante). É uma doença óssea focal caracterizada por uma alta taxa de

remodelação óssea.15

1.2.1- Osteoporose

A osteoporose é um importante problema de saúde em todas as partes do

mundo. Esta doença acomete ambos os sexos, sendo mais freqüente na mulher, já

que no climatério, a diminuição dos níveis estrogênicos precipita as perdas de

massa óssea. Aos 50 anos, a cada cinco fraturas por osteoporose na mulher

ocorrem duas nos homens. Aos 70 anos, essa relação cai para três fraturas na

mulher a cada duas no homem.16

Estima-se que, 1,7 milhões de fraturas de quadril tenham ocorrido em 1990

em todo o mundo, em decorrência da osteoporose; e que este número irá exceder 6

milhões até 2050.

No Brasil, uma de cada três pessoas com osteoporose, é diagnosticada,

sendo que uma de cada cinco recebe algum tipo de tratamento. Atualmente há a

ocorrência de aproximadamente 100.000 fraturas de fêmur por ano no Brasil. Cerca

4

de 10 milhões de brasileiros sofrem de osteoporose, sendo que 2,4 milhões sofrerão

um tipo de fratura, a cada ano, e, destes pacientes 200.000 morrerão por um fator

que é resultado direto da fratura.17

A Organização Mundial de Saúde (OMS) define a osteoporose como sendo

uma doença metabólica óssea sistêmica e progressiva, caracterizada por diminuição

da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo, com

conseqüente aumento da fragilidade do osso, podendo levar à diminuição da massa

óssea e deterioração da microarquitetura.18 A Figura 1.1 mostra a diferença entre um

osso com osteoporose e um osso normal.

Figura 1.1- Diferença de lacunas e cavidades entre um osso com (a) osteoporose e

outro (b) normal.

É inevitável, no processo de envelhecimento, a perda de massa óssea. No

individuo com osteoporose a perda é tão importante que a massa óssea cai abaixo

do limiar para fraturas, principalmente em determinados locais, como quadril,

vértebras e antebraço.19

A osteoporose ocorre quando os osteoclastos criam uma cavidade

excessivamente profunda que não consegue ser suficientemente preenchida pelos

osteoblastos ou quando estes não conseguem preencher uma cavidade de

reabsorção normal. 20

As mulheres são as mais atingidas pela osteoporose, devido à cessação da

função ovariana e perda do efeito protetor do estrogênio (osteoporose pós-

menopáusica). A perda de massa óssea esperada durante a menopausa é de cerca

de 15%.21

(a) (b)

5

1.2.2- Doença de Paget

A doença de Paget é a segunda doença osteometabólica mais comum, atrás

apenas da osteoporose. É difícil estimar a sua incidência uma vez que, na maioria

dos casos, ela é assintomática; embora freqüentemente se associe a dor óssea,

deformidades, fraturas patológicas, osteoartrite secundária e surdez. É rara em

pacientes com idade inferior a 40 anos e aumenta progressivamente conforme o

paciente envelhece.

A doença de Paget é uma doença comum em países com população anglo-

saxônica (Reino Unido e Alemanha).15

Na América do Sul a doença é incomum, embora séries grandes tenham sido

descritas na Argentina e no Brasil.22

No Brasil, a maioria dos casos são encontrados na cidade de Recife,

Pernambuco. As razões para este fato estão ligadas à colonização holandesa no

século XVII.

Sir James Paget descreveu a doença em 1887 baseado em observações e

estudos em pacientes com deformidades ósseas.

Ao contrario da osteoporose, que é essencialmente uma doença de redução

de massa óssea, a doença de Paget do osso é uma doença onde ocorre um

aumento da densidade óssea, ocasionando lesões secundárias e deformidades

ósseas.23

Na fisiopatologia da doença de Paget, há um aumento na formação e na

reabsorção óssea levando a um osso em mosaico de padrão lamelar com fibrose

adjacente. Os osteoclastos de pacientes com Paget contêm partículas virais que não

são encontradas em osteoclastos sadios.15

Vários fármacos vem sendo utilizados na prevenção e no tratamento das

desordens relacionadas ao processo de remodelagem óssea, destacando-se entre

estes um grupo de compostos denominados bifosfonados.

1.3- Bisfosfonados

As terapias farmacológicas de reposição hormonal ou com substâncias

estabilizadoras do processo reabsortivo, representam importantes estratégias no

campo da saúde pública, tendo por objetivo impedir a perda adicional de osso e

diminuir a probabilidade de f

Um dos primeiros bifosfonados a ser sintetizado foi o ácido etidronico, cujo

principal objetivo era ser utilizado como aditivo em detergente.

efeitos fisiológicos foram observados

foi precursora de estudos e

bifosfonados e avaliação de seus efeitos fisiológicos.

Os bisfosfonatos (BFs) são extensivamente utilizados no tratamento de várias

doenças ósseas, destacando

concentrações de cálcio no soro de pacientes) e a osteoporose, já que são potentes

inibidores da reabsorção óssea mediada por osteoclastos.

Bisfosfonados são análogos químicos da substância endógena denominada

ácido pirofosfórico, que no organismo se encontra como pirofosfato (P

inibidor natural da reabsorção óssea. No entanto, essa substância não pode ser

utilizada como agente terapêutico no tratamento de doenças ósseas, pois sofre uma

rápida hidrólise enzimática.

estrutural com este grupo de compostos, onde o átomo central de oxigênio do

pirofosfato é substituído por um átomo de carbono. Essa modificação faz com que

os BFs, contendo ligações P

resistentes à degradação enzimática e possuam uma meia

suficiente para influenciar o metabolismo ósseo. As estruturas químicas dos ácidos

pirofosfórico e bifosfônico podem ser observadas na

(a)

Figura 1.2- Estruturas químicas do

Os bifosfonados parecem prevenir a calcificação por um mecanismo físico

químico, agindo como cristais após adsor

reabsorção do osso por efeito nas células dos osteoclastos.

diminuir a probabilidade de fraturas.24


principal objetivo era ser utilizado como aditivo em detergente.

foram observados, e sua capacidade de inibir a reabsorção óssea

foi precursora de estudos e pesquisas para a síntese de diversos outros

bifosfonados e avaliação de seus efeitos fisiológicos.


doenças ósseas, destacando-se a de Paget, a hipercalcemia maligna (redução das


inibidores da reabsorção óssea mediada por osteoclastos.12, 25


sfórico, que no organismo se encontra como pirofosfato (P



rápida hidrólise enzimática. A ação dos bisfosfonados deve-se à sua semelhança



os BFs, contendo ligações P-C-P, sejam mais estáveis e conseqüentemente, mais

resistentes à degradação enzimática e possuam uma meia-vida biológica maior,

suficiente para influenciar o metabolismo ósseo. As estruturas químicas dos ácidos

nico podem ser observadas na Figura 2.26,27,

(b)

Estruturas químicas dos ácidos (a) pirofosfórico e (b) bifosfô

parecem prevenir a calcificação por um mecanismo físico

químico, agindo como cristais após adsorção na superfície óssea. Atuam

reabsorção do osso por efeito nas células dos osteoclastos.26

6


principal objetivo era ser utilizado como aditivo em detergente. Entretanto, seus

capacidade de inibir a reabsorção óssea

pesquisas para a síntese de diversos outros


cemia maligna (redução das



sfórico, que no organismo se encontra como pirofosfato (P-O-P), um



se à sua semelhança



eis e conseqüentemente, mais

vida biológica maior,

suficiente para influenciar o metabolismo ósseo. As estruturas químicas dos ácidos 26,27,28

s ácidos (a) pirofosfórico e (b) bifosfônico.

parecem prevenir a calcificação por um mecanismo físico-

ção na superfície óssea. Atuam inibindo a

7

Diferentes substituintes (R1 e R2) ligados ao carbono central do ácido

bifosfônico, dão características únicas para cada fármaco. O grupo R1 fornece a

afinidade do BFs pelos cristais ósseos, enquanto o grupo R2 é responsável pela

potência e atividade farmacológicas. Os BFs apresentam uma maior afinidade em se

ligar ao osso, prevenindo o crescimento e a dissolução de cristais, quando R1 = OH

ao invés de Cl.28

A maior determinante de potência anti-reabsorção é atribuída à cadeia lateral

R2, porém ambos os grupos fosfonatos também são necessários para a atividade

dos fármacos. Alterações em um ou outro grupo fosfonato reduzem a afinidade para

os ossos.

A alta afinidade dos BFs pelos ossos com alta taxa de remodelagem ocorre

devido à grande exposição da hidroxiapatita nesses sítios.29 A ação dos dois grupos

fosfonatos em conjunto com o grupo hidroxila da cadeia lateral R1, atuam como um

‘gancho nos ossos’, permitindo direcionamento eficiente e rápido desse grupo de

compostos para a superfície do osso. Uma vez localizado dentro do osso, a

estrutura e conformação tridimensional da cadeia lateral R2, bem como os grupos

fosfonatos, determinam a atividade biológica da molécula e influenciam na

capacidade dos fármacos de interagir com alvos específicos.30

Existem diversos fármacos da classe dos bisfosfonatos nos quais os

substituintes R1 e R2 variam sistematicamente com o propósito de: aumentar a

afinidade óssea, melhorar o perfil terapêutico (potência seletividade e toxicidade),

adquirir nova atividade farmacológica e alterar a biodisponibilidade da molécula. As

várias classes de BFs podem ser observadas na Figura 1.3.

Figura 1.3- Estruturas representativas das classes dos bisfosfonat

pamidrônico, (b) ácido risedronico, (c) ácido etidronico, (d) ácido alendronico, (e)

ácido clodronico e (f) ácido ibandronico.

Os bisfosfonatos que contêm nitrogênio terciário na cadeia l

são geralmente mais potentes em inibir a reabsorção óssea. Entre os BFs mais

potentes que inibem a reabsorção óssea estão aqueles contendo o átomo de

nitrogênio em um anel heterocíclico.

1.4- Risedronato

Como citado anteriormente, os

no tratamento de várias doenças ósseas. Entre eles destaca

considerado um dos mais potentes disponíveis no mercado.

Ácido pamidronico (a) Ácido risedronico (b)

Ácido etidronico (c) Ácido alendronico (d)

Ácido clodronico (e) Ácido ibandronico (f)

Estruturas representativas das classes dos bisfosfonat


ácido clodronico e (f) ácido ibandronico.

