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SIMONY DAVET MÜLLER
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
ITAJAÍ - 2006
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
SIMONY DAVET MÜLLER
Itajaí, Fev 2006.
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________ Maique Weber Biavatti, Dra
Orientadora
__________________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:
______________________________________ Maique Weber Biavatti, Dra
Presidente
______________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
______________________________________ Cid Aimbiré de Moraes Santos, Dr.
DEDICATÓRIA
Ao José Luis e ao nosso bebê, pelo amor, incentivo e paciência.
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Dra Maique Weber Biavatti pela dedicação e confiança que depositou
em mim ao longo destes anos.
Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Cid A. M. Santos e Dr.
Franco Della Monache pela disponibilidade de alguns padrões.
Ao Prof. MSc Renê Artur Ferreira pela coleta da Passiflora alata no Campus de Ilhota SC.
Ao Prof. Dr. Armando Cervi pela identificação e registro da planta. Agradeço as bolsistas Michelly e Sônia do Programa Integrado de Pós
Graduação e Graduação (PIPG) pelo esforço e dedicação.
Ao LAPAM, em especial Luciana e Roberta, pelo incentivo, compreensão,
amizade e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu marido José Luis pelo amor e compreensão.
A minha mãe, minha irmã Sabrina e meu irmão Odilon pela confiança e
incentivo.
Ao meu querido pai que já cumpriu sua missão aqui na Terra.
Aos meus amigos David, Rita, Bia, Anilson, Maria e Aldry pelo
companheirismo, amizade e carinho.
Aos amigos dos Laboratórios de Farmacognosia e Instrumentação
Analítica/UNIVALI, onde uma parte do trabalho foi conduzida.
À Pró-Reitoria de Pesquisa e Coordenação do Programa de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas pelos auxílios concedidos.
À secretária do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas,
Rosélia, pela eficiência e amizade.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva para
realização deste trabalho.
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora
alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Simony Davet Müller Fev/2006
Orientadora: Maique Weber Biavatti, Dra Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas Palavras-chave: Passiflora, flavonóides, controle de qualidade, alcalóides, CLAE Número de Páginas: 86.
As folhas de Passiflora alata Curtis, (espécie oficial da Farmacopéia Brasileira) são utilizadas como medicamento contra ansiedade, como antiespasmódico e sedativo. O desenvolvimento de metodologias analíticas para análise de flavonóides e alcalóides em espécies de Passiflora é de suma importância, para o controle de qualidade da planta e extratos fitomedicinais derivados. O estudo sobre perfil de flavonóides e alcalóides em folhas e extrato fluido de P. alata contendo isovitexina foi realizado através de CLAE, comparando seus perfis cromatográficos com extrato fluido de P. incarnata comercial e tintura de P. actinia. Adicionalmente, a concentração total de flavonóides em extratos e folhas foi realizada através de doseamentos Farmacopéicos. O extrato de P. alata foi produzido de acordo com a Farmacopéia Helvetica (1987), de P. incarnata foi obtido comercialmente e de P. actinia de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1926). Na análise dos flavonóides em CLAE verificou-se presença de isovitexina em P. alata: no extrato farmacopéico coletado em janeiro e agosto/2001 (0,018 e 0,007% m/m) e no extrato sob refluxo coletado em janeiro e agosto/2001 (1,137 e 0,018% m/m); em P. actinia: no extrato farmacopeico (0,028% m/m) e no extrato sob refluxo (0,631% m/m) e no extrato comercial de P. incarnata (1,198% m/m) sendo o flavonóide majoritário. A vitexina foi encontrada em P. alata (traços), P. incarnata (0,312% m/m) e ausência dos outros flavonóides marcadores testados: orientina, swertisina, hirerosídeo e rutina. O método desenvolvido em CLAE demonstrou ser adequado e diferenciou as espécies estudadas podendo ser aplicado à amostras comerciais. As análises espectrofotométricas baseadas em metodologias Farmacopéicas para P. incarnata, mostraram resultados diferentes em relação ao flavonóide quantificado isovitexina. Sendo que a metodologia da Farmacopéia Britânica apresentou melhor resultado. Não foi detectada a presença de alcalóides β-carbolínicos clássicos testados (harmana, harmina, harmol, harmalol e harmalina) nos extratos e folhas de P. alata .
Abstract of Dissertation (Thesis) presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Pharmaceutical Sciences
LC AND UV DETERMINATION OF ALCALOID AND FLAVONOID Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae
EXTRACTS
Simony Davet Müller Fev/2006
Advisor: Maique Weber Biavatti, Dra. Area of Concentration: Natural Products. Keywords: Passiflora, flavonoids, quality control, alkaloids, HPLC Number of Pages: 86.
Leaves of Passiflora alata Curtis (official species in the Brazilian Pharmacopoeia) are employed for anxiety, as antispasmodic and sedative. The development of new analytical methodologies for the analysis of flavonoids and alkaloids in Passiflora species are needed in order to improve the quality assurance of the plant and derived extract and phytomedicines. A survey on the flavonoids and alkaloids profile and content of isovitexin in leaves and fluid extract of P. alata through LC was made, comparing its chromatographical profiles with a commercial P. incarnata fluidextract and P. actinia tincture. Additionally, the concentration of the total flavonoids of extracts and leaves according to phamarcopoeial photometrical method was determined. The fluidextract of P. alata was produced in accordance with the Pharmacopoeia Helvetica, tincture of P. actinia as produced in accordance to the Brazilian Pharmacopoeia method. The presence of isovitexin in the species (which have distinct chromatographic profiles) was evidenced, which is the major flavonoid compound in the P. incarnata comercial extract (1.198% w/w), but not in P. alata (0.018 summer e 0.007 winter % w/w) fluidextract and leaves (1.137 e 0.018% w/w) P. actinia (0.028 extract and leaves 0.631% w/w). Just traces of vitexin could be observed in the P. alata and P. incarnata (0.312% w/w) and absence of the other tested flavonoids orientin, swertisin, hyperoside and rutin. The LC developed method demonstrated to be adjusted for the qualitative and quantitative analyses and to differentiate species, appropriate to be applied to commercial sample analysis. The flavonoids spectrophotometrical results of three different methods described to P. incarnata were not comparable, the most suitable performance was verified to the British Pharmacopoeia method. None of the classical beta-carbolinic alkaloids tested were found in the P. alata leaves and medicinal extracts: harmane, harmine, harmol, harmalol, harmaline.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO......................................................................................... 1
2 OBJETIVOS............................................................................................. 5
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................... 5
2.2 Objetivos Especificos............................................................................... 5
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................... 6
3.1 Gênero Passiflora..................................................................................... 6
3.1.1 Considerações botânicas......................................................................... 6
3.1.2 Considerações químicas......................................................................... 10
3.2 Controle de Qualidade de Passiflora........................................................ 15
3.3 Considerações Farmacológicas............................................................... 18
4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 23
4.1 Material Botânico...................................................................................... 23
4.2 Padrões e Solventes................................................................................ 23
4.3 Métodos para Obtenção de Extratos........................................................ 24
4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides ................................................... 24
4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides....... 25
4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides......... 26
4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides................................ 26
4.4. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)............................................ 29
4.4.1 Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira.............. 29
4.4.2 Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira.................. 29
4.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).................................... 30
4.5.1 Instrumentação......................................................................................... 30
4.5.2 Preparo das amostras para pesquisa de flavonóides C-glicosilados
e alcalóides..............................................................................................
30
4.5.3 Condições cromatográficas para pesquisa de flavonóides C-
glicosilados..............................................................................................
30
4.5.4 Curva de calibração para doseamento de isovitexina em CLAE............. 32
4.5.5 Curva de calibração para doseamento de vitexina em CLAE................. 33
4.5.6 Condições cromatográficas para pesquisa de alcalóides β-carbolínicos. 33
4.6 Validação Analítica................................................................................... 34
4.6.1 Linearidade e intervalo............................................................................. 35
4.6.2 Ensaio de exatidão.................................................................................. 35
4.6.3 Ensaio de especificidade......................................................................... 36
4.6.4 Limite de quantificação............................................................................. 36
4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV............................... 37
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................. 41
5.1 Obtenção dos Extratos Hidroalcoólico e Fracionados para Pesquisa de Flavonóides
e Alcalóides.........................................................................
41
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)............................................ 41
5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).................................... 45
5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE..................................................... 52
5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático).................... 62
5.6 Validação Analítica................................................................................... 64
5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais.......... 66
5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE................................................ 70
6 CONCLUSÕES........................................................................................ 78
7 REREFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 80
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da
planta...........................................................................................
8
Figura 2: Foto Passiflora incarnata Lineau, mostrando a inflorescência e o fruto da
planta..................................................................................
9
Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker; mostrando a inflorescência da
planta................................................................................................
9
Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos.................... 28
Figura 5: Fluxograma do método descrito por PETRY et al. (1998)............... 38
Figura 6: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA,
(2000)..........................................................................
39
Figura 7: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA
(1987)..........................................................................
40
Figura 8: CCD do extrato hidroalcoólico total de P.
alata.................................................................................................
42
Figura 9: Cromatografias em camada delgada das amostras: A- Extrato hidroalcoólico de
P. alata, B- Tintura Farmacopeica de P. actinia, C- Extrato hidroalcoólico
comercial de P. incarnata e os respectivos padrões 1-vitexina, 2-rutina e 3-
quercetina...................
43
Figura 10: Cromatogramas, da sobreposição do extrato fluido de P. alata coletadas em
Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em
Agosto/2001...............................................................
46
Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P. actinia e c)
P. incarnata....................................................................
51
Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides......... 54
Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A)....................... 56
Figura 14: Cromatograma de Extrato fluido de P. alata (A) e espectro de UV de: 1-
isovitexina...............................................................................
57
Figura 15: Cromatograma da co-injeção de padrões 1-isovitexina + 2-vitexina e espectro
de 1-isovitexina.................................................
57
Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia
(T).....................................................................................................
58
Figura 17: Cromatograma de P. actinia (T) e espectro de UV de: 1-
isovitexina.........................................................................................
59
Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e espectro
1-isovitexina......................................................
59
Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C) e
padrões............................................................................................
60
Figura 20: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 2-
vitexina.............................................................................................
61
Figura 21: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 1-
isovitexina.........................................................................................
61
Figura 22: Cromatogramas de P. incarnata (C), co-injeção dos padrões e espectro de UV
de: 2- vitexina.........................................................
61
Figura 23: Curva de calibração de isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340
nm.................................................................................
65
Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340
nm..................................................................................
65
Figura 25: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 71
Figura 26: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 72
Figura 27: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos................... 72
Figura 28: Espectros de UV dos padrões de alcalóides.................................... 73
Figura 29: Comparação dos cromatogramas do extrato fluido (A) e dos padrões
(B)................................................................................
74
Figura 30: Comparação dos cromatogramas do extrato a quente (A), extrato a frio (B) e
padrões (C).....................................................................
75
Figura 31: Comparação dos cromatogramas do extrato I (A), extrato II (B), padrões
(C)......................................................................................
77
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B =
Metanol, fluxo de 0,5 mL/min.......................................
31
Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =
Metanol e C = Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min...............
31
Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila - água (110:660); B = Acetonitrila -
água (120:180), fluxo de 1 mL/min...........................
32
Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água - ácido acético 0,5 % (m/v); B = Metanol; C
= Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min................................
32
Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min.............................................
34
Tabela 8: Ensaio de Recuperação do método............................................... 36
Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata
..........................................................................................
47
Tabela 10: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos de P.
alata, P. actinia e P. incarnata................................
50
Tabela 11: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos extratos de P.
alata, P. actinia e P. incarnata................................
50
Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de
Passiflora............................................................
55
Tabela 13: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide C-glucosilado
vitexina...........................................................................................
63
Tabela 14: Resultados do Ensaio de Recuperação do método....................... 66
SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E FÓRMULAS ºC graus Celsius
°GL Gay Lussac
% porcentagem
µg micrograma
µm micrômetro
µL microlitro
Abs absorbância
AlCl3 cloreto de alumínio
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BZD benzodiazepínico
CA campo aberto
CCD cromatografia de camada delgada
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
DL 50 dose letal 50%
g grama
H2O água
HPLC High performance liquid chromatrography
i.p. intra peritonial
k fator de retenção
LC Liquid chromatrography
LCE Labirinto em cruz elevado
L. Lineau
LQ Limite de Quantificação
m massa
mL mililitro
min minuto
nm nanômetro
P. A. pureza analítica
PDA Photo Diode Array
PIPG Programa Integrado de Pós-graduação e Graduação
p/v peso/volume
R reagente
v/v volume/volume
UFPR Universidade Federal do Paraná
USP United States Pharmacopeia
UV ultravioleta
1 INTRODUÇÃO O uso das espécies vegetais, com fins de tratamento de doenças e
sintomas, remota ao momento em que o homem despertou para consciência, e
começou um longo percurso de manuseio, adaptação e modificação dos recursos
naturais para seu próprio benefício (DI STASI, 1996; MARTINS; CASTRO;
CASTELLANI, 1994). Esta prática milenar, atividade humana por excelência,
ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo evolutivo e chegou
até os dias atuais, sendo amplamente utilizada por grande parte da população
mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996).
As plantas são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,
muitas das quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número
de medicamentos. Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem
os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função
biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela
derivada dos processos de síntese, que apesar dos avanços tecnológicos atuais,
ainda é restrita. Esse fato possibilita que os compostos químicos presentes nas
plantas possam vir a se tornar fármacos em potencial para as mais diferentes
moléstias (NODARI et al., 2000).
O conhecimento da biodiversidade vegetal, além de ser considerado uma
fonte de modelos químicos para a síntese de novas moléculas, também deve ser
incentivado como um recurso natural com possível atividade na forma de
fitoterápico padronizado, eficiente e seguro. Dentre as várias plantas com
atividade farmacológica conhecida, destacam-se algumas espécies do gênero
Passiflora, conhecido popularmente no Brasil como maracujá, cujas partes aéreas
são tradicionalmente empregadas por suas propriedades sedativas,
antiespasmódica e ansiolítica (NODARI et al., 2000).
