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Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Fernandes Figueira
Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher
ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS GENÉTICOS DO FATOR DE
NECROSE TUMORAL E LINFOTOXINA-ALFA E EVOLUÇÃO CLÍNICA
EM PACIENTES PEDIÁTRICOS CRITICAMENTE ENFERMOS SOB
VENTILAÇÃO MECÂNICA
Fernanda de Carvalho Lima
Rio de Janeiro
Abril de 2010
ii
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Fernandes Figueira
Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher
ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS GENÉTICOS DO FATOR DE
NECROSE TUMORAL E LINFOTOXINA-ALFA E EVOLUÇÃO CLÍNICA
EM PACIENTES PEDIÁTRICOS CRITICAMENTE ENFERMOS SOB
VENTILAÇÃO MECÂNICA
Fernanda de Carvalho Lima
Dissertação apresentada à Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
Orientadora: Maria Ignez Capella Gaspar Elsas, M.D., Ph.D.
Co-orientadora: Zina Maria Almeida de Azevedo, M.D., Ph.D.
Rio de Janeiro
Abril de 2010
iii
Agradecimentos
À Dra. Maria Ignez Elsas, pela orientação, por todo o aprendizado e por contribuir
para o meu crescimento profissional e pessoal.
À Dra. Zina Maria de Azevedo, pelos ensinamentos, paciência, compreensão e,
sobretudo, pelo carinho.
À Daniella Moore, pela inesperada colaboração, suporte e apoio, todos imprescindíveis
e absolutamente essenciais para a realização deste trabalho desde o início.
À Cynthia Cardoso, pela inestimável dedicação, atenção e apoio técnico excepcional.
Ao Dr. Pedro Paulo Elsas, pelas orientações e pela exaustiva revisão desta dissertação.
À Renata Bougleux, pela dedicação e contribuição para a padronização das técnicas de
laboratório, processamento e genotipagem das amostras.
À Roberta Tanabe, pelo suporte, orientações, colaboração e amizade, além de
participação ativa na coleta de amostras para esta dissertação.
Aos residentes e plantonistas da UPG, pela ajuda e dedicação à coleta diária de amostras
para o desenvolvimento desta dissertação.
Aos colegas do Laboratório de Fisiopatologia Humana por me receberem tão bem e
participarem direta e indiretamente deste trabalho: Zilton, Ricardo, Anísia, Mônica,
Dani Massid, Renata e Bianca, em especial, ao Túlio, pela sua incrível gentileza.
Aos colegas de trabalho que indiretamente fizeram parte desta dissertação e me
ajudaram em todos os momentos, especialmente aos amigos Fernanda Lobo e Angelo
Leal, que permitiram a minha dedicação quase exclusiva a esta árdua tarefa.
Aos amigos que, mesmo de longe, fizeram parte destes momentos, compartilhando
angústias e dúvidas, sempre me ajudando e incentivando.
À minha família, pelo carinho, paciência e incentivo, apesar de minha ausência.
Ao meu marido, Daniel, pelo carinho, compreensão, apoio e companheirismo.
iv
Lista de Símbolos e Abreviaturas
µL Microlitro
µM Micromolar
A Adenina
ACCP American College of Chest Physicians
ALT Alanina Aminotransferase
C Citosina
CAAE Certificado de Apresentação para Apreciação Ética
CARS Síndrome da Resposta Antiinflamatória Compensatória
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CID-10 Código Internacional de Doenças - 10
CIVD Coagulação Intravascular Disseminada
CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
Curva ROC Receiver-operating characteristic curve
DMOS Disfunção de Múltiplos Órgãos e Sistemas
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DP Desvios-Padrão
v
DPOC Doeça Pulmonar Obstrutiva Crônica
ECG Escala de Coma de Glasgow
EDTA Ácido Etilenodiamino-Tetracético
EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg
EUA Estados Unidos da América
FiO2 Fração Inspiratória de Oxigênio
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
G Guanina
GLM Generalized Linear Model
Modelo Linear Generalizado
h Horas
HCl Ácido Clorídrico
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA ou MHC Antígeno Leucocitário Humano ou
Complexo Principal de Histocompatibilidade
HSP Heat Shock Protein
Proteína de Choque Térmico
IC 95% Intervalos de Confiança 95%
IFF Instituto Fernandes Figueira
vi
IFN-γ Interferon-Gama
IL Interleucina
IL-1ra Antagonistas dos Receptores de Interleucina-1
INR Razão Normalizada Internacional
IOC Instituto Oswaldo Cruz
Kg Quilogramas
L Litros
LIS Lung Injury Score
Escore de Lesão Pulmonar
LPA Lesão Pulmonar Aguda
LPS Lipopolissacarídeo
LRM Logistic Regression Model
Modelo Regressão Logística
LTA ou LT-α ou TNF-β Linfotoxina-Alfa
LTB ou LT-β Linfotoxina-Beta
LT-βR ou LTBR Receptores de Linfotoxina-Beta
LTA Gene responsável pela Linfotoxina-Alfa
MARS Síndrome da Resposta Antiinflamatória Mista
mEq Miliequivalentes
vii
MgCl2 Cloreto de Magnésio
MHC ou HLA Complexo de Histocompatibilidade Principal ou
Antígeno Leucocitário Humano
MIF Fator Inibidor da Migração de Macrófagos
Min Minutos
mL Mililitros
mM Milimolar
mmHg Milimetros de Mercúrio
mRNA Ácido Ribonucleico Mensageiro
NaCl Cloreto de Sódio
NcoI Enzima de Restrição NcoI
NO Óxido Nítrico
OMIN Online Mendelian Inheritance in Man
Base de Dados de Genes Humanos e Fenótipos Genéticos
OMS Organização Mundial de Saúde
OR Odds Ratio
Razão de Chances
oC Graus Celsius
p p-valor
viii
PAF Fator de Ativação Plaquetário
PALS Pediatric Advanced Life Support
Suporte Avançado de Vida Pediátrico
PaO2 Pressão Arterial de Oxigênio
PaCO2 Pressão Arterial de Gás Carbônico
pb Pares de Base
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PCR-RT Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
PCR-RFLP Reação em Cadeia da Polimerase para Polimorfismos de
Comprimento de Fragmentos de Restrição
PIM Pediatric Index of Mortality
Índice de Mortalidade Pediátrica
POP Procedimento Operacional Padrão
PRISM Pediatric Risk of Mortality
Risco de Mortalidade Pediátrica
RFLP Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição
RNApol RNA Polimerase
Rpm Rotações por Minuto
rs Reference SNP
Referência de Polimorfismo de Base Única
ix
SCCM Society of Critical Care Medicine
Sociedade de Medicina Intensiva
SDRA Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
SEB Stain Extraction Buffer
Seg Segundos
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SIRS Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
SNP Single Nucleotide Polymorphisms
Polimorfismos de Base Única
SSLP Simple Sequence Lenght Polymorphism
Polimorfismos de Repetições de Sequências Simples
sTNFR Receptores Solúveis do TNF
STR Short Tandem Repeats
Repetições Curtas em Tandem
SUS Sistema Único de Saúde
T Timina
Taq Thermus aquaticus
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
x
TGF-β Fator Transformador de Crescimento
TLR4 Toll-like Receptor 4
Receptor do Tipo Toll 4
TNF ou TNF-α Fator de Necrose Tumoral
TNF Gene responsável pelo Fator de Necrose Tumoral
TNFB1 Alelo LTA +252 G
TNFB2 Alelo LTA +252 A
TNFR1 Receptor de Fator de Necrose Tumoral 1
TNFR2 Receptor de Fator de Necrose Tumoral 2
U Uracila
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
UPG Unidade de Pacientes Graves / IFF
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UTIP Unidade de Terapia Intensiva Pediátrica
Val Valina
VNTR Variable Number of Tandem Repeats
Número Variado de Repetições em Tandem
χ2 Teste do Qui-Quadrado de Pearson
xi
Lista de Figuras
Figura 1 O Alvéolo na SDRA -------------------------------------------------- página 23
Figura 2 O Sistema HLA -------------------------------------------------------- página 39
Figura 3 Estudos de associação entre o SNP TNF -308 e choque séptico incluídos na metanálise de Teuffel e colaboradores ------------------------------------------- página 44
Figura 4 Interações entre os genes TNF e LTA ------------------------------- página 46
Figura 5 Posição dos SNPs TNF -308 e LTA +252 ou NcoI --------------- página 47
Figura 6 Frequência de disfunções orgânicas nos pacientes --------------- página 78
Figura 7 Frequência das doenças de base dos pacientes -------------------- página 80
Figura 8 Diagnósticos principais à admissão na UPG ---------------------- página 82
Figura 9 Germes isolados durante a internação dos pacientes ------------- página 82
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1 Estudos de associação entre o SNP LTA +252, choque séptico e óbito ------------------------------------------------------------------------------------------------- página 51
Tabela 2 Características demográficas de crianças saudáveis e pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica ------------------------------------------------ página 75
Tabela 3 Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF -308 e LTA +252 de crianças saudáveis e pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica -------------------------------------------------------------------- página 77
Tabela 4 Características clínicas de pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica -------------------------------------------------------------------- página 79
Tabela 5 Característica clínicas de pacientes com insuficiência respiratória aguda, sobreviventes e óbitos em SDRA, internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica --------------------------------------------------------------------------------------------------- página 85
Tabela 6 Característica clínicas de pacientes com e sem choque séptico, sobreviventes e óbitos em choque séptico, internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica --------------------------------------------------------------------------------- página 87
Tabela 7 Característica clínicas de sobreviventes e não-sobreviventes, dentre pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica ----------------------- página 89
Tabela 8 Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF -308 e LTA +252 de pacientes com insuficiência respiratória aguda internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica --------------------------------------------------- página 91
xiii
Tabela 9 Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF -308 e LTA +252 de pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica que evoluíram com e sem choque séptico ------------------------------------------------ página 93
Tabela 10 Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF -308 e LTA +252 de pacientes sobreviventes e não-sobreviventes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica --------------------------------------------------- página 95
xiv
Resumo
A sepse é uma síndrome complexa que resulta da resposta imune do hospedeiro
a uma infecção invasiva, sendo a principal causa de internação em unidades de terapia
intensiva pediátrica, podendo evoluir de forma grave, como choque séptico ou
Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA). Avanços recentes na biologia
molecular e estudos genômicos vêm buscando identificar a correlação entre
polimorfismos genéticos de base única (SNPs) em genes reguladores da resposta
inflamatória sistêmica à sepse. Neste estudo, foram avaliados os SNPs na posição -308
do gene do fator de necrose tumoral (TNF -308 G A) e na posição +252 do gene da
linfotoxina alfa (LTA +252 G A) em relação à gravidade de evolução clínica na sepse,
avaliando os desfechos choque séptico, SDRA e óbito. Foram estudados 424 pacientes
pediátricos criticamente enfermos, admitidos na Unidade de Pacientes Graves (UPG) do
Instituto Fernandes Figueira (IFF/Fiocruz), que necessitaram suporte ventilatório
invasivo e 553 crianças saudáveis, provenientes dos ambulatórios de puericultura e
cirurgia pediátrica do IFF/Fiocruz, com idade entre 1 mês e 17 anos de vida, masculinos
e femininos. Foram coletados dados demográficos e clínicos dos pacientes e crianças
saudáveis e realizada genotipagem, cujos resultados foram comparados através de
regressão logística, sendo ajustadas co-variáveis. A distribuição da frequência de alelos,
genótipos e haplótipos foi similar em ambos os grupos estudados e os SNPs LTA +252 e
TNF -308 não estavam em desequilíbrio de ligação. Foi observada proteção para o
desenvolvimento de SDRA nos pacientes portadores do genótipo TNF -308 GA, com
risco três vezes menor de evoluir com esta síndrome quando expostos a uma infecção.