Os bisfosfonatos que contêm nitrogênio terciário na cadeia l



nitrogênio em um anel heterocíclico.26

Como citado anteriormente, os bisfosfonados são freqüentemente utilizados

no tratamento de várias doenças ósseas. Entre eles destaca

considerado um dos mais potentes disponíveis no mercado.24

Ácido pamidronico (a) Ácido risedronico (b)

Ácido etidronico (c) Ácido alendronico (d)

Ácido clodronico (e) Ácido ibandronico (f)

8

Estruturas representativas das classes dos bisfosfonatos: (a) ácido


Os bisfosfonatos que contêm nitrogênio terciário na cadeia lateral alquílica,



bisfosfonados são freqüentemente utilizados

no tratamento de várias doenças ósseas. Entre eles destaca-se o Risedronato,

O Ácido Risedronico (1

(Figura 1.4),31 cuja fórmula molecular é C

uma nova geração de bisfosfonato piridinil utilizado no tratamento de doenças

ósseas como a osteoporose e a de Paget.

que se liga a hidroxiapatita no osso e inibe a reabsorção óssea mediada por

osteoclastos, reduzindo a renovação óssea, enquanto a atividade osteoblástica e a

mineralização são preservadas

Pode-se dizer que o

a perda óssea, dando mais tempo para recuperar o déficit mineral do tecido ósseo

reduzido, produzido pela alta taxa

material ósseo.17

Figura 1.4- Ácido Risedrô

O Risedronato mostrou

vertebrais logo após 6 meses de tratamento.

no risco de fraturas, bem como a redução d

Paget, evitando a perda óssea associada à terapia com cort

1.4.1- Farmacocinéticas

A biodisponibilidade oral, fração de uma dose que alcança a circulação

sistêmica, é determinada pela comparação da área total sob a curva de

concentração no plasma

A biodisponibilidade do r

ser de baixa eficiência (<1%).

dificultando o transporte através da barreira epitelial. Além disso é um

relativamente grande, negativamente carregada no pH intestinal e complexa

facilmente com o cálcio, prejudicando ainda mais a sua absorção.

O Ácido Risedronico (1-hidroxi-2-[3-piridinil] etilideno ácido bisfosfônic

cuja fórmula molecular é C7H11NO7P2 e de peso molecular


ósseas como a osteoporose e a de Paget.32 É um agente altamente antireabsortivo



mineralização são preservadas.33,34

se dizer que o Risedronato reduz a taxa de remodelame


reduzido, produzido pela alta taxa de remodelamento, restaurando

Risedrônico.

isedronato mostrou-se capaz de reduzir as fraturas vertebrais e não

após 6 meses de tratamento. Além de propiciar a continua

bem como a redução da dor em pacientes com doença de

a perda óssea associada à terapia com corticóides.

Farmacocinéticas



concentração no plasma versus tempo, após a administração oral e

sponibilidade do risedronato após administração por via oral

(<1%).36 Isso corre devido ao risedronato ser pouco lipofílicos,

dificultando o transporte através da barreira epitelial. Além disso é um


facilmente com o cálcio, prejudicando ainda mais a sua absorção.

9

piridinil] etilideno ácido bisfosfônico)

e de peso molecular 283,11 é


É um agente altamente antireabsortivo,



isedronato reduz a taxa de remodelamento que retarda


de remodelamento, restaurando a rigidez do

reduzir as fraturas vertebrais e não-

Além de propiciar a continua redução

m pacientes com doença de

icóides.17,35



tempo, após a administração oral e intravenosa.28

após administração por via oral demonstra

Isso corre devido ao risedronato ser pouco lipofílicos,

dificultando o transporte através da barreira epitelial. Além disso é uma molécula


facilmente com o cálcio, prejudicando ainda mais a sua absorção.37

10

A absorção do risedronato dentro do trato intestinal superior é relativamente

rápida (tmax~1h) e independe do local de administração. A absorção também

independe da dose oral de 2,5 a 30 mg.35

A excreção renal é a única rota de eliminação do risedronato. Estudos

realizados em animais e humanos indicam que os bisfosfonados administrados

sistematicamente são parcialmente ligados aos tecidos ósseos e o restante é

excretado pelos rins.28

Depois que o risedronato é absorvido, a concentração no soro e a taxa de

excreção urinária são multifasicas, com uma meia-vida inicial de 1,5 horas e uma

meia-vida terminal exponencial de 230 horas em voluntários saudáveis.35

Os alimentos causam uma acentuada diminuição na absorção do

Risedronato, devendo este ser administrado pelo menos 30 minutos antes da

primeira alimentação diária.38

1.5 - Genéricos

O genérico é um medicamento que tem a mesma fórmula e produz os

mesmos efeitos no organismo que um medicamento de referência (conhecido pela

marca comercial).

A indústria de genéricos surgiu na década de 60, quando o governo dos

Estados Unidos decidiu provar a segurança e a eficácia dos medicamentos

produzidos até 1962. O National Research Council of the National Academy of

Scinces, foi indicado para avaliar todos os medicamentos aprovados para uso até

aquela data. Essa informação permitiu que os fabricantes de genéricos obtivessem

permissão para produzir medicamentos classificados como eficazes até 1962, sem a

necessidade da realização de estudos in vivo.39

A lei dos genéricos surgiu por que os preços dos medicamentos vinham

subindo descontroladamente, deixando o consumidor sem opção. A entrada dos

genéricos no mercado incentivou a concorrência no setor, trazendo novas opções ao

consumidor fazendo com que os preços caíssem.

Para serem registrados, os genéricos são submetidos a um rígido controle de

qualidade, que assegura que o consumidor terá resultados exatamente iguais aos

remédios de referência.

Visando garantir a qualidade do genérico, a ANVISA avalia os resultados dos

11

testes de bioequivalência no território nacional brasileiro.

A bioequivalência é um estudo comparativo entre as biodisponibilidades do

medicamento de referência e do genérico correspondente. Se não houver diferença

entre a velocidade e extensão de absorção dos dois medicamentos, isto quer dizer

que eles são intercambiáveis, ou seja, podem substituir um ao outro.40

De acordo com a Resolução RDC no 16 de 02 de março de 2007 da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária, dois medicamentos são considerados

bioequivalentes quando são administrados na mesma dose molar, nas mesmas

condições experimentais e não apresentam diferenças estatisticamente significativas

em relação a biodisponibilidade. Além disso, um medicamento considerado

bioequivalente tem que conter o mesmo fármaco, isto é, mesmo sal ou éster da

molécula terapeuticamente ativa, na mesma quantidade e forma farmacêutica,

podendo ou não conter excipientes idênticos, sendo portanto equivalente

farmacêutico.40

1.6- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ) e Ultra Eficiência (CLUE)

A cromatografia é um método físico-químico de separação e está

fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre

devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis: fase móvel e a fase

estacionária.

O desenvolvimento da cromatografia ocorreu por volta dos anos de 1950,

quando se usavam colunas recheadas com partículas irregulares de 100-200 µm

que alcançavam eficiência de apenas 200 pratos/15 cm.

Baseando-se na teoria da cromatografia gasosa, de que a eficiência de uma

separação aumenta com a diminuição do tamanho da partícula da fase estacionária,

surgiu na década de 60, a cromatografia líquida de alta eficiência. Neste período

foram introduzidas as colunas recheadas com partículas peliculares rígidas de 40-50

µm, mecanicamente resistentes e, dessa forma, próprias para serem usadas com

pressão.41

Com o surgimento da CLAE, através do aprimoramento da cromatografia

líquida clássica, foi possível superar as dificuldades de se separação de alguns

compostos, como corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos. 42

Um sistema de cromatografia líquida é composto por módulos, que são

12

projetados para proporcionar versatilidade, rapidez, reprodutibilidade e alta

sensibilidade nas análises. Na Figura 1.5 está demonstrado um esquema dos

componentes de um cromatógrafo líquido.

Figura 1.5- Representação esquemática de um sistema de cromatografia líquida.

O avanço mais recentes das técnicas de separação é a cromatografia líquida

de ultra eficiência (CLUE).

A CLUE baseia-se nos mesmos princípios da cromatografia líquida de alta

eficiência, porém são utiliza partículas menores que 2 µm nas colunas

cromatográficas e bombas bem mais potentes já que a pressão do sistema fica ao

redor de 15000 psi. O uso destas partículas juntamente com as altas velocidades da

fase móvel, aumentam a resolução (30000 pratos/15 cm), a detectabilidade e

diminuem o tempo de análise. 42

Na Figura 1.6 está demonstrado um cromatógrafo líquido de ultra eficiência

(CLUE).

13

Figura 1.6- Foto de um sistema de cromatografia líquida de ultra eficiência.

A cromatografia pode ser combinada a diferentes sistemas de detecção e

entre esses sistemas destacam-se: UV-Visível; Fluorescência; Índice de refração;

Infra-Vermelho; Eletroquímicos e o Espectrometro de Massas.

1.7- Espectrometria de Massas

Os primeiros experimentos da ciência em busca do conhecimento das

partículas sub-atômicas, datados do século XIX, contribuíram para o acúmulo de

conhecimento que culminaram com o advento da espectrometria de massa. O

controle do deslocamento por campo eletromagnético de átomos e moléculas

ionizadas através de câmaras de atmosfera rarefeita, bem como o experimento do

físico inglês J.J Thomson (1856-1940), demonstrando diferentes espectros de

massa para uma mesma molécula, se destacam.

O conhecimento desses princípios propiciou a elaboração de um novo

instrumento analítico. O espectrômetro de massas capaz de converter moléculas

neutras em íons na forma gasosa e separá-las eletromagnéticamente de acordo com

sua razão massa/carga e, ao mesmo tempo, quantificá-las usando isótopos estáveis

não-radioativos como padrões internos.43 Na Figura 1.7 pode ser observada a

fotografia de um espectrômetro de massas.

14

Figura 1.7- Fotografia de um Espectrômetro de Massas.

Um espectrômetro de massas pode ser entendido como um instrumento

contendo uma fonte de íons, um separador ou filtro de massas – na realidade,

massa/carga (m/z) – e um detector.44

O espectrômetro de massas pode ser utilizado como um detector

extremamente seletivo, através da fixação de um íon molecular. Nesta técnica

utiliza-se apenas um analisador de massas para separar os íons gerados na fonte

de ionização.45

Outra técnica espectrométrica é a espectrometria de massas sequencial

(MS/MS), onde ao invés de se utilizar apenas um analisador de massas para

separar os íons de mesma razão m/z gerados na fonte de ionização, utilizam-se dois

analisadores ou dois estágios de espectrometria de massas, em que um deles é

usado para isolar o íon de interesse e o outro é usado para estabelecer uma relação

entre este íon de interesse isolado e outros íons que foram gerados a partir de sua

dissociação induzida.45 Esta técnica acoplada à cromatografia é amplamente

empregada na detecção de compostos presentes em matrizes complexas em baixa

concentração, já que possibilita um aumento na detecção e reduz a interferência

espectral de compostos presentes na matriz, além de aumentar a quantidade de

informação estrutural que se pode obter.46

Existem diversos tipos de analisadores de massas, cada um com seus

princípios e características de análise. Entre os analisadores destacam-se o

analisador Quadrupolar, o analisador de Tempo de Vôo e o ion-trap, sendo que no

presente trabalho utilizou-se um instrumento contendo três analisadores de massas

Quadrupolar, ligados em série, constituindo um Triplo Quadrupolo.