Das quatrocentas espécies conhecidas de Passiflora, trinta são descritas
por terem frutos comestíveis. Somente poucas espécies alcançaram
desenvolvimento comercial e dentre estas as mais conhecidas são Passiflora
edulis Sims, de casca roxa e P. edulis f. flavicarpa Degener, com casca amarela
(SCHMIDT et al., 1995). Esta última é conhecida vulgarmente por maracujá
amarelo, e representa a forma mais cultivada em escala comercial no Brasil. São
também difundidas em nosso país, embora não na mesma escala: Passiflora
edulis Sims (maracujá roxo), Passiflora alata Curtis (maracujá doce), Passiflora
quadrangularis L., Passiflora caerulea L. e Passiflora laurifolia L. (FREITAS, 1985;
SOUZA e MELETTI, 1997).
Entre as inúmeras espécies de Passiflora nativas do Brasil, encontra-se no
estado do Paraná Passiflora actinia Hooker, espécie com poucos estudos
químicos e farmacológicos foram realizados até o presente. Reginatto (2000),
comparando por cromatografia em camada delgada, sete extratos de espécies de
Passiflora, identificou manchas com Rf semelhante aos padrões dos flavonóides
de isoorientina e isovitexina em P. actinia. Em 2001, Kurtz demonstrou a presença
de traços do alcalóide harmana na mesma espécie. Santos, (2003) demonstrou
que o extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia administrado em camundongos, em
doses inferiores a 1.800 mg/kg, não resultou em toxicidade aparente e através dos
métodos de labirinto em cruz elevado e campo aberto, foi observado um efeito
sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato
metanol-água.
A espécie Passiflora incarnata L. é nativa dos Estados Unidos, onde é
muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”
(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos
secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997), não tendo grande
difusão no Brasil em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,
1997). As partes aéreas da planta têm sido usada tradicionalmente para o
tratamento da ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
O uso de Passilfora decorrente de suas propriedades sedantes iniciou-se
no século XVII na Europa, mas os estudos farmacológicos sobre P. incarnata L.
começaram a aparecer a partir do século XIX (HOEHNE, 1939). Graças às
propriedades sedantes e devido à presença de flavonóides C-glicosilados e de
alcalóides do tipo harmana, a P. incarnata L. consta em monografias das
Farmacopéias Francesas (Pharmacopée Française, 1980), Européia (European
Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética
(Pharmacopoeia Helvetica, 1987) e italiana (Farmacopoea Ufficiale Della
Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do
Brasil e desta forma a Farmacopéia Brasileira (Farmacopéia Brasileira, 1977)
elegeu como oficial a P. alata Curtis, apesar desta ainda ser pouco estudada. As
flores grandes e de cor carmim intensa e os frutos comestíveis, de sabor muito
doce, fizeram com que esta espécie se disseminasse muito e fosse bastante
apreciada para o consumo natural, sendo reconhecida vulgarmente como
maracujá-doce (SOUZA e MELETTI, 1997).
Oga et al. (1984); Pereira e Vilegas, (2000); relatam a escassez de literatura
e informações científicas relacionadas com P. alata, o que desperta o interesse e
a necessidade de estudar esta espécie brasileira mais detalhadamente para no
futuro, estabelecer parâmetros mais sólidos em relação à atividade farmacológica
e à composição química correspondente assim como a descrição dos caracteres
microscópicos das espécies aqui encontradas com facilidade e com abundância.
Moraes, Vilegas e Lanças (1997) estudaram várias espécies de Passiflora
incluindo a P. alata, através da observação dos perfis cromatográficos das
amostras comerciais destas espécies. Foi possível ter uma idéia preliminar
somente de flavonóides da espécie comercializada, através de Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE), mas para sua identificação completa é
necessário possuir dados botânicos e identificação dos alcalóides também.
O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma metodologia
validada por CLAE para a determinação qualitativa e quantitativa de flavonóides e
alcalóides em P. alata comparando com os extratos das espécies P. actinia e P.
incarnata. O desenvolvimento desta metodologia poderá ser útil para aplicação no
controle de qualidade, uma vez que a validação de métodos analíticos aplicados
às drogas vegetais ainda é o ponto chave para se obter extratos padronizados.
Este trabalho pretende contribuir ao conhecimento da espécie medicinal brasileira
P. alata (maracujá-doce), carente de informações técnicas sobre sua qualidade,
que é largamente utilizada para ansiedade, como antiespasmódico e sedativa
(ZUANAZZI, 2001).
2 OBETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS 2.1 Objetivo Geral
Avaliar através de CLAE a presença de flavonóides e alcalóides nas folhas e nas
preparações extrativas de Passiflora alata Curtis, Passifloraceae.
2.2 Objetivos Específicos
Desenvolver métodos cromatográficos (CLAE), qualitativos e quantitativos para controle de
qualidade de extratos de Passiflora sp;
Avaliar qualitativamente e quantitativamente os extratos medicinais
produzidos no Laboratório de Farmacognosia da UNIVALI, com relação as
folhas coletadas em janeiro e agosto;
Avaliar quantitativamente o teor de flavonóides totais por espectrofotometria de ultravioleta
(UV), nas folhas e nas preparações extrativas de P. alata .
Comparar os teores de flavonóides e alcalóides através de UV, CLAE bem como os perfis
cromatográficos de P. alata com P. incarnata e P. actinia.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Gênero Passiflora
A família Passifloraceae compreende cerca de vinte gêneros e seissentas
espécies, distribuindo-se principalmente nas Américas e na África (BARROSO,
1978). São plantas escadentes, herbáceas ou lenhosas e possuem gavinhas, as
quais são ramos modificados, podendo ainda ser detectada a presença de
nectários extraflorais (BARROSO, 1978).
O gênero predominante nessa família é Passiflora, representado por aproximadamente
quatrocentas espécies, cujo nome é atribuído ao significado místico das características físicas de
suas flores, nas quais os escritores do século XVI interpretaram suas diferentes partes como
representando os símbolos da Paixão de Cristo. Por esta razão, esses vegetais são conhecidos na
Europa e América do Norte como flor-da-paixão (BARROSO, 1978; FREITAS, 1985).
Algumas espécies de Passiflora são cultivadas por seus frutos comestíveis, principalmente na
forma de sucos e refrescos. A forma de maracujá comestível, o maracujá amarelo, cultivada em
escala comercial é Passiflora edulis Sims forma flavicarpa Deg. Também muito difundida no Brasil
em menor escala temos a Passiflora alata (Dryander) Curtis, Passiflora quadrangularis L.,
Passiflora caerulea L. e Passiflora caurifolia L. (FREITAS, 1985).
3.1.1 Considerações botânicas
Passiflora alata Curtis
A Passiflora alata (Figura 1) é uma trepadeira com gavinhas, de caule quadrangular com
ângulos levemente alados. Estípulas foliáceas, verdes, com até 2 cm de comprimento. Folhas
alternadas, simples, oval ou oblonga, de 10 a 16 cm de comprimento por 8 a 11 cm de largura,
membranácea, glabérrima, de cor verde-escura na página superior, mais pálida na inferior,
uninérvia e arqueado-venosa, com as nervuras salientes em ambas as faces, principalmente na
inferior; suas margens são inteiras e hialino-cartilagíneas. O pecíolo mede geralmente cerca de 3
cm de comprimento e é profundamente caniculado na parte superior, apresenta 2 a 4 glândulas
sésseis nas margens, dispostas aos pares e convexo na parte inferior, que é carenada. Flores
vistosas hermafroditas, actinomorfas, pentâmeras, solitárias nas axilas das folhas, perfumadas,
tendo em média 10 a 12 cm de diâmetro. Sépalas e pétalas camosas, avermelhadas internamente.
Corola bisseriada, a série externa muito mais longa, com filamentos listados de branco e roxo,
série interna muito curta, dentiforme. Fruto ovóide a periforme, com até 10 cm de comprimento e 6
cm de largura, amarelo quando maduro (OLIVEIRA; AKISUE, 1998; FARMACOPÉIA BRASILEIRA,
1977).
A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas encontra-se
largamente distribuída em várias regiões. Conforme a região considerada, recebe os mais diversos
nomes populares, tais como maracujá-guaçú, maracujá-guasú, maracujá-de-refresco, maracujá-
doce, maracujá-comprido ou, simplesmente, maracujá. Esta espécie é muito semelhante a
Passiflora quadrangularis L. (maracujá-mamão, maracujá-assú, maracuja-uaçú), que pertence ao
mesmo sub-gênero e série respectivamente, Granadilla e Quadrangulares; as vezes é difícil
distingui-las a primeira vista, mas ambas apresentam detalhes de organização floral e foliar que as
caracterizam. A P. alata pode ser também confundida com Passiflora macrocarpa (maracujá-
melão), mas novamente, é possível reconhecê-las pela organização foliar e floral. Para alguns
botânicos, P. macrocarpa Mast. é sinonímia de P. quadrangularis L. (FREITAS, 1985; DE
OLIVEIRA et al., 1980)
Outros usos farmacêuticos incluem preparações fitoterápicas, como sedativo no tratamento
de nevralgias, insônia, histeria, epilepsia e ataques nervosos (CORRÊA, 1984). O extrato de
maracujá é usado como componente flavorizante em bebidas alcoólicas e não alcoólicas e em
sobremesas frias. Suas sementes são doces e acídulas, muito apreciadas para a fabricação de
refrigerantes e sucos (CORRÊA, 1984).
Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da planta. Fonte:
www.herbmed.org/herbs/passifloraalata.
Passiflora incarnata Lineau
A espécie P. incarnata L. (Figura 2) é nativa dos Estados Unidos, onde é muito cultivada e
conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho” (SOUZA e MELETTI, 1997). Esta
espécie cresce preferencialmente em solos secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al.,
1997) não tendo grande difusão no Brasil, em parte devido ao amargor da polpa do fruto
(MORAES et al., 1997). As partes mais utilizadas são as folhas, sendo estas trilobadas com
comprimento de 6 a 15 cm e largura de 5 a 12 cm (Souza e Meletti, 1997). As partes aéreas da
planta têm sido usadas tradicionalmente para o tratamento de ansiedade, ataques nervosos e
nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
A P. incarnata L. consta em monografias das Farmacopéias Francesas (Pharmacopée
Française, 1980), Européia (European Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch,
1992 ), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e italiana (Farmacopoea Officiale Della
Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do Brasil.
Figura 2: Foto Passiflora incarnata L. mostrando a inflorescência e o fruto da planta. Fonte:
www.exot-nutz-zier.de/images/ prod_images/Pass...
Passiflora actinia Hooker
A P. actinia (Figura 3), embora sendo uma espécie nativa da região Sul do Brasil, encontram-
se poucos estudos sobre a mesma. Kurtz et al. (2001) em um estudo morfoanatômico e
investigação de constituintes alcaloídicos da espécie através de CLAE, relatou que as folhas
apresentam um contorno oval, margem lisa, ápice obtuso, base arredondada e limbo inteiro.
Observou também que a face abaxial da epiderme é papilosa, o mesófilo é dorsiventral, os feixes
vasculares são colaterais e idioblastos contendo drusas estão distribuídos no parênquima foliar.
Na análise de alcalóides encontrou a presença de traços de harmana.
Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker mostrando a inflorescência da planta. Fonte:
www.passionflow.co.uk/ actinia1.htm
3.1.2 Considerações químicas
Os estudos referentes à composição química de diversas espécies de Passiflora evidenciam,
principalmente, os alcalóides e flavonóides. Entretanto, outras substâncias como saponinas,
glicosídios cianogênicos, esteróides, lignanas, ácidos graxos, maltol, aminoácidos e taninos,
também são citados freqüentemente na literatura (ALONSO, 1998; REGINATTO, 2000;
REGINATTO et al., 2001).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre
os produtos de origem natural (ZUANAZZI, 2001). São particularmente importantes para o controle
de qualidade de fitoterápicos, pois através deles é possível identificar muitas espécies de
Passiflora (QUERCIA et al., 1978).
Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Entre elas podemos citar:
proteção dos vegetais contra incidência de raios ultravioleta e visível, além de proteção contra
insetos, fungos, vírus e bactérias; atraentes de animais com finalidade de polinização;
antioxidantes; controle de ação de hormônios vegetais; agentes alelopáticos e inibição de enzimas.
Podem também ser usados como marcadores taxonômicos e isto é devido sobretudo a sua
abundância relativa em quase todo o reino vegetal, especificidade em algumas espécies, relativa
estabilidade e seu acúmulo com menor influência do meio ambiente (ZUANAZZI, 2001).
Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados e um grande
número ocorre conjugado com açúcares. Essa forma conjugada, também conhecida por
glicosídeos, pode ser formada pela ligação de um ou mais açúcares aos grupos hidroxilas por
ligação hemiacetal facilmente destruída por hidrólise ácida. Outra forma de conjugação de
açúcares ao núcleo flavônico é por meio de ligação açúcar-genina entre carbonos C-1 (anomérico)
do açúcar e um ou dois carbonos do anel A do flavonóide (C-glicosídeo). Quando o metabólito
encontra-se sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também denominado de
forma livre (ZUANAZZI, 2001).
Na Passiflora os flavonóides encontrados são do tipo C-glicosilados, possuem atividade
biológica e são de interesse quimiotaxonômico e freqüentemente são utilizados como “marcadores”
na análise de medicamentos fitoterápicos. Esses flavonóides C-glicosilados são menos solúveis
em acetato de etila do que as agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após
hidrólise (PEREIRA; VILEGAS, 2000).
Oga et al. (1984) encontraram os flavonóides orientina (1), isoorientina (2) vitexina (3),
isovitexina (4), e rutina (5) em P. alata através de CCD. Freitas (1985) realizou um estudo dos
flavonóides glicosídeos de P. incarnata, P. edulis, P. alata e P. quadrangulares, através de CCD e
verificou a presença de quatro flavonóides principais nestas espécies identificados como: vitexina,
isovitexina, orientina e isoorientina.
