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BfBLIOTEC A INSTITUTO DE OUIMICA Universidade de São Pa11l1
:k_ ·. l~ _bJ\ -
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Instituto de Química
Estudo do metabolismo secundário em Piper crassinervium
(Piperaceae)
Tese de Doutorado
Ana Paula Danelutte
Orientador: Massuo Jorge Kato
São Paulo 16/05/2001
DEDALUS - Acervo - CQ
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U N IV ERS ID A,:>~. ~ E ,.G;t-·~ .::·;U L :) ..., .. -, .,,,.
Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e
/Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Danelutte, Ana Paula D l 79e Estudo do metabolismo secundário em Piper crass inervium
(Piperaceae) / Ana Paula Danelutte . -- São Paulo , 2001. l l 7p.
Tese (doutorado) - Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Departamento de Química Fundamental.
Orientador: Kato, Massuo Jorge
1. Produtos naturais : Química orgânica 2. Cé lula : Cultura : Plantas. I. T. II. Kato, Massuo Jorge, orientador.
547 .7 CDD
"Bst1tdo do M•t•Oolis11to S•e1t11dá1io •11t
Plp11, e,n11/1111,11l11Nt (Pip•tt;te•tuJ"
ANA PAULA MNE.ltmE.
Tese de Doutorado submetida ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor , em Ciências - Area: Química Orgânica
Aprovado por:
Prof. Dr. MASSlJO JORGE KATO IQ • USP
( Orientado r e Presidente)
Prof. Dr. ETELVINO JOSE HENRIQUES BECHARA IQ • USP
Prof. Dr. JONAS G RUBER IQ • USP
Profa. Ora . M ARIA CLAUDIA MARX YOUNG IQ • UNIC AMP
Prof. Dr. ALBERTO JOSE C AVALHEIRO IQ - Unesp - Araraquara
SÃO PAULO 16 DE MAIO 2001 .
"Tente ser uma pessoa de sucesso, mas efetivamente
tente ser uma pessoa de valor. "
Albert Einstein
Dedico esta tese aos meus pais, Armando e Célia, agradecendo todo apoio, incentivo e amor em
todos os momentos da minha vida.
Ao Eduardo, meu irmão, por ser meu grande amigo.
Existem pessoas que cruzam nossos caminhos nas horas mais oportunas, trazendo muita alegria, e em seguida,
começam a fazer parte desta trajetória. Alexandre, obrigada pelo amor e dedicação.
Agradecimentos
Ao Prof. Massuo J. Kato, pela oportunidade de fazer parte de seu grupo de
pesquisa.
À amiga Patrícia Sartorelli, pela ajuda, dedicação e amizade durante estes 12
anos.
Ao Leandro R. Latorre, por sua atenção e amizade.
À Mara B. Costantin e Roberto C. C. Martins, pela ajuda durante o trabalho
experimental.
À Isabel C. Moreira, por me alojar durante vários meses, em sua casa, e por ser
tão gentil.
À minha tia Nair, pelas caronas nas minhas idas à USP.
Ao André, meu irmão, e à Roberta, minha cunhada, por estarem tão próximos
em momentos especiais.
Ao Prof. Raimundo B. Filho e Marcelo J. P. Ferreira, pela valiosa ajuda na
elucidação estrutural.
Ao Prof. Paulo R. H. Moreno, por suas dicas e observações durante o trabalho
experimental.
À Alessandra, pela dica no espectro de IV.
Aos alunos do laboratório do Prof. Pio Colepicolo, pelo empréstimo dos
equipamentos e ajuda no trabalho experimental.
À amiga Mariluci, pela ajuda prestada.
Aos amigos do laboratório de Produtos Naturais, Paulo Benevides, Angélica,
Ana Paula, Melânia, Serginho, Sérgio Galdino, Karine e Zezinho pelo convívio
agradável durante todo tempo.
Aos funcionários da central analítica pela obtenção dos espectros.
Ao CNPq pela bolsa de estudo concedida.
Conteúdo
Abreviaturas .................... ... ... ... ................ ... ...... ...... .. ...... .... .. ................ .. .. ......... ...... ..... ix
Resumo .................. ... ........................................ .. ... ..... .. .............. ... ........... ................... x
Abstract ................................................ ............... ................... ..... .... .. ....................... .... xi
Lista de Figuras .. ............................................ ... ..... ....... ......... ..... ....... ........ .................. xii
Lista de Ta belas ..... ..... .... ............... .. ...... .... ....... ........... ................... ....... ... ... ................ xv
······························· ····················································t ······················ ··· ·······················
1. Introdução ........ ........ .. .. ...................... ...... .... ....... :·: ...... ............. ........ .. ................... 01
1.1 A Família Piperaceae .... .... ..... .............. ........... ...... .......... ....... ................................. 06
1.2 Piper crassinervium ............................. ...... .... ........ : ..................... ... ... ..... ........ .. ....... 13
2. Objetivos .......... ........ ..... ...... .. ... ................................................. ..... ........ ................. 14
3. Materiais e Métodos .... ....... ................ .. .. ......... ... ... .... .. .. .. ..... .. ....... .......................... 15
3.1 Material vegetal. ... .. .. ... ..... ... ............ ..... ... ... .... .. ... .. ... ..... ............ ... .. ........... .. ... ... ...... 15 .
3.2 Obtenção de plântulas axênicas, calos e suspensões celulares de ·
Piper crassinervium ..................... ..... .. .. ........................................................... ........ 15
3.2.1 Micropropagação de P. crassinervium .... .. ......... ............................................... 15
3.2.2 Indução de calos .... ... ...... ....... .................................... ........... ............................ 16
3.2.3 Suspensões celulares .................... .. .... .... ........ ............. .......... .......................... 16
3. 3 Obtenção dos extratos de folhas e culturas de células de Piper crassinervium ...... . 18
3.3.1 Extratos de folhas de P. crassinervium ............................................................. 18
3.3.2 Extratos do meio BC-1 e das células provenientes das suspensões celulares
de P. crassinerivium .. ...... .... .................................................. .. ......................... . 18
3.4 Análise dos extratos de folhas e de cultura de células de
Piper crassinervium .. ........................ ......... ...................... .. .... .... .............. ... ............ 19
3.4.1 Cromatografia planar e cromatografia em coluna .......... ............. .... ... .......... .... .. 19
3.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .................. ............. .. ............... 19
3.4.3 Fracionamento do extrato de folhas de P. crassinervium ....... .. ......................... 20
3.4.4 Fracionamento do extrato de células de P. crassinervium ... .... ... .. ....... .. ......... ... 24
3.5 Estudo do óleo volátil de folhas de Piper crassinervium .......................................... 25
3.5.1 Material vegetal ...... ............ ......... ....... .... .. .. ............. .... .. .... ...... .... ... .......... ........ . 25
3.5.2 Isolamento dos compostos voláteis ..... ............. ..... .. ... ... .... .... .................. ..... ..... 25
3.5.3 Condições de análise do óleo volátil. ...... ........................... ................................ 25
3.6 Extração de proteínas para doseamento da fenilalanina amônia-liase (PAL)
e chalcona sintase (CHS) .............. ...... .. ... .. ....... ....... .. ..... .. ....... ...... .................. ... .. 26
3.6.1 Protocolo para extração da enzima PAL ... ... .... ..... ..... ... ........ ... ..... .... .... ......... ... 26
3.6.2 Ensaio da atividade da PAL ...... ...... ........ .... ... ..... .... ... ..... .. .... .... .. ...................... 26
3.6.3 Análise por CLAE ... .. .. ...... ............................................ ..... .... ... ........ ... .............. 26
3.6.4 Doseamento de proteínas totais ... .... ... ........ .. .......... ..... .... ... .............................. 27
3.6.5 Ensaio para extração enzimática da chalcona sintase (CHS) ............................ 27
3.6.6 Ensaio da atividade da CHS .... ... ........ .. .. ..... .. .. ......... ... ........... ... ........................ 28
3.6.7 Análise por CLAE ...... ... .... ......... .. .. .. .... .............................................................. 28
3. 7 Preparação dos precursores para o ensaio de doseamento da chalcona sintase .... 29
3. 7.1 Preparação do ácido p-cumárico .. .... .......... ......... ....... .. .............. ... .... ... ..... ........ 29
3. 7.2 Preparação do éster succinimídico do ácido p-cumárico ....... .. .............. ... .. ....... 30
3.7.3 Preparação do 4-hidroxi-cinamoil-CoA (p-cumaroil-CoA) ... .... ............. ......... .. .. . 30
3.8 Caracterização das culturas de Piper crassineNium ............. ..... .. ........................... 31
3.8.1 Determinação do peso fresco ... .. .... ... ............. .. ............ .. .. .......... .. .... ..... .......... .. 31
3.8.2 Determinação do peso seco ............... .... ..... ...... ...... ..... ..................................... 31
3.8.3 Determinação do pH do meio de cultura ............................................................ 31
3.8.4 Determinação da atividade específica da PAL ..... .............. ....... .... ............ .... .... 31
3.8.5 Quantificação das substâncias presentes no extrato de células de
P. crassineNium .............................. ............. .... ..... ..... .. ... ........ .......... .... .. ... ...... 32
3.8.6 Quantificação das substâncias presentes no extrato do meio celular .......... ...... 32
3.8.7 Experimentos de eliciação com cultura de células de P. crassineNium ............. 32
A) Experimento com fenilalanina ...... ....... .... ........ .. ....... ......... .......... .... ......... ...... .. ~. 34
8) Experimento com luz UV .... ................ ...... .. ..... ... .. ....... ........... ........ ......... ..... .. ... 34
C) Experimento com extrato de levedura ...... .. .. .... ... ...... .............. .................... .... .. 34
3. 9 Avaliação da atividade antifúngica dos extratos e das substâncias isoladas
dos diferentes tecidos de Piper crassineNium ............ .. .. .. ...... ... ....................... .. .... 35
3.9.1 Bioautografia dos extratos e das substâncias isoladas de P. crassineNium .. .... 35
3.1 O Dados espectroscópicos das substâncias isoladas de Piper crassineNium .. ....... .. 36
3.11 Substâncias isoladas de. folhas e da cultura de células de
Pi per crassinervium.................................................................. ................... ... ...... 36
4. Resultados e Discussão................... .... .................. ................................................ 39
4.1 Substâncias isoladas do extrato de folhas de Piper crassinervium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2 Identificação das substâncias isoladas do extrato de folhas de
Piper crassinervium.............................. ............................................. ...................... 41
4.2.1 Flavanonas (1 e 2).......... .. . . . . . . .. . . . . . ... . . . .. . . . . . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . . .. . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2.2 Hidroquinonas preniladas (3 e 4)................................ ... .................................... 45
4.2.3 Hidroquinona prenilada (5) .. . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . .. . . . . .. .. . ... .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . 49
4.3 Substâncias identificadas no óleo volátil de Piper crassinervium........ ....... ........... ... 68
4.3.1 Análise qualitativa e quantitativa................... ...... .. ......... ........ ............ .. ............. 68
4.3.2 Estrutura química dos constituintes identificados no óleo volátil de
P. crassinervium ............................................... , ................. ....... ... .... ................ 71
4.4 Estudo de etapas biossintéticas.......... .. .............................. .. .................... ..... ......... 73
4.4.1 Doseamento da PAL em folhas intactas e plantas propagadas de
P. crassinervium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.4.2 Doseamento das chalcona sintase em folhas de P. crassinervium............. ..... .. 75
4.5 Caracterização da curva de crescimento para culturas de células de
Piper crassinervium......... .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . . 78
4.5.1 Densidade do inóculo .......... .............................. ... ......... ........... .. .... ........ ..... ...... 78
4.5.2 Determinação do peso fresco e seco em suspensões celulares de
P. crassinervium . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.5.3 Determinação dos valores de pH do meio de cultura.. .... ......... .. ....... .... ............. 80
4.5.4 Determinação da atividade específica da PAL em células de
P. crassinervium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 81
4.6 Cultura de células de Piper crassinervium.. ... ...... ............................. ....................... 83
4.6.1 Substâncias isoladas do extrato de células .... ...... ... ...... .. ................. .. ............... 83
4.6.2 Identificação das substâncias isoladas do extrato de células provenientes
das suspensões celulares de P. crassinervium ................................................. 84
4. 7 Quantificação das substâncias isoladas do extrato de células...... ........................... 99
4.8 Experimentos com fenilalanina, luz UV e extrato de levedura .................. .. ........ .. ... 102
4.9 Bioautografia ....... ..... .. ........ ... ... .... .. ......................... ... ...... ... ................................ .. .. 107
5. Conclusões ........ ...... ..... ...... .. ........... .... .... ..... ............. ... .. .... ..... .... ......... ........ .... ... ... 110
6. Referências Bibliográficas ... ............ .. ............... .. ............... ....... ........ .... ... .... .... ...... 112
Abreviaturas
AIA - ácido indolacético
AG3 - ácido giberélico
ANA - ácido naftalenoacético
BAP - 6-benzilamino purina
CC - cromatografia em coluna
CHS - chalcona sintase
CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência
CPC - cromatografia planar comparativa
CPP - cromatografia planar preparativa
CoA - coenzima A
d-dubleto
dd - duplo dubleto
EDTA - ácido etilenodiaminotetraacético
EtOAc- acetato de etila
m - multipleto
PAL - fenilalanina
PVPP - polivinilpolipirrolidona
s - singleto
t-tripleto
Resumo
Este trabalho descreve o estudo do metabolismo secundário em folhas
diferenciadas e em suspensões celulares de Píper crassínervíum (Piperaceae). Este
estudo foi monitorado pela análise do extrato de folhas por CLAE, assim como pela
comparação entre os diferentes tecidos desta espécie (folhas, caule e raízes). Do extrato
das folhas foram isoladas duas flavanonas, duas hidroquinonas preniladas e uma
hidroquinona com um endoperóxido na cadeia lateral. A análise do óleo volátil das folhas
através de CG e CG-EM, revelou a presença de trinta e seis componentes, sendo
majoritários o germacreno-D (10,05%) seguido por J3 -cariofileno (9,91 %) e 6-metil-5-
hepten-2-ona (7,47%). Todas as substâncias isoladas foram submetidas ao ensaio
antifúngico bioautográfico contra C/adosporium sphaerospermun, sendo que as
flavanonas, as duas hidroquinonas e o óleo volátil mostraram-se ativos. As suspensões
celulares foram desenvolvidas a partir de calos, iniciados a partir de ápices, em meio 85
modificado, contendo ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilamino purina (BAP) como
reguladores de crescimento. As células não produziram flavonóides, mas alcalóides do
tipo aristolactamas, que são parcialmente excretados para o meio de cultura. A curva de
crescimento estabelecida para as células foi analisada quanto à atividade específica da
fenilalanina amônia-liase (PAL), à variação do pH e o acúmulo dos alcalóides. Alguns
experimentos de eliciação demonstraram respostas positivas face ao uso de luz UV,
adição de L-fenilalanina e uso de extratos de levedura.
Abstract
The present work studies the secondary metabolism in leaves of Piper
crassinervium (Piperaceae) and in its cell suspension culture as well. The profile of
secondary compounds in differenciatted and undifferenciated tissues were evaluated by
HPLC. The aerial parts of Piper crassinervium yielded two flavanones and three prenylated
hydroquinones, one having an endoperoxide group in the side chain. The analysis of the
volatile oil of Piper crassinervium by GC-MS allowed the identification of 36 compounds,
germacrene-D (10,05%), f3-cariofilene (9,91%) and 6-methyl-5-heptene-2-one (7,47%)
being detected as the major ones. AII isolated substances were evaluated using a
bioautography technique against the fungus C/adosporium sphaerospermun. The isolated
flavanones, two hydroquinones and the essential oil were found to be active against the
fungus. The cell suspensions had their growth curve established on basis of the dry weight
and pH variations. The cells were showed to accumulate several aristolactams alkaloids
instead. Determinations of these alkaloids by HLPC indicated that the cells excreted them
partially to the culture media. Determinations of specific activity of PAL and concentration
of alkaloids during the growth cycle were further performed. Additional experiments
revealed that UV light and the addition of either phenylalanine or yeast extract cause
elicitation response with increased production of alkaloids.