1.7.1- Analisador de M assa

O quadrupolo é constituído de quatro

se aplicam uma corrente elétrica do tipo DC e um potencial RF (rádio frequência)

alternante. Os íons produzidos na fonte de ionização do instrumento são focalizados

ao centro da região entre as quatro hastes e atravessa

Suas trajetórias serão dependentes ao campo elétrico produzido onde apenas íons

de uma particular m/z (razão massa sobre carga) terão uma trajetória estável e

chegarão ao detector. Todos outros valores de

ou colidir, ou escapar da região central do quadrupolo, logo não atingindo o detector,

conforme esquema da F

obtenham uma trajetória estável ao longo do quadrupolo chegando ao detector,

gerando assim um espectro de massas

Figura 1.8- Esquema de um filtro quadrupolar.

No instrumento triplo quadrupolar, o íon precursor proveniente do primeiro

quadrupolo é acelerado por um potencial elétrico para uma região de alto vácuo no

interior do segundo quadrupolo, onde sofre repetidas colisões com um gás inerte de

elevada energia (geralmente Ar, He ou N

potencial deste íon até ocasionar sua fragmentação, conduzindo a formação dos

íons produtos. É importante r

separar íons de mesma razão

fragmentação dos íons selecionados no primeiro quadrupolo.

demonstrado o funcionamento de um espect


assas Quadrupolo

é constituído de quatro hastes metálicas paralelas



ao centro da região entre as quatro hastes e atravessam quadrupolo axialmente.


(razão massa sobre carga) terão uma trajetória estável e

chegarão ao detector. Todos outros valores de m/z terão trajetórias inst


conforme esquema da Figura 1.8. A RF é variada para que íons de diferente

enham uma trajetória estável ao longo do quadrupolo chegando ao detector,

gerando assim um espectro de massas.45

Esquema de um filtro quadrupolar.



do segundo quadrupolo, onde sofre repetidas colisões com um gás inerte de

elevada energia (geralmente Ar, He ou N2), levando a um aumento da energia


íons produtos. É importante ressaltar que o segundo quadrupolo não é utilizado para

separar íons de mesma razão m/z, mas sim como cela de colisão, na qual ocorre a

fragmentação dos íons selecionados no primeiro quadrupolo.47

demonstrado o funcionamento de um espectrômetro de massas triplo quadrupolar.

15


hastes metálicas paralelas nos quais



m quadrupolo axialmente.


(razão massa sobre carga) terão uma trajetória estável e

terão trajetórias instáveis e irão,


é variada para que íons de diferente m/z

enham uma trajetória estável ao longo do quadrupolo chegando ao detector,



do segundo quadrupolo, onde sofre repetidas colisões com um gás inerte de

), levando a um aumento da energia


essaltar que o segundo quadrupolo não é utilizado para

, mas sim como cela de colisão, na qual ocorre a

Na Figura 1.9, está

rômetro de massas triplo quadrupolar.

Os íons gerados na fonte são inseridos no quadrupolo Q1, liberando apenas um íon

precursor. O segundo estágio q2 o íon precursor colide com as moléculas de N

Ar em uma pressão de aproximadamente 10

íons filhos. O quadrupolo Q3 atua como um segundo filtro, permitindo que somente

determinados íons filhos passem para o detector.

Figura 1.9- Demonstração esquemática do espectrômetro de massas triplo

quadrupolar.

1.8- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a E spectrometria de

Massas(LC-EM)

O acoplamento de um cromatógrafo com um espectrômetro de massas

combina as vantagens da cromatografia (alta seletividade e eficiência de separação)

com as vantagens da espect

massa molar e aumento adicional da seletividade).

Na utilização da cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas,

são encontradas dificuldades

cromatográfico com o

espectrômetro de massas.

grandes (da ordem de 1,0 mL min

eluente de um cromatógrafo líquido dir

espectrômetro, que opera a pressões de cerca de 1,3 x 10

função da interface empregada em CLAE

parte, da fase móvel.45

Na tentativa de minimizar os problemas encontrados no interfaceamento do

sistema CLAE-EM, foram desenvolvidas várias interfaces, nas quais, muitas vezes,


precursor. O segundo estágio q2 o íon precursor colide com as moléculas de N

Ar em uma pressão de aproximadamente 10-8 a 10-6 bar e se fragmenta formando os


determinados íons filhos passem para o detector.

Demonstração esquemática do espectrômetro de massas triplo

omatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a E spectrometria de



com as vantagens da espectrometria de massas (obtenção de informação estrutural,

massa molar e aumento adicional da seletividade).46


dificuldades relacionadas à vazão do eluente do sistema

sistema de vácuo e o projeto da fonte de íons do

espectrômetro de massas.46 As vazões utilizadas na CLAE são relativamente

grandes (da ordem de 1,0 mL min-1), de maneira que não é possível bombear

eluente de um cromatógrafo líquido diretamente para o interior da fonte do

espectrômetro, que opera a pressões de cerca de 1,3 x 10-4 Pa. Por este motivo a

função da interface empregada em CLAE-EM está na remoção de toda, ou grande


EM, foram desenvolvidas várias interfaces, nas quais, muitas vezes,

16


precursor. O segundo estágio q2 o íon precursor colide com as moléculas de N2 ou

bar e se fragmenta formando os


Demonstração esquemática do espectrômetro de massas triplo

omatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a E spectrometria de



rometria de massas (obtenção de informação estrutural,


relacionadas à vazão do eluente do sistema

sistema de vácuo e o projeto da fonte de íons do

As vazões utilizadas na CLAE são relativamente

), de maneira que não é possível bombear

etamente para o interior da fonte do

Pa. Por este motivo a

EM está na remoção de toda, ou grande


EM, foram desenvolvidas várias interfaces, nas quais, muitas vezes,

17

também é realizada a ionização do analito por métodos que permitem a obtenção de

íons a partir de moléculas sensíveis à temperatura e/ou pouco voláteis.45,47 No

presente trabalho foi utilizado electrospray (ESI) como interface e método de

ionização.

1.8.1- Ionização por Electrospray (ESI)

A ionização por electrospray tornou-se uma das técnicas mais importante

para analisar pequenas moléculas polares, peptídeos, proteínas e oligonucleotídeos

e outros compostos de alto peso molecular.48

Em 1968 Dole sugeriu o electrospray como um possível modo de ionização

para espectrometria de massas, mas foi somente me 1984 que Yamashita e Fenn

demonstraram a aplicabilidade da fonte de electrospray como um método de

ionização branda.49

A ionização por electrospray envolve a formação de um spray eletrostático, a

partir do qual são geradas pequenas gotas carregadas e destas são liberados os

íons, conforme demonstrado na Figura 1.10.44, 50

Figura 1.10- Ilustração da fonte de electrospray.

Em “ESI”, o líquido no qual o analito de interesse se encontra dissolvido,

18

passa através de um capilar, a pressão atmosférica, sob alta voltagem. Na saída do

capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas (spray) que são

dessolvatadas ao se deslocarem para uma região com maior ou menor potencial

(depende do modo de ionização: positivo ou negativo), ou seja, em direção ao contra

eletrodo. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará enriquecida em

íons. Conforme a densidade da carga aumenta na gota, o campo elétrico formado

entre o capilar e o contra eletrodo aumenta, provocando a deformação da gota. A

gota ganha à forma de um cone que é denominado cone de Taylor. Também

participa da dessolvatação um fluxo contínuo de N2. A medida que ocorre a

dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido até o ponto em que a força de

repulsão entre as cargas similares fica maior que as forças de coesão da fase

líquida. Neste momento ocorre a chamada “explosão coulômbica”, que gera gotas

com tamanhos equivalentes a 10% do tamanho das gotas das quais se originaram.

Uma série de explosões passa então a ocorrer até que são produzido íons do analito

a partir destas gotas, os quais são transferidos para o interior do espectrômetro de

massas por uma série de dispositivos de focalização. Este modelo de formação de

íons é chamado de carga residual (charged residue mode, CRM).

Um outro modelo que explica a formação de íons, consiste na evaporação

das gotículas carregadas até o ponto onde as cargas presentes começam a sofrer

repulsão eletrostática ocasionando a evaporação dos íons. Este modelo é chamado

de evaporação de íons (íon evaporation mode, IEM).44, 45, 46

Para a análise por LC-EM de compostos presentes em matrizes biológicas

complexas, primeiramente é necessário a realização de um pré-tratamento das

amostras a serem analisadas.

1.9- Tratamento da Amostra

A análise cromatográfica de substâncias presentes em matrizes biológicas

(soro, plasma, urina, etc), em geral, requer um pré-tratamento da amostra. As razões

para tal tratamento são inúmeras, destacando-se a complexidade das matrizes

biológicas, das quais os compostos são obtidos, a existência de proteínas que são

incompatíveis com as colunas cromatográficas e a concentração de substâncias a

serem analisadas, a nível de traço. A meta final do tratamento da amostra é a

obtenção de uma sub-fração da amostra original enriquecida com as substâncias de

19

interesse analítico, de forma que se obtenha uma separação cromatográfica livre de

interferentes, com a detecção adequada e um tempo razoável de análise.

Existem várias técnicas para extração de compostos presentes em fluídos

biológicos e dentre elas estão à extração líquido-líquido, a precipitação de proteínas

e a extração em fase sólida.

Na extração líquido-líquido ocorre a partição da amostra entre duas fases

imiscíveis (orgânica e aquosa). A eficiência da extração depende da afinidade do

soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações.

A escolha adequada do solvente orgânico e o ajuste do pH da amostra são

necessários para assegurar uma boa recuperação do analito. A extração de

substâncias básicas é, normalmente, realizada a pH maiores que 7,0 e a extração

de substâncias ácidas é feita em pH menores que 5,0. Vários tipos de solventes

orgânicos têm sido empregados na extração de drogas ácidas e básicas presentes

em amostras de fluidos biológicos, tais como éter dietílico, acetato de etíla, hexano,

tolueno, diclorometano, misturas de solventes, etc. Quanto maior a afinidade do

analito pelo solvente orgânico, maior a recuperação do mesmo.51

Outro processo de preparo de amostra é a precipitação de proteínas das

matrizes biológicas. Os compostos ligam-se às proteínas, porém estas ligações

podem ser quebradas através de um processo chamado precipitação.

