UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

DANIELE BRUSTOLIM AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DAS FISALINAS B E F EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE DOENÇAS AUTOIMUNES

Feira de Santana, BA 2007

DANIELE BRUSTOLIM AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DAS FISALINAS B E F EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE DOENÇAS AUTOIMUNES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Milena Pereira Botelho Soares

Feira de Santana, BA 2007

DEDICATÓRIA

À meus pais, pelo apoio constante,

companheirismo e dedicação em todas as

etapas até aqui conquistadas. À meus irmãos

pela amizade. À Neto por estar ao meu lado.

E à minha filha, Maria que veio para me

ensinar que tudo vale a pena.

AGRADECIMENTOS

• À Deus o arquiteto do universo.

• À Dra Milena pela orientação, dedicação e compreensão em todos os momentos do

desenvolvimento deste trabalho.

• À Dr. Ricardo Ribeiro dos Santos, pela co-orientação, pela estrutura e experiência em

ciência transmitida.

• À família por ser o alicerce da vida. E aos meus amigos por existirem.

• À José Fernando Oliveira Costa, que me trouxe até aqui e segue me apoiando sempre.

• À Marcel Farias, por ter me auxiliado em várias etapas no desenvolvimento deste

trabalho.

• À Maria de Fátima Cepa Matos, minha mãe cientifica, quem me deu a primeira

oportunidade de fazer ciência.

• À todos os amigos do LETI que estiveram ao meu lado chorando, sorrindo e aprendendo

nestes anos de convivência. Em especial à Ricardo Santana e Elisalva Guimarães, por

compartilharem a experiência científica além da amizade. E Juliana Senra e Fabrício

Souza, por vivermos juntos esta etapa.

• À Flávia Maciel, pela amizade e por administrar o laboratório com muita competência. E

ainda por nos salvar várias vezes.

• A Carla e Siane, recentes companheiras de laboratório. Obrigada por me auxiliarem nas

etapas finais.

• À Josiane Quetz, amiga e companheira de laboratório. Mesmo distante sempre pronta a

ajudar.

• Aos funcionários do biotério do CpqGM. Em especial à Márcio e Josi, por estarem

sempre dispostos a ajudar.

• À Helton pela dedicação nos assuntos acadêmicos.

• À Dr.Washington Luis e Dr.Luis Freitas, por me auxiliarem nas observações

patológica.

• À FAPESB pela bolsa concedida.

“Embora a minha história queira fugir de mim, não significa que eu não seja seu autor; ela foge por que outros fizeram e fazem a minha história”.

JEAN PAUL SARTRE

RESUMO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DAS FISALINAS B e F EM MODELOS DE DOENÇAS AUTOIMUNES. [INTRODUÇÃO] As fisalinas B e F são seco-esteróides isolados da planta Physalis angulata com atividade imunomoduladora comprovada. Neste trabalho foram avaliadas a toxicidade aguda dessas moléculas e a atividade imunomoduladora nos modelos experimentais de lupus eritematoso sistêmico e artrite reumatóide. [MÉTODOS] A toxicidade aguda foi realizada em camundongos Swiss Webster. No modelo de lupus foram utilizados camundongos fêmeas NZB/W F1, e no modelo de artrite induzida por colágeno do tipo II, camundongos machos DBA/1. [RESULTADOS] Camundongos tratados com as fisalinas B e F apresentaram baixa mortalidade e poucos sinais de toxicidade. Os padrões bioquímicos não foram alterados, porém, o perfil hematológico mostrou um efeito dose-dependente na ação destas drogas. No modelo de lupus, houve uma melhora de 20-25% na sobrevida dos animais tratados com as fisalinas B ou F. A proteínuria nos camundongos tratados com fisalina F, apresentou uma redução significativa em relação ao grupo tratado com placebo. A análise histológica dos rins destes camundongos demonstrou melhora na evolução da doença pelo tratamento com as fisalinas. No modelo de artrite, a fisalina F agiu reduzindo o edema e o processo inflamatório nas articulações. [CONCLUSÃO] As fisalinas B e F apresentaram baixa toxicidade aguda. Essas drogas apresentaram, ainda, atividade supressora nos modelos de lupus eritematoso sistêmico e artrite reumatóide. PALAVRAS CHAVES: Produtos naturais. Toxicidade. Imunossupressão. Lupus eritematoso sistêmico. Artrite reumatóide.

ABSTRACT EVALUATION OF ACUTE TOXICITY AND OF THE IMMUNOMODULATORY ACTIVITY OF PHYSALINS B AND F IN EXPERIMENTAL MODELS OF AUTOIMMUNE DISEASES. Physalins B and F are seco-steroids isolated from Physalis angulata whith immunomodulatory activity. In this work we evaluated the acute toxicity of these substances and their immunomodulatory activity in experimental models of systemic lupus erythematosus and of reumathoid arthirtis. The acute toxicity was evaluated using Swiss Webster mice. We used female NZB/W F1 mice and male DBA/1 mice injected with type II collagen as model of lupus and arthritis, repsctively. Mice treated with physalins B and F showed low mortality and few signs of toxicity. The biochemical parameters were not altered, whereas the hematological profile showed a dose-dependent effect of these drugs. An improvement in survival of 20-25% in the group treatd with physalins B or F was observed in the experimental model of lupus. Mice treated with physalin F had a significant reduction in proteinuria compared to placebo-treated controls. Histologycal analysis of kidneys of these mice demonstrated an improvement of the disease progression by the treatment with physalins. In the model of arthritis, physalin F reduced the edema and inflammatory process in the joints. PhysalinsB and F have low acute toxicity. Furthermore, they have immunomodulatory activity in models of systemic lupus erythematosus and of rheumatoid arthritis Keywords: Natural products. Toxicity., Immunossupression. Systemic lupus erythematosus. Reumathoid arthirtis.

LISTA DE ABREVIATURAS ACF Adjuvante completo de Freund’s AIC Artrite induzida por colageno tipo II ALT Alanina amino transferase AR Artrite reumatóide AST Aspartato amino transferase DL50 Dose letal 50 DMSO Dimetilsufóxido DNA Ácido desoxiribonucleico ED50 Dose eficaz 50 EDTA Ácido etilenodiamino tetracético H&E Hematoxicilina e eosina i.p. Intra-peritoneal IL Interleucina INF-γγγγ Interferon gama LES Lupus eritematoso sistêmico LPS Lipopolissacarídeo MPLC Cromatografia líquida por pressão média NZB/W New zealand black/white OMS Organização mundial de saúde Th Linfócito T helper TLC Cromatografia de camada fina TNF-αααα Fator de necrose tumoral alfa v.o. Via oral

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 9 2 OBJETIVOS 11 3 REVISÃO DA LITERATURA 12 3.1 DESENVOLVIMENTO DE DROGAS 12 3.2 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA 13 3.3 IMUNOSSUPRESSORES 14 3.3.1 Agentes imunossupressores 15 3.3.2 Glicocorticóides 15 3.4 DOENÇAS AUTOIMUNE 16 3.4.1 Lupus eritematoso sistêmico (LES) 17 3.4.2 Artrite Reumatóide 18 3.5 PRODUTOS NATURAIS 19 3.6 Physallis angulata 21 3.7 FISALINAS B e F 22 4 MATERIAIS E MÉTODOS 23 4.1 ANIMAIS 23 4.2 OBTENÇÃO DAS FISALINAS 23 4.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA 24 4.3.1 Gaiola metabólica 24 4.3.2 Coleta de sangue 25 4.3.3 Sinais gerais de toxicidade 25 4.3.4 Avaliação hematológica 25 4.3.5 Avaliação bioquímica 26 4.3.6 Grupos experimentais 26 4.4 TRATAMENTO COM FISALINAS B e F NO MODELO EXPERIMENTAL DE LES 27 4.4.1 Tratamento de camundongos NZB/W F1 com fisalinas B e F 27 4.4.2 Dosagens Bioquímicas 27 4.4.3 Histopatologia dos rins 28 4.5 TRATAMENTO COM FISALINAS B e F EM MODELO EXPERIMENTAL DE AR 28 4.5.1 Indução de artrite por colágeno tipo II 28 4.5.2 Tratamento com fisalina F 28 4.5.3 Histopatologia das Patas 29 4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 29 5 RESULTADOS 30 5.1 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DAS FISALINAS B e F 30 5.1.1 Cálculo da DL50, consumo alimentar e diurese de camundongos Swiss Webster

machos e fêmeas tratadas com as fisalinas B ou F 31

5.2 TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS NZB/W F1 COM FISALINAS B E F EM MODELO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO (SLE).

35

5.2.1 Avaliação patológica dos rins de camundongos NZB/W (F1) tratados com a fisalina F e placebo.

39

5.3 TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS MACHOS DBA/1 COM FISALINAS F, PARA AVALIAÇÃO DA AÇÃO DA FISALINA F NO MODELO DE ARTRITE INDUZIDA POR COLÁGENO TIPO II (CIA)

41

6 DISCUSSÃO 46 7 CONCLUSÃO 55 8 REFERÊNCIAS 56

9

1 INTRODUÇÃO

As doenças autoimunes representam uma diversidade de desordens clínicas com uma

etiologia comum, que envolve uma resposta imune a antígenos autólogos. Estas doenças têm alta

prevalência em todo mundo. Têm também grande implicação econômica, devido à sua natureza

crônica e aos efeitos debilitantes causados por essas patologias. Os tratamentos para pacientes

com doenças autoimunes são de alto custo e tornam-se um problema social muito grande pois,

em geral, as pessoas que desenvolvem essas patologias estão em fase produtiva da vida. O

Instituto Nacional Americano de Saúde estima um gasto de 100 bilhões de dólares anualmente

com pacientes portadores de doenças autoimunes (ROSE, 2002). As patologias mediadas pelo

sistema imune são, portanto, um problema de saúde bastante significativo, estão crescendo em

proporções epidêmicas e requerem agilidade na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos e

terapias alternativas.

Os tratamentos hoje disponíveis para minimizar os efeitos das imunopatologias utilizam

duas classes de fármacos: os imunossupressores e os antiinflamatórios esteroidais, os

glicocorticóides. Ambas as classes terapêuticas têm amplo espectro de ação e podem ser

utilizadas combinadas. Suprimem o sistema imune visando ao controle da resposta contra os

auto-antígenos, porém de forma não específica. Portanto, podem deixar o organismo mais

susceptível a doenças oportunistas. Outra desvantagem no uso destes medicamentos é que essas

patologias requerem tratamentos prolongados e o uso contínuo dessas substâncias causa efeitos

adversos graves em muitos pacientes (KRENSKY, 2001).

No contexto das doenças autoimunes, há duas formas que são bastante características da

patologia, além de ter alta prevalência na população. Uma de resposta sistêmica, como o lupus

eritematoso sistêmico (LES) que afeta diversos órgãos causando muitas manifestações clínicas e

sintomas não-específicos, podendo comprometer gravemente os rins, com glomerulonefrite

mediada por imunocomplexos, que pode evoluir para morte por insuficiência renal. A outra é

órgão-específica, como a artrite reumatóide (AR), que se caracteriza por inflamação crônica nas

articulações, muitas vezes acompanhadas de manifestações extra-articulares.

No modelo experimental de lupus, camundongos fêmeas NZB/W (F1) desenvolvem uma

patologia bastante semelhante ao LES em humanos. No modelo experimental de artrite

10

reumatóide, camundongos machos DBA/1 são induzidos, após injeção de emulsão de colágeno

bovino tipo II, a desenvolverem a patologia bastante semelhante a AR em humanos.

O uso de produtos naturais vem crescendo constantemente na busca de alternativas

terapêuticas que apresentem eficácia e menores efeitos colaterais. A observação empírica da ação

terapêutica de produtos naturais levou ao interesse pela pesquisa de princípios ativos de plantas e

hoje há um número considerável de plantas medicinais que possuem atividade biológica

comprovada.