Lista de Figuras
Figura 1: Estrutura do cloreto de tubocurarina ............................................................. 01
Figura 2: Exemplos de produtos naturais utilizados industrialmente .......................... .... 04
Figura 3: Algumas espécies dos gêneros Piper e Peperomia .. ................... .. ........ .... ..... 07
Figura 4: Estrutura da amida piperina ...... ....... ..... .......... ............................................... 07
Figura 5: Estruturas de kavapironas isoladas de Pi per methysticum .... ...... ..... ...... ... ..... 08
Figura 6: Estrutura do ácido aristolóquico .. .. ........................... ............................... .. .. ... 09
Figura 7: Estruturas químicas das flavanonas isoladas de espécies de Piper ...... .. ....... 12
Figura 8: Espécie de P. crassineNium cultivada no Instituto de Química - USP ..... ....... 13
Figura 9: Etapas principais para obtenção de plantas propagadas cultivadas in vitro e
suspensões celulares de P. crassineNium .............. ...................................... 17
Figura 1 O: Suspensão celular de P. crassineNium .. .... ............ ............... ........ .... ........... 18
Figura 11: Fracionamento do extrato de folhas de P. crassíneNíum ... ......... .. ......... ... ... 23
Figura 12: Fracionamento do extrato de células proveniente das
suspensões celulares de P. crassíneNium ........... ...................................... 24
Figura 13: Cromatograma obtido por CLAE (sistema S7) do extrato de folhas de
P. crassineNium ...... .. .. ....................................................... ........ ...... ........... 40
Figura 14: Estrutura de uma flava nona ..................... ............................ ................. .. .... .41
Figura 15: Estrutura das substâncias 3 e 4 ..... .. ....... .......... ........................................... 45
Figura 16: Estrutura da substância 5 ... ... ...... ....... .... .............. .. ........... ......... ........ ..... .. ... 49
Figura 17: Exemplos de hidroquinonas alergênicas de espécies de Phacelía ....... ........ 51
Figura 18: Alguns exemplos de hidroquinonas isoladas de Aplidium californicum .. .. ..... 52
Figura 19: Estrutura das hidroquinonas isoladas de /. spinosula .. ......... .. .... .................. 53
Figura 20: Espectro de RMN-1 H de 1 ... .... ........ ............ ...... ........................ .. .. ........... ... 54
Figura 21: Espectro de RMN-13C de 1 ... ...... ... .. .. .. ...... .............. ............... ...................... 55
Figura 22: Espectro de massas de 1 ......... .......... .... ..... ................................ .. ... ........... 56
Figura 23: Espectro de RMN-1 H de 2 .... ........... .................... ....... .... ............. ....... ... ... ... 57
Figura 24: Espectro de massas de 2 ........ .. ........ ........... ........... .................................... . 58
Figura 25: Espectro de RMN-1 H de 3 ............. .. ................. ........... .......... ... .. .. ... ........... 59
Figura 26: Espectro de RMN-13C de 3 ......... ............. ............. ... .. ....................... ... ......... 60
Figura 27: Espectro de massas 3 .... ... .. .... ....... .... .. ... ... .... .... .......... ........ ... .... ..... .... ........ 61
Figura 28: Espectro de RMN-1 H de 4 ........... ..... .......... ............ .... ... ... .. ..... ............ .. ....... 62
Figura 29: Espectro de RMN-13C de 4 ..... .......... ............ ... .. ... ... ....................... .. ............ 63
Figura 30: Espectro de massas de 4 ................................................ .. ...... ......... ... ......... 64
Figura 31: Espectro de RMN-1H de 5 ................ ......... ................................................... 65
Figura 32: Espectro de RMN-13C de 5 ......... ....... ........ ... ......... ..... ................... .......... ... .. 66
Figura 33: Espectro de massas de 5 .............. ... .. ....... ...................... ........ .... .......... ....... 67
Figura 34: Reação de desaminação da fenilalanina catalisada pela enzima PAL ......... . 74
Figura 35: Biossíntese do flavonóide naringenina, segundo Heller (1988) .. ... ................ 76
Figura 36: Curva de crescimento de suspensões celulares de P. crassinervium ... .. ..... 79
Figura 37: Variação do pH em função do crescimento celular ....................................... 81
Figura 38: Atividade específica da PAL e quantidade de proteínas totais
em função do crescimento celular ......... .. ................ ... ................................. 82
Figura 39: Cromatograma obtido por CLAE (sistema S7) do extrato de células
proveniente das suspensões celulares de P. crassinervium ..................... .... 84
Figura 40: Esqueleto das aristolactamas isoladas ...... .......... .. .... ...... ... .......................... 84
Figura 41: Espectro de RMN-1H de 6 .... ........ .. .. ................... ....... ......... .................. .... .. 91
Figura 42: Espectro de RMN-1 H de 7 ............... ................................. ....... ... .................. 92
Figura 43: Espectro de RMN-13C de 7 ............ .................................. .... .... ................... .. 93
Figura 44: Espectro de massas de 7 ....... ..... ................. .................... .............. ....... .... ... 94
Figura 45: Espectro de RMN-1 H de 8 ............... ............ ............. ......... ........................... 95
Figura 46: Espectro de massas de 8 .................. .. ......... ....... ... .................... ....... .. ......... 96
Figura 47: Espectro de RMN-1H de 9 ......... ....... ......... ... ........ ........ ..... .... .. .. .... ....... ... .. ... 97
Figura 48: Espectro de massas de 9 .... .... ...... ................ ...... .... .... .. ..... ... .... ............ ... .... 98
Figura 49: Estrutura do ácido aristolóquico ................................................................. .. 89
Figura 50: Formação de aristolactamas a partir de alcalóides dioxoaporfínicos
in vitro ....................................................... ...... ........... ................... .. ..... .... .... 89
Figura 51: Proposta de biossíntese para as aristolactamas isoladas ............................. 90
Figura 52: Quantificação dos alcalóides 6 e 7 nas células ..... ....... ..... .. ..................... .... 100
Figura 53: Quantificação dos alcalóides 6 e 7 no meio .......... ..... ....... .. .......... ......... ....... 100
Figura 54: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com fenilalanina (células) .... ... 103
Figura 55: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com fenilalanina (meio) .......... 103
Figura 56: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com luz UV (células) .............. 103
Figura 57: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com luz UV (meio) ............... .. . 103
Figura 58: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com levedura (células) .. .. ..... .. 103
Figura 59: Quantificação do alcalóide 6 no experimento com levedura (meio) .. ............ 103
Figura 60: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com fenilalanina (células) ... .... 104
Figura 61: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com fenilalanina (meio) ......... . 104
Figura 62: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com luz UV (células) ... ..... .. .... 104
Figura 63: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com luz UV (meio) ...... ............ 104
Figura 64: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com levedura (células) .......... . 104
Figura 65: Quantificação do alcalóide 7 no experimento com levedura (meio) ....... ....... 104
Figura 66: Cromatoplaca das substâncias puras e frações do extrato de folhas
de P. crassinervium ....... .... .. ..... ... ........... ...... ........ ... .............. ..................... 107
Figura 67: Comatoplaca das substâncias purificadas ........ ... ... .. .. .. ... .. ..... .. .. .................. 108
Lista de Tabelas
Tabela 1
Aristolactamas isoladas de espécies de Píper. .. ..... .. .. ...... ......... ... ......... .. ... ... ... ....... ..... . 1 O
Tabela 2
Flavanonas isoladas de espécies de Píper. .. .... .. ..... .. ... .......... ...... ... ..... ....... ... .. .... ..... .... 11
Tabela 3
Condição eluotrópica (S7) utilizada na análise dos extratos de folhas, cultura de
células e substâncias isoladas de P. crassínervíum ..... .... ..... .. .... ... ..... ........... .. .... .... .. ... 20
Tabela 4
Frações obtidas no fracionamento do extrato de folhas de P.crassínervíum por
cromatografia em coluna ........ .... ....... .. .. ...... ......... ..... .... .......... .... ...... ...... .. .. ... ........ ....... 21
Tabela 5
Frações do extrato de folhas de P. crassinervium submetidas à purificação
por cromatografia planar preparativa .. .... ........ ................. .. .. .... ........... .... .. .. ..... ...... ..... ... 22
Tabela 6
Frações obtidas no fracionamento de FPc 28-29, proveniente do extrato de
folhas de P. crassinervium .... ............. ........... ...... ........ ............... ...... .. ...... .... .... ......... ... . 22
Tabela 7
Experimentos de eliciação realizados com células de P. crassinervium provenientes
das suspensões celulares ...... ... .. ... .. ..... ... ... .... .................. ..... ... .. ...... ................. ...... .... . 33
Tabela 8
Dados de RMN-1 H e 13C para a substância 1 ... ......... ............ .............. .... .. ..... ....... ..... ... 42
Tabela 9
Dados de RMN-1H e 13C para a substância 2 .......... ............. ...... .... ...... ...... .. ......... ... ... .. 42
Tabela 10
Dados de RMN-1H e 13C para as hidroquinonas 3 e 4 ..... ............. ......... .......... .... .. ..... .. 47
Tabela 11
Dados de RMN-1H e 13C para a substância 5 ..... ......... .. .... ..... ... ... .... .... ..... ....... ... ..... .. ... 50
Tabela 12
Composição relativa dos constituintes do óleo volátil de P. crassinervium ..... .... .. ..... .... 69
Tabela 13
Teores de proteínas solúveis obtidos dos tecidos analisados de
P. crassínervíum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4
Tabela 14
Dados de RMN-1 H e 13C para a substância 6 ... ... ...... ...... .. ........... .... ..... ...... .. .. ............ .. 85
Tabela 15
Dados de RMN-1H e 13C para a substância 7 ... ... .......... ................................................ 87
Tabela 16
Dados de RMN-1H e 13C para as substâncias 8 e 9 ............... ............... ........ .. ........ .. .. .. 88
Tabela 17
Limite mínimo de detecção em µg das substâncias ativas .... ... .......... .......... ........... ..... . 109
1
l . 1 ntrod ução
O interesse do homem pelas substâncias químicas que estão ao seu redor é tão
antigo quanto sua própria existência. Embora de forma rudimentar, os produtos naturais
foram utilizados pela espécie humana na caça, na alimentação e na medicina (Lobo,
1976; Balandrin et ai. 1985; Walton, 1992). Mesmo em batalhas visando a conquista de
territórios entre os diversos povos, relatos descrevem a utilização de venenos mortais em
flechas. Atualmente sabe-se que produtos naturais como a tubocurarina (Figura 1 ),
extraída de Chondodendron tomentosum e espécies de Strychnos, possuem forte
atividade como agente bloqueador neuromuscular, causando paralisia do músculo de
forma letal (Mann, 1994).
OMe
o
~ o
MeO 2CI
Figura 1 - Estrutura do cloreto de tubocurarina
Na medicina, as civilizações antigas utilizavam os metabólitos de plantas na forma
de extratos brutos ou mesmo pela aplicação das ervas nas partes afetadas, visando curar
diversos males (Stafford, 1991 ).
O início da história moderna de produtos naturais de plantas ocorreu a partir do
século XIX, quando se teve o registro dos primeiros estudos com base científica, que
resultou no isolamento de alguns princípios ativos de plantas medicinais (Montanari &
Bolzani, 2001 ).
Nos estudos fitoquímicos de plantas usadas na medicina popular antigamente, no
tratamento de doenças, foi detectado um grande número de compostos com atividade
antitumoral. Entre estes encontram-se o ácido úsnico e a podofilotoxina. Alcalóides com
2
atividades contra o câncer (vinblastina e vincristina) também foram isolados de
Catharanthus roseus, embora nesse caso o uso tradicional estivesse relacionado à
diabetes (Stafford, 1991). Outros quimioterápicos como o taxol e os análogos da
podofilotoxina, etoposídeo e teniposídeo, também foram descobertos, fazendo com que
aumentasse o interesse pelos medicamentos de origem vegetal (Montanari & Bolzani,
2001).
O progresso alcançado no isolamento de novos produtos naturais foi diretamente
relacionado com a evolução das técnicas de separação. O advento da cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) foi de particular importância, pois permitiu o isolamento e
a purificação de uma gama de compostos, especialmente os de maior polaridade
(Hamburger & Hostettmann, 1991 ). A evolução das modernas técnicas espectroscópicas,
como ressonância magnética nuclear (RMN), espectrometria de massas e difração de
raios-X, foi de extrema importância na elucidação estrutural de moléculas orgânicas de
uma forma geral.
Num organismo vivo, os produtos diversos são sintetizados e degradados através
de uma série de reações químicas, catalisadas por enzimas altamente específicas e
seletivas na maioria dos casos. Este processo, conhecido como metabolismo, origina e
degrada diversos produtos essenciais como açúcares, aminoácidos, ácidos graxos,
proteínas e ácidos nucleicos. Estas substâncias constituem os metabólitos primários, que
estão presentes em todos os organismos, sendo essenciais para a sobrevivência e bom
funcionamento deles. A segunda grande classe de substâncias, denominada de
metabólitos secundários, é produzida a partir de um pequeno número de moléculas
chave, provenientes do metabolismo primário. Entre estes precursores fundamentais
destacam-se o (1) acetato, precursor de ácidos graxos; (2) mevalonato, um dos
precursores de isoprenóides (monoterpenos, sesquiterpenos, esteróides); (3) ácido
chiquímico, precursor de muitos compostos aromáticos, incluindo aminoácidos
aromáticos, ácidos cinâmicos e certos polifenóis; e (4) alguns aminoácidos, que
constituem-se nos precursores dos alcalóides. Muitos outros produtos são provenientes
da biossíntese mista envolvendo duas classes de compostos precursores e, como
exemplos podem ser citados os flavonóides e as quinonas preniladas (Mann, 1994).
Estes produtos do metabolismo secundário possuem ocorrência bastante
específica, sendo encontrados em determinados organismos ou espécies, e expressam a
individualidade destas espécies. Estas substâncias não são necessariamente produzidas
em todas as condições e, na maioria dos casos, não se sabe exatamente qual a função
3
destes compostos. Sabe-se que algumas delas são sintetizadas por um indivíduo como
defesa em relação a determinado predador, outras agem como atraentes voláteis para
uma futura polinização, outras ainda são agentes que conferem cor a determinadas
espécies. Com base nestas informações, assume-se que de uma maneira ou outra, estes
produtos naturais exercem alguma função vital para o organismo que os sintetizam
(Dewick, 1997).
Embora estas substâncias isoladas sejam denominadas "metabólitos secundários"
e estejam muitas vezes em quantidades ínfimas nas plantas, elas culminaram por assumir
várias aplicações no cotidiano do homem moderno (Figura 2). Alguns exemplos incluem
inseticidas, flavorizantes, adoçantes e perfumes, além de serem utilizadas na área médica
como analgésicos, anticolinérgicos, antimaláricos, etc (Stafford, 1991 ). Assim, tais
produtos representam a base do arsenal terapêutico da medicina do século XX e, em
função da sua importância econômica, representam as bases do mercado farmacêutico
que movimenta cerca de 350 bilhões de dólares anualmente (Ferreira et ai., 1998). Alguns
dos produtos naturais possuem uso indireto, como precursores de substâncias
importantes, como é o caso das sapogeninas extraídas dos carás (Dioscorea spp), na
síntese de hormônios sexuais e anticoncepcionais. A bacatina Ili ou cefalomanina são
exemplos recentes de substâncias empregadas na síntese comercial do antitumoral taxol
(Matos, 1988; Montanari & Bolzani, 2001).
;·- ,_)
codeína
(Papaver somniferum)
analgésico
~ 9H20H o-có atropina
(Atropa belladona)
anticolinérgico
MeO
quinina
(Cinchona ledgeriana)
antimalárico
nicotina
(Nicotiana tabacum)
inseticida
Figura 2 - Exemplos de produtos naturais utilizados industrialmente
4
Um dos grandes atrativos de produtos naturais derivados de plantas continua
sendo o estudo de suas rotas biossintéticas, que são extremamente elegantes do ponto
de vista mecanístico e notáveis em termos de rendimento. Tais aspectos têm inspirado
químicos sintéticos na busca de alternativas, utilizando-se enzimas de plantas . ou de
microrganismos em algumas etapas específicas, com o objetivo de se obter diversos
produtos com atividade biológica, de maneira a minimizar a dependência de plantas como
única fonte destas substâncias (Kutney, 1997).
5
Sabe-se que, dependendo da época do ano em que a planta é coletada, ou mesmo
de seu habitat, existem variações nas concentrações dos compostos de interesse, o que
acaba por dificultar o seu isolamento e caracterização (Kutney, 1997). As plantas estão
sujeitas a uma variedade de estresses climáticos, que podem alterar o nível de produção
destas substâncias, interferindo, desta maneira, na obtenção do produto desejado
(Stafford, 1991 ).
Tendo-se em vista tais considerações, torna-se complexo depender
exclusivamente de determinada espécie vegetal para a obtenção da substância de
interesse, além de ser necessário quantidades adequadas para os fins requisitados.
Através de processos de isolamento das substâncias a partir de plantas obtém-se
quantidades que podem servir como materiais de partida para síntese de determinados
produtos, mas tais enfoques são freqüentemente limitados pelos baixos rendimentos.
Os produtos naturais apresentam uma grande complexidade estrutural e as
sínteses requerem tantas etapas que acabam por inviabilizar economicamente o
processo. Do ponto de vista acadêmico, muitas sínteses constituem-se em grandes
desafios intelectuais mas tornam-se inviáveis para produções em escala comercial
(Kutney, 1997).
A cultura de células surgiu na década de 50 como uma poderosa ferramenta
complementar para o estudo do metabolismo em plantas intactas. Entre as principais
vantagens do uso de cultura de tecidos e células, podem ser citadas a relativa
uniformidade de biomassa, a reprodutibilidade dos experimentos e a facilidade de obter
grandes quantidades de células (Dougall, 1981). Por receberem condições de tratamento
controladas em laboratório, os parâmetros de crescimento, tais como pH, mudanças nos
nutrientes do meio e temperatura, podem ser manipulados e otimizados com a finalidade
de se alcançar uma produção maior dos produtos secundários, em comparação com a
planta cultivada. A menor complexidade dos extratos obtidos através da cultura de células
constitui-se também num aspecto favorável contribuindo para a separação das
substâncias alvo. Estes sistemas in vitro constituem-se também numa excelente fonte de
enzimas, freqüentemente superior à das plantas diferenciadas, favorecendo a realização
de experimentos de biossíntese e de biotransformações, relacionados à produção dos
metabólitos (Zenk, 1991; Kutney, 1997).
Apesar disso, existem também as desvantagens, que incluem um esforço contínuo
em se manter estes sistemas celulares, através da realização freqüente de sub-culturas,
os custos de manutenção, assim como problemas causados pela instabilidade genética
6
que culminam por alterar todo o comportamento destas células, afetando a produção de
determinado metabólito secundário (Dougall, 1981). A produção econômica de produtos
naturais através dessa técnica está ainda restrita a poucos exemplos e constitui-se ainda
num desafio.
Diante desse cenário, pode-se compreender a razão pela qual a pesquisa de novos
fármacos provenientes de plantas constitui-se numa das áreas mais competitivas no meio
acadêmico e, principalmente, no setor industrial. De uma forma geral, essa investigação
é tipicamente uma atividade interdisciplinar que requer a colaboração tanto de químicos
de produtos naturais e de síntese orgânica, como de botânicos, biólogos e farmacólogos,
sendo praticamente impossível atingir resultados satisfatórios através de pesquisas
realizadas de forma isolada.
1 .1 A Família Piperaceae
A família Piperaceae compreende 14 gêneros e cerca de 1950 espécies, segundo
Mabberley (1997). Os gêneros Piper e Peperomia (Figura 3) são os mais representativos,
com aproximadamente 700 e 600 espécies, respectivamente (Joly, 1985).
Em geral, as espécies de Piperaceae caracterizam-se por serem plantas
predominantemente herbáceas, raramente sendo arbóreas ou arbustivas. Espécies de
Piper, presentes nas regiões tropicais e subtropicais, têm sido amplamente investigadas
devido a inúmeras substâncias biologicamente ativas nelas presentes, o que justifica seu
amplo uso na medicina popular, como remédios para dores no estômago, agentes anti
inflamatórios, antipiréticos e contra asma, e até como repelentes de insetos (Parmar et ai.,
1997).
7
Peperomia obtusifolia Peperomia scandens Piper solmsianum
Piper nigrum Peperomia nivences Peperomia pellucida
Figura 3 - Algumas espécies dos gêneros Piper e Peperomia
No início do século XIX o sabor picante dos frutos de Piper nigrum motivou estudos
fitoquímicos que resultaram no isolamento e caracterização da amida piperina (Figura 4),
responsável pelo princípio picante desta pimenta (Sengupta & Rao, 1987).
o
< o Figura 4 - Estrutura da amida piperina
De Piper methysticum (kava-kava), uma espécie de ocorrência restrita às ilhas do
Pacífico Sul, de importância comercial por causa de suas propriedades calmantes, foram
8
isoladas substâncias denominadas de kavapironas (metisticina e kavaína) (Figura 5), que
apresentam efeitos hipnótico e anestésico (Smith, 1983; Singh, 1992).