Não foi observada associação de nenhum dos genótipos e alelos estudados com sepse,
choque séptico ou óbito. Desta forma, o genótipo TNF -308 GA parece se comportar
como protetor para a evolução de SDRA em pacientes pediátricos criticamente
enfermos com sepse.
Palavras-chave: Polimorfismo, Genético; Fatores de Necrose Tumoral;
Linfotoxina-alfa; Sepse; Choque Séptico; Síndrome do Desconforto Respiratório do
Adulto; Unidades de Terapia Intensiva Pediátrica.
xv
Abstract
Sepsis is a complex syndrome that results from the immune response of the host
to an infection and is the leading admission cause in pediatric intensive care units.
Sepsis can be presented in different ways and progress to severe forms, as septic shock
and Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). Recent advances in molecular
biology and genomic studies allowed the identification and correlation between Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs) located in genes that control the systemic
inflammatory response to sepsis. In this study, we evaluated the SNPs in the positions -
308 (G A) of the tumor necrosis factor gene and +252 (G A) of the lymphotoxin-
alpha gene, with respect to the severity of sepsis, evaluating the clinical outcomes septic
shock, ARDS and mortality. We studied 424 critically ill pediatric patients that were
mechanically ventilated and admitted to the intensive care unit of the Fernandes
Figueira Institut (IFF/Fiocruz) and 553 healthy children proceeding from the pediatric
and surgical ambulatories (IFF), with age ranging between 1 month and 17 years old,
males and females. Demographic and clinical data were collected and the molecular
determination of the genotypes was compared through models of logistic regression,
adjusted for confounding variables. The genotypes, alleles and haplotypes frequencies
were similar in both groups and the SNPs LTA +252 e TNF -308 were not in linkage
disequilibrium. It was observed protection for the development of ARDS in carriers of
the genotype TNF -308 GA, with a threefold decreased risk of ARDS development in
septic patients. No association of any genotypes and alleles studied with sepsis, septic
shock or mortality was found. Therefore, the genotype TNF -308 GA seems to behave
as a genetic marker of protection to ARDS development in critically ill pediatric
patients with sepsis.
Key-Words: Polymorphism, Genetic; Tumor Necrosis Factors; Lymphotoxin-alpha;
Sepsis; Shock, Septic; Respiratory Distress Syndrome, Adult; Intensive Care Units,
Pediatric.
xvi
Sumário
Lista de Símbolos e Abreviaturas ----------------------------------------------- Página v
Lista de Figuras ------------------------------------------------------------------- Página xii
Lista de Tabelas ------------------------------------------------------------------- Página xiii
Resumo ----------------------------------------------------------------------------- Página xv
Abstract ----------------------------------------------------------------------------- Página xvi
1. Introdução ---------------------------------------------------------------------- Página 01
2. Quadro Teórico ---------------------------------------------------------------- Página 04
a. Infecção e Sepse em Pediatria -------------------------------------- Página 04
b. Imunofisiopatologia da Sepse --------------------------------------- Página 17
c. Fator de Necrose Tumoral ------------------------------------------- Página 24
d. Linfotoxina-Alfa ------------------------------------------------------ Página 29
e. Biomarcadores em Terapia Intensiva ------------------------------ Página 30
f. Polimorfismo Genético ----------------------------------------------- Página 33
g. Polimorfismos do Fator de Necrose Tumoral - Rosição -308 --- Página 38
h. Polimorfismo da Linfotoxina-alfa - Posição +252---------------- Página 47
3. Hipótese do Estudo ------------------------------------------------------------ Página 53
xvii
4. Objeto de Estudo --------------------------------------------------------------- Página 54
5. Objetivo Geral ------------------------------------------------------------------ Página 55
6. Objetivos Específicos --------------------------------------------------------- Página 56
7. Justificativa --------------------------------------------------------------------- Página 58
8. Metodologia -------------------------------------------------------------------- Página 60
a. Linha de Pesquisa Clínica-------------------------------------------- Página 60
b. Instituições e Setores onde foi realizado o estudo----------------- Página 60
c. Desenho de Estudo ---------------------------------------------------- Página 61
d. População -------------------------------------------------------------- Página 62
e. Classificação de Crianças e Pacientes Incluídos no Estudo ----- Página 63
i. Classificação Demográfica --------------------------------- Página 63
ii. Classificação Clínica dos Pacientes ----------------------- Página 63
f. Análise pelo Comitê de Ética ---------------------------------------- Página 65
g. Coleta e Processamento do Material ------------------------------- Página 66
i. Coleta das Amostras ----------------------------------------- Página 66
1. Grupo de Pacientes ---------------------------------- Página 66
2. Grupo de Crianças Saudáveis -------------------- Página 63
xix
ii. Processamento das Amostras, Extração de DNA e Genotipagem--
------------------------------------------------------------------ Página 67
h. Variáveis Analisadas-------------------------------------------------- Página 68
i. Análise Estatística----------------------------------------------------- Página 70
9. Resultados ---------------------------------------------------------------------- Página 73
Seção 1 – Pacientes e Crianças Saudáveis – Variáveis Demográficas e
Frequências Alélicas, Genotípicas e Haplotípicas ------------------------- Página 73
Seção 2 – Pacientes – Apresentação e Evolução Clínica ----------------- Página 78
Seção 3 – Relação entre SDRA e Marcadores Genéticos ----------------- Página 88
Seção 4 – Relação entre Choque Séptico e Marcadores Genéticos ----- Página 92
Seção 5 – Relação entre Óbito e Marcadores Genéticos ----------------- Página 94
10. Discussão ----------------------------------------------------------------------- Página 96
11. Conclusões -------------------------------------------------------------------- Página 117
12. Perspectivas Futuras --------------------------------------------------------- Página 118
13. Bibliografia -------------------------------------------------------------------- Página 121
14. Anexos ------------------------------------------------------------------------- Página 142
Anexo A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Pacientes -- Página 142
xix
Anexo B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Controles -- Página 144
Anexo C - Folha Diagnóstica SIRS / Sepse ------------------------------ Página 146
Anexo D – Procedimento Operacional Padrão – SNP LTA +252 ----- Página 147
Anexo E – Procedimento Operacional Padrão – SNP TNF -308 ------ Página 153
Anexo F – Tabela com Dados Clínicos dos Pacientes ------------------ Página 161
1
1. Introdução
A terapia intensiva pediátrica tem como um de seus maiores desafios lidar com o
espectro clínico da sepse. A sepse é uma síndrome complexa que resulta da resposta
imune do hospedeiro a uma infecção invasiva. Quando cursa com desarranjo das
funções orgânicas fisiológicas é considerada grave e se há prejuízo na perfusão tecidual,
denomina-se choque séptico. A sepse grave e o choque séptico são indicações comuns
de admissão em unidades de terapia intensiva e algumas das principais causas de
morbidade e mortalidade em pacientes criticamente enfermos (Salluh et al., 2008).
Diferentemente da população adulta, as crianças apresentam poucas comorbidades e
doenças crônicas, de forma que a principal causa de internação em unidades de terapia
intensiva pediátrica é a infecção descontrolada, que pode evoluir para sepse grave e
choque séptico.
Apesar dos recentes progressos nos cuidados intensivos, a sepse grave ainda é
associada a altas taxas de mortalidade, disfunção respiratória e neuromuscular nos
sobreviventes. A dificuldade em sua abordagem relaciona-se a alguns fatores, tais como
variabilidade individual, complexidade da resposta imune, conhecimento insuficiente a
respeito dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na sepse e ausência de
biomarcadores bem estabelecidos.
A identificação de biomarcadores na sepse é de extrema importância, tendo em
vista que existe correlação direta entre o prognóstico de uma criança com infecção
grave e o tempo decorrido entre o início do quadro e o momento de instituição
terapêutica. Portanto, a necessidade do diagnóstico correto e precoce de sepse, assim
2
como a identificação dos pacientes em risco de evolução desfavorável é crucial (Salluh
et al., 2008).
Avanços recentes na biologia molecular enfatizando genômica vêm permitindo
uma compreensão mais profunda dos processos orgânicos relevantes para a Terapia
Intensiva Pediátrica, tais como sepse, choque séptico, Síndrome do Desconforto
Respiratório Agudo (SDRA) e Síndrome de Disfunção de Múltiplos Órgãos (DMOS).
Com o sequenciamento do genoma humano e o reconhecimento do grau de variação
genética que existe na população, ficou claro que a carga genética de um indivíduo tem
impacto na apresentação da doença, tratamento e evolução clínica (Dahmer et al.,
2005). Este conhecimento estimulou estudos buscando identificar a correlação entre
genes polimórficos de citocinas inflamatórias e sepse.
Alguns polimorfismos de base única de genes reguladores da resposta
inflamatória vêm sendo associados com evolução grave e mortalidade na sepse e choque
séptico em adultos e crianças. Sua genotipagem permite acesso a uma classe de
biomarcadores que, se efetivamente validados, podem ser conhecidos precocemente e
contribuir para o emprego mais racional de alguns recursos terapêuticos que possam
inibir ou estimular a resposta do hospedeiro à infecção e até mesmo antecipar a
necessidade de cuidados intensivos, funcionando como marcadores prognósticos de
evolução desfavorável (Lin Z et al., 2000).
Neste estudo, foi realizada a genotipagem de polimorfismos de base única
relacionados à posição -308 do Fator de Necrose Tumoral (TNF) e à posição +252 da
Linfotoxina-alfa (LTA) em pacientes pediátricos criticamente enfermos submetidos à
ventilação mecânica. Os dados obtidos com a genotipagem foram correlacionados com
3
características demográficas e clínicas, além dos desfechos choque séptico, Síndrome do
Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) e óbito, buscando a identificação de
biomarcadores. Esta genotipagem também foi realizada em um grupo de crianças
saudáveis para conhecimento da freqüência de tais genótipos e alelos em uma população
similar aos pacientes.
4
2. Quadro Teórico
a) Infecção e Sepse em Pediatria
A sepse é a principal causa de óbito em lactentes e crianças, com mais de 42.000
casos de sepse grave anualmente nos Estados Unidos (EUA), chegando a milhões em
todo o mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as quatro doenças
principalmente relacionadas à mortalidade infantil em todo o mundo são: pneumonia
grave (1,9 milhões por ano), diarréia grave (1,6 milhões por ano), malária grave (1,1
milhões de óbitos ao ano) e sarampo grave (550.000 óbitos ao ano), sendo o termo
grave utilizado quando a criança desenvolve acidose ou hipotensão (Watson e Carcillo,
2005).