Vários estudos relatam a presença dos seguintes flavonóides em P. incarnata: C-glicosil
schaftosídio, isoschaftosídio, isovitexina-2´-O-glucopiranosídeo, orientina, isoorientina, isoorientina-
2´-O-glucopiranosídio, swertisina (6), isoscoparin-2”-O-glicosídio quercetina e kaempferol
(PROLIAC et al., 1988; LI et al., 1991; RAHMAN et al., 1997).
Em folhas de P. sexflora, McCormick e Mabry (1992) encontraram seis di-C-glicosilflavonas:
lucenina-2, carlinosídeo, isoviolantina, schaftosídeo, vicenina-1 e isochaftosídeo e seis mono-C-
glicosilflavonas: orientina, isoorientina, isoswertiajaponina e isoswertisina. Em adição, luteolina-7-
O-glucosídeo, luteolina e uma aurona (sufulrentina), também foram identificadas.
Ulubelen et al. (1982) pesquisaram três espécies de Passiflora e relataram a presença dos
seguintes compostos: C-glucosídeo isovitexina, 2”-xilosilvitexina, luteolina-7-O-glucosídeo e uma
mistura de vicenina-2, schaftosídio e isochaftosídeo em folhas de P. pittieri. A partir de P. alata, os
autores obtiveram 2”-xilosilvitexina, vitexina, isovitexina e orientina. Saponarina foi encontrado
somente em P. ambigua.
Os estudos em relação aos flavonóides de Passiflora relatam que os mesmos são derivados
da luteolina (7) e apigenina (8) (GEIGER et al., 1986). Alguns flavonóides detectados com maior
freqüência no gênero Passiflora são os seguintes: orientina, homoorientina, isovitexina, vitexina,
schaftosídeo e swertisina (6) (PEREIRA et al., 2000).
Souza, Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando CLAE, fase isocrática,
para quantificar flavonóides isolados ou compostos em matrizes biológicas complexas, sendo que
o mesmo demonstrou um excelente desempenho em separar os flavonóides quercetina, luteolina e
3-O-metilquercetina em extratos de Achyrocline satureioides.
Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e P. incarnata com base nos
flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico destas três espécies permite diferenciá-
las através da CLAE.
Dhawan et al. (2001) consideraram os flavonóides como o maior grupo de constituintes já
pesquisados no gênero Passiflora.
O
Glu
OH
OH O
OH
vitexina
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
O
OH O
OH
OHOH
Glu
isoorientina(1) (2)
O
Glu
OH
OH O
OH
OH
orientina
Os alcalóides já encontrados no gênero Passiflora são do tipo indólico simples, derivados do
sistema ß-carbolina, conhecidos como ß-carbolinas ou alcalóides ß-carbolínicos (CORDELL, 1981;
DEWICK, 1997). Vários alcalóides indólicos possuem atividade biológica comprovada, sendo que
muitos têm valor na medicina como tranqüilizante e no tratamento da hipertensão (Cordell, 1981;
Harbone, Baxter, 1995), geralmente essa ação é mediada pela sua interação com um ou mais
receptores específicos.
Muitos dos alcalóides ß-carbolínicos são substituídos em C-1 por um grupo metila, como por
exemplo harmana (8) (CORDELL, 1981).
OOH
OH O
OH
OH
O glu-rha
rutina
O
OH O
OH
Glu
OCH3
swertisina
O
OH O
OH
OH
apigenina
O
OH O
OH
OHOH
luteolina
(5) (6)
(7)
(8)
Fellows et al. (1938) foram os primeiros autores a pesquisarem alcalóides em P. incarnata,
porém o extrato clorofórmico da mesma, frente aos reativos gerais para alcalóides (Mayer e
Wagner), não apresentou reação positiva.
Entre 1954-1956, Neu, citado por Souza (1997), isolou o alcalóide harmana a partir de partes
aéreas de P. incarnata e posteriormente detectou a mesma substância em P. edulis e P.
quadrangularis.
Estudos realizados com P. incarnata durante a década de 1960 detectaram, através de
análises cromatográficas e espectroscópicas, os alcalóides harmana (8), harmol (9), harmalol (10),
harmalina (11) e harmina (12) (LUTOMSKI, 1959; LUTOMSKI, 1960; LUTOMSKI, 1967; BENNATI
et al., 1968; LUTOMSKI et al., 1968; BENNATI, 1971).
Rehwald et al. (1985) desenvolveram uma metodologia analítica para a detecção de
alcalóides em P. incarnata que consistia na extração, purificação, concentração e posterior análise
em CLAE da fração alcaloídica. Essa técnica foi sensível à detecção de harmana, harmina,
harmalina, harmol e harmalol, porém em quinze amostras comerciais analisadas, somente uma
apresentou traços de harmana.
Segundo Bennati (1967), harmana, harmina e harmalina são alcalóides presentes no
extrato fluido de P. incarnata sendo que o isolamento e separação foram possíveis mediante
extração etérea. O comportamento cromatográfico com padrões de alcalóide foi característico e
permitiu reconhecimento comparando-se com extrato fluido de Passiflora em preparação
farmacêutica complexa.
Estudos com P. incarnata detectaram os alcalóides: harmana, harmina,
harmalina, harmol, harmana e harmalol, sendo que foi utilizado o método de
Cromatografia de Camada Delgada (BENNATI, 1971).
Oga et al. (1984) relatam apenas o teor de alcalóides expresso em harmana de P. alata,
sendo que encontrou 0,217 mg % de alcalóides, no extrato seco das folhas.
Pereira e Vilegas (2000) relatam que contradições e variações dos valores de teor de
alcalóides encontrados na literatura devem-se em parte as diferentes metodologias aplicadas, e
também pode-se considerar os órgãos empregados, a época e o local de colheita.
NN
CH3H
harmana
NN
CH3H
OH
harmol
NN
CH3H
OH
harmalol
NN
CH3H
OCH3
harmalina
(8) (9)
3.2 Controle de Qualidade de Passiflora
O nome vulgar “maracujá”, de origem tupi-guarani, é empregado para designar uma série de
espécies vegetais pertencentes ao gênero Passiflora. As diversas empresas que comercializam
drogas vegetais obtidas a partir destas espécies freqüentemente enfrentam dificuldade na
identificação destes materiais.
Com freqüência, tais empresas adquirem-nas de coletores preocupados única e
exclusivamente com a atividade extrativa, sem interesse no cultivo da espécie medicinal, bem
como, indiferentes à época da colheita e ao processo de transformação adequada das partes
vegetais em droga. Por isso, muitas vezes, a droga comercializada no Brasil é de baixa qualidade
e não raro apresenta-se fraudada. Com referência a este último fato é conveniente acrescentar que
o problema é bem mais amplo e diz respeito de uma maneira geral á maior parte das drogas aqui
comercializadas (FREITAS, 1985).
Recentemente, as Resoluções - RDC n° 48 e 89 de 16 de março de 2004, da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), incorporaram a P. incarnata L.
na lista de plantas para registro simplificado, para as quais não são necessários
estudos complementares toxicológicos, pré-clínicos e clínicos para a obtenção de
registro de medicamentos, em função do acesso aos estudos sobre esta espécie
(BRASIL ANVISA, 2004), embora até hoje não existam resultados conclusivos que
indiquem qual (is) do(s) constituinte(s) químicos(s) presente(s) nas folhas de
maracujá promovam ação sobre o sistema nervoso central (DHAWAN et al.,
2001b). Entretanto, a referida não preconiza os teores de flavonóides totais
(isovitexina/vitexina).
A diferenciação de P. alata de outras espécies comerciais do gênero Passiflora é
relativamente fácil, visto estes materiais apresentarem folhas lobadas, como P. incarnata L. e P.
edulis Sims ou folhas digitadas/palmatilobadas como P. caerulea L. Outra diferenciação
preocupante é aquela que diz respeito a P. incarnata L. e P. edulis Sims: a margem da folha de P.
edulis Sims é mais nitidamente serrilhada do que a de P. incarnata L. a folha de P. edulis Sims é
NN
CH3H
OCH3
harmina
(12)
também um tanto irregular, não se conseguindo aplainá-la totalmente quando prensada entre
folhas de papel absorvente. Por outro lado, a face dorsal da folha de P. incarnata L. é pubescente,
o que pode ser observado com auxílio de lupa, fato este não observado em P. edulis Sims
(FREITAS, 1985).
Como a droga comercializada na maioria das vezes é representada pelas partes aéreas, a
dificuldade de diferenciação macroscópica destas drogas aumenta com o grau de fragmentação.
Sendo assim, a diferenciação entre as espécies para propósitos de controle de qualidade deve ser
baseada em constituintes químicos como os flavonóides e farmacognósticas. Normalmente os
parâmetros de avaliação da qualidade da matéria-prima vegetal são caracterizados por critérios de
identidade, pureza e teores descritos nas Farmacopéias (FARIAS, 2001).
A determinação dos flavonóides em plantas medicinais, como proposto pelas
Farmacopéias Alemã (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e
Italiana (Farmacopoea Ufficiale Della Republica Italiana, 1998) consiste na análise
espectrofotométrica do complexo quelato de alumínio após hidrólise e extração com acetato de
etila. Este é um método geral e é preconizado para P. incarnata e outras espécies ricas em
flavonóides tais como Camomila recutita, Crataegus spp e Betula alba. Muitos autores (Glasl e
Becker, 1984; Schmidt e Ortega, 1993; Pereira, 2002) têm atribuído a metodologia muitas fontes
de erro analítico, uma vez que o método foi desenvolvido especificamente para analisar
flavonóides O-glicosilados e não para flavonóides C-glicosilados, que resistem à hidrólise ácida. Os
C-glicosilados são menos solúveis em acetato de etila (solvente utilizado para extração) do que as
agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após hidrólise, fase esta que é
descartada. Durante a hidrólise ácida, podem sofrer isomerização, denominada rearranjo de
Wessely-Moser, formando misturas de 8-C-glicosídeo e 6-C-glicosídeo (MARKHAM, 1982).
Até 1978 haviam sido publicados poucos trabalhos detalhando a análise de
flavonóides por CLAE. Na década de 70, a separação de misturas complexas de
flavonóides glicosídeos ainda era difícil, e eram utilizadas com sucesso fases
estacionárias do tipo C8, C18 e NH2, e como fase móvel, misturas de água e
metanol, ou misturas acetonitrila-água, fracamente acidificadas com ácido acético.
A utilização da CLAE começou a crescer como ferramenta de análise de
flavonóides em Passiflora principalmente a partir da década de 80.
Num estudo realizado por Quércia et al. (1978) através de CLAE em
amostras de P. incarnata, foi utilizada coluna Zorbax ODS (25 x 2,0 mm I. D.),
temperatura 45 °C, sistema gradiente composto por metanol-água e fluxo de 0,5
mL/min e foi encontrado um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%
em amostras de extratos pulverizados. Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores
de flavonóides através de CLAE utilizaram coluna RP 18 (30 X 0,5 cm I. D.),
sistema isocrático composto por metanol-água-ácido acético (25:70:5) e fluxo 1,5
mL/min em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata
possuía o menor teor de vitexina dentre as três espécies.
Em um outro estudo, Pietta et al. (1986), analisando simultaneamente
flavonóides em amostras que continham extratos de P. incarnata e Crataegus
monogyna, utilizaram coluna C18 (30 cm x 3,9 mm I. D.), sistema isocrático
composto por 2-propanol-tetrahidrofurano-água (5:15:85) e fluxo 1,5 mL/min
verificando a presença de vitexina-4’-O-ramnoside, isovitevina, vitexina e
hiperosídeo.
Também flavonóides C-glicosilados foram pesquisados em extratos de P.
incarnata pelos autores Qimin et al. (1991) em CLAE, onde foi utilizada coluna RP
18 (250 X 4 mm I. D.), sistema gradiente composto por metanol-ácido fórmico 5%-
água e um fluxo de 1,8 mL/min. Foram identificados nestes extratos os flavonóides
schaftosídeo, isochaftosídeo e isovitexina-2”-O-glucopiranosil e isoorientina-2”-
glucopiranosil.
Grice et al., 2001 desenvolveram um novo método em HPLC para análise
simultânea de alcalóides e flavonóides característicos de P. incarnata,
identificando e quantificando harmane, harmine, harmol, isovitexina e vitexina
onde foi utilizado coluna C18 (150 X 4 mm) e um sistema gradiente composto por
metanol-água-ácido acético e fluxo de 1 mL/min.
Os estudos demonstram que a CLAE vem se tornando um dos procedimentos
cromatográficos de análise mais utilizados na área de produtos naturais, visto a alta eficiência de
separação e sensibilidade que são alcançadas, além da possibilidade de utilização com vários
tipos de detectores (MERKEN et al., 2000).
3.3 Considerações Farmacológicas
O gênero Passiflora é mundialmente conhecido por suas propriedades terapêuticas sobre o
Sistema Nervoso Central, fato que vem sendo cientificamente comprovado desde meados do séc.
XX (RUGGY et al., 1940; LUTOMSKI et al., 1975; LOGGIA et al., 1981).
Na medicina tradicional, a classe de fármacos mais utilizadas como ansiolíticas e sedativas
são os compostos benzodiazepínicos (BZD). Entretanto, além dessas ações, também promovem
uma série de efeitos indesejados, como hipnose, relaxamento muscular, amnésia anterógrada,
prejuízo no desempenho psicomotor, dependência, incompatibilidade com álcool e tolerância
(GRAEFF, 1999). Devido a esses fatores, faz-se necessária pesquisa e o desenvolvimento de
novas drogas, capazes de produzir uma ação ansiolítica e/ou sedativa desprovida desses efeitos.