As fisalinas B e F são seco-esteróides que, em estudos anteriores, demonstraram uma

atividade inibidora de macrófagos ativados, bloqueando a produção de citocinas pró-

inflamatórias e protegendo camundongos desafiados com uma dose letal de LPS em modelo de

choque endotóxico (SOARES, 2003). Outro estudo mais recente demonstrou que as fisalinas são

capazes de inibir a proliferação de esplenócitos estimulados por concanavalina A ou em ensaio de

reação mista linfocitária. Estas substâncias ainda apresentam efeitos na inibição da rejeição de

transplantes quando administradas por via oral (SOARES, 2006).

Devido a essas considerações, avaliações toxicológicas são necessárias para poder garantir

a segurança e eficácia das fisalinas B e F no uso em modelos experimentais de LES e AR.

11

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a toxicidade aguda e a atividade imunomoduladora as fisalinas B e F em modelos de

doenças autoimunes.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1-Avaliar a toxicidade aguda em camundongos Swiss Webster tratados com fisalinas B e F.

2- Avaliar a atividade imunomoduladora das fisalinas B e F, no modelo de lupus eritematoso

sistêmico em camundongos NZB/W F1

3- Avaliar a atividade imunomoduladora da fisalina F em modelo experimental de artrite induzida

por colágeno do tipo II em camundongos da linhagem DBA/1.

12

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS

O interesse na pesquisa de novas moléculas biologicamente ativas é crescente hoje no

mundo. Para uma molécula ser considerada ativa, é necessário que se cumpram várias fases de

pesquisas e etapas que comprovam a eficácia e a segurança da possível droga a ser utilizada na

terapêutica. Na fase pré-clínica, são realizados ensaios citotóxicos, toxicológicos e testes de

comprovação terapêutica, além de testes de farmacocinética e farmacodinâmica.

O enorme progresso no setor de fármacos, verificado nos últimos anos, tende a fazer valer

o extraordinário papel que as drogas de origem natural desempenham na terapêutica e como uso

na medicina popular ao longo da história. Com o desenvolvimento das pesquisas observam-se

centenas de princípios ativos extraídos de microorganismos, plantas e animais que enriquecem o

arsenal terapêutico e servem de base para a síntese de produtos iguais ou análogos

(KOROLKOVAS,1982).

O estudo fitoquímico monitorado por ensaios biológicos é uma metodologia muito

utilizada em laboratórios de produtos naturais. Vai desde a busca empírica até estudos racionais

para triagem de drogas direcionada por ação biológica, estrutura química e uso na medicina

popular.

A abordagem moderna para o desenvolvimento de fármacos está voltada para o

desenvolvimento de substâncias contra alvos moleculares bem definidos, o que leva a maior

especificidade na ação da droga (BASSO, 2005). Neste âmbito, as drogas de origem vegetal estão

se destacando e alcançando números significativos na indústria farmacêutica, pois além de haver

uma grande biodiversidade mundial, há um patrimônio genético de substâncias isoladas de

produtos naturais que através de outro advento importante, a modificação molecular, pode

direcionar o desenvolvimento de substâncias para alvos definidos (DI STASI, 2002).

Farmacologistas tentam entender os mecanismos de patogênese das doenças para desenvolver

moléculas que possam interagir e neutralizar os agentes envolvidos. Este é um processo

extremamente complexo, já que ocorrem várias reações intracelulares ainda não compreendidas,

tornando o desenvolvimento racional de drogas uma tarefa muito difícil. Novos métodos de

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modificação molecular têm sido desenvolvidos para superar essas dificuldades, criando a

possibilidade de realizar triagem de novas drogas com alta precisão (YING LIU, 2004).

A indústria farmacêutica é responsável por 33% da produção total de produtos químicos

existentes no mundo. Esses produtos são de várias origens: 65% são sintetizados em laboratórios,

25% são extraídos de plantas e 10% de outros organismos vivos (SANT’ANA, 2002).

Para avaliação de drogas, os potenciais de citotocixidade dos compostos a serem

estudados devem ser avaliados por parâmetros que incluem desde a morte celular até a alteração

do seu metabolismo. Testes de citotoxicidade in vitro têm sido muito utilizados como métodos

alternativos aos testes farmacológicos em órgãos isolados, pelo menos durante a fase de triagem,

reduzindo assim a experimentação in vivo (HAMBURGER, 1991). Concluídos os ensaios de

citotoxicidade, as substâncias em geral passam por ensaios de atividade in vitro que comprovam

sua ação biológica.

Moléculas com a ação biológica comprovada são testadas em ensaios in vivo, onde se faz

necessária à avaliação toxicológica, a fim de indicar a eficiência da droga em doses seguras. São

os testes toxicológicos em espécies animais que permitem explorar particularidades e efeitos

toxicológicos ao organismo.

3.2 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA

Durante o desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação toxicológica in vivo de drogas

constitui uma etapa importante para que estas possam ser testadas e utilizadas em seres humanos.

Têm como objetivo a determinação do modo e local de ação farmacológica das drogas em

potencial. Nessa fase, podem ser realizados estudos farmacológicos comparativos com fármacos

da mesma classe terapêutica já descritos. Há várias etapas distintas para se obter todas as

características da substância candidata a um novo fármaco. Os testes de toxicologia dividem-se

basicamente em toxicidade aguda, toxicidade sub-crônica, toxicidade crônica e genotoxicidade

(HAYES, 1994).

A toxicidade aguda é caracterizada por ensaios de dose única, que pretendem avaliar a

dose máxima que poderá ser utilizada, sem que haja efeitos tóxicos. Muitas drogas são liberadas

para uso após a realização de ensaios de segurança, pois esses ensaios podem fornecer

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informações qualitativas e quantitativas, ou seja, a toxicidade aguda pode fornecer dados sobre

efeitos nos parâmetros bioquímicos, hematológicos e sinais de nocicepção (HAYES, 1994). Pode

também, de acordo com o grau de toxicidade da droga, causar mortalidade dos animais, podendo-

se então calcular a DL50 (dose letal necessária para matar 50% dos animais no grupo).

Caso não haja mortalidade ou que a mortalidade seja observada apenas em uma das doses

testadas, pode-se calcular a ED50 (dose média eficaz) através da avaliação dos parâmetros

qualitativos (HAYES, 1994). Pois, não é possível calcular a DL50 se não houver mortalidade em

mais de uma dose testada. Os estudos agudos determinam a dose-resposta e o início dos sinais de

toxicidade. A observação dos animais submetidos ao teste de toxicidade aguda depende da

proposta do estudo, podendo durar um curto período, que pode ser determinado pela morte dos

animais ou pela gravidade dos sinais de toxicidade apresentados. O período de observação, sendo

curto ou longo, não ultrapassa quatorze dias, um tempo pré-estabelecido que assegura toda a

absorção da droga e seus efeitos agudos. Os estudos da toxicidade aguda são muito utilizados

devido à rapidez e economia na quantidade de droga utilizada, além de fornecerem segurança na

base de cálculo para a dose eficaz (HAYES, 1994).

3.3 IMUNOSSUPRESSORES

A imunossupressão acarreta riscos intrínsecos de infecções oportunistas e tumores

secundários. Por essa razão, inúmeras pesquisas de fármacos para inibir a rejeição de transplantes

e doenças autoimunes estão direcionadas para a indução e manutenção da tolerância imunológica,

ou estado ativo de não reatividade aos antígenos específicos. Espera-se que estes fármacos

possam auxiliar no tratamento dessas patologias, e que possam minimizar efeitos indesejados

dessa classe terapêutica (GOODMAN, 2006). Duas classes de fármacos são utilizadas como

imunossupressores: os agentes imunossupressores e os glicocorticóides.

3.3.1 Agentes imunossupressores

Os agentes imunossupressores possuem em geral ação inespecífica. São utilizados para

atenuar a resposta imune de pacientes que receberam transplante ou com doenças autoimunes.

Alguns, entretanto, apresentam um certo grau de especificidade. Por exemplo, a ciclosporina é

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um peptídeo fúngico que afeta primariamente a função de linfócitos T através da inibição da

calcineurina, bloqueando as células T efetoras que participam da resposta imune. Existem agentes

citotóxicos que também são utilizados como agentes imunossupressores, tais como a azatioprina,

a ciclofosfamida e a imunoglobulina anti-linfocitária. Todos apresentam severos efeitos adversos,

como leucopenia, trombocitopenia, anemias, suscetibilidade a infecções, disfunção renal,

hipertensão, hepatotoxicidade, além de outros efeitos (RANG, 2001).

3.3.2 Glicocorticóides

Os glicocorticóides endógenos são hormônios esteróides derivados do colesterol que,

assim como outros hormônios esteróides, atuam em vários processos no organismo, incluindo a

regulação neuro-imuno-endócrina. Entre as principais classes de hormônios esteroidais estão os

androgênios, os estrogênios, os progestagênios, os glicocorticóides e os mineralocorticóides. Os

glicocorticóides e mineralocorticóides são secretados pelo córtex da supra-renal. Os receptores

para estes esteróides possuem estrutura similar, com a região amino-terminal específica, uma

região de ligação ao DNA conservada e uma região carboxi-terminal de ligação ao hormônio. A

ação dos glicocorticóides é iniciada com a penetração destes esteróides na célula, seguida da

interação com seus receptores no citoplasma celular. A interação da molécula com seu receptor

expõe o domínio de ligação ao DNA, tornando o receptor ativado e translocando o complexo

molécula-receptor para o núcleo, local de sua ação (RANG, 2001).

Os glicocorticóides têm amplo espectro de ação, alteram a resposta imune dos linfócitos

um importante efeito na atividade antiinflamatória e imunossupressora, sendo freqüentemente

utilizados no tratamento de doenças autoimunes, alergias, prevenção da rejeição de transplantes,

doenças reumáticas, neoplasias e doenças degenerativas do sistema nervoso central. A ação

antiinflamatória dos glicocorticóides inclui a redução da atividade de macrófagos e neutrófilos.

Bem como a diminuição da migração leucocitária, da ação e proliferação de células T, e a

modulação da secreção de citocinas e de outros mediadores pró-inflamatórios como ácido

araquidônico, impedindo a sua liberação e conseqüentemente não deixando formar seus

metabólitos: prostaglandinas, tromboxamos e leucotrienos (ROSE, 2002). Atuam como

supressores potentes da inflamação e, em virtude de serem utilizados numa variedade de doenças

inflamatórias e autoimunes, estão entre as classes de fármacos mais prescritos. As ações

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imunossupressoras e antiinflamatórias dos glicocorticóides estão associadas, devido a ação destes

na inibição de funções dos leucócitos, citadas acima (GOODMAN, 2006).

Além de todas as ações terapêuticas descritas, os glicocorticóides atuam regulando o

metabolismo de carboidratos, proteínas e gorduras. Como ação regulatória, agem sobre o

hipotálamo e a hipófise anterior promovendo uma ação de retro-alimentação negativa, resultando

em uma menor produção dos glicocorticóides endógenos.

As ações metabólica, reguladora e terapêutica são inerentes aos glicocorticóides, não

sendo possível beneficiar-se de uma das ações sem que a outra se manifeste. Assim, quando

fármacos desta classe são utilizados como antiinflamatórios e imunossupressores, seus efeitos

metabólicos apresentam-se como efeitos colaterais indesejados ao organismo. A utilização destes

fármacos está ligada diretamente a graves efeitos colaterais, tais como catarata, osteopenia,

osteoporose, hipertensão, alterações comportamentais além de ações nefrotóxicas e

diabetogênicas. Devido ao número e à gravidade dos efeitos colaterais potenciais, a decisão de

instituir uma terapia com glicocorticóides sempre requer cuidadosa análise dos riscos e benefícios

(GOODMAN, 2006).

3.4 DOENÇAS AUTOIMUNES

O sistema imune reconhece moléculas que entram em contato e atingem a via parenteral.