A incidência de sepse grave em adultos é comparável em diferentes países
(Linde-Zwirble et al., 2004; Annane et al., 2003; Schuerholz e Marx, 2008) e as taxas
de mortalidade associadas à sepse grave e ao choque séptico variam de 25-30% e 40-
70%, respectivamente (Russel JA, 2006). No Brasil, o único estudo publicado (estudo
BASES) mostrou taxa de mortalidade geral em 28-dias foi de 21,8%, porém, em
pacientes com sepse grave e choque séptico, esta taxa aumentou para 47,3% e 52,2%,
respectivamente. Para pacientes brasileiros com SIRS sem infecção, a taxa de
mortalidade foi de 11,3% (Silva et al., 2004).
O comportamento da sepse em crianças mostra uma evolução diferente. Dentre
as crianças diagnosticadas com sepse, 5 a 30% desenvolverão choque séptico. Inúmeros
5
estudos conduzidos em outros países nas décadas de 80 e 90 reportaram taxas de
mortalidade acima de 50% em crianças com choque séptico, entretanto, investigações
mais recentes reportaram mortalidade de aproximadamente 20% em crianças com
choque séptico (Kutko et al., 2003). Houve 4.400 óbitos associados à sepse grave
pediátrica nos EUA em 1995 e a mortalidade hospitalar foi de 10,3%, sendo 7,8% em
crianças previamente saudáveis e 12,8% em crianças com doença de base (Watson e
Carcillo, 2005).
Análises de dados anteriores a 1999 demonstraram que as taxas de sepse grave
estavam aumentando, enquanto a mortalidade hospitalar diminuía. O aumento na
incidência de sepse grave pareceu dever-se ao aumento na viabilidade de prematuros de
extremo baixo peso ao nascer nos EUA e à elevada taxa de sepse neste grupo. Embora a
taxa de mortalidade hospitalar não tenha mudado entre crianças saudáveis, diminuiu em
quase 9% em crianças portadoras de doença crônica (Watson e Carcillo, 2005), o que
pode refletir uma melhora no tratamento destas outras doenças e não necessariamente da
sepse.
Não há dados epidemiológicos atuais publicados a respeito da demanda e do
perfil de internação em unidades de terapia intensiva pediátrica no Brasil. No entanto,
os dados brasileiros em relação à mortalidade corroboram os dados internacionais,
sendo a mortalidade em crianças com choque séptico ainda muito alta, alcançando taxas
de até 40 - 60% em alguns estados do Brasil (Gama et al., 2007). Tanto nos países
industrializados, quanto nos em desenvolvimento, o choque continua sendo o mais
importante fator de risco para mortalidade em crianças sépticas (Watson e Carcillo,
2005).
6
A resposta inflamatória sistêmica secundária à infecção não controlada pode
manifestar-se em uma cascata de gravidade progressiva, que se inicia com SIRS. Esta
resposta inflamatória sistêmica pode ser secundária a qualquer agressão clínica, seja ela
infecção, trauma, pancreatite, queimadura, choque hemorrágico ou isquemia (Bone et
al., 1989).
Em 1989, Bone e colaboradores descreveram a “síndrome séptica”, para
descrever pacientes que apresentavam evidências de resposta sistêmica a uma infecção,
tais como temperatura elevada, taquicardia, taquipnéia, contagem anormal de leucócitos
e evidência de disfunção orgânica. Tais definições foram aperfeiçoadas em 1992, sendo
publicado um consenso para utilização em adultos criticamente enfermos, contendo as
definições de SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico (ACCP- American College of
Chest Physicians/SCCM - Society of Critical Care Medicine Consensus Conference,
1992), o qual foi revisado em 2003 (Levy et al., 2003). Estas definições eram
específicas para a população adulta e incluíam valores de frequência cardíaca,
frequência respiratória e pressão sistólica, não podendo ser imediatamente utilizadas
para a população pediátrica (Brilli et al., 2005).
Na tentativa de adaptar tais definições para pediatria, modificações foram
propostas por diferentes autores, incluindo os valores esperados de sinais vitais
conforme as diferentes faixas etárias para a população pediátrica. Enquanto alguns
autores definiram critérios para admissão em ensaios clínicos próprios ao estudo que
estava sendo conduzido, outros modificaram e adaptaram as definições de Bone para
crianças (Hayden et al., 1994; Saez-Llorens et al., 1993; Brilli et al., 2005). Em 2002,
foram publicados os guidelines da ACCM/PALS (Pediatric Advanced Life Support) de
2002, que definiam diferentes tipos de choque conforme a terapêutica instituída, como
7
choque responsivo a líquido e choque refratário a aminas. Tais critérios objetivavam o
reconhecimento precoce do choque e melhora na sobrevida das crianças atendidas nos
serviços de emergência pediátrica (Carcillo et al., 2002).
Entretanto, a utilização inconsistente de critérios de definição de sepse
contribuía para gerar confusão, variabilidade e resultados conflitantes na literatura
(Angus et al., 2001). Portanto, em face da necessidade de uniformizar as definições de
sepse em pediatria, realizou-se uma conferência internacional em 2002, cujos resultados
foram publicados em 2005, em um artigo contendo definições de SIRS, sepse, sepse
grave, choque séptico e disfunções orgânicas que contemplavam as diferentes faixas
etárias (Goldstein et al., 2005). Desde então, esta definição é a mais amplamente
utilizada em ensaios clínicos que incluem pacientes pediátricos sépticos.
Clinicamente, denomina-se SIRS quando há a presença de pelo menos dois dos
seguintes critérios: 1) hiper- ou hipotermia (temperatura central >38,5ºC ou < 36ºC); 2)
taqui- ou bradicardia, conforme média padrão previamente estabelecida para as
diferentes faixas etárias pediátricas; 3) taquipnéia ou necessidade de ventilação
mecânica não relacionados à doença neuromuscular ou anestesia geral; e 4) leucocitose
ou leucopenia, também de acordo com a faixa etária (Goldstein et al., 2005).
É necessária a aferição de temperatura central, ou seja, retal, vesical, oral ou
medida através de cateteres centrais, já que temperaturas timpânicas, axilares ou
cutâneas não são suficientemente acuradas. A presença do critério de temperatura ou
contagem de leucócitos é obrigatória, já que taquicardia e taquipnéia são sinais comuns
presentes em muitas doenças pediátricas, sendo esta uma das principais diferenças entre
os critérios definidos por Goldstein para crianças e os critérios de Bone para adultos.
8
Ainda, o critério pediátrico definiu valores limítrofes para cada sinal e sintoma
conforme a faixa pediátrica, incluindo bradicardia como sinal de SIRS em lactentes
(Goldstein et al., 2005).
Quando a SIRS é secundária a uma infecção, ou seja, presença de um
microorganismo e seus produtos ou invasão de um tecido previamente estéril por
microorganismos, passa a se chamar sepse. No consenso pediátrico de 2002, não é
necessário o isolamento de germe por cultura, histopatologia ou teste da reação em
cadeia da polimerase para o diagnóstico de infecção. Achados positivos em exames
clínicos, radiológicos ou testes laboratoriais suspeitos de infecção podem ser definidos
como tal. Assim, o diagnóstico de sepse é feito quando há SIRS na presença de infecção
suspeita ou comprovada (Goldstein et al., 2005).
Quando a sepse está associada à disfunção orgânica, isto é, disfunção
cardiovascular, respiratória, renal, hepatológica, hematológica ou neurológica, é
chamada sepse grave. A sepse grave tem progressão mais lenta, entre 7-14 dias,
apresentando taxa de mortalidade de 30-70%, dependendo da disfunção orgânica
concomitante (Ulloa e Tracey, 2005). Segundo Goldstein, denomina-se sepse grave a
associação de sepse com SDRA ou sepse na presença de duas outras disfunções
orgânicas, a seguir:
• Disfunção Neurológica Escala de Coma de Glasgow (ECG) menor que 11 ou
diminuição do nível de consciência com queda na ECG em três pontos do valor
basal.
9
• Disfunção Hematológica plaquetopenia menor que 80.000 ou declínio de
50% no maior valor dos últimos três dias para pacientes onco-hematológicos
crônicos, ou presença de INR (Razão Normalizada Internacional) maior que 2.
• Disfunção Renal aumento na creatinina sérica acima de 2 ou acima do dobro
do valor à admissão.
• Disfunção Hepática aumento de bilirrubina acima de 4 (exceto em recém-
natos) ou ALT (Alanina Aminotransferase) acima de duas vezes o valor para
idade.
• Disfunção Respiratória relação PaO2 (pressão arterial de oxigênio) / FiO2
(fração inspirada de oxigênio) abaixo de 300mmHg na ausência de doença
pulmonar crônica ou doença cardíaca cianótica preexistente; aumento na PaCO2
(pressão arterial de gás carbônico) acima de 65 ou 20mmHg acima do valor
basal; necessidade de FiO2 acima de 50% para manter saturação maior que 92%
e necessidade de ventilação mecânica invasiva ou não-invasiva desde que não-
eletiva.
• Disfunção Cardiovascular diagnosticada apenas se a criança mantém sinais de
hipoperfusão orgânica após administração de expansão volêmica acima de
40mL/kg em 1 hora. São sinais de hipoperfusão: diminuição da pressão arterial
abaixo do percentil 5 para idade (hipotensão) ou queda da pressão sistólica
abaixo de 2DP (desvios-padrão) do normal para a idade; necessidade de drogas
vasoativas para manter a pressão; ou dois dos seguintes – acidose metabólica
(excesso de base>5,0mEq/L), lactato arterial acima de duas vezes o valor limite,
oligúria (débito urinário < 0,5mL/kg/h), enchimento capilar periférico
10
prolongado (acima de 5 seg) e diferença entre as temperaturas periférica e
central maior que 3oC (Goldstein et al., 2005).
Quando há acometimento do sistema cardiovascular, apesar de adequada
ressuscitação volêmica, denomina-se choque séptico (Goldstein et al., 2005). Portanto, a
principal diferença entre adultos e crianças é a ausência da necessidade de hipotensão
para o diagnóstico de choque séptico, já que as crianças podem se encontrar claramente
em estado de choque sem a presença de hipotensão arterial sistêmica. Assim, uma vez
caracterizada disfunção cardiovascular na presença de sepse, faz-se o diagnóstico de
choque séptico em crianças.
O choque séptico é uma síndrome altamente letal, que pode culminar em óbito
em 24-48h após seu início e é invariavelmente acompanhado por disfunção
cardiovascular. Em casos de choque séptico em que o estado de choque não é revertido,
há progressão para DMOS, comprometendo muito o prognóstico do paciente.
Após estabelecimento de disfunção orgânica, a taxa de mortalidade de pacientes
pediátricos passa a ser de 54%, sendo esta taxa diretamente relacionada ao número de
órgãos em disfunção (Wilkinson et al., 1986). Outros estudos reportaram taxas de
mortalidade de 46% em disfunção orgânica e sepse e 52% em disfunção orgânica
associada a choque séptico (Wilkinson et al., 1987; Proulx et al., 1996). Estudo mais
recente demonstrou diferença significativa na taxa de mortalidade entre pacientes com e
sem DMOS, sendo 18,6% e 0%, respectivamente (Kutko et al., 2003).
