Diagnóstico Microbiológico - ufjf.br³stico... · Bacteriologia - 1º/2018 04/04/2018 Prof. Cláudio 4 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO Pesquisa da presença de agentes causais

Bacteriologia - 1º/2018 04/04/2018

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Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico Diagnóstico Microbiológico

Identificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem BacterianaIdentificação e Tipagem Bacteriana

Prof. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo DinizProf. Cláudio Galuppo Diniz

� Diagnóstico clínico

• Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivos)

• Origem

• Etiologia

• Natureza

� Diagnóstico laboratorial

• Identificação agentes envolvidos em patologias

• Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico

• Investigação epidemiológica

• Investigação científica


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Microbiota indígena

Microbiota exógena

ORIGEM

Monomicrobiana

Polimicrobiana

ETIOLOGIA

Infecciosa

Não-infecciosa

NATUREZA

A utilidade do resultado liberado pelo laboratório de

microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para

investigação.

A investigação baseia-se na construção de um estudo extremamentecuidadoso para a identificação correta de determinada espécie ou linhagembacteriana.

Linhagem microbiana:

- Grupo de indivíduos, que de acordo com um sistema de identificação sãoindistinguíveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivíduos de umamesma espécie em uma população.


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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO

Pesquisa da presença de agentes causais de processos infecciosos em espécimes clínicos.

Em termos gerais o diagnóstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes:

• Cultivo de microrganismos em meio de cultura específicos;

• Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia;

• Detecção de antígenos específicos do patógeno. Estes métodos requerem a utilização de técnicas imunológicas ou de biologia molecular;

• Detecção de seqüências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação gênica;

� A visualização e o cultivo são, em geral, as técnicas mais utilizadas para se realizar diagnóstico microbiológico.

• São técnicas mais simples;

• Requerem menor infraestrutura;

• Tem menor custo.

� O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microrganismos permite a recuperação do agente etiológico e sua utilização futura para estudos científicos

• Epidemiológicos;

• Susceptibilidade a drogas.

Alguns microrganismos não podem ser visualizados ao microscópio óptico e outros não crescem em meios de cultivo.

Neste caso, devemos nos ater aos métodos moleculares de diagnóstico ou às técnicas de diagnóstico indireto.

• As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior além de seus resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicos especializados.


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A detecção de antígenos e de ácidos nucléicos não permite recuperar células microbianas.

• Estas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentrações muito baixas nos espécimes clínicos.

Outra vantagem destas técnicas é sua rapidez.

• Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo porque não dependem do crescimento in vitro do patógeno.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO

É possível diagnosticar uma infecção estudando-se o sistema imunológico do paciente pela pesquisa de anticorpos formados pela resposta imune específica.

• A pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos específicos de um dado microrganismo possibilita o diagnóstico de infecções crônicas ou agudas.

Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade do espécime.

O diagnóstico incorreto pode ter conseqüências diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes.

Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na recuperação de patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso.


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Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um

"falso" agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada

� Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;

� Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;

� Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos;

� Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado;

� Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos, causadores

de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a

fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal.

� Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise

microbiológica;

� O pedido do exame deve conter dados como idade, doença de base e indicação do uso de

antibióticos.


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Métodos broncoscópicos: => Escovado brônquico => Lavado broncoalveolar

Métodos não broncoscópicos: => Aspirado endotraqueal => Coleta às cegas


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CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DE SISTEMAS DE INVESTIGAÇÃO

� Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo, nulo ou

indistinguível entre diferentes amostras

� Reprodutibilidade: fatores técnicos e biológicos.

� Poder discriminatório: capacidade de discriminação entre as

linhagens.

� Facilidade de execução: infra-estrutura pessoal e material.


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As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou

estruturais.

� Biotipagem (isolamento e identificação);

� Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;

� Sorologia;

� Fagotipagem;

� Tipagem por bacteriocinas;

� Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;

� Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)

� Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia

As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou

estruturais.

� Biotipagem (isolamento e identificação);

� Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;

� Sorologia;

� Fagotipagem;

� Tipagem por bacteriocinas;

� Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;

� Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)

� Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia


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BIOTIPAGEM

Também utilizado para taxonomia bacteriana – manual e automatizada.