Inúmeras drogas vegetais, como Melissa officinalis L., Tília europaea L., Hypericum
perforatum L., vêm sendo usadas na medicina popular devido a suas propriedades tranqüilizantes
(COLETA et al., 2001). Em 1940, Ruggy et al., trabalhando com um derivado do extrato fluido de P.
incarnata L., observaram a diminuição da pressão sangüínea e da contração da musculatura lisa
do intestino e do útero em mamíferos. Em 2000, Shi et al. observaram um efeito vaso relaxante
similar, trabalhando com o alcalóide harmana, isolado de Pegamum harmala L.
Alguns alcalóides β-carbolínicos, como a harmina, possuem acentuada atividade
alucinógena, bem como promovem tremores quando aplicados intracerebralmente em ratos
(CORDELL, 1981; SCHRIPSEMA et al., 2000). A capacidade de ligação dos alcalóides β-
carbolínicos aos receptores BZD em ratos foi apresentada por Rommelspacher et al. (1980), sendo
a harmana e a norharmana os mais potentes inibidores destes. Posteriormente em 1996,
Pepplinkhuizen et al. demonstraram que, em altas doses, o alcalóide norharmana ligava-se aos
receptores BZD, bem como inibia a atividade da enzima monoamonoxidase B (MAO-B).
Experimentalmente o mesmo alcalóide induziu sedação e relaxamento da musculatura lisa.
Em 1974, foi relatado que os derivados da pirona (maltol e etil maltol), isolados a partir de P.
incarnata L., causavam efeitos depressores em camundongos como: potencialização do sono
induzido por hexobarbital, ação anticonvulsivante em altas doses e diminuição da atividade
locomotora em doses relativamente baixas (1/10 da DL50) (AOYAGI et al., 1974).
Contraditoriamente, Soulimani et al. (1997) demonstraram que o maltol isolado, misturas de
maltol e harmana e misturas de compostos flavonoídicos e maltol não apresentavam variação nos
parâmetros comportamentais e diminuição da atividade locomotora mesmo em doses elevadas.
Porém esses mesmos autores confirmaram a atividade ansiolítica de P. incarnata L. no extrato
hidroalcoólico (400 mg/kg, i.p.) e a atividade sedativa da mesma a partir do extrato aquoso (400 e
800 mg/kg, i.p.) em camundongos, caracterizando as atividades observadas dependentes do
solvente utilizado na produção do extrato.
Em estudo químico farmacológico, Lutomski et al. (1960) alertaram para a importância da
presença do complexo alcalóide-flavonóide em P. incarnata, para a obtenção de um melhor efeito
farmacológico. Os mesmos autores ainda observam que este complexo está presente no extrato
etanólico.
Trabalhando com extrato fluido e evaporado obtido a partir de folhas de P. alata, contendo
princípios flavonoídicos e alcaloídicos, Oga et al. (1984) relataram que o mesmo promoveu
redução da atividade locomotora, prolongamento do tempo de sono induzido por pentobarbital
sódico e aumento do tempo de latência das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (doses de
75 e 159 mg/kg, via i.p.).
Utilizando o modelo experimental de ansiedade, labirinto em cruz elevado (LCE), Wolfman et
al. (1994) testaram a atividade do flavonóide crisina (1 mg/kg, via i.p.) isolado de P. coerulea e
concluíram que esse composto é um agonista parcial dos receptores BZD, pois apresentou um
decréscimo da ansiedade sem manifestações de atividade sedativa.
Ao contrário dessa observação, Zanoli et al. (2000), ao administrar os flavonóides crisina a
apigenina obtidos respectivamente a partir de P. incarnata e Matricaria chamomilla, verificaram que
ambos produziram uma redução da atividade locomotora espontânea em ratos (sedação) na dose
de 25 mg/kg (via i.p.). Na dosagem de 1 mg/kg (via i.p.), somente a crisina produziu atividade
ansiolítica no modelo de ansiedade claro-escuro. Entretanto, o efeito observado não foi atribuído
aos receptores BZD, visto que estes se encontravam bloqueados por injeção do antagonista
benzodiazepínico flumazenil.
Um estudo comparativo sobre atividade ansiolítica no LCE dos extratos hidroalcoólicos das
espécies de P. alata e P.edulis foi realizado por Petry et al. (2001). Ambos extratos, pela via
intraperitonial em ratos (100 e 150 mg/kg), demonstraram atividade, apesar do extrato de P. edulis
ser mais efetivo em doses menores (50 mg/kg). Trabalhando com o extrato aquoso dessas
mesmas espécies, De-Paris et al. (2002) recentemente obtiveram resultados semelhantes, além de
demonstrar que a composição flavonoídica de P. edulis é mais complexa do que a P. alata.
A partir de 2001, Dhawan et al. começaram a publicar uma série de experimentos em relação
ao gênero Passiflora, dentre os quais um estudo comparativo da atividade biológica de extratos
metanólicos igualmente obtidos de P. incarnata e P. edulis. A dose de 125 mg/kg (via oral) do
extrato metanólico das partes aéreas de P. incarnata apresentou significante atividade ansiolítica
em camundongos no modelo LCE, enquanto que P. edulis não apresentou atividade significativa
em nenhuma das doses testadas (DHAWAN et al., 2001c). O posterior fracionamento do extrato
metanólico de P. incarnata, possibilitou o isolamento de uma substância benzoflavônica (BZF), o
qual apresentou uma atividade ansiolítica expressiva (10 mg/kg, p.o.) similar ao efeito exibido pelo
diazepam (2 mg/kg, v.o) em camundongos submetidos ao LCE (DHAWAN et al., 2001a).
Esses mesmos autores analisaram extratos obtidos de diferentes órgãos vegetais de P.
incarnata e observaram que o extrato metanólico das raízes dessa espécie não apresenta
significativa atividade ansiolítica em relação aos demais órgãos vegetais (DHAWAN et al., 2001b).
O extrato metanólico das folhas de P. incarnata apresentou atividade ansiolítica, propriedades anti-
tussígenas (Dhawan et al., 2002b) contra tosse induzida por SO2 e propriedades afrodisíacas na
dose de 100 mg/kg em animais de laboratório (DHAWAN et al., 2002c).
Santos (2003) realizou um estudo farmacológico através da administração do extrato bruto
hidroalcoólico de P. actinia em camundongos, em doses inferiores a 1.800 mg/kg não resultando
em toxicidade aparente. Através dos métodos LCE e campo aberto, observou um efeito sedativo
com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato metanol-água, sendo que
apenas este último apresentou atividade ansiolítica na dose de 30 mg/kg. Ainda no mesmo estudo
verificou-se que todos os extratos e frações com atividade sedativa, apresentaram atividade de
catalepsia em camundongos.
Apesar dos experimentos laboratoriais desenvolvidos com o intuito de avaliar a atividade
farmacológica de Passiflora, ainda não se pode afirmar à qual classe de compostos se deve tal
atividade sedativa, se a um composto isolado ou a grupos de compostos químicos (PEREIRA e
VILEGAS, 2000).
O extrato fluido de P. alata que foi produzido e analisado quimicamente neste trabalho, foi
também investigado por (Salomão, 2003) farmacologicamente quanto aos seus efeitos
psicotrópicos. Efeito ansiolítico foi observado em camundongos tratados com o extrato (100 mg/kg)
e submetidos ao LCE. Todas as doses utilizadas do extrato (30, 100 e 300 mg/kg) produziram
sedação, confirmada pela diminuição do número de cruzamentos e levantamentos realizados pelos
animais, no campo aberto. Finalmente, extrato 100 mg/kg aumentou o tempo de sono induzido
pelo pentobarbital sódico e induziu catalepsia em camundongos produzindo atividade ansiolítica e
sedativa nas doses empregadas neste estudo.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Material Botânico A P. alata foi coletada no horto botânico do Campus da UNIVALI em Ilhota SC, nos meses
de janeiro e agosto de 2001 e identificada botanicamente como P. alata Curtis pelo Professor
Armando Cervi, Curador do Herbário da UFPR e está sob registro UPCB 43.414 no Herbário do
Departamento Botânico da Universidade Federal do Paraná – Curitiba PR.
Após a coleta as folhas foram secas ao ar, trituradas e estocadas em frascos de vidro
protegidas de umidade e calor, no Laboratório de Farmacognosia do curso de Farmácia da
UNIVALI.
A P. actinia, espécie utilizada para fins de comparação com P. alata, foi coletada na
Fazenda Experimental do Canguiri da Universidade Federal do Paraná (UFPR) nos meses de
outubro e novembro de 2001. A amostra coletada esta registrada no Herbário do Departamento
Botânico da Universidade Federal do Paraná – Curitiba PR, sob número UPCB 30.831.
4.2 Padrões e Solventes
Os solventes utilizados no preparo e extração da amostra, foram: álcool de cereais (Synth),
metanol, acetato de etila, ácido fórmico, clorofórmio, diclorometano, hexano, ácido clorídrico e
hidróxido de amônio todos grau P.A. (Merck).
Para as análises em CLAE, foram utilizados metanol, acetonitrila, isopropanol (Nuclear) e
tetrahidrofurano (Sigma-Aldrich), todos grau HPLC; ácido acético (Dinâmica), ácido ortofosfórico
(Merck) reagentes de grau analítico, e água ultrapura, produzida num sistema Compacto Easypure
(Barnstead) a 18,2 MΩcm.
Foram utilizados os padrões de flavonóides rutina (Sigma), os padrões vitexina, isovitexina,
swertisina, orientina e hiperosídeo cedidos pelos professores Dr. Valdir Cechinel Filho e Dr Franco
Delle Monache. Padrões de alcalóides, harmana, harmol, harmina, harmalina e harmalol, (Fluka)
foram cedidos pelo professor Dr. Cid ª Santos do Departamento de Farmácia da UFPR.
Padrões e solventes foram filtrados por membrana de celulose regenerada (Schleicher e
Schuell) com poros de abertura 0,45 µm.
4.3 Métodos para Obtenção de Extratos
Os diferentes métodos de obtenção de extratos para pesquisa de alcalóides e flavonóides
estão resumidos na Figura 4.
4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides
Extrato de P. alata (A) Folhas secas (500 g) foram moídas e padronizadas pela passagem em um sistema
composto por três tamises com aberturas de 1400 µm, 850 µm e 250 µm respectivamente
(SONAGLIO et al., 1999). Na seqüência utilizando a metodologia adaptada da Pharmacopoeia
Helvética VII (1987), 40% do material vegetal que passou através do tamis com abertura 250 µm,
foi misturado ao pó que passou pelas aberturas anteriores. A droga foi umedecida com o líquido
extrator (álcool de cereais 97°GL: duas partes de álcool para uma parte de água destilada,
obtendo-se teor alcoólico de 64,7%), passada através do tamis com abertura 1400 µm e deixada
em repouso por duas horas.
Utilizando um funil de separação, o material vegetal foi empacotado,
colocando previamente um pequeno pedaço de algodão no funil com objetivo de
uma pré-filtração e o solvente foi distribuído uniformemente sobre a planta moída
e padronizada deixando um excesso de dois centímetros acima do nível da droga.
Durante 12 horas o solvente ficou em contato com o material vegetal. Após,
iniciou-se a percolação coletando-se 1 mL de extrato por minuto.
Extrato de P. actinia (T)
O extrato de P. actinia foi obtido do Laboratório de Farmacognosia da
UFPR, produzido por Kely Cristina Santos, segundo metodologia proposta pela
Farmacopéia Brasileira I para o preparo de tintura de P. alata (DA-SILVA, 1926).
Extrato de P. incarnata ©
O extrato fluido de P. incarnata foi obtido comercialmente (“Chemische
Fabrik Dr. Hetterich”) Fürth, Alemanha.
4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides
Extrato de P. alata (A1) Após elaborado o extrato hidroalcoólico de acordo com a metodologia adaptada da
Pharmacopoeia Helvética VII (1987) e armazenado em refrigerador a 8°C, por 3 dias, o precipitado
(20 g) foi diluído em 200 mL de metanol:água (2:1) e extraído três vezes em funil de separação,
com porções de 100 mL com os solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila. O líquido
restante foi denominado fração aquosa que foi concentrado até secura. Em cada uma dessas
extrações foi aguardado o tempo suficiente até obter a nítida visualização das linhas de separação
das duas fases. As fases orgânicas de cada extração, foram reunidas e também concentradas até
a secura em evaporador rotatório.
4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides
Extrato de P. alata e P. actinia (B)
Para obtenção dos extratos das folhas sob refluxo, foram utilizados 0,400 g da planta, seca
e padronizada de acordo com o item 3.3.1 para extrato de P. alata. Colocada em balão de fundo
redondo de 50 mL, acrescentado 25 mL de etanol 40% e aquecido em banho-maria, sob refluxo
por 15 minutos. Após, a mistura foi filtrada por algodão para balão volumétrico de 50 mL. O resíduo
da droga e o algodão foram lavados em balão de fundo redondo com 10 mL de etanol 40% e
aquecido a fervura sob refluxo por 10 minutos. Filtrado novamente a mistura por algodão, lavado o
resíduo e o algodão e mais 10 mL de solvente em balão de 50 mL e aquecido em banho-maria sob
refluxo por mais 10 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente, o extrato foi filtrado
para balão volumétrico completando o volume com etanol 40%.
4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides
A preparação de extratos para pesquisa de alcalóides foi realizada somente com P. alata.
Extrato I
Pó padronizado das folhas (5 g), umedecidas com hidróxido de amônio 5%, deixado em
repouso por 10 minutos, adicionado aproximadamente 30 mL de clorofórmio suficiente para cobrir
a amostra e colocado no ultrassom por 15 minutos. Após, o extrato foi filtrado e concentrado em
banho maria, o resíduo foi ressuspendido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extrato II
Utilizando 15 g de pó padronizado das folhas, umedecido com hidróxido de amônio 5%,
deixado em repouso por 10 minutos, foi adicionado clorofórmio o suficiente para cobrir a amostra e
colocado no ultrassom por 20 minutos. Após, o extrato foi filtrado, concentrado em banho maria,
redissolvido o resíduo com 10 mL de acido clorídrico 1% e colocado no ultrassom por 10 minutos.
