Dissertação - Eduardo Ernst Massarelliarquivos.cruzeirodosuleducacional.edu.br/principal/old/mestrado... · Ortodontia da UNICID, Professor Doutor Flávio Vellini Ferreira, pela

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

CURSO DE MESTRADO EM ORTODONTIA

BIOLOGIA MOLECULAR DA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA

EDUARDO ERNST MASSARELLI

Dissertação apresentada à Universidade

Cidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para concorrer ao título de

Mestre em Ortodontia.

São Paulo

2011

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

CURSO DE MESTRADO EM ORTODONTIA

BIOLOGIA MOLECULAR DA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA

EDUARDO ERNST MASSARELLI

Dissertação apresentada à Universidade

Cidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para concorrer ao título de

Mestre em Ortodontia.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Vellini Ferreira

São Paulo

2011

FOLHA DE APROVAÇÃO

Massarelli. E. E., Biologia Molecular da Movimentação Ortodôntica. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

São Paulo, ____/____/________.

Banca Examinadora

1)..........................................................................

Julgamento:..................................... Assinatura:..............................

1)..........................................................................


1)..........................................................................


Resultado:............................................................

Agradecimentos

Ao meu orientador, coordenador do curso de mestrado em

Ortodontia da UNICID, Professor Doutor Flávio Vellini Ferreira, pela

sua paciência e empenho para conclusão deste trabalho.

Á minha filha Luiza, que já me ensinou tanto em tão pouco

tempo, e me dá forças para lutar por qualquer objetivo. Á minha avó

Heliette, por seu carinho e compaixão.

Ao meu co-orientador, Cláudio Antônio Barbosa de Toledo, in

memoriam.

Ao Professor Doutor Flávio Augusto Cotrim Ferreira, pela

confiança e por estar sempre disponível para ajudar.

Aos meus Professores, Doutores Ana Carla Raphaelli Nahás,

Daniela Gamba Garib, Danilo Furquim Siqueira, Hélio Scavone Jr.,

Karyna do Valle-Corotti, Paulo Eduardo Guedes Carvalho, Rívea

Inês Ferreira, pela disponibilidade em dividir seus conhecimentos.

Massarelli. E. E., Biologia Molecular da Movimentação Ortodôntica. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

RESUMO

Na última década, a biologia molecular tem sido uma ferramenta de

estudo cada vez mais presente na pesquisa ortodôntica. Estar atento ao novo

conhecimento que emerge desvendando as bases moleculares da

movimentação ortodôntica é um pré-requisito para o ortodontista que almeja a

excelência em sua prática clínica. O foco desse estudo restringe-se a três

moléculas-chave, que regulam a diferenciação e ativação dos osteoclastos e,

em última instância, a reabsorção óssea necessária para movimentação

ortodôntica. São elas o Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β (RANK), o

seu ligante (RANKL) e a Osteoprotegerina (OPG). O presente estudo teve por

objetivo realizar um levantamento bibliográfico do papel dessas moléculas na

movimentação ortodôntica, assim como das ferramentas que o ortodontista tem

em mãos para influenciá-las e as terapias que surgem como possibilidades

futuras de garantir ao seu paciente um tratamento ortodôntico cada vez mais

eficaz e seguro. Através dos trabalhos científicos analisados, concluiu-se que,

através da variação de direção, magnitude e duração da força ortodôntica, o

ortodontista pode interferir no padrão de expressão de RANKL e OPG no

ligamento periodontal. Não obstante, o uso do laser de baixa potência para

aumentar a movimentação ortodôntica apresenta-se como uma terapia a ser

utilizada em um futuro próximo, assim como a utilização de fármacos que

garantirão uma melhor contenção pós-tratamento através da inibição da

movimentação dentária.

Palavras-chave: Biologia Molecular, RANK, RANKL, OPG, Movimentação

Dentária, Ortodontia.

Massarelli. E. E., Molecular Biology of Orthodontics Movement. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

ABSTRACT

In the last decade, molecular biology has been a study tool increasingly

present in orthodontic research. The orthodontist who aspire excellence in their

clinical practice must be aware of new knowledge that emerges revealing the

molecular basis of orthodontic tooth movement. The focus of this study is three

key molecules that regulate the differentiation and activation of osteoclasts and,

ultimately, bone resorption witch is necessary for orthodontic movement. They

are the Receptor Activator of Nuclear kappa β (RANK), its ligand (RANKL) and

Osteoprotegerin (OPG). The aim of this study was to conduct a literature review

of the role of these molecules in orthodontic movement, as well as the tools that

the orthodontist has to influence it, nowadays or in the near future, to ensure his

patient an orthodontic treatment more effective and safe. Through scientific

analysis, it was concluded that, by changing the direction, magnitudes and

duration of orthodontic force, the orthodontist can interfere with the expression

pattern of RANKL and OPG in periodontal ligament. Nevertheless, the use low

level laser therapy to increase orthodontic movement presents itself as a

therapy to be used in the near future, as well as the drugs that ensure better

containment post-treatment by inhibition of tooth movement.

Keywords: Biologia Molecular, RANK, RANKL, OPG, Movimentação Dentária,

Ortodontia.

LISTA DE TRADUÇÕES E ABREVIATURAS

Termo utilizado / Traduções Abreviatura

Ácido Desoxirribonucléico

Deoxyribonucleic acid

AND

DNA

Ácido Ribonucléico

Ribonucleic acid

ARN

RNA

Fosfatase ácida resistente ao tartarato

Tartrate-resistant acid phosphatase

TRAP

Íon de hidrogênio H+

Fator Nuclear kappa β

Nuclear Factor kappa β

NF-kβ

Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β

Receptor Activator of Nuclear Factor kappa β

RANK

Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β

Receptor Activator of Nuclear Factor kappa β ligand

RANKL

Osteoprotegerina

Osteoprotegerin

OPG

Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA

Reação da Polimerase em Cadeia

Polymerase Chain Reaction

PCR

Reação da Polimerase em Cadeia – Transcrição Reversa

Reverse Transcryption Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Fator de Necrose Tumoral α

Tumor Necrosis Factor α

TNF-α

Interleucina 1

Interleukin 1

IL-1

Proteínas inibitórias da família kappa β

Inhibitory kappa β

Ikβ

Termo utilizado / Traduções Abreviatura

Retículo endoplasmático rugoso

Rough endoplasmic reticulum

RER

Prostaglandina E2

Prostaglandin E2

PGE2

Fator estimulador de colônias de macrófagos

Macrophage colony-stimulating factor

M-CSF

Arseniato de gálio e alumínio AsGaAl

Fator de transformação do crescimento β

Transforming growth factor β

TGF-β

Diodo emissor de luz

Light emitting diode

LED

Tridimensional 3D

Bidimensional 2D

Receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos

Macrophage colony-stimulating factor receptor

c-Fms

Fator de crescimento epidérmico

Epidermal growth factor

EGF

Fator de transcrição Runt relacionado 2

Runt-related transcription factor 2

Runx2

Receptor de calcitonina

Calcitonin receptor

CTR

LISTA DE UNIDADES DE MEDIDA

Símbolo Unidade

g/cm2 grama / centímetro quadrado

Nm Nanômetro

mW Miliwatt

J Joule

mg/kg miligrama / kilograma

mm Milímetro

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO................................................................................................1

2- REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................13

3- DISCUSSÃO.................................................................................................51

3.1- As forças de pressão.............................................................................56

3.2- As forças de tensão...............................................................................59

3.3- Terapia genética.....................................................................................61

3.4- Fármacos.................................................................................................61

3.5- Vibração por ressonância......................................................................63

3.6- Laserterapia............................................................................................63

3.7- Descorticalização óssea........................................................................65

3.8- Condições patológicas locais e sistêmicas.........................................66

3.9- Reabsorção radicular.............................................................................67

4- CONCLUSÃO................................................................................................69

5- REFERÊNCIAS.............................................................................................72

INTRODUÇÃO

2

1- INTRODUÇÃO

É amplamente aceito o conceito de que o movimento ortodôntico se dá

pela reabsorção do osso alveolar decorrente da ação da raiz dentária, que sob

efeito da mecanoterapia, comprime o periodonto em uma face do alvéolo,

gerando reabsorção óssea, ao mesmo tempo em que induz à deposição óssea,

onde há força de tensão do ligamento periodontal. Durante anos os

ortodontistas têm reservado especial atenção ao diagnóstico, focado nas

análises cefalométricas, faciais e de modelo, assim como à mecanoterapia,

aprimorando modelos de braquetes, a composição dos fios ortodônticos e o

controle de ancoragem. Sem diminuir a relevância desses temas, o estudo das

reações teciduais mediadas em nível molecular deveria receber maior

destaque, sobretudo diante do advento da biologia molecular nas últimas

décadas. A duplicação (replicação do DNA), a transcrição (síntese do RNA) e a

tradução (síntese de proteínas) podem regular, em última instância, parâmetros

como reabsorção radicular e velocidade da deposição e da reabsorção óssea.

Antes do nível molecular, devem-se saber quais são as células-chave

envolvidas no processo de remodelação óssea que ocorre durante a

movimentação dentária ortodonticamente induzida. Duas linhagens de células

estão presentes no osso, cada uma com sua função específica. As células

osteogênicas, onde se incluem os osteoblastos, formam e mantém o osso nas

regiões de tensão do ligamento periodontal; enquanto os osteoclastos

reabsorvem o osso nas regiões de compressão. As principais células do

ligamento periodontal são os fibroblastos, cujos fatores secretados podem inibir

a mineralização do tecido ósseo circundante (TEN CATE, 2007).

Introdução 3

Os osteoclastos multinucleados são originados da fusão de células

mononucleares de origem hematopoiética da linhagem monócito/macrófago.

São células assimétricas que apresentam a região da membrana irregular

(borda em escova), a qual se liga à superfície óssea, onde a atividade de

reabsorção ocorre. O citoplasma adjacente à borda em escova é destituído de

organelas celulares, esta “zona clara” não somente liga as células à superfície

mineralizada, mas também isola o microambiente entre ela e a superfície

óssea. Devido ao seu tamanho, podem ser facilmente identificadas à

microscopia de luz. São identificadas citoquimicamente pelo processo da

fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) positivo, o que as distingue de

outras células gigantes. Normalmente, são encontradas na superfície óssea,

ocupando depressões criadas por eles, chamadas de lacunas de Howship

(TEN CATE, 2007).

Os osteoclastos são constituídos de muitos núcleos, cada um dos quais

é rodeado por múltiplos complexos de Golgi, mitocôndrias, retículo

endoplasmático rugoso e numerosas estruturas vesiculares situadas entre o

complexo de Golgi e a superfície de reabsorção. As enzimas como a fosfatase

ácida são sintetizadas nos retículos endoplasmáticos rugosos, transportadas

ao complexo de Golgi e levadas à borda em escova em vesículas de transporte

onde elas liberam seu conteúdo dentro de compartimentos selados adjacentes

à superfície óssea, criando essencialmente um lisossomo extracelular. Outra

característica do osteoclasto é um próton emitido associado à borda em escova

que emite íons de hidrogênio (H+) dentro do compartimento vedado (TEN

CATE, 2007).

Introdução 4

A regulação do desenvolvimento dos osteoclastos é carreada por

numerosas substâncias, tais como hormônios, citocinas, fatores de crescimento

e constituintes da matriz óssea (TEN CATE, 2007).

Na fase de reabsorção ocorre a aderência dos osteoclastos na superfície

óssea, através de sua borda em escova. O meio acidificado pela ação do

próton H+ desmineraliza o osso e expõe a matriz orgânica; ocorre então a

degradação desta matriz exposta pela ação de enzimas como a catepsina B e

fostatase ácida (TEN CATE, 2007).

Os odontoclastos são células provenientes da mesma linhagem dos

osteoclastos (monócito/macrófago). São citologicamente muito semelhantes,

apresentando múltiplos núcleos, borda em escova, zona clara e TRAP. A

principal característica que distingue odontoclastos de osteoclastos é o tecido

que reabsorvem, uma vez que os odontoclastos são encontrados em lacunas

reabsortivas na raiz dentária. Não obstante, os odontoclastos possuem menor

número de núcleos, assim como marcação para TRAP diminuída, o que sugere

uma menor diferenciação, em relação aos osteoclastos, nas suas

características de reabsorção da matriz orgânica (TSUCHIYA et al., 2008).

Na movimentação ortodôntica, a reabsorção óssea mediada pelos

osteoclastos é o fator-limite que determina a movimentação dentária. Essa

resposta fisiológica é regulada por um sofisticado processo de reações

bioquímicas que orquestram a tradução da força mecânica em movimento

ortodôntico, as quais são influenciadas por fatores como magnitude, direção e

duração da força (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006); assim como outros de

ordem genética – “a adaptação do osso às forças ortodônticas depende dos

Introdução 5

genes de osteoblastos e osteoclastos funcionando normalmente para

expressar as proteínas necessárias no tempo e locais corretos” (MASELLA e

MEISTER, 2006).

Na última década, foram identificados três agentes-chaves para que

ocorra a reabsorção óssea mediada pelo emprego da força ortodôntica, que

atuam na regulação da ativação e formação de osteoclastos, através da

ativação de um fator de transcrição denominado Fator Nuclear kappa β (NF-

kβ). São eles o Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β (RANK), o seu

ligante (RANKL) e a Osteoprotegerina (OPG) (KANZAKI et al., 2001, 2002;

SHIOTANI et al. 2001, 2002; OSHIRO et al., 2002). Conhecer o papel

específico desses agentes, que se mostram determinantes para ativação e

função reabsortiva dos osteoclastos, torna-se essencial para decifrar a

interação entre estímulo mecânico e resposta biológica no nível molecular, que

tem, com resultado final, a movimentação dentária ortodonticamente induzida.

Biologia Celular e Molecular

A análise de organelas isoladas em grande quantidade, a cultura de

células, o aparecimento de numerosas técnicas que permitiram manipular o

genoma através da adição ou supressão de genes para o estudo dos

mecanismos envolvidos no fenômeno biológico da hereditariedade, assim

como os processos bioquímicos que regem a produção de proteínas

(polipeptídeos) e ácidos ribonucléicos (RNA e DNA), levaram ao surgimento do

que se costuma chamar de biologia celular e molecular (JUNQUEIRA;

CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

Introdução 6

Dentre as técnicas empregadas na biologia celular, pode-se citar a

citoquímica, ainda muito utilizada para a identificação e localização das

moléculas que constituem as células. Pode ser aplicada em nível de

microscopia óptica e eletrônica para localizar e/ou mensurar enzimas como as

fosfatases ácidas, através do emprego de corantes bioquímicos, ou da

produção de partículas elétron-densas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).

A histoquímica compreende os métodos utilizados para identificar e

localizar substâncias em cortes histológicos. A imunohistoquímica localiza

proteínas específicas, por meio de interações moleculares de alta afinidade

(antígeno-anticorpo). Anticorpos são proteínas que fazem parte de uma grande

família, a família das imunoglobulinas. Quando o organismo é exposto a

moléculas estranhas (antígenos), pode haver uma resposta na forma da

produção de anticorpos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).

Para proceder a uma reação imunohistoquímica, o material que se

supõe conter uma proteína é incubado em uma solução que contém um

anticorpo que reconhece esta proteína. O anticorpo se liga especificamente á

proteína (assim como sua localização) pode então ser evidenciado através do

marcador que foi conjugado a ele. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS

et al., 2007).

A técnica de eletroforese em gel tem diversas variantes para esclarecer

diferentes problemas. Uma dessas variantes serve como ferramenta para

determinar o tamanho de uma proteína ou ácido nucléico consequentemente,

os identificando. A técnica consiste na dissolução das moléculas em uma

solução que as carrega negativamente. Com as cargas positivas neutralizadas,

Introdução 7

colocam-se as moléculas sobre um gel e submete-se este a um campo elétrico.

Com todas as moléculas migrando em direção do pólo positivo, a velocidade

desta migração dependerá exclusivamente do tamanho de cada uma,

formando-se uma banda na região onde cada molécula cessa a sua migração

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

As moléculas fracionadas são então transferidas (blotting) para uma

membrana de nitrocelulose ou náilon, aplicando-se sobre elas um forte campo

elétrico. Essa membrana é então colocada em uma solução com o anticorpo

marcado para revelar a proteína (Wertern blotting) de interesse ou, no caso de

ácidos nucléicos (Southern ou Northern blotting), em uma solução com uma

sonda de RNA ou DNA marcada. A banda de cada molécula pode agora então

ser visualizada com conseguinte identificação e/ou quantificação da mesma

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

Através do ensaio imunoenzitáciao (ELISA), a presença de um antígeno

pode ser também detectada e quantificada. O antígeno é adsorvido em um

suporte sólido (placa de ELISA). Um anticorpo é conjugado a uma enzima e

após a adição do substrato apropriado, ocorre a coloração da ligação antígeno-

anticorpo, que pode então ser avaliada quantitativamente (ALBERTS et al.,

2007).

O PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) é uma metodologia que se

baseia na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de

DNA de uma única célula. O objetivo do PCR é produzir uma grande

quantidade de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade

mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas,

Introdução 8

obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. O molde

pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla. Um ciclo de PCR consiste

em três fases: desnaturação do DNA molde, ligação (“annealing”) dos primers e

polimerização do DNA. Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla

hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª

fase, dois primers de oligonucleótidos se liguem às sequências dos pares de

bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e

sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das

cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem,

portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-

se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA

polimerase termo-estável (Taq). Duas novas cadeias são sintetizadas a partir

da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo, ocorre um crescimento

exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início

(SANTOS et al., 2004).

O RT-PCR (Transcrição Reversa da Reação da Polimerase em Cadeia)

pode ser utilizado para informação sobre a expressão de um gene em uma

célula ou tecido. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza DNA

complementar (cDNA). O cDNA serve como molde então para realização de

PCR. Uma variante de RT-PCR, denominada RT-PCR em tempo real (Real

Time RT-PCR), permite quantificar a amostra obtida através do método

(SANTOS et al., 2004).

A hibridação in situ é um método que permite identificar o locus

cromossômico onde se localiza uma determinada sequência de DNA

Introdução 9

previamente clonada. Este método tem como princípio a complementaridade

das bases que reage a organização de DNA. O DNA de um esfregaço

metafásico e o DNA de uma sonda são transformados em sequências

monocatenares através da desnaturação e posteriormente são postos em

contato em condições de hibridação. Assim a sonda vai hibridar com a

sequência cromossômica onde se localizam as bases complementares. Visto

que a sonda é previamente marcada (com um fluorocromo), o local de ligação

torna-se visível, o que permite identificar especificamente o local do

cromossoma onde se localiza o gene ou a sequência não codificadora em

causa. A realização desta técnica pode ser feita usando uma única sonda ou

até mesmo várias sondas, cada uma, marcada com um fluorocromo diferente.

(ALBERTS et al., 2007).

Fatores de Transcrição

Para que a RNA polimerase II (enzima que catalisa a reação) consiga

encontrar o ponto de início da transcrição (formação de RNA a partir do DNA),

ela necessita de proteínas conhecidas como Fatores de Transcrição. Essas

proteínas se ligam a sequências específicas de DNA (promotores), que

representam o local de início da transcrição e recrutam a RNA polimerase II a

esses sítios (ALBERTS et al., 2007) O Fator Nuclear kappa β é um complexo

protéico que desempenha funções como fator de transcrição. Ele é encontrado

inativado no citoplasma de células animais, inclusive os osteoclastos, e está

envolvido na resposta celular a estímulos como estresse e antígenos

Introdução 10

(MASELLA; MEISTER, 2006; KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; MEIKLE,

2006).

Ativação do Fator Nuclear kappa β

A ligação de moléculas sinalizadoras (ligantes) aos seus receptores os

ativa, fazendo com que eles se liguem ao DNA, regulando a transcrição de

genes específicos. Estes receptores são estruturalmente semelhantes, fazendo

parte de uma superfamília de receptores nucleares. Alguns receptores estão no

citosol e entram no núcleo somente após a interação com o ligante. O receptor

inativo está ligado a complexos protéicos inibitórios, sendo que a interação com

o ligante altera a conformação do receptor, causando a dissociação do

complexo inibitório e, por conseguinte, a ligação do receptor a proteínas co-

ativadoras que induzem a transcrição gênica (ALBERTS et al., 2007).

O Fator Nuclear kappa β (NF-kβ) é um complexo protéico que

desempenha funções como factor de transcrição. NF-kβ pode ser encontrado

em quase todos os tipos de células animais e está envolvido na resposta

celular a estímulos como o estresse, citocinas, radicais livres, radiação

ultravioleta, antígenos virais e bacterianos. NF-kβ desempenha um papel

fundamental na regulação da resposta imunitária à infecção (ALBERTS et al.,

2007).

Duas citocinas de vertebrados, produzidas por células do sistema imune

inato (como macrófagos), ligam-se aos receptores de superfície e ativam o NF-

kβ. Estas citocinas são o Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e a Interleucina-1

(IL-1), elas são especialmente importantes na indução de respostas

inflamatórias (ALBERTS et al., 2007).

Introdução 11

As proteínas inibitórias chamadas Ikβ ligam-se firmemente ao NF-kβ no

citoplasma, mantendo-o inativo. Os sinais como TNF-α e IL-1 promovem a

degradação da Ikβ, o que expõe um sinal de localização nuclear nas proteínas

NF-kβ que se deslocam para o núcleo e estimulam a transcrição de genes

específicos (ALBERTS et al., 2007).

Para que ocorra a ativação do NF-kβ nos osteoclastos, é essencial que

se faça a ligação entre RANKL e seu receptor, RANK. Enquanto RANKL é

expresso principalmente na superfície de células do ligamento periodontal,

osteoblastos e seus precursores, RANK é expresso na superfície de

osteoclastos e seus precursores. Entretanto, a OPG, proteína solúvel e

também secretada por células do ligamento periodontal, osteoblastos e

precursores, compete com RANK na ligação com RANKL, inibindo assim a

ativação dos osteoclastos (MASELLA; MEISTER, 2006; KRISHNAN;

DAVIDOVITCH, 2006; MEIKLE, 2006) – figura 1.

A proposta dessa revisão de literatura é reunir os dados publicados

pertinentes a expressão de RANKL, RANK e OPG pelas células envolvidas na

movimentação ortodôntica; e elucidar como fatores controlados pelo

ortodontista como magnitude, duração e direção da força ortodôntica, assim

como aplicação de terapias com laser ou até o uso de fármacos, podem

Osteoblasto osteoclasto OPG

RANKL RANK

Estimula reabsorção óssea

Inibe reabsorção óssea

Figura 1: A regulação da ativação dos osteoclastos. RANKL se liga a RANK determinando a ativação. Ao se

ligar também com RANKL, a OPG compete pelos mesmos sítios inibindo assim a atividade osteoclástica.

Introdução 12

interferir nessa expressão, analisando estudos in vitro e in vivo, tanto em

humanos como em animais. O ortodontista que estiver familiarizado com esse

tema, certamente estará pronto para usufruir dos benefícios que os avanços no

campo da biologia molecular propiciarão, tanto para a maior eficiência da

movimentação ortodôntica, quanto para o controle de seus efeitos colaterais.

REVISÃO DE LITERATURA

14

2- REVISÃO DE LITERATURA

O primeiro estudo que analisou a presença de RANKL no ligamento

periodontal durante o movimento ortodôntico foi publicado por Shiotani et al.

(2001). Através da movimentação ortodôntica obtida pela inserção de elásticos

separadores entre os molares de ratos durante quatro dias, os autores

detectaram, por meio de técnicas imunohistoquímicas, a presença de

marcação para RANKL no ligamento periodontal submetido à pressão,

principalmente no citoplasma e nas cisternas do retículo endoplasmático

rugoso (RER) dos osteoblastos. RANKL também foi detectada na membrana

plasmática dos osteoblastos e células do estroma. Similar localização

subcelular foi detectada em osteócitos e fibroblastos. Nos osteoclastos,

marcação de RANKL foi detectada na membrana da borda em escova, no

citoplasma adjacente a ela, assim como na zona clara. Esta localização de

RANKL sugeriria, de acordo com os autores, uma função regulatória sobre os

osteoclastos, determinada pela localização de RANKL no RER de osteoblastos,

fibroblastos e células do estroma; associada a uma função reabsortiva,

determinada pela presença na membrana da borda em escova e na zona clara

de osteoclastos. Dessa forma, RANKL expressa por osteoclastos poderia ter

uma função auto-regulatória na sua atividade reabsortiva.

Em outro estudo, Kanzaki et al. (2001) comprovaram que o estímulo

para a ocorrência de reabsorção óssea depende do contato célula-a-célula,

entre as células do ligamento periodontal e células precursoras de

osteoclastos. O cultivo de células precursoras, juntamente com células do

Revisão de literatura 15

ligamento periodontal, estimulou a atividade reabsortiva em dentina bovina

quando comparadas às mesmas células precursoras cultivadas sozinhas.

Essas células precursoras, quando cultivadas em contato indireto (no mesmo

meio, porém, separadas por uma membrana que permitia a passagem de

fatores solúveis, mas impedia o contato célula-a-célula) com as células do

ligamento periodontal, apresentaram uma atividade reabsortiva

significantemente diminuída, assim como o número de células TRAP-positivas

diminuiu de maneira estatisticamente significante. Em paralelo, foi também

constatada a expressão (através de RT-PCR) de RANKL e OPG pelas células

do ligamento periodontal, sendo que a quantidade de OPG (medida através de

ELISA) não se alterou entre os meios cultivados em contato direto e indireto. O

estudo concluiu que as células do ligamento periodontal podem determinar o

aumento da atividade osteoclástica através do contato direto com células

sanguíneas, ou inibir a mesma através da produção contínua de fatores

solúveis.

Após a constatação de que o aumento da atividade osteoclástica se dá

pelo contato célula-a-célula entre células precursoras de osteoclastos

provenientes do sangue e células do ligamento periodontal, Kanzaki et al.

(2002), concluíram que essa atividade pode ser aumentada pelo emprego de

forças de pressão, assim como pela adição de prostaglandina E2 (PGE2) sobre

essas células em cultura. Nesse estudo, o aumento da expressão de RANKL

(medido através de RT-PCR) e do número de osteoclastos (através de

citoquímica) foi proporcional à magnitude e duração da força empregada. No

entanto, após atingir um pico de 2 g/cm2 de magnitude e 24 horas de duração,

não houve mais mudanças estatisticamente significantes no número de


osteoclastos; assim como a partir de 2 g/cm2 de magnitude e 48 horas de

duração, a expressão de RANKL não foi aumentada. Já com relação à OPG,

não foi observada qualquer mudança na sua expressão (medida através de

RT-PCR) diante do emprego da força de pressão. Os níveis de PGE2

aumentaram significantemente, proporcionalmente à duração da força aplicada

até um período de 60 horas. A adição de PGE2 exógena ao meio promoveu um

aumento de RANKL (avaliado através de Western Blotting). Os autores

concluíram que o emprego de forças de pressão estimulou a

osteoclastogênese devido a uma maior expressão de RANKL, e não à

diminuição de OPG.

Com o objetivo de estudar o papel de RANKL e OPG na remodelação

óssea durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida, Oshiro et

al. (2002), utilizaram elásticos separadores entre os incisivos superiores de

camundongos com deficiência na produção de OPG, fazendo o mesmo em

camundongos normais. Através da imunohistoquímica, observou-se um

aumento da marcação para RANKL em ambos os grupos (animais deficientes

na produção de OPG e animais normais) após 2 e 5 dias de inserção dos

elásticos. Nos camundongos com deficiência em OPG, a marcação para

RANKL foi maior em relação aos camundongos normais, somente no momento

inicial (“dia 0”). A localização de RANKL foi temporalmente diferente entre os

grupos, sendo a marcação observada em osteoblastos e fibroblastos nos

camundongos normais após 2 dias e, adicionalmente, em osteoclastos após 5

dias; já no grupo deficiente em OPG, foi observada marcação em osteoblastos

e fibroblastos após 0 dia e, após 2 e 5 dias, também em osteoclastos. O

número de osteoclastos na região do ligamento periodontal submetida à


pressão, assim como a reabsorção óssea, foi maior nos camundongos com

deficiência em OPG após 0, 2 e 5 dias de inserção dos elásticos separadores,

em relação aos camundongos normais. Os autores concluíram que, durante a

movimentação ortodôntica, a osteoclastogênese é regulada por RANKL

positivamente e pela OPG negativamente.

O papel biológico de RANKL e OPG na ativação de osteoclastos foi

estudado, in vitro, por Shiotani et al. (2002). Pré-osteoclastos de camundongos

foram cultivados em presença de RANKL; ou do fator estimulador de colônias

de macrófagos (M-CSF); ou de RANKL e OPG. Já osteoclastos maduros foram

cultivados com RANKL; ou RANKL e OPG. A adição de dentina nos meios

permitiu observar a atividade reabsortiva que, através de microscopia

eletrônica, comprovou ser notadamente aumentada nos meios que receberam

apenas RANKL, tanto para pré-osteoclastos quanto para osteoclastos

maduros. Os pré-osteoclastos, após cultivados com M-CSF, apresentaram

algumas características de osteoclastos (células fundidas, com vários núcleos)

entretanto, não foi observada intensa atividade reabsortiva, assim como nos

meios em que pré-osteoclastos e osteoclastos foram cultivados com RANKL e

OPG. O estudo concluiu que M-CSF não induz a formação de osteoclastos;

RANKL é determinante na maturação e ativação de osteoclastos; e que a OPG

inibe a atividade destas células.

Uma vez elucidado o papel biológico de RANKL e OPG na diferenciação

e maturação de osteoclastos, Kanzaki et al., 2004 comprovaram a influência da

OPG sobre a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos. Foi

confeccionado um aparelho ortodôntico para produzir movimentação palatina

dos molares e, após a sua ativação, os animais receberam uma injeção


subperiostal, na região adjacente ao lado de pressão do ligamento periodontal,

contendo um vetor com o gene específico para indução da expressão de OPG.

Em relação aos animais submetidos apenas à força ortodôntica, os animais

com expressão de OPG induzida apresentaram uma menor atividade

osteoclástica (avaliada através de citoquímica), estatisticamente significante.

Do mesmo modo, nesses animais foi detectada maior marcação

imunohistoquímica para OPG na região do ligamento periodontal. O grupo em

que a expressão de OPG foi induzida também apresentou menor

movimentação dentária, a partir do sétimo até o vigésimo primeiro dia de

ativação, estatisticamente significante, em relação ao grupo submetido apenas

à força ortodôntica. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo

OPG um receptor que inibe a ação de RANKL, a movimentação ortodôntica é

regulada primariamente pela sinalização de RANKL nas células periodontais.

Para esclarecer as mudanças que ocorrem na expressão de RANKL,

RANK e osteoprotegerina durante a reabsorção óssea, Ogasawara et al.(2004)

avaliaram a quantidade de RANK-RNAm em osteoclastos durante a

movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, obtida pela

inserção de elásticos separadores entre o primeiro e o segundo molar superior.

A identificação do RNAm foi obtida pela visualização de sondas

(complementares aos RNA-alvos) marcadas, de modo semelhante à marcação

imunohistoquímica, em uma técnica denominada “hibridização in situ”. Em

condições fisiológicas (antes da inserção dos elásticos separadores), foi

evidenciada a expressão de RANKL por osteoclastos, osteoblastos e células do

ligamento periodontal, sendo que os mesmos osteoclastos RANKL-positivos

apresentaram marcação para RANK. A expressão de RANK também foi


evidenciada em células mesenquimais indiferenciadas, mas não nos outros

tipos celulares. Já a expressão de OPG foi observada em osteoblastos e

células do ligamento periodontal. Durante a movimentação ortodôntica, o

número de osteoclastos RANKL e RANK-positivos aumentou, sendo

novamente a expressão de ambas concomitante em muitas dessas células. A

expressão de RANKL também sofreu um incremento, mas somente nas células

do ligamento periodontal e não nos osteoblastos. Nenhuma alteração na

expressão de OPG foi aferida. Os autores concluíram que a expressão de

RANK e RANKL ocorre concomitantemente nos osteoclastos, sob condições

fisiológicas, e que essa expressão é aumentada após o emprego da força

ortodôntica (inserção dos elásticos separadores).