� Princípio: o perfil de atividades metabólicas expressado por uma dada amostra

bacteriana que inclui características como:

� Desvantagens: mutações ou mesmo condição fisiológica sob diferentes condições de

estresse podem trazer resultados errôneos de tipagem e identificação.

� Morfologia colonial e celular;

� Reações bioquímicas

� Tolerância ambiental (meios seletivos, atmosfera, pH, temperatura, salinidade)


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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

- Muito utilizado nos centros de saúde para monitoramento dos níveis de resistência.

- Alteração nos padrões susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da

ocorrência de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vários pacientes pode

ser considerado como primeiro indicativo de um surto.

� Princípio:

Avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes.


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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS

� Desvantagens:

� A ausência da pressão seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos

marcadores de resistência;

� Os mecanismos de recombinação genética bacteriana permitem a troca de

marcadores de resistência em diferentes circunstâncias, o que dificulta a determinação

de marcadores epidemiológicos.

� Resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificação

equivocada dos marcadores epidemiológicos.


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SOROLOGIA

- Este método tem sido largamente utilizado na identificação microbiana, sendo uma das

ferramentas clássicas para os estudos epidemiológicos.

� Princípio: baseados na observação de que microrganismos de mesma espécie podem

expressar diferentes determinantes antigênicos na superfície. Variadas estruturas da

superfície apresentam propriedades antigênicas, como:

� Lipopolissacarídeo (LPS);

� Polissacarídeo capsular;

� Proteínas de membrana;

� Organelas extracelulares (flagelos e fímbrias)

Como outros métodos, a sorologia está sujeita a erros

• Em alguns casos a presença de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um agente infeccioso e não, necessariamente, apresenta uma doença.

• Janela imunológica - causa freqüente de falsos negativos: período compreendido entre o contato com o agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunológico e a produção de anticorpos específicos.

• Reações cruzadas podem ser a causa de falsos positivos.

- Estruturas antigênicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecífico de antígenos.

• Imunossupressão pode induzir uma queda ou inibição da resposta imune específica impedindo a detecção de anticorpos mesmo durante uma doença infecciosa.

� A determinação isolada de anticorpos específicos oferece pouca informação porque qualquer contato com antígenos vai desencadear sua produção.

� Para se estabelecer um diagnóstico sorológico confiável é necessário comparar-se a quantidade de anticorpos em períodos distintos do processo infeccioso


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SOROLOGIA

-Várias são as técnicas disponíveis para os ensaios sorológicos, como:

� Reações antígeno-anticorpo;

� Soroaglutinação;

� Aglutinação de partículas;

� Neutralização

� Marcação enzimática;

� Fluorescência;

� Aplicação de anticorpos monoclonais, etc.

� Desvantagens:

- Técnicas sorológicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua

pureza e as soluções preparadas.

- Considerando-se células bacterianas, estas técnicas podem apresentar um baixo poder

discriminatório devido à diversidade de determinantes antigênicos em uma mesma

população bacteriana.

Aplicabilidade de técnicas

moleculares no diagnóstico

microbiológico


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Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser usadasno lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente rápidas,sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo benefício.

• A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em consideração

principalmente o impacto da nova técnica na prática clínica e a economia de

gastos associados à intervenção e para o paciente.

• A detecção rápida de bactérias multirresistente pode resultar em um

isolamento mais rápido do paciente, terapia mais apropriada e diminuição da

infecciosidade do paciente.


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Contenção do

espalhamento da

infecção

diminuição do

tempo de

morbidade do

paciente

custo-benefício da

utilização de técnicas

moleculares para

diagnóstico

+ =

• Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico molecular não pode

substituir os métodos culturais e sorológicos convencionais em todos os

momentos.

• Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos culturais e sorológicos

têm significado diferente.

A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos

determinam se existe DNA ou RNA de um organismo

particular em uma amostra biológica

• Não revela dados sobre a viabilidade do organismo

• Não diz se um microrganismo está envolvido em um processo

infeccioso

• Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e

permite avaliação de surtos e geração de conhecimento

epidemiológico


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