Filtrado novamente, alcalinizado com hidróxido de amônia 10% até pH 9-12, foi procedido a
extração em funil de separação com 5 mL de diclorometano. A extração foi repetida por 3 vezes.
Após este processo, a fase orgânica foi concentrada em banho maria, e o resíduo redissolvido
com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extratos III e IV
De modo a reproduzir a metodologia clássica para extração de alcalóides, segundo método
descrito por Benatti (1967), uma parte do extrato hidroalcoólico foi concentrado em rota-vapor,
sendo feita a extração durante 7 horas com éter sob aquecimento usando o aparelho Soxhlet.
Após finalizado este processo foi adicionado o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrado e
levado em banho-maria até resíduo, em seguida foi redissolvido com ácido clorídrico 1% sob
agitação por 1 hora. Após este processo o extrato foi colocado na geladeira por 10 horas, em
seguida foi realizada a extração com clorofórmio (fase orgânica descartada), adicionando hidróxido
de sódio 10% a fase aquosa e novamente foi submetido a extração com clorofórmio,
acrescentando agente secante sulfato de sódio anidro à fase orgânica, concentrando em banho-
maria até 1mL e realizando a CCD com a mesma fase móvel e revelador descritos anteriormente
(Extrato Quente III).
Realizou-se o mesmo processo descrito acima, com alteração na extração inicial
com éter, a qual foi realizado a frio, em funil de separação (Extrato Frio IV).
Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos
Extrato (A) (Phram. Helvética VII )
Extrato (T) (Farm.
Brasielira II)
Folhas padronizadas P. actinia
Folhas padronizadas P. alata
Extrato (C) P. incarnata (obtido comercialmente)
Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV,
CCD)
Extrato (B) sob refluxo
Pesquisa Flavonóides e
alcalóides (CLAE, UV, CCD)
Extrato (A1) fracionado
Pesquisa Flavonóides
(CCD)
Pesquisa Flavonóides e
alcalóides (CLAE, UV, CCD)
Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV)
Extrato (B) Sob refluxo
Pesquisa Flavonóides (UV, CLAE)
Extrato I, II, III e IV
Pesquisa alcalóides
(CLAE)
4.4.Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
4.4.1 Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Preparou-se uma tintura alcoólica das folhas de P. alata, a 1/5 por
maceração em álcool a 60°C à temperatura ambiente. Evaporou-se 3 mL dessa
tintura a banho-maria e o resíduo foi retomado com 5 mL de metanol sendo filtrado
sobre sulfato de sódio anidro ® (cerca de 0,5 g). Evaporou-se o filtrado a seco,
retomando-o com 5 gotas de metanol. Foi depositado 5 µL desta última solução
sobre uma camada fina de sílica e usando como fase móvel: acetato de etila,
metiletilcetona, água, ácido fórmico (5:3:2:1, v/v). A visualização foi feita sob luz
UV (366 nm ) após nebulização de reativo citrobórico (ácido bórico, ácido cítrico,
metanol 5:5:100, p/v) e solução alcoólica de tricloreto de alumínio a 1%),
FARMACOPÉIA BRASILEIRA (1977).
Realizou-se ainda a seguinte pesquisa para flavonóides: 1 mL do extrato hidroalcoólico foi
evaporado e solubilizado com um mínimo de metanol sendo aplicado em placas de alumínio
cobertas com uma fina camada (0,2 mm) de sílica gel 60 F 254 Merck, ativada a 110°C por 2
horas. Alternadamente, foi preparada a seguinte fase móvel: acetato de etila, água, ácido fórmico
na proporção 80:15:5 e a visualização foi feita sob luz UV 366 nm seguido pela revelação com
ácido 2- aminoetil ester difenilbórico a 1% em metanol e Polietilenoglicol 4000 a 5% em metanol,
sendo a placa aquecida a 120°C por 5 minutos. Para os extratos fracionados seguiu-se este
mesmo procedimento.
4.4.2 Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Utilizando o extrato hidroalcoólico de P. alata, foram feitas extrações com clorofórmio,
adicionando o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrou-se, evaporou-se o filtrado a seco,
retomando-o com algumas gotas de clorofórmio. Foi depositado 5 µL desta última solução sobre
uma camada fina de sílica e usando como fase móvel clorofórmio–metanol-hidróxido de amônia
(9,7:0,3:0,025 v/v). A visualização foi feita sob luz UV (254 e 365 mm) após nebulização do reativo
Dragendorf (WAGNER e BLADT, 1995).
4.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
4.5.1 Instrumentação As análises dos extratos foram realizadas utilizando o cromatógrafo líquido do LAPAM
(Laboratório de Produção e Análise de Medicamentos – UNIVALI) da marca SHIMADZU LC-10;
coluna C18 (Phenomenex), Luna 5µm C18 (Dimensão 250 x 4,60 mm), usando detector SPD –
M10A VP, um “loop” de injeção de 20 µL, uma Bomba LC 10 VP e um software Class VP.
4.5.2 Preparo das amostras para pesquisa de flavonóides C-glicosilados e
alcalóides
Os extratos foram filtrados em presença de carvão ativo e diluída em
metanol 50% na proporção 1:10, sendo novamente filtrada por membrana de
celulose regenerada (Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µµµµm.
Todas as análises foram realizadas em triplicata, a temperatura da coluna de
30 °°°°C.
4.5.3 Condições cromatográficas para pesquisa de flavonóides C-glicosilados
Foram testadas sete condições cromatográficas para as análises dos extratos (T, B, A
e C) em CLAE.
A detecção em UV foi efetuada a 340 nm, 270 nm e 260 nm. Conforme Quadro 1 e
Tabelas 1, 2, 3 e 4:
Quadro 1: Sistemas de solventes utilizados nas corridas isocráticas
SISTEMA
SOLVENTES
FLUXO
(mL/min) 1 acetonitrila – água – ácido acético (18:82:0,5)
1
2 A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,
(10:2:3) (0-60 min de 12% de A em B)
1,2
3 A = agua – ácido ortofosfórico (100:0,1), pH= 2,6 e B = tetrahidrofurano – isopropanol – acetonitrila,
(10:2:3) (0-80 min de 10% de A em B)
1,2
4 isopropanol – tetrahidrofurano – água (5:15:85),
1,5
Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = água – ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B = Metanol,
utilizando um fluxo de 0,5 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%)
1 80 20
45 - 100
60 80 20
Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = água – ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) = Metanol e C =
Acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)
1 80 10 10
20 70 15 15
30 60 20 20
35 50 25 25
Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila – água (110:660); B = Acetonitrila – água
(120:180), utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%)
0,01 88 12
5 95 20
10 90 30
17 83 40
25 75 50
35 65 10
Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água – ácido acético 0,5% (m/v); B =
Metanol; C = acetonitrila, utilizando um fluxo de 1 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%) C (%) 1 75 15 10
20 62 20 15
25 55 25 20
30 75 15 10
4.5.4 Curva de calibração para doseamento de isovitexina em CLAE
O teor de isovitexina foi realizado utilizando o sistema gradiente descrito na
Tabela 4. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso pela
média das determinações em gramas de isovitexina por 100 g da droga (%, m/m).
Foram pesados 2 mg da substância de referência isovitexina e dissolvido em uma
solução de metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para balão
volumétrico de 100 mL completando-se o volume com solução de metanol na
proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas da solução-mãe foram diluídas com uma
mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se soluções contendo
isovitexina, nas seguintes proporções: 4,0; 8,0; 12,0; 16,0; 20,0 µg/mL. As soluções
foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 µm de
diâmetro nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.
4.5.5 Curva de calibração para doseamento de vitexina em CLAE
O teor de vitexina foi realizado de acordo com o sistema isocrático 4 do
Quadro 1. As injeções foram realizadas em triplicata e o resultado foi expresso
pela média das determinações em gramas de vitexina por 100 g da droga (%,
m/m).
Foi pesado 1 mg da substância referência, vitexina e dissolvida em uma solução de
metanol e água na proporção de 1:1. A solução foi transferida para balão volumétrico de 100 mL
completando-se o volume com solução de metanol na proporção de 1:1 (solução-mãe). Alíquotas
da solução-mãe foram diluídas com uma mistura metanol e água na proporção de 1:1 obtendo-se
soluções contendo vitexina, nas seguintes proporções: 2,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0 µg/mL. As soluções
foram filtradas através de filtro de membrana de celulose regenerada (0,45 µm de diâmetro
nominal de poro) e injetadas no cromatógrafo.
4.5.6 Condições cromatográficas para pesquisa de alcalóides ββββ-carbolínicos
Para desenvolver método utilizando a CLAE e melhor separar cada
padrão (harmana, harmina, harmol, harmalina, harmalol), foram usados os
gradientes de concentração da fase móvel (acetonitrila 22%, metanol 22%),
segundo método descrito por Rehwald et al. (1995), conforme as Tabelas 5, 6 e 7.
A detecção em PDA foi efetuada a 340 nm, 240 nm e 260 nm.
Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH 8,0),
utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)
0-5
5-18
18-30
32
40
32
12
20
12
56
60
56
Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH 8,0),
utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)
0-5
5-18
18-30
35
45
35
10
20
10
55
35
55
Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH 8,0),
utilizando um fluxo de 0,8 mL/min.
TEMPO (min) A (%) B (%) C (%)
0-5
5-18
18-30
31
38
31
11
18
11
58
44
58
4.6 Validação Analítica
A validação do método (sistema gradiente 4 – Tabela 04) foi baseada na United States
Pharmacopeia (2000). A amostra para os ensaios de validação foi o extrato hidroalcoólico de P.
alata conforme procedimento da Farmacopéia Helvética (1987). A isovitexina, em três níveis
diferentes de concentração (5, 7 e 10 µg/mL), foi adicionada ao extrato para avaliação da
recuperação do método.
4.6.1 Linearidade e intervalo
A linearidade foi determinada com a construção da curva padrão, obtida através das
injeções no cromatógrafo, de diferentes concentrações da substância de referência (isovitexina).
Foi realizada análise de regressão linear e calculado a equação da reta e o
coeficiente de correlação linear o qual deve ser R2 ≥ 0,999 usando o software
CLASS VP-503.
4.6.2 Ensaio de exatidão
A exatidão do método foi determinada após o estabelecimento da
linearidade, sendo verificada através do ensaio de recuperação, “contaminando”
diluições apropriadas de amostra, com diferentes concentrações conhecidas de
solução padrão (isovitexina). A concentração em cada balão ficou compreendida
no intervalo de linearidade do método.
A solução-padrão foi preparada pesando-se 8 mg de isovitexina e diluído
com metanol 50% para balão volumétrico de 100 mL, tendo como concentração
final: 80 µg/mL.
No preparo da solução-amostra, foi utilizado 5 mL de extrato fluido de P.
alata, diluído com metanol 50% para balão volumétrico de 50 mL e sonicado
durante 5 minutos, tendo como concentração final: 18 µg/mL.
Filtrou-se a solução amostra em papel filtro com carvão ativo e preparou-se
alíquotas seguindo as concentrações demonstradas na Tabela 8. Após realizou-se
as injeções no cromatógrafo utilizando-se como fase móvel o sistema gradiente
(4), demonstrado na Tabela 4.
Tabela 8: Ensaio de Recuperação calculado para o extrato fluido de P. alata (A) fortificado com
isovitexina.
Balão (10 mL) Volume (mL) Amostra
(18 µg/mL)
Volume (µL) Padrão
(18 µg/mL)
Conc. Teórica total
(µg/mL)
Conc. Teórica adicionada
(µg/mL) 1 3 625 10 5
2 3 750 12 7
3 3 1,12 15 10
4 (amostra) 3 - 5 -
5 (padrão) - 625 5 5
4.6.3 Ensaio de especificidade
Este estudo foi realizado durante o teste de recuperação acima (citado no
ensaio de exatidão), tendo como base os dados relativos ao balão no qual foi
realizada a adição de iguais volumes de amostra e padrão comparando com
aquele que foi colocado apenas padrão.
Cálculo:
Resultado do balão apenas com padrão -------------100%
Resultado do balão com amostra e padrão ---------- X%
Inteferência do extrato fluido = 100 – X%
4.6.4 Limite de quantificação
O limite de quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração
que pode ser quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. Este foi
determinado através da equação 1, utilizando o coeficiente angular da curva de
calibração e o desvio padrão da curva de regressão linear (S) (USP, 1995).
Equação 1:
LQ = 10 x S
A
4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV Nas Figuras 5, 6 e 7 estão descritos os procedimentos operacionais realizados para
análise do teor de flavonóides totais.
*Valor de referência para P. alata: 0,55% C= A*FD m*E1%
C= concentração de Apigenina em % (m/m); A= absorbância; FD= fator de diluição; m= massa da planta seca em g; E = Coeficiente de abs específica da apigenina (336,5)
Partes aéreas de P. alata (0,2 g droga
seca)
Extração sob refluxo etanol 40% (v/v), 30
min
Solução extrativa
Diluição da solução extrativa (1:20)
Amostra: solução extrativa + 2 mL
Solução AlCl3 0,5% (m/v)
Solução de compensação: sem
adição de AlCl3 0,5% (m/m)
Figura 5: Fluxograma do método descrito por PETRY et al. (1998). *Valor de referência para P. incarnata: 1,5% do total de flavonóides expressos em Vitexina. Equação: A x 0,8 m Sol 1*: metanol 10% em ác. acético glacial; Sol oxálico -bórica*: 25 g/l ác. bórico + 20 g/l ác. oxálico em ác. fórmico.
Leitura em espectrofotômetro (397
nm) após 30 min.
Partes aéreas de P. alata (0,2 g droga
seca)
Extração sob refluxo 40 mL etanol 60% (V/V), 30
min (2 x)
Completar vol 100 mL
Evaporar 5 mL sol acima, adicionar 10 mL sol 1* e 10
mL sol oxálico bórica* e completar 25 mL ác. acético.
Solução de
compensação: sem adição da sol oxálico
bórica.
Leitura em espectrofotômetro (401 nm) após 30 min.