Low et al. (2005) descreveram as mudanças na expressão de RANKL e

OPG durante a reabsorção radicular induzida pelo emprego de forças

ortodônticas pesadas em molares de ratos. Através de forças contínuas de

100g direcionadas para produzir mesialização dos primeiros molares inferiores,

foram obtidos dados sobre a expressão de OPG e RANKL nas áreas de tecido

ósseo e radicular submetidas à pressão, através da análise dos produtos da

reação de RT-PCR em tempo real, 14 dias após a instalação do aparelho. Os

resultados apontaram para um aumento discreto na expressão de RANKL,

enquanto que, com relação à OPG, foi detectado um aumento estatisticamente

significante. Os autores concluíram que os níveis de OPG, acima dos de

RANKL, podem ter sido induzidos pela intensa atividade inflamatória

desencadeada pelo emprego de forças ortodônticas pesadas.

Diante das evidências sobre a importância de RANK na diferenciação de

osteoclastos, Aihara, Yamaguchi e Kasai (2006) realizaram um estudo para


investigar os efeitos do laser de baixa potência sobre suas células precursoras,

aferindo os níveis de expressão de RANK e quantificando o número de

osteoclastos obtido após o seu emprego. As células (provenientes de ratos) em

cultura foram expostas à radiação do laser de baixa potência de Arseniato de

gálio e alumínio (AsGaAl) por períodos de 1, 3, 6 ou 10 minutos por dia,

durante 8 dias, resultando em doses de 9,33, 27,99, 55,98 ou 93,30 J/cm2,

respectivamente. A radiação foi empregada em um comprimento de onda de

810 nm e potência de 50 mW. O número de osteoclastos foi medido através de

citoquímica e a expressão de RANK por imunohistoquímica. A comprovação da

atividade reabsortiva dos osteoclastos foi feita pela introdução de slices de

dentina no meio e a expressão de RANK pelas células em cultura aferida por

RT-PCR. Os resultados apontaram para um aumento estatisticamente

significante no número de osteoclastos, nas células irradiadas pelos períodos

de 1,3 e 6 minutos por dia, sendo o maior número obtido no período de 3

minutos por dia. As células irradiadas por esse período foram então estudadas

em relação à influência do tempo de exposição ao laser. Através de

citoquímica, observou-se a presença de osteoclastos após 2 dias de irradiação,

sendo que estas células não foram observadas antes de 3 dias nos controles.

A imunohistoquímica revelou uma maior marcação para RANK após 2 e 3 dias

de irradiação. Para esses períodos (2 e 3 dias de irradiação por 3 minutos ao

dia), foi avaliada a expressão de RANK através de RT-PCR e observada uma

banda, correspondente a RNAm para RANK, mais intensa nos meios irradiados

com laser. Ao inserir slices de dentina, constatou-se maior número de lacunas

reabsortivas, estatisticamente significante, nos meios irradiados por laser após

8 dias, por períodos de 1, 3 e 6 minutos por dia, mas não por 10 minutos por


dia. Esse aumento da atividade reabsortiva foi proporcional aos períodos,

exceto 10 minutos por dia. Os autores chegaram à conclusão de que a

irradiação com laser de baixa potência (AsGaAl) induz a diferenciação e

ativação de osteoclastos in vitro, via expressão de RANK.

Kanzaki et al. (2006ª) comprovaram a influência de RANKL sob a

movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, empregando

técnicas de terapia genética. Foi confeccionado um aparelho ortodôntico para

produzir movimentação palatina dos molares e, após a sua ativação, os

animais receberam uma injeção subperiostal, na região adjacente ao lado de

pressão do ligamento periodontal, contendo o vetor com o gene específico para

indução da expressão de RANKL. Em relação ao grupo controle (em que não

foi induzida a expressão de RANKL), foi observada, através de citoquímica,

uma maior atividade osteoclástica e, através de imunohistoquímica, maior

expressão de RANKL na região do ligamento periodontal, ambas

estatisticamente significantes. O grupo em que a expressão de RANKL foi

induzida também apresentou maior movimentação dentária, após a ativação do

aparelho ortodôntico em relação ao grupo controle, também estatisticamente

significante. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo RANKL

um indutor da atividade osteoclástica, a movimentação ortodôntica pode ser

acelerada pelo emprego da terapia genética por eles empregada.

Para avaliar os níveis de RANKL e OPG durante a movimentação

ortodôntica em humanos, Kawasaki et al. (2006), analisaram o fluído crevicular

de pacientes adolescentes (média de 15.1 anos) e adultos (média de 31 anos).

Os grupos contavam com indivíduos de ambos os sexos, masculino e feminino.

A análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no


lado em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por

períodos de 0, 1, 24 e 168 horas. Os resultados apresentaram uma maior taxa

de movimentação dentária, estatisticamente significante, nos adolescentes

após 168 horas de emprego da força ortodôntica. Da mesma forma, os níveis

de RANKL apresentaram-se mais elevados após 24 horas, sendo esse

aumento estatisticamente maior nos pacientes adolescentes em relação aos

adultos. No mesmo período, OPG apresentou níveis menores em ambos os

grupos em relação aos controles, sendo que os níveis nos adultos foram ainda

menores. Após 0, 1 e 168 horas, não foi observada diferença estatisticamente

significante em relação aos níveis-controle. Os autores concluíram que a

diminuição da movimentação dentária nos pacientes mais velhos pode ser

relacionada à diminuição dos níveis de RANKL/OPG durante os estágios

iniciais da movimentação ortodôntica.

Para estudar o efeito de forças de tensão sobre a expressão de OPG,

Kanzaki et al. (2006b) utilizaram células de ligamento periodontal humano

cultivadas conjuntamente com células precursoras de osteoclastos. As células

foram submetidas a forças de tensão intermitentes por 30 minutos, 90 minutos,

6 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas. Através de RT-PCR, os autores

verificaram uma maior expressão estatisticamente significante de OPG, RANKL

e TGF-β sendo, este último, uma citocina relacionada ao controle da expressão

de OPG. Os resultados apontaram para um aumento significativo da expressão

de RANKL, OPG e TGF-β após 48 e 72 horas de aplicação da força de tensão.

As células submetidas a forças de tensão apresentaram uma atividade

reabsortiva, sobre dentina adicionada aos meios, estatisticamente significante

menor. O aumento da expressão de OPG foi dependente de TGF-β, uma vez


que a neutralização da citocina no meio provocou uma diminuição de OPG em

uma relação dose-dependente. Os autores concluíram que o emprego de

forças de tensão intermitentes induzem o aumento da expressão de RANKL,

OPG e TGF-β. Não obstante, TGF-β estaria envolvida na regulação da

expressão de OPG dentro deste processo.

Nishijima et al. (2006) também analisaram o fluído crevicular de

pacientes adolescentes dos sexos masculino e feminino, após a aplicação de

forças ortodônticas de pressão sobre o ligamento periodontal humano. A

análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no lado

em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por períodos

de 0, 1, 24 e 168 horas e apresentaram uma maior expressão de RANKL e

uma diminuição de OPG, estatisticamente significante, somente no período de

24 horas. Adicionalmente, um estudo in vitro foi realizado em células do

ligamento periodontal humano, cultivadas e submetidas a forças de pressão

crescentes. Foi verificado que ocorreu aumento da expressão de RANKL e

diminuição de OPG, estatisticamente significante, na medida em que a

intensidade da força foi aumentada, até um limite de 2 g/cm2. Sob esta

intensidade de força compressiva, a mudança dos níveis de RANKL e OPG

apresentou o mesmo padrão proporcionalmente ao tempo de emprego da força

(0, 3, 6, 9, 12, 24 e 48 horas). Diante dos resultados obtidos, os autores

concluíram que, no fluído crevicular de humanos, os níveis de RANKL sofrem

aumento e os de OPG diminuição durante a movimentação ortodôntica, no lado

de pressão do ligamento periodontal. Nas células do ligamento periodontal

humano in vitro, as mudanças dos níveis de RANKL e OPG apresentam o

mesmo padrão em uma relação tempo e força-depentendes.


Em outro estudo, que analisou como forças de tensão com magnitudes

diferentes podem influenciar a expressão de OPG e RAKNL, Tang, Lin e Li

(2006) utilizaram osteoblastos de camundongos in vitro. As células foram

submetidas a alongamento de 0%, 6%, 12% ou 18% com o incremento da

força de tensão, por um período de 24 horas. A força foi empregada de forma

intermitente e os resultados apresentaram uma diminuição de RNAm (aferido

por RT-PCR) para RANKL, assim como uma diminuição dos níveis de RANKL

(resultados obtidos por ELISA) secretada por osteoblastos, em uma relação

dependente da magnitude da força empregada. Concomitantemente, houve um

aumento da expressão de OPG (resultados obtidos por ELISA). Todas essas

variações revelaram-se estatisticamente significantes. Os autores então

concluíram que diferentes magnitudes de forças de tensão influenciam o

comportamento de osteoblastos, sendo que as mudanças observadas na

expressão de RANKL e OPG podem repercutir na ocorrência da remodelação

óssea.

Com o objetivo de relacionar a expressão de RANKL e o fenômeno de

reabsorção radicular, Yamaguchi et al. (2006), submeteram as células do

ligamento periodontal de pacientes que apresentaram reabsorção radicular

severa nos incisivos centrais após o tratamento ortodôntico à incidência de

forças pressão in vitro. Em relação às células do grupo controle (pacientes que

não apresentaram reabsorção severa), as células submetidas à força de

pressão (2,0 g/cm2), provenientes de primeiros pré-molares, apresentaram

maiores níveis de RANKL a partir do período de 6 horas (aferido por ELISA) e

uma diminuição de OPG (ELISA), sendo essas mudanças estatisticamente

significantes. Esse aumento de RANKL e diminuição de OPG foram


proporcionais à duração da aplicação da força até um período de 12 horas. O

número de osteoclastos, analisado através de citoquímica, também se

apresentou estatisticamente maior nas células de pacientes com severa

reabsorção radicular, assim como os níveis de reabsorção de dentina

adicionada aos meios. Os autores concluíram que as células periodontais

derivadas de indivíduos que apresentaram severa reabsorção radicular

produzem uma maior quantidade de RANKL e menor de OPG quando

submetidas a forças de pressão, resultando em uma hiperestimulação da

osteoclastogênese.

Dunn et al. (2007), examinaram o papel da OPG na regulação da

remodelação óssea ortodonticamente induzida em ratos. Através de um

dispositivo ortodôntico, forças contínuas de 54±2 gramas foram empregadas no

sentido de mover mesialmente os primeiros molares superiores de ratos. Doses

de 0,5 e 5,0 mg/kg de OPG recombinante foram injetadas duas vezes por

semana no lado de pressão do ligamento periodontal dos molares

movimentados. A dose de 5,0 mg/kg inibiu a movimentação ortodôntica, de

forma estatisticamente significante, em taxas de 45,7%, 70,6% e 78,7% nos

períodos de 7, 14 e 21 dias respectivamente (medida pela análise de modelos);

assim como diminuiu significantemente o número de osteoclastos

(quantificados por citoquímica) em comparação com o grupo controle, nas

áreas de pressão do ligamento periodontal. A dose de 0,5 mg/kg também inibiu

a movimentação de forma estatisticamente significante, mas em níveis

menores, sendo 43,8% e 31,8% nos períodos de 7 e 14 dias. Os resultados

sugerem, segundo os autores, que a injeção de OPG recombinante nas áreas

submetidas à reabsorção óssea (mucosa palatal adjacente à raiz mesial, de


acordo com a direção da força aplicada), inibe a movimentação ortodôntica e

pode contribuir para solução da perda de ancoragem na mecânica ortodôntica.

Garlet et al. (2007) realizaram um estudo onde observaram a expressão

de várias citocinas, além de OPG e RANKL, no ligamento periodontal de

humanos, onde incidiram tanto forças de pressão quanto de tensão in vivo. Os

dentes analisados (pré-molares) foram extraídos 7 dias após o início do

tratamento com expansor Hyrax e, através da análise de RT-PCR em tempo

real, a expressão das diversas citocinas, OPG e RANKL foram avaliadas nos

lados de tensão e pressão do ligamento periodontal. As citocinas TGF-β, TNF-

α e IL-10 apresentaram aumento estatisticamente significante na sua

expressão no grupo experimental, sendo os níveis de expressão de IL-10

maiores no lado de tensão do ligamento periodontal; e TNF-α maiores no lado

de pressão. Com relação a RANKL e OPG, os resultados apontaram uma

maior expressão, estatisticamente significante, de ambas as citocinas tanto nos

lados de pressão quanto tensão. Entretanto, esse aumento da expressão de

RANKL foi estatisticamente maior no lado de pressão em relação à OPG,

assim como o aumento de OPG no lado de tensão revelou-se estatisticamente

maior em relação à RANKL. A expressão de um marcador bioquímico de

formação óssea, a Osteocalcina, também foi analisada e demonstrou um

padrão de variação semelhante à OPG. Os autores concluíram que o estudo

não apresentou evidências da relação de causa-efeito entre as citocinas

analisadas, OPG, RANKL e a resposta tecidual, uma vez que os dados

gerados in vivo são influenciados por um ambiente complexo, onde a presença

de diversos tipos celulares, citocinas e hormônios (que podem interagir e


influenciar uns aos outros) podem mascarar os resultados e induzir a

conclusões não condizentes com a realidade.

Segundo Keles et al. (2007) a perda de ancoragem e a recidiva são os

maiores problemas clínicos enfrentados na ortodontia. Nesse contexto, os

autores realizaram um estudo com o objetivo de investigar a eficácia de OPG e

do bisfosfonato (substância capaz de inibir a reabsorção óssea) Pamidronato

na inibição do movimento ortodôntico. Com a utilização de um aparelho

ortodôntico instalado em camundongos, foram empregadas forças iniciais de

22,4 gramas sobre os molares superiores. Após 12 dias de ativação, a força

final correspondia a 20,1 gramas. O número de osteoclastos (avaliado através

de citoquímica) nas áreas de pressão do ligamento periodontal aumentou de

forma estatisticamente significante após 3 dias, atingindo o pico em 4 dias e

persistindo até 12 dias. O movimento obtido foi proporcional ao número de

osteoclastos, sendo aumentado de maneira estatisticamente significante após

8 dias. O índice de apoptose osteoclástica foi muito baixo, o que sugere que o

recrutamento, mais do que a morte celular programada, é um regulador crítico

da atividade reabsortiva sob a ação de forças constantes. Tanto a OPG quanto

o Pamidronato, após injetados subcutaneamente nas áreas adjacentes ao

ligamento periodontal sob pressão, diminuíram o número de osteoclastos, de

forma estatisticamente significante, sendo que o último mostrou-se menos

efetivo (redução de 70%) em relação à OPG (95%). A movimentação

ortodôntica obtida também foi inibida, sendo no nível de 77% com a OPG

(estatisticamente significante), contra 34% com o Pamidronato. Os autores

concluíram que as forças empregadas com essa metodologia desencadeiam o

recrutamento, ativação e função dos osteoclastos; e que a OPG pode ter uma


utilidade clínica relevante na prevenção dos movimentos ortodônticos

indesejáveis.

Kim et al. (2007) investigaram as mudanças na expressão de RANKL

pelas células do ligamento periodontal de ratos, submetidas à força ortodôntica

contínua. Em um estudo longitudinal, 15 ratos foram utilizados, sendo que no

grupo experimental os primeiros molares receberam a força ortodôntica

contínua de 17,6 gramas na direção vestibular. Através de reação citoquímica,

osteoclastos foram localizados na distal dos molares não submetidos à força

ortodôntica, e no lado de pressão do ligamento periodontal após 1 dia de

ativação, atingindo o número máximo após 3 e mantendo-se após 7 dias. A

imunohistoquímica revelou marcação de RANKL em osteoblastos,

osteoclastos, células do ligamento periodontal e cementoblastos na região

distal dos molares que não foram submetidos à força ortodôntica, assim como

nas regiões de pressão do ligamento periodontal nos molares vestibularizados.

Em relação ao lado de tensão, o lado de pressão apresentou maior marcação

imunohistoquímica para RANKL após 3 e 7 dias de emprego da força. Os

autores concluíram que as células do ligamento periodontal submetidas a

forças contínuas de pressão expressam RANKL. Além disso, outras citocinas

estariam relacionadas no equilíbrio do processo de reabsorção óssea, posto

que os níveis de RANKL não determinaram o aumento contínuo do número de

osteoclastos nos períodos estudados.