O comprometimento respiratório também aumenta em muito a morbidade de
pacientes pediátricos. A disfunção respiratória que apresenta insuficiência respiratória
por hipoxemia com relação PaO2/FiO2 abaixo de 300mmHg é denominada Lesão
11
Pulmonar Aguda (LPA). Estudo americano recente avaliando pacientes de 1996 a 2005
demonstrou que a mortalidade relacionada à LPA diminuiu ao longo do tempo, de 35%
para 26%, entre 2004 e 2005 (Erickson et al., 2009).
Caso o desconforto respiratório seja de instalação insidiosa e progressiva; haja
aparecimento de infiltrado pulmonar difuso na radiografia de tórax, na ausência de
edema pulmonar de origem cardiogênica; além de hipoxemia progressiva, grave e
refratária à administração suplementar de oxigênio, com relação PaO2/FiO2 abaixo de
200; se estabelece o diagnóstico de SDRA - Síndrome do Desconforto Respiratório
Agudo (Piva e Celiny, 2005).
A SDRA é uma síndrome clínica comum que afeta pacientes clínicos e
cirúrgicos, primeiramente descrita em 1967, em pacientes com desconforto respiratório,
cianose refratária à oxigenioterapia, diminuição da complacência pulmonar e infiltrados
difusos à radiografia de tórax. Estudos iniciais sugeriram que a incidência de SDRA nos
EUA era de 75 para cada 100.000 habitantes. Estudos mais recentes reportaram baixas
incidências de 1,5 a 8,3 por 100.000. Na Escandinávia, a incidência de LPA foi de 17,9
por 100.000 e a de SDRA de 13,5 por 100.000 (Ware e Matthay, 2000).
A LPA e a SDRA ocorrem com menos frequência nas crianças que nos adultos,
sendo a incidência de LPA 2,2 a 12 por 100.000, com mortalidade de 20% em crianças.
Dos pacientes pediátricos que necessitam suporte ventilatório invasivo, 8 a 10%
evoluem com SDRA, tendo mortalidade estimada entre 20 e 75% (Flori et al., 2004).
Pode-se estimar que a cada ano entre 2.500 a 9.000 crianças terão LPA, contribuindo
para 500 a 2.000 óbitos. A mortalidade em crianças com LPA/SDRA variou entre 8 a
27,5% no últimos ensaios clínicos americanos publicados (Randolph et al., 2009). Na
12
Alemanha, estudo em crianças demonstrou prevalência de 5,5 por 100.000 e incidência
de 3,2 por 100.000 casos por ano em crianças entre um mês de vida e dezoito anos de
idade (Bindl et al., 2005). Já estudo multicêntrico chinês publicado recentemente,
realizado em crianças de um mês a quatorze anos de idade, demonstrou que 1,44% das
crianças admitidas em UTIPs desenvolveram SDRA, com taxa de mortalidade elevada
(61%), contabilizando 13,2% dos óbitos nas UTIPs, aumentando em nove vezes o risco
de óbito. Neste estudo, pneumonia (55,2%) e sepse (22,9%) foram os principais fatores
predisponentes para o desenvolvimento de SDRA e 63% dos casos se estabeleceram em
menos de 24h após a admissão (Yu et al., 2009).
Os fatores de risco para o desenvolvimento da SDRA em adultos e crianças são
similares, sendo os principais mecanismos desencadeadores, a pneumonia, a
broncoaspiração e a sepse. Lesões diretas ou indiretas à vasculatura pulmonar e epitélio
alveolar iniciam um processo que se manifesta clinicamente como deficiência aguda na
oxigenação e infiltrados bilaterais na radiografia torácica (Flori et al., 2006).
A SDRA é normalmente progressiva, caracterizada por fases distintas com
manifestações clínicas, histopatológicas e radiológicas diversas. A fase aguda, ou
exsudativa, é manifestada pelo início rápido de insuficiência respiratória em um
paciente com fator de risco para esta condição. Hipoxemia arterial refratária ao
tratamento com oxigênio suplementar é característica. Radiograficamente, os achados
são indistinguíveis daqueles encontrados no edema pulmonar cardiogênico. Infiltrados
pulmonares bilaterais podem ser irregulares e assimétricos, podendo incluir infusões
pleurais. Tomografia computadorizada demonstra edema alveolar, consolidações e
atelectasias ocorrendo principalmente nas zonas pulmonares dependentes, enquanto
outras áreas pulmonares são poupadas. No entanto, mesmo nas áreas tomograficamente
13
livres, lavados bronco-alveolares encontram inflamação substancial. Achados
patológicos incluem dano alveolar difuso, com neutrófilos, macrófagos, eritrócitos,
membranas hialinas e fluido hiper-proteico dentro dos espaços alveolares, além de lesão
capilar e rompimento de seu epitélio (Ware e Matthay, 2000).
Em alguns pacientes, a LPA e a SDRA não se resolvem na fase aguda, podendo
progredir para alveolite fibrosante com hipoxemia persistente, aumento do espaço morto
alveolar e diminuição ainda maior da complacência pulmonar. Hipertensão pulmonar
secundária à obliteração do leito capilar pulmonar pode ser grave e culminar em
insuficiência ventricular direita. Nesta fase, radiografias torácicas demonstram
opacidades lineares, consistentes com a presença de fibrose e tomografias demonstram
opacidades intersticiais difusas.
A fase de recuperação é caracterizada por resolução da hipoxemia, melhora da
complacência pulmonar, normalização dos achados radiológicos e restauração da função
pulmonar, na maioria dos casos (Ware e Matthay, 2000).
Uma das primeiras e mais importantes definições de SDRA foi desenvolvida por
Murray em 1988, denominada LIS (Lung Injury Score – Escore de Lesão Pulmonar).
Esta definição foi proposta para quantificar o dano respiratório através da avaliação de
quatro parâmetros: nível de pressão expiratória final positiva utilizado, relação PaO2 /
FiO2, complacência pulmonar estática e grau de infiltrado pulmonar evidente na
radiografia pulmonar. Embora tenha sido amplamente utilizado, o escore LIS não pode
ser utilizado para predizer desfecho nas primeiras 24-72h após o início da SDRA, tendo
uso clínico limitado (Murray et al., 1988).
14
Em 1994, uma nova definição foi recomendada por Bernard et al. que
reconhecia a variedade da gravidade da lesão pulmonar. Pacientes com hipoxemia
menos grave (PaO2/FiO2 < 300) são denominados portadores de Lesão Pumonar Aguda
(LPA), enquanto aqueles com hipoxemia grave (PaO2/FiO2 < 200) são denominados
portadores de SDRA. Esta nova definição, mais ampla e simples, permite o
reconhecimento precoce de pacientes com lesão pulmonar aguda e pode facilitar a
identificação e introdução de pacientes em ensaios clínicos (Bernard et al., 1994). Em
crianças, os critérios de Murray e de Bernard são também utilizados, não sendo
necessárias adaptações para as diferentes faixas etárias.
A SDRA não é, portanto, uma doença única ou isolada, mas o final comum para
diversas agressões que podem lesar o pulmão, tendo como causa uma agressão local
(pulmonar) ou sistêmica (extra-pulmonar), o que gera lesão alvéolo-capilar terminal e
resulta em grave hipoxemia e infiltrado pulmonar difuso ou edema pulmonar não-
cardiogênico.
Devido às inúmeras possibilidades de evolução desfavorável em um paciente
com infecção, a definição do prognóstico de diversas doenças e tratamentos é parte
importante de seu cuidado. A utilização de marcadores prognósticos que estratifiquem
gravidade e possam identificar um grupo de pacientes de maior gravidade, que se
beneficiem de determinadas terapêuticas específicas, é importante para avaliar a
qualidade do atendimento prestado, comparando-o com o de outras unidades, ou uma
mesma unidade ao longo do tempo, além de melhor orientar a alocação de recursos
disponíveis (Slater et al., 2003).
15
Os escores de gravidade, também chamados de escores prognósticos, são escalas
numéricas constituídas por um grupo de variáveis, que servem para caracterizar a
gravidade dos pacientes de maneira uniforme e objetiva, podendo ser utilizados para
avaliar a performance do cuidado intensivo (Gemke et al., 2002). Os modelos de escore
prognósticos construídos para UTI foram desenvolvidos a partir da identificação de
variáveis relevantes para o risco de morte após uma análise estatística multivariada de
regressão logística. Assim, avaliam o risco da mortalidade, comparando a porcentagem
da mortalidade estimada com a mortalidade realmente observada e são utilizados para
predizer o desfecho em pacientes dentro de uma UTI (Lacroix et al., 2005).
Tais escores não podem ser utilizados como instrumentos para definição de
conduta clínica para cada paciente isoladamente, mas podem ajudar a equipe que assiste
os pacientes na discussão dos prognósticos e de decisões clínicas para melhorar a
alocação de recursos dentro da terapia intensiva (Soares et al., 2004). Ao definir a
gravidade do paciente no momento de entrada na unidade, além de estimar sua
mortalidade, os escores prognósticos também podem servir para classificar os pacientes,
uniformizar as informações, favorecendo a entrada em estudos clínicos e também
propiciando a comparação entre diferentes unidades (Slonim et al., 2006).
O escore Pediatric Risk of Mortality (PRISM) I (Anexo 5), publicado em 1988
por Pollack et al. e amplamente utilizado em unidades de terapia intensiva pediátricas na
última década, foi validado por muitos estudos, sendo apontado como útil e confiável
(Lacroix et al., 2005). Por isso, é ainda o índice mais amplamente conhecido e utilizado
nas UTIP, sendo aplicado em estudos clínicos para avaliação de gravidade de doença
em pacientes pediátricos. O PRISM avalia variáveis clínicas e laboratoriais dos
pacientes nas primeiras 24 horas de sua admissão, devendo ser utilizados os piores
16
valores encontrados neste período. A partir de variáveis como pressão arterial,
freqüência cardíaca e respiratória, reação pupilar, escala de Glasgow, relação
PaO2/FiO2, PaCO2, coagulograma, bilirrubina total, cálcio, potássio, glicemia,
bicarbonato, que são ponderadas após a análise multivariada de regressão logística,
chega-se a um resultado percentual, que codifica o risco de morte de zero a cem por
cento (Gunning et al., 1999).
Já o escore Pediatric Index of Mortality (PIM) foi desenvolvido em 1996 na
Austrália (Shann et al., 1997), com o objetivo de obter um escore mais prático, ou seja,
com um menor número de variáveis e de mais fácil coleta. Pretendia-se também
diminuir o viés de interpretação da qualidade dos cuidados dos resultados, já que os
dados deveriam ser coletados na primeira hora de internação, momento em que a
terapêutica dentro da UTI se inicia (Shann et al., 1997). O PIM 2 (Anexo 6) foi
publicado em 2003 pelo PIM Study Group e é uma versão revisada do PIM que,
comparada à versão original, seria mais bem calibrada, mais segura e com melhor ajuste
em diferentes grupos diagnósticos. É calculado a partir do valor de cada variável desde
o momento do primeiro contato médico-paciente até a primeira hora de chegada à UTI,
tendo como vantagem principal a utilização de poucas variáveis (Slater et al. 2003).
