RELATÓRIO DE FUNDAMENTOS DE TOXICOLOGIA

DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO HIPÚRICO EM URINA POR HPLC

Discentes: Glaucia de Souza Silva

Letícia Ramos de Menezes

Mariana Cristina de Freitas Porto

Curso: Ciências Biológicas (bacharelado) Período: 4º

Docente: Eduardo Costa

Alfenas

Março de 2013

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INTRODUÇÃO:

O ácido hipúrico é considerado um marcador de exposição ocupacional para o tolueno e é o

principal metabólito urinário do tolueno. A determinação urinária é utilizada para monitorização

biológica de trabalhadores expostos ocupacionalmente ao solvente.  Os produtos metabólicos do

tolueno são o cresol (menos de 1%) e o metabólito intermediário benzaldeído. O benzaldeído é

metabolizado a ácido benzóico o qual se conjuga com a glicina e forma o ácido hipúrico.  Cerca

de 75% do tolueno inalado é metabolizado a ácido hipúrico e é excretado na urina 12 horas após

a exposição.

OBJETIVO:

Determinar a quantidade de ácido hipúrico (AH) na urina para monitorização de indivíduos que

possivelmente está exposto ocupacionalmente ao tolueno. Monitorização onde a coleta da

amostra é por meio não invasivo, utiliza-se a urina, e para quantificação usa-se a técnica de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou, mais comumente, HPLC) que se trata de

uma técnica muito sensível e, portanto de alta precisão.

MATERIAIS:

Amostra - tratamento

1 ml de urina + 1 ml de etanol em tubo de centrífuga

Homogeneizar

Centrifugar 2000 RPM por 15 min

Injetar 20μL do sobrenadante no HPLC

MÉTODO:

Condições do HPLC

Fase móvel: água/metano/ácido acético (para 1L: 792/200/8)

Calibração - Fazer 3 calibradores e branco da urina(em balão volumétrico)

C1 = 0,1 mg/ml (adicionar 100μL do padrão 2 a 5ml de urina) - homogeneizar no

sonicador, 10 min

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C2 = 0,5 mg/ml (adicionar 50μL do padrão 1 a 5ml de urina) - homegeneizar no

sonicador,10 min

C3 = 1,0 mg/ml (adicionar 100μL do padrão 1 a 5ml de urina) - homegeneizar no

sonicador, 10 min

Padrão de Ácido Hipúrico (AH)

Sol. 1(50mg/ml) : Dissolver 0,2525g de HÁ (Sigma, 99%) em 5 ml de metanol. Sonicar

10 min e deixar a 4ºC

Sol2.(5mg/ml) : Diluir 1:10ml (balão de 10 ml) da sol.1

Técnica de Cromatografia Líquida de Alta Pressão

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração

diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre

duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações

entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande

aplicação. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por

comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-

se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. O grande

avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com

Partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de

bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. A

Figura 1 mostra um equipamento típico de CLAE. As fases móveis utilizadas em CLAE devem

possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas

e desgaseificadas antes do uso.

Figura 1 - Esquema do

equipamento de CLAE (HPLC)

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A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade,

possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado. As válvulas de injeção usadas

possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas

posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Existem

alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 μL para injeções

analíticas e 0,5-2 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço

inoxidável, com diâmetro interno de cerca de0, 45 cm para separações analíticas e na faixa de

2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25

cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas

com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação. O

detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também

empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros.

Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos

quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada.

Fluxograma dos Métodos

Fundamento químico:

O ácido hipúrico é considerado um marcador de exposição ocupacional para o tolueno estando a

sua concentração relacionada à exposição ocupacional, durante a jornada de trabalho do dia. O

tolueno é um composto aromático também chamado de metilbenzeno por sua estrutura química.

É um líquido incolor, volátil quando em pressão de vapor a 25°C, com propriedade significativa

de lipossolubilidade e que apresenta traços de benzeno de até25%, quando utilizado para fins

comerciais. A absorção ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do

tolueno inalado é absorvido pelos pulmões. A absorção ocorre principalmente pela via

pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado é absorvido pelos pulmões. A principal

via de biotransformação é a oxidação do grupamento metila. O primeiro passo corresponde à

formação do álcool benzílico, mediado pelo citocromo P450.Segue-se a oxidação a benzaldeído,

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pela ação de álcool desidrogenase e finalmente a formação do ácido benzóico, etapa catalisada

pela enzima aldeído desidrogenase . Este ácido se conjuga principalmente com a glicina,

formando o ácido hipúrico e em menor proporção com o ácido glicurônico, produzindo

benzoilglicuronatos.