Figura 6: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000). *Valor de referência para P. incarnata: 0,3% expressos em Hiperosídeo. A x 1.25 m Sol 1*: hexametilenotetramina 0,5% m/v Sol 2*: ác. clorídrico R1: 25% m/v Sol 3*: ác. acético 5% em metanol.
Partes aéreas de P. alata (0,6 g droga seca)
Extração sob refluxo +1mL sol 1*+20 mL acetona +2 mL sol
2* 30 min (2 X)
Amostra: 10 mL sol acima +1 mL AlCL3 e
completar vol com sol 3*.
Solução de compensação: sem
adição de AlCl3
20 mL sol acima+20 mL H2O+15 mL acetado etila partição da fase
aquosa (3 x). Reunir extratos orgânicos e lavar com 50 mL
H2O.Completar vol 50 mL
Leitura em espectrofotômetro (422
nm) após 30 min.
Figura 7: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA (1987).
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Obtenção dos Extratos Fluidos e Fracionados para Pesquisa de Flavonóides e
Alcalóides
O extrato hidroalcoólico (A) (1:1, 360 mL), foi obtido por percolação, com álcool bidestilado
diluído, das folhas de P. alata. Durante o armazenamento observou-se a formação de um
precipitado ocasionado possivelmente devido à evaporação do álcool, conseqüentemente
diminuindo o teor alcoólico do extrato e tornando insolúveis substâncias menos polares.
O precipitado desse extrato (A1) (1,5 g) foi particionado com diclorometano, hexano e
acetato de etila com objetivo de purificá-lo e separar as substâncias nele contidas, por ordem de
polaridade, para posteriormente submetê-las a cromatografia em camada delgada (CCD).
A fração diclorometano apresentou coloração verde escura intenso, teve rendimento de
0,2148 g equivalente a 14,32% do precipitado do extrato hidroalcoólico. A fração hexano obteve
um peso de 0,6983 g equivalente a 46,55% do precipitado do extrato hidroalcoólico e a fração
acetato de etila de coloração verde escura, teve rendimento de 0,3 g equivalente a 20% do
precipitado do extrato hidroalcoólico total. A fase aquosa, de coloração castanho avermelhada,
resultou em 0,2870 g de matéria seca, equivalente a 19,13% do precipitado do extrato
hidroalcoólico.
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
A caracterização de flavonóides de P. alata realizada segundo Farmacopéia Brasileira
(1977), não apresentou resultado satisfatório. A metodologia descreve que deve aparecer quatro
manchas apresentando coloração amarelo esverdeada sob luz ultravioleta após nebulização do
revelador. Observou-se mancha alongada no centro da placa de alumínio, não apresentando
separação para uma possível caracterização dos flavonóides.
Utilizando a fase móvel, constituída de acetato de etila-água-ácido fórmico na proporção
80:15:5 houve separação dos flavonóides. Nas frações aquosa, diclorometano e acetado de etila
após a eluição cromatográfica e revelação, constatou-se a presença de flavonóides e na fração
hexânica não houve extração de flavonóides. Como pode ser observado na Figura 8, a maioria dos
flavonóides, concentram-se na fase acetato e aquosa devido serem os solventes com maior
polaridade que os demais utilizados. Segundo Markhan (1982), os flavonóides são compostos
polares ou moderadamente polares.
Figura 8: CCD do extrato fluido fracionado (A1) de P. alata, a-fração diclometano, b-fração hexano,
c-fração acetato de etila e d-fração aquosa. Fase móvel: acetato de etila – água - ácido fórmico
(80:15:5).
Na CCD do extrato hidroalcoólico de P. alata (A) (Figura 9), comparando-se com os perfis
dos padrões observa-se possível ausência do flavonóide O-glicosilado rutina, presença de
flavonóide C-glucosilado vitexina e/ou isovitexina e possível ausência do flavonóide quercetina. O
mesmo foi observado para o extrato comercial de P. incarnata e para a tintura farmacopeica de P.
actinia na Figura 9.
a b c d
Figura 9: Cromatografias de camada delgada das amostras: A- (Extrato hidroalcoólico de P. alata
), T- (Tintura Farmacopeica de P. actinia), C- (Extrato hidroalcoólico comercial de P.incarnata) e os
respectivos padrões 1-Vitexina, 2-Rutina e 3-Quercetina. Fase móvel: acetato de etila-água-ácido
fórmico
( 80:15:5).
Comparando-se os perfis cromatográficos das três espécies de Passiflora, observa-se que
as espécies que mais assemelham-se são P. incarnata e P. actinia. Após efetuarmos as análises
em CLAE, onde também comparamos os perfis cromatográficos das três espécies, confirmamos
este mesmo resultado, podendo assim verificar que as análises preliminares efetuadas através de
CCD foram satisfatórias.
Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira (1977)
Na caracterização de alcalóides de P. alata segundo método da Farmacopéia Brasileira
(1977), utilizando o extrato fluido (A), não foi obtido resultado satisfatório. A metodologia descreve
três manchas apresentando coloração castanho-avermelhada, após nebulização do revelador. No
entanto, não foi observado nenhuma mancha característica para alcalóides.
A CCD realizada com o extrato I, também não apresentou nenhum
resultado positivo para alcalóides. Já com o extrato II, houve o aparecimento de
uma mancha alaranjada, que depois desapareceu, sendo provavelmente um
resultado falso-positivo para alcalóides, já que o revelador Dragendorff utilizado se
complexa com outras substâncias gerando a mesma coloração característica
(WAGNER e BLADT, 1995)
Segundo Reginatto (2000) há um acúmulo de saponinas em P. alata
verificada por CCD com revelador anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento.
1 2 3 1 2 3 1 2 3 A T C
A presença de saponinas em P. alata pode ser considerada explicação para o
aparecimento das manchas CCD quando reveladas por Dragendorff, sendo que
este reativo dá falso positivo para compostos terpênicos como limonóides e
saponinas (Biavatti com. pessoal).
5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Sistemas utilizados na pesquisa de flavonóides C-glicosilados em CLAE
Foram realizadas várias análises em CLAE, utilizando vários sistemas isocráticos (Quadro
1) e vários sistemas gradientes (Tabelas 1, 2, 3 e 4), com o objetivo de obter uma separação dos
flavonóides e um perfil cromatográfico satisfatório das preparações extrativas para assim podermos
comparar, qualificar e quantificar os flavonóides possíveis das três espécies de Passiflora.
De todas as fases testadas para pesquisa de flavonóides verificou-se que a maior
dificuldade foi a separação dos flavonóides C-glucosilados isovitexina e vitexina, devido à
semelhança estrutural, por serem isômeros, mudando apenas a posição da glucose no anel
aromático.
Foi observado uma separação satisfatória destes flavonóides utilizando o sistema
isocrático 4 (Quadro 1) e o sistema gradiente (4) (Tabela 4). Sendo que o sistema isocrático
permitiu quantificar o flavonóide C-glucosilado vitexina na espécie P. incarnata e o sistema
gradiente permitiu quantificar o flavonóide C-glucosilado isovitexina nas preparações extrativas das
três espécies de Passiflora. O sistema escolhido para ser validado foi o sistema gradiente (4)
(Tabela 4).
Comparação entre extrato fluido (A) (Farmacopoea Helvética, VII) de P. alata
coletada no mês de Janeiro e Agosto/2001
1
Figura 10: Cromatogramas da sobreposição do extrato fluido de P. alata (A) (em
preto) coletadas em Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em
Agosto/2001 (em vermelho). Pico 1 – isovitexina. (Sistema gradiente (4) Tabela 4).
A avaliação quantitativa de isovitexina por CLAE e UV entre os extratos
(refluxo e fluido) da planta coletada em janeiro e agosto/2001 em Ilhota SC,
mostra uma diferença significativa entre os diferentes tipos de extratos e entre as
estações do ano da coleta comprovando a influência sazonal na obtenção de
fitoterápicos (Tabela 9).
Um dos fatores que deve ser levado em conta na escolha de um processo
de extração é se o mesmo não altera a composição dos analitos de interesse.
Neste trabalho, tanto a extração por percolação quanto a extração sob refluxo e
aquecimento não alteraram a composição dos flavonóides principais de maracujá
que foram encontrados em quase todas as amostras, variando quantitativamente
de acordo com as condições de extração.
Qimin et al. (1991) afirmam que os dados sobre quantificação de
flavonóides de P. incarnata encontrados na literatura são contraditórios, isto
porque a fração flavonoídica também está sujeita a variações no seu conteúdo: a
época de colheita, parte da planta que constitui a droga, o local de cultivo e a
metodologia de análise empregada são responsáveis por estas variações.
Menguini e Mancini (1988) estudando diversos estágios de desenvolvimento de P.
incarnata, verificaram que o teor de flavonóides é maior nas folhas. A maior
concentração do flavonóide isovitexina ocorre no período que antecede a floração
até o período de floração do vegetal (setembro a março).
Em termos qualitativos o perfil cromatográfico não sofreu alterações com as
estações do ano analisadas (Figura 10).
Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata.
(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm
(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm
(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm
Amostra P. alata
CLAE* Isovitexina %
m/m
UV1 Vitexina % m/m
UV 2 Apigenina %
m/m
UV3
Hiperosídeo % m/m
Extrato B (Janeiro)
1,137 (
0,002) 0,470 (
0,001) 0,087(
0,000
5)
0,775 (
0,001)
Extrato A (Janeiro)
0,018 (
0,001) 0,256 (
0,069) 0,054 ( 0,001)
0,116 ( 0,0005)
Extrato B (Agosto)
0,018 (
0,006) 0,395(
0,0005
)
0,061
(
0,007)
0,405 (
0,001)
Extrato A (Agosto)
0,007(
0,0007)
0,204 (
0,001) 0,033
(
0,005)
0,084
(
0,0005)
* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (
desvio padrão)
Extrato A= fluido P. alata
Extrato B= refluxo
Comparação dos perfis cromatográficos de P. alata, P. incarnata e P. actinia
Foi observada separação razoável dos diferentes compostos através da
CLAE, sendo possível diferenciar os extratos das espécies de Passiflora nos dois
sistemas cromatográficos desenvolvidos (Figura 11).
Os flavonóides são considerados por alguns autores como sendo o maior
grupo de constituintes ativos presentes no gênero Passiflora (Dhawan et al.,
2001), sendo em grande parte C-glicosilados e com polaridade elevada. Essa
característica possibilita uma eficiente separação e análise por meio de CLAE em
coluna de fase reversa (MORAES, 1995).
Para escolha do melhor comprimento de onda (340 nm) foram levados em consideração os
espectros UV de padrões, das agliconas e principalmente dos flavonóides presentes nas diferentes
espécies aqui estudadas. Através do Detector de Arranjo de Fotodiodos (PDA) obteve-se os
espectros UV dos diferentes componentes dos extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata os
quais foram identificados como flavonóides, devido aos espectros característicos, com dois
máximos de absorção determinados pelo núcleo da benzopirona: um entre 240-285 nm (banda II)
e outro entre 300-400 nm (banda I). Em geral a banda II é atribuída á absorção do anel A e a
banda I devido ao anel B. Em flavonas a banda I aparece entre 304-350 nm e em flavonóis entre
352-385 nm (Zuanazzi, 2001) (Figuras 15 e 22). Porém não foi possível a identificação dos
flavonóides majoritários da espécie P. alata devido à indisponibilidade dos padrões.
Quando os cromatogramas dos extratos foram comparados e co-injetados com amostras
autênticas de flavonóides, observou-se a presença de vitexina (pico 2) somente nos extratos de P.
alata (Figura 11) e P. incarnata (Figuras 11, 19 e 20). O flavonóide isovitexina (pico 1) foi
identificado nos extratos das três espécies (Figuras 13, 16 e 19). Rehwald et al. (1994) observaram
que a isovitexina é um dos flavonóides majoritários em amostras de P. incarnata. A identificação da
isovitexina feita por meio da comparação dos tempos de retenção de picos e dos espectros UV foi
considerada pelos autores, uma forma segura de identificação de compostos quando são usados
padrões adequados.
No Sistema Gradiente (4), (Tabela 4) foram detectados a presença de 5
picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata (Figura 13), 6 picos na
tintura farmacopéica de P. actinia (Figura 16) e 11 picos no extrato comercial de
P. incarnata (Figura 19). Neste sistema cromatográfico, nenhuma das espécies
apresentou pico característico de flavonóide com tempo de retenção superior a 25
minutos (Tabela 10).
No sistema isocrático 4 (Quadro 1), foram detectados a presença de aproximadamente 5
picos correspondentes a flavonóides no extrato de P. alata, 6 picos na tintura farmacopeica de P.
actinia e 9 picos no extrato comercial de P. incarnata. A vitexina foi identificada em maior
quantidade em P. incarnata e está presente na quantidade de traços em P. alata. Já na espécie de
P. actinia pode-se observar a ausência total de vitexina (Figura 11). Neste sistema, a maior
concentração dos picos de flavonóides sai em até 10 minutos e nenhuma das espécies apresenta
pico de flavonóide com tempo de retenção superior a 15 minutos (Tabela 11).
Dessa forma, os dois sistemas permitiram identificar cada espécie e
também permitiram constatar ausência dos demais padrões de flavonóides
(orientina, swertisina e rutina) testados nas preparações extrativas das três
espécies. Há mais semelhança entre as espécies P. incarnata com P. actinia
quando comparados entre si com P. alata, conforme observado através de CCD
(Figura 9).
Tabela 10: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos
extratos de P. alata, P. actinia e P. incarnata. (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
* (n=3).
tR (min)
Flavonóide Padrão P. alata* P. actinia* P. incarnata*
Isovitexina 17,020 17,109 17,230 17,122
Orientina 11,851 - - -
Swertisina 26,069 - - -
Rutina 22,475 - - -
Tabela 11: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos de P. alata, P.
actinia e P. incarnata. Sistema isocrático 4 (Quadro 1). * (n=3).
tR (min)
Flavonóide Padrão* P. alata* P. actinia* P. incarnata*
Vitexina 13,860 13,833 - 14,081
Orientina 10,037 - - -
Swertisina 17,877 - - -
Rutina 12,416 - - -
1
tR=17,1
1 tR=17,2
1 tR=17,1
2
tR2=13,8
2
tR2=14,0
a
b
c
Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P.
actinia e c) P. incarnata. Pico 1-Isovitexina, sistema gradiente 4 (Tabela 4) e Pico
2-Vitexina. À esquerda Sistema Gradiente (4) (Tabela 4) e a direita sistema
isocrático 4 (Quadro 1).