Entretanto, os parâmetros clínicos e laboratoriais incluídos nos escores
pediátricos de avaliação atualmente utilizados podem ser insuficientes para a predição
do prognóstico de pacientes graves. Frente a uma mesma agressão, pacientes pediátricos
apresentam evoluções e desfechos completamente diferentes, portanto a enorme
variabilidade individual tem sido um desafio na terapia intensiva pediátrica. A
construção de ferramentas que auxiliem a identificação de crianças com potencial para
pior desfecho antes que o mesmo ocorra, além de definir as que se beneficiariam da
17
utilização de determinado tratamento, pode ser extremamente importante para o avanço
nos cuidados intensivos em pediatria. Desta forma, muitos estudos vêm se concentrando
na identificação de biomarcadores.
b) Imunofisiopatologia da Sepse
A resposta inflamatória é caracterizada pelo reconhecimento do local de lesão por
células inflamatórias, recrutamento específico de subpopulações de leucócitos para o
tecido, destruição ou contenção do agente invasor, eliminação de restos celulares e
reparo do sítio de lesão com o intuito de reestabelecer a relação normal entre as matrizes
extracelulares, parênquima e estroma (Keane et al., 2000).
As citocinas liberadas produzem três principais efeitos: a) primeiramente, induzem à
produção de proteínas de fase aguda pelo fígado, que podem entre outras coisas
potencializar a ação microbicida do sistema complemento; b) em segundo lugar, podem
induzir febre, contribuindo para restringir a multiplicação dos microorganismos,
reduzindo ao mesmo tempo a atividade espontânea do hospedeiro, levando às mudanças
comportamentais que configuram “sickness syndrome” (letargia, anorexia, sonolência e
dificuldade de concentração); c) as citocinas podem, ainda, induzir à inflamação local,
alterando as propriedades de superfície e a permeabilidade dos vasos sanguíneos,
recrutando fagócitos e linfócitos do endotélio para o sítio de infecção (Oberholzer et al.,
2001).
18
As citocinas produzidas por macrófagos e neutrófilos têm efeitos longos e
contribuem para a defesa do hospedeiro. A elevação da temperatura corporal, por
exemplo, é causada por TNF, IL-1, IL-6 e outras citocinas (Ward et al., 2008). Além
disso, IL-1, IL-6 e TNF induzem os hepatócitos a produzir proteínas de fase aguda. A
proteína C-reativa se liga a alguns lipopolissacarídeos da parede de certas bactérias e
fungos, servindo como opsonina e ativando a cascata de complemento. A presença
destas citocinas também acarreta outras manifestações clínicas da infecção, tais como
extravasamento capilar, vasodilatação e a expressão hepática de heat shock proteins
(HSP) (Ward et al., 2008).
A indução vigorosa do sistema imune inato pode gerar efeitos catastróficos no
paciente com síndrome séptica. Produção exagerada de citocinas pró-inflamatórias e
indução de mediadores mais distais como NO, PAF e prostaglandinas foram implicadas
nas mudanças endoteliais e indução de estado pró-coagulatório, assim como em
hipotensão, prejuízo da perfusão orgânica e morte celular necrótica associada à
Síndrome de Disfunção Orgânica Múltipla (DMOS) (Oberholzer et al., 2001).
Desta forma, o termo SIRS, ou Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica, é
associado com a ativação do sistema imune inato e cascata pró-inflamatória vista
durante a síndrome séptica (Oberholzer et al., 2001). As citocinas pró-inflamatórias e os
mediadores humorais responsáveis pela indução da resposta imune inata e SIRS
também contribuem para o desenvolvimento de efeitos imunes específicos. Em seguida,
o paciente frequentemente entra em um estado imunológico caracterizado por
hiporresponsividade de células-T, anergia e disfunção na apresentação de antígenos,
chamado CARS ou Síndrome da Resposta Antiinflamatória Compensatória (Oberholzer
et al., 2001).
19
A SIRS foi um modelo de inflamação persistente e não-controlada proposto por
Bone e colaboradores para explicar a patogênese da sepse (1996). Acreditava-se que em
resposta a um evento agressivo, como infecção, hemorragia ou trauma, a partir de uma
certa gravidade, o organismo desencadeava uma reação inflamatória capaz de se
amplificar indefinidamente, resultando em um estado séptico que frequentemente
produzia choque séptico, disfunção orgânica múltipla e morte (Bone et al., 1996).
Após o fracasso da utilização de agentes bloqueadores da inflamação em
pacientes sépticos, Bone e colaboradores descreveram a CARS em 1996 com o objetivo
de ajudar a elucidar a imunodepressão cada vez mais descrita na sepse (Ward et al.,
2008). A CARS apresenta um padrão complexo e ainda não claramente definido de
respostas imunológicas à infecção grave.
A principal diferença entre as duas síndromes é: enquanto a SIRS é uma reação
pró-inflamatória, cuja principal função é a destruição de agentes infecciosos através da
ativação do sistema imune, a CARS é uma reação antiinflamatória compensatória, tendo
como principal função a tentativa de restauração da homeostase a partir de um estado
inflamatório (Netea et al., 2003). No entanto, CARS não é simplesmente a
descontinuação da SIRS, podendo as duas existirem concomitantemente ou
separadamente. Os padrões de secreção de citocinas e de respostas celulares são
distintos entre estes estados e podem ter fortes influências nos desfechos clínicos da
sepse (Ward et al., 2008).
O termo CARS usualmente reflete a imunossupressão causada por um insulto
principal, como sepse, queimaduras ou lesão tecidual. Ela reverte muitas das
manifestações do processo inflamatório, sendo caracterizada por alterações clínicas,
20
como diminuição da resposta de hiperssensibilidade tardia, hipotermia, leucopenia,
maior susceptibilidade à infecção e incapacidade de eliminá-la, uma vez estabelecida
(Ward et al., 2008).
A resposta antiinflamatória inclui os seguintes mediadores: IL-4, IL-10, IL-11,
IL-13, TGF-β (Fator transformador de crescimento), receptores solúveis do TNF
(sTNFR) e antagonistas dos receptores de IL-1 (IL-1ra). Tais mediadores têm efeito
importante na função dos monócitos/macrófagos e especialmente no que se refere a sua
atividade de apresentação dos antígenos, além de inibirem as atividades de linfócitos T e
B, incluindo a proliferação de linfócitos T específicos para um antígeno. O resultado é
uma imunossupressão que, algumas vezes, pode ser profunda (Bone et al., 1996).
Pacientes que manifestam um padrão mais heterogêneo de resposta inflamatória
foram denominados portadores de Síndrome da Resposta Anti-Inflamatória Mista, ou
MARS (Oberholzer et al., 2001).
Apesar de alguns autores postularem o padrão multimodal da resposta
inflamatória sistêmica: SIRS inicial, fase intermediária com MARS e CARS no estágio
final, outros discordaram desta definição. Osuchowski e colaboradores estudaram a
evolução da resposta inflamatória sistêmica precoce em modelo murino através da
coleta repetitiva de sangue e dosagem de mediadores inflamatórios. Eles observaram
que ocorreram elevações simultâneas tanto nos mediadores pró- quanto nos
antiinflamatórios, sendo ambos correlacionados com mortalidade em 48h. Estes dados
não sustentam a transição simples entre SIRS e CARS proposta no modelo anterior e
questionam a utilização da simples dosagem de uma citocina pró-inflamatória como
21
biomarcador e classificador do estado inflamatório durante a sepse (Osuchowski et al.,
2006).
O choque séptico é a mais grave consequência patológica induzida por citocinas
após infecção bacteriana. É uma síndrome caracterizada por colapso circulatório,
distúrbios metabólicos e coagulação intravascular disseminada. TNF e IL-1 são os
principais mediadores do choque séptico, embora, INF-γ, IL-12 e IL-18 provavelmente
contribuam significativamente. De fato, níveis séricos de TNF foram preditores de
desfecho grave em alguns estudos sobre infecção bacteriana por gram-negativos
(Oberholzer et al., 2001). No entanto, não apenas citocinas pró-inflamatórias foram
correlacionadas com desfecho grave, mas também mediadores antiinflamatórios, como
IL-10, foram correlacionados com a gravidade de pacientes politraumatizados e risco
aumentado de desenvolver complicações como SDRA e sepse (Oberholzer et al., 2001).
As vias de sinalização alteradas na sepse culminam na lesão tecidual e disfunção
orgânica. A disfunção cardiovascular é caracterizada por choque circulatório e
redistribuição de fluxo sanguíneo, com resistência vascular diminuída, hipovolemia e
diminuição da contratilidade miocárdica associada com níveis aumentados de NO, TNF,
IL-6 e outros mediadores. A disfunção renal pode ser muito grave, contribuindo para a
morbidade e mortalidade da sepse (Russel et al., 2006).
A disfunção respiratória é caracterizada por aumento da permeabilidade
vascular, gerando lesão pulmonar aguda. No pulmão, a barreira alvéolo-capilar é
formada por duas diferentes camadas: o endotélio microvascular e o epitélio alveolar. A
fase aguda da lesão pulmonar aguda (LPA) e da SDRA é caracterizada pelo influxo de
fluidos proteicos para dentro dos alvéolos como consequência de um aumento na
22
permeabilidade da barreira alveolo-capilar. A perda da integridade capilar e lesão dos
pneumócitos tipo II desorganizam o transporte de fluidos epiteliais, prejudicando a
remoção de líquido do espaço alveolar, além de diminuir a produção de surfactante, o
que pode finalmente culminar em fibrose, secundária ao reparo epitelial ineficaz (Ware
e Matthay, 2000).
Estudos clínicos e experimentais demonstraram a ocorrência de lesão mediada
por neutrófilos na LPA e SDRA. Estudos histológicos demonstraram o predomínio de
neutrófilos no edema pulmonar e lavado bronco-alveolar obtidos de pacientes afetados.
Neutrófilos aderem ao endotélio capilar lesado e alcançam o espaço intra-alveolar,
repleto de líquido rico em proteínas. Dentro do espaço aéreo, macrófagos alveolares
secretam: IL-1, IL-6, IL-8 e IL-10, além de TNF, que agem localmente para estimular
quimiotaxia e ativar neutrófilos. Os neutrófilos, por sua vez, podem liberar oxidantes,
proteases, leucotrienos e outras moléculas pró-inflamatórias, como fator ativador de
plaquetas (PAF) (Ware e Matthay, 2000).
Alguns mediadores antiinflamatórios também estão presentes dentro do alvéolo
inflamado, como o IL-1ra, o sTNFR, auto-anticorpos contra IL-8, além de IL-10 e IL-
11. Além disso, o influxo de líquido rico em proteína para dentro do alvéolo culmina em
inativação do surfactante. O fator inibidor de migração do macrófago (MIF) é uma
citocina regulatória produzida na hipófise anterior, entre outros locais e encontrada em
grandes concentrações no lavado bronco-alveolar de pacientes com SDRA. Esta
citocina aumenta a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-8 e TNF e pode
contrapor-se à inibição da secreção de citocinas induzida pelos glicocorticóides (Ware e
Matthay, 2000). Tais mecanismos possivelmente contribuem para a progressão da
disfunção respiratória rumo à SDRA (Figura 1).
23
Figura 1 – O Alvéolo na SDRA
Retirado de Ware LB, Matthay MA. The acute respiratory syndrome.
N Engl J Med 2000; 342(18): 1334-1349.