O Etanol utilizado no tratamento da amostra tem função de precipitar cristais de urina.

RESULTADOS:

VR=1,5 g/g de creatinina

IBMP = 2,5 g/g de creatinina

Para as amostras, adotar:

Urina 24 horas

Amostras 1200 ml de urina

Excreção de creatinina =1,5 g de creatinina/ dia

Y= 3.224.147 x + 188.950 (Gráfico)

00,1 726.596,500,5 1.413.607

1 3.585.282,50

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.20

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

f(x) = 3224147.00819672 x + 188950.262295082

Series2Linear (Series2)

Média das amostras:

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A1 = 3.092.192,75

A2 = 4.558.451,00

Substituindo em A1:

3.092.192,75 = 3.224.147 x + 188.950

3.092.192,75 – 188.950 = 3.224.147 x

2.903.242,75 = 3.224.147 x

3.224.147 x = 2.903.242,75

X=2.903.242,75

3.224 .147

x= 0,900468

Substituindo em A2:

4.558.451,00 = 3.224.147 x +188.950

4.558.451,00 -188.950 = 3.224.147x

4.369.501 = 3.224.147 x

X=4.369 .5013.224 .147

X=1,3552

Amostra 1:

0,900468 mg -----1 ml

x--------------------1200 ml

x=1080 mg de ácido hipúrico

Amostra 2:

1,3552 mg ---------1 ml

x---------------------1200 ml

x= 1626 mg de ácido hipúrico

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Para amostra 1:

1080 ÷ 1,5 = 720 mg de ácido hipúrico /g de creatinina ou 0,720 g de ácido hipúrico/g de

creatinina

Para amostra 2:

1626 ÷ 1,5 = 1084 mg de ácido hipúrico/g de creatinina ou 1,084 g de ácido hipúrico/g de

creatinina

INTERPRETAÇÃO:

VR=1,5 g/g de creatinina

IBMP = 2,5 g/g de creatinina

Pode-se interpretar que a quantidade de ácido hipúrico/creatinina na urina tanto na amostra 1,

que equivale a 0,720 g de ácido hipúrico/g de creatinina, assim como na amostra 2 que equivale

a 1,084 g de ácido hipúrico/g de creatinina, estão abaixo do Valor de Referência e abaixo do

IBMP estabelecidos. Portanto, o valor está dentro do esperado.

A creatinina é uma substância inócua no sangue, sendo produzida e eliminada de forma

constante pelo organismo. Se o paciente mantém sua massa muscular mais ou menos estável,

mas apresenta um aumento dos níveis de creatinina sanguínea, isso é um forte sinal de que o seu

processo de eliminação do corpo está comprometido, ou seja, os rins estão com algum problema

para excretá-la. Se os rins não estão conseguindo eliminar a creatinina produzida diariamente

pelos músculos, eles provavelmente também estarão tendo problemas para eliminar diversas

outras substâncias do nosso metabolismo, incluindo toxinas. Portanto, um aumento da

concentração de creatinina no sangue é um sinal de um possível problema. No caso dos

resultados obtidos, não obteve-se um aumento da concentração de creatinina no sangue, então

não se prevê um possível problema.

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CONCLUSÃO:

Conclui-se que pelo método de HPLC, que a quantidade de ácido hipúrico na urina está abaixo

do estabelecido, portanto dentro do padrão (VR=1,5g/g de creatinina e IBMP= 2,5g/g de

creatinina).

Através do gráfico, pode-se concluir que ele é crescente, porque quanto maior a concentração

do calibrador, maior o sinal. Este aumento é linear, porque respeita a equação de uma reta.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

OGA, S Fundamentos de toxicologia. 3° edição. São Paulo: ateneu Editora, 2008

LORENZETTI, G. G.; LETTIERI, M. T. Avaliação de ácido hipúrico como biomarcador de

exposição ocupacional em trabalhadores de postos de combustíveis. Revista Saúde e Pesquisa,

v. 2, n.3, p. 319-324, 2009.

SILVA, Z. L.; NICÁCIO, J. S.; JACINTO, M.; AMORIN, L. C. A.; ALVAREZLEITE, E. M.

Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 38, n. 2, 2002.

SIQUEIRA, M. E. P. B.; PAIVA, M. J. N. Hippuric acid in urine: reference values. Revista

Saúde Pública, 36 (6), p. 723-727, 2002.

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