A precipitação pode ocorrer através de vários métodos, entre eles,

aquecimento, tratamento com ácidos, bases ou solventes orgânicos que são

miscíveis com a água como: metanol, acetonitrila e o etanol. Após o processo de

precipitação, faz-se uma centrifugação para separar o precipitado, e o sobrenadante

é injetado diretamente no cromatógrafo ou submetido a um processo de extração

líquido-líquido.52

Uma das técnicas mais poderosas e muito empregada para a extração de

analitos presentes em matrizes complexas é a extração em fase sólida.

Este processo emprega sorventes recheados em cartuchos, nas formas de

barril ou seringas, e os mecanismos de retenção são idênticos àqueles envolvidos

em cromatografia líquida em coluna. Em geral os procedimentos de extração em

fase sólida envolve 5 etapas: i)ativação do sorvente para deixar os sítios ativos

disponíveis; ii) condicionamento do sorvente com solvente adequado para ajustar as

forças do solvente de eluição com o solvente da amostra; iii) introdução da amostra;

20

iv) limpeza da coluna para retirar os interferentes menos retidos que o analito; v)

eluição e coleção do analíto.

Em geral, os materiais de recheio, empregados para extração em fase sólida,

são similares aos usados em cromatografia líquida (alumina, sílica gel, silicato de

magnésio, fases químicamente ligadas e polímeros). Os grupos mais

frequentemente usados à base de sílica quimicamente ligada podem ser divididos

em 3 categorias: i) fase reversa, quando o sorvente é menos polar que o solvente de

eluição; ii) fase normal, quando o solvente é menos polar que o sorvente e iii) troca

iônica.51

21

2- OBJETIVO

Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento e a validação de um

método bioanalítico para a determinação e quantificação do fármaco Risedronato em

plasma humano por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à

Espectrometria de Massas seqüencial (LC/MS/MS).

22

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1- Princípios do Método Bioanalítico

O Risedronato juntamente com seu padrão interno Risedronato D4 foram

extraídos do plasma humano através da técnica de extração em fase-sólida (EFS).

Após o preparo da amostra utilizando ácido clorídrico 1,0 M, esta é aplicada no

cartucho de EFS, e em seguida lavada com solução de ácido clorídrico 5 mM,

metanol e água milli-Q, derivatizada com diazometano e eluída com fase móvel.

Após esse procedimento a fase aquosa das amostras foi transferida para insert e

analisada por Cromatografia Líquida de Ultra Performance com detecção por

Espectrometria de Massas Sequêncial (LC/MS/MS).

3.1.1- Equipamentos e Materiais

Para o desenvolvimento e validação da metodologia bioanalítica, foram

utilizados diferentes tipos de equipamentos e materiais. Os equipamentos, materiais

e os componentes da Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) estão

descritos nas Tabelas 3.1 e 3.2, respectivamente.

Tabela 3.1- Descrição dos equipamentos e materiais utilizados.

Descrição Fabricante / País de Origem

Micropipetas de Volume Variável Gilson / França

HTL / Polonia

Ponteira para Micropipeta Axygen / USA

Mesa Agitadora Fine Mixer PCR / Coréia

Misturador (Vortex) Phoenix / USA

Balança Analítica Precisa CP 225 D Sartorius /

Alemanha

Cartucho de Extração de Fase-Sólida

(ESF) OASIS WAX Waters / USA

Bomba à Vácuo Tecnal / Brasil

Extration Plate Manifold Waters / USA

Destilador UFSCAR / Brasil

23

Tabela 3.2- Descrição dos componentes do CLUE.

Descrição Fabricante / Modelo

Espectrômetro de Massas Micromass MS / Premier XE

Nitrogênio Líquido White Martins / TM500

Bomba Analítica Waters / Binary Solvent Manager

Auto-Injetor Waters / Sample Manager / Sample

Organizer

Programa Micromass / Mass Lynx 4.1

3.1.2- Preparo das Soluções Padrão

No desenvolvimento e validação do método, foram preparadas soluções de

Risedronato (fármaco) e Risedronato D4 (padrão interno) na concentração de 100,0

µg/mL. Para o preparo das soluções, tanto de fármaco como de padrão interno,

utilizou-se água Milli-Q como diluente. Todas as soluções padrão preparadas foram

transferidas para frascos de plásticos rotulados, e tampados com batoque e tampa

de rosca. As soluções foram armazenadas na geladeira (de 2o C a 10o C) e

substituídas de acordo com os prazos de validades pré-determinados.

3.1.3- Preparo da Fase Móvel

A fase móvel utilizada no presente estudo foi Acetonitrila / Acetato de Amônio

10mM na proporção 70:30 v/v.

A solução utilizada como fase móvel foi preparada de acordo com a

necessidade e substituída diariamente antes de uma nova corrida analítica.

3.1.4- Preparo dos Padrões da Curva de Calibração e das Amostras Controle

de Qualidade

As concentrações dos padrões da curva de calibração e das amostras

controles de qualidade foram definidas através de uma pesquisa bibliográfica, onde

é determinada a concentração plasmática máxima (Cmax) relativa à dose

administrada. Após definição do Cmax, determina-se os valores da curva de

24

calibração e dos controles de qualidade, sendo que essas concentrações

correlacionam-se com a dose par qual o método foi desenvolvido.

A curva de calibração inclui a análise de uma amostra de branco (matriz

biológica isenta de padrão do fármaco e do padrão interno), uma amostra zero

(matriz biológica com adição de padrão interno) e de amostras contendo padrão do

fármaco e padrão interno contemplando a faixa prevista de concentrações que se

pretende analisar. Os padrões da curva de calibração foram preparados

adicionando-se o fármaco a ser analisado ao plasma humano. Na Tabela 3.3, estão

apresentados os dados referentes aos níveis da curva de calibração.

Tabela 3.3- Valores de concentração para curva de calibração do Risedronato.

Nível Amostra Concentração no Plasma (ng/mL)

B Branco 0

Z Zero 0

1 Risedronato 0,5

2 Risedronato 5,0

3 Risedronato 10,0

4 Risedronato 30,0

5 Risedronato 50,0

6 Risedronato 100,0

7 Risedronato 200,0

Os controles de qualidade (CQ) definidos neste trabalho têm 2 objetivos

distintos: Os definidos por LQ são utilizados para determinar o Limite de

Quantificação (LQ) do método analítico. Para sua determinação foram feitas análises

da matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor

nível quantificável com precisão e exatidão aceitáveis.

Os controles de qualidade baixo (CQB), médio (CQM) e alto (CQA) foram

utilizados para monitorar a precisão e exatidão do método de quantificação durante

os ensaios.

O controle de qualidade baixo (CQB) é determinado como sendo três vezes a

concentração do limite de quantificação (LQ), o controle de qualidade alto (CQA)

como sendo de 75-90% do ponto mais alto da curva e o controle de qualidade médio

25

(CQM) seria a média aproximada do CQB e CQA.

Todas as amostras dos controles de qualidade foram preparadas

adicionando-se o analito a ser analisado ao plasma humano.

Na Tabela 3.4 estão apresentados os dados referentes às concentrações das

amostras dos controles de qualidade.

Tabela 3.4- Preparo dos controles de qualidade.

CQ Analito Concentração no plasma (ng/mL)

LQ Risedronato 0,5

CQB Risedronato 1,5

CQM Risedronato 80,0

CQA Risedronato 160,0

As amostras da curva de calibração e os controles de qualidade foram

fracionadas em alíquotas de 200 µL, armazenadas em tubos tipo eppendorf

devidamente rotuladas e estocadas a -70 °C até a su a utilização.

3.1.5- Parâmetros Cromatográficos

As análises cromatográficas foram realizadas usando uma coluna analítica

Acquity UPLC BEH – Hilic (1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm) à temperatura ambiente. O

fluxo no Cromatógrafo Líquido de Ultra Performance foi programado para operar

com 0,25 mL/min, um volume de injeção de 10 µL e o tempo total de corrida foi

ajustado para 3,50 minutos. As análises foram realizadas com auto-injetor à

temperatura ambiente.

O tempo de retenção, tanto para o Risedronato quanto para o Risedronato D4,

foi de 2,0 minutos.

3.1.6- Parâmetros de Detecção no Espectrômetro de M assas Seqüencial

MS/MS

Os parâmetros do equipamento utilizados para a detecção do Risedronato e

Risedronato D4 foram: fonte de ionização por electrospray operando em modo

positivo (ESI+) e MRM 354,23 > 228,32 para monitoramento do Risedronato e MRM

358,15 > 232,38 para Risedronato D4. A temperatura da fonte foi de 110 ºC e

26

dessolvatação de 450 ºC. O fluxo dos gases do cone e dessolvatação foram de 14 e

695 L/h, respectivamente. Os valores de voltagem do capilar, cone e energia de

colisão foram, respectivamente, 3,0 KV, 20,0 V e 15,00 eV para o Risedronato e o

Risedronato D4, tendo como pressão de Argônio para a dissociação 3,24 x 10-3

mbar.

3.2- Preparo da Amostra

O preparo do reagente de derivação e o tratamento das amostras,

consecutivamente descritos abaixo, foram utilizados para a extração do Risedronato

e do Risedronato D4 do plasma humano. Este procedimento foi utilizado durante

todo o desenvolvimento e validação da metodologia.

3.2.1- Preparo do Reagente de Derivação Diazometano

Para o preparo do diazometano, primeiramente pesou-se 10,7 g do reagente

p-toluil-sulfonil-nitrosamida (Diazald) e dissolveu-se em 150 mL de éter dietílico.

Resfriou-se a solução em banho de gelo e em seguida transferiu-se a mesma para

um balão de destilação

Em seguida, preparou-se uma solução de 2,0 g de KOH em 50 mL de etanol

96%. Esta solução também foi resfriada em banho de gelo. Adicionou-se ao balão

de destilação contendo a solução de Diazald, a solução de KOH em etanol 96%.

Deixou-se o sistema em repouso por 10 minutos em banho de gelo.

Após o repouso do sistema, a mistura foi destilada em banho-maria a 60 ºC.

Ao final da destilação, neutralizou-se a reação com ácido acético (aproximadamente

10 mL).

O produto da reação foi mantido resfriado à -70 ºC.

3.2.2- Tratamento da Amostra

Para a extração do analito (Risedronato) e do padrão interno (Risedronato D4)

das amostras biológicas, as seguintes etapas foram seguidas.