Apesar dos progressos das últminas décadas no manuseio clínico do paciente
séptico, que incluem a ressuscitação hídrica adequada, utilização precoce de
antibióticos, otimização do atendimento e da terapia, controle dos níveis de glicemia
sanguínea, uso de proteína C ativada, além de inúmeros ensaios clínicos com drogas
anti-inflamatórias, apenas uma modesta diminuição na mortalidade por sepse foi
observada. A incapacidade destas terapias em aliviar os efeitos devastadores desta
condição indica que a hipótese inicial da fisiopatologia da sepse pode ter sido
erroneamente construída, devendo-se ter cautela nas avaliações de estudos baseados
nesta hipótese (Monneret et al., 2008).
24
Torna-se necessária a correta identificação do paciente que verdadeiramente se
beneficiaria de terapias imunoestimulatórias ou imunodepressoras. De fato, na ausência
de sinais clínicos específicos da condição imune do paciente, é necessário definir os
melhores critérios biológicos para a estratificação dos mesmos, etapa que não foi
realizada na maioria dos ensaios clínicos. Isto permitiria talvez, futuramente, a definição
da ação correta (estimular a imunidade inata e/ou adaptativa, bloquear a apoptose,
restaurar outras funções alteradas), no tempo adequado (precoce ou retardado) e no
paciente correto, conforme características individuais (Monneret et al., 2008). Desta
forma, o maior conhecimento a respeito da fisiopatologia da sepse é necessário não só
para o desenvolvimento de terapias, mas também para identificar em quem e em que
momento estas intervenções serão mais eficazes (Monneret et al., 2008; Seam et al.,
2007).
c) Fator de Necrose Tumoral
O Fator de Necrose Tumoral (TNF ou TNF-α) é um potente mediador da
resposta inflamatória a patógenos e toxinas e é secretado principalmente por macrófagos
e neutrófilos após exposição aos antígenos. É um dos principais mediadores da
imunidade inata e é crucial para a indução da resposta imune local protetora contra
infecções, trauma ou isquemia (Ulloa et al. e Tracey et al., 2005). O TNF é secretado
alguns minutos após a infecção, porém após 3-4h sua produção pára e os níveis séricos
de TNF passam a ser quase indetectáveis (Tracey et al., 1993).
25
O TNF foi descrito como um dos principais mediadores do choque séptico, pois
é encontrado em pacientes e modelos experimentais de choque, além de ser capaz de
disparar todo o espectro de consequências hemodinâmicas, metabólicas e patológicas
relacionadas, como extravasamento capilar, hipotensão, SDRA e DMOS (Ulloa et al.,
2005). Também é considerado um dos mais importantes mediadores dos efeitos
induzidos por endotoxinas, sendo descritas diferenças interindividuais na sua liberação
(Dahmer et al., 2005) .
O TNF age através de dois receptores distintos, os receptores do fator de necrose
tumoral 1 e 2 (TNFR1 e TNFR2), que são expressos separadamente na membrana
celular. Os receptores de TNF solúveis são produzidos por clivagem proteolítica da
forma ligada à célula e têm sua liberação aumentada durante a sepse, provavelmente
agindo como um mecanismo regulador negativo da atividade do TNF (Vincent et al.,
2002).
Quando há bacteremia, esta é acompanhada pela liberação de TNF por
macrófagos no fígado, baço e outros tecidos. A liberação sistêmica de TNF,
especialmente quando concomitante à liberação de IL-1, causa vasodilatação e perda de
volume plasmático, levando ao aumento da permeabilidade vascular, culminando em
choque. O TNF e alguns mediadores inflamatórios também induzem a expressão de
moléculas nas células endoteliais que favorecem um estado pró-coagulante e deflagram
a coagulação sanguínea em pequenos vasos, ocasionando sua oclusão (Oberholzer et al.,
2001). Assim, a coagulação intravascular disseminada (CIVD) deflagrada pelo TNF no
choque séptico leva a depósitos de fibrina em pequenos vasos e consumo maciço de
proteínas da coagulação. Desta forma, a capacidade de coagulação apropriada é perdida
e os depósitos de fibrina na microvasculatura levam à lesão isquêmica de órgãos e
26
tecidos. Esta condição frequentemente culmina em disfunção orgânica, especialmente
nos rins, fígado, coração e pulmões (Oberholzer et al., 2001).
A produção excessiva de TNF pode ser letal por si só, pois se dispersa na
corrente sanguínea, podendo produzir colapso cardiovascular (Ulloa e Tracey, 2005).
Embora correlações tenham sido feitas entre concentrações elevadas de TNF, evolução
grave e resposta inflamatória alterada, a ausência de citocinas detectáveis no plasma não
é um indicativo de falta de expressão. Isto se deve ao fato de que a meia-vida do TNF
injetado em muitos modelos experimentais é extremamente curta, podendo não ser
identificado o pico de secreção, conforme o momento da coleta. O TNF, bem como a
IL-1, pode existir em uma forma asssociada às membranas e sua concentração nos sítios
de infecção ser frequentemente maior que na circulação sistêmica, o que no entanto
provavelmente não acarreta efeitos sistêmicos (Oberholzer et al., 2001).
Em alguns ensaios experimentais, verificou-se que a administração exógena de
grandes quantidades de TNF causa choque, hipotensão, coagulação intravascular
disseminada (CIVD) e a necrose hemorrágica e lesão tecidual características do choque
séptico (Tracey et al., 1986). Já a neutralização de TNF parecia prevenir choque
induzido por bacteremia, mesmo quando as endotoxinas e bactérias ainda persistiam na
circulação (Tracey et al., 1987). Mais tarde, anticorpos neutralizantes anti-TNF
passaram a ser considerados estratégias terapêuticas em diversas doenças, como Artrite
Reumatóide, Doença de Crohn, Espondilite Anquilosante e Psoríase (Feldmann et al.,
2002; Van Assche e Rutgeerts, 2000). Apesar da justificativa fisiopatológica e do
sucesso em outras doenças, a administração de anticorpos anti-TNF não obteve
resultados contundentes na sepse.
27
Inicialmente, anticorpos anti-TNF foram ineficazes ou pioraram o desfecho em
modelo murino de sepse induzida por peritonite (Eskandari et al., 1992; Remick et al.,
1995). No tratamento do choque séptico humano, preparações com anticorpos murinos
monoclonais anti-TNF humanos foram os primeiros agentes anti-TNF a serem testados.
No entanto, após alguns resutados iniciais positivos, um grande ensaio clínico
(NORASEPT II) não demonstrou efeitos benéficos na mortalidade, na duração do
choque ou resolução de disfunção orgânica induzida por sepse, mesmo em um subgrupo
de pacientes que apresentava níveis elevados de TNF no início do estudo (Abraham et
al., 1998 e Vincent et al., 2002).
Em outra abordagem, um fragmento F(ab’) 2 de anticorpo monoclonal murino
(MAK 195F - afelimomab) foi desenvolvido para diminuir a imunogenicidade potencial
dos anticorpos anti-TNF e facilitar a penetração tecidual. Dois ensaios clínicos
multicêntricos, um na Europa e Israel e outro nos EUA e Canadá investigaram seus
efeitos em pacientes sépticos, estratificados de acordo com seus níveis de IL-6 e
randomizados para o recebimento de placebo ou afelimomab por três dias. O estudo
americano demonstrou queda no risco relativo de mortalidade de 10% e efeitos
benéficos na disfunção de órgãos (Vincent et al., 2002). Entretanto, um estudo
multicêntrico atual não reproduziu os mesmos resultados (Rondon e Venkataraman,
2005).
Receptores de TNF também foram usados em terapias anti-TNF. Um ensaio
clínico mostrou diminuição nas taxas de mortalidade de pacientes com sepse grave que
receberam altas doses do receptor TNFR1 solúvel, entretanto outro estudo com maior
número de pacientes não reproduziu tais resultados (Vincent et al., 2002).
28
Assim, foram aventadas algumas explicações para a ineficácia do tratamento
anti-TNF em humanos sépticos. Devido ao pico precoce de TNF e sua diminuição
abrupta diretamente relacionada com o tempo decorrido após a exposição ao agente
agressor, a terapia anti-TNF apresenta uma janela terapêutica limitada para intervenção
clínica em infecção aguda ou trauma, já que é ineficaz quando administrada após a
expressão aguda da citocina (Ulloa e Tracey, 2005). Portanto, o fato da maioria dos
pacientes sépticos registrados em ensaios clínicos grandes anti-TNF ter sido admitida
horas ou dias após o início do insulto pode justificar a falência do tratamento
direcionado a esta citocina.
De fato, o único tratamento imunomodulador que apresentou eficácia na sepse
até o momento foi o uso de Proteína C Ativada, que apresenta tanto propriedades
anticoagulantes como antiinflamatórias. Após um grande ensaio clínico, Bernard e
colaboradores demonstraram mortalidade diminuída em pacientes com sepse grave após
o uso de Proteína C Ativada recombinante humana (Bernard et al., 2001 e Matthay et
al., 2001).
Apesar dos resultados de ensaios clínicos em humanos terem sido frustros, o
TNF ainda é uma das citocinas pró-inflamatórias mais estudadas na sepse. A
identificação de polimorfismos genéticos associados à sua produção pode ajudar a
estratificar subgrupos de pacientes e desta forma permitir a realização de novos estudos
com a terapia anti-TNF que podem ter efeitos diferentes em cada subgrupo.
29
d) Linfotoxina-alfa
A Linfotoxina-α (LTA) e a Linfotoxina-β (LTB) são duas citocinas relacionadas ao
TNF que podem desencadear sinal através dos receptores TNFR I e II, além dos
receptores LT-βR, dependendo de sua composição. Estes sinais têm funções
importantes no desenvolvimento e homeostase do sistema imune (Drustkaya et al.,
2010).
A LTA foi primeiramente caracterizada como um homotrímero (LT-α3), porém
desde então foi descoberta como parte de um heterotrímero ligado à membrana
contendo LT-β, predominantemente como a molécula LT-α1β2, que se liga ao seu
próprio receptor, o receptor LT-β (LTBR). Já a LT-α3 secretada se liga aos receptores
de TNF TNFRI e TNFRII e apresenta muitas das funções do TNF (Hansen et al., 2009).
A criação de camundongos deficientes em LTBR revelou um papel crucial desta
citocina na formação de tecidos linfóides secundários, como o fígado e linfonodos e dos
centros germinativos, onde as células B proliferam e amadurecem após ativação
(Hansen et al., 2009).
Caso produzida em quantidade suficiente, a LTA pode desencadear os mesmos
efeitos sistêmicos descritos anteriormente para o TNF, visto que compartilham um
mesmo receptor.
Entretanto, apesar dos efeitos benéficos das citocinas pró-inflamatórias para
ativação da resposta imune do hospedeiro, vários estudos experimentais demonstraram
que uma produção exacerbada de tais mediadores pode levar a vasodilatação, aumento
30
da permeabilidade vascular, hipotensão, choque, DMOS e óbito, sendo o fenômeno
inicial chamado de SIRS (Netea et al., 2003). Assim, o equilíbrio da resposta
inflamatória passa a exercer papel chave na otimização e funcionalidade da resposta
protetora do hospedeiro.
e) Biomarcadores em Terapia Intensiva
A sepse é um processo altamente heterogêneo em seus fatores desencadeantes e
expressão, sendo o manuseio clínico e seu prognóstico igualmente variáveis. Acontece
através da ativação da resposta imune inata, com mudanças na expressão e atividade de
mediadores endógenos da inflamação, coagulação e metabolismo intermediário.