Para estudar os efeitos das forças intermitentes sobre a expressão de

RANKL, OPG e outra citocina, IL-1β, Nakao et al. (2007) empregaram forças de

pressão sobre células periodontais humanas em cultura. As células foram

submetidas a forças de 2,0 ou 5,0 g/cm2, por 2 a 4 dias, 8 horas por dia ou de


forma contínua. Através de RT-PCR, foi quantificada a expressão de RANKL,

OPG e IL-1β. As células foram analisadas com relação aos danos causados

pelas forças de pressão, de acordo com o nível de desoxihidrogenase lática

liberada pelas mesmas, obtido através de ELISA. Os resultados apontaram

para um dano celular menor com a força de 2,0 g/cm2 em relação a 5,0 g/cm2.

Na comparação entre forças contínuas e intermitentes, as forças contínuas de

2,0 g/cm2 resultaram em maior dano celular, estatisticamente significante, em

relação às forças intermitentes de mesma intensidade. A expressão de OPG se

mostrou maior nas células controle, nas quais não incidiu a força e menor

proporcionalmente à magnitude e duração da força nas células submetidas à

pressão, sendo que somente após 3 dias a expressão foi menor sob forças

intermitentes em relação às contínuas. Já a expressão de RANKL não foi

detectada nas células controle, porém, as forças intermitentes se mostraram

mais eficientes em estimular a expressão de RANKL em relação às contínuas,

sendo a expressão aumentada proporcionalmente à magnitude da força de

pressão empregada. Já a expressão de IL-1β foi maior sob a incidência de

forças intermitentes de 2,0 g/cm2 após 4 dias. Ao neutralizar a IL-1β do meio

neste período, a expressão de RANKL foi inibida. Os autores concluíram que

as forças de pressão intermitentes podem induzir a expressão de RANKL pelas

células do ligamento periodontal humano in vitro, produzindo menos danos

celulares; e que a IL-1β é um regulador autócrino da expressão de RANKL sob

essas condições.

Em outro estudo, Zuo et al. (2007) observaram a influência da

movimentação dentária ortodonticamente induzida sobre a ativação do Fator

Nuclear kappa β. Através de imunohistoquímica, foi constatado um aumento da


ativação do Fator Nuclear kappa β no osso alveolar adjacente ao ligamento

periodontal de incisivos de ratos submetidos à força ortodôntica contínua de 40

gramas. A marcação revelou-se presente em osteoclastos, em baixa

intensidade no grupo controle (sem movimentação); e em alta intensidade após

3 e 12 horas de ativação do aparelho ortodôntico. Osteoclastos de

camundongos em cultura também foram analisados e, após a adição de

RANKL ao meio, não foram observadas mudanças no nível de ativação do

Fator Nuclear kappa β. Através de Western Blotting, foi constatado aumento na

ativação do Fator Nuclear kappa β após os osteoclastos em cultura serem

submetidos a estresse mecânico (as células foram agitadas com uma espátula

plástica). Os autores concluíram que a ativação do Fator Nuclear kappa β se dá

após estímulo ortodôntico.

Com o objetivo de examinar os efeitos do laser de baixa potência

(AsGaAl) na expressão de RANK, RANKL e OPG durante o movimento

dentário ortodonticamente induzido, Fujita et al. (2008) aplicaram força

ortodôntica constante de 10 gramas nos molares de ratos durante 7 dias. O

laser foi irradiado com uma potência de 100 mW em um comprimento de onde

de 810 nm, sendo a dose recebida por cada um dos 25 animais correspondeu

a 54 J/cm2; aplicada uma vez por dia por 3 minuntos em cada ponto da gengiva

adjacente aos molares, nas regiões mesial, palatal e vestibular. Além do grupo

controle (25 animais não irradiados), outros 25 ratos foram irradiados com LED,

seguindo a mesma metodologia, com comprimento de onde de 850 nm,

potência de 75 mW e dose idêntica ao grupo experimental. Cada grupo foi

dividido em 5 subgrupos de 5 animais cada, para análise dos diferentes

períodos de movimentação ortodôntica (1, 2, 3, 4 e 7 dias). A região de pressão


do ligamento periodontal foi analisada histologicamente. Através de

imunohistoquímica, foi verificada uma marcação maior para RANKL,

estatisticamente significante, no grupo irradiado com laser em todos os

períodos analisados. A marcação para RANKL foi detectada em osteoclastos,

osteoblastos e células do ligamento periodontal. A marcação para RANK, a

partir de 2 dias de irradiação, foi estatisticamente maior nos animais que

receberam laser e foi visualizada em osteoclastos e células mononucleares no

ligamento periodontal. Marcação imunohistoquímica para OPG foi visualizada

em todos os grupos, mas nenhuma variação foi detectada durante os períodos

analisados, sendo que foi restrita aos osteoblastos. O número de osteoclastos,

avaliado por citoquímica, foi estatisticamente maior nos animais irradiados com

laser a partir de 2 dias de movimentação. A partir de 3 dias da ativação do

aparelho, os animais que receberam a irradiação laser apresentaram maior

movimentação ortodôntica, estatisticamente significante, em relação aos dois

grupos controle (não irradiados e irradiados com LED). Para confirmar os

efeitos observados in vivo, células precursoras de osteoclastos também

receberam, in vitro, irradiação laser com comprimento de onda de 810 nm,

potência de 50 mW e dose correspondente a 27,99 J/cm2; aplicada uma vez

por dia durante 8 dias. Através de RT-PCR, foi detectada uma maior expressão

de RANK, estatisticamente significante, após 2 e 3 dias de irradiação. Com

esses resultados, os autores concluíram que o laser de baixa potência estimula

a velocidade da movimentação ortodôntica, via indução de RANK e RANKL.

Garlet et al. (2008) estudaram, dentre outras proteínas, a expressão de

RANKL e osteocalcina (proteína utilizada como marcador para formação

óssea) nas regiões de tensão e pressão do ligamento periodontal de 16


pacientes (32 dentes) submetidos a expansão rápida maxilar, com uma força

intermitente de 7 Newtons (aproximadamente 714 gramas), durante 7 dias. O

ligamento periodontal dos pré-molares extraídos foi analisado logo após a

remoção do disjuntor. Através de RT-PCR, foi detectada uma maior expressão

de RANKL e osteocalcina, estatisticamente significante, tanto no lado de

pressão quanto no lado de tensão em relação ao grupo controle. Entretanto, o

aumento da expressão de RANKL foi estatisticamente maior no lado de

pressão em relação ao lado de tensão, sendo o contrário observado para

osteocalcina. Outras citocinas também apresentaram aumento e diminuição da

expressão variando conforme o lado do ligamento periodontal analisado,

enquanto outras não apresentaram variação. Os autores concluíram que há

uma expressão diferencial de citocinas, RANKL e osteocalcina conforme a

direção de emprego da força, gerando pressão ou tensão, sendo que esse

padrão acarreta o estabelecimento de microambientes distintos que contribuem

para os diferentes padrões de remodelação óssea observados em ambos.

Em outro estudo in vitro, Nakajima et al. (2008) estudaram o efeito de

forças de pressão contínuas (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 g/cm2), empregadas

durante 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas, na expressão de RANKL solúvel e do Fator de

crescimento de fibroblastos 2 nas células do ligamento periodontal humano. As

células foram obtidas de pré-molares extraídos durante o tratamento

ortodôntico de seis jovens (14 a 16 anos). Através de ELISA, foi detectado

aumento nos níveis do Fator de crescimento de fibroblastos 2 e RANKL,

estatisticamente significante, após 24 horas de emprego da força,

independentemente da magnitude. Entretanto, a força de magnitude 4,0 g/cm2

demonstrou aumento estatisticamente significante maior em relação às outras


magnitudes empregadas. Já a OPG apresentou aumento dos níveis após 24

horas, estatisticamente significante, com diminuição da magnitude das forças

de pressão empregadas, sendo que as forças de 0,5 e 1,0 g/cm2 resultaram em

níveis ainda maiores, estatisticamente significantes, em relação às forças de

maior magnitude. Através de RT-PCR, foi observado também um aumento na

expressão do fator de crescimento de fibroblastos 2 proporcional à magnitude

da força empregada, por um período de 24 horas. A neutralização do Fator de

crescimento de fibroblastos 2 no meio coincidiu com uma diminuição dos níveis

de RANKL e OPG, estatisticamente significante, após 24 horas do emprego da

força de 4,0 g/cm2. Os autores concluíram que o Fator de crescimento de

fibroblastos 2 pode estar parcialmente envolvido na osteoclastogênese durante

a movimentação dentária ortodonticamente induzida.

Nishimura et al. (2008), investigaram a influência da vibração por

ressonância, aplicada sobre o esmalte dentário, na movimentação

ortodonticamente induzida em ratos. Os molares receberam força contínua de

12,8 gramas na direção vestibular por 21 dias, sendo que, durante 8hs, foi

aplicada vibração nesses dentes, após 0, 7 e 14 dias de ativação do aparelho.

Os resultados apontaram para um aumento da movimentação dentária,

estatisticamente significante, através da aplicação da vibração com 21 dias de

ativação. Através de imunohistoquímica, foi detectada uma maior marcação

para RANKL nos animais submetidos à vibração, sendo mais intensa no lado

de pressão do ligamento periodontal. Também foi detectado um aumento no

número de osteoclastos (através de citoquímica e estatisticamente significante)

após 7 dias. A marcação para RANKL foi visualizada em fibroblastos e

osteoclastos no ligamento periodontal submetido à pressão; e em fibroblastos e


osteoblastos no lado de tensão. Histologicamente, não foram observadas

diferenças no padrão de reabsorção radicular com a aplicação da vibração

conjuntamente com a força ortodôntica. Os autores concluíram que a aplicação

de vibração sobre os dentes, em conjunto com a força ortodôntica, pode

acelerar o movimento dentário através da indução do aumento da expressão

de RANKL no ligamento periodontal, sem promover aumento de danos

teciduais indesejáveis, como a reabsorção radicular.

Toygar et al. (2008), investigaram o nível de OPG no fluído crevicular de

adolescentes (13 a 17 anos) submetidos à força ordotôntica contínua de 150

gramas (distalização de caninos), no lado de pressão do ligamento periodontal.

As amostras foram colhidas antes da instalação do aparelho e após, 1 hora, 24

horas, 168 horas, 1 mês e 3 meses de ativação do mesmo. A concentração de

OPG foi avaliada por ELISA, sendo que os resultados apontaram uma

diminuição estatisticamente significante, em relação aos níveis basais, após 1

hora, mantendo-se durante os 3 meses analisados. No entanto, o grupo

controle (sem força ortodôntica) apresentou concentrações variáveis que,

quando comparadas com o grupo experimental, não apresentaram diferenças

estatisticamente significantes. Os autores concluíram que OPG é um

importante mediador responsável pela remodelação alveolar durante o

movimento dentário ortodonticamente induzido.

Com o intuito de averiguar a origem dos osteoclastos responsáveis pela

reabsorção óssea durante a movimentação ortodôntica, Xie, Kuijpers e Maltha

(2008), avaliaram espacial e sequencialmente a distribuição dos precursores de

osteoclastos, através da detecção de três receptores: Receptor de M-CSF (c-

Fms), RANK e Receptor de Calcitonina. A diferenciação entre células


precursoras e osteoclastos maduros foi feita através de imunohistoquímica. Foi

utilizado o critério de que células precursoras jovens apresentam marcação

para c-Fms, enquanto células precursoras maduras para c-Fms e RANK. A

marcação para o Receptor de Calcitonina é considerada exclusiva de

osteoclastos ativados. Elásticos separadores foram inseridos entre os molares

de ratos, e os períodos de 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 dias foram avaliados. Na medula

óssea, foram detectadas células mononucleares com marcação para c-Fms e

RANK. A marcação para RANK sofreu aumento nessas células,

estatisticamente significante, após 3 dias decrescendo após 6 dias mas

mantendo-se estatisticamente aumentada em relação ao nível basal. A

marcação para c-Fms apresentou variação semelhante, mas não

estatisticamente significante. Já as células multinucleares apresentaram-se em

menor número em relação às mononucleares. Osteoclastos maduros,

apresentando marcação para Receptor de Calcitonina, foram visualizados em

maior número com 2 dias de ativação, decrescendo até os níveis basais, com 6

dias. Na região do ligamento submetida a pressão, as células mononucleares

apresentaram marcação apenas para RANK, tendo seu número elevado

(estatisticamente insignificante) até que, após 3 dias, seguiu diminuindo

progressivamente. As células multinucleares desta região não apresentaram

marcação tanto para c-Fms, quanto para RANK e Receptor de Calcitonina

antes da introdução dos elásticos. Entretanto, após 1 dia de ativação, a

marcação para ambos aumentou, apresentando um aumento no número de

osteoclastos maduros, estatisticamente significante, com 3 dias de ativação,

voltando a diminuir após esse período mas mantendo o aumento

estatisticamente significante em relação aos níveis basais. Os autores


concluíram que os precursores de osteoclastos se diferenciam dentro da

medula óssea e então migram para o ligamento periodontal durante os estágios

iniciais da movimentação ortodôntica.

Alves et al. (2009) avaliaram a influência da injeção do Fator de

Crescimento Epidérmico (EGF), via lipossomo, na mucosa adjacente de

molares de ratos submetidos a força ortodôntica contínua de 20 gramas, para

mesialização dos molares superiores. Sendo EGF um fator estimulador da

reabsorção óssea, o lipossomo (vesículas produzidas artificialmente) foi

utilizado como um veículo para a avaliação de seus efeitos sobre a quantidade

de osteoclastos e a movimentação ortodôntica produzida pela ativação do

aparelho. Através de citoquímica, constatou-se um aumento do número de

osteoclastos, estatisticamente significante, até 14 dias após a ativação do

aparelho. Esse aumento esteve correlacionado com uma maior marcação

imunohistoquímica (estatisticamente significante) para RANKL em osteoclastos

e osteoblastos no mesmo período. A movimentação ortodôntica obtida também

apresentou aumento em relação aos controles, estatisticamente significante,

mesmo quando comparada com a injeção de somente EGF (sem lipossomo).

Foi avaliado, para obtenção desses dados, o período de 5 a 21 dias de

ativação. Os autores concluíram que a injeção local de EGF, utilizando como

veículo lipossomos estimula a osteoclastogênese e a movimentação

ortodôntica.

No sentido de avaliar o efeito de outra citocina na movimentação

ortodôntica, Andrade Jr. et al. (2009), também utilizaram RANKL e OPG como

marcadores da atividade osteoclástica. Empregando forças ortodônticas

constantes de 0,1 Newton (aproximadamente 10,2 gramas) para mesializar os


molares de ratos, os autores estudaram o papel que um receptor de CCL5

(uma citocina envolvida no recrutamento de osteoclastos), denominado CCR5,

desempenha durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida.

Para tanto, a expressão de RANKL e outros marcadores da atividade

osteoclástica; assim como a expressão de OPG, e outros marcadores da

atividade osteoblástica foram avaliadas em ratos deficientes em CCR5. Através

de citoquímica, foram observados osteoclastos na região distal dos molares

antes da ativação do aparelho. Constatou-se um aumento no número de

oseoclastos, estatisticamente significante, na região de pressão do ligamento

periodontal (mesial dos molares) dos animais deficientes em CCR5 e normais,

com 7 dias de ativação. Com 12 dias de ativação, o aumento de osteoclastos

nos animais deficientes em CCR5 foi estatisticamente significantemente maior

em relação aos animais normais. Através de RT-PCR, foi detectada uma maior

expressão de RANKL, estatisticamente significante, a partir de 3 dias de

ativação na mesma região, sendo esse aumento estatisticamente

significantemente maior nos animais deficientes em CCR5 em relação aos

normais. Da mesma forma, detectou-se uma diminuição da expressão de OPG,

estatisticamente significante, após 3 dias de ativação nos animais deficientes

em CCR5. Não obstante, os ratos deficientes em CCR5 apresentaram, após 7

dias, uma movimentação dentária estatisticamente maior em relação aos

animais normais. Esses dados levaram os autores a concluir que o receptor

CCR5 pode desempenhar uma função inibitória sobre a reabsorção óssea

durante a movimentação ortodôntica.

No sentido de desvendar as bases moleculares dos estágios iniciais da

movimentação ortodôntica, Brooks et al. (2009), avaliaram a presença de KI-67


(um marcador da proliferação celular), Fator de Transcrição Runt Relacionado

2 (Runx2) e RANKL em ratos submetidos a forças contínuas de 10 gramas na

direção de mesialização dos molares superiores, em períodos de 3 e 24 horas.

