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Dosagem de Citocinas
Karina Carvalho
Detecção de proteínas Intracelular
• Estudo intracelular da atividade enzimática
• Sinal de transdução
• Resposta imunológica - Produção de citocinas
Detecção de proteínas Intracelular
• Estudo intracelular da atividade enzimática
• Sinal de transdução
• Resposta imunológica - Produção de citocinas
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
CD3 CD28
PHA
Con A
PMA LPS
APC
T cell
Super Ag MHC
APC
Tipo celular
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
Protocolo de ativação
• Ativadores policlonais ou estímulos inespecíficos – Forbol esters – Concavalina A – Fitohemaglutinina – LPS – Acs monoclonais anti-CD3
• Peptídeos e/ou estímulos específicos
Protocolo de ativação
• Moléculas co-estimulatórias
– CD28 e CD49d
• Peptídeos e/ou estímulos específicos
CD3 CD28
PHA
Con A
PMA LPS
APC
T cell
Super Ag MHC
APC
Estímulos
• Estímulos policlonais • Específicos: estímulo monoclonal, peptídeo, vírus, bactéria
0 10 2 10 3 10 4 10 5
0 10 2
10 3
10 4
10 5
0.98
6B11 0 10 2 10 3 10 4 10 5
0 10 2
10 3
10 4
10 5
0.98
Vβ11
v
Vα
24
0 10 2 10 3 10 4 10 5
0 10 2
10 3
10 4
10 5
0.93
Dimer+ αGalCer
0 1000 2000 3000 4000 0
1000
2000
3000
4000
21
FSC
v SS
C
0 10 2 10 3 10 4 10 5 0
1000
2000
3000
4000
80
CD3
v
SS
C
Snyder-Cappione e cols., JID 2007
Estratégia de Análise
0 102 103 104 1050
50K
100K
150K
200K
250K
0 102 103 104 105
0
10 2
10 3
10 4
10 5
CD3 Vα24
4.57 60.1
9.725.6
5.65 0.87
0.4393
B Healthy HIV-Infected
IFNγ
Controle HIV infectado
Snyder-Cappione e cols., AIDS 2009
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
Tempo de incubação
• Depende – Citocinas
– Estímulo
– Tipo celular
• Melhor opção – CINÉTICA
cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<PE-
A>: I
L2
2.35
5.42
4.66
87.6
cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<PE-
Cy7
-A>:
IFN
g
1.58
3.84
8.03
86.5
cd4+cd3+IL17_PMA 5.fcsEvent Count: 22234
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<APC
-A>:
TN
Fa
1.03
4.39
11.1
83.5
cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<PE-
A>: I
L2
4.92
11.4
3.57
80.1
cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<PE-
Cy7
-A>:
IFN
g
1.98
11.5
3.86
82.7
cd4+cd3+IL17_PMA 16.fcsEvent Count: 14267
0 102 103 104 105
<FITC-A>: IL17
0
102
103
104
105
<APC
-A>:
TN
Fa
0.95
12.5
5.89
80.7
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
Inibidor do transporte da proteina
• Brefeldina A e Monoensima
• Tempo e dose/dependente para atividade citotóxica
• Cinética
CD3 CD28
PHA
Con A
Ionomycin LPS
APC
T cell
Super Ag MHC
APC
Estímulo
STOP Secreção de citocina
(Brefeldina A ou Monensina)
Acúmulo de citocina intracelular
Monensina Brefeldina A
Brefeldina:IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFNγ e MIP-1β Monoensina: CD107, CD154, IL-10 e TGFβ Brefeldina bloqueia CD69 e CD154
+
Superfície
+
Intracelular
CD3 CD28
PHA
Con A
Ionomycin LPS
APC
T cell
Super Ag MHC
APC
Estímulos
Superfície
Secreção stop (Brefeldina A ou Monensina)
Fixação/Permeabilização Marcação Intracelular
Comercial ou Caseiro
Parâmetros Críticos
• Tipo celular
• Protocolo de ativação
• Tempo de incubação
• Inibidor do transporte da proteína
• Melhor anticorpo
Melhor anticorpo
• Pergunta????????? – Expressão do Anticorpo
• Fluorocromo
• Clone
Control Co-infected
SS
C
0 10 2 10 3
10 4 10 5
0
1000
2000
3000
4000
0.42%
0 10 2 10 3
10 4 10 5
4.25%
IL-‐4
Obrigada!! [email protected]