Portanto, os diversos componentes desta resposta são alvos terapêuticos experimentais
atraentes, podendo representar importantes avanços no tratamento da sepse (Marshall e
Reinhart, 2009).
Mais de 100 moléculas distintas foram propostas como marcadores biológicos úteis
na sepse, porém ainda não se sabe quais destas provêm informações verdadeiramente
úteis, nem como esta utilidade é mais bem estabelecida. Um biomarcador é uma
molécula característica que é objetivamente medida e avaliada como indicador dos
processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma
intervenção terapêutica (Biomarkers Definition Working Group 2001). A identificação
de biomarcadores úteis na sepse representa um importante avanço em pesquisa e sua
utilidade está em sua capacidade de providenciar informações de maneira mais rápida
31
que os dados fisiológicos e exames clínicos de rotina já disponíveis. Esta informação
adicional pode permitir definir a patogênese ou o prognóstico da doença, além de
auxiliar nas decisões terapêuticas (Marshall e Reinhart, 2009).
Biomarcadores podem ser utilizados em diferentes situações: (1) triagem, para
identificar pacientes com risco de pior prognóstico e iniciar tratamento profilático ou
testes diagnósticos; (2) diagnóstico, para permitir decisão terapêutica, de forma mais
acurada, segura e rápida; (3) estratificação de risco, para identificar subgrupos de
pacientes que podem se beneficiar ou ter maior prejuízo com uma intervenção
terapêutica mais direcionada; (4) monitorização, quando seus níveis mudam
dinamicamente conforme a resposta do paciente, ajudando a quantificar a resposta à
intervenção e permitindo titulação de dose ou duração de tratamento e (5) substituição
de alvo terapêutico, caso as mudanças no nível de um biomarcador se correlacionem
consistentemente com desfechos clínicos importantes do paciente, podendo ser utilizado
como medida de desfecho (Marshall e Reinhart, 2009).
Um biomarcador pode ser selecionado através de sua associação biológica com a
doença ou com uma possível intervenção terapêutica. Em pacientes com sepse, por
exemplo, endotoxina circulante pode ser um marcador de infecção por bactérias gram-
negativas e poderia identificar um paciente que se beneficiaria de tratamento com
agente neutralizador da endotoxina. Da mesma forma, o fator de necrose tumoral
circulante ou outra molécula como a IL-6, cuja liberação é induzida por TNF, é
intuitivamente marcador atraente de um paciente que poderia se beneficiar da utilização
de uma terapia anti-TNF (Marshall e Reinhart, 2009).
32
Na sepse, existem biomarcadores já descritos para: (1) Predisposição -
polimorfismos de base única; (2) Infecção - procalcitonina; (3) Resposta ao tratamento -
citocinas, proteína C-reativa - e (4) Disfunção orgânica - lipocalina associada à
gelatinase neutrofílica para insuficiência renal aguda.
Alguns biomarcadores inflamatórios já foram definidos, como a Procalcitonina,
cujos níveis séricos se encontram aumentados em pacientes com infecção e diminuem
em resposta à antibioticoterapia adequada. Até o momento, a procalcitonia é um dos
biomarcadores para sepse com maior especificidade e sensibilidade e ajuda a distinguir
a resposta inflamatória secundária à sepse da inflamação não-infecciosa. Também
apresenta valor preditivo para desfecho, podendo identificar sepse antes mesmo dos
critérios clínicos definidos pela ACCP/SCCM (Schuerholz e Marx, 2008).
Outro biomarcador já descrito na sepse é a Proteína C Reativa, cujos níveis
aumentados proporcionam informação diagnóstica maior que o aumento de temperatura
corporal no diagnóstico de infecção em pacientes criticamente enfermos. No entanto,
revisões sistemáticas recentes sugerem que a procalcitonina é superior à proteína C-
reativa, apresentando maior sensibilidade, maior razão positiva e maior área abaixo da
curva ROC (Simon et al., 2004 e Povoa et al., 2005). Ainda, a procalcitonina foi
superior quando comparada aos níveis séricos de TNF e IL-6 no que diz respeito ao
diagnóstico de choque séptico (Schuerholz e Marx, 2008).
Apesar de resultados positivos de estudos clínicos e experimentais, a maioria das
citocinas utilizadas como biomarcadores falhou em representar avanços para os
intensivistas (Salluh et al., 2008). Hipóteses iniciais que a IL-6 circulante poderia
33
identificar pacientes que se beneficiariam de tratamentos direcionados contra o TNF
foram abandonadas (Panacek et al., 2004 e Marshall e Reinhart, 2009).
Biomarcadores também podem ser identificados através de avaliação molecular,
utilizando abordagens por microarray ou proteômicas, com o objetivo de identificar
quais espécies moleculares são expressas diferencialmente na população de interesse,
ampliando as possibilidades de screening genômico para biomarcadores em potencial.
Polimorfismos em genes da imunidade inata são comuns e resultam em significativa
variabilidade interindividual na resposta a um dado insulto. Desta forma, polimorfismos
genéticos podem representar biomarcadores úteis para triagem de pacientes predispostos
a evoluir de forma grave quando expostos a um insulto infeccioso.
f) Polimorfismo Genético
A maioria das doenças humanas é substancialmente afetada por fatores
genéticos. Até o presente momento, parece claro que a patogênese da maior parte das
doenças resulte de interações complexas entre o genótipo, o meio-ambiente e a natureza
do processo que leva à lesão celular, tecidual, orgânica ou sistêmica.
O genoma humano é composto de cerca de 3 bilhões de pares de base,
compreendendo aproximadamente 30.000 genes (Christie JD, 2008). A informação
proveniente do conhecimento do genoma humano e a biologia molecular
revolucionaram a medicina aumentando o conhecimento de mecanismos
fisiopatológicos de doenças e providenciando novas ferramentas no diagnóstico de
34
doenças secundárias a mutações genéticas, assim como na avaliação do risco genético
(Winning et al., 2006).
Muitos métodos podem ser utilizados para demonstrar o risco genético de infecção.
Estudos familiares tradicionais, com gemelares e adotados fornecem a melhor
evidência, mas são difíceis de realizar. Entretanto, a evidência mais forte para o papel
da genética na infecção em seres humanos vem de um estudo em adotados (Wunderink
et al., 2003). Em 1988, Sorensen e colaboradores demonstraram que a influência
genética no risco de óbito secundário a uma causa infecciosa não é desprezível. Neste
estudo clássico, os autores acompanharam 960 famílias de crianças nascidas entre 1924
e 1926 que foram adotadas no início da infância e compararam o risco de morte precoce
pelas mesmas causas entre filhos e pais biológicos e adotivos. O risco de morte de um
pai biológico antes dos 50 anos resultou em risco relativo de morte nas crianças de 1,98
para causas naturais, 1,19 para câncer, 4,52 para causas cardiovasculares e 5,81 para
infecções. Os autores concluiram que morte prematura em adultos tem um fundo
genético importante, especialmente no que diz respeito às infecções. Este estudo tornou
claro que a evolução clínica de um paciente séptico não é determinada apenas pelas
espécies de patógenos isoladas no sítio de infecção, mas também pela resposta do
hospedeiro (Sorensen et al., 1998; Winning et al., 2006).
De fato, há evidências de que a resposta imune adquirida, tanto celular quanto
humoral, seja sujeita ao controle genético, o que pode explicar a já conhecida
diversidade de manifestações clínicas e desfechos em pacientes criticamente doentes
com a mesma patologia clínica. Portanto, diferenças genéticas entre indivíduos ou
populações podem afetar o prognóstico de sua doença (Vilar et al., 2002).
35
A maior parte do interesse atual em terapia intensiva é nos polimorfismos
relacionados aos genes codificadores de moléculas inflamatórias, já sabidamente
relacionadas à patogênese da SIRS, sepse, sepse grave, choque séptico, LPA e SDRA
(Wunderink et al., 2003).
Algumas mutações do DNA não têm nenhum efeito fenotípico, seja porque a
alteração não modifica a seqüência primária de aminoácidos de um polipeptídio ou
porque a alteração resultante da seqüência de aminoácidos codificada ocorre em uma
região não crítica do polipeptídio. Logo, nem todas as proteínas alteradas trazem
conseqüências clínicas. Pelo contrário, muitas proteínas existem normalmente em duas
ou mais formas estruturalmente distintas, geneticamente diferentes e relativamente
comuns.
Uma mutação é definida como qualquer alteração estrutural permanente do DNA,
isto é, uma alteração na seqüência de nucleotídeos ou arranjo do DNA no genoma. As
mutações são responsáveis por doenças genéticas ou hereditárias e por muitos casos
oncológicos (Thompson & Thompson, 2006).
Polimorfismo genético é um termo relacionado, porém mais amplo, pois indica uma
variação genética estável que é mantida dentro de uma população e não se traduz
necessariamente por diferenças fenotípicas ou por diferenças na sequência de
aminoácidos do produto gênico. Estas variações incluem as que geram os diferentes
alelos que resultam em variantes fenotípicas identificáveis, como também em outras
sem uma expressão fenotípica (Kumar et al., 1999). Um gene polimórfico é aquele no
qual a comparação da sequência de DNA do gene em múltiplos indivíduos apresenta
diferenças em uma frequência maior que 1%, enquanto um gene mutante apresenta
36
diferenças em uma frequência menor que 1%. Os sítios nos quais os genes são
diferentes são chamados polimórficos, podendo existir um ou mais sítios polimórficos
em um mesmo gene. Também podem estar localizados em regiões codificadoras,
envolvidas na regulação da expressão gênica, ou não-codificadoras. Algumas destas
variações podem influenciar o nível ou atividade da proteína resultante, afetando a
função celular (Dahmer et al., 2005). Assim,o polimorfismo genético pode ser definido
como a ocorrência regular em uma população de dois ou mais alelos em uma
localização particular do cromossomo, podendo resultar em uma deficiência na proteína,
uma proteína alterada, uma mudança no nível normal da proteína expressada ou
nenhuma mudança na produção ou expressão protéica. Além disso, muitos destes
polimorfismos podem diretamente causar uma mudança no fenótipo, serem ligados a
um fenótipo em particular ou não apresentarem nenhuma ligação com um fenótipo
específico (Wheeler et al., 2001).
Existem diferentes tipos de polimorfismos: os de base única (SNP – Single
Nucleotide Polymorphism), onde há troca de uma única base nitrogenada por outra
(adenina, timina, guanina e citosina); os de inserção/deleção, nos quais há adição ou
ausência de uma ou mais bases; e os SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism),
STR (Short Tandem Repeats) e VNTR (Variable Number Tandem Repeats), nos quais
há repetições de sequências simples ou repetições curtas em Tandem.