5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE
Quando se trabalha com amostras complexas, como extratos de plantas, a separação
isocrática geralmente exibe baixa resolução das substâncias eluidas com menor tempo de
retenção e difícil detecção das substâncias eluidas com maior tempo de retenção, além da demora
para sua eluição. Neste caso a eluição por gradiente permite melhores condições de separação,
otimizando os valores de k de cada pico cromatográfico (PEREIRA, 2002).
Visto serem a maioria dos estudos sobre teor de flavonóides direcionados para P.
incarnata, não foram encontrados dados sobre os flavonóides majoritários em P. alata. Os métodos
em CLAE utilizam flavonas C-glicosiladas como padrões ou então as amostras são submetidas à
hidrólise ácida antes da análise por CLAE (SCHMIDT e ORTEGA, 1993; QUERCIA et al., 1978;
QIMIN et al., 1991). Vários autores relatam que os flavonóide C-glicosilados resistem a hidrólise
ácida (SCHMIDT e ORTEGA, 1993; PETRY et al., 1998; PEREIRA, 2002). Na análise quantitativa
das três espécies, utilizando o sistema gradiente, observou-se que o flavonóide C-glucosilado
isovitexina foi identificado em maior quantidade no extrato fluido comercial de P. incarnata (C),
seguido da tintura Farmacopéica de P. actinia (T) e em menor quantidade no extrato fluido da
espécie oficial da Farmacopéia Brasileira P. alata (A) (Tabela 12). Sendo identificado como o
composto majoritário nas espécies P. actinia e P. incarnata (Figuras 16 e 19).
Vários autores relatam a presença majoritária de isovitexina ou vitexina em amostras de P.
incarnata. Rehwald et al. (1994) analisando 4 amostras de P. incarnata através de CLAE, verificou
que os teores de isovitexina diferem entre as amostras, apesar de constatar que é o flavonóide
majoritário na espécie. Após analisar extrato metanólico em 09 amostras de P. incarnata através
de CLAE, Grice et al. (2001) demonstraram não ser a isovitexina o flavonóide majoritário nas
amostras e sim a vitexina. Já Abourashed et al. (2002), analisando extratos metanólicos através de
CLAE em 115 amostras de diferentes espécies de Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P.
actinia e P. incarnata, encontrou ausência de isovitexina em amostras de P. alata, 0,16% de
isovitexina em P. actinia, 0,42 e 0,11% em amostras de P. incarnata de diferentes locais. A
literatura demonstra dados coerentes com este trabalho, evidenciando também que os teores
diferem de acordo com a época e o local onde são coletadas as espécies. Nas comparações do
teor de isovitexina nas preparações extrativas sob refluxo e aquecimento (B) das espécies P. alata
e P. actinia, a P. alata demonstrou maior teor deste composto. A metodologia de extração sob
refluxo e aquecimento demonstrou que extraiu maior teor de flavonóide do que a metodologia
através da percolação (Tabela 12). Também deve-se considerar que as amostras de P. alata e P.
actinia foram coletadas em épocas e locais diferentes.
Outro fator muito importante na quantificação de flavonóides que deve ser levado em
consideração, é a degradação destas substâncias por fungos e bactérias (Fiura 12). Em um
estudo realizado por Schoefer et al. (2003), o fungo anaeróbio Clostridium orbiscidens demonstrou
ser capaz de converter os flavonóides quercetina, luteolina, apigenina, entre outros em ácido 3,4-
dihidrofenilacético, ácido 3-(3,4-dihidróxifenil) propiônico e ácido 3-(4-hidroxifenil) propiônico. Em
outro estudo realizado por Mamma et al. (2004) foi investigado um sistema multienzimático
produzido por Penicillium decunbens degrada rutina quebrando seu anel heterocíclico
transformando-a em quercetina.
O baixo teor de flavonóide nos extratos fluidos Farmacopéicos de P. alata (A) e P. actinia
(T), visto que estes extratos foram concentrados, em conseqüência diminuindo seu teor alcoólico e
armazenados por mais de 6 meses em geladeira, pode ser explicado por uma possível degradação
por fungos e bactérias, diminuindo o teor de flavonóides. Possivelmente o extrato fluido comercial
de P. incarnata possua conservantes ou pode ter sido submetido a uma etapa de esterilização.
quercetinaa
taxifolina alfitonina
floroglucinol
Ác. 3, 4-dihidroxifen
R= H apigenina R= OH luteolina
R= H naringenina R= OH eriodictiol
dihidrochalconas R= OH floretina
R= H 3-(4-ácido hidroxifenilpropiônico) R= OH 3-(3,4- ácido dihidroxifenilpropiônico)
Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides.
Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide Isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de
Passiflora (n=3).
(1) Metodologia segundo FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000) λ=401 nm
(2) Metodologia segundo PETRY et al. (1998) λ=397 nm
(3) Metodologia segundo FARMACOPÉIA HELVÉTICA, (1987) λ=422 nm
Amostra
CLAE*
Isovitexina % m/m
UV1
Vitexina % m/m
UV 2
Apigenina % m/m
UV3
Hiperosídeo % m/m
Extrato B P. alata
1,137 ( 0,002) 0,470 ( 0,001) 0,087( 0,0005) 0,775 ( 0,001)
Extrato A 0,018 ( 0,001) 0,256 ( 0,069) 0,054 ( 0,001)
0,116 ( 0,0005)
Extrato T 0,028 ( 0,002) 0,083 ( 0,00) 0,022 ( 0,0005) 0,025 ( 0,00)
Extrato B P. actinia
0,631 ( 0,001) 0,348 ( 0,001) 0,079 ( 0,00) 0,668 ( 0,012)
Extrato C 1,198 ( 0,009) 0,164 ( 0,00) 0,023 ( 0,003)
0,032 ( 0,0009)
* Sistema gradiente (4) (Tabela 4), os valores expressam a média de triplicata (
desvio padrão)
Extrato A= fluido P. alata Extrato B= refluxo Extrato T= tintura P. actinia Extrato C= fluido comercial P. incarnata
Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A) e Padrões: picos 1-
isovitexina, 2-vitexina, 3-orientina, 4-rutina e 5-swertisina (sistema gradiente (4),
Tabela 4)
1
tR=17,1
tR=17,0
1
2
tR=11,8 4 tR=22,4 5 tR=26,0 3
a
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
O
Glu
OH
OH O
OH
OH
orientina
OOH
OH O
OH
OH
O glu-rha
rutina
O
OH O
OH
Glu
OCH3
swertisina
Figura 14: Cromatograma do extrato fluido de P. alata (A) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
Figura 15: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina + 2-vitexina e
ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
1
1
2
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
tR=17,23
tR=17,02
1
1 tR=11,8
2
3 tR=22,4
tR=26,0
b
4 5
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
O
Glu
OH
OH O
OH
OH
orientina
OOH
OH O
OH
OH
O glu-rha
rutina
O
OH O
OH
Glu
OCH3
swertisina
Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia (T). Padrões: picos 1-
isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente
(4), Tabela 4)
Figura 17: Cromatograma da tintura de P. actinia (T) e ao lado pode ser visto o
espectro de UV de: 1- Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e
ao lado pode ser visto o espectro: 1-Isovitexina (Sistema Gradiente (4), Tabela 4).
1
1
2
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C). Padrões: pico
1-isovitexina, 2- vitexina, 3- orientina, 4- rutina e 5- swertisina (Sistema Gradiente
4, Tabela 4)
1
tR= 17,12
3 tR=11,8
tR=17,0
1
2
5 tR=26,0
c
4 tR=22,4
2
O
Glu
OH
OH O
OH
OH
orientina
O
OH O
OH
Glu
OCH3
swertisina
OOH
OH O
OH
OH
O glu-rha
rutina
OOH
OH O
OH
Glu
isovitexina
Figura 20: Cromatograma do extrato fluido de P. incarnata (C) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 2- vitexina (Quadro 1,Sistema isocrático 4).
Figura 21: Cromatograma do extrato fluido P.incarnata (C) e ao lado pode ser
visto o espectro de UV de: 1- isovitexina (Sistema Gradiente (4), tabela 4).
5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático 4, Quadro 1)
As análises realizadas através do sistema isocrático, apresentaram uma
separação satisfatória dos flavonóides vitexina e isovitexina (Figura 22),
possibilitando a quantificação da vitexina nas amostras de P. alata e P. incarnata.
1
2
tR=14,081
OH
OH
Glu
OH
O
O
Vitexina
2
1
Figura 22: Cromatograma da co-injeção dos padrões (1-isovitexina e 2-vitexina).
Ao lado espectros de UV de: 2- Vitexina (Quadro 1, Sistema isocrático 4).
Foi verificado ausência de vitexina em P. actinia e também ausência dos demais
padrões testados. Tanto nos extratos sob refluxo (B) como nos extratos sob
percolação de P. alata (A), a vitexina apareceu em baixa quantidade (traços),
ficando abaixo da menor concentração da curva utilizada para o doseamento,
sendo possível quantificá-la apenas no extrato fluido comercial de P. incarnata
(Tabela 13 e Figura 24).
Ainda existem poucos estudos sobre teores de flavonóides em P. alata
através de CLAE, sendo a maioria direcionados para P. incarnata. Tais estudos
relatam a presença de teores baixos ou ausência de vitexina em amostras de P.
alata e teores maiores em amostras de P. incarnata.
Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores de flavonóides através de CLAE
em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata
possuía o menor teor de vitexina entre as três espécies. Abourashed et al. (2002),
analisaram extratos metanólicos através de CLAE em 115 amostras de diferentes
espécies de Passiflora, entre elas as espécies P.alata, P. actinia e P. incarnata.
Estes autores encontraram ausência de vitexina em amostras de P. alata e P.
actinia e 0,06% deste composto para amostras de P. incarnata.
Quercia et al. (1978) através de um estudo em CLAE em amostras de P.
incarnata encontraram um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%
em amostras de extratos pulverizados. Grice et al. (2001) após analisarem 9
amostras de P. incarnata (extratos metanólicos) encontraram teores que variam de
16,3 a 2.301,5 µg/g de vitexina.
Segundo a Resolução número 89, de 16 de março de 2004 da ANVISA na
“Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos” a vitexina ou isovitexina são os
flavonóides marcadores da espécie P. incarnata apontada como forma de uso a
tintura ou extrato das folhas, indicando como dose diária 15 a 100 mg de
vitexina/isovitexina.
Os estudos sugerem um teor menor ou ausência de vitexina em P. alata e
P. actinia comparando-se com P. incarnata. Sendo que os teores podem variar de
acordo com o método de extração, local, época de colheita da planta e possível
degradação de flavonóide por fungos e bactérias.
Tabela 13: Teor encontrado do flavonóide C-glucosilado vitexina,
Amostra tR (min)* g de flavonóide/ %
± SD
Extrato A 13,833 Traços
Extrato B (P. alata) - Traços
Extrato T - -
Extrato B (P. actinia) - -
Extrato C 14,081 0,312 ± 0,0009
(Sistema Isocrático 4, quadro 1, n*=3). Extrato A= fluido P. alata Extrato B= refluxo Extrato T= tintura P. actinia Extrao C= fluido comercial de P. incarnata
5.6 Validação Analítica
O padrão analítico utilizado no procedimento de validação apresentou
resposta linear, cuja curva apresentou valores de R2 ≥ 0,999 com intercepto em y
próximo a zero para isovitexina (Figura 23).
Os dados de recuperação são úteis para avaliar a eficiência do método
analítico proposto, sendo desta forma importante avaliá-la em diferentes
concentrações, uma vez que esta pode variar muito em concentrações baixas.
A especificidade do método foi testada a partir dos dados obtidos no ensaio de recuperação
(Tabela 14), comparando-se o resultado do balão contendo iguais quantidades de amostra e
padrão e aquele onde foi adicionado apenas padrão, para observar o efeito do extrato sobre o
resultado do doseamento do padrão. O extrato demonstrou uma interferência negativa de 4,8%. A
relação feita com a comparação da concentração teórica adicionada com a concentração prática
adicionada, resultou em uma média de 98,67% de recuperação, mostrando que há uma pequena
variação de 1,33%. O coeficiente de variação ficou relativamente baixo, em torno de 0,01. Com isto
tornamos este método válido, pois o valor encontrado está dentro do limite que é de 2% de
variação (GREEN, 1996).
O limite de Quantificação (LQ) corresponde ao menor nível de concentração que pode ser
quantificado com precisão e exatidão aceitáveis. O valor encontrado foi de 1,29 µg/ml
apresentando uma sensibilidade satisfatória (Tabela 14).
A Figura 24 contém a curva de calibração realizada para o flavonóide vitexina o qual não foi
validado devido estar presente em P. alata na forma de traços.
Figura 23: Curva de calibração de Isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50%
a 340 nm (y= 2.11816e-008x-0.000543441)
Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340 nm (R2=
0,999619). (y=2,29831 e-008x+0,000350931).
Tabela 14: Ensaio de Recuperação do método, calculada para o extrato fluido de P. alata (A)
fortificado com isovitexina
5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais A maneira mais precisa e exata de se identificar e quantificar flavonóides em produtos
naturais é a análise por HPLC. Entretanto, quando se pensa em controle de qualidade, é
conveniente a introdução de alternativas mais simples e baratas, pois nesses casos requerem-se
procedimentos que permitem a análise rápida de numerosas amostras, em laboratórios geralmente
modestos no que se refere ao instrumental instalado e utilizado por analistas na maioria das vezes
sem formação superior. Uma das técnicas que se enquadram bem nesse contexto é a
determinação de flavonóides totais por espectrometria no UV (MARCUCCI, 1995).