OMe OMe
o
< o o
kavaína metisticina
Figura 5 - Estruturas de kavapironas isoladas de Piper methysticum
A pesquisa de novos constituintes de Piper foi intensificada recentemente devido à
detecção de várias substâncias com atividade biológica, como alcalóides citotóxicos,
amidas com atividade antifúngica e lignanas com atividade anti-PAF, antifúngica e anti
tumoral (Matsui & Munakata, 1976; Sun et ai., 1987; Duh, et ai., 1990; Ruangrungsi et ai.,
1992; Wu et ai., 1997; Alécio et ai., 1998).
Investigações fitoquímicas das espécies de Piper possibilitaram a descrição de
uma grande variedade de novos compostos químicos, incluindo-se alcalóides e amidas,
lignanas, neolignanas, propenilfenóis, terpenos, esteróides, chalconas, dihidrochalconas,
flavonas, flavanonas, kavapironas e piperolídeos (Sengupta & Rao, 1987; Jensen et ai.,
1993; Parmar et ai., 1997). Alcalóides e amidas são considerados os constituintes mais
comuns de espécies de Piper e também os mais estudados por apresentarem atividades
biológicas. A aduncamida, isolada de Piper aduncun, apresentou atividade bactericida
contra Bacil/us subtilis e Micrococcus luteus (Orjala et ai., 1993) enquanto a amida
pirrolidínica, N-[7-(3' ,4' -metilenodioxifenil)-2(Z),4(Z)-heptadienoil]pirrolidina, isolada de P.
hispidum, mostrou ser ativa contra o fungo Cladosporium shaerospermum (Alécio et ai.,
1998).
As aristolactamas pertencem a um reduzido grupo de alcalóides, encontrados
principalmente na família Aristolochiaceae, sendo responsáveis pela origem do nome
desta classe de compostos. Entretanto as aristolactamas têm sido relatadas em espécies
de Piperaceae, além das famílias Annonaceae, Menispermaceae e Monimiaceae (Desai
et ai., 1990).
9
O interesse por esta sub-classe de alcalóides é devido a diversidade de atividades
biológicas, destacando-se a potente atividade inseticida apresentada pelas
aristolactamas. A relação estrutural entre o ácido aristolóquico (Figura 6), um
nitrocomposto bastante tóxico, as aristolactamas e os alcalóides dioxoaporfínicos e
isoquinolínicos tem motivado diversos estudos biossintéticos (Chen, Z-L. & Zhu, D-Y.,
1987).
o
< o
Figura 6 - Estrutura do ácido aristolóquico
As lactamas fenantrênicas, ou aristolactamas, isoladas de espécies de Piper são
mostradas na Tabela 1.
1
MeO
HO
MeO
HO
Ta bela 1 - Aristolactamas isoladas de espécies de Pi per
Estruturas
1a R1 = R2 = Me; R3 = H
(piperolactama D)
1 b R1 = R3 = Me; R2 = H
(goniopedalina)
1 e R1 = H ; R2 = R3 = Me
(piperolactama B)
1 d R1 = R2 = R3 = Me
(piperolactama C)
Piperolactama A
Referência
Olsen et ai., 1993; Singh
et ai., 1996
Ruangrungsi et ai., 1992
Singh et ai., 1996
10
11
Flavonóides são produtos naturais presentes em muitas espécies de plantas, mas
que apresentam uma ocorrência restrita no gênero Píper (Tabela 2). Estes compostos
estão associados à capacidade protetora contra radiação UV além de estarem envolvidos
como compostos de defesa contra microorganismos. Os flavonóides também são
encontrados em frutas, vegetais, chás e vinhos, fazendo parte da dieta alimentar humana
(Harborne & Williams, 2000). A Tabela 2 relaciona as flavanonas isoladas de diferentes
espécies de Piper (Sengupta & Rao, 1987; Parmar et ai., 1997).
Tabela 2 - Flavanonas isoladas de espécies de Piper
Composto Planta
5, 7-dihidroxiflavanona ( 1) P. hostmannianum
P. steemi
6-hidroxi-5, 7-dimetoxiflavanona (2) P. hispidum
8-hidroxi-5, 7-dimetoxiflavanona (3) P. hispidum
5-hidroxi-7-metoxi-6,8- P. hostmannianum
dimetilflavanona ( 4)
5-hidroxi-7-metoxiflavanona (5) P. aduncum
(pínostrobina) P. fadyeniii
P. hispídum
P. steemi
5,4'-dihidroxi-7-metoxiflavanona (6) P. aduncum
(sakuranetina)
5, 7,8-trimetoxiflavanona (7) P. híspídum
7-hidroxi-5-metoxiflavanona (8) P. methystícum
(alpinetina)
5, 7-dihidroxi-6-metoxiflavanona (9)
(dihidrooroxilina A)
(1) R1=R2=R3=R4=R5=H
(2) R 1 =R3=CH3; R2=0H; R4=RS=:H
(3) R1=R3=CH3; ~.4=~5~H; R4=0H
(4) R1=R5=H; R2=R3=R4=CH3
(5) R1 =R2=R4=RS=H; R3=CH3
R5
(6) R1=R2=R4=H; R3=CH3; RS=OH
(7) R1=R3=CH3; R2=R5=H; R4=0CH3
(8) R 1 =CH3; R2=R3=R4=R5=H
(9) R1=R3=R4=R5=H; R2=0CH3
Figura 7 - Estruturas químicas das flavanonas isoladas de espécies de Piper
12
13
1 . 2 Pi per crassinervium
Piper crassinervium Kunth, objeto deste trabalho, é um arbusto que ocorre na Mata
Atlântica (Brasil), além de ser encontrada na Colômbia, Equador e Peru. Tem 2 a 5
metros de altura. Suas folhas possuem um formato ovalado, com um ápice acuminado, ' medindo de 5 a 15 cm de largura e de 13 a 25 cm de comprimento (Yuncker, 1 ~72).
Figura 8 - Espécie de P. crassinervium cultivada no Instituto de Química - USP
14
2. Objetivos
O presente trabalho teve por objetivos o estudo químico e biológico da espécie P.
crassinervium. Devido a ausência de relatos anteriores sobre sua composição química, o
estudo foi direcionado para a comparação dos metabólitos secundários presentes em
folhas de P. crassinervium com aqueles encontrados em suspensões celulares desta
espécie. Sendo frequente a presença de compostos fenólicos em espécies de Piper, a
capacidade metabólica foi avaliada através da determinação da atividade de enzimas
específicas. Dessa maneira, este trabalho foi desenvolvido através das etapas seguintes:
1. Isolamento e determinação estrutural dos principais metabólitos secundários de folhas
de plantas diferenciadas, incluindo a análise do óleo essencial de P. crassinervium;
2. Estabelecimento de suspensões celulares e obtenção de diversos parâmetros de
crescimento visando sua caracterização, incluindo-se o isolamento e a determinação
estrutural dos principais metabólitos secundários;
3. Análise das enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL) e chalcona sintase (CHS)
envolvidas na biossíntese dos metabólitos fenólicos isolados de folhas e das
suspensões celulares;
4. Avaliação das respostas das suspensões celulares mediante a utilização de
precursores ou de agentes estimulantes (aliciadores) da biossíntese de metabólitos
secundários, e
5. Investigação da atividade antifúngica (Bioautografia) dos metabólitos secundários
isolados dos diferentes tecidos de P. crassinervium.
15
3. Materiais e Métodos
3.1 Material vegetal
As folhas estudadas de P. crassinervium foram coletadas no Parque Estadual
Turístico do Alto Ribeira - PETAR, localizado no Vale do Ribeira, município de lporanga,
Estado de São Paulo. Esta espécie foi identificada pelo Prof. Dr. Guillermo E. D. Paredes
(Universidade Pedro Ruiz Gallo, Tambayeque, Peru) e a exsicata foi depositada no
Herbário do Instituto de Botânica. As sementes utilizadas para germinação de plântulas,
fonte de expiantes para cultura de células, foram coletadas em outubro de 1998 no
Parque Estadual da Serra do Mar, Picinguaba, município de Ubatuba, Estado de São
Paulo. Esta espécie de Piper também é cultivada no Instituto de Química da Universidade
de São Paulo (Figura 8).
3.2 Obtenção de plântulas axênicas, calos e suspensões celulares de
Piper crassinervium
3.2.1 Micropropagação de P. crassinervium
A partir de plantas intactas de P. crassinervium, de 3 a 5 meses de idade, obtidas
por germinação de sementes, ápices caulinares e nós, de 1 cm de comprimento, foram
inoculados para o estabelecimento de plantas propagadas cultivadas in vitro. Estes
expiantes foram desinfetados durante 1 O minutos em solução etanólica 70% e,
posteriormente, lavados com água destilada em condições assépticas, antes da
inoculação. O meio utilizado para a propagação de plântulas, classificado como N1,
consistiu dos sais inorgânicos Gamborg 85 (1968) suplementado com mio-inositol (100
mg/L), tiamina (1 mg/L), sacarose (30 g/L), ácido indolacético (AIA) (0,02 mg/L), ácido
giberélico (AG3) (0,02 mg/L) e Fitagel® (Sigma) (0,7%). Esta formulação foi estabelecida
pelo prof. Dr. Guillermo Eduardo Delgado Paredes (Universidade Pedro Ruiz Gallo,
Tambayeque, Peru).
Estas plântulas cultivadas in vitro serviram como fonte de expiantes para a
micropropagação de plântulas de P. crassinervium, no caso, os ápices caulinares e os
nós, cultivados em posição vertical no meio de cultura N 1. Estas culturas foram mantidas
16
sob 35 µmol / m2 s de irradiância, fornecida por lâmpadas fluorescentes de 30 W, sob
temperatura de 24-26ºC e fotoperíodo de 16/8 h.
Para conservação do germoplasma in vitro foram mantidas 5-8 plantas desta
espécie, propagadas por culturas de nós e mantidas sob 20 µmol / m2 s de irradiância.
3.2.2 Indução de calos
Para a indução de calos foram utilizados os nós provenientes de plantas axênicas
obtidas in vitro, que serviram como fonte de expiantes, que foram mantidos a 0-5 µmol /
m2 s de irradiância e nas mesmas condições ambientais de incubação já descritas. O
meio de cultura utilizado foi denominado de BC-1 e consistiu no meio Gamborg B5 (1968)
suplementado com mio-inositol (100 mg/L), tiamina (1 mg/L), sacarose (30 g/L), ácido
naftalenoacético (ANA) (1,0 mg/ml), 6-benzilamino purina (BAP) (0,2 mg/ml) e
Fitagel ® (Sigma) (0,7%).
A manutenção dos calos foi realizada por repicagens sucessivas (intervalo de 20
dias), e constituiu-se num processo mais crítico que a própria indução, devido ao
problema de oxidação, necrosamento e morte das células do calo após a repicagem.
3.2.3 Suspensões celulares
A partir dos calos friáveis foram iniciadas as suspensões celulares, utilizando-se o
meio de cultura denominado BC-1, sem a adição do Fitagel®. As repicagens das
suspensões celulares estabelecidas foram efetuadas com intervalo de quinze a vinte dias,
descartando-se o meio usado e distribuindo uma quantidade equivalente de células em
dois Erlenmeyers contendo o meio BC-1 fresco.
A Figura 9 apresenta a sequência de passos para obtenção de plantas propagadas
cultivadas in vitro e suspensões celulares de P. crassinervium.
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3.3 Obtenção dos extratos de folhas e de cultura de células de
Piper crassinervium
Os solventes utilizados para a extração dos tecidos estudados foram das marcas
Merck, Vetec, CRQ e Synth com diferentes graus de pureza dependendo da finalidade do
uso. Os que não apresentaram qualidade adequada foram purificados por destilação
fracionada.
3.3.1 Extratos de folhas de P. crassinervium
Folhas de P. crassinervium (748 g) foram secas, moídas, e submetidas à extração a
frio com 500 ml de EtOAc por três vezes, obtendo-se 10,6 g do extrato de folhas, após a
concentração e eliminação do solvente.
3.3.2 Extratos do meio BC-1 e das células provenientes das suspensões celulares
de P. crassinervium
Células de P. crassinervium
obtidas a partir da filtração a vácuo das
suspensões celulares (Figura 1 O)
foram extraídas com metanol sob
banho de ultrassom. Depois da
eliminação do solvente, o extrato
obtido foi submetido à partição com
acetato de etila, e novamente
concentrado, obtendo-se então o
extrato de células. Figura 1 O - Suspensão celular de
P. crassinervium
Para obtenção do extrato do meio celular BC-1 fez-se a partição do meio de cultura
das suspensões celulares, com aproximadamente 300 ml de EtOAc, por três vezes. A
fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e concentrada em rotaevaporador para
eliminação do solvente.
19
3.4 Análise dos extratos de folhas e de cultura de células de Piper
crassinervium
O fracionamento dos extratos obtidos foi realizado através das técnicas de
cromatografia em coluna e planar, enquanto que á análise dos extratos e das substâncias
isoladas foi realizada por CLAE e por cromatografia planar comparativa.
3.4.1 Cromatografia planar e cromatografia em coluna
Para preparação das placas usadas para cromatografia planar comparativa (CPC) e
preparativa (CPP) utilizou-se sílica gel PF2s4, da Merck. As revelações das substâncias
foram efetuadas com irradiação de luz UV de 254 e 366 nm, seguidas de borrifações com
sulfato cérico e aquecimento a 80ºC, por 15 minutos. A recuperação das frações após a
separação por CPP foi realizada por extração com EtOAc.
Para o fracionamento cromatográfico em coluna (CC) utilizou-se sílica-gel 60
(0,063-0,200 mm) da Merck.
Os eluentes usados para o fracionamento das substâncias foram:
S1 - diclorometano: acetona: hexano 79,6: 0,4: 20
S2 - hexano: acetato de etila: isopropanol 70: 30: 1
S3 - hexano: acetato de etila 70: 30
S4 - hexano: diclorometano: acetato de etila 70: 17,5: 37,5
S5 - diclorometano: acetona: hexano 78,4: 1,6: 20
S6 - clorofórmio: metanol 90: 1 O
A concentração dos solventes foi realizada sob pressão reduzida, por bomba de
vácuo, usando-se rotaevaporadores.
3.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Para cromatografia líquida de alta eficiência foi utilizado um cromatógrafo líquido
analítico/semipreparativo, Shimadzu, mod. LC-10, munido de detector espectrofotométrico
de comprimento de onda variável e injetor automático, modelo SIL-10A. Para as análises
por CL.AE foram utilizados solventes de grau cromatográfico da Merck e colunas (a)
analítica, fase reversa - RP-18 Supelco 5 µm, 250 x 4 mm (Supelcosil), (b) analítica, fase
reversa - Luna C18, 250 x 4 mm 5 µm (Phenomenex) e (c) semi-preparativa, fase reversa
-Luna C18, 250 x 10 mm 5 µm (Phenomenex). BIBL I OTECA tN:::;-~lúJTO CE QU;MlCA
20
Na análise qualitativa dos extratos de folhas e culturas de células de P.
crassinervium, assim como na purificação das substâncias isoladas, foi utilizado o sistema
de solventes metanol:água (S7), no modo gradiente (Tabela 3), com detecção a 254 nm.
O fluxo e o volume de injeção variaram de acordo com a coluna utilizada, sendo
1, O ml/min e 20 µL, respectivamente, para colunas analíticas e 4, 7 mUmin e 350 µL para
a coluna semi-preparativa. O tempo de equilíbrio estabelecido antes de cada injeção foi de
7 minutos.
Um tratamento prévio dos extratos foi introduzido antes das injeções e constituiu-se
na suspensão de uma massa conhecida de cada extrato ou fração em metanol, seguida
de filtração em coluna C-18 seppak, para eliminação da matriz lipofílica.
Tabela 3 - Condição eluotrópica (S7) utilizada na análise dos extratos de folhas, cultura
de células e substâncias isoladas de P. crassinervium
MeOH H20 Tempo (min)
65 35 o 100 o 25
100 o 30
- Para o ensaio da atividade da PAL
A análise do ácido cinâmico formado nos ensaios de atividade da PAL foi realizada
através do sistema S8, MeOH:H2O:CH3COOH 60:40:1, no modo isocrático, com detecção
a 275 nm e fluxo de 1 ml/min.
- Para o ensaio da atividade da CHS
A análise da naringenina formada no ensaio da chalcona sintase foi realizada de
acordo com o método estabelecido por Zuurbier (1993), e denominado neste trabalho
como sistema de solventes S9, MeOH:H2O:H3PO4 85% (v/v) (70:30:0,25), no modo
isocrático, com detecção a 290 nm e fluxo de 1 ml/min.
3.4.3 Fracionamento do extrato de folhas de P. crassinervium
Extrato de folhas de P. crassinervium (10 g) foi submetido à cromatografia em
coluna utilizando-se como eluente misturas de hexano:acetato de etila em ordem
21
crescente de polaridade. Foram obtidas 50 frações de 50 ml, analisadas em seguida por
cromatografia planar comparativa e agrupadas, conforme Tabela 4.
Tabela 4 - Frações obtidas no fracionamento do extrato de folhas de
P. crassinervium por cromatografia em coluna
Frações Denominação Massa (mg) 2 FPc2 103,2
3-4 FPc3 85,5 5-6 FPc5 688,3 7 FPc7 381,7 8 FPc8 206,2
9-12 FPc9 328,4 13 FPc13 25,1 14 FPc14 41, 1 15 FPc15 42,9 16 FPc16 51, 1
17-18 FPc17 125,2 19-22 FPc19 148,0
23 FPc23 49,7 24-27 FPc24 326,0 28-29 FPc28 136,0
30 FPc30 101,6 31 FPc31 210,4 32 FPc32 113, 1 33 FPc33 115, 1
34-36 FPc34 439,0 37-38 FPc37 630,6 39-40 FPc39 278,6
41 FPc41 441,9 42-45 FPc42 467,4
46 FPc46 659,2 47 FPc47 700,8 48 FPc48 263,5 49 FPc49 393,1 50 FPcS0 468,6
As frações agrupadas foram analisadas por CLAE (sistema S7) e posteriormente,
submetidas a purificação por CPP, utilizando-se diferentes sistemas de solventes (Tabela
5).