1ª Etapa) Pré-Tratamento da Amostra:

i. Em tubos eppendorff de 2 mL, tranferiu-se uma alíquota de 200 µL de plasma

27

humano e 25 µL da solução de Risedronato D4 1 ug/mL (Água Milli-Q);

ii. Em seguida agitou-se por 1 minuto em mesa agitadora;

iii. Após agitação, adicionou-se 10 µL de HCl 1M;

iv. Agitou-se novamente por 3 minutos em mesa agitadora;

v. Centrifugou-se as amostra a 14000 rpm durante 5 minutos a temperatura de 4 °C.

vi. Transferiu-se para outro eppendorf, 150 µL do sobrenadante e adicionou-se ao

mesmo 450 µL de Água Milli-Q.

vii. Em seguida, agitou-se a amostra por 1 minuto em mesa agitadora e a mesma foi

reservada (extrato 1).

2a Etapa) Condicionamento do Cartucho:

i. No condicionamento do cartucho, primeiramente injetou-se 2 mL de

Metanol 100% (1 mL por vez);

ii. Em seguida injetou-se 2 mL de HCl 5 mM (1 mL por vez);

iii. E finalmente injetou-se no cartucho 2 mL de água (Milli-Q) (1 mL por vez).

3a Etapa) Injeção do Extrato:

i. Nesta etapa, injetou-se no cartucho, 300 µL do extrato 1 reservado na

primeira etapa.

4a Etapa) Lavagem do Cartucho:

i. Para a lavagem do cartucho após a injeção do extrato, primeiramente injetou-se 1

mL de HCl 5 mM;

ii. Em seguida injetou-se 1 mL de Metanol 100%;

iii. E finalizou-se a lavagem injetando-se 1 mL de Água (Milli-Q).

5a Etapa) Eluição e Reação das Amostras:

i. Na eluição das amostras contidas no cartucho, primeiramente injetou-se 1 mL de

Diazometano, sendo 0,5 mL injetado de cada vez.

ii. Em seguida injetou-se 0,5 mL de Fase Móvel, finalizando a eluição.

iii. Os tubos contendo o eluente foram cobertos com papel alumínio, porém não

28

foram selados completamente já que a reação entre o diazometano e o fármaco em

análise libera gás nitrogênio.

iv. Os tubos contendo as amostras foram deixados em repouso durante 30 minutos.

v. Após o término da reação, transferiu-se do tubo contendo amostra reagida, 200

µL de fase inferior para inserts de vidro descartáveis e injetou-se10 µL no sistema

cromatográfico.

29

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1- Pré-Desenvolvimento

Como mencionado anteriormente o Risedronato é um fármaco pertencente ao

grupo dos bifosfonados. Os bifosfonados apresentam em comum dois grupos

fosfóricos o que confere a esse grupo de moléculas, como característica principal, a

capacidade de se quelarem com íons metálicos tornando sua extração seletiva de

matrizes biológicas e sua determinação e quantificação por cromatografia líquida

acoplada a espectrometria de massas, muito desafiadora.

Os bifosfonados podem interagir facilmente com metais nos sistemas de

cromatografia líquida (por exemplo, na injeção ou colunas cromatográficas), dando

origem ao formato de picos pobres e cromatografia irreprodutível. Além disso, os

bifosfonados não são normalmente passíveis de análise por cromatografia líquida

acoplada a espectrometria de massas.53

A experiência tem demonstrado que os bifosfonados produzem uma

distribuição de múltiplos íons carregados, e são propensos a formação de aduto sob

condições de ionização por electrospray (ESI). Esses fatores limitam, por sua vez, a

sensibilidade do ensaio inviabilizando a determinação e quantificação dessa classe

de fármacos por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.53

A baixa sensibilidade e a irreprodutibilidade dos bifosfonados quando

analisados por cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, devido

principalmente à sua característica de se quelarem facilmente com íons metálicos,

induz a pensarmos na necessidade de se obter amostras livre desses íons, porém

essa não é uma tarefa tão simples.

Já é sabido que em matrizes biológicas como o plasma, que foi utilizado no

presente estudo, encontra-se dissolvidos íons metálicos e dentre esses íons está o

cálcio (Ca2+).

A presença dos íons cálcio dissolvidos no plasma é sem dúvida o fator mais

importante que dificulta a extração do Risedronato da matriz biológica.

O Risedronato quando solubilizado no plasma, na sua grande maioria de

moléculas, encontra-se fortemente quelado com os íons cálcios e técnicas

usualmente utilizadas na extração de fármacos de matrizes biológicas, como a

30

precipitação de proteínas, não são eficientes o bastante para a extração do

Risedronato livre dos íons cálcio.

Uma solução para driblar as dificuldades da extração do Risedronato livrando-

o de interferentes e, tornar a análise por cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massas possível, foi a derivatização química com diazometano

juntamente com a extração em fase sólida.

4.1.1- Derivatização Química com Diazometano

A derivatização é um processo no qual o constituinte em análise é modificado

quimicamente para torná-lo mais fácil de ser detectado ou separado. Este processo

químico de derivatização tem sido largamente utilizado para aumentar a detecção de

analítos por LC/MS/MS.48,54

O diazometano, reagente utilizado para derivatizar o risedronato, é um líquido

amarelado extremamente tóxico e altamente explosivo. Em geral é preparado a

partir do p-toluil-sulfonil-nitrosamida por reação com hidróxido de potássio e éter

etílico (Figura 4.1).

S

O

O

N

NO

CH3

CH3

C7H7SO3- +

CH3 N-

N O

CH3 N N OH..

H+

OH -

N+

NCH3

PO

-R

O OH

+ N+

NCH3 N2 +

p-toluil-sulfonil-nitrosamida

Diazometano

DiazometanoÁcido Fosfonico

POR

O OH

CH3

Produto Metilado

Reação a

Reação b

Figura 4.1- a) Reação do p-toluil-sulfonil-nitrosamida com hidróxido de potássio para

a formação do diazometano e b) Reação do ácido fosfônico com diazometano para

formação do produto metilado.

O diazometano é um reagente muito útil na metilação de ácidos carboxílicos e

ácidos fosfônicos, permitindo obter ésteres metílicos.48,54

A reação entre o risedronato e o diazometano resultou em produtos tetra e

31

pentametil derivados, (Figura 4.2), que são facilmente ionizados em electrospray em

modo positivo, resultando em um aumento substancial na sensibilidade da detecção

espectrométrica.

Figura 4.2- Reação do Risedronato com Diazometano gerando produtos tetra e

pentametil derivados.

O produto pentametil derivado é conseqüência de reações que ocorreram não

só nos ácidos fosfônicos do Risedronato, mas também na hidroxila presente na

molécula. Como o produto pentametil derivados foi o que apresentou maior

intensidade de sinal, este foi utilizado para a determinação e quantificação do

Risedronato. Dessa maneira, através da derivatização química, foi possível detectar

e quantificar concentrações muito baixas de risedronato, da ordem de pg/mL.

4.2- Desenvolvimento da Metodologia Bioanalítica

4.2.1- Obtenção do Espectro de Massas (MS)

Para a obtenção do espectro de massas, primeiramente foi necessário a

derivatização da solução de Risedronato preparada em água. Para isso diluiu-se

uma solução de Risedronato para 100 µg/mL, e uma alíquota de 200 µL desta

solução foi transferida para um eppendorf. Adicionou-se ao eppendorf contendo a

solução de Risedronato 1 mL do reagente diazometano previamente preparado em

éter dietílico. O tubo então foi tampado e a mistura foi agitada manualmente. Após

algumas agitações, a tampa dos eppendorfs foram abertas permitindo a liberação do

gás nitrogênio formado na reação. Este processo de agitação e abertura do tubo

eppendorf foram realizadas até desprendimento total do gás, bem como a perda da

coloração da solução de amarelo para transparente. Ao final da reação transferiu-se

uma alíquota da parte inferior aquosa (~ 150 µL) para outro tubo eppendorf.

N

OH P

P

O

O

OH

OHOH

OH

N

OH P

P

O

O

O

OO

O

CH3

CH3CH3

CH3

+N

O P

P

O

O

O

OO

O

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3N2

FM= C7H11NO7P2

PM= 283FM= C11H19NO7P2

PM= 339FM= C12H22NO7P2

PM= 353

32

Como o volume da solução produto da reação é baixo, foi necessária a

realização de várias reações em eppendorfs no intuito de se obter um volume

razoável de solução de Risedronato para posterior infusão direta no espectrômetro

de massas.

Previamente à infusão, o espectrômetro de massas foi programado para

realizar uma varredura de massas que compreendesse a massa do Risedronato

derivatizado.

Como o Risedronato possui uma cadeia lateral contendo um anel piridínico, o

que confere a molécula uma basicidade considerável, a infusão foi feita em modo

positivo de ionização (ES+). Após a programação dos parâmetros do espectrômetro

de massas com as condições tradicionais para a obtenção de espectros de massas

em modo MS (resolução do primeiro e terceiro quadrupolo 15 V; energia de saída do

íon do primeiro quadrupolo 1 V; entrada e saída no quadrupolo de colisão 50 V,

energia de colisão 0 V; resolução do terceiro quadrupolo 15 V; saída do terceiro

quadrupolo 3 V; multiplicador de elétrons 950 V), iniciou-se a infusão direta da

solução de Risedronato derivatizado, com um fluxo que variou de 10 µL/mim a

50µL/mim.

4.2.2- Obtenção do Espectro de Massas (MS/MS)

Para a obtenção do espectro de massas do Risedronato em modo MS/MS,

foram necessárias algumas mudanças nos parâmetros do espectrômetro de

massas. Primeiramente aumentou-se a energia de colisão para um valor maior que

0 V e alterou-se os valores de entrada e saída da cela de colisão para -1 e 1 V

respectivamente, e em seguida abriu-se o gás de colisão (argônio) com uma

pressão inicial de 3x10-3 Torr. Os demais parâmetros permaneceram iguais aos do

modo MS.

Com essas mudanças nos parâmetros do espectrômetro de massas, uma

seleção da massa do íon precursor ocorre no primeiro quadrupolo, que é

posteriormente fragmentado no segundo quadrupolo (sela de colisão), e finalmente

no terceiro quadrupolo é realizada uma varredura de massas dos fragmentos

gerados (íons produtos). Na Figura 4.3 estão demonstrados os espectros de massas

em modo MS/MS do Risedronato e Risedronato D4 e na Figura 4.4 está

demonstrada a proposta de fragmentação do Risedronato.

33

Figura 4.3- a) Espectro Risedronato em modo MS/MS.

Figura 4.3- b) Espectro Risedronato D4 em modo MS/MS.