A fim de defender o organismo, a população de linfócitos possui um largo e vasto repertório de

receptores. Inevitavelmente, muitos desses receptores reconhecem antígenos próprios bem como

moléculas exógenas. A reatividade de células B e T próprias ocorre em indivíduos normais, mas

mecanismos de tolerância como seleção negativa de células T no timo e na medula óssea

impedem essas reações autoimunes. Conseqüentemente, para a manutenção da homeostase, os

indivíduos dependem destes mecanismos de tolerância que evitam o desenvolvimento da

autoimunidade. Bem como os mecanismos regulatórios periféricos como anergia e supressão.

Quando esses mecanismos falham, podem levar a instalação de um processo inflamatório que

pode causar lesão tecidual e o desenvolvimento de doenças autoimunes (ROSE, 2002). Portanto,

a autoimunidade é causada por defeitos na indução da tolerância central ou periférica.

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As imunopatologias podem ser mediadas por auto-anticorpos ou por células T auto-

reativas. A lesão tecidual pode ser resultado do ataque direto ou indireto das células efetoras, da

deposição de complexos auto-imunes nos tecidos ou ainda pode ser causada pela inflamação

local. Como a resposta imune adaptativa é incapaz de remover os antígenos autólogos, há uma

produção constante destes antígenos, exacerbando a resposta imune que causa danos nos próprios

tecidos (JANEWAY, 2002).

As doenças autoimunes acometem aproximadamente 5% da população de países

industrializados. Afetam desproporcionalmente mulheres em relação a homens, devido à ação de

hormônios sexuais no eixo neuro-imuno endócrino. Acometem indivíduos em fase produtiva, e

seus efeitos debilitantes e tratamentos prolongados representam um grande problema econômico

e social (O’SHEA, 2002).

3.4.1 Lupus eritematoso sistêmico (LES).

É uma doença autoimune que afeta vários órgãos, tais como a pele, os rins, os nervos e as

articulações. O LES é considerado o protótipo das doenças autoimunes humanas e agride

mulheres em 90% dos casos. É caracterizado pela produção de auto-anticorpos contra certos tipos

de antígenos próprios, como componentes nucleares e componentes citoplasmáticos, além de

hemácias. Ocorre predominantemente a produção de auto-anticorpos anti-DNA, que são

determinantes no desenvolvimento da nefrite lúpica (MIHARA,1997). Os mecanismos que

quebram a tolerância contra os antígenos próprios são desconhecidos. Anormalidades em células

T, células B e células apresentadoras de antígenos são observadas em pacientes com a doença

ativa. Há uma hiper-reatividade de células B, com a produção de auto-anticorpos, enquanto que

uma diminuição significativa da imunidade celular mediada por células T e células natural killer

(NK) é observada, diminuindo a defesa do organismo (MIESCHER, 1995).

O desenvolvimento do LES é mediado por citocinas produzidas por linfócitos T helper

(Th) 1 e Th 2. Um desequilíbrio entre as citocinas pode acelerar o desenvolvimento da patologia.

Em pacientes com LES os níveis de citocinas Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) são elevados, enquanto há

uma queda na produção de citocinas Th1, como IL-2 e interferon-γ (IFN-γ), (HSIEH, 2004).

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A mortalidade de pacientes com lupus tem diminuído de 1 a 2 % por ano nas últimas

décadas. O maior problema hoje é em relação à qualidade de vida e o risco da diminuição na

função renal. Em muitos casos, a terapia com baixas doses de esteróides (como dexametasona),

pode proporcionar essa desejada qualidade de vida. Porém, algumas formas do LES não

respondem a essa terapia. O uso da ciclofosfamida em pulso-terapia é benéfica no tratamento de

pacientes com alto risco, porém os efeitos colaterais são bastante graves. A ciclosporina tem sido

a terapia de escolha para pacientes que não respondem aos esteróides, porém há muita cautela no

uso desse imunossupressor, já que o seu maior efeito adverso é a nefrotoxicidade, sendo portanto

o rim o órgão mais lesado nessa patologia de amplo espectro (MIESCHER, 1995).

Alguns modelos experimentais que apresentam quadros semelhantes a essa patologia tem

sido estudados. Camundongos fêmeas New Zealand Black X New Zealand White F1 (NZB/W F1)

desenvolvem espontaneamente uma doença autoimune semelhante ao LES em humanos, que

compreende hipergamaglobulinemia, produção de autoanticorpos inclusive anti-DNA e formação

de complexo imune mediando glomerulonefrite que leva os animais à morte por falência renal

(MIHARA,1997). Enquanto os mecanismos da patologia não são bem esclarecidos, muitos

estudos sugerem que o camundongo NZB tem uma forte contribuição genética no

desenvolvimento do LES. A fêmea NZB apresenta anemia hemolítica, o que pode estar associado

ao desenvolvimento do LES nos NZB/W F1. Uma grande porcentagem dos camundongos fêmeas

F1 cursam com insuficiência renal grave, glomerulonefrite, produção de auto-anticorpos anti-

DNA e morte (GOLDBLATT, 2005a). Já os machos NZB/W F1 não desenvolvem LES e

nenhum outro tipo de imunopatologia. Esse modelo é importante até mesmo nesta manifestação

direcionada a fêmeas , pois, o lupus em humanos acomete prioritariamente mulheres.

3.4.2 Artrite reumatóide

A artrite reumatóide (AR) é caracterizada pela inflamação crônica das articulações, com

degeneração da cartilagem e erosão na matriz óssea. Acomete um número estimado de 0,8 a 1%

de adultos, e a doença crônica pode causar uma significativa morbidade e mortalidade prematuras

(GOLDBLATT, 2005b). A doença afeta o tecido sinovial, com hiperplasia e infiltração de

linfócitos T e B. A hiperplasia do tecido sinovial destrói irreversivelmente a cartilagem e matriz

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óssea, afetando a articulação. A progressão da AR está associada a elevados níveis de fator de

necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina (IL)-1β, produzidos por macrófagos e células

dendríticas, além de um desequilíbrio entre as respostas Th1/Th2 e elevada produção de

imunoglobulinas específicas contra autoantígenos (SHIN, 2003). Na AR, a manifestação mais

freqüente é a artrite inflamatória, sendo classicamente tratada com antiinflamatórios e drogas

imunossupressoras que, como mensionado anteriormente, têm efeitos adversos bem conhecidos

(COELHO, 2004).

A artrite induzida por colágeno (AIC) é um modelo experimental que mais se assemelha a

AR em humanos, sendo amplamente utilizado nas pesquisas para terapia anti-artrite. A AIC é

induzida em camundongos da linhagem DBA/1 através de imunização intradérmica com

colágeno tipo II emulsificado em adjuvante. Em poucos dias após o início da artrite, as

articulações são afetadas, apresentando uma reação inflamatória com grande destruição tecidual

observando-se um quadro histopatológico muito similar à observada em RA, com formação de

um tecido erosivo e remodelamento da articulação (COELHO, 2004). A patogênese da AIC

depende da resposta do hospedeiro desafiado com colágeno do tipo II e a subseqüente geração de

anticorpos que reconhecem o tecido das articulações que são ricos em colágeno. A inflamação

crônica mediada por complexos imunes inicia o recrutamento de uma variedade de células e

outros eventos humorais. Além do recrutamento e ativação de neutrófilos, macrófagos e

linfócitos no tecido das articulações, há a formação de pannus, a principal marca da patologia,

tanto em AIC como em AR (CUZZOCREA, 2003).

3.5 PRODUTOS NATURAIS

Durante séculos, a humanidade usou extratos de partes vegetais ou de órgãos animais para

o tratamento de várias doenças. Devido aos bons efeitos na medicina popular, o uso de produtos

naturais tem sido extensivamente explorado no mundo todo. Diversos medicamentos usados hoje

em dia, principalmente agentes antiinfecciosos, como alcalóides e antibióticos, resultaram da

purificação de extratos e do isolamento e identificação de seus princípios ativos. Essas classes de

20

fármacos juntas ocupam um percentual de 70% das substâncias de origem vegetal (SANT’ANA,

2002).

Grande parte das plantas conhecidas pela medicina popular possui atividade biológica

comprovada, podendo ser utilizadas com êxito no tratamento de várias patologias. A grande

diversidade da flora brasileira permite a produção de fitofármacos de alta qualidade e eficácia.

Apesar do grande aumento de estudos nessa área, somente 15 a 17% das espécies vegetais

conhecidas em todo o mundo foram estudadas, quanto a suas propriedades medicinais (SIMÕES,

2003). Nesse contexto, as pesquisas com o propósito de obter novos medicamentos a partir de

plantas têm reassumido um importante papel nos últimos anos. Exemplos de drogas importantes

obtidas a partir de plantas são: digoxina da Digitalis spp., a quinina e quinidina da Cinchona ssp.,

a vincristina e vimblastina da Catharanthus roseus, a atropina da Atropa belladona e a morfina e

a codeína da Papaver somniferum (RATES, 2001).

Os indicadores científicos mostram que a probabilidade de se encontrar um produto

terapêutico de alto valor é maior nos estudos de fitoterápicos e plantas medicinais de uso popular

do que na obtenção de novas substâncias bioativas por síntese química (STROHL, 2000). Além

de haver uma grande diversidade molecular em substâncias isoladas de produtos naturais, a

funcionalidade (reações aquosas, absorção, permeabilidade, tamanho das moléculas) em geral

está aumentada quando se trata de substâncias de origem natural.

Um terço das drogas mais utilizadas na terapêutica por todo o mundo são derivadas de

produtos naturais. Cada vez mais esses fármacos são preferidos pelas indústrias farmacêuticas,

por apresentarem amplo espectro de ação e diversas estruturas com potencial de atividade

farmacológica (KOROLKOVAS, 1982). Das 252 drogas consideradas básicas e essenciais pela

Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente originadas de plantas e outra

grande parte são drogas sintéticas que foram obtidas a partir de precursores vegetais (RATES,

2001).

A utilização de terapias alternativas vem crescendo recentemente, particularmente as que

envolvem o uso de produtos naturais, principalmente os derivados de plantas. O aumento no

interesse do uso dessas drogas pode ser atribuído à ineficiência de fármacos já existentes na

terapêutica, bem como aos efeitos adversos graves e recorrentes advindos da utilização de

substâncias sintéticas. Os produtos naturais já são muito utilizados na medicina popular,

principalmente em populações mais carentes, que em geral não tem acesso à medicina

21

convencional. Mesmo sem autorização e sem eficácia e segurança comprovadas, produtos

naturais são muitas vezes comercializados, alimentando um poderoso mercado que é o da

biopirataria. Atenta para essa realidade, a indústria farmacêutica e os órgãos de saúde em todo

mundo têm reconhecido cada vez mais a importância da pesquisa de substâncias derivadas de

plantas utilizadas na medicina popular como um bom caminho para o desenvolvimento de novas

drogas (RATES, 2001).

As plantas não fornecem apenas o princípio ativo de drogas, mas também podem servir de

base para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos ou semi-sintéticos. Os produtos naturais

têm sido utilizados com uma alta freqüência com esta finalidade. Um em quatro fármacos da

terapêutica atual foi obtido ou idealizado a partir de vegetais das florestas tropicais (SANT’ANA,

2002).

3.6 Physalis angulata L

O gênero Physalis, pertencente à família Solanaceae, tem cerca de 120 espécies

distribuídas entre as zonas tropical e temperada por todo mundo. Physalis angulata é uma planta

herbácea de ciclo anual amplamente difundida nas regiões tropicais e subtropicais dos

continentes asiático, africano e sul-americano. É muito utilizada na medicina popular e seu fruto

na alimentação. Tem diversos nomes populares, tais como mullaca, camapú e bucho de rã (LIN,

1992 e CHIANG, 1992). No Brasil, pode ser encontrada em todo território e suas utilizações na

medicina popular incluem ação antiinflamatória, antireumática, diurética, sudorífera e para o

tratamento da bexiga e do fígado. Análises fitoquímicas de P. angulata demonstram a presença

de vários flavonóides, alcalóides e esteróides. Alguns estudos comprovaram atividades

farmacológicas de substâncias isoladas de P. angulata. Foram descritas propriedades antivirais e

bactericidas (MOEMA, 2002). A atividade antitumoral foi comprovada para a wintangulantina A,

também isolada da P. angulata e com estrutura química definida (LIN, 1992, CHIANG, 1992 e

BELLINTANI, 2002). Outros estudos demonstraram a atividade antiinflamatória (em edema de

pata induzido por carragenina), analgésica (em modelo da placa quente) e antialérgica (em um

modelo experimental no qual é administrado o 2,4-dinitrofluorobenzene, induzindo reação de

22

hipersensibilidade tipo IV, em camundongos tratados por via oral com o extrato das flores de P.

angulata (CHOI, 2003).