Tabela 5 - Frações do extrato de folhas de P. crassinervium submetidas à
purificação por cromatografia planar preparativa
Frações Sistema de
solventes utilizado
24-27 S1
28-29 S2, CC
30 S3
32-33 S1
34-36 S2
42-45 S1
46 S3
48 S2
22
A fração 28-29, depois de analisada por CLAE (sistema S7), foi submetida a CC,
utilizando-se como eluente uma mistura de hexano:acetato de etila, em ordem crescente
de polaridade, resultando em 23 frações, que depois de analisadas por CPC, foram
agrupadas (Tabela 6).
Tabela 6 - Frações obtidas no fracionamento de FPc 28, proveniente do extrato de folhas
de P. crassinervium
Frações 28.4
28. 10-28. 11 28.12-28.17
Massa (mg) 75,4 22,7 16,3
A Figura 11 descreve o fracionamento cromatográfico para obtenção das
substâncias isoladas de folhas de P. crassinervium.
24-27
S1
24.b
S2
4 1,8 m
28-29 30
S3
30c
S3
30c1
CC
S3
28.4d
S3
Extrato de folhas dé f! crassinervium (lporanga)
10g
CC
32-33 34-36 42-45
S2
34.1 S1
S3 S1
42a
46
S3
Figura 11 - Fracionamento do extrato de folhas de P. crassinervium
23
48
S2
2 (2,2 m
24
3.4.4 Fracionamento do extrato de células de P. crassinervium
O extrato de células proveniente das suspensões celulares de P. crassinervium foi
purificado por cromatografia planar preparativa, tendo-se como aluentes o sistema S3.
Nesta condição foram separadas quatro faixas (Figura 12), dentre elas duas substâncias
puras (alcalóides 6 e 7), sendo que a segunda fração (cel 1) foi submetida novamente à
cromatografia planar preparativa (sistemas S3 e S6), originando duas frações. A fração
denominada 1 b, ainda uma mistura, foi submetida à cromatografia líquida (sistema S7),
em coluna Luna semi-preparativa, resultando nas substâncias 8 e 9.
celO
Extrato de células proveniente das suspensõe celulares de P. crassinervium
S3
cel1
S3e S6
cel 1a cel 1b
S7
Figura 12 - Fracionamento do extrato de células provenientes das suspensões celulares
de P. crassinervium
25
3.5 Estudo do óleo volátil de folhas de Piper crassinervium
Além do isolamento das substâncias acumuladas nas folhas de P. crassinervium
fez-se o estudo dos componentes voláteis presentes no óleo obtido dessas folhas, através
da cromatografia gasosa e CG/EM, considerando que não existem até o momento dados
sobre sua composição.
3.5.1 Material vegetal
As folhas utilizadas no estudo da composição dos componentes voláteis foram
coletadas em Araraquara, Estado de São Paulo, em outubro de 1998.
3.5.2 Isolamento dos compostos voláteis
Folhas frescas (280 g) de P. crassinervium foram submetidas à hidrodestilação,
durante três horas, em um aparelho do tipo Clevenger. O óleo originado desta extração foi
utilizado para o estudo dos componentes voláteis presentes.
3.5.3 Condições de análise do óleo volátil
O fracionamento e análise quantitativa do óleo volátil foram realizados por
cromatografia gasosa (CG), sendo que a associação desta técnica à espectroscopia de
massas (CG/EM) permitiu inferir sobre a identidade da maioria dos constituintes da
mistura. A determinação dos constituintes voláteis de P. crassinervium foi baseada na
comparação dos tempos de retenção dos constituintes do óleo com os de padrões ou de
compostos de banco de dados.
Nesta análise foram utilizados um cromatógrafo Shimadzu GC-17A equipado com
um programa Shimadzu GC 1 O, uma coluna capilar de sílica fundida (30 m x 0,25 mm x
0,25 µm, cobertas com DB-5) , e um detector de ionização de chama. A temperatura do
forno variou de 60 a 300ºC, a 3ºC/min, utilizando-se gás hélio como gás de arraste
(1 ml/min). As temperaturas do injetor e detector foram de 220 e 250ºC, respectivamente.
· Para cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa utilizou-se um
cromatógrafo gasoso Shimadzu, com coluna capilar, acoplado a um espectrômetro de
massa com analisador quadrupolar (QP 5000) operando a 70 eV nas mesmas condições
descritas acima.
2$
3.6 Extração de proteínas para doseamento da fenilalanina
amônia-liase (PAL) e chalcona sintase (CHS)
Com o objetivo de se comparar a atividade da enzima fenilalanina amônia-liase
(PAL) em folhas, plantas propagadas in vitro e culturas de células de P. crassinervium,
foram feitos ensaios de doseamento desta enzima para estes tecidos.
3.6.1 Protocolo para extração da enzima PAL
O material fresco (folhas, células e tecidos de plantas propagadas de P.
crassinervium) foi congelado em nitrogênio líquido e triturado com auxílio de um almofariz
e pistilo. Foram adicionados polivinilpolipirrolidona (PVPP) (0,0059/9 de material fresco) e
uma quantidade equivalente de sílica-60 neste processo. Este material fresco foi suspenso
em tampão borato O, 1 M, pH 8,8 (3 ml de tampão/g de material fresco). O homogeneizado
foi filtrado em gaze, em banho de gelo. O filtrado foi então centrifugado a 10.000 g por 20
min a 4°C (Moreno et ai., 1994). As proteínas do sobrenadante foram dessalinizadas e
concentradas em uma coluna PD-1 O (Sephadex G-25) e foram usadas tanto para o ensaio
da atividade enzimática por CLAE como para o doseamento de proteína segundo Bradford
(1976).
3.6.2 Ensaio da atividade da PAL
Duzentos microlitros do extrato proteico foram incubados durante 30 min, a 29 ºC,
em 1 ml de tampão borato O, 1 M, pH 8,8, contendo 300 µL de fenilalanina 1 O mM. A
incubação foi interrompida com a adição de 100 µL de ácido clorídrico. Após a adição de
50 µL do padrão interno 4-metilumbeliferona 1 mM, a mistura foi centrifugada por 5 min a
10000 g e então analisada por CLAE (Heide et ai. , 1989).
3.6.3 Análise por CLAE
O ácido cinâmico foi determinado por CLAE, por meio da injeção de 20 µL do
sobrenadante utilizando-se uma coluna Supelcosil LC-18 e o sistema de solventes S8.
A determinação da atividade da PAL nos tecidos estudados foi baseada na seguinte
equação:
Atividade PAL (pKatal/mL) = [(A ácido/A p.i.) - (A ácido B/ A p.i.)] x p.i.
R x tempo incubação x V
Onde,
A= área
B = ensaio branco
R = fator de conversão obtido através da curva padrão da albumina sérica bovina
tempo de incubação= 30 min
V = volume da preparação enzimática utilizada no ensaio (0,2 ml)
p.i. = massa do padrão interno (50 pmol)
3.6.4 Doseamento de proteínas totais
27
O doseamento de proteínas em folhas intactas, plântulas propagadas in vitro e
células provenientes das suspensões celulares de P. crassinervium, foi realizado pelo
método de Bradford (1976), utilizando-se o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 (kit
Bradford - Bio-Rad). A ligação do corante à proteína causa um deslocamento no máximo
de absorção do corante, de 465 para 595 nm, onde a formação do complexo pode ser
monitorada.
Protocolo do ensaio:
1. Dez microlitros do extrato proteico foram pipetados em uma cubeta de poliestireno
(1 cm, 1,5 ml).
2. Adicionou-se 1190 µL de tampão borato pH 8,8 e 300 µL do corante (Coomassie
Brilliant Blue G-250), seguido de agitação.
3. A mistura de reação foi incubada à temperatura ambiente por 5 min.
4. Mediu-se a absorbância a 595 nm (espectrofotômetro UVNIS Perkin-Elmer, modelo
Lambda 3P) .
5. O teste branco deste ensaio foi feito com 1200 µL de tampão borato e 300 µL do
corante.
3.6.5 Ensaio para extração enzimática da chalcona sintase (CHS) (0-4ºC)
Folhas de P. crassinervium foram congeladas em N2 líquido, trituradas com auxílio
de um almofariz e pistilo, com sílica e cerca de 10% PVPP (peso/peso). O pó formado foi
misturado com o tampão de extração (2 ml de tampão / g de tecido vegetal), filtrado e
28
centrifugado a 14000 rpm, por 20 minutos. O sobrenadante foi utilizado para o ensaio da
chalcona sintase (Zuurbier et ai., 1993).
Tampão de extração:
Para extração da CHS foi utilizado o tampão fosfato 0,5 M, pH 8, com adição de
1,5% de polietilenoglicol (peso/volume), 400 mM de sacarose, 1 mM de cloreto de cálcio e
O, 1% de albumina sérica bovina (pelo/volume). Este tampão foi deaerado e posteriormente
foram adicionados 200 mM de ácido ascórbico, 50 mM de EDTA, 50 mM de cisteína e
10% Dowex (peso/volume).
3.6.6 Ensaio da atividade da CHS
Foram adicionados em um Eppendorf 25 µL do extrato protéico (sobrenadante),
75 µL do tampão para ensaio, 5 µL de malonil-CoA 0,4 mM (2 nmol) (Sigma) em tampão
citrato O, 1 M (pH 3) e 5 µL de p-cumaroil-CoA 0,2 mM (1 nmol) (previamente preparado).
Para controle fez-se um ensaio sem p-cumaroil-CoA. As soluções foram incubadas à
30ºC, por 30 minutos. No final da incubação foram adicionados 1200 µL de EtOAc, sendo
a mistura agitada em vórtex e posteriormente centrifugada por 2 minutos.
A fase orgânica destes ensaios foi evaporada e o resíduo foi ressuspendido em
20 µL de metanol e analisado por CLAE (sistema S9) (Zuurbier et ai., 1993).
Tampão para o ensaio:
Para o ensaio da atividade da CHS foi utilizado o tampão fosfato, 0,5 M, pH 6,8,
com adição de 2,8 mM 2-mercaptoetanol e 2% de albumina sérica bovina (peso/volume).
3.6. 7 Análise por CLAE
O produto formado no período da incubação foi analisado por CLAE, de acordo com
o método estabelecido por Zuurbier (1993), para detecção da naringenina, substância
proveniente da reação entre o malonil-CoA e p-cumaroil-CoA, tendo-se como referência o
tempo de retenção da naringenina (Sigma) previamente analisada nas mesmas condições.
Utilizou-se nesta análise uma coluna C-18 (Supelcosil) e o sistema de solventes S9.
29
tempo de retenção da naringenina (Sigma) previamente analisada nas mesmas condições.
Utilizou-se nesta análise uma coluna C-18 (Supelcosil) e o sistema de solventes S9.
3. 7 Preparação dos precursores para o ensaio de doseamento
da chalcona sintase
De acordo com Grisebach (1985), o primeiro produto na biossíntese dos
flavonóides, a 4,2',4',6'-tetrahidroxichalcona (naringenina chalcona), é formado pela
condensação de uma molécula de p-cumaroil-CoA com três moléculas de malonil-CoA,
através da ação da chalcona sintase (Cooman et ai., 1993). O tioéster p-cumaroil-CoA foi
preparado através da conversão em seu éster succinimídico correspondente que, por sua
vez, reagiu com a coenzima A
3. 7 .1 Preparação do ácido p-cumárico
O ácido p-cumárico foi preparado através da condensação de Knoevenagel entre o
ácido malônico e o p-hidroxi-benzaldeído, catalisada por aminas (Katayama et ai., 1992).
Foram utilizados 2,43 g de ácido malônico e 1,9 g de p-hidroxi-benzaldeído, que foram
solubilizados em 3,5 ml de piridina, e adicionou-se uma gota de piperidina e uma gota de
anilina, previamente destiladas. A temperatura foi mantida por 55ºC, por 24 horas, e
depois foi elevada para 1 00ºC, por mais uma hora. Fez-se a adição de 15 ml de água à
80ºC e a mistura foi resfriada à temperatura ambiente. Em seguida foi acidificada com
5,0 ml de HCI 2M e extraída com EtOAc (25 ml x 6). A fase orgânica foi concentrada até
metade do volume inicial e extraída posteriormente com uma solução de bicarbonato de
sódio 5% (20 ml x 4). As frações aquosas foram combinadas, extraídas com
diclorometano (20 ml), acidificadas à pH 1 e extraídas com EtOAc (20 ml x 6).
A fase orgânica foi evaporada sob pressão reduzida, fornecendo o ácido para
cumárico, que foi caracterizado por CLAE (sistema S7) através da comparação com o
ácido padrão e RMN-1H (H-2, 8 6,94, dd; H-3, 8 7,72, dd; H-5, 8 7,62, dd; H-6, 8 6,94, dd;
H-7, 8 6,40, d; H-8, 8 7,70, d).
o o
HO~OH
ác. malônico p-hidroxi-benzaldeído ác. p-cumárico
30
3.7.2 Preparação do éster succinimídico do ácido p-cumárico
A mistura do ácido p-cumárico (1,0 g, previamente preparado) e 756,7 mg de
N-hidroxisuccinimida (Merck) foi dissolvida em 250 ml de EtOAc, sob aquecimento (60-
?0ºC), sendo em seguida resfriada a 30ºC (Stockigt & Zenk, 1975). A essa solução foram
adicionados 7,5 mmol (1,54 mg) de N,N'-diciclohexil carbodiimida (aquecida previamente à
40ºC, até tornar-se líquida). A reação foi mantida por 24 horas em temperatura ambiente,
sendo depois filtrada em filtro de papel, e o resíduo lavado, por três vezes, com 5 ml de
EtOAc. O filtrado foi então extraído três vezes com 20 ml de bicarbonato de sódio 1 Me
adicionou-se à fase EtOAc, sulfato de sódio anidro, para eliminação da água. Esta mistura
foi filtrada e o solvente evaporado em rotaevaporador, sob pressão reduzida. O éster
formado foi purificado por cromatografia planar preparativa e caracterizado por CLAE
através da comparação com o éster padrão.
~co,H
HO
ác. p-cumárico N-hidroxisuccinimida
o li o
[e, li , ,__;=\ i;i-occHC~OH
o
éster succinimídico do ácido
para-cumárico
3.7.3 Preparação do 4-hidroxi-cinamoil-CoA (p-cumaroil-CoA)
Foram dissolvidos 25,2 mg de bicarbonato de sódio em 6 ml de água destilada e
nesta solução borbulhou-se N2 por 15 minutos (Stockigt & Zenk, 1975). Posteriormente
foram adicionados 23,0 mg de coenzima A (Sigma), e novamente gás N2 por 15 minutos.
Foram solubilizados em 0,5 ml de acetona 56,0 mg do éster succinimídico, e esta solução
foi gotejada sobre a solução de CoA. Foram adicionados, posteriormente, 6 ml de
acetona até formação de uma única fase, e a reação foi mantida por 24 horas.
O solvente foi evaporado sob fluxo de N2, e o precipitado formado foi centrifugado.
O sobrenadante foi utilizado nos ensaios posteriores da chalcona sintase.
31
o li o o
[e, li -o- _/\__ li r~-OCCHCH ~ /J OH + CoA-SH --- HO~CHCHCSCoA
éster succinimídico do ácido coenzima A p-cumaroil-CoA para-cu má rico
3.8 Caracterização das culturas de Piper crassinervium
Suspensões celulares com 15 a 20 dias de cultivo foram utilizadas como inóculo
para a determinação da curva de crescimento. Estas suspensões foram filtradas à vácuo,
em condições assépticas, sendo inoculados 5 g de células por frasco contendo 50 ml de
meio BC-1. Este procedimento foi realizado em triplicata, nos intervalos apresentados na
parte dos resultados, e foram mantidos em agitadores a 100 rpm.
3.8.1 Determinação do peso fresco
As células foram separadas das suspensões celulares de P. crassinervium por
filtração a vácuo e foram pesadas para determinação do peso fresco.
3.8.2 Determinação do peso seco
Para determinação do peso seco as células separadas das suspensões de P.
crassinervium foram colocadas em estufa, a 50ºC, até atingir peso constante.
3.8.3 Determinação do pH do meio de cultura
Os meios provenientes da filtração das suspensões celulares de P. crassinervium,
foram analisados quanto ao pH com auxílio de um pH-metro.
3.8.4 Determinação da atividade específica da PAL
Com base na equação da reta da curva padrão da albumina sérica bovina , em
diferentes concentrações, determinou-se a quantidade total de proteínas nas células
avaliadas desta curva. A atividade específica da PAL (nkaUmg proteína) foi calculada
como a relação entre a atividade da PAL e a quantidade de proteínas totais.
A sequência biossintética que conduz à formação das aristolactamas tem como
importante precursor a fenilalanina/tirosina, que devem sofrer uma reação de
32
descarboxilação mediada pela tirosina descarboxilase, resultando na feniletilamina. Ainda
assim, a determinação da atividade da PAL foi realizada, visando determinar algumas
condições básicas para induzir a formação de flavonóides nas suspensões celulares.
3.8.5 Quantificação das substâncias presentes no extrato de células de P.
crassinervium
A quantificação das substâncias isoladas do extrato de células foi baseada na curva
de crescimento celular. Foi feita uma nova curva nos mesmos parâmetros da descrita
previamente, a fim de se poder analisar o acúmulo das substâncias no decorrer do
crescimento das células. Foram analisados novamente oito pontos da curva, nos mesmos
intervalos de tempo da anterior, e para cada ponto foram determinados o peso fresco e o
peso seco. Neste caso, porém, as células foram congeladas a -BOºC, liofilizadas e
pesadas, para a determinação da matéria seca.
A partir destas células obteve-se os extratos em metanol referentes aos diversos
pontos da curva, que foram tratados em Sep-pak (fase reversa), filtrados e analisados por
CLAE (sistema S7). Utilizou-se como padrão interno 1 mg de ferulato de metila, que foi
extraído junto com as células, para posterior quantificação, além da curva padrão de cada
substância isolada em diferentes concentrações.
3.8.6 Quantificação das substâncias presentes no extrato do meio celular
Os meios de cultura provenientes dos oito pontos da curva também foram
analisados, a fim de se determinar a quantidade de substâncias excretadas das células.
Para esta análise, os meios, depois de separados das células (aproximadamente 40 ml),
foram submetidos à partição com EtOAc, por três vezes, juntamente com o padrão interno
ferulato de metila (1 mg). Após evaporação do solvente em rotaevaporador, sob pressão
reduzida, estes foram analisados por CLAE (sistema S7), tendo-se como referência o
padrão interno e as curvas padrão das substâncias isoladas.