Através de imunohistoquímica, foi detectado aumento da marcação para KI-67

e RANKL nas regiões de pressão do ligamento periodontal após 3 horas, sendo

a marcação de RANKL citoplasmática. Após 24 horas, a marcação para

RANKL e KI-67 apresentou-se diminuída. Em contrapartida, foi detectado um

aumento da expressão de Runx2 (considerado um marcador de precursores

osteoblásticos), nas áreas de tensão após 24 horas. Os osteoclastos foram

detectados apenas na região distal da raiz dos molares mesializados, assim

como dos controles (não movimentados ortodonticamente). Os autores

concluíram que o aumento da marcação de RANKL (após 3 horas de ativação)

indica que nesse estágio da movimentação ortodôntica as células estão

envolvidas na sinalização de precursores osteoclásticos. Além disso, a baixa

expressão de KI-67 próxima ao ponto médio das raízes pode representar o

centro de rotação do dente, representando, através da observação de eventos

em nível molecular, a visualização do padrão mecânico da movimentação.

George e Evans (2009) realizaram um estudo para avaliar a liberação de

proteínas da matriz orgânica e citocinas no fluído crevicular em pacientes

apresentando reabsorção radicular durante o tratamento ortodôntico. O fluído

crevicular foi coletado das regiões mesial e distal dos incisivos superiores de 20

pacientes não submetidos a tratamento e sem indícios de reabsorção radicular;

20 pacientes submetidos a tratamento a pelo menos 1 ano com reabsorção

radicular moderada (até 2 mm); e 20 pacientes submetidos a tratamento a pelo

menos 1 ano com reabsorção radicular severa (maior do que 2 mm) . Através


de ELISA, foi detectado um aumento da expressão de OPG proporcional ao

grau de reabsorção radicular, no entanto, essa diferença não foi

estatisticamente significante. Por outro lado, o aumento da expressão de

RANKL dos grupos com reabsorção radicular em relação aos controles (sem

reabsorção) demonstrou-se estatisticamente significante, assim como a

diferença na relação entre RANKL/OPG. Os autores concluíram que a

presença de proteínas da matriz orgânica, assim como citocinas, foi confirmada

em pacientes acometidos por reabsorção radicular durante o tratamento

ortodôntico. Além disso, as mudanças no nível de RANKL e na relação

RANKL/OPG podem ser utilizadas para identificar dentes sob o risco de sofrer

reabsorção radicular. Concluíram também que há um aumento de RANKL,

enquanto OPG mantém seus níveis normais durante o tratamento.

Kook et al. (2009), examinaram a influência de forças mecânicas sobre

os fibroblastos da gengiva de humanos na produção de OPG e inibição da

osteoclastogênese. Os fibroblastos foram obtidos do tecido gengival adjacente

aos terceiros molares extraídos de três indivíduos, sendo submetidos à

centrifugação (50 g/cm2) por períodos de 30, 60 e 90 minutos. Através de RT-

PCR, foi verificada uma maior expressão de OPG, estatisticamente significante,

após 30 minutos de centrifugação, mantendo-se nesse nível até 8 horas após o

término da mesma, retornando aos níveis basais após 16 horas. Através de

ELISA, foi detectado um aumento nos níveis de OPG, estatisticamente

significante, somente após 9hs cessada a centrifugação, atingindo o pico após

48 horas. Em relação à RANKL, o aumento foi observado após 9 horas,

mantendo-se constante seus níveis após 48 horas. A adição de IL-1β aos

fibroblastos, 24 horas após a centrifugação, coincidiu com um aumento da


detecção de RANKL e OPG, através de ELISA. O mesmo procedimento

realizado com TNF-α não apresentou mudanças nos níveis de RANKL, mas

coincidiu com um aumento de OPG semelhante ao observado com a adição de

IL-1β. Ao cultivar conjuntamente os fibroblastos com células precursoras de

osteoclastos, foi detectada marcação citoquímica para osteoclastos 5 dias após

a centrifugação. Neutralizando-se a OPG deste meio, o número de

osteoclastos aumentou estatisticamente significantemente e, ao analisar essas

células sem a incidência de centrifugação, o incremento foi maior ainda. Os

autores concluíram que a incidência de força centrífuga sobre fibroblastos

gengivais, in vitro, estimula a expressão de OPG por essas células, inibindo a

osteoclastogênese. Portanto, os fibroblastos da gengiva de humanos podem ter

um mecanismo de defesa natural contra reabsorção óssea induzida por

estresse mecânico.

Com o objetivo de estudar os efeitos da inflamação periodontal na

movimentação ortodôntica, Okamoto et al. (2009), instalaram aparelhos

ortodônticos para mesializar os molares de camundongos com forças contínuas

de 10 gramas durante 14 dias, sendo que a periodontite induzida através da

presença de um fio de ligadura ao redor do dente. Os resultados apresentaram

uma diminuição estatisticamente significante na movimentação ortodôntica dos

animais submetidos à inflamação periodontal nos períodos de 7 e 14 dias.

Também foi detectada uma redução estatisticamente significante no número de

osteoclastos (através de citoquímica), nas áreas de pressão do ligamento

periodontal submetido às forças ortodônticas, dos tecidos com inflamação

periodontal induzida. O número de osteoclastos nesses casos foi

estatisticamente significantemente maior nas regiões de septos interradiculares


e interdentais. Através de imunohistoquímica, foi visualizado um padrão de

marcação para RANKL idêntico ao observado para osteoclastos, sendo

estatisticamente maior nas regiões do ligamento periodontal submetidas a

pressão nos dentes sem inflamação induzida; e maior nas regiões de cristas

ósseas quando há peridontite. Os autores concluíram que a inflamação dos

tecidos periodontais pode diminuir a eficiência do tratamento ortodôntico.

Tan et al. (2009), estudaram a expressão de RANKL e OPG em ratas

ovariectomizadas, durante a mesialização de molares com força ortodôntica

contínua de aproximadamente 20,4 gramas (0,2 Newton). Uma vez

ovariectomizados, os animais desenvolvem osteoporose e aumento da

velocidade do movimento ortodôntico. Através de imunohistoquímica, foi

avaliada a relação entre o aumento da velocidade do movimento ortodôntico

nestes animais experimentais e a presença de RANKL e OPG. As análises

foram feitas após 0, 1, 3, 5, 7, 10 e 14 dias e os resultados apontaram para

uma maior taxa de movimentação dentária, estatisticamente significante, nas

ratas ovariectomizadas a partir de 5 dias da ativação do aparelho. A marcação

para OPG apresentou aumento, no lado de tensão do ligamento periodontal,

sendo esse aumento estatisticamente significante maior nas ratas não

ovariectomizadas, no período de 7 a 14 dias após a ativação do aparelho. A

expressão de RANKL, no lado de pressão, apresentou-se estatisticamente

significante maior nas ratas ovariectomizadas antes da instalação do aparelho

e a partir de 10 dias de ativação. Foi detectada uma mudança estatisticamente

significante na proporção OPG/RANKL ao longo do tempo somente no lado de

pressão nas ratas ovariectomizadas. Os autores concluíram que a

movimentação dentária ortodonticamente induzida foi maior nas ratas


ovariectomizadas, sendo a expressão de RANKL e OPG diferenciada sob

essas condições.

Em outro estudo utilizando terapia a laser, Altan, Sokucu e Ozkut (2010)

analisaram o efeito da irradiação de laser de baixa potência (AsGaAl) nas

áreas de pressão do ligamento periodontal (distal das raízes) de incisivos de

ratos movimentados ortodonticamente. Foi empregada força ortodôntica

contínua de 20 gramas por 8 dias, sendo que os grupo experimentais

receberam irradiação a 820 nm e 100 mW de potência, com 54 J de energia

laser total em um dos grupos e 15 J no outro, em 5 pontos na região

correspondente à distal da raiz dos incisivos. O grupo que recebeu 54 J de

energia total apresentou maior movimentação dentária, embora essa diferença

não tenha sido estatisticamente significante em relação aos outros, no entanto,

através de citoquímica, foi observado um número de osteoclastos

estatisticamente significante maior neste grupo em relação aos demais. Além

disso, o número de osteoblastos foi estatisticamente significante maior nos

grupos que receberam irradiação laser em relação ao controle.

Histologicamente, também foi observado um aumento no número de capilares,

estatisticamente significante maior nos grupos irradiados, sendo esse aumento

proporcional ao tempo de movimentação (analisados períodos após 3 e 7 dias).

O número de células inflamatórias foi maior no grupo que recebeu 54 J de

irradiação em relação aos outros, assim como a taxa de neoformação óssea. A

marcação imunohistoquímica para RANKL foi visualizada em fibroblastos,

osteoblastos e osteoclastos, nas superfícies ósseas submetidas à força

ortodôntica, após 3 e 7 dias. Essa marcação foi mais intensa de maneira

proporcional a energia total irradiada. A marcação de OPG foi visualizada em


osteoblastos, fibroblastos e osteoclastos, porém, sem apresentar diferença

entre os grupos. De acordo com esses resultados, os autores concluíram que a

irradiação com laser de baixa potência acelera a remodelação óssea através

do estímulo a proliferação e ativação de osteoblastos e osteoclastos durante o

movimento dentário ortodonticamente induzido.

Han et al. (2010) relatam a “recidiva” como “maior consenso entre os

ortodontistas”. Neste contexto, os autores avaliaram os efeitos da sinvastatina,

um fármaco frequentemente utilizado para diminuição dos níveis de colesterol

sanguíneo em humanos e estimulador da formação óssea, na movimentação

ortodôntica em ratos. Para tanto, molares inferiores foram mesializados,

através do emprego de forças ortodônticas contínuas de aproximadamente 60

gramas, por 21 dias. Logo após, o aparelho ortodôntico foi removido e os

animais do grupo experimental receberam sinvastatina por 4 semanas, em uma

dose de 2,5 mg/Kg por dia. Após a remoção do aparelho, a movimentação

ortodôntica característica de recidiva foi estatisticamente significantemente

menor nos animais que receberam sinvastatina. Através de imunohistoquímica,

detectou-se uma marcação maior, estatisticamente significante, de OPG nos

lados de pressão e tensão do ligamento periodontal no grupo experimental,

sendo o contrário observado para RANKL. Os autores concluíram que a

sinvastatina inibe a reabsorção óssea por osteoclastos e, ao mesmo tempo,

estimula a neoformação provavelmente, através do controle dos níveis de

RANKL e OPG no ligamento periodontal. Portanto, a sinvastatina pode ser útil

na retenção após o movimento ortodôntico.

Tyrovola et al. (2010), avaliaram o nível de OPG e RANKL solubilizados

no fluído crevicular e no sangue de 14 ratos submetidos à reabsorção radicular


com o emprego de força ortodôntica contínua de 25 gramas. Os molares de

ratos foram mesializados por 21 dias e então extraídos para quantificar o nível

de reabsorção radicular ocorrido, no terço cervical do lado de pressão do

ligamento periodontal, na raiz mesial, em relação ao grupo controle (dentes que

não foram submetidos à força ortodôntica). As amostras de fluído crevicular

foram extraídas no primeiro dia de emprego da força ortodôntica, sendo obtidas

dos dentes de ancoragem (incisivos). Já as amostras de sangue foram

extraídas da região ocular antes e após o emprego da força ortodôntica. Os

resultados detectaram um padrão de reabsorção radicular mais alto

(estatisticamente significante) em quatro animais. Nesse grupo, com alta taxa

de reabsorção radicular, foi detectada, através de ELISA, uma concentração

estatisticamente significante maior de RANKL no sangue antes do experimento.

Já no fluído crevicular, a concentração de RANKL apresentou forte tendência

de ser diminuída nesse grupo. A concentração de OPG apresentou-se

estatisticamente significantemente menor no sangue dos animais com alta taxa

de reabsorção, após o experimento, mas a concentração no fluído crevicular

não apresentou diferenças significantes. Foi encontrada uma correlação linear

positiva entre a concentração inicial de RANKL no sangue e a diminuição da

taxa de reabsorção radicular. Já a concentração inicial de RANKL no fluído

crevicular apresentou uma correlação linear negativa em relação à sua

concentração inicial sanguínea. Os autores concluíram que a relação entre as

concentrações de OPG e RANKL no sangue provém o melhor prognóstico pré-

tratamento sobre o nível de reabsorção radicular após o tratamento ortodôntico.

Com o objetivo de estabelecer um modelo de cultura de células do

ligamento periodontal humano, mais fidedigno às condições observadas in vivo,


Li et al. (2011), avaliaram a expressão de indutores da osteoclastogênese

(inclusive RANKL) em células periodontais humanas cultivadas de forma

tridimensional (3D). Para tanto, foram cultivadas em 3D células do ligamento

periodontal de dentes extraídos por indicação ortodôntica e então submetidas a

forças de pressão de 5, 15, 25 ou 35 g/cm2. Em um experimento paralelo,

células do ligamento periodontal de pré-molares submetidas a forças de

pressão in vivo, por 24 horas, também foram utilizadas. Nas células in vitro

(cultivadas em 3D), as forças a partir de 25 g/cm2 de magnitude, empregada

por 6 horas resultou em uma maior expressão de RANKL, estatisticamente

significante (avaliada através de RT-PCR). Com essa magnitude de força, a

expressão de RANKL apresentou decréscimo com o passar do tempo. Já a

expressão de OPG apresentou-se diminuída, estatisticamente

significantemente, após 6 horas, aumentando após 24 e 72 horas. Outros

indutores de osteoclastogênese foram avaliados e, em relação às células

submetidas à força de pressão in vivo, apresentaram padrão de expressão

semelhante. Os autores concluíram que o modelo apresentado, de cultivo de

células periodontais humanas em 3D, apresenta uma alternativa promissora

para uma efetiva e eficiente ferramenta que possibilitaria o estudo da

biomecânica do movimento dentário ortodonticamente induzido in vitro.

Em outro estudo in vitro (2D), Mitsuhashi et al. (2011), empregaram

forças de pressão durante diferentes períodos (0, 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas) e

com magnitude crescente (1, 2 ou 4 g/cm2), com o intuito de observar se uma

proteína relacionada a estresse celular (HSP70) pode influenciar a expressão

de RANKL, OPG e TNF-α nessas condições. As células utilizadas foram

extraídas do ligamento periodontal de 6 adolescentes (14 a 16 anos) durante o


tratamento ortodôntico. A expressão de HSP70 (avaliada através de RT-PCR)

aumentou de maneira estatisticamente significante a partir do período de 6

horas de incidência da força de 4 g/cm2, atingindo o pico após 12 horas e

mantendo-se estável até 24 horas. Com relação à, TNF-α, a expressão foi

aumentada de maneira estatisticamente significante a partir de 1 hora,

atingindo o pico em 9 horas e decaindo até próximo aos níveis iniciais após 24

horas. Já a expressão de RANKL apresentou aumento estatisticamente

significante após 3 horas, atingiu o pico após 6 horas, decaindo levemente

após 9 horas e mantendo-se constante após 24 horas. Não houve mudanças

estatisticamente significantes na expressão de OPG. Através de ELISA, foi

detectado aumento, estatisticamente significante, no nível de HSP70

proporcionalmente á magnitude e duração da força no período analisado. A

adição de HSP70 exógena inibiu a expressão de RANKL e TNF-α, de maneira

estatisticamente significante, proporcionalmente à dose empregada após 6 e

12 horas. Os autores concluíram que a proteína relacionada ao estresse,

HSP70 pode modular a expressão de TNF-α e RANKL nas células do

ligamento periodontal submetidas à força de compressão.

Em outro estudo envolvendo o processo de reabsorção radicular,

Nakano et al. (2011), avaliaram a expressão de M-CSF, c-Fms, RANKL e

RANK nas áreas acometidas por reabsorção radicular após o emprego de força

ortodôntica pesada. Os molares de 40 ratos foram movidos mesialmente, com

força contínua de 10 ou 50 gramas, por períodos de 0, 3, 7 e 10 dias. As áreas

em que o ligamento periodontal foi submetido à pressão foram analisadas. Ao

fim de 10 dias de movimentação, não houve diferenças estatisticamente

significantes entre a quantidade de movimentação dentária obtida nos animais


que receberam 10 gramas, em relação aos submetidos a 50 gramas de força

ortodôntica. Microscopicamente, foram detectadas lacunas reabsortivas no

osso alveolar após 7 dias de emprego de força de 10 e 50 gramas nas

superfícies radiculares. Através de citoquímica, constatou-se um número de

oseoclastos estatisticamente significante maior com o uso de 50 gramas de

força ortodôntica. Maior número de odontoclastos foram visualizados após 7

dias com o emprego de força pesada (50 gramas). Após 7 e 10 dias, foi

detectado um aumento da marcação imunohistoquímca para RANKL e M-CSF

em fibroblastos e osteoblastos, assim como para RANK e c-Fms em

osteoclastos, proporcional à magnitude da força empregada. Os autores

concluíram que RANK, RANKL, M-CSF e c-Fms podem estar envolvidos no

processo de reabsorção radicular causado pelo emprego de força ortodôntica

pesada.