3.7 FISALINAS

As fisalinas são, substâncias que pertencem ao grupo de seco-esteróides isolados da

espécie Physalis angulata, presentes normalmente em níveis de 30 a 500 partes por milhão (ppm)

em raízes, caule e folhas da espécie. As fisalinas B, F e G apresentam atividade

imunomoduladora in vitro e in vivo são inibidores da ativação de macrófagos, inibindo a

produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-12 e IL-6) e de óxido nítrico por macrófagos

ativados por LPS e IFN-γ (SOARES, 2003). Estas substâncias inibem a proliferação de

esplenócitos estimulados por concanavalina A ou em ensaio de reação mista linfocitária, assim

como a produção de IL-2. Doses de 0,5 a 1 mg/camundongo por via intraperitoneal das fisalinas

B, F e G foram capazes de proteger animais desafiados com uma dose letal de LPS em modelo

de choque endotóxico. Estudos recentes in vivo mostram a atividade das fisalinas B, F e G na

prevenção da rejeição de transplante alogênico heterólogo (SOARES, 2006). Esses estudos

demonstraram o potencial antiinflamatório e imunomodulador destas moléculas sugerindo seu

potencial terapêutico no tratamento de doenças autoimunes.

23

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Para os estudos toxicológicos foram utilizados camundongos machos e fêmeas da

linhagem Swiss Webster com idade variando entre 4-6 semanas, pesando em média 50 gramas.

Para a avaliação da atividade imunomoduladora das drogas testadas no modelo de artrite foram

utilizados camundongos machos da linhagem DBA/1 com idade aproximada de 9 semanas. Já

no modelo de lupus foram utilizados camundongos fêmeas F1 resultantes do cruzamento

NZBXNZW, com idade aproximada de três meses. Os camundongos foram criados e fornecidos

pelo biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - FIOCRUZ-BA, onde foram mantidos com

água e ração comercial balanceada ad libitum e em estantes ventiladas até o final dos

experimentos e sacrifício. Os procedimentos experimentais utilizados neste trabalho foram

aprovados pelo Comitê de Ética Para o Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ-BA.

4.2 OBTENÇÃO DAS FISALINAS

A purificação das fisalinas (seco-esteróides constituintes da Physalis angulata L.) foi

realizada no Laboratório de Produtos Naturais II em FarManguinhos FIOCRUZ/RJ, sob a

coordenação da Dra Therezinha Tomassini. Cerca de 15 g do extrato etanólico do caule de P.

angulata, preparado a partir de espécimes coletadas em Belém do Pará, foram dissolvidos em 300

mL de metanol. Adicionou-se, em seguida, solução de acetato de chumbo (200 mL de água

destilada, quente, com 25 g de acetato de chumbo). Agitou-se esta mistura por duas horas e em

seguida foram adicionados 20 g de carvão ativado, sob agitação constante. A mistura obtida foi

filtrada, colocada em funil de separação e extraída com 200 mL de clorofórmio, por três vezes,

resultando em 770 mg na fase clorofórmica (IMR III-44-1). Esta fração foi submetida à

cromatografia por MPLC (cromatografia líquida por pressão média) utilizando, para eluição, o

sistema gradiente hexano/acetato de etila iniciado na proporção 70:30, até chegar a 100% do

último solvente. As frações foram coletadas através de tubos e, após a evaporação do solvente,

24

foram secas e submetidas à cromatografia de camada fina (TLC), bem como a métodos

espectroscópicos. Como resultado final, obtiveram-se 15 mg de fisalina B com grau de pureza de

96% e 56 mg de fisalina F com grau de pureza de 97,8%. As fisalinas foram diluídas em DMSO a

10% de acordo com a dose a ser utilizada nos experimentos.

4.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA

Para avaliação da toxicidade aguda, os camundongos foram pesados e distribuídos de

forma randomizada antes do experimento (n = 6 animais por grupo) e mantidos em estante

ventilada. Cada grupo recebeu uma única dose de fisalina B ou F, a depender do grupo

experimental. As drogas utilizadas foram diluídas em solução de DMSO a 10% no dia do

experimento e foram administradas por via intraperitoneal. O grupo placebo recebeu apenas o

veículo de diluição da droga. Os camundongos foram submetidos a análises observatórias e

mensurações de metabólitos para avaliação da toxicidade das drogas testadas. O período de

avaliação da toxicidade aguda é bem estabelecido em 14 dias, tempo suficiente para absorção

completa da dose única administrada.

4.3.1 Gaiola metabólica

Após administração da droga ou placebo, os camundongos foram colocados em gaiolas

metabólicas (Tecniplast), compartimento individual, onde é possível mensurar o consumo

alimentar, a diurese e fezes, além de ser feita observação visual. A ração foi devidamente pesada,

e os camundongos permaneceram por 24 horas na gaiola. No dia seguinte, os camundongos

foram retirados das gaiolas metabólicas e a urina coletada em recipiente próprio e graduado,

acoplado à gaiola. A ração foi novamente pesada para avaliar o consumo alimentar. Após o

período de 14 dias, os camundongos foram colocados novamente nas gaiolas metabólicas, onde

permaneceram por mais 24 horas para nova avaliação de consumo alimentar e diurese, para

comparação com os dados obtidos nas primeiras 24 horas.

25

4.3.2 Coleta de sangue

Sangue dos camundongos foi coletado da veia safena lateral, após imobilização em tubos

de contenção (tubo Falcon de 50 mL perfurado). A pata dos animais foi tricotomizada com

lâmina e perfurada com agulha 40x12 mm para punção com pipeta. Foram coletadas duas

alíquotas de sangue de aproximadamente 200 µL, uma com anticoagulante EDTA, para

hematologia, e outra alíquota seca, para análises bioquímicas. O procedimento de coleta foi

realizado em dois tempos diferentes para comparação dos efeitos agudos da droga, o primeiro, 24

horas após a administração da droga e o segundo, após 14 dias. No décimo quarto dia, a coleta foi

realizada por punção do plexo braquial também em duas alíquotas, para hematologia e

bioquímica.

4.3.3 Sinais gerais de toxicidade

Para avaliação da toxicidade aguda, o padrão comportamental dos camundongos

submetidos ao teste é importante para demonstrar o perfil de toxicidade da droga testada. Os

camundongos foram observados nas primeiras 24 horas e diariamente durante 14 dias quanto a

sinais de toxicidade geral, tais como piloereção, movimentação, tremores, convulsões, ptose,

efeitos sobre a respiração, tônus muscular e morte. Com estes padrões, é possível fazer o cálculo

da DL50 (dose letal para 50%) através de um programa específico, o Probits (FINNEY, 1971).

4.3.4 Avaliação hematológica

A alíquota de sangue coletada com EDTA foi homogeneizada e, imediatamente após a

coleta, processada em contador hematológico (ADVIA 60 Bayer®), que forneceu os padrões

eritrocitários e leucocitários no sangue dos camundongos avaliados. O procedimento foi repetido

após 14 dias com nova amostra fresca de sangue total, para avaliar possíveis alterações nestes

padrões, que seriam sinais indicativos de toxicidade aguda.

26

4.3.5 Avaliação bioquímica

A alíquota de sangue coletada para análise bioquímica foi centrifugada a 1500 rpm

imediatamente após a coleta e o soro separado e armazenado hermeticamente a -20º C. Ao final

do experimento, as amostras de soro coletadas nas primeiras 24 horas e após 14 dias foram

submetidas aos ensaios bioquímicos com “kits” (LABTEST®) específicos para cada substrato

dosado: uréia (cat. 27, reação Uréase-Berthelot), creatinina K (cat. 96, baseado na reação de

Jaffé-Pricato alcalino), glicose (PAP liquiform cat. 84, glicose-oxidase reação de Trinder) e

colesterol (liquiform cat. 76, reação colesterol-oxidase reação de Trinder). A leitura das reações

foi realizada em espectrofotômetro (Spectra Max 190, Molecular Devices), obedecendo ao

comprimento de onda específico para cada teste, de acordo com as recomendações do fabricante.

As dosagens de AST (aspartato amino tranferase) e ALT (aspartato alanina transferase) foram

realizadas em aparelho específico para bioquímica (Hitachi 902 ROCHE®), utilizando o “kit”

próprio para o equipamento.

4.3.6 Grupos experimentais

Os animais foram distribuídos em cinco grupos de 6 camundongos para cada sexo, sendo

os experimentos realizados em separado, para fêmeas e para machos. Para cada experimento

houve um grupo tratado com placebo. Os outros quatro grupos receberam doses gradativas das

drogas (fisalinas B ou F) nas dosagens de 100, 200, 400 e 800 mg/kg. Os animais receberam uma

administração única da droga ou placebo por via intraperitoneal (i.p.). As drogas ou placebo

foram administrados pela manhã para avaliação durante o primeiro dia de hora em hora, e

diariamente por 14 dias até o sacrifício, realizado através de dose letal de anestésico barbitúrico

(Tiopental).

27

4.4 TRATAMENTO COM FISALINAS B e F EM MODELO EXPERIMENTAL DE LES

4.4.1 Tratamento de camundongos NZB/W F1 com fisalinas B e F

Camundongos fêmeas NZB/W F1 com idade aproximada de três meses foram tratados

com fisalina B (experimento 1) ou F (experimento 2) diariamente, por gavagem, durante três meses

ou até apresentarem mortalidade. De 15 em 15 dias os camundongos permaneceram por 12 horas

em gaiola metabólica para a coleta de urina e avaliação da diurese. Com amostras da urina foi

realizada dosagem de proteínuria. A cada duas semanas também foi coletado sangue por punção da

veia safena lateral. Após a coleta, o soro foi separado imediatamente por centrifugação a 1500 rpm,

armazenado hermeticamente e congelado a -20º C para determinação dos níveis de creatinina. A

mortalidade dos animais tratados com as fisalinas foi comparada à de animais tratados com

placebo.

Para cada experimento grupos de 10 camundongos foram tratados diariamente por

gavagem com 1 mg/animal de fisalina B ou F ou placebo. Os animais foram tratados durante três

meses ou até apresentarem mortalidade. Foram avaliados em condições semelhantes, com coletas

quinzenais de material em gaiola metabólica e de sangue. Ao final dos três meses de tratamento, os

camundongos sobreviventes foram sacrificados com injeção letal de anestésico barbitúrico

(tiopental).

4.4.2 Dosagens Bioquímicas

No soro coletado a cada duas semanas foram mensurados os níveis de creatinina K

(Labtest cat. 96, baseado na reação de Jaffé-Pricato alcalino). Em amostras de urina coletada

através da gaiola metabólica foram dosados os níveis de proteinúria, com o kit sensiprot (Labtest

cat. 36, reação vermelho de pirogalol). As leituras foram realizadas em espectrofotômetro

(Spectra Max 190, Molecular Devices) utilizando um comprimento de onda para cada teste, de

acordo com as recomendações do fabricante.

28

4.4.3 Histopatologia dos rins

Ao final do experimento, os rins dos camundongos foram retirados após o sacrifício,

fixados em Bouin por 48 horas e posteriormente encaminhados para processamento

histopatológico. Os fragmentos dos rins foram incluídos em parafina e secções de 2 µm de

espessura foram obtidas e coradas com hematoxilina e eosina (HE), para análise em microscópio

óptico.