Risedronate 100 ug/mL

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

Risedronate_system_12 369 (1.862) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (362:383-107:120) Daughters of 354ES+ 1.62e6228.32

166.32

150.36

134.33107.32

212.16

196.27

322.18

244.28

258.14289.91

354.09

Risedronate D4 100 ug/mL

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

Risedronate_system_11 374 (1.887) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (353:383-233:248) Daughters of 358ES+ 2.17e6326.23232.31

170.31154.35

138.18111.45

216.29

199.21

248.34

262.34 294.11

358.22

34

N+

OP

P

O

O

O

OO

O

CH3

H H

Me

MeMe

Me

H

MeOH−

N+

P

P

O

O

O

OO

O

Me

MeMe

Me

H

N+

H

P

P

O

O

OMe

OMe

OMe

MeO

..

N

P

P

O

O

OMe

OMeOMe

MeO

H

+

: MeOH−N

P

P

O+

O

OMeOMe

MeO

N

C+ P

O

MeOOMe

m/z 354 m/z 322 m/z 290

m/z 212

CH3PO2−

a

b

ba

a

b C2H7PO3

N+

P

O

O

O

Me

Me

H

OMe

N+

H

PO

OMe

OMe

OMe

:MeOH− N

PO+

OMe

OMe

CH3PO2

−

− N

C+ OMe

m/z 244

m/z 212 m/z 134

NP

P

O+

O

O

OO

O

Me

MeMe

Me

H

..

N

CH+

P

P

O

O

OO

O

Me

MeMe

Me

OH

C+

N P

PO

O

OO

O

Me

MeMe

Me

OH

H

N P

PO

O

OO

O

Me

MeMe

Me

OH

C+

H

CH+N P

PO

O

OO

O

Me

MeMe

Me

O

H

..N P

PO

O

OO

O

Me

MeMe

Me

O+

H ..

CH+N P

PO

O

O

O

O

Me

MeOH

Me

CH3

CH+N P

O

O

Me

MeOH

CH3

-CH3OPO2

m/z 228

H

m/z 322

NP

PO

O

O

O

Me

Me

Me

O+

MeOH−

m/z 290

c

cc

c

c

c

d

dd

Figura 4.4- Proposta de fragmentação para a molécula de Risedronato com m/z 354

(íon precursor). As rotas a,b,c e d sugerem íons produtos correspondentes à

fragmentação do íon precursor.

Através dos espectros de massas em modo MS e MS/MS, foi possível

determinarmos a função MRM (Monitoramento de Reações Múltiplas).

Na função MRM os parâmetros do espectrômetro de massas são ajustados

para que no primeiro quadrupolo ocorra o monitoramento apenas do íon precursor, e

no terceiro quadrupolo seja monitorado somente o íon produto escolhido. O objetivo

35

da função MRM é a obtenção do aumento da seletividade de íons e da sensibilidade.

Com base nesses conceitos determinou-se a função MRM para o

Risedronato: 354,23 > 228,32.

O Risedronato D4 (Figura 4.5), utilizado como padrão interno, foi procedido da

mesma maneira que o Risedronato para a determinação do MS, MS/MS e MRM.

N

OHP

P

O

O

OH

OHOH

OH

D

D

D

D

Figura 4.5- Estrutura molecular do Risedronato D4.

Após a determinação da função MRM, realizou-se o acoplamento da

cromatografia líquida ao espectrômetro de massas. No acoplamento utilizou-se uma

coluna cromatográfica Acquity UPLC BEH – Hilic (1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm) e a

mesma fase móvel utilizada no modo MS e MS/MS.

Primeiramente ajustou-se a proporção dos solventes da fase móvel, a fim de

minimizar interferentes cromatográficos e em seguida ajustou-se fonte de ionização

e analisadores, assim como energia de colisão e cone do espectrômetro de massas,

no objetivo de um aumento substancial na intensidade do sinal.

Ajustes também foram realizados no sistema de lavagens do cromatógrafo

líquido, afim de minimizar possíveis contaminações.

4.2.3- Extração das Amostras da Matriz Biológica: E xtração em Fase Sólida

(EFS) e Simultânea Derivatização

Experiências anteriores mostraram que a realização da derivatização química

do Risedronato após a extração em fase sólida, ocasionava grande variabilidade de

resultados entre os diferentes lotes analisados. Isso devido à inconsistência da

reação gerada por interferentes que se desprendem do sorvente e são arrastados

juntos com o Risedronato na eluição, geralmente feita com ácido clorídrico.

Pesquisas em sínteses orgânicas demonstraram que a reação de

derivatização com diazometano pode ser realizada de forma eficiente em sorventes

36

de fase sólida.54

Baseado nesses dados científicos, escolheu-se para extração em fase sólida

e simultânea derivatização do risedronato, cartuchos Oasis WAX (Weak Anion e-

Xchange) que são recheados com sorventes que possuem moléculas contendo

trocadores iônicos básicos fracos, que propiciam alta seletividade na análise de

compostos ácidos.

Para os testes iniciais de extração do risedronato do plasma, a fim de

avaliarmos a eficiência dos cartuchos e a reação de derivação, utilizamos plasma

branco, plasma branco com padrão interno, e plasma com concentrações de LQ,

CQB, CQM e CQA.

Os cartuchos WAX foram carregados com o extrato de plasma, e em seguida

foram lavados com ácido clorídrico 5 mM, metanol e finalmente água. A lavagem dos

cartuchos após a adição do extrato é essencial para a eliminação dos interferentes

que por vez possam estar interagindo com o sorvente e dificultando a posterior

reação do Risedronato com o Diazometano.

Após a lavagem, passou-se pelo cartucho o regente derivatizador

Diazometano, e após a sua passagem, eluiu-se as amostras com fase móvel. O

Risedronato uma vez tendo os seus ácidos fosfônicos derivatizados, passa a perder

a interação iônica que o mantinha preso ao sorvente tornando-se mais hidrofóbico, e

desta forma é facilmente arrastado pela fase móvel utilizada na eluição.

Este processo de derivatização na superfície do sorvente do cartucho de

extração em fase sólida se mostrou muito específico quanto à seletividade na

retenção do Risedronato, resultando em extratos muito limpos que resultaram em

uma alta sensibilidade na detecção e quantificação do Risedronato.

4.3- Validação de Metodologia Bioanalítica

A validação do método bioanalítico tem por objetivo demonstrar que a

metodologia préviamente desenvolvida para a quantificação do Risedronato

utilizando o Risedronato D4 como padrão interno, está dentro das normas descritas

na resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003.

A validação do método bioanalítico engloba um pré-estudo que inclui os

parâmetros de especificidade, linearidade, precisão e exatidão, além da definição

37

dos parâmetros de limite de quantificação, concentração dos padrões de calibração

e das amostras do controle de qualidade e é finalizada pela determinação das

estabilidades das amostras tanto em matriz biológica quanto em solução.

4.3.1- Validação do Pré-Estudo

Na realização destes testes foram utilizados padrões de referência com

procedência rastreáveis para o preparo das soluções. Os padrões de referência

utilizados nesta validação estavam todos dentro da vigência determinada pelo

fabricante.

4.3.2- Especificidade

Para o teste de especificidade do método, foram realizadas análises de

amostras de plasma branco de seis indivíduos, sendo quatro amostras normais, uma

lipêmica e uma hemolisada, identificadas pelos respectivos lotes: 3869/6, 56342/1,

37647/4, 54497/2, 26210/7, 4056/9, obitidas no hemonúcleo do hospital universitário

São Francisco (HUSF)

As amostras foram testadas, utilizando o procedimento de extração e as

condições cromatográficas desenvolvidas, para avaliar possíveis interferentes no

tempo de retenção do fármaco (2,0 min) e do padrão interno (2,0 min). Os resultados

foram comparados com aqueles obtidos com uma solução aquosa do analito, em

concentração próxima ao LQ e do padrão interno próxima a sua concentração final.

Nas figuras abaixo estão demonstrados os cromatogramas referentes ao plasma

normal (Figuras 4.6, 4.7, 4.8 e 4.9), ao plasma lipêmico (Figura 4.10), ao plasma

hemolisado (Figura 4.11) e aos cromatogramas referentes à solução de LQ do

Risedronato (Figura 4.12) e do padrão interno na concentração final na amostra

extraída (Figura 4.13).

38

A

B

Figura 4.6- A) Plasma branco normal lote 3869/6, cromatograma referente ao

Risedronato. B) Plasma branco normal lote 3869/6, cromatograma referente ao

padrão interno.

A

B



padrão interno.

Lote # 3869/6

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

Especificidade_01 Sm (Mn, 2x2) 1: MRM of 3 Channels ES+ 354.23 > 228.32

5.49e32.140.47

1.32


4.89e30.53

0.161.06 2.93

1.91

Lote # 56342/1

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100


5.34e32.261.890.35

0.92 1.28

2.712.99


4.69e31.02

0.570.12 1.99 2.52

39

A

B



padrão interno.

A

B



padrão interno.

Lote # 37647/4

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100


6.02e32.34

0.220.59 1.12

2.87


5.23e30.49

1.83

1.260.89

3.05

Lote # 54497/2

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100


5.22e30.59

0.26 1.32 2.582.01


4.61e30.20 2.97

0.65 2.561.79 2.20

40

A

B

Figura 4.10- A) Plasma branco lipêmico lote 26210/7, cromatograma referente

ao Risedronato. B) Plasma branco lipêmico lote 26210/7, cromatograma

referente ao padrão interno.

A

B

Figura 4.11- A) Plasma branco hemolisado lote 4056/9, cromatograma referente

ao Risedronato. B) Plasma branco hemolisado lote 4056/9, cromatograma

referente ao padrão interno.

Lote # 26210/7 (Plasma Lipemico)

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100


5.62e31.890.47

1.00 1.32

2.50 3.03


5.04e32.280.45 0.98

1.79 2.81

Lote # 4056/9 (Plasma Hemolisado)

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100


5.01e32.580.35


4.41e32.520.04

41

A

Figura 4.12- A) Solução aquosa de Risedronato na concentração de 0,5 ng/mL

(concentração do LQ).

A

Figura 4.13- A) Solução aquosa de Risedronato D4 na concentração de 31,2

ng/mL (concentração final de padrão interno na amostra extraída).

Residronato 0.5 ng/mL

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

%

0

100

Solucao-LQ-02 Sm (Mn, 2x3) 1: MRM of 1 Channel ES+ 354.23 > 228.32

1.48e4Area

2.031422

Solucao-LQ-02 Sm (Mn, 3x3) 2: MRM of 1 Channel ES+ 358.15 > 232.38

7.27e30.63

0.22 3.202.870.98 2.04

Residronato D4 31.2 ng/mL

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

%

0

100

Solucao_PI_05 Sm (Mn, 2x2) 1: MRM of 3 Channels ES+ 354.23 > 228.32

7.88e31.24

0.302.792.22

Solucao_PI_05 Sm (Mn, 2x2) 2: MRM of 3 Channels ES+ 358.15 > 232.38

3.48e5Area

2.24134295

1.421067

42

Os resultados obtidos demonstraram que não houve interferências nos

tempos de retenção tanto do risedronato quanto do risedronato D4.