3.8.7 Experimentos de eliciação com cultura de células de P. crassinervium
Estes experimentos foram realizados visando-se observar e determinar quais
metabólitos estariam envolvidos nas respostas defensivas das células, mediante
tratamento com fenilalanina, extrato de levedura e luz UV. Em princípio seriam observados
os teores relativos das aristolactamas previamente isoladas, mas eventualmente outros
33
metabólitos produzidos em níveis detectáveis poderiam ser analisados quanto à suas
estruturas.
Para estes experimentos com eliciadores foram utilizadas suspensões celulares de
21 e 28 dias. Estas suspensões celulares foram filtradas à vácuo, em condições
assépticas, fornecendo as células frescas, que foram transferidas para Erlenmeyers
autoclavados com o meio BC-1 (Tabela 7).
Tabela 7 - Experimentos de eliciação realizados com células de P. crassinervium
provenientes das suspensões celulares
Tipo de Volume do Massa de Quantidade de Idade das
experimento meio BC-1 células (g) Erlenmeyers suspensões
Fenilalanina 50 ml 5,5 9 28 dias
LuzUV 30ml 4,0 12 21 dias
Extrato de levedura 50ml 5,0 9 21 dias
Para os experimentos com fenilalanina e extrato de levedura os ensaios foram
preparados em duplicata, enquanto experimentos com luz UV, em triplicata. Em todos
experimentos foram realizados ensaios controle (branco).
Foram determinados os intervalos de tempo de tratamento, após a adição do
precursor/eliciador, de 24h, 48h e 66h para cada série de experimentos. Após cada
intervalo, as suspensões celulares de cada experimento foram filtradas a vácuo,
separando-se as células dos meios de cultura. Em seguida, as células foram congeladas a
-80 ºC e, posteriormente, liofilizadas para a determinação da matéria seca. Estas células
foram extraídas com metanol, juntamente com 1 mg do padrão interno, ferulato de metila,
e evaporadas para eliminação do solvente. Estes extratos foram submetidos à partição,
com EtOAc, sendo que a fase orgânica foi seca com Na2SO4, filtrada, concentrada e
analisada por CLAE (sistema S7).
Os meios de cultura foram submetidos à partição com EtOAc, juntamente com 1 mg
do padrão interno, e evaporados. As fases orgânicas, após secagem e concentração,
foram analisadas por CLAE (sistema S7).
34
A) Experimento com fenilalanina
Uma solução estoque de fenilalanina foi preparada numa concentração de 51 mM e
esta foi filtrada em filtro estéril, em condições assépticas. Uma alíquota de 1 ml foi
transferida para cada um dos 6 erlenmeyers contendo 5,5 g de células/50 ml de meio BC-
1. Nos 3 Erlenmeyers restantes foram adicionados 1 ml de água destilada, previamente
autoclavada, que foram utilizados como ensaios controle neste experimento. As células e
os meios provenientes deste experimento foram analisados nos intervalos de 24, 48 e 66
horas.
A análise dos extratos das células e do meio de cultura foi realizada de forma
análoga à descrita no item anterior.
B) Experimento com luz UV
Duas lâmpadas de luz UV, de 20 W cada, foram adaptadas em agitadores
(aproximadamente 50 cm de distância) e estes foram revestidos com uma cobertura para
ficarem isolados da luz branca.
Os 12 Erlemeyers deste experimento foram divididos em conjuntos, dos quais nove
Erlenmeyers foram colocados sob luz UV e três foram mantidos sob luz branca, a fim de
se obter os ensaios controle. Estes foram analisados nos intervalos de 24, 48 e 66 horas,
da mesma maneira que o ensaio anterior.
C) Experimento com extrato de levedura
Fez-se uma solução de extrato de levedura de Saccharomyces cerevisiae, 10
mg/ml, e esta foi autoclavada. Em condições assépticas, uma alíquota de 100 µL da
solução de levedura foi transferida para cada um dos 6 erlenmeyers, contendo 5,0 g de
células/50 ml de meio BC-1, enquanto nos 3 erlenmeyers restantes, ensaios controle,
foram adicionados 100 µL de água destilada autoclavada. Estes foram analisados nos
mesmos intervalos de tempo dos ensaios anteriores, seguindo o mesmo procedimento.
35
3.9 Avaliação da atividade antifúngica dos extratos e das
substâncias isoladas dos diferentes tecidos de Piper crassinervium
Os ensaios para verificação da atividade antifúngica foram realizados no Instituto
Botânico (Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo) com a colaboração da
Ora. Maria Cláudia Marx Young.
Para detecção de substâncias fungitóxicas presentes nos extratos dos diferentes
tecidos de P. crassineNium foi utillizada a técnica da bioautografia (Homans & Fuchs,
1970). As substâncias ou extratos analisados são aplicados numa cromatoplaca e esta é
desenvolvida com um sistema de solventes adequado. Após evaporação do solvente esta
placa é aspergida com uma suspensão de esporos de fungos (solução de glicose e sais),
e então incubada por um período de 2 a 3 dias, a 25ºC, em atmosfera úmida. O
aparecimento de zonas de inibição visíveis indica a presença de compostos fungitóxicos.
3.9.1 Bioautografia dos extratos e das substâncias isoladas de P. crassinervium
As substâncias isoladas neste trabalho, provenientes de folhas, suspensões
celulares e folhas de plantas micropropagadas de P. crassineNium, foram aplicadas em
uma cromatoplaca de sílica e esta foi eluída com o sistema de solventes S3. Para as
substâncias puras foram aplicadas 100 µg, enquanto que para os extratos, 500 µg. Esta
placa foi aspergida com uma suspensão de esporos de C/adosporium sphaerospermum,
em meio de glicose e sais, e incubada durante 72 horas em uma câmara úmida e escura,
a 25ºC. O padrão utilizado como referência foi a nistatina (1 µg).
36
3.1 O Dados espectroscópicos das substâncias isoladas de Piper
crassinervium
Os espectros de RMN-1 H das substâncias isoladas foram obtidos utilizando-se
espectrômetros Bruker DPX-300 e DRX- 500 (Instituto de Química-USP), operando a 300
e 500 MHz, respectivamente, enquanto que os espectros de RMN-13C foram registrados a
75 e 125 MHz, respectivamente. O deuteroclorofórmio foi utilizado como solvente, tendo o
tetrametilsilano como padrão de referência interna.
Para as análises espectroscópicas foram utlizados espectrofotômetros na região do
IV operando por FT (Nicolet e Perkin-Elmer) e espectrofotômetros de massas de baixa e
alta resolução (Hewlett-Packard e Finnigan).
3.11 Substâncias isoladas de folhas e da cultura de células de
Piper crassinervium
(1) 4'-metoxi-5,7-dihidroxi flavanona
C1sH140s
RMN-1 H , Figura 20, página 54
RMN-13C, Figura 21, página 55
Espectro de massas, Figura 22, página 56
E.M. m/z (int. rei.) 286 [M( (57), 179 (13), 134(12), 121 69), 119 (24), 91 (13)
(2) 5, 4'-dihidroxi-7-metoxi flavanona
C1sH140s
RMN-1 H , Figura 23, página 57
Espectro de massas, Figura 24, página 58
E.M. m/z (int. rei.) 286 [M( (73), 193 (29), 180 (39), 167 (100), 166 (28), 120 (44), 107
(12), 95 (22)
(3)
C15H2003
RMN-1 H , Figura 25, página 59
RMN-13C , Figura 26, página 60
Espectro de massas, Figura 27, página 61
E.M. m/z (int. rei.) 260 [Mt (3), 178 (11), 177 (100), 137 (22), 109 (4), 69 (12)
(4)
C1sH2003
RMN - 1 H , Figura 28, página 62
RMN - 13C , Figura 29, página 63
Espectro de massas, Figura 30, página 64
E.M. m/z (int. rei.) 260 [Mr (3), 242 (10), 199 (13), 177 (100), 137 (44), 109 (11), 69 (27)
(5)
C15H200s
RMN - 1H , Figura 31, página 65
RMN - 13C, Figura 32, página 66
Espectro de massas, Figura 33, página 67
E.M. m/z (int. rei.) 292 [Mr (2), 177 (35), 137 (100), 109 (11), 81 (17), 55 {12)
(6) 10-amino-2,3,4 -trimetoxi fenantreno -1-ácido carboxílico lactama {piperolactama C)
C1aH1sN04
RMN-1H: Figura 41, página 91
(7) 10- amino metil- 2,3,4- trimetoxi- fenantreno-1-ácido carboxílico lactama
C19H11N04
RMN - 1H, Figura 42, página 92
RMN - 13C, Figura 43, página 93
Espectro de massas, Figura 44, página 94
E.M. m/z (int. rei.) 323 [Mr (100), 308 (47), 250 (33), 139 (12)
37
(8) 10- amino - 2,4- dimetoxi-3-hidroxi fenantreno -1-ácido carboxílico lactama
C11H13NÜ4
RMN - 1H, Figura 45, página 95
Espectro de massas, Figura 46, página 96
E.M. m/z (int. rei.) 295 [Mf (79), 280 (45), 209 (15), 164 (12)
(9) 1 O- amino metil- 2- metoxi-3-hidroxi fenantreno -1-ácido carboxílico lactama
C11H13NÜ3
RMN - 1H, Figura 47, página 97
Espectro de massas, Figura 48, página 98
E.M. m/z (int. rei.) 279 [Mf (100), 236 (16), 193 (21), 164 (24)
38
39
4. Resultados e Discussão
O estudo químico de P. crassinervium consistiu na análise dos metabólitos
secundários de folhas e suspensões celulares desta espécie. A primeira parte do trabalho
foi baseada no isolamento e determinação estrutural dos principais constituintes
visando-se comparar as substâncias biossintetizadas neste tecido com aquelas
acumuladas na cultura de células. A análise dos constituintes do óleo essencial de folhas
foi realizado através de CG/EM, pois o procedimento para o isolamento a partir dos
extratos obtidos por maceração normalmente não permite tal tarefa, em função da alta
complexidade da mistura. Além disso, a técnica CG/EM é bastante eficiente e tem sido
utilizada como instrumento preferido em função da maioria dos constituintes em óleos
essenciais serem conhecidos e identificados pelo uso de padrões.
4.1 Substâncias isoladas do extrato de folhas de Piper
crassinervium
O extrato obtido de folhas de P. crassinervium foi inicialmente caracterizado por
CLAE (Figura 13, página 40) e por espectroscopia de RMN-1 H. Os dados no espectro de
hidrogênio indicaram a presença de substâncias contendo anéis aromáticos e metoxilas
aromáticas .. Este extrato foi submetido a etapas de purificação por cromatografia em
coluna, além de purificações por cromatografias planares com detecção no UV, resultando
no isolamento das duas flavanonas, 1 e 2, e de três hidroquinonas preniladas, 3, 4 e 5.
HO
OH O
1
OMe
OH
4
MeO
OH O
2
Data:EXFANA.O01 Method:EXFANA.M01 Ch=2 rnAbs Chrorn:EXFANA.C01 Atten:7
100
OH
OH
5
- ~ 50
OH
,._ CX) ,._ o
"! ~ CX) CX) ..... N
v C')
"": ..... ..... o (D
,ri N
o 10 20
OH O
OH
3
(D N a, a, C') ~ o C') ;;;
30 rnin
Figura 13 - Cromatograma obtido por CLAE (sistema S7) do extrato de folhas de
P. crassínervíum
BIBL OTECA INSTI I UlO DE QUf 11CA Unl\'et ;.:.~a te SJo Paulo
40
41
4.2 Identificação das substâncias isoladas do extrato de folhas de
Piper crassinervium
4.2.1 Flavanonas (1 e 2)
Os espectros de RMN-1 H das substâncias 1 e 2 (Figuras 20 e 23, páginas 54 e 57)
apresentaram absorções características de hidrogênios que compõem os anéis aromáticos
A e B além das absorções de hidrogênios metoxílicos aromáticos. Os sinais do anel
aromático A estão claramente representados em 8 6,05, para os hidrogênios 6 e 8 (d, 2,4
Hz), indicando a presença de substituintes nas posições 5 e 7, enquanto que para o anel B
os deslocamentos observados em 8 6,95 para os prótons 3', 5' (dd) e 8 7,37, para 2' e 6'
(dd) indicaram a presença de um anel aromático dissubstituído. Os espectros de RMN-1H,
para ambas substâncias, apresentaram um singleto em aproximadamente 8 3,8, referente
ao hidrogênios metoxílicos. A definição da natureza das substâncias 1 e 2 como
flavanonas (Figura 14) foi inferida através da presença de três duplos dubletos em 8 5,32-
5,39 (H-2) e 8 2, 73-3, 15 (H-3), indicando, portanto, ausência da ligação dupla entre C2 e
C3 nestas estruturas.
3'
OH O
Figura 14 - Estrutura de uma flavanona
A única diferença entre estas duas flavanonas estaria associada à posição da
metoxila, que em 1 pode ser localizada na posição C-4' enquanto que a mesma poderia
ser posicionada em C-7 na flavanona 2. De particular importância para a determinação das
flavanonas foi a fragmentação clássica retro Diels-Alder indicada pelos íons em 152/134 e
166/120 para 1 e 2, respectivamente, no espectro de massas (Esquemas 2 e 3 , páginas
43 e 44). As fórmulas moleculares foram determinadas como sendo C16H140 5, condizente
com o pico relativo ao íon molecular em m/z 286 (Figuras 22 e 24, páginas 56 e 58).
42
Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN-13C possibilitaram
confirmar as estruturas destas flavanonas 1 e 2 (Tabelas 8 e 9) além da comparação com
os dados da literatura (Bohlmann et ai., 1981; Me Cormick et ai., 1986).
Tabela 8 - Dados de RMN-1H e 13C para a substância 1
Posição 1H ( o, J em Hz) 13c
2 5,32-5,39 (dd, 13; 2,9) 79,9 / 3 2,73-2,81 (dd, 16,9; 2,9) 43,1 /
3,06-3,15 (dd ,16,9; 13) 4 --------------- 196,7 / 5
,,,- . --------------- ( -- /
6 6,05 (d, 2,4) 96_,J / 7 --------------- ,'__)
8. 6,05, (m) 95,5 / 2'/6' . 7,37 (d, 8,8) 127,7 / 3'/5' . 6,95 (d, 8,8) 114,2 /
OMe-4' 3,87 (s) 55,4 /
Tabela 9 - Dados de RMN-1H e 13C para a substância 2
Posição 1H ( õ, J em Hz) 13c
2 5,34-5,38 (dd, 13; 3,0) 78,9 3 2,75-2,81 (dd, 17,1; 3,0) 43,1
3,06-3,16 (dd, 17,1;13) 4 ----- --- 196;-7· 5 ---------------- \___ __> 6 5,98 (d, 2,4) 96,7 8 5,98 (d, 2,1) 95,4
2'/6' 7,38 (d, 8,7) 127,7 3'/5' 6,95 (d, 8,7) 114,2
OMe - 7' 3,84 (s) 55,4
OMe
HO
OH O
B ~
43
HO
OH O
m/z 179 (13%)
m/z 152 (7%) ~ D~ls-Alde,
HO
C15H140s m/z 286 (57%) M+
~etro •;ets-Atde,
POM~~
,,/,/-
1
m/z 121 (69%) m/z 134 (100%)
\
Esquema 2 - Interpretação dos dados de EM da flavanona 1
.· /'\, m/z 166 (28%)
mtz 120 (44%)
MeO
C15H140s mtz 286 (73%) M+
MeO +
OH O
m/z 193 (29%)
m/z 107 (12%)
Esquema 3 - Interpretação dos dados de EM da flavanona 2
44
45
4.2.2 Hidroquinonas preniladas (3 e 4)
Os espectros de RMN-1H e de 13C (Figuras 25, 26, 28 e 29 páginas 59, 60, 62 e 63)
das substâncias 3 e 4 apresentaram sinais de hidrogênios aromáticos, de hidroxilas
fenólicas quelatadas e de grupos prenílicos. A atribuição dos deslocamentos químicos das
cadeias laterais das hidroquinonas preniladas foi baseada no uso do programa SISCONST
(Fromanteau et ai., 1993), desenvolvido para auxiliar no processo de determinação
estrutural de produtos naturais, a partir dos deslocamentos químicos e multiplicidades
observadas no espectro de RMN-13C. O programa prevê o tipo de esqueleto mais provável
para o composto sob análise e sugere várias subestruturas, de acordo com os sinais
apresentados no espectro de RMN-13C. A partir dos diversos fragmentos sugeridos para a
cadeia lateral das hidroquinonas, selecionou-se aquele que apresentava semelhança de
deslocamentos no espectro de RMN-1 H. Desta maneira, os dados obtidos para as
substâncias 3 e 4 indicaram tratar-se de isômeros (Figura 15), com a fórmula molecular
C16H200 3_. Observou-se nos espectros de massas das substâncias 3 e 4 picos
correspondentes aos íons moleculares em m/z 260, condizente com a fórmula sugerida.
OH
3 (E) 4 (Z)
Figura 15 - Estruturas das substâncias 3 e 4
O espectro de RMN-1 H mostrou para estas substâncias absorções referentes ao
hidrogênio hidroxílico (C-2) quelatado com a carbonila em 8 12 (s), confirmando a relação
orto entre a carbonila e a hidroxila. Os sinais dos hidrogênios do anel aromático foram
observados em 8 6,84 (d, 8,9 Hz) para o hidrogênio H-3, 8 6,98 (dd, 8,9 e 3,0) para o H-4
e em 8 7,21 (d, 3,0 Hz) referente ao hidrogênio H-6.
46
encontrou mais desprotegida do que a metila na hidroquinona 4 (eis), o2,2 e o2,0,
respectivamente. Por outro lado, os deslocamentos químicos observados nos espectros
de RMN de 13C foram compatíveis com essa atribuição, especialmente em função do
pronunciado efeito de proteção y sobre o carbono metílico C-16 na hidroquinona 3, que
apresentou sinal em o 20,0. No caso da hidroquinona 4, o carbono metílico C-16
apresentou sinal em 8 26, 1. Coerentemente, nesse último caso, o efeito y de proteção é
observado para o carbono metilênico C-10 que absorve em o 34,5.
Os sinais observados nos espectros de RMN-13C das hidroquinonas 3 e 4
(Tabela 10) confirmaram estas estruturas como as apresentadas .