4.5 TRATAMENTO COM FISALINAS B e F EM MODELO EXPERIMENTAL DE AR

4.5.1 Indução de artrite por colágeno tipo II

Camundongos da linhagem DBA/1 macho com idade de 9 a 10 semanas foram randomizados

em grupos de 6 e imunizados com injeção intradérmica na base da cauda com 100 µg/camundongo

de colágeno bovino do tipo II (Chondrex, U.S.A.) em emulsão de adjuvante completo de

Freund’s (ACF-Sigma, M.O, U.S.A). Após um intervalo de 20 dias, os animais receberam outra

injeção de 100 µg/camundongo de colágeno em emulsão de ACF. Os camundongos foram

avaliados a cada 5 dias por observação macroscópica e por medida do volume da pata em

plestimômetro (Ugo Basile, Italy).

4.5.2 Tratamento com fisalina F

Após o aparecimento de edema nas patas, aproximadamente 10 dias após a segunda injeção

de colágeno, iniciou-se o tratamento. Os camundongos (n=6) foram tratados diariamente, por

gavagem, com 1 mg/animal/dia de fisalina F, com dexametasona 50 µg/animal ou com o veículo de

diluição da droga (DMSO 10%) por via oral (v.o) durante 20 dias. Ao final do experimento, os

animais foram sacrificados com uma injeção letal de anestésico barbitúrico (Tiopental), o sangue

foi coletado por punção da artéria braquial e as patas foram retiradas para avaliação

histopatológica. Foram realizados dois experimentos, ambos com fisalina F.

29

4.5.3 Histopatologia das Patas

As patas dos camundongos foram retiradas após o sacrifício, fixadas em formalina a 10%

por 48 horas e posteriormente descalcificadas em solução contendo ácido nítrico a 7% durante 3

dias, em agitador mecânico. Para a retirada do excesso de ácido, as patas foram lavadas durante 5

dias com água destilada e, em seguida, foram então encaminhadas para processamento

histopatológico. Os fragmentos do tecido da pata foram incluídos em parafina e secções de 4-6 µm

do corte foram obtidas e coradas com hematoxilina e eosina (HE) para análise em microscópio

óptico.

4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os valores numéricos apresentados nos gráficos e tabelas correspondem às médias ±

SEM de mensurações efetuadas nos diferentes grupos de animais, conforme indicado nas figuras.

A significância das diferenças entre os grupos foi avaliada utilizando o teste one way ANOVA e

pós-teste de comparação múltipla Newman Keuls para o grupo de amostras ou análise de

variância (lista de comparações entre os grupos analisados). A curva de sobrevivência foi

analisada de acordo com o método Kaplan-Meier, usando os software SPSS versão 9.0, sendo a

análise estatística realizada pelo test log rank. O limite crítico de significância foi estabelecido

para P ≤ 0,05.

30

5 RESULTADOS

5.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DAS FISALINAS B e F

5.1.1 Cálculo da DL50, consumo alimentar e diurese de camundongos Swiss Webster

machos e fêmeas tratadas com as fisalinas B ou F.

A toxicidade aguda das fisalinas B e F foi determinada utilizando camundongos Swiss

Webster machos e fêmeas. Os animais receberam uma dose única da droga por via

intraperitoneal (100, 200, 400 e 800 mg/Kg) ou placebo (veículo de diluição da droga). A

mortalidade dos animais foi avaliada durante 14 dias. Apenas o grupo que recebeu a dose mais

alta das fisalinas (800 mg/kg) foi observada mortalidade de alguns animais (três camundongos

no grupo tratado com a fisalina F e apenas um camundongo com a fisalina B). Não foi possível

realizar o cálculo da DL-50 a partir dos resultados obtidos, pois é necessária a observação de

mortalidade em pelo menos duas doses diferentes das drogas em teste para que o programa

Probits possa calcular a DL50. No entanto, estes resultados indicam uma baixa toxicidade das

drogas (Figura 1).

Os animais foram avaliados quanto a sinais gerais de toxicidade (nocicepção) durante

as primeiras 24 horas e diariamente por 14 dias. A tabela 1 mostra os resultados do grupo de

camundongos machos tratados com fisalina B. Na dose mais alta (800 mg/kg) foram

observados 3 dos 5 sinais de nocicepção avaliados. Os sinais observados foram: piloereção,

ptose e efeitos sobre a movimentação. Estes sinais foram revertidos já no dia seguinte.

Comparamos ainda o consumo alimentar e a diurese dos camundongos tratados com a fisalina

B, em relação aos camundongos do grupo placebo, dentro do intervalo de 14 dias. O consumo

alimentar não variou significativamente no intervalo analisado. Já a diurese, observada no 14º

dia foi reduzida de forma dose-dependente sendo, portanto a maior redução nos camundongos

machos tratados com fisalina B na dose de 800 mg/kg (tabela 1). Resultados semelhantes

foram obtidos com o grupo de fêmeas tratados com a fisalina B, e com os grupos de machos e

fêmeas tratados com a fisalina F. Deste modo, nesta e nas análises subseqüentes optamos por

representar apenas os dados dos machos tratados com fisalina B.

31

Figura 1

A B

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

1

2

3

4

5

6

fisalina F g/kg

sobtrevivencia

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

1

2

3

4

5

6

fisalina B g/kg

sobrevivencia

Fig.1: Curva de sobrevida dos camundongos machos Swiss Webster tratados com

fisalinas B e F. Grupos com 6 camundongos machos foram tratados com diferentes doses de

fisalinas F (A) ou B (B). No grupo tratado com fisalina F 800 mg/kg houve três óbitos nas

primeiras 24 horas e no grupo tratado com fisalina B 800 mg/kg houve apenas um óbito nas

primeiras 24 horas.

Tabela 1: Sinais de nocicepção, consumo alimentar e diurese em camundongos machos

(n=6) Swiss Webster tratados com fisalina B

Parâmetros Controle

Fisalina B 100 mg/kg

Fisalina B 200 mg/kg

Fisalina B 400 mg/kg

Fisalina B 800 mg/kg

P

Sinais de toxicidade

24 h 14 d

0/5 0/5

0/5 0/5

0/5 0/5

0/5 0/5

3/5 0/5

P > 0,05

Consumo alimentar(g)

24 h 14 d

2,57 ± 0,89 3,05 ± 0,73

3,10 ± 0,68 3,16 ± 0,79

3,58 ± 0,46 3,25 ± 0,57

3,44 ± 1,05 3,33 ± 1,13

3,05 ± 0,84 2,58 ± 0,29

P > 0,05

Diurese (mL)

24 h 14 d

0,90 ± 0,11 1,25 ± 0,52

1,50 ± 0,33 1,20 ± 0,29

1,25 ± 0,21 1,10 ± 0,24

1,87 ± 0,25 0,47 ± 0,38

1,85 ± 0,46 0,70 ± 0,26

P <0.001

Os 5 sinais de toxicidade avaliados foram tremores, piloereção, ptose, efeitos sobre a respiração e movimentação. Nos camundongos tratados com fisalina B na dose de 800mg/kg observou-se os sinais de piloereção, ptose e efeitos sobre a movimentação.

32

5.1.2 Avaliações bioquímicas e hematológicas de camundongos Swiss Webster machos e

fêmeas tratados com as fisalinas B e F

Amostras de sangue dos animais tratados com diferentes doses de fisalinas ou placebo

foram coletados 24 horas e 14 dias após administração da droga para separação do soro. Foram

realizadas análises bioquímicas para avaliação das funções metabólicas que poderiam estar

comprometidas em caso de toxicidade para o organismo, tais como creatinina, uréia, colesterol,

glicose, TGO e TGP. Os resultados das primeiras 24 horas (tabela 2) e do 14° dia (tabela 3) em

camundongos machos tratados com fisalina B ou com placebo indicam a ausência de alterações

significativas nos padrões bioquímicos avaliados. Todos os parâmetros apresentados nas tabelas

2 e 3 permaneceram dentro dos valores de referência normais para camundongos Swiss

Webster machos e fêmeas.

Tabela 2: Dosagens bioquímicas realizadas no soro de camundongos Swiss Webster machos

(n=6) tratados com a fisalina B, 24 horas após a administração da droga.

Parâmetros

Controle 24 h

Fisalina B 100 mg/kg

Fisalina B 200 mg/kg

Fisalina B 400 mg/kg

Fisalina B 800 mg/kg

P

Uréia (mg/dL)

53,9 ± 14,4

52,7 ± 11,6

46,4 ± 15,7

42,8 ± 24,4

55,8 ± 18,8

P>0,05

Creatinina (mg/dL)

0,66 ± 0,36

0,52 ± 0,23

0,46 ± 0,16

0,35 ± 0,14

0,53 ± 0,20

P>0,05

Glicose (mg/dL)

136,7 ± 4,1

146,3 ± 3,9

141,7 ± 4,3

142,1 ± 4,9

140,6 ± 4,7

P>0,05

Colesterol (mg/dL)

140,3 ± 27,5

136,5 ± 23,1

161,1 ± 21,9

162,7 ± 12,1

167,4 ± 23,6

P>0,05

ALT (UI/L)

21,5 ± 8,8/

23,3 ± 5,4/

22,7 ± 7,6

21,8 ± 5,3

29,2 ± 8,7

P>0,05

AST (UI/L)

27,7 ±14,8/

36,0 ± 17,3

38,0 ± 9,7

41,0 ± 15,4

41,6 ± 8,8

P>0,05

33

Tabela 3: Dosagens bioquímicas realizadas no soro de camundongos Swiss Webster machos

(n=6) tratados com fisalina B, 14 dias após a administração da droga.

Parâmetros

Controle 14 dias

Fisalina B 100 mg/kg

Fisalina B 200 mg/kg

Fisalina B 400 mg/kg

Fisalina B 800 mg/kg

P

Ureia (mg/dL)

45,4 ± 23,4 56,6 ± 13,1 49,9 ± 15,3 45,9 ± 8,9 65,9 ± 15,5 P>0,05

Creatinina (mg/dL)

0,51 ± 0,20 0,45 ± 0,17 0,41 ± 0,14 0,57 ± 0,26 0,48 ± 0,26 P>0,05

Glicose (mg/dL)

156,3 ± 4.8 143,5 ± 5.2 145,4 ± 4.4 141,4 ± 5.3 144,4 ± 3,8 P>0,05

Colesterol (mg/dL)

166,7 ± 33,6 158,1 ± 47,1 174,2 ± 44,4 190,7 ± 41,0 199,8 ± 31,9 P>0,05

ALT (IU/L)

19,7 ± 4,9 25,0 ± 8,8 26,1 ± 4,2 27,2 ± 4,0 32,0 ± 6,9 P>0,05

AST (IU/L)

31,0 ± 9,0 44,0 ± 16,7 43,0 ± 8,1 42,0 ± 16,6 46,9 ± 10,2 P>0,05

Para a avaliação hematológica foram utilizadas amostras de sangue total coletados nas

primeiras 24 horas e no 14º dia. Os padrões hematológicos foram avaliados apenas em

camundongos tratados com as doses mais altas (400 e 800 mg/kg) das fisalinas, uma vez que foram

estas as doses em que os camundongos apresentaram sinais indicativos de toxicidade, conforme

descrito anteriormente. Na amostra de sangue total foi realizado o hemograma em contador

hematológico automático. Avaliamos o número total de leucócitos (figura 2) e de hemácias (figura

3) dos grupos de camundongos Swiss Webster tratados com fisalina B e do grupo tratado com

placebo, como parâmetros de toxicidade aguda.

Na concentração de 800 mg/kg foi observada uma diminuição significativa do número

total de leucócitos, de modo dose-dependente. A diminuição dos leucócitos atingiu níveis graves de

leucopenia, indicando uma ação tóxica e imunossupressora sobre essas células. Observou -se

também uma redução estatisticamente significativa, do número de hemácias periféricas nos

camundongos tratados com 800 mg/kg da fisalina B. Porém, esta diminuição não chegou a

caracterizar um quadro de anemia. Estas alterações demonstraram um efeito dose-resposta para a

diminuição do padrão celular periférico.