4.3.3- Determinação do Limite de Quantificação

Na definição do limite de quantificação foi considerado a sensibilidade,

especificidade/seletividade, precisão e exatidão do método analítico. O LQ foi

determinado através de análises da matriz biológica contendo concentrações

decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável com precisão e exatidão

aceitáveis.

Alguns critérios foram seguidos para a definição do LQ: a) a resposta de pico

para o LQ deve ser, no mínimo, 5 vezes maior que qualquer interferência na amostra

de branco no tempo de retenção do fármaco; b) o pico de resposta do fármaco no

LQ deve ser identificável e reprodutível com precisão de 20% e exatidão entre 80-

120% em relação à concentração nominal do padrão, através da análise de, no

mínimo, cinco amostras de padrões.

Dentro destas condições, o valor encontrado para o LQ foi de 0,5 ng/mL.

4.3.4- Linearidade

Para a avaliação da linearidade da curva de calibração alguns critérios foram

seguidos: a) o desvio deve ser menor ou igual a 20% em relação a concentração

nominal para o LQ, em pelo menos duas das triplicatas e para as outras

concentrações da curva de calibração, o desvio deve ser menor ou igual a 15% em

relação a concentração nominal em pelo menos duas das triplicatas; b) No mínimo

66% das concentrações da curva de calibração devem cumprir com os critérios

descrito no item a incluindo LQ e ponto de maior concentração da curva de

calibração; c) o coeficiente de correlação deve ser igual ou maior do que 0,98.

Na Figura 4.14 e na Tabela 4.1 estão apresentados os dados referentes às três

linearidades e as curvas de calibração respectivamente.

43

Figura 4.14- Representação gráfica das Linearidades.

Tabela 4.1- Equações da curvas de calibração e do respectivo coeficiente de

correlação linear (R).

Equação da Curva de Calibração

Equação da Curva de Calibração 1: Y= 0,00828006X + 0,00783981 (R = 0,998296)



4.3.5- Precisão e Exatidão

A avaliação da precisão e exatidão do método bioanalítico, foram analisadas

quatro concentrações distintas dentro da faixa da linearidade. A precisão e exatidão

foram determinadas dentro de um mesmo lote (intra-lote) e em lotes diferentes (inter-

lote).

As concentrações dos controles de qualidades foram definidas como sendo o

CQ-LQ com a mesma concentração do LQ, o CQB (Controle de Qualidade Baixo)

0,000

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0

Co

nce

ntr

açã

o E

nco

ntr

ad

a (

ng

/mL)

Concentração Nominal (ng/mL)

Linearidades

Linearidade 01

Linearidade 02

Linearidade 03

sendo menor ou igual a 3 vezes o valor do LQ, o CQM (Controle de Qualid

Médio) aproximadamente a média entre o CQB e o CQA (Controle de Qualidade

Alto) e o CQA definido entre 75

4.3.5.1- Precisão e Exatidão Intra

Na determinação da precisão e exatidão intra

contendo uma curva de calibração nas concentrações definidas anteriormente e

nove amostras de cada controle de qualidade.

Para a validação intra

de Variação (CV) não devem ser maior

(CQB, CQM e CQA) e não exceder os 20% para o LQ. Em relação à exatidão, as

amostras CQB, CQM e CQA devem estar dentro do desvio de

nominal e para o LQ, desvios menores ou iguais a 20%.

Os resultados da

hemolisado estão apresentados nas Figuras 4.1

Figura 4.15- Resultados

do LQ para matriz (plasma) normal

-20

LQ

CQB

CQM

CQA

Coeficiente de Variação Encontrado

sendo menor ou igual a 3 vezes o valor do LQ, o CQM (Controle de Qualid


Alto) e o CQA definido entre 75-90 % da maior concentração da curva de calibração.

Precisão e Exatidão Intra -lote

Na determinação da precisão e exatidão intra-lotes uti


nove amostras de cada controle de qualidade.

Para a validação intra-lote ser aprovada, em relação à precisão, o Coeficiente

de Variação (CV) não devem ser maior que 15% para os controles de qualidade


amostras CQB, CQM e CQA devem estar dentro do desvio de

nominal e para o LQ, desvios menores ou iguais a 20%.

Os resultados das análises intra-lote para o plasma normal, lipêmico e

hemolisado estão apresentados nas Figuras 4.15, 4.16 e 4.17; respectivamente.

s obtidos das análises intra-lote dos controles de qualidade e

para matriz (plasma) normal.

20-10

010

20

7,07

7,076

2,509

3,646

Coeficiente de Variação (CV) %

Intra-Lote - Plasma Normal

Coeficiente de Variação Encontrado Limites do Coeficiente de Variação

Exatidão

44

sendo menor ou igual a 3 vezes o valor do LQ, o CQM (Controle de Qualidade


90 % da maior concentração da curva de calibração.

lotes utilizou-se um lote


lote ser aprovada, em relação à precisão, o Coeficiente

que 15% para os controles de qualidade


amostras CQB, CQM e CQA devem estar dentro do desvio de ± 15% do valor

lote para o plasma normal, lipêmico e

; respectivamente.

lote dos controles de qualidade e

Plasma Normal

Limites do Coeficiente de Variação

100,3

102,47

99,43

91,60

Exatidão


do LQ para matriz (plasma) lipêmica


do LQ para matriz (plasma) hemolisada

CQB

CQM

CQA


CQB

CQM

CQA



para matriz (plasma) lipêmica.


para matriz (plasma) hemolisada.

-15 -10 -5 0 5 10

CQB

CQM

CQA

7,42

1,906

2,557


Intra-Lote - Plasma Lipêmico

Coeficiente de Variação Encontrado Limites de Coeficiente de Variação

-15 -10 -5 0 5 10 15

4,55

2,128

1,998


Intra-Lote - Plasma Hemolisado


45



15

Plasma Lipêmico

Limites de Coeficiente de Variação

Plasma Hemolisado


Exatidão (%)

4.3.5.2- Precisão e Exatidão Inter

Na determinação da precisão e exatidão inter

mesmos critérios de avaliação da intra

Os resultados das análises inter


4.3.6- Validação da Diluição

A validação da diluição

ultrapassem o limite superior da curva de calibração apresentem resultados precisos

e exatos. Para avaliação da

uma concentração 1,7 vezes maior do que o último ponto da curva de calibração.

Esse ponto então foi diluído

identificado como CQD (Controle de Qu

exatidões.

A validação da diluição obedeceu os mesmos critérios de avaliação da precisão

e exatidão.

-20 -15

LQ

CQB

CQM

CQA


Precisão e Exatidão Inter -lotes

Na determinação da precisão e exatidão inter-lotes foram seguidos os

mesmos critérios de avaliação da intra-lote.

Os resultados das análises inter-lote estão apresentados na Figura 4.1

s obtidos das análises inter-lote.

Validação da Diluição

validação da diluição tem por objetivo garantir que as diluições de pontos

o limite superior da curva de calibração apresentem resultados precisos

e exatos. Para avaliação da exatidão e precisão dopou-se o plasma branco com


Esse ponto então foi diluído na proporção de 1:4 com plasma branco, e

CQD (Controle de Qualidade Diluído) e quantificado


15 -10 -5 0 5 10 15 20

2,819

2,160

0,970

2,080


Inter-Lote


100,32

99,95

104,97

98,12

Exatidão(%)

46

lotes foram seguidos os

lote estão apresentados na Figura 4.18.

diluições de pontos que

o limite superior da curva de calibração apresentem resultados precisos

o plasma branco com


na proporção de 1:4 com plasma branco, e o mesmo foi

iluído) e quantificado na curva das



100,32

99,95

104,97

98,12

Exatidão(%)

Verificou-se que os resul

dentro dos limites ace

respectivamente.

Figura 4.19- Resultado

diluição.

Figura 4.20- Resultado

diluição.

-15,000

CQD 1

CQD 2

CQD 3

Intra


CQD

Inter

s resultados da validação da diluição intra e inter

dentro dos limites aceitáveis, como demonstrado nas Figuras 4.1

Resultados das análises intra-lote dos controles de qualidade

Resultados das análises intra-lote dos controles de qualidade

15,000-10,000-5,000 0,000 5,000 10,000 15,000

3,297

2,761

3,152


Intra-Lote - Controle de Qualidade de

Diluição


-15 -10 -5 0 5 10 15

CQD 2,123


Inter-Lote - Controle de Qualidade

de Diluição

47

tados da validação da diluição intra e inter-lotes estão

Figuras 4.19 e 4.20,

lote dos controles de qualidade de

lote dos controles de qualidade de

Controle de Qualidade de


99,06

102,17

98,13

Exatidão (%)

Controle de Qualidade

99,79

Exatidão

99,79

4.3.7- Recuperação

O cálculo da recuperação do fármaco é feito comparando

picos do Risedronato (controles baixo, médio e alto) das amostras extraídas do

plasma com as áreas dos picos do Risedronato preparado em solução.

O padrão interno é

31,2 ng/mL .

Na Figura 4.21

risedronato e do risedronato D

Figura 4.21- Resultados obtidos para a recuperação do fármaco e do padrão interno.

4.4- Estabilidades

4.4.1- Estabilidade Curta Duração

4.4.1.1- Estabilidade no

Processamento)

No processo de avaliação da estabilidade das amostras

mesmas foram mantidas dentro do auto

cada amostra de controle de qualidade

(seis) réplicas nos tempos

Padrão Interno

O cálculo da recuperação do fármaco é feito comparando



O padrão interno é calculado da mesma maneira, porém na concentração de

21 estão apresentados os resultados da recuperação do

risedronato e do risedronato D4.

Resultados obtidos para a recuperação do fármaco e do padrão interno.

Estabilidade Curta Duração

Estabilidade no Tempo e Condições de A nálise (Estabilidade

No processo de avaliação da estabilidade das amostras

foram mantidas dentro do auto-injetor, a temperatura ambiente de 20,4°C, e

cada amostra de controle de qualidade (CQB,CQM e CQA) foram analisadas

(seis) réplicas nos tempos : 0; 3,53; 5,37; 7,21; 9,05 e 10,49 horas.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

CQB

CQM

CQA

Padrão Interno

78,57

78,96

Recuperação (%)

Recuperação

Recuperação Encontrada Recuperação Nominal

48

O cálculo da recuperação do fármaco é feito comparando-se as áreas dos



calculado da mesma maneira, porém na concentração de

estão apresentados os resultados da recuperação do

Resultados obtidos para a recuperação do fármaco e do padrão interno.

nálise (Estabilidade Pós-

No processo de avaliação da estabilidade das amostras processadas, as

injetor, a temperatura ambiente de 20,4°C, e

(CQB,CQM e CQA) foram analisadas em 6

3,53; 5,37; 7,21; 9,05 e 10,49 horas.