Baloul et al. (2011) avaliaram o efeito da indução osteoclástica, via

corticotomia, na movimentação ortodôntica em ratos. Forças contínuas de 25

gramas foram empregadas para mesialização dos primeiros molares por

períodos de 3, 7, 14, 21, 28 e 42 dias. A corticotomia foi realizada sob baixa

rotação e refrigeração constante nas paredes palatinas e vestibulares do osso

adjacente a raiz mesial. Os animais submetidos á corticotomia e força

ortodôntica apresentaram maior movimentação dentária, estatisticamente

significante, em relação aos que não sofreram o procedimento cirúrgico nos

primeiros 7 dias de ativação. A movimentação diminui após 21 dias no grupo

que não foi submetido à corticotomia, sendo que, no grupo operado, a

diminuição ocorreu somente após 28 dias. Após 42 dias, não houve diferenças

estatisticamente significantes entre os dois grupos. Para os experimentos que


utilizaram RT-PCR, foram colhidas as áreas do ligamento periodontal ao redor

dos molares, obtendo-se amostras mesiais, distais, vestibulares e linguais. A

expressão de RANKL foi maior (estatisticamente significante) no grupo

submetido à corticotomia em relação ao não operado somente após 28 dias de

movimentação. Já a expressão de OPG aumentou após 3 dias no grupo

submetido à corcotomia e diminuiu no mesmo período no grupo não submetido

ao procedimento cirúrgico, ambos de de forma estatisticamente significante. O

aumento estatisticamente significante no grupo não operado só ocorreu após

14 dias e, após 42 dias, não houve mudanças estatisticamente significantes na

expressão de OPG para ambos os grupos. A expressão do receptor de

calcitonina (CTR) também foi avaliada para detecção dos osteoclastos

maduros. A expressão de CTR apresentou o maior aumento estatisticamente

significante após 3 dias em relação aos outros grupos, decaindo após 7 dias e

sofrendo novo aumento após 14 dias. No grupo sem corticotomia ocorreu

diminuição da expressão de CTR após 14 dias, sendo novamente aumentado

após 21 dias. Em ambos os grupos, houve diminuição após 28 dias, mas a

expressão manteve-se aumentada após 42 dias em relação aos níveis basais.

Os autores concluíram que a corticotomia acelera a movimentação ortodôntica,

através do aumento da taxa de remodelação óssea.

Braga et al. (2011) investigaram o efeito da diabetes sobre a

movimentação ortodôntica. A diabetes foi induzida em 35 camundongos, sendo

que dez receberam injeções de insulina. A movimentação ortodôntica foi

induzida pelo emprego de força contínua de 35 gramas, resultando em

mesialização do primeiro molar. Os camundongos diabéticos que não

receberam insulina apresentaram movimentação ortodôntica maior,


estatisticamente significante, após 6 e 12 dias. O número de osteoclastos,

avaliado através de citoquímica na região de pressão do ligamento periodontal,

aumentou em todos os grupos (controle, diabetes, e diabetes + insulina)

nesses períodos, sendo estatisticamente significante maior no grupo de

animais diabéticos que não receberam insulina. Nesse mesmo grupo, a

expressão de RANK (avaliada através de RT-PCR) em todo o ligamento

periodontal não demonstrou diferenças significantes em relação aos controles,

entretanto, foi detectada uma expressão estatisticamente significantemente

aumentada de RANKL após 72 horas de ativação. Os autores concluíram que a

movimentação ortodôntica é facilitada em camundongos diabéticos, mas esse

efeito pode ser revertido pelo controle da hiperglicemia através de insulina.

Além disso, os resultados sugerem que a diabetes altera o padrão de

reabsorção óssea através da mudança no número de osteoclastos e da

expressão de citocinas osteoclastogênicas como RANKL.

Yu, de Vos e Ren (2011) estudaram o papel da OPG na maturação de

osteoblastos. Para tanto, pré-osteoblastos foram cultivados e submetidos à

transfecção (introdução de ácidos nucléicos em células eucarióticas utilizando

vetor viral ou plasmídeo) para hiper-estimular a expressão de OPG. Através de

ELISA, foi detectada uma concentração duas vezes maior (estatisticamente

significante) de OPG secretada por essas células, em relação às células que

não receberam o plasmídeo como gene OPG. A análise com Western blotting

detectou maior quantidade de OPG também no citoplasma das células

transfectadas. A expressão de RANKL (avaliada através de RT-PCR) não

sofreu alterações significantes com a hiper-expressão de OPG, já a expressão

de fosfatase alcalina (um marcador expresso por pré-osteoblastos durante a


diferenciação em osteoblastos) sofreu um aumento estatisticamente

significante nas células transfectadas. Com base nesses resultados, os autores

concluíram que a hiper-expressão de OPG em pré-osteoblastos promove sua

diferenciação em osteoblastos maduros.

Com o intuito de investigar a expressão de RANKL e OPG na ocorrência

de reabsorção radicular durante o tratamento ortodôntico, Zhou et al. (2011)

empregaram forças ortodônticas de 100 gramas na mesialização de molares de

40 ratos. Analisando o ligamento periodontal submetido à pressão, assim como

áreas adjacentes foi constatado aumento estatisticamente significante no

número de osteoclastos (citoquímica) e, através de hibridização in situ,

aumento da expressão de RANKL. Os autores concluíram que ocorre maior

expressão de RANKL paralelamente ao aumento do número de osteoclastos e

reabsorção radicular.

DISCUSSÃO

52

3- DISCUSSÃO

É uma constatação da prática clínica que uma das principais

preocupações do paciente submetido ao tratamento ortodôntico se refere ao

tempo de duração do tratamento. O ortodontista frequentemente procura

alternativas para satisfazer a expectativa do seu paciente, finalizar o tratamento

na maior brevidade possível, tendo os objetivos almejados sido alcançados.

Para tanto, há inúmeros sistemas de braquetes, que se renovam e ressurgem

com o passar dos anos, fios confeccionados com diferentes ligas, assim como

diversas alternativas de mecânicas ortodônticas para o mesmo tipo de

movimentação pretendida. Por outro lado, o ortodontista pode se deparar em

seu caminho com talvez os maiores óbices da prática ortodôntica, a perda de

ancoragem e a ocorrência de reabsorções radiculares.

Dentro desse contexto, muitos estudos têm investigado terapias que

permitam abreviar o tempo de tratamento ortodôntico, com foco nos eventos

que ocorrem em nível molecular e culminam com a remodelação óssea, essa

imprescindível para que ocorra a movimentação dentária (AIHARA;

YAMAGUCHI; KASAI, 2006; KANZAKI et al., 2006ª; FUJITA et al., 2008;

NISHIMURA et al., 2008; ALVES et al., 2009; ALTAN; SOKUCU; OZKUT,

2010; BALOUL et al., 2011).

Com este enfoque, em nível molecular, o indesejado fenômeno de

reabsorção radicular tem sido abordado no sentido de encontrar subsídios para

aumentar a segurança do paciente submetido a terapia ortodônticas (LOW et

53

al., 2005; YAMAGUCHI et al., 2006; GEORGE; EVANS, 2009; NAKANO et al.,

2011; TYROVOLA et al., 2010; ZHOU et al., 2011); assim como a perda de

Discussão 54

ancoragem, apontando promissoras terapias, alternativas ao uso de

dispositivos como mini-implantes ortodônticos (KANZAKI et al., 2004; DUNN et

al., 2007; KELES et al., 2007; HAN et al., 2010).

Na última década, ficou evidenciado o papel de três moléculas-chave

que desempenham papel crucial na remodelação óssea estimulada pelo

emprego da força ortodôntica. São elas o Receptor Ativador do Fator Nuclear

kappa beta – RANK, seu ligante – RANKL e a osteoprotegerina – OPG

(KANZAKI et al., 2001; SHIOTANI et al., 2002; DUNN et al., 2007; BROOKS et

al., 2009; LI et al., 2011; TAN et al., 2009).

A ligação entre RANK e RANKL é determinante para que ocorra a

reabsorção óssea nas áreas adjacentes ao ligamento periodontal submetido às

forças de pressão (KANZAKI et al., 2001; SHIOTANI et al., 2002; BROOKS et

al., 2009). Já a OPG, uma proteína solúvel, é expressa por osteoblastos e

fibroblastos do ligamento periodontal (OGASAWARA et al., 2004). A OPG se

liga com RANKL, bloqueando a ativação de RANK e inibindo a reabsorção

óssea (OSHIRO et al., 2002; DUNN et al., 2007; TAN et al., 2009).

O contato direto entre as células precursoras de osteoclastos e as

células do ligamento periodontal é crucial para que ocorra a osteoclastogênese.

Portanto, antes da secreção de fatores solúveis que promovam a maturação de

osteoclastos, o fluxo de células precursoras sanguíneas ao ligamento

periodontal é fundamental para o estímulo da reabsorção óssea (KANZAKI et

al., 2001).

Apesar de outras moléculas guardarem importância sobre a maturação e

ativação de osteoclastos, Shiotani et al. (2002), comprovaram que RANKL

Discussão 55

exerce papel determinante nesse processo. Mesmo o fator estimulador de

colônias de macrófagos não é capaz de promover a maturação completa de

osteoclastos in vitro, sendo que, apenas da presença de RANKL, os pré-

osteoclastos são convertidos em células com função reabsortiva sobre o tecido

ósseo. Já a OPG inibi a formação de bordas em escova e, logo, a atividade

reabsortiva de osteoclastos. O aumento da expressão de RANKL determina,

segundo Kanzaki et al. (2002), o aumento proporcional da reabsorção óssea.

Portanto, RANKL expressa na superfície de osteoblastos e células do

ligamento periodontal é a principal molécula responsável pela reabsorção

óssea, uma vez que pode promover a maturação e ativação de osteoclastos

através da ligação com RANK que, conforme demonstrado por Ogasawara et

al. (2004), é expresso pelas células precursoras e osteoclastos inativados.

Outro achado que evidencia o papel de RANKL é a presença dessa

molécula na zona clara de osteoclastos, conforme estudos de Shiotani et al.

(2001). Por ser uma zona desprovida de organelas encontrada apenas em

osteoclastos ativados (TEN CATE; 2008), as moléculas de RANKL ali

presentes podem estar sendo transportadas para o meio extracelular. Como já

sabido, lisossomos participam desse trânsito, enviando enzimas como a

fosfatase ácida para a região de reabsorção óssea (TEN CATE; 2008). Os

osteoclastos maduros teriam, portanto, um mecanismo de regulação autócrina,

uma vez que essas mesmas células podem expressar RANKL e RANK

concomitantemente, como elucidado por Ogasawara et al. (2004).

O fato de os próprios osteoclastos expressarem tanto RANKL quanto

RANK, poderia levantar a hipótese de que essas células, ao receber o estímulo

Discussão 56

adequado, seriam capazes de iniciar o processo de reabsorção óssea

sozinhas.

Entretanto, o estudo de Oshiro et al. (2002) demonstraram, em cobaias,

que a expressão de RANKL por osteoclastos guarda um atraso de 72 horas em

relação a RANKL expresso por fibroblastos e osteoblastos. Portanto, RANKL

expresso por osteoclastos só participa da regulação da reabsorção óssea em

um segundo momento, após o processo ter sido deflagrado. Dessa forma, a

expressão de RANKL por osteoclastos é uma evidência da atividade

osteoclástica ou, vsitos de outra forma, RANKL é um marcador da atividade

osteoclástica (ANDRADE JR. et al., 2009).

Mas o que deflagraria o processo de reabsorção óssea? Shiotani et al.

(2001) submeteram cobaias a forças ortodônticas de pressão e estudaram a

localização de RANKL e RANK no ligamento periodontal, no entanto, os

autores não relacionaram a expressão dessas proteínas ao estímulo aplicado.

Já Oshiro et al. (2002), assim como Ogasawara et al. (2004) e Kim et al.

(2007), citaram o aumento da expressão de RANKL após a aplicação das

forças de pressão, mas não submeteram seus resultados à análise estatística.

A seguir será explanado como a direção da força ortodôntica, a terapia

genética, a utilização de fármacos, a laserterapia, condições patológicas e a

reabsorção radicular influenciam e/ou estão relacionados com RANKL e OPG.

Nos próximos parágrafos, será elucidado como a reabsorção óssea é

deflagrada através do aumento de RANKL. Em continuação, como ela pode ser

modulada, através da alteração nos níveis de RANKL e OPG, para produzir a

Discussão 57

movimentação ortodôntica com a maior eficiência e menor dano tecidual

possível.

3.1- AS FORÇAS DE PRESSÃO

Os precursores de osteoclastos se diferenciam dentro da medula óssea

e então migram para o ligamento periodontal durante os estágios iniciais da

movimentação ortodôntica (XIE; KUIJPERS; MALTHA, 2008).

Kanzaki et al. (2002) foram os primeiros autores a demonstrar,

estatisticamente, o aumento da expressão de RANKL e do número de

osteoclastos através do emprego de forças de pressão sobre células do

ligamento periodontal e células precursoras de osteoclastos in vitro. Ambos os

aumentos foram proporcionais à magnitude e o tempo de aplicação da força de

pressão, até que, após um determinado nível de magnitude e passadas

algumas horas, não houve mais aumento, tanto da expressão de RANKL

quanto no número de osteoclastos. Com relação aos níveis de OPG, os

autores não relataram qualquer mudança. Em outro estudo semelhante, Nakao

et al. (2007) apresentaram resultados que sugerem que forças de pressão

leves e intermitentes são as ideais para induzir a expressão de RANKL, em

quantidade e com menor dano celular, entretanto, não foi apresentada análise

estatística desses dados. Já Nakajima et al. (2008) constataram o aumento da

expressão de RANKL, proporcional ao tempo e magnitude da força de pressão

empregada.

Já foi largamente difundido o conceito de “força ótima” em magnitude e

tempo para realização de tratamentos ortodônticos em humanos, sendo que,

Discussão 58

esses resultados, são os indícios moleculares de como e por que isso ocorre.

Entretanto, o fato desses dados a respeito da expressão de RANKL sob a

influência de forças de pressão terem sido obtidos in vitro, além de alguns

serem apresentados sem análise estatística, exige que sejam guardadas

ressalvas antes de se afirmar que o mesmo ocorre em humanos, in vivo.

Outros resultados concordantes com o conceito de “força ótima” foram

obtidos por Li et al. (2011), também in vitro. Foi constatado que, com o

aumento do tempo de aplicação das forças de pressão sobre células do

ligamento periodontal, os níveis de RANKL, antes aumentados, apresentaram-

se diminuídos, sendo o contrário observado para OPG. Apesar das ressalvas

com que se deve analisar os resultados in vitro, há de se levar em

consideração que o tempo de aplicação da força, e não só a sua direção,

podem influenciar diferentemente a expressão de RANKL e OPG. Resultados

semelhantes de Mitsuhashi et al. (2011), corroboram com Li et al. (2011). No

entanto, a diminuição de RANKL com o aumento do tempo de aplicação da

força de pressão não foi estatisticamente significante.

Kanzaki et al. (2006ª) aplicaram um modelo em que a expressão de

RANKL foi estimulada através de terapia genética e força ortodôntica em ratos.

Pode-se constatar in vivo, que o aumento da expressão de RANKL na região

do ligamento periodontal submetido a forças de pressão estimula a

osteoclastogênese e, como conseguinte, a movimentação ortodôntica. Esses

resultados são sustentados por Zuo et al. (2007), que constataram a ativação

do Fator Nuclear kappa β após o emprego de força ortodôntica em cobaias.

Discussão 59

O aumento da expressão de RANKL em relação a OPG, no ligamento

periodontal submetido a forças ortodônticas contínuas de pressão foi

demonstrado por Kim et al. (2007). Em acordo com esses dados, Brooks et al.

(2009) observaram aumento de RANKL no ligamento periodontal sob forçars

ortodônticas de pressão, também em cobaias Entretanto, nesses estudos in

vivo, não foi apresentada análise estatística dos dados obtidos.