34

Figura 2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9placebo

400 mg/kg

800 mg/kg

**

*

**

**

2 4 h 14 d

Leucócitos (mm3/103)

Fig.2: Avaliação hematológica dos camundongos Swiss Webster machos submetidos ao teste

de toxicidade aguda por fisalina B. Contagem de leucócitos nas doses de 400 e 800 mg/kg.

Dados representam a média±SEM de 6 animais por grupo. * p < 0,05 e ** p < 0,01, teste one way

ANOVA e pós-teste Newman Keuls.

Figura 3

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9placebo

400 mg/kg

800 mg/kg

***

**

24 h 14 d

Hemácias (106/mm3)

Fig.3: Avaliação hematológica dos camundongos Swiss Webster machos submetidos a

toxicidade aguda por fisalina B. Contagem de hemácias nas doses de 400 e 800 mg/kg. Dados

representam a média±SEM de 6 animais por grupo. * p < 0,05 e ** p < 0,01, teste one way

ANOVA e pós-teste Newman Keuls.

35

5.2 TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS NZB/W F1 COM FISALINAS B E F EM

MODELO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO (SLE).

Camundongos fêmeas NZB/W F1 com idade a partir de três meses foram tratadas com as

fisalinas B ou F (1 mg/animal) diariamente, por gavagem, durante três meses. Como pode ser

observado na curva de sobrevivência (figura 4), os camundongos NZB/W F1 tratados com as

fisalinas B ou F apresentaram uma redução de 20-25% na mortalidade em relação à curva de

sobrevida dos animais tratados com placebo. Apesar da mortalidade ser maior no grupo tratado

com placebo os resultados não apresentaram diferenças significantes entre os grupos tratados

com as fisalinas e o grupo tratado com placebo.

Figura 4

Fig. 4: Curva de sobrevida de camundongos NZB/W F1 fêmeas tratadas com as fisalinas B

ou F. Camundongos tratados com 1 mg/ animal por dia de fisalina B (A) F (B) por via oral,

durante três meses. Análise estatística log rank test.

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12semanas de tratamento

% de sobrevivência PLACEBO

FISALINA B

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12semanas de tratamento

% de sobrevivência PLACEBO

FISALINA F

A B

36

Para investigar os efeitos das fisalinas B e F quanto a função renal dos camundongos

utilizados no modelo de lupus, foi avaliada a proteinúria em amostras de urina coletadas em

gaiolas metabólicas. Observamos um aumento gradativo nos níveis de proteinúria dos

camundongos do grupo controle ao longo dos três meses de tratamento, enquanto que os

camundongos tratados com as fisalinas tiveram um aumento mais discreto no mesmo período

(figura 5). Os camundongos tratados com fisalinas B e F tiveram um decréscimo de

aproximadamente 20mg/dL. Passaram de valores de 100 mg/dL para valores inferiores a 80

mg/dL ao final do tratamento. Para o grupo tratado com a fisalina B, a redução no final do

tratamento não apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo tratado

com placebo. Já no grupo tratado com a fisalina F, observamos uma redução nos níveis de

proteínuria, com valores significativos em relação ou grupo tratado com placebo no ponto final

do tratamento. Apesar de os níveis de proteínuria dos camundongos tratados com fisalina B ou F

serem bastante superiores aos valores normais de referência para este padrão, a queda deste

parâmetro sugere a ação destas drogas na melhora da função renal.

A coleta de urina na gaiola metabólica serviu também como parâmetro de avaliação da

diurese em 12 horas. Observou-se uma tendência de melhora na diurese dos camundongos

tratados com as fisalinas B ou F em relação ao grupo tratado com placebo, principalmente no

último ponto avaliado (figura 6), sugerindo também uma melhora na função renal, apesar de não

termos observado diferenças significativas na avaliação deste parâmetro.

37

Figura 5

A B

0

50

100

150placebo

Fisalina B

0 6 12

semanas de tratamento

proteinúria (mg/dL)

0

50

100

150Placebo

Fisalina F

*

0 6 12

semanas de tratamento

proteinúria (mg/dL)

Fig. 5: Dosagem de proteinúria em camundongo NZB/W F1 tratados com as fisalinas. A

dosagem de proteína foi realizada em amostras de urina coletadas em diferentes pontos do

tratamento com fisalina B, F ou placebo. (A) Camundongos tratados com a fisalina B. (B)

Camundongos tratados com a fisalina F. Os valores representam as médias ±SEM de 6

camundongos por grupo. * P <0,001, referente ao teste one way ANOVA e pós-teste Newman

Keuls.

Figura 6 A B

0.0

0.5

1.0

1.5Placebo

Fisalina B

0 6 12

diurese 12 horas/mL

semanas de tratamento

0.0

0.5

1.0

Placebo

Fisalina F

0 6 12

semanas de tratamento

diurese 12 horas/mL

Fig. 6: Diurese camundongos NZB/W F1 tratados com fisalinas B e F. Urina medida através

de compartimento da gaiola metabólica onde os camundongos de cada grupo de estudo

38

permaneceram por 12 horas. (A) Camundongos tratados com a fisalina B. (B) Camundongos

tratados com a fisalina F. Os valores representam as médias ±SEM de 6 camundongos por grupo.

Os diferentes grupos experimentais foram submetidos a coletas de sangue quinzenais. A

dosagem de creatinina foi realizada no soro destes camundongos, em três tempos diferentes

durante o tratamento. Como demonstrado na figura 7, não houve diferenças estatisticamente

significantes para o padrão da creatinina, nos grupos tratados com as fisalinas em relação ao

grupo placebo.

Figura 7 A B

Fig. 7: Níveis de creatinina em camundongos NZB/W F1. A dosagem de creatinina foi

realizada em amostras de soro coletadas em diferentes pontos do tratamento com fisalina B, F ou

placebo. (A) Camundongos tratados com a fisalina B. (B) Camundongos tratados com a fisalina

F. Os valores representam as médias ±SEM de 6 camundongos por grupo.

0.0

0.5

1.0

1.5Placebo

Fisalina B

Semanas de tratamento

0 6 12

Creatinina (mg/dL)

0

1

2Placebo

Fisalina F

Semanas de tratamento

0 6 12

Creatinina (mg/dL)

39

5.2.1 Avaliação patológica dos rins de camundongos NZB/W (F1) tratados com a fisalina F

e placebo.

Secções dos rins dos camundongos NZB/W F1 tratados com as fisalinas foram observadas

em microscopia óptica. Observamos parâmetros característicos da patologia, tais como a presença

de glomerulonefrite em ambos os grupos avaliados. No grupo placebo (figura 8) foi visto

glomerulonefrite proliferativa difusa (proliferação endocapilar e mesangial), presença de

cilindros séreos e protéicos além de infiltrado pélvico intenso. No grupo tratado com a fisalina F

(figura 9) foi observada glomerulonefrite mesangial, pouca proliferação endocapilar e presença

de infiltrado pélvico moderado.

40

Figura 8

Fig. 8. Secção transversal do rim de camundongo fêmea NZB/W (F1) tratado com placebo.

Coloração H&E, aumento de 100X. O glomérulo demonstrado sugere proliferação celular

endocapilar intensa, proliferação mesangial intensa.

Figura 9

Fig. 9. Secção transversal do rim de camundongo fêmea NZB/W (F1) do grupo tratado com

fisalina F. Coloração H&E, aumento de 100X. O glomérulo demonstrado mostra proliferação

mesangial predominante com inicio de proliferação endocapilar moderada.

41

5.3 TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS MACHOS DBA/1 COM FISALINAS F, PARA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DA FISALINA F NO MODELO DE ARTRITE INDUZIDA POR

COLÁGENO TIPO II (CIA).

Camundongos DBA/1 machos com nove semanas de idade foram imunizados com

colágeno bovino do tipo II emulsificado em adjuvante de Freund’s. Cinco dias após a última

injeção de colágeno, os camundongos apresentaram edema nas patas traseiras e/ou dianteiras.

Durante o tratamento, o volume das patas foi medido em plestimômetro com intervalos de 5 em 5

dias. Observamos diminuição no volume das patas dos camundongos do grupo tratado com a

fisalina F e no grupo tratado com a droga controle, a dexametasona, em relação aos camundongos

do grupo placebo (figura 10). O volume das patas foi reduzido ao final do tratamento com fisalina

F de 0,6 mL para 0,2 mL. No grupo placebo foi registrada a morte de três animais, sendo o

primeiro com 16 dias e os outros dois com 18 dias de tratamento. Após os 20 dias propostos para

o tratamento, os grupos foram sacrificados com injeção letal de anestésico tiopental. As patas

foram retiradas e passaram por processo de descalcificação em ácido nítrico 7% para inclusão em

parafina. Secções das patas foram coradas com H&E. A análise histopatológica das secções das

patas dos camundongos tratados com placebo demonstraram a presença de um infiltrado

inflamatório de polimorfonucleares no espaço interarticular e no tecido sinovial, com formação

de tecido granulomatoso e presença de fibrilas, além de edema e congestão de vasos (figura 11).

Das secções das patas dos camundongos do grupo tratado com fisalina F, apenas uma apresentou

tecido sinovial hiperplasiado, com presença de tecido fibrótico e deposição de fibrilas no espaço

interarticular (figura 12). As outras secções observadas deste mesmo grupo apresentaram o

espaço interarticular intacto, com o tecido sinovial normal e cartilagens preservadas (figura 13).

O mesmo pode-se observar para as secções das patas de camundongos tratados com

dexametasona (figura 14).

42

Figura 10

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

placebo

Fisalina F

Dexametasona

0 5 10 15 20

*** **

dias de tratamento

Volume das patas (mL)

Fig 10. Medida do volume das patas de camundongos DBA/1 com AIC. Animais imunizados

com colágeno bovino do tipo II foram tratados diariamente com placebo, fisalina F (1 mg/animal)

e dexametasona (50 µg/animal), por gavagem, durante 20 dias. * p<0,05 em comparação com os

grupos placebo e fisalina F; ** p<0,01 em relação ao grupo placebo, teste one way ANOVA e

pós-teste Newman Keuls.

43

Figura 11

Fig. 11: Histopatologia da pata de camundongo DBA/1 com AIC após tratamento com

placebo. Os fragmentos do tecido foram incluídos em parafina e os cortes foram corados com

H&E. Em (A), presença de infiltrado inflamatório no espaço interarticular e no tecido sinovial,

com deposição de fibrilas, aumento de 4X. Em (B) mesma secção no aumento de 40X dando

enfâse no infiltrado inflamatório presente no espaço interarticular e na deposição de fibrila. Em

(C), predomínio de células inflamatórias polimorfonucleares, demonstrando tecido edemaciado e

congestão de vasos, aumento de 10X.

A

B C

44

Figura 12 Fig. 12: Histopatologia da pata de camundongo DBA/1 com AIC após tratamento com

fisalina F. Os fragmentos do tecido foram incluídos em parafina e os cortes foram corados com

H&E. De todas as secções de patas dos camundongos do grupo tratado com fisalina F, apenas

esta apresentou perfil histopatológico com presença de células inflamatórias e deposição no

espaço interarticular. Em (A), presença tecido sinovial hiperplasiado, com presença de tecido

fibrótico e deposição de fribilas no espaço interarticular, aumento de 4X. Em (B) mesma secção

no aumento de 10X dando ênfase no tecido fibrótico, deposição de fibrila e debris celulares. Em

(C), predomínio de fibrinas depositadas no espaço interarticular, aumento de 40X.

A

B C

45

Figura 13 Fig.13 Histopatologia da pata de camundongo DBA/1 com AIC após tratamento com

fisalina F. Os fragmentos do tecido foram incluídos em parafina e os cortes foram corados com

H&E. Espaço interarticular límpido com articulações intactas. Perfil observado em 5 de 6

camundongos tratados com a fisalina F. Análise em microscópio óptico, aumento de 4X .