90 100

78,57

78,96

80,06

80,16

Recuperação Nominal

Utilizou-se dos mesmos critérios

teste de estabilidade pós processamento.

Os resultados apresentados na Figura 4.2

controles de qualidades entre o período de análise de 0 a 10,49 horas são estáveis

já que estão abaixo do desvio permitido de 15%.

Figura 4.22- Resultados obtidos para as análises de estabilidade em função do

tempo e condição de exposição.

4.4.1.2- Estabilidade do F

Para se avaliar a estabilidade do

congelamento e degelo, foram analisadas nove amostras de cada controle de

qualidade em cada um dos ciclos. Primeiramente as amostras

foram congeladas a -70o

tempo, todas as amostras foram submetidas ao descongelamento natural (primeiro

degelo), a temperatura ambiente, e nove controles de cada concentração foram

extraídas e imediatamente analisadas. Depois de completamente descongeladas, as

amostras foram novamente congeladas

a 24 horas e descongeladas

CQB

CQM

CQA

Estabilidade em Tempo e Condições

Coeficente de Variação Encontrado

se dos mesmos critérios de avaliação da exatidão e precisão para o

teste de estabilidade pós processamento.

Os resultados apresentados na Figura 4.22, observa-se que a variação dos três


ão abaixo do desvio permitido de 15%.

Resultados obtidos para as análises de estabilidade em função do

tempo e condição de exposição.

Estabilidade do F ármaco em Ciclos de Congela mento

Para se avaliar a estabilidade do Risedronato durante três ciclos de


qualidade em cada um dos ciclos. Primeiramente as amostras o C e mantidas nesta temperatura por 24 horas e apó




m novamente congeladas a -70o C, mantidas nesta temperatura de 12

a 24 horas e descongeladas (degelo 2). O mesmo procedimento foi repetido mais

-15 -10 -5 0 510

CQB

CQM

CQA

2,46

1,55

2,16

Coeficiente de Variação - CV (%)


de Análises

Coeficente de Variação Encontrado Limites de Coeficiente de Variação

49

de avaliação da exatidão e precisão para o

se que a variação dos três


Resultados obtidos para as análises de estabilidade em função do

mento e Degelo

Risedronato durante três ciclos de


qualidade em cada um dos ciclos. Primeiramente as amostras CQB, CQM e CQA

e mantidas nesta temperatura por 24 horas e após este




mantidas nesta temperatura de 12

O mesmo procedimento foi repetido mais

15



uma vez, com o intuito de completar o 3

(degelo 3).

Na Figura 4.23 podem ser observadas as variações das médias dos controles de

qualidades para cada ciclo de degelo.

Figura 4.23- Resultados obtidos para as análises de estabilidade nos ciclos de

degelo.

4.4.1.3- Estabilidade das Amostras de Plasma N

Neste teste foram analisadas nove amostras de cada controle de qualidade

recém preparados e outras nove amostras de cada controle de qualidade não

processados mantidos à temperatura ambiente

estão apresentados os resultados

Os critérios utilizados para a avaliação deste teste de estabilidade são os

mesmos da precisão e exatidão.

CQB Degelo 01

CQB Degelo 02

CQB Degelo 03

CQM Degelo 01

CQM Degelo 02

CQM Degelo 03

CQA Degelo 01

CQA Degelo 02

CQA Degelo 03


uma vez, com o intuito de completar o 3o ciclo de congelamento e descongelamento

em ser observadas as variações das médias dos controles de

qualidades para cada ciclo de degelo.

Resultados obtidos para as análises de estabilidade nos ciclos de

Estabilidade das Amostras de Plasma N ão-Processadas



processados mantidos à temperatura ambiente durante 6 horas. Na Figura 4.24

estão apresentados os resultados obtidos nesta análise.


mesmos da precisão e exatidão.

-15 -10 -50

510

CQB Degelo 01

CQB Degelo 02

CQB Degelo 03

CQM Degelo 01

CQM Degelo 02

8,76

7,60

2,14

2,20

3,61

2,47

2,24

2,10


Ciclos de Degelo


50

ciclo de congelamento e descongelamento

em ser observadas as variações das médias dos controles de

Resultados obtidos para as análises de estabilidade nos ciclos de

rocessadas



durante 6 horas. Na Figura 4.24


15

10,01

8,76

7,60


Figura 4.24- Resultados obtidos para as análises de estabilidade para as amostras

não-processadas.

4.4.1.4- Estabilidade de

Para avaliar a estabilidade das soluções pad

Risedronato e do Risedronato D

soluções. Foram comparadas as áreas dos picos

com as áreas dos picos

soluções refrigeradas durante 51 dias para o Risedronato e 49 dias para o

Risedronato D4.

Na Figura 4.25 estão apresentados os resultados das análises de soluç

padrão, onde pôde-se notar que as variações obtidas são menores que 15%, o que

indica a estabilidade das soluções padrão do fármaco e do padrão interno.

-15

CQB

CQM

CQA

Amostras Não Processadas


Resultados obtidos para as análises de estabilidade para as amostras

Estabilidade de Soluções Padrão

Para avaliar a estabilidade das soluções padrão foram utilizados

Risedronato e do Risedronato D4 na concentração de 15,0 ng/mL para as duas

soluções. Foram comparadas as áreas dos picos das soluções

com as áreas dos picos das soluções mantidas à temperatura ambiente por 6 h e

refrigeradas durante 51 dias para o Risedronato e 49 dias para o

estão apresentados os resultados das análises de soluç

se notar que as variações obtidas são menores que 15%, o que


-10 -5 0 510

15

9,76

2,83

1,680


Amostras Não Processadas


51

Resultados obtidos para as análises de estabilidade para as amostras

rão foram utilizados do

na concentração de 15,0 ng/mL para as duas

soluções recém-preparadas

mantidas à temperatura ambiente por 6 h e

refrigeradas durante 51 dias para o Risedronato e 49 dias para o

estão apresentados os resultados das análises de solução

se notar que as variações obtidas são menores que 15%, o que


15


Figura 4.25- Resultados obtidos para as análises de estabilidade da solução padrão.

4.4.2- Estabilidade de Longa D

Para avaliar a estabilidade do fármaco, em plasma, em condições de longa

duração, o tempo de armazenamento deve exceder o intervalo de tempo

compreendido entre a coleta da primeira amostra na Etapa Clínica (07/11/08) e a

análise da última amostra dos voluntários na Etapa Analítica (1

03/11/08 foram preparadas, em plasma, amostras de controles de qualidade e os

mesmos foram armazenados em temperatura

em plasma a curva de cali

de calibração em triplicata (recém preparada) e nove controles de qualidade de cada

concentração recém preparados.

Risedronato - Recém Preparada

Risedronato - Após 6 horas

Risedronato- Após 51 dias

Risedronato D4 - Recém Preparada

Risedronato D4 - Após 6 horas

Risedronato D4 -Após 49 dias

Estabilidade Soluções Padrão


Resultados obtidos para as análises de estabilidade da solução padrão.

Estabilidade de Longa D uração




lise da última amostra dos voluntários na Etapa Analítica (1


mesmos foram armazenados em temperatura -70 °C. No dia 20/02/09 preparou

em plasma a curva de calibração e os controles de qualidade. Extraiu


concentração recém preparados. Também foram extraídos

-15 -10 -5 0 5 10

Recém Preparada

Após 6 horas

Após 51 dias

Recém Preparada

Após 6 horas

Após 49 dias

0,86

0,65

2,47

1,68

0,34

0,07

Coeficente de Variação - CV (%)

Estabilidade Soluções Padrão


52

Resultados obtidos para as análises de estabilidade da solução padrão.




lise da última amostra dos voluntários na Etapa Analítica (12/02/09). No dia


No dia 20/02/09 preparou-se

bração e os controles de qualidade. Extraiu-se uma curva


nove controles de

10 15

0,86

CV (%)


qualidade de cada concentração preparados e

armazenados à -70 °C por um período de 109 dias

demonstrados os resultados da análise de longa duração.

Figura 4.26- Resultados obtidos para as análises de estabilidade da longa duração.

-15 -10

CQB

CQM

CQA


qualidade de cada concentração preparados em plasma dia 03/11/08 e

°C por um período de 109 dias . Na Figura 4.26

demonstrados os resultados da análise de longa duração.

Resultados obtidos para as análises de estabilidade da longa duração.

10 -50

510

6,53

2,41

2,58

Coeficente de Variação - CV (%)

Longa Duração


53

m plasma dia 03/11/08 e

. Na Figura 4.26 estão

Resultados obtidos para as análises de estabilidade da longa duração.

15


54

5- CONCLUSÃO

O método bioanalítico desenvolvido para determinação e quantificação de

risedronato em plasma humano, demonstrou ser bastante robusto, uma vez que

foram cumpridos todos os critérios estabelecidos na RE nº 899, de 29 de maio de

2003.

Na análise da especificidade não ocorreram interferências nos tempos de

retenção do fármaco e do padrão interno, ou estas foram menores que 20% da

resposta do LQ e 5% da resposta da concentração do padrão interno utilizada no

estudo.

Quando analisado a sensibilidade do método, também foram encontrados

resultados positivos, já que a menor concentração da curva de calibração foi aceito

como LQ apresentando uma variação < 20%.

O coeficiente de variação (CV) calculado para os controles de qualidade CQB,

CQM e CQA foram menores ou iguais a 15% e menores ou iguais a 20% para o

controle de qualidade LQ, demonstrando a precisão do método. Na exatidão

calculada para o controle de qualidade LQ e para os controles de qualidade CQB,

CQM e CQA apresentaram valores compreendidos dentro do desvio de + 20% e +

15%, respectivamente, em relação ao valor nominal.

No teste de estabilidade no tempo e condições de análises as amostras

processadas foram estáveis dentro do auto-injetor durante um período de 10,49 h,

(tempo suficiente para as análises de qualquer uma das etapas da validação) já que

os desvios, para os três controles de qualidade, foram inferiores aos 15 %

permitidos. O risedronato também se mostrou estável tanto para os três ciclos de

congelamento e degelo quanto para as amostras de plasma não processadas, uma

vez que o CV não ultrapassou os 15% permitidos na legislação.

Contudo, conclui-se que o método analítico desenvolvido, é extremamente

eficiente para a determinação e quantificação do risedronato em plasma humano,

uma vez que o mesmo foi validado com sucesso cumprindo todos os critérios

impostos pela legislação vigente.

55

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Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia ...livros01.livrosgratis.com.br/cp133931.pdfPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Danilo Chorfi