O uso do cloreto de alumínio para a determinação da quantidade de flavonóides totais não
é, no entanto, um procedimento isento de limitações. O método é preciso, isto é, ele é
reproduzível, fornecendo desvios pequenos entre um ensaio e outro com a mesma amostra. No
entanto ele pode ser pouco exato, ou seja, o valor que ele fornece pode ser diferente (geralmente
inferior) em relação à quantidade de flavonóides totais realmente presente na amostra analisada
(MARCUCCI, 1995).
Neste trabalho foram realizadas análises do teor de flavonóide total em P. alata
comparando com as outras duas espécies: P. actinia e P. incarnata, através de três métodos de
doseamentos em UV. Destes, dois utilizam solução de cloreto de alumínio e um utiliza solução
oxálico bórica na complexação dos flavonóides. Além de mensurarmos os flavonóides totais
diretamente nas folhas (B), foram também mensurados nos extratos fluidos de P. alata (A), P.
incarnata (C) e na tintura de P. actinia (T).
BalãoVolumeAmostra
(mL)
VolumePadrão
(µL)
Conc.Teóricoadicion.(µg/mL)
Conc.TeóricoTotal
(µg/mL)
Conc.PráticoTotal
(µg/mL)
Conc.Práticoadicion.(µg/mL)
Coef. de
variação
Desviopadrãorelativo
%
1 3 625 5 10 10,34 4,96 0,020 0,4 99,20
2 3 750 7 12 12,31 6,93 0,0133 0,2 99,0
3 3 1,12 10 15 15,16 9,78 0,0156 0,15 97,80
4 3 - - 5 5,38 - 0,0155 - -
5 - 625 5 5 5,21 5,21 0,0133 - -
Média 98,67
Na metodologia de doseamento de flavonóides totais (λ = 397 nm) baseada na
proposta de Petry et al. (1998) não foram removidos os interferentes lipofílicos.
Segundo o autor, o efeito da interferência lipofílica é avaliado em função do teor
alcoólico do líquido extrator, comparando-se os teores de flavonóides totais de
soluções extrativas com teores alcoólicos crescentes. Foi evidenciado uma
relação direta com a proporção de etanol no líquido extrator e, conseqüentemente,
uma interferência crescente da fração lipofílica extraída. Soluções extrativas
preparadas com etanol a 20 e 40% praticamente não diferiram no seu teor de
flavonóides totais, após o tratamento em coluna de extração sólida.
Os resultados obtidos segundo esta metodologia (Petry et al., 1998) (apesar
de serem utilizadas as amostras numa concentração maior (1:20) do que a do
método descrito) mostraram valores abaixo do referenciado (0,55 g% de
flavonóide em termos de apigenina). Na comparação do teor de flavonóides totais
dos extratos neste método, o extrato de P. alata (A) (janeiro/2001) e extrato de P.
incarnata (C) apresentaram o maior teor, seguido do extrato de P. actinia (T). No
doseamento das folhas a P. actinia apresentou o maior teor em comparação com
P. incarnata. É evidente também que a extração de flavonóides das folhas sob
refluxo e aquecimento é maior do que a extração por percolação, mesmo que na
extração por percolação tenha sido utilizado um grau alcoólico maior, em torno de
60% (Tabela 12).
A metodologia da Farmacopéia Helvética (1987) que doseia os flavonóides
totais (λ = 422 nm) em termos de hiperosídeo (O-glicosilado) (ver Figura 7, pág 40
e Tabela 12, pág 55) é um dos métodos de quantificação do teor de flavonóides
totais mais freqüentemente utilizado (DEUTSCHES, 1992). O método é geral e
preconizado para P. incarnata e outras espécies vegetais ricas em flavonóides.
Contudo, diversos autores assinalam para o mesmo diversas fontes de erro
analítico, decorrentes do método ter sido desenvolvido, de forma específica, para
análise de flavonóides O-glicosilados, mas não para flavonóides C-glicosilados,
que resistem a hidrólise ácida (SCHMIDT e ORTEGA, 1993). Além de tudo, o
método apresenta uma metodologia complexa, a amostra é extraída sob refluxo e
aquecimento utilizando como líquido extrator acetona e ácido, na seqüência é
ainda submetida a uma extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila e a
fração aquosa, onde estão presente os flavonóides encontrados freqüentemente
em Passiflora, é desprezada utilizando-se como solução exame a fração acetato
de etila complexada com cloreto de alumínio.
Nesta metodologia, envolvendo diversas etapas, os resultados obtidos das
folhas das espécies de P. alata e P. actinia foram coerentes com o referenciado
pelo método (mínimo 0,3% de flavonóide em termos de hiperosídeo para P.
incarnata). As folhas e o extrato fluido de P. alata (janeiro/2001) possuem maior
teor de flavonóides totais analisadas de acordo com esta metodologia.
Segundo a metodologia da Farmacopéia Britânica, (2000); onde o líquido
extrator é etanol 60%, a amostra não é submetida a hidrólise ácida. A metodologia
propõe o uso do reagente oxalo-bórico no lugar do cloreto de alumínio para a
formação do complexo a ser analisado por espectrofotometria. De acordo com a
literatura (Glasl, 1985), este tipo de complexação é mais específica para flavonas,
sendo portanto sujeito a menos erros analíticos. Os resultados obtidos foram
inferiores ao referenciado pelo método (1,5% de flavonóides totais em termos de
vitexina para P. incarnata). Comparando-se com as outras duas metodologias
testadas, a metodologia da Farmacopéia Britânica (2000) foi a que apresentou
teores maiores para os extratos de P. alata (A), P. incarnata (C) e P. actinia (T)
(Tabela 12).
As três metodologias analisadas para teor de Flavonóides totais em
espectrofotométricos de UV apresentam em comum: a) teores maiores para
amostras de P. alata coletadas em janeiro do que as coletadas em agosto; b)
teores maiores para amostras de extratos sob refluxo e aquecimento do que
extratos fluidos e c) teor maior para o extrato fluido de P. alata do que para extrato
fluido de P. incarnata e tintura de P. actinia (Tabela 12).
Na comparação dos métodos farmacopéicos com a metodologia
desenvolvida em CLAE observa-se divergências nos resultados. A quantificação
por CLAE apresenta vantagem da separação prévia dos compostos e
possibilidade de quantificação isolada de alguma substância de interesse frente
aos métodos espectrofotométricos. Rehwald et al. (1994) em seu estudo também
desenvolveram método em CLAE para qualificar e quantificar flavonóides em P.
incarnata e compararam os resultados com teor de flavonóides totais segundo a
metodologia espectrofotométrica da FARMACOPÉIA HELVETICA (1987). Neste
último a maioria dos resultados apresentou teores totais inferiores ao teor de um
único flavonóide analisado em CLAE. As quatro edições da Farmacopéia
Brasileira incluem monografias das folhas de P. alata sem no entanto, preconizar
um método analítico quantitativo para avaliação fidedigna da qualidade da droga.
Estes dados demonstram que há uma necessidade de reavaliação nos
métodos farmacopéicos para doseamentos de flavonóides totais.
5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE Sistemas utilizados na pesquisa de alcalóides β-carbolínicos em CLAE Para desenvolver o método de separação dos padrões de alcalóides,
foram realizadas várias análises, utilizando sistema gradiente e como fase móvel
metanol-acetonitrila-tampão fosfato pH 8,0 com diferentes concentrações,
segundo descrito na Tabela 05.
As análises em CLAE foram monitorados por UV nos comprimentos de
onda de 240, 255 e 370 nm, sendo que os cromatogramas demonstrados
aparecem apenas no comprimento de onda de 240 nm, que foi o de maior
absorção.
Na Figura 25, percebe-se quatro picos característicos de alcalóides, pico 1
do alcalóide harmalol, pico 2 do harmol, pico 3 do harmalina e pico 4 uma mistura
de harmana e harmina. A fase utilizada nesta análise foi baseada na metodologia
descrita por Rehwald, Sticher e Meyer (1995), que utililizou como fase móvel
tampão fosfato em pH 8,0 e metanol-acetonitrila, na proporção 1:1, no
desenvolvimento das suas análises.
A estrutura básica dos padrões harmana (8) e harmina (12) são iguais,
diferenciando-se apenas por uma ligação de um radical –OCH3, na estrutura do
padrão harmina. Provavelmente esta semelhança leva a retenção dos padrões
no mesmo tempo.
(8) (12)
Na tentativa de separação dos alcalóides harmana e harmina, foram feitas
alterações nos gradientes de concentração da fase móvel utilizada anteriormente,
aumentando a concentração de metanol e diminuindo a de acetonitrila. Como
pode-se perceber na Figura 26, houve um adiantamento nos tempos de retenção
dos padrões, não havendo a separação dos padrões harmana e harmina.
A separação dos padrões harmana e harmina foi realizada após uma
pequena modificação nas concentrações de metanol e acetonitrila (metanol 32% e
acetonitrila 12%), (Tabela 5) como pode ser observado na Figura 27, que
apresenta os tempos de retenções para cada padrão, sendo o do harmolol 6,6
min, harmol 11,4 min, harmalina 16,5 min, harmana 18,4 min e harmina 19,1min. A
Figura 28 apresenta os espectros em UV de cada padrão.
NN
CH3H
harmana
NN
CH3H
OCH3
harmina
Figura 25: Cromatograma desenvolvido em CLAE, da mistura dos padrões ß-
carbolínicos, pico 1= harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4=
harmana + harmina. Fase móvel metanol 22% , acetonitrila 22% e tampão fosfato
56% pH 8,0.
Figura 26: Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=
harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina e pico 4= harmana + harmina.
Fase móvel (Tabela 6)
1 2 3
4
1 2
3
4
Figura 27: Cromatograma, da mistura dos padrões ß-carbolínicos, pico 1=
harmalol, pico 2= harmol, pico 3= harmalina, pico 4= harmana e pico 5=
harmina. Fase móvel (Tabela 5).
1 2
3 4
5
A B
C D
E
NN
CH3H
OH
harmalol
NN
CH3H
OH
harmol
NN
CH3H
OCH3
harmalina
NN
CH3H
harmana
NN
CH3H
OCH3
harmina
Figura 28: Espectros em UV dos padrões de alcalóides. A= harmalol, B= harmol, C=
harmalina, D= harmana e E= harmina.
O extrato fluido de P. alata (A), foi analisado segundo metodologia descrita
na Tabela 5. Comparando-se o cromatograma do extrato com o cromatograma
dos padrões, percebe-se que não há picos caracteristícos de alcalóides, não
coincidindo os tempos de retenção. O cromatograma demonstra apenas um pico,
sendo que este apresenta retenção antes de 6 min, e os padrões começam a
serem detectados a partir deste tempo (Figura 29).
Figura 29: Comparação do cromatograma do extrato P. alata (A) e dos padrões
(B), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel
metanol 32%, acetonitrila 12% e tampão fosfato (pH 8,0) 56%.
A
B
1 2
4 3
5
Os extratos a quente (III) e a frio (IV) segundo item 4.3.4, pág 27, também foram
analisados segundo método descrito na Tabela 5. Observando os cromatogramas dos extratos
com o dos padrões, percebe-se que não há picos definidos, além da linha de base estar alterada e
quando observado o perfil dos espectros dos extratos comparado com o dos padrões nota-se que
não há semelhança (Figura 30).
Figura 30: Comparação do cromatograma extrato a quente (III) (A), extrato a frio (IV) (B) e padrões
(C), 1= harmalol, 2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel (Tabela 5)
C
A B
1 2
3 4
5
Visto que as análises dos extratos anteriores não apresentaram
resultados positivos para presença de alcalóides, foram desenvolvidos
novos extratos, segundo o método de extração clássica para alcalóides
ácido/base, denominamos extrato I e extrato II (descritos nos itens 4.3.4, pág
26 e 27), o último é mais purificado. As análises foram realizadas em sistema
gradiente, com fase móvel descrita na Tabela 5. Comparando os
cromatogramas do extrato I, extrato II e dos padrões, percebe-se que os
cromatogramas dos extratos são semelhantes, apresentando picos mais
definidos, se comparado ao dos cromatogramas anteriores. Quando
comparados com o cromatograma dos padrões, verifica-se que não há
semelhança nos tempos de retenções e o perfil dos espectros não é
caracteristico. (Figura 31).
A literatura relata que, o gênero Passiflora é composto principalmente
por alcalóides e flavonóides. A investigação dos compostos alcaloídicos
presentes na planta, é em função de que esses alcalóides foram associados
à atividade farmacológica de muitas plantas medicinais que atuam sobre o
sistema nervoso central (PEREIRA; VILEGAS, 2000; REHWALD; STICHER;
MEIER, 1995). Atualmente Dharwan, Kumar e Sharma (2001), relatam que
ainda não está claramente descrito qual constituinte, ou grupo de
constituintes, é responsável elos efeitos sedativos e traquilizantes do
gênero.
Os primeiros estudos relatados na literatura (Bennati, 1971) que detectaram
alcalóides no gênero Passiflora utilizaram métodos mais antigos (CCD) e não
muito precisos. Grice et al. (2001) desenvolveram um único método em CLAE
para análise simultânea de flavonóides C-glicosilados e alcalóides β-carbolínicos
(harmano, harmina e harmol) em 9 amostras de P. incarnata. Os resultados
obtidos mostraram ausência de harmol em todas as amostras, traços de harmana
em 6 amostras, ausência de harmine em 2 amostras e presença nas demais em
pequenas quantidades. As contradições de informações levam a crer que os
alcalóides não são de fato os compostos predominantes no gênero Passiflora e
provavelmente não estão envolvidos com a atividade farmacológica observada.
Figura 31: Comparação do cromatograma do extrato I (A), extrato II (B), padrões (C), 1= harmalol,
2= harmol, 3= harmalina, 4= harmana, 5= harmina. Fase móvel (Tabela 5)
C
A B
1 2
3 4
5
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