Figura 14 Fig.14 Histopatologia da pata de camundongo DBA/1 com AIC após tratamento com

dexametasona. Os fragmentos do tecido foram incluídos em parafina e os cortes foram corados

com H&E. Espaço interarticular límpido com articulações intactas. Perfil observado em

camundongos tratados com a dexametasona. Análise em microscópio óptico, aumento de 4X.

46

6 DISCUSSÃO

Physalis angulata é uma espécie vegetal de vasta utilização na medicina popular. Os

efeitos antiinflamatórios e anti-reumáticos do extrato das flores desta solanácea já foram

comprovados cientificamente (CHOI, 2003). Dentre os princípios ativos desta espécie, estão as

fisalinas B e F, seco-esteróides isolados a partir de folhas e raízes de P. angulata. Estudos in vitro

demonstraram a atividade dessas fisalinas na modulação do sistema imune, com ação inibidora da

ativação de macrófagos e da produção de óxido nítrico (NO), potente mediador químico da

inflamação, e de citocinas pró-inflamatórias, além de proteger camundongos contra doses letais

da injeção de lipopolissacarídeo (SOARES, 2003). As fisalinas B e F também demonstraram ação

antiinflamatória inibindo a reperfusão e aumentando a permeabilidade vascular, a diminuição de

TNF-α e aumento de IL-10 nos tecidos (VIEIRA, 2005).

Um estudo mais recente relatou que as fisalinas B e F têm uma potente ação na supressão

da atividade in vitro de esplenócitos estimulados com concanavalina A e um efeito significativo

na prevenção da rejeição de transplantes alogênicos. Camundongos tratados diariamente com

fisalinas (1 mg/animal), inibiram em até 70% a rejeição de enxertos heterólogos (SOARES,

2006). Portanto, além de atividade sobre macrófagos, as fisalinas também agem na resposta

mediada por linfócitos. Em conjunto, estes dados sugeriram que estas moléculas tivessem ação

terapêutica em outras patologias mediadas pelo sistema imune.

Contudo, neste trabalho avaliamos a atividade das fisalinas B e F no tratamento de

doenças autoimunes, como LES e AR. Porém, a fim de excluir a possibilidade de intoxicação por

essas drogas nos animais submetidos aos modelos experimentais, realizamos estudos de

toxicidade das drogas, pois, não havia sido realizado nenhum estudo toxicológico das fisalinas B

e F até o momento.

A avaliação da toxicidade aguda consiste na primeira etapa do estudo toxicológico na fase

pré-clínica no desenvolvimento de drogas, e ocorre por administração única em doses bastante

superiores às doses terapêuticas (HAYES, 1994). Para a avaliação da toxicidade aguda, os

parâmetros de avaliação metabólica e morte são os mais importantes e que fornecem o perfil de

toxicidade da droga testada. A análise histopatológica dos tecidos pode ou não fornecer

alterações nos padrões de toxicidade aguda, já que o período estabelecido para estas analises são

47

de 14 dias de observação, não havendo tempo para manifestações patológicas em órgãos e tecidos

(HAYES, 1994).

Os ensaios de toxicidade que devem ser realizados em duas vias de administração

diferentes, em geral i.p. e v.o. Neste estudo, devido a escassez de droga, optamos apenas em fazer

a administração da dose aguda pela via i.p. Pois, esta via oferece maior biodisponibilidade das

drogas administradas.

No estudo da toxicidade aguda das fisalinas B e F foram realizados experimentos em

camundongos Swiss Webster machos e fêmeas. Os resultados aqui apresentados foram sempre

dos grupos de machos e tratados com fisalina B, pois não houve diferenças nos resultados para

ambos os sexos e as drogas estudadas possuem estruturas bastante similares (SOARES, 2006).

Os resultados dos ensaios bioquímicos, hematológicos e sinais de toxicidade também foram

muito semelhantes entre os grupos.

Embora o grupo de camundongos tratados com a fisalina F tenha apresentado uma

mortalidade maior que a fisalina B na dose de 800 mg/kg, o que sugeriu inicialmente uma maior

toxicidade para a fisalina F, em conjunto os sinais de toxicidade e os parâmetros bioquímicos e

hematológicos não confirmaram essa observação inicial, uma vez que os resultados foram

semelhantes para ambas as drogas.

Há vários métodos para se calcular a DL50 de uma droga. Neste estudo optamos pelo

método tradicional desenvolvido por Finney (1971), que é a análise probit. O programa é

alimentado com dados de experimentos de toxicidade aguda, representados por grupos que

receberam doses logarítmicas da droga e por um grupo controle. A análise probit é apenas

possível se houver morte em mais de uma das doses testadas. Em nosso estudo foi observada

morte apenas na dose mais alta testada, e por isso não foi possível calcular a DL50.

Segundo Hayes (1994), muitos autores têm avaliado a DL50 de drogas e chegado à

conclusão de que DL50 tem um valor impreciso, não é uma constante biológica e para muitas

substâncias não é possível determiná-la. Esses autores demonstram que valores aproximados da

DL50 são suficientes na prática proposta para ensaios toxicológicos e que se deve dar maior

ênfase aos sinais de toxicidade, no declínio da curva dose-resposta e nos achados patológicos.

Sinais comuns de fármaco-toxicidade em camundongos, que não são capazes de relatar os

sintomas, são manifestados pela ativação de órgãos sensoriais especializados, ou receptores que

respondem a estímulos nocivos, e são denominados sinais de nocicepção. Estes abrangem sinais

48

respiratórios, de atividade motora, convulsão, reflexos, sinais oculares, sinais cardiovasculares,

salivação, piloereção, tônus muscular, analgêsia e sinais gastrintestinais, como emêse e diurese

(HAYES, 1994).

Neste estudo, os sinais de nocicepção observados foram: tremores, piloereção, ptose,

efeitos sobre a respiração e movimentação. Além disso, foram avaliados o peso corporal e a

diurese nas primeiras 24 horas e 14 dias após a administração da dose única das fisalinas B e F.

Os sinais tóxicos foram observados nas primeiras 24 horas de quatro em quatro horas e

diariamente até o décimo quarto dia (HAYES, 1994, ABDEL-BARRY, 2000). Observamos nas

primeiras 12 horas o aparecimento de alguns sinais de toxicidade na dose mais alta testada (800

mg/kg), tanto para fisalina B como fisalina F, que foram piloereção, ptose e movimentação. Esses

sinais foram revertidos e desapareceram com 48 horas e são comuns até mesmo em drogas que

estão incluídas na terapêutica. São os chamados sinais colaterais, que são facilmente revertidos

após a absorção da droga (HAYES, 1994 e FDA, 1997). Apenas estudos de toxicidade crônica

podem excluir a possibilidade destes efeitos serem nocivos ao organismo.

Os camundongos foram pesados antes da administração da droga e no final do

experimento, tendo em média 50 g e 54 g, respectivamente (dados aqui não demonstrados), e

sugere que as drogas não provocaram uma diminuição ou aumento de peso anormal no período

observado. O mesmo observa-se para o consumo alimentar, indicando que as fisalinas não

interferiram no apetite dos camundongos tratados. O consumo alimentar permaneceu estável

entre os grupos e durante todo o experimento, sendo em média diária de 3,1 gramas de ração

ingerida em cada grupo.

A diurese foi outro sinal de toxicidade também avaliado neste experimento. Observou-se

que, nas doses mais altas testadas (400 e 800 mg/kg das fisalinas B e F), os animais apresentaram

uma diminuição significativa na quantidade de urina eliminada no intervalo de tempo avaliado,

de modo dose-dependente. Essa redução significativa na eliminação da urina sugere estudos de

investigação molecular, que possam encontrar o possível mecanismo de ação destas drogas.

Os padrões bioquímicos avaliados descrevem o perfil metabólico dos camundongos

submetidos à toxicidade, além de poder indicar qual órgão, tecido e até mesmo qual metabolismo

fisiológico está sofrendo alterações devido à agressão tóxica de substancias (ABDEL-BARRY,

2000). Foi realizada a dosagem de glicose, que avalia a função do metabolismo de carboidratos, e

demonstrou que as fisalinas não interferiram no metabolismo de carboidratos, não havendo

49

diferenças entre as doses testadas e grupos controle. Portanto, esta pode ser uma vantagem da

utilização destas drogas em relação aos glicocorticóides, que possuem efeito hiperglicemiante,

pois atuam aumentando a gliconeogênese e o acúmulo de glicogênio (RANG, 2001). As dosagens

realizadas demonstraram valores do início ao final do experimento dentro dos níveis normais para

esta linhagem de camundongo (FOSTER, 1982).

Outro padrão bioquímico avaliado foi o colesterol, que demonstra a atividade do

organismo em metabolisar os lipídeos. Os resultados obtidos indicam que as fisalinas não foram

capazes de interferir no processamento dos lipídeos, uma vez que não houve variações

significativas nos valores encontrados, que estão dentro da faixa de normalidade para esta

linhagem, de acordo com Foster, 1982. O colesterol é um dos precursores dos hormônios

esteróides no organismo. O uso contínuo dos glicocorticóides pode provocar o acúmulo de

colesterol no organismo e até mesmo desregular a produção destes hormônios pela supra-renal,

podendo levar ao desenvolvimento de uma síndrome denominada, síndrome de Cushin. Os níveis

de colesterol não foram alterados com a administração aguda das fisalinas, porém estudos

crônicos são necessários para excluir definitivamente este efeito adverso.

Foram dosados os níveis de uréia e creatinina, que são metabólitos utilizados para avaliar

a função renal e o metabolismo protéico, pois a uréia é o principal produto da metabolização das

proteínas. Observou-se um discreto aumento geral entre o início e o fim do experimento, que não

prova nenhum efeito tóxico, mas sugere uma investigação de toxicidade crônica desta droga

sobre os metabolismos envolvidos na produção de uréia no organismo.

A creatinina, que depende da filtração glomerular, também é eficaz para mensurar o

clearance renal e corporal da droga, pois, em conjunto com a medida da diurese, pode-se medir a

velocidade de eliminação da droga. Não realizamos a mensuração do clearance, pois são

avaliações para estudo de farmacocinética e investigação do mecanismo de ação, que são outras

etapas no desenvolvimento de drogas. Os valores nas dosagens séricas de creatinina não

demonstraram diferenças no intervalo observado para o ensaio de toxicidade aguda.

A maioria das drogas passa por metabolização no fígado, através do efeito de primeira

passagem. Quando administradas doses tóxicas de uma droga, o fígado recebe uma grande

quantidade da substância para metabolizar. Essas substâncias podem se acumular no fígado,

agredindo este órgão importantíssimo na metabolização de substâncias exógenas e endógenas.

Em geral, é um órgão alvo nas avaliações de toxicidade, que podem levá-lo a alterações

50

funcionais e patológicas. Duas enzimas específicas indicam lesão celular no fígado, a AST e a

ALT. Nos grupos avaliados por toxicidade aguda pelas fisalinas B e F, os níveis dessas enzimas

não foram alterados, permanecendo próximo dos valores normais de referência para

camundongos desta linhagem, tanto nas primeiras 24 horas quanto 14 dias após a administração

das drogas testadas.

O perfil bioquímico demonstrou que as drogas testadas apresentaram baixa toxicidade

diante dos metabólitos avaliados. Os discretos aumentos observados pelas médias dos grupos

entre o primeiro e décimo quarto dia não foram observados individualmente entre cada grupo no

mesmo intervalo de tempo. As dosagens dos metabólitos não ultrapassaram em nenhum momento

os valores normais de referências sugeridos por Foster (1982).