47
Tabela 10- Dados de RMN-1H e 13C para as hidroquinonas 3 e 4
Hidroquinona 3 Hidroquinona 4
Posição 1H ( õ, J em Hz) 13c 1H ( õ, J em Hz) 13c
1 -------------- 120,6 -------------- 120,5 2 -------------- 157,4 -------------- 157,4 3 6,84 (d, 8,9) 119,2 6,87 (d, 9,0) 119,2 4 6,98 (dd, 8,9;3,0) 123,0 6,99 (dd, 9; 2,8) 123,5 5 -------------- 147,3 -------------- 147,2
··- 6 7,21 (d, 3,0) 119,7 7,23 (d, 2,8) 120,3 7 -------------- 196, 1 -------------- 195,6 8 6,66 (s) 115,0 6,66 (s) 115,0 9 -------------- 161, 1 -------------- 161,5 10 2,20-2,30 (m) 41,6 2,58-2,64 (m) 34,5 11 2,20-2,30 (m) 26,2 2, 17-2,25 (m) 26,8 12 5, 12 (t) 124,2 5, 13 {t, 7,2) 124, 1 13 -------------- 132,8 -------------- 132,6 14 1,71{s) 25,7 1,64 (s) 25,6 15 1,63 (s) 17,8 1,62 (s) 17,7 16 2, 17 (s) 20,0 2,00(s) 26,1
OH O
OH
3 4
OH
OH C15H2003 m/z 260 (3%, eis e trans) ~
OH
OH
OH m/z260 eis (3%) trans (3%)
m/z 137 eis (44%)
e A + m/z69 eis (27%) trans (12%)
OH
OH m/z 109 eis(11%) trans (4%)
Me•
o
m/z245 OH eis (2%)
trans (3%)
H + "o
OH
m/z 177
o
eis e trans (100%)
Esquema 4 - Interpretação dos dados de EM das hidroquinonas 3 e 4
48
49
4.2.3 Hidroquinona prenilada (5)
O espectro de RMN-1 H da substância 5 (Figura 31, página 65) apresentou os sinais
dos hidrogênios aromáticos e da hidroxila fenólica quelada, de forma semelhante aos
observados para as hidroquinonas 3 e 4. Diferentemente das hidroquinonas 3 e 4, os
espectros de RMN de 1H e de 13C apresentaram sinais correspondentes a duas metilas (õ
1,28 e 1,79; 8 24,7 e 19,6), três metilenos (8 3,37-3,58; 1,74-1,91; 8 43,1, 33,2 e 24,8) e
um carbono metínico (8 4,48; 8 83, 7). O espectro de RMN-13C apresentou ainda dois
sinais relativos a carbonos carbinólicos em 8 83,7 e 79,9. Considerando que o espectro de
massas (Figura 33, página 67) apresentou o íon molecular em m/z 292, compatível com a
fórmula molecular C1sH20Os, foi proposta a estrutura contendo um endoperóxido entre os
carbonos C-10 e C-13. Através do programa SISCONST citado anteriormente, foi possível
a confirmação da cadeia lateral desta hidroquinona 5 (Figura 16).
OH
Figura 16 - Estrutura da substância 5
A ausência de sinais de uma ligação dupla sugeriu a presença do grupo CH2 ligado
ao H-9, que pôde ser comprovado pelo deslocamento do C-9 no espectro de RMN-13C,
que variou de 8 161, O para 142, O em relação aos isômeros 3 e 4, e através das constantes
de acoplamento de 13,0 Hz para os hidrogênios do grupo metileno (H-16), que apresentou
no espectro de RMN-1H os deslocamentos em 8 4,98. No espectro de RMN-13C o
deslocamento de 8 83, 7 ppm para o C-1 O sugeriu a presença do anel com um átomo de
oxigênio ligado. Os deslocamentos observados no espectro de RMN-13C (Figura 32,
página 66) confirmaram a estrutura da substância 5 (Tabela 11) .
50
Tabela 11 - Dados de RMN-1H e 13C para a substância 5
Posição 1H ( õ, J em Hz) 1;sc
1 -- 119,9 2 157,0 3 6,87 (d, 8,9) 119,3 4 7,04 (dd,8,9; 3,0) 125,3 5 -------------- 147,6 6 7,35 (d, 3,0) 115,7 7 -------------- 204,7 8 3,37-3,58 (2d, 15,5Hz) 43,1 9 ---- 142,4 10 4,48 (d, 9,6 Hz) 83,7 11 1,86 -1,91 (m) 33,2 12 1, 7 4 -1, 78 (m) 24,8 13 ---- 79,9 14 1,28 (s) 24,7 15 1,79(s) 19,6 16 4,98 (d, 13,0) 113,5
OH
5
Hidroquinonas e benzoquinonas preniladas não substituídas são comuns em
organismos marinhos. Triprenil- e tetraprenilhidroquinonas são os compostos mais
abundantes desta classe de metabólitos, enquanto que diprenil- e triprenilhidroquinonas
são os mais estudados, em virtude da variedade de suas atividades biológicas (De Rosa,
1994). Esta classe de metabólitos tem ocorrência restrita em plantas superiores (Williams
et ai., 2001) sendo esta a primeira descrição do isolamento de hidroquinonas preniladas
em espécies de Piper.
As hidroquinonas isoladas de P. crassinervium foram avaliadas quanto à sua
atividade antifúngica através da técnica da bioautografia (página 35). Entre as
hidroquinonas 3 e 4, somente o isômero E (3) mostrou-se ativo frente ao fungo
Cladosporium sphaerospermum, além da hidroquinona 5, cuja inibição foi menor em
51
relação à substância 3. Como referência utilizou-se o antibiótico poliênico nistatina, que
não exerce ação contra bactérias, mas contra fungos, aparentemente por apresentar
afinidade com as substâncias presentes na membrana do fungo (Korolkovas, 1976).
Geranilhidroquinonas e geranilquinonas estão presentes em várias espécies de
Phacelia (Hydrophyllaceae), e são responsáveis pela alergia de contato em humanos.
Verificou-se que o principal constituinte tanto de Phacelia minar como de Phacelia parryi é
a geranil-geranil hidroquinona e um constituinte minoritário, também alergênico, a 1-
oxofarnesil hidroquinona. Ambos compostos são novos em plantas superiores sendo que a
geranil-geranil-hidroquinona havia sido previamente isolada de esponjas marinhas
(Reynolds & Rodriguez, 1981) (Figura 17).
OH
geranil-geranilhidroquinona
OH O
OH
1- oxofarnesilhidroquinona
Figura 17- Exemplos de hidroquinonas alergênicas de espécies de Phacelia
Derivados simples de hidroquinonas preniladas (Figura 18) têm sido isolados de
Aplidium califomicum, um tunicado marinho. Entre elas, algumas mostraram propriedades
antioxidantes e foram sugeridas como agentes de proteção contra o câncer, devido à
semelhança estrutural das substâncias formadas, após ciclização das hidroquinonas, com
o a-tocoferol (Cotelle et ai., 1991).
52
HO
Figura 18 - Alguns exemplos de hidroquinonas isoladas de Aplidium califomicum
A partir de estudos de hidroquinonas isoladas de esponjas de lrcinia spinosula
(Dictyoceratida) ou sintetizadas, verificou-se que as substâncias conte_ndo cadeias laterais
com 5-15 átomos de carbonos, apresentaram maior potencial frente aos ensaios
antimicrobianos e de toxicidade, mostrando que o comprimento desta cadeia influenciou
na atividade. Para cadeias hidrogenadas com mais de 20 átomos de carbono observou-se
uma diminuição de atividade. Os derivados da quinona mostraram maior toxicidade do que
as hidroquinonas (De Rosa, 1994).
De esponjas de lrcinia spinosula foram isoladas duas hidroquinonas (1 e 2), sendo
que somente a substância 2 mostrou uma atividade citotóxica moderada e uma atividade
específica contra a bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus e a bactéria gram
negativa Enterobacter cloacae (Figura 19) (Mihopoulos, 1999).
53
OR1
(1) R1 = H, R2 = Me (2-octaprenil-1,4-hidroquinona)
(2) R1 = H, R2 = CH20H (2-[24-hidroxi]-octaprenil-1,4-hidroquinona)
Figura 19 - Estruturas das hidroquinonas isoladas de /. spinosula
Com base nos ensaios de citotoxicidade dos derivados sintéticos destas
hidroquinonas, verificou-se a necessidade de grupos hidroxílicos livres, tanto no anel
aromático como na cadeia lateral dos compostos. A oxidação das hidroquinonas a
quinonas também aumentou a atividade contra E coli. As quinonas podem ser
consideradas tóxicas aos organismos aeróbios devido ao seu poder de reação com a
glutationa reduzida e com grupos -SH de proteínas, bem como pelo potencial redox que
as reduzem a semi-quinonas (Halliwell & Gutteridge, 1999).
Estes resultados confirmam os efeitos antimicrobianos de moderados a fortes, e
mostram que tanto a oxidação das hidroquinonas como a hidrogenação das ligações
duplas da cadeia lateral aumenta o efeito farmacológico das moléculas (Mihopoulos,
1999).
De acordo com os relatos sobre hidroquinonas, verificou-se que as substâncias
isoladas 3 e 4 enquandraram-se no perfil descrito quanto ao número de carbonos na
cadeia lateral, o que pode justificar a atividade antifúngica apresentada por estas
substâncias.
J /
,/ /1.
12
1
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10
9
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4.3 Substâncias identificadas
crassinervium
4.3.1 Análise qualitativa e quantitativa
68
no óleo volátil de Piper
A família Piperaceae tem sido fonte de vários estudos sobre óleos essenciais.
Espécies de P. gaudichaudianum, P. regnellii, P. auritum, P. peltatum, P. lolot, P. pierrei,
P. acutifolium, P. aduncum e P. cernuum foram previamente estudadas quanto à
composição de seus componentes químicos presentes (Andrade et ai., 1998; Dung et ai.,
1996; Leclerq et ai., 1997; Lognay et ai., 1996; Maia et ai. , 1998; Martins et ai., 1998; Pino
et ai., 1998). Para P. crassinervium esta é a primeira vez que a composição química de
seu óleo essencial foi determinada. Os resultados obtidos da análise qualitativa e
quantitativa do óleo volátil de P. crassinervium são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12 - Composição relativa dos constiutintes do óleo volátil de P.
crassinervium
Compostos % IK Compostos Monoterpenos hidrocarbonados Sesquiterpenos oxigenados limoneno 0,5 1017 bulnesol mirceno 0,2 978 cx-cadinol cx-pineno 3,0 923 t-cadinol 13-pineno 4,2 965 1-epi-cubenol
1-10-epi-cubenol Monoterpenos oxigenados espatulenol linalol 1,6 1087 l3-eudesmol
y-eudesmol Sesquiterpenos guaiol hldrocarbonados aromadendreno 1,4 1421 globulol 6-cadineno 3,8 1509 epi-globulol y-cadineno 1,2 1500 cx-muurolol ~-cariofileno 9,9 1401 i:-muurolol+cubenol a-copaeno 0,9 1357 E-nerolidol 13-elemeno 0,6 1373 óxido de cariofileno a-humuleno 0,9 1436 óxido de humuleno 1 germacreno D 10, 1 1467 valerianol a-muuroleno 0,8 1485 y-muuroleno 3,9 1461 Outros viridifloreno+biciclogermacreno 4,4 1482 6-metil-5-hepten-2-ona
TOTAL(%)
69
% IK
2,4 1653 6,6 1640 1,5 1619 1,5 1610 1,0 1607 1,2 1561 2,3 1635 1,9 1614 7, 1 1581
2,3 1568 0,7 1575 1,5 1630 3,6 1626 6,4 1548 2,3 1566 0,9 1599 0,8 1643
7,5 973
98,7
O óleo de P. crassinervium apresentou 14,3% de monoterpenos e 85,7% de
sesquiterpenos em sua composição. O principal monoterpeno identificado foi 13-pineno
(4.2%). Como principais sesquiterpenos hidrocarbonados foram identificados o 13-
cariofileno (9,9%) e germacreno D (10,1%), sendo estes os constituintes principais do
óleo. cx-cadinol (6,6%} e guaiol (7, 1%) foram observados como os principais
sesquiterpenos oxigenados. No total foram identificados 36 compostos, que
corresponderam a 98,7% da composição do óleo.
Enquanto que para P. crassinervium os sesquiterpenos são os principais
constituintes do óleo volátil de suas folhas (85,7% de sua composição), para Piper
capense, Piper nigrum e Piper umbellatum verificou-se a predominância de monoterpenos,
51, 7%, 62,2% e 59,6%, respectivamente, nos óleos obtidos de suas partes aéreas.
Apesar de estas três espécies apresentarem em comum uma alta percentagem de
70
monoterpenos na composição de seus óleos, observou-se variação dos constituintes
principais. í3-pineno (32,5%) e í3-cariofileno (12,6%) foram os principais compostos do óleo
volátil de P. capense. Os constituintes mais importantes no óleo de P. nigrum foram
limoneno (18,8%), í3-cariofileno (15,4%), sabineno (16,5%) e f3-pineno (1 O, 7%). O óleo de
P. umbellatum foi caracterizado pela sua alta concentração de f3-pineno (26,8%), a-pineno
(17,6%) e E-nerolidol (12.4%) em sua composição (Martins et ai., 1998).
Os óleos voláteis obtidos das folhas e galhos de Pothomorphe umbellata e
Pothomorphe peltata, outro gênero da família Piperaceae, também foram investigados
quanto à composição de seus constituintes. Enquanto germacreno D foi identificado como
o constituinte majoritário de P. umbellata (27,4% da composição do óleo), para P. pe/tata
í3-cariofileno, 39,0%, foi classificado como composto principal (Luz et ai., 1999).
Desta maneira verificou-se que a composição das substâncias presentes nos óleos
voláteis varia de acordo com as espécies estudadas. A diversidade estrutural dos
compostos acumulados pode estar relacionada com a facilidade de condensação das
unidades isoprênicas e subsequentes dimerizações, ciclizações, rearranjos e oxidações
(Limberger, 1998).
A utilização dos óleos voláteis das plantas aromáticas provém de longo tempo. Há
mais de 2000 anos, na medicina chinesa, o uso destes óleos já esteve relacionado à suas
propriedades bactericidas, sendo que atualmente são usados como aromatizantes,
edulcorantes e odoríferos na indústria alimentícia e farmacêutica. As substâncias voláteis
que compõem os óleos de plantas aromáticas também apresentam funções ecológicas
como atrativos de insetos e animais polinizadores, além de atuarem como sistema de
defesa frente a predadores (Limberger, 1998).
71
4.3.2 Estrutura química dos constituintes identificados no óleo volátil de P,
crassinervium
aromadendreno
H /'-.....
a-cadinol
1, 10-epi-cubenol
bulnesol
- H
/'-.....
t-cadinol
13-elemeno
H 1 1 1
/'--.....
õ-cadineno
13-cariofileno
espatulenol
y-cadineno
OH~
1-epi-cubenol
13-eudesmol
1ouaqn~ 1010Jnnw-g f0f0Jnnw-n
oua10Jnnw-,t oua10Jnnw-n OU~J!W euo-i-ualda4-g-1!l8W-9
IOfBU!f OU9UOW!f
10,enô 0 OU8J~8WJ8Ô 1owsapna-l
7l
óxido de cariofileno óxido de humuleno a-pineno J3-pineno
OH
valerianol viridifloreno biciclogermacreno
4.4 Estudo de etapas biossintéticas
4.4.1 Doseamento da PAL em folhas intactas e plantas propagadas de P.
crassinervium
A fenilalanina amônia-liase é uma das enzimas mais estudadas em relação ao
metabolismo secundário em plantas, devido a sua rápida resposta a uma grande
variedade de estímulos, em pequenos intervalos de tempo, além de ser relativamente
estável, permitindo sua análise.
A PAL catalisa a eliminação da amônia, a partir da fenilalanina, para produzir o
ácido trans-cinâmico (Figura 34) (Jones, 1984). A atividade desta enzima pode ser
detectada medindo-se a formação do ácido cinâmico, seja por técnicas
espectrofotométricas ou por cromatografia líquida de alta eficiência (Camm & Towers,
1977).
74
+ (Y):COOH H +
2
PAL ~COOH
V
Figura 34 - Reação de desaminação da fenilalanina catalisada pela enzima PAL
O ácido cinâmico produzido é intermediário de uma grande variedade de produtos
como alcalóides, flavonóides, lignanas e ligninas.
A determinação da atividade específica da enzima PAL para folhas intactas e os
diversos tecidos (folhas, caules e raízes) de plântulas micropropagadas de P.
crassinervium foi realizada segundo protocolo apresentado na página 26. A partir da curva
padrão da albumina sérica bovina determinou-se a quantidade de proteínas totais para os
tecidos analisados de P. crassinervium (Tabela 13).
Tabela 13 - Teores de proteínas solúveis obtidos dos tecidos analisados de
P. crassinervium
Tecidos analisados Concentração de Atividade da PAL Atividade específica proteínas (µg/ml) (pKat/mL) da PAL (nKat/mg de
proteína) Folhas adultas 15,93 5,03 0,32
Folhas de plantas 2,46 0,68 0,28 propagadas
Caules de plantas 1, 10 1, 15 1,05 propagadas
Raízes de plantas 0,43 0,69 1,60 propagadas
De acordo com os dados obtidos verificou-se que a atividade específica da enzima
PAL variou de 0,28 a 1,60 nKat/mg de proteína para os diferentes tecidos de P.
crassinervium. Para folhas intactas e propagadas a atividade mostrou-se bem próxima,
embora as análises por CLAE (sistema S7) tenham revelado um maior acúmulo de
metabólitos no tecido intacto. Comparando-se os dados obtidos dos extratos de folhas e
caules propagados de P. crassinervium observou-se uma concentração elevada de
substâncias nos caules, podendo indicar uma maior atividade da PAL nestes tecidos,
embora um aumento na atividade desta enzima não esteja correlacionado diretamente
com a produção de compostos fenilpropanoídicos específicos (Jones, 1984).
75
Folhas de Piper regnellii, uma outra espécie da família Piperaceae, avaliadas
quanto à atividade da enzima PAL, apresentaram aproximadamente metade do valor
encontrado para P. crassinervium, O, 18 nKaUmg de proteína (Sartorelli, 2000), enquanto
que para culturas de células de Picea abies a atividade da enzima variou de 0,01 a 0,05
nKaUmg (Messner et ai., 1991) indicando que a variação da atividade enzimática depende
do tecido e da espécie analisada.