Os primeiros estudos em humanos que avaliaram os níveis de OPG e

RANKL no ligamento periodontal após o emprego de forças de pressão são de

Kawasaki et al. (2006) e Nishijima et al. (2006). Ambos relataram aumento nos

níveis de RANKL e diminuição de OPG após 24 horas da ativação do aparelho

fixo, na região de pressão do ligamento periodontal. Entretanto, em outro

estudo em humanos, Garlet et al. (2007) relataram aumento tanto nos níveis de

OPG quanto de RANKL, sendo que no lado de pressão do ligamento

periodontal, o aumento de RANKL foi mais pronunciado. Com relação a

RANKL, os mesmos resultados foram obtidos em outro estudo de Garlet et al.,

2008. Concordando com Kawasaki et al. (2006) e Nishijima et al. (2006), o

estudo de Toygar et al. (2008) também demonstrou em humanos que, sob

forças ortodônticas de pressão, há uma diminuição dos níveis de OPG no

ligamento periodontal.

Esses diferentes resultados, principalmente com relação a OPG,

comprovam que a região do periodonto estudada, assim como o tipo e

magnitude de força empregada podem influenciar sensivelmente nos dados

obtidos. Nos trabalhos de Garlet et al., são analisados o ligamento periodontal

de pré-molares extraídos submetidos à ancoragem para disjunção maxilar não

cirúrgica (força ortopédica); já nos trabalhos de Kawasaki et al. (2006),

Discussão 60

Nishijima et al. (2006) e Toygar et al. (2008), é analisado o fluído crevicular de

caninos submetidos à retração após a extração de primeiros pré-molares (força

ortodôntica). A despeito da metodologia empregada, pode-se concluir que, sob

a influência de forças de pressão in vivo, os níveis de RANKL sofrem um

aumento no ligamento periodontal (KAWASAKI et al., 2006; NISHIJIMA et al.,

2006; GARLET et al., 2007; 2008). Já os níveis de OPG podem ser

aumentados também sob forças de pressão, quando estas apresentam

grandes magnitudes, neste caso, forças ortopédicas (GARLET et al., 2007) ou

diminuídos sob a ação de forças ortodônticas (TOYGAR et al., 2008).

Outro fato que chama a atenção para o aumento de OPG observado por

Garlet et al. (2007) no lado de pressão do ligamento peiodontal, é que os

autores não mencionam o intervalo de tempo entre o fim da ativação do

aparelho e a remoção do mesmo, no momento em que foram feitas as

análises. Como demonstrado por Mitsuhashi et al. (2011) e Li et al. (2011) o

tempo de aplicação da força pode, além de sua direção e magnitude,

influenciar na expressão de RANKL e OPG.

3.2- AS FORÇAS DE TENSÃO

Assim como as forças de pressão, as forças de tensão também

demonstraram, in vitro, influenciar a expressão de RANKL e OPG em células

do ligamento periodontal. Kanzaki et al. (2006b) constataram aumento de

RANKL e OPG. Com relação à atividade reabsortiva, foi evidenciada uma

diminuição, estatisticamente significante, nas células submetidas à tensão.

Tang, Lin e Li (2006) concluíram, em estudo semelhante, que há aumento da

Discussão 61

expressão de OPG e diminuição de RANKL, proporcional a magnitude da força

de tensão aplicada sobre osteoblastos. Apesar dos estudos utilizarem forças

intermitentes, os resultados díspares com relação à RANKL podem ser

explicados pela duração de emprego da força de tensão ser diferente. A

diminuição de RANKL foi constatada após 24 horas; e o aumento após 48

horas. Entretanto, ambos os estudos concordam em afirmar que o emprego de

forças de tensão intermitentes promovem aumento nos níveis de OPG in vitro.

Com relação aos resultados obtidos in vivo, foi demonstrado que os

níveis de OPG no ligamento periodontal de humanos são aumentados quando

do emprego de forças de tensão pesadas (ortopédicas), o mesmo ocorrendo

com RANKL, porém, em menor escala (GARLET et al., 2007; 2008).

Apesar de os estudos evidenciarem o aumento de OPG nas células

periodontais submetidas às forças de tensão (KANZAKI et al., 2006b; TANG;

LIN; LI, 2006; GARLET et al., 2007; 2008), o resultado obtido por Kanzaki et al.

(2006b) torna-se o mais relevante sobre o aspecto clínico, uma vez que foi

evidenciado uma diminuição da atividade reabsortiva dos osteoclastos in vitro.

Yu, de Vos e Ren et al. (2011), observaram o comportamento de pré-

osteoblastos in vitro que foram estimulados geneticamente a expressar OPG. O

estudo concluiu que o aumento nos níveis de OPG não influenciou RANKL,

mas promoveu estímulo maior à maturação de osteoblastos. Portanto, além de

inibir a atividade osteoclástica, a OPG exerce importante papel na neoformação

óssea que ocorre no lado de tensão (através do estímulo à maturação de

osteoblastos) do ligamento periodontal, uma vez já comprovado o aumento dos

níveis de OPG sob forças de tensão (KANZAKI et al., 2006b; TANG; LIN; LI,

Discussão 62

2006; GARLET et al., 2007; 2008). Assim como RANKL representa um

marcador da atividade osteoclástica, a OPG é um marcador da atividade

osteoblástica (ANDRADE JR. et al., 2009).

3.3- TERAPIA GENÉTICA

No momento atual, a ciência tem obtido avanços significativos no estudo

da genética. Através da terapia genética, Kanzaki et al. (2004 e 2006ª)

promoveram a aceleração e o retardamento da movimentação ortodôntica in

vivo. Através da indução da expressão de RANKL no ligamento periodontal

submetido a forças de pressão, Kanzaki et al. (2006ª) observaram um aumento

da movimentação ortodôntica. Em outro estudo utilizando a mesma

metodologia, Kanzaki et al. (2004) estimularam a expressão de OPG e

constataram uma diminuição da movimentação ortodôntica. Ambos os estudos

têm grande relevância clínica, uma vez que foram realizados in vivo.

Entretanto, ainda não há evidências suficientes para que a técnica seja

empregada com segurança em humanos.

3.4- FÁRMACOS

Uma vez que as terapias genéticas ainda não encontram respaldo

científico para aplicação em humanos, o estudo de Keles et al. (2007) busca

como alternativa a utilização de fármacos para influenciar a movimentação

ortodôntica. O Pamidronato dissódico, largamente utilizado no tratamento da

osteoporose, foi avaliado como inibidor da movimentação ortodôntica in vivo,

uma vez que atua na inibição da atividade osteoclástica (KELES et al., 2007).

Discussão 63

Os resultados apontaram para uma diminuição de 34% na movimentação

ortodôntica, porém, não estatisticamente significante, com a injeção local do

fármaco. Em contrapartida, a injeção de OPG demonstrou-se eficiente

(estatisticamente significante) na inibição da movimentação ortodôntica. Apesar

dos resultados obtidos com a injeção de OPG, não há fármacos com esse

princípio ativo que tenham aplicação comprovadamente segura em humanos.

No sentido de acelerar a movimentação ortodôntica, Alves et al. (2009)

avaliaram os efeitos da injeção local do Fator de Crescimento Epidérmico

(EGF) in vivo. Apesar de os autores constatarem um aumento estatisticamente

significante na movimentação ortodôntica após 14 dias da ativação do

aparelho, no caso do EGF também não há evidências científicas que suportem

sua aplicação em humanos.

Além da utilização de fármacos para acelerar (ALVES et al., 2009) ou

inibir (KELES et al., 2007) a movimentação ortodôntica, Han et al., em 2010,

estudaram uma alternativa para solucionar o problema da recidiva nos

tratamentos ortodônticos. Nesse estudo, Han et al. (2010) prescreveram

Sinvastatina a cobaias e, in vivo, observaram que a recidiva após o uso do

aparelho fixo apresentou-se significantemente reduzida. Além desses dados,

foi constatado um aumento dos níveis de OPG no ligamento periodontal nesses

casos. Isso indica que, não obstante o aumento dos níveis de OPG inibir a

movimentação ortodôntica (KANZAKI et al., 2004), também a movimentação

dentária característica de recidiva pós tratamento ortodôntico também é

reduzida (HAN et al., 2010).

Discussão 64

Entretanto, apesar da Sinvastatina (HAN et al., 2010) já ser, como o

Pamidronato (KELES et al., 2007), largamente utilizada, ainda não há estudos

que comprovem a sua eficácia em prevenir a recidiva ortodôntica em humanos.

Portanto, o uso de fármacos que influem nos níveis de OPG e RANKL

no ligamento ortodôntico, ainda não encontra respaldo científico para aplicação

clínica.

3.5- VIBRAÇÃO POR RESSONÂNCIA

Nishimura et al. (2008) constataram aumento da movimentação

ortodôntica através do emprego de vibração por ressonância sobre o esmalte

dentário de cobaias. Concomitantemente, foi observado aumento nos níveis de

RANKL, embora não revelados estatisticamente significantes. Embora seja um

pouco invasivo, há poucas evidências científicas que respaldem o emprego

desse método em humanos com o propósito de estimular a movimentação

ortodôntica.

3.6- LASERTERAPIA

O uso do laser na área médica e odontológica já é bastante difundido

atualmente. No entanto, o primeiro estudo a relacionar variação da atividade

osteoclástica, via RANKL, através de laserterapia foi realizado por Aihara,

Yamaguchi e Kasai, em 2006. Esses autores demonstraram estimulação da

osteoclastogênese, assim como da atividade reabsortiva, nas células

precursores de osteoclastos irradiadas com laser de baixa potência (AsGaAl) e

Discussão 65

citaram um aumento dos níveis de RANKL (não confirmado estatisticamente).

Corroborando com esse estudo, Fujita et al. (2008) realizaram experimentos, in

vivo, em que comprovaram, além do aumento dos níveis de RANKL e do

número de osteoclastos nas áreas de pressão do ligamento periodontal, maior

movimentação ortodôntica com a irradiação do laser de baixa potência

(AsGaAl) de forma estatisticamente significante. No entanto, o laser não

demonstrou qualquer influência sobre os níveis de OPG.

Altan, Sokucu e Ozkut (2010), em estudo semelhante, confirmaram os

resultados obtidos por Fujita et al. (2008), porém, relataram aumento não

estatisticamente significante na movimentação ortodôntica. Em ambos os

estudos, foi empregada a mesma dose de laserterapia em cada cobaia (54 J).

A diferença entre ambos restringiu-se a duas variáveis importantes; enquanto

Fujita et al. (2008) utilizaram 25 cobaias no grupo experimental e força de 10

gramas aplicada à molares, Altan, Sokucu e Ozkut (2010) fizeram uso de 11

cobaias e força de 20 gramas aplicada à incisivos.

Se por um lado a maior amostra confere maior valor estatístico ao

estudo de Fujita et al. (2008), o estudo de Altan, Sokucu e Ozkut (2010)

emprega força ortodôntica de intensidade duplicada (20 gramas versus 10

gramas). Além disso, o fato da análise deter-se sobre elementos dentais

diversos (incisivos e molares), não permite uma conclusão que valide mais um

dos estudos em detrimento do outro.

Apesar de não haver estudos, em humanos, comprovando o aumento da

movimentação ortodôntica através da variação dos níveis de RANKL/OPG com

laserterapia, o emprego do laser de baixa potência já mostra eficácia no

Discussão 66

aumento da movimentação ortodôntica em estudos pré-liminares (CRUZ et al.,

2004; YOUSSEF et al., 2007).; além de comprovar-se eficaz e seguro no alívio

da dor causada pela ativação do aparelho ortodôntico (LIM; LEW; TAY, 1995;

TURHANI et al, 2006; TORTAMANO et al, 2009).

No Brasil, a norma adotada para regulamentar o uso do laser de baixa

potência é a da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) que, por

sua vez, tem base na norma européia IEC 60601-2-22. O laser de AsGaAl

pode ser classificado como pertencente a Classe IIIb e demanda, por isso, o

uso de óculos de proteção (específico para o comprimento de onda utilizado) e

dispositivo de interrupção de emissão laser.

Portanto, apenas a realização de mais estudos respaldando a utilização

do laser de baixa potência para aumento da movimentação ortodôntica em

humanos é aguardada para que seu emprego possa ser difundido para este fim

(CRUZ et al., 2004; YOUSSEF et al., 2007). Entretanto, já é confirmado pela

literatura a eficácia e segurança do emprego dessa terapêutica no alívio da dor

resultante da ativação do aparelho ortodôntico (LIM; LEW; TAY, 1995;

TURHANI et al, 2006; TORTAMANO et al, 2009).

3.7- DESCORTICALIZAÇÃO ÓSSEA

A descorticalização (remoção da cortical óssea) tem-se demonstrado um

método eficaz de aumentar a movimentação ortodôntica em humanos (KIM et

al., 2009; WILCKO et al., 2009). Baloul et al. (2011) constataram, em cobaias,

que concomitantemente à maior movimentação ortodôntica, há aumento na

expressão de RANKL através do emprego dessa técnica. Entretanto, trata-se

Discussão 67

de um procedimento cirúrgico, onde há a remoção parcial da cortical óssea no

entorno das raízes dos dentes a serem movimentados.

3.8- CONDIÇÕES PATOLÓGICAS LOCAIS E SISTÊMICAS

O primeiro indício de que condições patológicas sistêmicas podem

influenciar a expressão de RANKL e, por conseqüência, a movimentação

ortodôntica foi apresentado por Braga et al., em 2011. Cobaias diabéticas, além

de apresentarem maior movimentação ortodôntica, têm a expressão de RANKL

aumentada no ligamento periodontal submetido a forças de pressão (BRAGA et

al., 2011).

Segundo Okamoto et al. (2009), a saúde local do tecido periodontal

também tem influência sobre as mudanças nos níveis de RANKL observados

durante a incidência de força ortodôntica. O aumento da expressão de RANKL

nas áreas do ligamento periodontal sob a incidência de forças de pressão tem

um padrão alterado na presença de doença periodontal, sendo os maiores

níveis de RANKL observados nas regiões da crista óssea. Não obstante, nas

áreas onde o ligamento encontra-se comprimido, a expressão de RANKL é

menor em relação ao ligamento periodontal saudável. Já foi demonstrado, in

vitro, que fibroblastos gengivais, embora sobre a influência de forças de

pressão, têm a expressão de OPG aumentada, no que pode ser um

mecanismo de defesa contra reabsorção da crista alveolar (KOOK et al., 2009).

A doença periodontal, portanto, além de suplantar esse mecanismo de defesa,

tem o potencial de inibir a movimentação ortodôntica através da menor

expressão de RANKL nas outras áreas de pressão do ligamento periodontal.

Discussão 68

3.9- REABSORÇÃO RADICULAR

A reabsorção radicular é um fenômeno de etiologia multifatorial que

pode acometer os dentes submetidos a tratamento ortodôntico, principalmente

nos casos onde esse tratamento se estende por longo período; e/ou emprega

forças ortodônticas pesadas (LOW et al., 2005; YAMAGUCHI et al., 2006;

GEORGE; EVANS, 2009; NAKANO et al., 2011; TYROVOLA et al., 2010;

ZHOU et al., 2011; JUNG; CHO, 2011).

Recentemente, as moléculas envolvidas no processo de reabsorção

radicular têm sido o foco de vários estudos, em especial RANKL e OPG (LOW

et al., 2005; YAMAGUCHI et al., 2006; GEORGE; EVANS, 2009; NAKANO et

al., 2011; TYROVOLA et al., 2010; ZHOU et al., 2011).

O aumento dos níveis e expressão de RANKL está relacionado à

reabsorção radicular, seja no fluído crevicular, no ligamento periodontal ou no

sangue circulante, in vitro e in vivo (YAMAGUCHI et al., 2006; GEORGE;

EVANS, 2009; NAKANO et al., 2011; TYROVOLA et al., 2010; ZHOU et al.,

2011). Em apenas um estudo (LOW et al., 2005), realizado in vivo, foi

constatado aumento na expressão de OPG nas áreas de pressão do ligamento

periodontal dos dentes que sofreram reabsorção radicular.