As dosagens bioquímicas refletem o funcionamento fisiológico e possíveis alterações

patológicas de um organismo (KANZ, 1998). Como não houve diferenças nos resultados

apresentados, não foram realizadas análises patológicas de órgãos e tecidos, já que os parâmetros

bioquímicos não sugeriram nenhuma alteração metabólica. Estes estudos devem obrigatoriamente

ser realizados em testes de toxicidade crônica.

O perfil hematológico dos camundongos demonstrou uma relação dose-resposta das

fisalinas B e F nas dosagens realizadas no décimo quarto dia após a administração da única dose

de uma ou outra droga testada. Houve uma discreta variação observada nas primeiras 24 horas,

que não atribuímos ao efeito da droga, mais sim a possíveis variações individuais, já que este

parâmetro não foi critério de randomização dos animais.

Os valores encontrados nos hemogramas do grupo que recebeu a dose mais alta das

fisalinas estavam abaixo dos valores normais de referência. Já os valores de hemácias, apesar de

reduzidos, encontram-se dentro dos níveis normais para esta linhagem de camundongos

(HARKNESS, 1983). Na dose mais alta testada (800 mg/kg), a diminuição periférica do número

total de leucócitos foi bastante significativa. Houve uma queda mais severa no número de

leucócitos em relação ao número de hemácias. A leucopenia apresentada é um efeito observado

com a utilização de corticóides, que induzem apoptose de leucócitos e interferem na proliferação

de células na medula óssea (GOODMAM, 2006). Os mecanismos pelos quais as fisalinas causam

este efeito serão ainda investigados.

51

A diminuição acentuada nestes índices hematimétricos sugere uma manifestação tóxica

para estas substâncias. Portanto, apesar de não ser possível realizar o cálculo da DL50, a

observação destes sinais de toxicidade indica que a dose segura para utilização destas substâncias

encontra-se abaixo de 800 mg/kg, uma dose relativamente alta para a classe farmacológica dos

esteróides, demonstrando uma segurança terapêutica elevada para uso dessas drogas. Porém,

estudos de toxicidade sub-crônica e crônica e de genotoxicidade devem ainda ser realizados.

Para dar continuidade aos estudos do mecanismo de ação destas drogas são relevantes

dados de trabalhos anteriores que demonstraram, ao utilizar um antagonista do receptor de

glicocorticóide (RU486) não houve bloqueio da ação das fisalinas, enquanto que o efeito da

dexametasona foi bloqueado (SOARES, 2003 e 2006). Resultados preliminares da investigação

do mecanismo de ação sugerem que essas substâncias se liguem ao receptor de vitamina D, outro

hormônio esteróide com ação imunomoduladora. Evelyne van Etten , demonstrou que a 1,25

(OH) D3 e seus análogos têm sido utilizados em modelos de doenças autoimunes espontâneas ou

induzidas. Como: encefalomielite, LES, AIC, diabetes tipo I. Além, da ação na prevenção da

rejeição de transplantes (2005).

O lupus eritematoso sistêmico (LES) em seres humanos se manifesta de várias formas.

Pode ter início agudo ou insidioso, mas é uma doença crônica, remitente e recidivante,

caracterizada principalmente por lesão de pele, articulações, rim e membranas serosas

(COTRAN, 2000). As fêmeas NZB/W F1 desenvolvem uma patologia semelhante à do LES, com

maior comprometimento renal e desenvolvimento de nefrite lúpica característica desta

imunopatologia. Estes camundongos têm hiper-atividade das células B, elevação de IgM e IgG no

soro, aumento na produção de auto-anticorpos e conseqüentemente aumento de complexos

imunes na circulação. O efeito culminante desta patologia é fatal e ocorre devido à

glomerulonefrite mediada por complexos imunes (BANOTAI, 1999).

Como a principal manifestação neste modelo é a nefrite lúpica, nos atemos a avaliar a

função renal dos camundongos submetidos ao tratamento com fisalina B ou F. Os efeitos destas

drogas no modelo de LES em camundongos fêmeas NZB/W F1 foram avaliados em dois

experimentos, um tratado com a fisalina B e o outro com a fisalina F. Um pequeno aumento da

sobrevida dos animais foi observado nos grupos tratados com uma das fisalinas testadas.

A elevação nos níveis de creatinina, proteínuria e diminuição da diurese acompanham o

desenvolvimento da nefrite lúpica (MIHARA, 1997). Neste trabalho, realizamos a dosagem de

52

proteinúria em alguns pontos do tratamento com as fisalinas B e F. Pudemos observar que os

animais tratados com a fisalina B ficaram com os níveis de proteinúria estabilizados em relação

ao placebo, que permaneceu elevando até o final do tratamento. Porém, os níveis continuaram

acima dos normais. Já o grupo tratado com fisalina F apresentou níveis de proteinúria

significativamente menores do que os do grupo placebo no ponto final do tratamento (12

semanas).

Na avaliação da diurese dos camundongos do grupo tratado com a fisalina B, apesar de os

camundongos já apresentarem inicialmente níveis melhores de diurese em relação ao grupo

placebo, observamos que o grupo tratado com a droga apresentou uma redução no volume de

urina. Excluindo-se as diferenças iniciais, pode-se observar que a fisalina B não apresentou

nenhum efeito sobre a melhora da diurese destes camundongos, pois ambos os grupos tiveram

uma queda em 0,4 mL na diurese durante o tratamento.

A diurese nos camundongos NZB/W F1 tratados com fisalina F apresentou uma melhora

discreta em relação ao grupo placebo deste experimento. Como se pode observar nos resultados

apresentados, o grupo tratado com a fisalina F evoluiu aumentando a diurese no ponto final do

tratamento, indicando uma leve melhora da função renal. Outro parâmetro bioquímico avaliado

foi a dosagem sérica de creatinina, que é um produto de exclusiva eliminação renal. Se seus

níveis séricos estão aumentados, pode-se sugerir um comprometimento da função renal. No

experimento do tratamento com a fisalina B, observamos que a droga não produziu nenhum

efeito positivo na redução deste produto a níveis séricos e, ao final do tratamento, tanto o grupo

tratado com fisalina B como o grupo placebo apresentaram níveis de creatinina bastante elevados,

sugerindo lesão renal em ambos os grupos. Já no experimento do tratamento com a fisalina F,

tanto o grupo tratado com esta droga quanto o grupo placebo apresentaram uma redução nos

níveis de creatinina. Todavia, no último ponto analisado, os níveis de creatinina no grupo tratado

com a fisalina F estavam relativamente reduzidos em relação ao grupo placebo, e os valores de

creatinina estavam dentro da faixa de normalidade.

As avaliações morfológicas dos rins foram então realizadas, para detectar alguma

anormalidade neste órgão, e determinar se as drogas contribuíram para reverter

morfologicamente as lesões provocadas pela doença. Devido as inúmeras manifestações e

complexidade do LES, a OMS faz 5 classificações para a nefrite lúpica: I- morfologia renal

53

normal à microscopia. II- glomerulonefrite lúpica mesangial. III- glomerulonefrite proliferativa

focal. IV - glomerulonefrite proliferativa difusa e V- glomerulonefrite membranosa (COTRAN,

2000). Esses padrões fazem parte da evolução da patologia e hoje, o tratamento desta visa

melhorar a qualidade de vida dos pacientes, diminuindo a classe na qual o indivíduo se enquadra

e, conseqüentemente, a severidade da doença.

Na análise histopatológica dos camundongos NZB/W F1 pertencentes ao grupo placebo,

secções de rim coradas em HE, apresentaram glomerulonefrite proliferativa difusa, sendo

classificada como classe IV do LES, que inclui um grau alto de gravidade da doença. Esta

classificação foi feita com base nos achados de proliferação de células endoteliais e mesangiais e

acentuada celularidade em todo o glomérulo. Já nas secções do rim de camundongos NZB/W F1

tratados com fisalina F indicaram uma classe II das manifestações renais da nefrite lúpica. Foram

também observadas seções de rim dos camundongos tratados com fisalina B, os cortes

apresentaram glomerulonefrite lúpica mesangial com histologia semelhante ao observado no

grupo tratado com fisalina F. Observamos proliferação mesangial, que é caracterizada pelo

aumento moderado da matriz mesangial intercapilar, bem como do número de células

mesangiais. Ainda observamos, em outros campos desta lâmina, a deposição de imunocomplexos

e infiltrado pélvico moderado. Em conjunto, a caracterização morfológica leva a crer que houve

melhora na qualidade de vida dos animais tratados com as fisalinas B e F em relação ao grupo

placebo.

O modelo de AR foi desenvolvido em camundongos machos DBA/1, por esta ser uma

linhagem bastante susceptível a esta patologia. Após a padronização do modelo, observamos que

apenas machos com idades superiores a nove semanas de idade respondiam bem às imunizações

com colágeno do tipo II. Este colágeno é utilizado por ser este o tipo de colágeno que forma

fibrilas e está presente na cartilagem, o principal alvo da resposta imune na AR (JUNQUEIRA,

2004). Pelo fato de haver na circulação anticorpos anticolágeno do tipo II circulante, estes

interagem com o colágeno tipo I normalmente presente na membrana basal, aumentando a

formação de anticorpos, ocasionando uma exacerbação do processo inflamatório e exposição dos

demais componentes da matriz extracelular, dificultando o habitual processo de reparo e

causando lesão tecidual e remodelagem das fibras nas articulações e em outros órgãos

(YOSHINARI, 2002).

54

Foram realizados dois experimentos com este modelo. Cada experimento teve um grupo

tratado com fisalina F e outro grupo placebo. Apenas no segundo experimento utilizamos um

grupo controle tratado com dexametasona, uma droga utilizada para o tratamento desta patologia.

Esta droga é capaz de controlar bem as manifestações da AR, mas muitos indivíduos não

respondem a este tratamento paliativo, além de causar efeitos colaterais graves pelo seu uso

crônico.

Entre 15 e 20 dias após a segunda e última imunização, os camundongos começaram a

apresentar sinais de inflamação em uma ou mais patas. Após observarmos, instalação do processo

inflamatório com rubor e edema, iniciou-se a medida do volume das patas em plestimomêtro. Os

camundongos foram ramdomizados e iniciamos o tratamento com fisalina F 1mg/animal/dia por

v.o. durante 20 dias (COELHO, 2001). Esse modelo experimental não recebeu o tratamento com

fisalina B, por não haver quantidade suficiente desta droga. O processo de purificação ainda não

atingiu escala industrial dificultando a obtenção destas substâncias.

A redução significativa no volume das patas, nas manifestações macroscópias (edema) e

microscópias (redução do infiltrado inflamatório) da inflamação característica da artrite

demonstrou que a fisalina F agiu sobre os efeitos da inflamação. Ação já observada em resultados

anteriores na diminuição de citocinas pró-inflamatórias quando em presença desta molécula

(SOARES, 2003 e SOARES, 2006). O grupo controle tratado com a dexametasona, comprovou

que esta droga inibe as manifestações da patologia, como descrito na literatura. Todavia, em seres

humanos a maior parte dos indivíduos que desenvolvem artrite reumatóide não respondem ao

tratamento com dexametasona (GOODMAN, 2001). A fisalina F demonstrou excelente resultado

na redução e no reparo da inflamação das articulações, demonstrando nos estudos

histopatológicos uma recuperação semelhante a dos camundongos tratados com dexametasona.

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7 CONCLUSÕES

1- As fisalinas B e F apresentaram uma baixa toxicidade quando administradas por via

intraperitoneal (i.p.) em ensaios agudos, realizados em camundongos.

2- Apesar de a fisalina F ter causado uma maior mortalidade, os outros parâmetros de

toxicidade aguda avaliados indicam que as fisalinas B e F possuem toxicidades

semelhantes.

3- Estudos de toxicidade sub-crônica e crônica e investigação do mecanismo de ação são

necessários para o prosseguimento do desenvolvimento das fisalinas como novas drogas.

4- A fisalina F apresentou ação imunomoduladora no modelo de LES, diminuindo os

principais danos renais.

5- A fisalina F também causou diminuição do processo inflamatório causado pela AIC em

camundongos DBA/1.

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