4.4.2 Doseamento da chalcona sintase em folhas de Piper crassinervium
A estrutura básica dos flavonóides C6-C3-C6 é proveniente de uma biossíntese
mista, que tem como precursores malonil-CoA e 4-cumaroil-CoA, ambos derivados de
carbohidratos (Mann, 1994). O malonil-CoA é sintetizado a partir da reação do acetil-CoA
com dióxido · de carbono, enquanto que a formação do 4-cumaroil-CoA envolve a via do
chiquimato/arogenato, rota esta que origina os aminoácidos aromáticos tais como
fenilalanina e tirosina em plantas superiores. A desaminação da fenilalanina, catalisada
pela fenilalanina amônia-liase, fornece o ácido cinâmico, que é hidroxilado pela cinamato
4-hidroxilase para formação do ácido 4-cumárico, que pela ação da 4-cumarato:CoA
ligase origina o 4-cumaroil-CoA (Hahlbrock & Grisebach, 1979; Heller, 1988).
O primeiro intermediário no caminho dos flavonóides, a 4,2',4',6'-
tetrahidroxichalcona (naringenina chalcona), é formado pela condensação de Claisen de p
cumaroil-CoA com três moléculas de malonil-CoA, através da ação da chalcona sintase. A
transformação da chalcona pela ação da enzima chalcona isomerase fornece o primeiro
flavonóide, a naringenina, classificada como flavanona (Figura 35) (Grisebach, 1985;
Heller, 1988).
acetil-CoA
a
CoAS
o 4-cumaroil-CoA
fi 3HOOC-CH 2-C-SCoA
malonil-CoA
OH OH
HO
o ác. 4-<:umárico
~OH
HOYYOH,,_.,,.lv w OH O
4,2',4',6'-tetrahidroxichalcona
OH O
naringenina
OH
HO
o ác. cinâmico
76
l chiquimato
! arogenato
l -""'b'-- fenilalanina
Enzimas:
a: Acetil-CoA carboxilase b:PAL e; cinamato 4-hidroxilase d: 4-cumarato:CoA ligase e: chalcona sintase f: chalcona isomerase
Figura 35 - Biossíntese do flavonóide naringenina, segundo Heller (1988)
77
O estudo fitoquímico realizado com plantas intactas de P. crassinervium levou ao
isolamento de duas flavanonas, que pertencem à classe dos flavonóides. Com o objetivo
de correlacionar a presença dessas flavanonas com a atividade enzimática da chalcona
sintase foi necessário a realização do doseamento desta enzima nas folhas de P.
crassinervium.
A partir da análise prévia da naringenina para verificação do tempo de retenção
(aproximadamente 5,2 min) por CLAE, confirmou-se pela injeção do extrato da incubação,
a presença da chalcona sintase em folhas de P. crassinervium. Desta maneira concluiu
se que as flavanonas produzidas por folhas de Piper foram originadas pela ação desta
enzima, presente nestes tecidos. Com base na curva padrão da naringenina e com os
dados obtidos nos ensaios realizados com folhas, verificou-se a atividade específica da
enzima CHS como sendo 1,25 x 1 o-s nkaUmg.
Na espécie Daucus carota, pétalas brancas e coloridas foram estudadas quanto à
atividade da CHS, visto que esta espécie acumulava substâncias com o esqueleto básico
do flavonóide. Enquanto que pétalas brancas não mostraram atividade frente a esta
enzima, em flores coloridas a atividade enzimática da chalcona sintase variou entre
2 x 10-4 a 1 x 10-3 nKaUmg (Hinderer et ai. , 1983).
78
4. S Caracterização da curva de crescimento para culturas de
células de Piper crassinervium
4.5.1 Densidade do inóculo
O crescimento da cultura de células está associado, entre outros fatores, com a
concentração inicial de inóculo, que depende da espécie vegetal estudada. Para que
ocorra a divisão celular, um número mínimo de células deve estar presente no meio. Para
células de P. crassinervium foram selecionados 5 g de inóculo para 50 ml de meio, visto
que com quantidades menores ou maiores que esta massa, não houve duplicação da
densidade celular no intervalo de tempo selecionado. Em culturas de Psychotría
carthagenensis, por exemplo, a quantidade de inóculo ideal variou de O, 7 a 1,5 g, em 25
ml de meio (Lopes et ai., 2000), enquanto que para células de Piper cemuum , 5 g de
células frescas foram inoculadas em 50 ml de meio de cultura (Costantin, 2001 ).
4.5.2 Determinação do peso fresco e seco em suspensões celulares de P.
crassinervium
O aumento do número de células, volume ou massa celular em uma cultura
caracteriza o seu crescimento, em um intervalo de tempo selecionado denominado ciclo
de crescimento celular, que compreende algumas fases (Dodds & Roberts, 1995). Neste
trabalho, a medida do crescimento celular foi realizada com base na obtenção da matéria
fresca e seca, através da separação das células, do meio celular, por filtração à vácuo.
O crescimento das culturas de células de P. crassínervíum em suspensão,
determinado de acordo com as variações do peso fresco e seco (Figura 36), revelou uma
curva com um ciclo de 26 dias. A fase lag, período anterior à divisão celular, foi observado
durante os oito primeiro dias da curva, seguido de um aumento exponencial da massa
celular por 18 dias. A fase estacionária, período em que as células não se dividem,
constituiu-se de 8 dias e a decrescente, onde existe um esgotamento de nutrientes do
meio e consequentemente a morte celular, perdurou por 22 dias.
Comparando-se as curvas de peso fresco e seco das suspensões celulares de P.
crassinervium, verificou-se que o crescimento máximo da matéria fresca foi obtido 8 dias
após a matéria seca atingir seu maior valor, de modo que esta diferença pode ser
atribuída ao alongamento e aumento do volume celular, segundo Figueiredo (1992).
79
Com base nos dados obtidos da cuNa de crescimento para esta espécie de Piper,
fez-se as subculturas das suspensões celulares em inteNalos regulares de 22 a 25 dias,
no período coincidente ao final da fase exponencial, com a finalidade de se manter o
metabolismo celular constante. A subcultura tem por objetivo a manutenção da cultura de
células, de modo que possam ser minimizadas as possíveis variações do metabolismo
celular (Dodds & Roberts, 1995).
Considerando-se a matéria fresca na cuNa de crescimento, a fase lag para culturas
de células de Psychotria carthagenensis durou por 5 dias, sendo que a quantidade de
células aumentou 4 vezes em torno de 12 dias. Células de Piper cernuum tiveram a
mesma duração da fase lag, com um aumento triplicado da densidade celular em torno de
21 dias (Costantin, 2001 ). Com base nos dados apresentados verificou-se que células de
P. crassinervium apresentaram um maior período para atingir o valor máximo de células,
que correspondeu a 34 dias .
12
..--. 10 O) .__...
2
-e- matéria seca -•- matéria fresca
1,0
0,8
~ m
0,6 CD-:::::! . m (/) CD
0,4 fJ ..--. co .__...
0,2
o -+------.-~---,.---.--,----r---r-----r---.----.---r--r------1 0,0
o 10 20 30 40 50 60
Tempo (dias)
Figura 36 - CuNa de crescimento de suspensões celulares de P. crassinervium
80
4.5.3 Determinação dos valores de pH do meio de cultura
A obtenção do perfil de variação do pH durante a curva de crescimento de uma
suspensão celular é bastante importante para auxiliar na justificativa dos eventos
metabólicos, especialmente no que tange à questão da compartimentalização de
metabólitos secundários.
Em geral, o emprego da cultura de células torna-se possível entre os valores de pH
4 a 7,5. As atividades metabólicas das culturas de células determinam o valor do pH, além
da quantidade de citólise causada pela ação mecânica. Certos componentes presentes no
meio de cultura (amônia, nitrato, fosfato) apresentam tanto a função de nutrientes como de
tamponante destes sistemas celulares (Endress, 1994).
Embora o pH afete o crescimento celular, bem como a quantidade de substâncias
produzidas, poucos estudos têm sido realizados sobre sua função na cultura de células
(Stafford et ai., 1991).
As suspensões celulares de P. crassinervium tiveram seu pH ajustado em 5,8
antes da inoculação. Durante a fase lag este valor variou entre 6,2 e 6,5. Com o
crescimento celular, entre os dias 9 e 26, observou-se que o pH oscilou entre 6,2 e 6,6,
aumentando linearmente até 7,7 no final da fase decrescente (Figura 37). O aumento do
pH nesta última fase da cultura de células de P. crassinervium pode estar associado ao
acúmulo dos alcalóides sintetizados nesta fase do ciclo, que acabam por aumentar este
valor.
Culturas de células de Tabernaemontana elegans (Apocynaceae) mostraram um
decréscimo no valor do pH de 5,0 para 4,6 na fase /ag, aumentando gradualmente até
atingir o valor de 6,3 no decorrer da curva de crescimento (van der Heidjen, 1989). Para
culturas de Psychotria carthagenensis o pH do meio aumentou de 6,3 para 7,0 em dez
dias de cultura, após um decréscimo inicial ao pH 4,3 (Lopes et ai., 2000). Cultura de
células de Piper cernuum também apresentou Lim decréscimo do pH na fase lag, de 5,3
para 4,9, permanecendo em 5,0 durante 13 dias. Nas fases finais da curva houve um
aumento de 1,8 unidades de pH, sugerindo a excreção de aminas aromáticas sintetizadas
por estas células neste período (Costantin, 2001 ).
Desta maneira pode-se concluir que a variação do pH em culturas de células de
diversas espécies mostrou-se diferente, sugerindo que este parâmetro depende do meio
de cultura assim como das espécies envolvidas.
10
9
8
7
6
I o. 5
4
3
2
o 10 20 30 40 50 60
Tempo (dias)
Figura 37 - Variação do pH em função do crescimento celular
4.5.4 Determinação da atividade específica da PAL em células de P. crassinerivum
81
A determinação da atividade da PAL, para as células provenientes da curva de
crescimento, foi realizada através do cálculo das razões da área do ácido cinâmico pelo
padrão interno metilumbeliferona, a partir dos cromatogramas obtidos por CLAE (sistema
S7).
A atividade específica da PAL foi calculada segundo a equação mostrada na página
27. O fator de conversão R para este ensaio com células foi de 0,009, obtido através da
curva padrão do ácido cinâmico.
A partir da quantidade total de proteínas solúveis (Bradford, 1976) obtida para as
células durante a curva de crescimento determinou-se a atividade específica da PAL
(Figura 38), tendo como referência a curva padrão da albumina sérica bovina.
-e- proteínas totais -•- atividade específica da PAL
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10
o 10 20 30 40 50 60
Tempo (dias)
Figura 38 -Atividade específica da PAL e quantidade de proteínas totais em função do
crescimento celular
82
A partir dos dados obtidos verificou-se que o perfil da curva da atividade enzimática
foi semelhante ao da curva de crescimento de células de P. crassinervium (Figura 36),
mostrando que o aumento linear da atividade específica da PAL esteve relacionado com a
divisão celular que ocorreu na fase exponencial (entre os dias 16 e 34). O máximo valor
alcançado foi observado no final da fase linear (27,86 nKat/mg proteína), que coincidiu
com a concentração máxima de proteínas para estas células (0,92 mg/ml). Em
aproximadamente 41 dias, início da fase decrescente, houve uma diminuição da atividade
enzimática da PAL, atingindo seu menor valor, 9,09 nKat/mg proteína, no final da curva de
crescimento.
Para células de Piper cernuum o máximo valor obtido para a atividade enzimática
foi 1,60 nKat/mg de proteína, nos primeiros dias da fase exponencial, coincidindo com o
início da divisão celular (Costantin, 2001 ).
83,
4.6 Cultura de células de Piper crassinervium
4.6.1 Substâncias isoladas do extrato de células
O extrato obtido das células, provenientes das suspensões celulares de P.
crassinervium, foi caracterizado por CLAE (Figura 39) e por RMN de 1 H. Os sinais obtidos
no espectro de hidrogênio, indicaram a presença de substâncias aromáticas. O extrato foi
submetido à purificação, por CPP e CLAE, resultando no isolamento de quatro
substâncias que foram determinadas como sendo alcalóides do tipo aristolactamas (6, 7, 8
e 9).
MeO MeO
MeO MeO
6 7
HO
MeO
8 9
Data:CEL259A.D01 Method:CEL259A.M01 Ch=2 mAbs Chrom:CEL259A.C01 Atten:7
HO HO
100 MeO
p.i. 1 50 \~ '-:6. IO o ('! ..... ..... ,,,
a, 00 ..... ~
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MeO
MeO
-~~ 1 N-Me MeO
1 ~
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1 o ,;1; ,_ 'SI" C\i ,,,
30 min
Figura 39 - Cromatograma obtido por CLAE do extrato de células provenientes das
suspensões celulares de P. crassineNium
84
4.6.2 Identificação das substâncias isoladas do extrato de células provenientes das
suspensões celulares de P. crassinervium
As aristolactamas isoladas de células provenientes de suspensões celulares de P.
crassineNium possuem o esqueleto básico mostrado abaixo (Figura 40), diferindo entre si
nos grupos substituintes ligados.
R1
7
Figura 40 - Esqueleto das aristolactamas isoladas
85
No espectro de RMN-1 H da substância 6 (Figura 41, página 91) observou-se a
presença de três grupos metoxílicos, singletos, em 8 4,0, 4,2 e 4,5 ppm, além dos sinais
em o 7, 18 (s, H-9), o 7,5 (H-6 e H-7, m), o 7,8 (H-8, m) e o 9,2 (H-5, m). Os sinais dos
hidrogênios metoxílicos absorvendo em campo mais baixo indicaram que os mesmos
estavam desprotegidos por uma carbonila ou que se encontraram fora do plano de
conjugação do anel aromático. Este conjunto de dados possibilitou identificá-la como
sendo a piperolactama C, uma aristolactama previamente isolada de Piper acutisleginum
(Olsen et ai., 1993).
Os dados obtidos no espectro de RMN-13C confirmaram a estrutura de 6 (Tabela
14). O espectro de massas apresentou o pico correspondente ao íon molecular em m/z
309, condizente com a fórmula molecular C1sH1sNO4.
Tabela 14 - Dados de RMN-1H e de 13C observados para a substância 6
Posição 1H,õ 13c, 8
1 ------------ 167,2 2 ------------ 157,3 3 ------------ 154,3 4 ------------ 146,4 4a ------------ 116,5 4b 126,6 5 9, 19 (m) 126,6 6 7,52-7,58 (m) 125,9 7 7,52-7,58 (m) 126,8 8 7,82 (m) 128,7
8a 133,3 9 7,18(s) 106, 1 10 ------------ 135,5
MeO-2 4,52 (s) 63,0 MeO-3 4,20(s) 61,6 MeO-4 4,00 (s) 60,9
OMe
MeO
MeO
6
86
O alcalóide 7 possui o mesmo esqueleto de 6, além de apresentar os três grupos
metoxilas nas mesmas posições. O que diferiu estas duas substâncias foi a presença de
um grupo metila ligado ao nitrogênio, na estrutura de 7, que pôde ser observado no
espectro de RMN-1 H (Figura 42, página 92), através do sinal em o 3,48, e o 26,4 no
espectro de RMN-13C (Figura 43, página 93, Tabela 16). O íon molecular em m/z 323
mostrou-se condizente com a fórmula molecular C19H17N04.
Estruturas que apresentam este tipo de esqueleto têm sido descritas na literatura
como aristolactamas. O primeiro alcalóide natural substituído com o grupo metila no
nitrogênio, 4-hidroxi-3-metoxi-N-metilaristolactama, foi isolado em 1992, de partes aéreas
de Piper ribesioides (Ruangrungsi et ai., 1992).
Até o momento não se tem descrita a ocorrência da substância 2,3,4-trimetoxi-N
metil-aristolactama (7) como produto natural ou . sintético, tratando-se portanto de uma
substância inédita.
87
Tabela 15 - Dados de RMN-1H e de 13C para a substância 7
Posição 1H,õ 13c, õ 1 165,7 2 ------------ 156,8 3 154,0 4 ------------ 146,4
4a 116, 1 4b ------------ 126,6 5 9, 18 (m) 126,5 6 7,54 (m) 125,7 7 7,54 (m) 127,0 8 7,85 (m) 128,7
8a ------------ 133,4 9 7,00(s) 104,5 10 136,6
MeO-2 4,54 (s) 63,0 MeO-3 4, 18 (s) 61,6 MeO-4 3,99 (s) 60,8 Me-N 3,49 (s) 26,4
OMe
MeO
MeO
7
Através dos sinais observados no espectro de RMN-1H para os alcalóides 8 e 9
(impuros), verificou-se que se tratavam de aristolactamas, por apresentarem os
deslocamentos químicos parecidos com as substâncias 6 e 7. As substâncias 8 e 9
tiveram suas fórmulas moleculares determinadas como sendo C11H13NÜ4 e C15H13NO4,
respectivamente, de acordo com os picos relativos aos íons moleculares em m/z 295 e
279 (Figuras 46 e 48, páginas 96 e 98).
No espectro de RMN-1 H da substância 8 (Figura 45, página 95) observou-se os
deslocamentos de o 4,5 e 4, 1 para as metoxilas nas posições 2 e 4 respectivamente,
enquanto para a aristolactama 9 (Figura 47, página 97), observou-se apenas uma metoxila
em õ 4, 1, posição 2, vizinha a um grupo hidroxila, na posição 3, o que explica este valor
88
menor de deslocamento. Este alcalóide 9 também apresenta um grupo metila ligado ao
nitrogênio, observado pelo deslocamento em õ 3,5 aproximadamente (Tabela 16).
Tabela 16 - Dados de RMN-1H para as substância 8 e 9
Posição 1H, õ (8) 1H, õ (9) 1 2 ------·------ ------------3 ------------4 ------------ 7,82 (s)
4a 4b 5 9, 19 (m) 9,24 (m)
6/7 7,55 (m) 7,56 (m) 8 7,84 (m) 7,81 (m)
Ba 9 7,19 (s) 7,07 (s) 10
MeO-2 4,54 (s) 4, 13 (s) MeO-3 ------------MeO-4 4,07 (s) Me-N ---------- 3,49 (s)
OMe OMe
HO HO
MeO
8 9
Espécies de Piper produzem uma grande variedade de produtos naturais, sendo
que muitos destes apresentam propriedades medicinais. Os alcalóides são raros, mas
foram descritos entre as substâncias isoladas neste gênero (Olsen et ai. , 1993). As
aristolactamas pertencem a um pequeno grupo de alcalóides, encontrados principalmente
na família Aristolochiaceae, sendo responsáveis pela origem do nome desta classe de
compostos, mas também têm sido relatadas a partir de espécies pertencentes às famílias
Annonaceae, Menispermaceae e Monimiaceae (Desai et ai., 1990).