O fato de cobaias acometidas por reabsorção radicular durante o

tratamento ortodôntico com forças leves apresentarem, antes do tratamento,

maiores níveis séricos de RANKL em relação àquelas não acometidas, aponta

um método de predizer o risco de um indivíduo apresentar reabsorção radicular

antes do início do tratamento através de um exame sanguíneo (TYROVOLA et

al., 2010). Entretanto, apenas o estudo de Tyrovola et al. (2010), realizado em

Discussão 69

cobaias, fornece evidências para aplicação deste método, que utiliza RANKL

como marcador biológico para reabsorção radicular.

Um método de induzir a reabsorção radicular em pesquisas científicas é

o emprego de forças ortodônticas pesadas (LOW et al., 2005; NAKANO et al.,

2011; ZHOU et al., 2011). O aumento da magnitude da força ortodôntica é

proporcional ao aumento de RANKL (KANZAKI et al. 2002; NAKAJIMA et al.

2008; NAKAO et al. 2007). Porém, a partir de uma magnitude muito elevada,

há uma diminuição de RANKL (KANZAKI et al. 2002; LI et al. (2011)

MITSUHASHI et al. 2011). Essa diminuição de RANKL pode ser uma maneira

de reequilibrar a proporção fisiológica entre RANKL/OPG, uma vez que ela

encontre-se muito alterada. Entretanto, não há evidências da existência desse

mecanismo de regulação entre RANKL e OPG.

Portanto, o aumento de RANKL está relacionado à reabsorção radicular,

sendo a incidência de forças ortodônticas pesadas por longos períodos o

principal fator desencadeador desse processo.

CONCLUSÃO

71

4- CONCLUSÃO

Fazendo uma análise dos trabalhos científicos apresentados, julga-se

lícito concluir que:

• A RANKL RANK e OPG têm papel fundamental no processo de

maturação e ativação dos osteoclastos.

• Enquanto RANKL estimula a reabsorção óssea, OPG a inibe.

• A direção da força ortodôntica pode influenciar na expressão de

RANKL, no sentido de que forças de pressão aumentam os níveis de RANKL,

enquanto forças de tensão aumentam os níveis de OPG no ligamento

periodontal.

• A magnitude da força ortodôntica pode influenciar na expressão de

RANKL. Os níveis de RANKL aumentam proporcionalmente à magnitude da

força ortodôntica de pressão, até um limite.

• A OPG inibe a movimentação dentária, tanto ortodôntica quanto de

recidiva em cobaias. No entanto, não há ainda respaldo científico para o

emprego de terapias que aumente os níveis de OPG com o intuito de evitar a

recidiva pós-tratamento ortodôntico em humanos.

• Condições patológicas locais e sistêmicas podem influenciar na

expressão de RANKL e, portanto, na movimentação ortodôntica.

• O laser de baixa potência induz a expressão de RANKL e acelera a

movimentação ortodôntica em humanos, de forma não-invasiva.

• A reabsorção radicular está relacionada com o aumento dos níveis de

RANKL.

REFERÊNCIAS

73

5- REFERÊNCIAS

Aihara N, Yamaguchi M, Kasai K. Low-energy irradiation stimulates formation of osteoclast-like cells via RANK expression in vitro. Lasers Med Sci. 2006 Apr;21(1):24-33.

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Molecular Biology of the Cell, 5nd ed. Taylor and Francis; 2007.

Altan BA, Sokucu O, Ozkut MM, Inan S. Metrical and histological investigation of the effects of low-level laser therapy on orthodontic tooth movement. LasersMed Sci. 2010 Oct 31 [Epub ahead of print].

Alves JB, Ferreira CL, Martins AF, Silva GA, Alves GD, Paulino TP, Ciancaglini P, Thedei G Jr, Napimoga MH. Local delivery of EGF-liposome mediated bone modeling in orthodontic tooth movement by increasing RANKL expression. Life Sci. 2009 Nov 4;85(19-20):693-9.

Andrade I Jr, Taddei SR, Garlet GP, Garlet TP, Teixeira AL, Silva TA, Teixeira MM. CCR5 down-regulates osteoclast function in orthodontic tooth movement. J Dent Res. 2009 Nov;88(11):1037-41.

Baloul SS, Gerstenfeld LC, Morgan EF, Carvalho RS, Van Dyke TE, Kantarci A. Mechanism of action and morphologic changes in the alveolar bone in response to selective alveolar decortication-facilitated tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2011 Apr;139(4 Suppl):S83-101.

Braga SMG, Taddei SRA, Andrade Jr. I, Queiroz-Júnior CM, Garlet GP, Repeke CE, Teixeira MM, da Silva TA. Effect of diabetes on orthodontic tooth movement in a mouse model. Eur J Oral Sci. 2011;119:7-14.

Brooks PJ, Nilforoushan D, Manolson MF, Simmons CA, Gong SG. Molecular markers of early orthodontic tooth movement. Angle Orthod. 2009 Nov;79(6):1108-13.

Cruz DR, Kohara EK, Ribeiro MS, Wetter NU. Effects of low-intensity laser therapy on the orthodontic movement velocity of human teeth: a preliminary study. Lasers Surg Med. 2004;35(2):117-20.

Dunn MD, Park CH, Kostenuik PJ, Kapila S, Giannobile WV. Local delivery of osteoprotegerin inhibits mechanically mediated bone modeling in orthodontic tooth movement. Bone. 2007 Sep;41(3):446-55.

Fujita S, Yamaguchi M, Utsunomiya T, Yamamoto H, Kasai K. Low-energy laser stimulates tooth movement velocity via expression of RANK and RANKL. Orthod Craniofac Res. 2008 Aug;11(3):143-55.

Garlet TP, Coelho U, Silva JS, Garlet GP. Cytokine expression pattern in compression and tension sides of the periodontal ligament during orthodontic tooth movement in humans. Eur J Oral Sci. 2007 Oct;115(5):355-62.

Referências 74

Garlet TP, Coelho U, Repeke CE, Silva JS, Cunha Fde Q, Garlet GP. Differential expression of osteoblast and osteoclast chemmoatractants in compression and tension sides during orthodontic movement. Cytokine. 2008 Jun;42(3):330-5.

George A, Evans CA. Detection of root resorption using dentin and bone markers. Orthod Craniofac Res. 2009 Aug;12(3):229-35.

Han G, Chen Y, Hou J, Liu C, Chen C, Zhuang J, Meng W. Effects of simvastatim on relapse and remodeling of periodontal tissues after tooth movment in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2010;138:550.e1-550.e7.

Junqueira LCU, Carneiro J. Biologia Celular e Molecular, 8.a ed. Guanabara; 2005.

Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition. J Dent Res. 2001 Mar;80(3):887-91.

Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Periodontal ligament cells under mechanical stress induce osteoclastogenesis by receptor activator of nuclear factor kappaB ligand up-regulation via prostaglandin E2 synthesis. J Bone Miner Res. 2002 Feb;17(2):210-20.

Kanzaki H, Chiba M, Takahashi I, Haruyama N, Nishimura M, Mitani H. Local OPG gene transfer to periodontal tissue inhibits orthodontic tooth movement. J Dent Res. 2004 Dec;83(12):920-5.

Kanzaki H, Chiba M, Arai K, Takahashi I, Haruyama N, Nishimura M, Mitani H. Local RANKL gene transfer to the periodontal tissue accelerates orthodontic tooth movement. Gene Ther. 2006 Apr;13(8):678-85. ª

Kanzaki H, Chiba M, Sato A, Miyagawa A, Arai K, Nukatsuka S, Mitani H. Cyclical tensile force on periodontal ligament cells inhibits osteoclastogenesis through OPG induction. J Dent Res. 2006 May;85(5):457-62. b

Kawasaki K, Takahashi T, Yamaguchi M, Kasai K. Effects of aging on RANKL and OPG levels in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement. Orthod Craniofac Res. 2006 Aug;9(3):137-42.

Keles A, Grunes B, Difuria C, Gagari E, Srinivasan V, Darendeliler MA, Muller R, Kent R Jr, Stashenko P. Inhibition of tooth movement by osteoprotegerin vs. pamidronate under conditions of constant orthodontic force. Eur J Oral Sci. 2007 Apr;115(2):131-6.

Kim T, Handa A, Iida J, Yoshida S. RANKL expression in rat periodontal ligament subjected to a continuous orthodontic force. Arch Oral Biol. 2007 Mar;52(3):244-50.

Referências 75

Kim SH, Kook YA, Jeong DM, Lee W, Chung KR, Nelson G. Clinical application of accelerated osteogenic orthodontics and partially osseointegrated mini-implants for minor tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2009 Sep;136(3):431-9.

Kook SH, Son YO, Choe Y, Kim JH, Jeon YM, Heo JS, Kim JG, Lee JC. Mechanical force augments the anti-osteoclastogenic potential of human gingival fibroblasts in vitro. J Periodontal Res. 2009 Jun;44(3):402-10.

Krishnan V, Davidovitch Z. Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2006 Apr;129(4):469.e1-32.

Li Y, Zheng W, Liu JS, Wang J, Yang P, Li ML, Zhao ZH. Expression of Osteoclastogenesis Inducers in a Tissue Model of Periodontal Ligament under Compression. J Dent Res. 2011 Oct 12 Jan;90(1):115-20.

Lim HM, Lew KK, Tay DK. A clinical investigation of the efficacy of low level laser therapy in reducing orthodontic postadjustment pain. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 1995 Dec;108(6):614-22.

Low E, Zoellner H, Kharbanda OP, Darendeliler MA. Expression of mRNA for osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand (RANKL) during root resorption induced by the application of heavy orthodontic forces on rat molars. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2005 Oct;128(4):497-503.

Masella RS, Meister M. Current concepts in the biology of orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2006 Apr;129(4):458-68.

Meikle MC. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. Eur J Orthod. 2006 Jun;28(3):221-40. Epub 2006 May 10.

Mitsuhashi M, Yamaguchi M, Kojima T, Nakajima R, Kasai K. Effects of HSP70 on the compression force-induced TNF-a and RANKL expression in human periodontal ligament cells. Inflamm Res. 2011 Feb;60(2):187-94.

Nakajima R, Yamaguchi M, Kojima T, Takano M, Kasai K. Effects of compression force on fibroblast growth factor-2 and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand production by periodontal ligament cells in vitro. J Periodontal Res. 2008 Apr;43(2):168-73.

Nakano Y, Yamaguchi M, Fujita S, Asano M, Saito K, Kasai K. Expressions of RANKL/RANK and M-CSF/c-fms in root resorption lacunae in rat molar by

heavy orthodontic force. Eur J Orthod. 2011 Aug;33(4):335-43.

Referências 76

Nakao K, Goto T, Gunjigake KK, Konoo T, Kobayashi S, Yamaguchi K. Intermittent force induces high RANKL expression in human periodontal ligament cells. J Dent Res. 2007 Jul;86(7):623-8.

Nishijima Y, Yamaguchi M, Kojima T, Aihara N, Nakajima R, Kasai K. Levels of RANKL and OPG in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement and effect of compression force on releases from periodontal ligament cells in vitro. Orthod Craniofac Res. 2006 May;9(2):63-70.

Nishimura M, Chiba M, Ohashi T, Sato M, Shimizu Y, Igarashi K, Mitani H. Periodontal tissue activation by vibration: intermittent stimulation by resonance vibration accelerates experimental tooth movement in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2008 Apr;133(4):572-83.

Ogasawara T, Yoshimine Y, Kiyoshima T, Kobayashi I, Matsuo K, Akamine A, Sakai H. In situ expression of RANKL, RANK, osteoprotegerin and cytokines in osteoclasts of rat periodontal tissue. J Periodontal Res. 2004 Feb;39(1):42-9.

Okamoto A, Ohnishi T, Bandow K, Kakimoto K, Chiba N, Maeda A, Fukunaga T, Miyawaki S, Matsuguchi T. Reduction of orthodontic tooth movement by experimentally induced periodontal inflammation in mice. Eur J Oral Sci. 2009 Jun;117(3):238-47.

Oshiro T, Shiotani A, Shibasaki Y, Sasaki T. Osteoclast induction in periodontal tissue during experimental movement of incisors in osteoprotegerin-deficient mice. Anat Rec. 2002 Apr 1;266(4):218-25.

Santos CF, Sakai VT, Machado MAAM, Schippers DN, Greene AS. Reverse transcription and polymerase chain reaction: principles and applications in dentistry. J Appl Oral Sci. 2004; 12(1):1-11.

Shiotani A, Shibasaki Y, Sasaki T. Localization of receptor activator of NFkappaB ligand, RANKL, in periodontal tissues during experimental movement of rat molars. J Electron Microsc (Tokyo). 2001;50(4):365-9.

Shiotani A, Takami M, Itoh K, Shibasaki Y, Sasaki T. Regulation of osteoclast differentiation and function by receptor activator of NFkB ligand and osteoprotegerin. Anat Rec. 2002 Oct 1;268(2):137-46.

Tan L, Ren Y, Wang J, Jiang L, Cheng H, Sandham A, Zhao Z. Osteoprotegerin and ligand of receptor activator of nuclear factor kappaB expression in ovariectomized rats during tooth movement. Angle Orthod. 2009 Mar;79(2):292-8.

Tang L, Lin Z, Li YM. Effects of different magnitudes of mechanical strain on Osteoblasts in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2006 May 26;344(1):122-8.

Referências 77

Ten Cate, AR. Oral histology: development, structure and function, 7nd ed. Elservier: Mosby; 2007.

Tortamano A, Lenzi DC, Haddad AC, Bottino MC, Dominguez GC, Vigorito JW. Low-level laser therapy for pain caused by placement of the first orthodontic archwire: a randomized clinical trial. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2009 Nov;136(5):662-7.

Toygar HU, Kircelli BH, Bulut S, Sezgin N, Tasdelen B. Osteoprotegerin in gingival crevicular fluid under long-term continuous orthodontic force application. Angle Orthod. 2008 Nov;78(6):988-93.

Tsuchiya M, Akiba Y, Takahashi I, Sasano Y, Kashiwazaki J, Tsuchiya S, Watanabe M. Comparison of expression patterns of cathepsin K and MMP-9 in odontoclasts and osteoclasts in physiological root resorption in the rat molar.

Arch Histol Cytol. 2008 Sep;71(2):89-100. Turhani D, Scheriau M, Kapral D, Benesch T, Jonke E, Bantleon HP. Pain relief by single low-level laser irradiation in orthodontic patients undergoing fixed appliance therapy. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2006 Sep;130(3):371-7.

Tyrovola JB, Perrea D, Halazonetis DJ, Dontas I, Vlachos IS, Makou M. Relation of soluble RANKL and osteoprotegerin levels in blood and gingival crevicular fluid to the degree of root resorption after orthodontic tooth movement. J Oral Sci. 2010;52(2):299-311.

Wilcko MT, Wilcko WM, Pulver JJ, Bissada NF, Bouquot JE. Accelerated osteogenic orthodontics technique: a 1-stage surgically facilitated rapid orthodontic technique with alveolar augmentation. J Oral Maxillofac Surg. 2009 Oct;67(10):2149-59.

Xie R, Kuijpers-Jagtman AM, Maltha JC. Osteoclast differentiation during experimental tooth movement by a short-term force application: an immunohistochemical study in rats. Acta Odontol Scand. 2008 Oct;66(5):314-20.

Yamaguchi M, Aihara N, Kojima T, Kasai K. RANKL increase in compressed periodontal ligament cells from root resorption. J Dent Res. 2006 Aug;85(8):751-6.

Youssef M, Ashkar S, Hamade E, Gutknecht N, Lampert F, Mir M. The effect of low-level laser therapy during orthodontic movement: a preliminary study. Lasers Med Sci. 2008 Jan;23(1):27-33.

Yu H, de Vos P, Ren Y. Overexpression of osteoprotegerin promotes preosteoblast differentiation to mature osteoblasts. Angle Orthod. 2011 Jan;81(1):102-8.

Referências 78

Zhou JP, Feng G, Zhou WW, Ren AS, Wu Y, Zhang DM, Dai HW. Expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor κB ligand in root resorption induced by heavy force in rats. J Orofac Orthop. 2011 Nov;72(6):457-468.

Zuo J, Archer LA, Cooper A, Johnson KL, Holliday LS, Dolce C. Nuclear factor kappaB p65 phosphorylation in orthodontic tooth movement. J Dent Res. 2007 Jun;86(6):556-9.

Documents

Dissertação - Eduardo Ernst Massarelliarquivos.cruzeirodosuleducacional.edu.br/principal/old/mestrado... · Ortodontia da UNICID, Professor Doutor Flávio Vellini Ferreira, pela