89
O interesse por esta sub-classe de alcalóides é devido à diversidade de atividades
biológicas, mas cabe ressaltar a potente atividade inseticida apresentada pelas
aristolactamas. A relação estrutural entre o ácido aristolóquico (Figura 49), um
nitrocomposto bastante tóxico (Chen & Zhu, 1987), as aristolactamas e os alcalóides
dioxoaporfínicos e isoquinolínicos têm motivado diversos estudos biossintéticos.
o
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Figura 49 - Estrutura do ácido aristolóquico
O isolamento de alcalóides dioxoaporfínicos de diferentes espécies vegetais
sugeriu que estes podem ser originados pela oxidação de alcalóides aporfínicos e
funcionam como intermediários na biossíntese de aristolactamas. A conversão da
pontevidrina nas aristolactamas ocorre in vitro e pode estar relacionada com o rearranjo do
ácido benzílico seguido da perda do carbono (Figura 50) (Chen & Zhu, 1987).
OH o
HO COO- MeO MeO MeO o MeO
N-Me
MeO MeO MeO - -MeO MeO MeO
MeO OMe OMe OMe
OMe
pontevidrina
Figura 50 - Formação de aristolactamas a partir de alcalóides dioxoaporfínicos in vitro
(Chen & Zhu, 1987)
90
Plantas intactas e culturas de células de P. crassínervíum mostraram um acúmulo
diferente de metabólitos em seus tecidos. Enquanto folhas de plantas acumularam
flavanonas e hidroquinonas preniladas, nas suspensões celulares desta espécie foram
observadas somente aristolactamas. O estudo de tecidos diferenciados e não
diferenciados de Píper cernuum, indicou também diferentes composições. De folhas de
plantas foram isolados fenilpropanóides, ácido 3,4-dimetoxi-di-hidrocinâmico e cubebina,
sendo que as suspensões celulares acumularam tiramina e dopamina. Do ponto de vista
biossintético as substâncias acumuladas seguiram diferentes rotas metabólicas. Os
fenilpropanóides foram formados através da conversão da fenilalanina a ácido cinâmico
pela PAL, e as substâncias acumuladas nas células foram originadas pela descarboxilação
da tirosina, catalisada pela tirosina descarboxilase (Costantin, 2001 ).
A comparação destas duas espécies de Píper sugeriu que as aristolactamas
poderiam ser formadas a partir de rotas metabólicas mais avançadas, a partir da
dopamina, e que em P. crassínervíum estariam presentes as enzimas responsáveis por
essa formação. Observa-se na Figura 51 uma proposição de biossíntese para as
aristolactamas isoladas.
HO
OH TYDC
L-tirosina tiramina
HO
-- HO
HOrn --- j // NH2
HO
--
dopamina
MeO
MeO
R=H (piperolactama C) (alcalóide 6)
R=Me (alcalóide 7)
Figura 51 - Proposta de biossíntese para as aristolactamas isoladas de suspensões
celulares de P. crassínervíum
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4. 7 Quantificação das substâncias isoladas do extrato de células
A partir do estabelecimento de uma nova curva celular, nos mesmos parâmetros da
descrita anteriormente, foram quantificados os dois alcalóides, 6 e 7, presentes tanto no
meio como nas células das suspensões celulares.
Após determinação da matéria fresca e seca, as células e os meios celulares
correspondentes aos intervalos da curva foram analisados por CLAE (sistema S7), com o
objetivo de se obter as áreas relativas de cada alcalóide em relação ao padrão interno,
para posterior quantificação. Como referência uilizou-se a curva padrão dos alcalóides
isolados.
A equação abaixo mostra como foi determinada a quantidade de cada alcalóide,
tanto para as células como para o meio proveniente das suspensões celulares de Piper
crassinervium.
Quantidade do alcalóide = (R áreas x quantidade p.i.) / R'
Onde,
R áreas = razão entre a área do alcalóide / área do padrão interno
quantidade do p. i. = 1 mg
R' = inclinação da reta (proveniente da curva padrão de cada alcalóide)
para o alcalóide 6, R = 0,00319
para o alcalóide 7, R = 0,0045
A quantidade encontrada de cada alcalóide foi multiplicada por dois, pois as
amostras analisadas por CLAE tinham um volume final de 2 ml. Estes valores, em
miligramas, foram relacionados à quantidade de células secas, em gramas, e com base
nestes resultados foram determinadas as quantidades de cada alcalóide por grama de
células secas (Figura 52). Para os meios provenientes das suspensões celulares, partiu
se do mesmo cálculo, mas a quantidade do alcalóide foi relacionada com 50 ml de meio,
volume este usado para a preparação das suspensões celulares na curva de crescimento
(Figura 53).
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Idade das suspensões celulares (dias)
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Figura 53 - Quantificação dos alcalóides 6 e 7 no meio
BIBLIOTECA INSTITUTO DE cu;'.\,!CA U11ivors1Jdd8 de São PaLJlo
100
101
A análise dos principais constituintes produzidos pelas células de P. crassinervium
indicou a produção dos alcalóides 6 e 7, metabólitos não isolados da planta diferenciada.
Nas células a concentração observada para o alcalóide 6 variou entre 1,21 e 55,89 mg/g
de células secas enquanto que para o meio de O a 0,60 mg/ml de meio. Para o alcalóide
7, presente em maior quantidade nas suspensões celulares, verificou-se a variação de
38,78 a 123,91 mg/ g de células secas e para o meio celular entre 0,12 e 1,01 mg/ml de
meio. A variação da concentração dos alcalóides 6 e 7 não mostrou relação com a
atividade da PAL (Figura 38, página 82). Enquanto a atividade específica da enzima PAL
aumentou linearmente até o quinto dia da curva, final da fase exponencial, para os
alcalóides pôde-se perceber um perfil totalmente diferente. No valor máximo da atividade
enzimática existia uma quantidade elevada do alcalóide 7 (100,97 mg), e uma pequena
quantidade da substância 6 (7,44 mg). Quando a enzima atingiu seu menor valor, fase
descrescente da curva de crescimento, obteve-se a quantidade máxima do alcalóide 7
(123,91 mg) e somente 1,92 mg do alcalóide 6. A correlação negativa entre a atividade da
PAL e os alcalóides sintetizados pode estar associada às rotas biossintéticas, indicando
que as substâncias acumuladas nas suspensões celulares de P. crassinervium são
originadas a partir da tirosina, conforme a biossíntese proposta na Figura 51 (página 90).
102
4.8 Experimentos com fenilalanina, luz UV e extrato de
levedura
Após cada intervalo de tempo estabelecido para análise das células e dos meios
provenientes das supensões celulares (24, 48 e 66 h), foram obtidas as quantidades de
células frescas e secas, conforme descrito anteriormente. Tanto as células como os meios
provenientes destes experimentos, foram analisados por CLAE (sistema S7), juntamente
com o padrão interno. Com base nesses resultados foram calculadas as quantidades de
cada alcalóide acumuladas nas células e nos meios, para cada experimento, tendo-se
como referência um controle. Para este cálculo utilizou-se a mesma equação da
quantificação dos alcalóides e os mesmos valores de R para a inclinação da reta de cada
substância (página 99). As figuras apresentadas a seguir (54-65) mostram os resultados
destes experimentos de eliciação.
24 48
Tempo do experimento (h)
66
D controle
• fenilalanina
Figura 54 - Quantificação do alcalóide 6 no experimento com fenilalanina (células)
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• controle
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Figura 56 - Quantificação do alcalóide 6 no experimento com luz UV (células)
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Figura 58 - Quantificação do alcalóíde 6 no experimento com levedura (células)
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Tempo do experimento (h)
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• controle
• fenilalanina
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Figura 57 - Quantificação do alcalóide 6 no experimento com luz UV (meio)
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Tempo do experimento (h)
Figura 62 - Quantificação do alcalóide 7 no experimento com luz UV (células)
24 48 66
Tempo do experimento (h)
Figura 64 - Quantificação do alcalóide 7 no experimento com levedura (células)
0,4
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a controle
• fenílalanina
48 66
Tempo do experimento (h)
Figura 61 - Quantificação do alcalóide 7 no experimento com fenilalanina (meio)
0,4
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24 48 66
Tempo do experimento (h)
Figura 63 - Quantificação do alcalóide 7 no experimento com luz UV (meio)
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Tempo do experimento (h)
Figura 65 - Quantificação do alcalóide 7 no experimento com levedura (meio)
104
105
Os resultados de indução da biossíntese e acúmulo/excreção de metabólitos
secundários em suspensões celulares de P. crassinervium foram baseados na utilização
de luz UV, adição de L-fenilalanina e extrato de levedura.
A utilização de L-fenilalanina foi baseada no fato desta ser o aminoácido precursor dos
alcalóides. Para os experimentos, os perfis dos gráficos para as células e para os meios
de cultura indicaram um aumento da concentração destas substâncias com a adição de
fenilalanina, quando comparados com o controle. Um pequeno aumento de concentração
desses alcalóides nas células foi observado 44h após a adição, enquanto que no meio de
cultura observou-se um aumento somente 66 h após a adição (Figuras 54, 55, 60 e 61).
O objetivo do experimento com luz UV foi o de induzir a formação de flavonóides,
considerando que esses estão presentes nas folhas intactas de Piper e que os mesmos
possuem determinadas etapas, como a mediada pela PAL, ativadas pela luz. A análise
destes experimentos por CLAE, mostrou o mesmo perfil do extrato de células e do meio,
provenientes das suspensões celulares, analisados previamente. Dessa maneira pôde-se
concluir que a luz UV não induziu a formação de novos compostos ou mesmo dos
flavonóides, que agiriam como substâncias de defesa ou seriam formados devido às
condições de estresse do cultivo in vitro. Através destes resultados foi possível observar
um aumento da concentração dos alcalóides, em todos os intervalos de tempo, para os
experimentos com o meio celular, enquanto que para as células o aumento da quantidade
dos alcalóides 6 e 7 apenas foi observado nos intervalos de 48 e 66 horas (Figuras 56,
57, 62 e 63).
A luz, independente do seu tipo, é um dos estímulos para indução da atividade da
PAL, atuando assim na regulação do metabolismo e nos processos de diferenciação das
plantas (Moreno et ai., 1994). A atividade da PAL foi determinada em culturas de
suspensões celulares de pinheiro (Picea abies), pré-cultivadas à luz visível (células
verdes) ou no escuro (células brancas). Estas suspensões foram irradiadas com luz UV
(302 nm) por dez, quinze e vinte minutos. Observou-se que a atividade da PAL foi
induzida no período subseqüente à irradiação. O tratamento durante vinte minutos
resultou em um aumento da atividade de cerca de trinta vezes. Contudo, a indução foi
observada somente para células brancas (crescidas no escuro). As diferenças nas
respostas do tratamento das células com luz UV podem estar relacionadas à presença
nas células verdes de substâncias protetoras contra luz UV, tais como flavonóides que
haviam sido detectados em estudos preliminares (Messner et ai. , 1991).
106
Suspensões celulares de salsa também mostraram uma dependência da atividade
da enzima PAL com a luz UV, resultando na formação de flavonóides (Jones, 1984),
assim como suspensões celulares de Catharanthus roseus que apresentaram um
aumento da atividade desta enzima quando tratadas com luz UV (Moreno et ai. , 1994).
Experimentos com eliciadores geralmente levam à formação de substâncias ainda não
presentes nas suspensões celulares, através de modificações em seu metabolismo, em
resposta a um ataque externo, no caso, por fungos (Moreno et ai., 1994).
Plantas do gênero Cinchona (Rubiaceae) são fontes de importantes alcalóides
terapêuticos, como quinina e quinidina. Além destes compostos, substâncias do tipo
antraquinonas têm sido isoladas sendo que, em Cinchona exercem a função de
fitoalexinas, além de seu acúmulo em partes infectadas por patógenos estar relacionado
com a redução do conteúdo de alcalóides. Suspensões celulares de Cinchona robusta,
em condições normais de cultura, foram estudadas e verificou-se que estas não
acumulavam antraquinonas. A adição de 0,8 mg do eliciador por ml de suspensão celular
produziu altos níveis des antraquinonas, com alta viabilidade das células. O eliciador foi
adicionado em culturas de O, 2, 4, 6 e 8 dias. O acúmulo máximo de antraquinonas nas
células (cerca de 12 µmol/g células secas) foi alcançado em 72 horas. Nestas culturas
menos do que 2% do conteúdo total das antraquinonas foi encontrado no meio celular
(Schripsema et ai., 1999).
Com o objetivo de avaliar o acúmulo de novas substâncias em culturas de P.
crassinervium fez-se a incubação das suspensões celulares com o extrato de levedura
(100 µL de uma solução 10 mg/ml). Para as células o aumento só foi observado para o
alcalóide 6, num intervalo de 48 horas. Para os meios, houve um aumento em todos os
intervalos de tempo do experimento para o alcalóide 6, enquanto que para o 7, apenas no
intervalo de 48h (Figuras 58, 59, 64 e 65).
A fim de se verificar estes dados, seria necessário uma curva, para dosar a
quantidade máxima e mínima do eliciador que causa uma resposta, e analisar como este
afeta, por exemplo, a atividade da PAL. Tratando-se de um experimento novo em culturas
de células de P. crassinervium, muito estudo ainda é necessário para o estabelecimento
de melhores condições. Desses dados pode-se afirmar, no entanto, que as células
ensaiadas conseguem suportar a quantidade usada do eliciador, fornecendo apenas uma
leve resposta, que não levou a formação de um novo composto.
107
4.9 Bioautografia
As substâncias isoladas neste trabalho foram testadas, pela técnica da
bioautografia, frente ao fungo Cladosporium sphaerospermum, a fim de se avaliar a
atividade antifúngica destas substâncias. A Figura 65 mostra a cromatoplaca com as
substâncias aplicadas, além dos extratos brutos que também foram submetidos ao teste.
As frações relacionadas nesta cromatoplaca foram provenientes do fracionamento de
folhas de P. crassinervium (página 21).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Extr. folha Fração 5-6 Fração 9-12 Fração 17-18 Fração 23 Fração 24-27 Fração 30 Fração 34-36 Fração 37-38 Fração 42-45 Fração 46 Fração 50
13 Aristolactama 6 14 Aristolactama 7 15 Aristol. 8 e 9 16 Extr. folha prop. 17 Extr. caule prop. 18 Folhapr. 19-21 19 Talo prop. b4 20 Hidroquinona3 21 Hidroquinona4 22 Hidroquinona5 23 Flavanona2 24 Flavanonal
Figura 66 - Cromatoplaca das substâncias puras e frações do extrato de folhas de P.
crassinervium
108
As substâncias que se mostraram ativas, 1, 2, 3, 5 e 19-21 b (fração proveniente de
folha propagada) foram novamente bioautografadas, só que em quantidades menores, no
caso, 50 e 1 O µg, conforme mostra a Figura 67 .
1. 3
2. 19-21b
3. 5
4. 1
5. 2
6. 30d1
Figura 67 - Cromatoplaca das substâncias purificadas
Baseado neste último ensaio, foram aplicados em uma cromatoplaca 10; 5; 2,5 e
1 µg destas substâncias consideradas ativas (substâncias mostradas na Figura 67) e do
óleo volátil de P. crassinervium, juntamente com o padrão nistatina, 1 µg, a fim de se
estabelecer a quantidade mínima de cada substância ativa frente ao fungo Cladosporium
sphaerospermum. A Tabela 17 mostra os resultados obtidos.
109
Tabela 17 - Limite mínimo de detecção em µg das substâncias ativas
Substância Limite mínimo de
detecção (µg)
Flavanona 1 5 µg
Flavanona 2 1µg
Hidroquinona 3 5 µg
Hidroquinona 5 10 µg
19-21 b 5 µg
óleo volátil 5 µg
nistatina (padrão) 1 µg
110
5. Conclusões
A partir dos resultados obtidos pôde-se concluir que plantas de campo e cultura de
células de P. crassineNium biossintetizam e acumulam diferentes metabólitos
secundários.
Dos extratos das folhas foram isoladas duas flavanonas e três hidroquinonas,
sendo que esta é a primeira descrição do isolamento de hidroquinonas em espécies de
Piperaceae. As suspensões celulares não produziram flavonóide nem outro metabólito
relacionado, porém foram isolados quatro alcalóides do tipo aristolactamas. O alcalóide N
metilado 7 é um novo produto natural.
A fim de se avaliar tal perfil , ensaios de injúria mecânica em folhas de campo, ou
mesmo experimentos com eliciadores devem ser realizados, com o objetivo de induzir a
formação de aristolactamas em folhas intactas. Mesmo sendo considerados compostos
de proteção, os flavonóides não foram sintetizados pelas culturas de células tratadas com
luz UV. Sabe-se que a flavanona sakuranetina (substância 2 isolada neste trabalho)
apresenta-se como fitoalexina em culturas de folhas de arroz e somente foi sintetizada
após tratamento destas folhas com luz UV (Kodama et ai., 1992). Além dessa função,
esta flavanona apresenta uma alta atividade antifúngica o que está de acordo com a
flavanona 2 isolada neste trabalho, que mostrou-se ativa contra o fungo Cladosporium
sphaerospermum.
Comparando-se diferentes espécies de Piper, no caso Piper crassineNium e Piper
cernuum, verificou-se que elas acumularam diferentes substâncias nos tecidos
diferenciados e não-diferenciados, sendo que nas folhas intactas estes metabólitos seriam
provenientes da desaminação da fenilalanina enquanto que nas suspensões celulares
eles seriam formados a partir da descarboxilação da tirosina.
Os dados obtidos sugeriram que para P. crassineNium enzimas específicas para
formação das aristolactamas estariam presentes nos tecidos celulares, visto que estes
alcalóides seriam formados a partir da dopamina, enquanto que para Piper cernuum os
únicos metabólitos isolados das suspensões foram tiramina e dopamina.
Tratando-se de um trabalho novo para P. crassineNium, muitos estudos terão que
ser desenvolvidos com o objetivo de avaliar as enzimas presentes nestas suspensões
celulares. Considerando-se que este trabalho constitui-se no primeiro estudo químico,
111
biológico e biossintético de P. crasssinervium, os resultados obtidos são de fundamental
importância por revelar as diferentes rotas biossintéticas operantes, especialmente
quando se compara plantas diferenciadas e suspensões celulares.
112
6. Referências bibliográficas
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