O tipo de polimorfismo mais comum é o de base única (SNP), onde há a
substituição de um nucleotídeo por outro, sendo a mais comum a substituição de T por
C (Winning et al., 2006). Os SNPs respondem por aproximadamente 90% da
variabilidade humana, acreditando-se que um SNP ocorra em média a cada 100 a 300
bases. Desta forma, há aproximadamente 10 milhões de variações comuns da classe dos
37
SNPs no genoma humano (Christie et al., 2008). Embora a maioria deles ainda esteja
por ser identificada, caso esta variabilidade realmente ocorra em todo o genoma, é
possível que existam mais de 20 milhões de SNPs no genoma humano.
Quando têm impacto detectável, os SNPs podem alterar a função de um gene de
diversas maneiras. Por exemplo, alterando uma única base, pode haver alteração no
aminoácido codificado e conseqüentemente na proteína, o que pode ou não levar à
alteração na função protéica. Além disso, SNPs também podem ter efeito significativo
sem necessariamente alterar as proteínas. Um SNP que ocorra em uma região promotora
que controla a transcrição pode levar à síntese aumentada ou diminuída daquela
proteína, o que pode culminar em efeitos significativos. Quando a mudança de base não
afeta a composição da proteína, isto é, quando a mudança é conservativa, mantendo-se
um códon que codifica o mesmo aminoácido, o SNP é chamado sinônimo, enquanto os
não-sinônimos são aqueles que alteram a composição da proteína, podendo afetar sua
função e contribuir para doenças genéticas. No entanto, SNPs que em regiões não-
codificantes podem ser funcionais mesmo sem alterar a proteína, já que podem alterar a
taxa de transcrição do gene (Dahmer et al., 2005).
Embora os SNPs ainda estejam sendo mapeados e o impacto funcional da maioria
deles esteja por ser definida, claramente algumas destas substituições são responsáveis
pela vasta maioria dos fenótipos humanos, que abrangem aspectos tão diversos quanto
diferenças na cor do cabelo ou na resposta a medicamentos (Zimmerman et al., 2006).
Qualquer indivíduo apresenta muitos loci gênicos diferentes, sendo um dos
polimorfismos mais extensamente conhecidos os do grupo sanguíneo ABO (o qual não
envolve SNP), que têm sido marcadores genéticos úteis em estudos populacionais de
famílias e em análises de ligação devido a sua classificação imediata em fenótipos
38
distintos, seu modo de herança simples e suas freqüências variadas em diferentes
populações.
Cada indivíduo tem muitos SNPs, que juntos criam uma sequência de DNA única.
Estes polimorfismos são altamente conservados ao longo da evolução e dentro das
populações, sendo, portanto, excelentes marcadores genotípicos tanto para genética
populacional, quanto para terapias individualizadas (Winning et al., 2006).
Atualmente, é muito bem estabelecida a correlação entre polimorfismos nos genes
do Antígeno Leucocitário Humano (HLA) ou Complexo de Histocompatibilidade
Principal (MHC) e susceptibilidade a infecções, incluindo malária, hepatite B e HIV
(Winning et al., 2006). O estudo de outros tipos de polimorfismo genético vem se
desenvolvendo e gerando informações importantes relacionadas à susceptibilidade
genética, portanto individual, para o desenvolvimento de doenças graves tais como
sepse ou SDRA. Cerca de mais de 100 polimorfismos têm sido descritos em genes de
citocinas, podendo contribuir para a intensidade da resposta inflamatória e,
conseqüentemente, para a gravidade da doença (Mira et al., 1999).
g) Polimorfismos do Fator de Necrose Tumoral – Posição -308
O locus gênico responsável pela codificação do TNF se localiza no braço curto do
cromossomo 6, na região de Classe III do MHC ou HLA e já foi bem caracterizado
(Figura 2) (Winning et al., 2006).
39
Figura 2 – O Sistema HLA
Retirado de Klein J e Sato A. The HLA system. N Eng J Med 2000; 343 (10): 702-709.
Como o TNF (OMIN 191160) é um dos principais mediadores na fisiopatologia
da sepse, indivíduos com característica genética para ser altamente respondedores para
TNF, o que não é necessariamente atribuível a qualquer SNP específico, podem ser
considerados de maior risco para o desenvolvimento de DMOS e óbito, quando
expostos a infecções mais graves, trauma e outras injúrias que possam evocar resposta
inflamatória sistêmica (Stüber et al., 1996). A determinação genética pode identificar
precocemente certos grupos de pacientes que se beneficiariam de tratamentos
específicos, como por exemplo, terapia anti-TNF para pacientes que produzem altos
níveis de TNF (Vincent et al., 2002).
Vários polimorfismos de base única têm sido identificados na região promotora
do gene codificador do TNF, muitos associados com produção espontânea ou
estimulada de TNF alterada, tanto in vivo, quanto ex vivo (Dahmer et al., 2005). Dentre
estes, um polimorfismo de base única que diretamente afeta a expressão do TNF foi
40
localizado na região promotora do gene TNF, na posição −308 (rs 1800629) (Terry et
al., 2000), isto é, 308 nucleotídeos acima do sítio de início da transcrição do gene. Este
polimorfismo resulta em duas formas alélicas, uma onde a Guanina (G) define o alelo
selvagem TNF1 e outro onde a Adenina (A) define o alelo polimórfico TNF2
(polimorfismo −308 G/A), de acordo com a frequência populacional. Assim, um
indivíduo pode ser homozigoto para o alelo mais comum (TNF -308 GG) ou ser
carreador do alelo raro A, sejam eles homozigotos (TNF -308 AA) ou heterozigotos
(TNF -308 GA).
Uma quantidade significativa de evidência suporta a importância biológica de
polimorfismos na região promotora do gene codificador do TNF. Estudos ex vivo
demonstraram que o alelo raro TNF -308 A é associado com aumento na transcrição
gênica, quando comparado com o alelo selvagem TNF -308 G (Wilson et al., 1997).
Além disso, o alelo A também é associado com aumento na secreção de TNF por
macrófagos após estimulação com lipopolissacarídeos (LPS) ex vivo (Louis et al.,
1998). Vários estudos ex vivo encontraram variação individual consistente na produção
de TNF após uma variedade de estímulos inflamatórios, na presença deste SNP
(Waterer et al., 2005).
O alelo TNF A foi associado com gravidade da apresentação clínica e
mortalidade em uma variedade de doenças infecciosas. Esta associação foi descrita em
Doença de Kawasaki em crianças (Quasney et al., 2001), nas formas graves de malária
cerebral (McGuire et al., 1994), na demência relacionada ao vírus da imunodeficiência
humana (HIV) em adultos (Quasney et al., 2001), em crianças com infecção
41
meningocócica (Nadel et al., 1996), em adultos com pneumonia comunitária (Waterer et
al., 2001) e na leishmaniose mucocutânea (Dahmer et al., 2005).
Este polimorfismo foi o mais extensivamente estudado na sepse, já que o gene
polimórfico poderia resultar em liberação de TNF alterada após exposição aos
patógenos. De fato, homozigotos para o alelo A na posição TNF -308 produzem maiores
quantidades de TNF durante o choque séptico e têm um risco de mortalidade
significativamente maior, quando comparados a pacientes que são homozigotos ou
heterozigotos para o alelo G (Majestschak et al., 1999).
Estudos de associação entre o alelo TNF -308 A e sepse foram realizados em
pacientes clínicos com sepse primária, causada por diferentes agentes, e em pacientes
com sepse secundária, após trauma, queimaduras ou realização de cirurgias eletivas. A
presença do SNP foi correlacionada à susceptibilidade a sepse, aos diferentes espectros
clínicos da sepse e à mortalidade.
Os primeiros estudos publicados apresentavam grupos relativamente pequenos
de pacientes e sugeriram uma associação entre TNF -308 e choque séptico. Em 89
adultos com choque séptico, o risco de morte foi 3,7 vezes maior nos portadores de ao
menos uma cópia do alelo A, após controle para idade e gravidade de doença (Mira et
al., 1999). Alguns estudos posteriores também apresentaram associação positiva entre o
alelo TNF -308 A e óbito (Appoloni et al.,2001 e Nuntayanuwat et al., 1999), além de
associação entre o SNP e piora clínica na sepse, evoluindo para choque séptico (Nakada
et al., 2005 e Dianliang et al., 2003).
Em pacientes vítimas de politraumatismo, a correlação entre o alelo TNF -308 A
e sepse secundária grave e óbito foi positiva em dois estudos (O’Keefe et al., 2002 e
Menges et al.,2008). Em pacientes com sepse secundária à queimadura também houve
42
correlação entre o SNP em questão e sepse grave (Barber et al., 2006), além de
correlação com óbito (Shalhub et al., 2009).
Em crianças, muitos dos estudos publicados são em neonatologia. Hedberg e
colaboradores publicaram estudo em 173 prematuros de muito baixo peso, em que não
encontraram associação do SNP TNF -308 com susceptibilidade a sepse, porém
mortalidade três vezes maior em carreadores A (2004). No entanto, não foi encontrada a
mesma associação em 67 prematuros com sepse neonatal precoce (Schueller et al.,
2006).
Na faixa etária pediátrica excluindo os recém-natos, uma das primeiras
associações entre o polimorfismo do TNF -308 e sepse foi realizada em pacientes com
meningococcemia, por ser uma doença grave, relativamente frequente em pediatria, de
curso fulminante e associada com ativação rápida de inflamação sistêmica. Inicialmente,
foi encontrada associação entre o alelo TNF -308 A e óbito, não apenas nas crianças
homozigotas AA, mas também nas heterozigotas (Nadel et al., 1996). Tais resultados
foram novamente buscados por outros dois autores, porém os mesmos não conseguiram
confirmar esta associação (Read et al., 2000 e Balding et al., 2003). Em 2009, foi
publicado novo estudo de Read e colaboradores, desta vez em uma coorte mais
numerosa, envolvendo 1321 pacientes com meningococcemia comprovada, entre
crianças e adultos, sendo 959 pacientes abaixo de 16 anos. Read observou associação
positiva entre o alelo TNF -308 A e susceptibilidade à doença meningocócica, mas não
encontrou associação com óbito.
Em crianças com sepse secundária a outras causas que não meningococcemia,
existe apenas um estudo publicado, realizado na Turquia em 2006, com 53 pacientes
43
entre 0 e 15 anos. Neste estudo, os pacientes carreadores do alelo TNF -308 A
apresentaram risco 2,42 vezes maior de desenvolvimento de sepse grave e choque
séptico, porém sem associação com óbito (Sipahi et al., 2006).
Apesar de vários resultados positivos descritos, outros estudos não conseguiram
demonstrar associação entre o SNP TNF -308 e susceptibilidade à sepse (Stüber et al.,
1996; Gallagher et al., 2003; Schaaf et al., 2003; Garnacho-Montero et al., 2006) ou
óbito (Jessen et al., 2007; Tang et al., 2000; Gordon et al., 2004), mesmo em grupo de
854 pacientes caucasóides com sepse grave (Watanabe et al., 2009).
Devido aos resultados conflitantes publicados na literatura a respeito da
associação entre o SNP TNF -308 e susceptibilidade a sepse e óbito, recentemente foi
publicada uma metanálise, com o objetivo de esclarecer tais divergências. O artigo
publicado por Teuffel e colaboradores comparou estudos que incluíam pacientes com
sepse primária causada por diferentes agentes etiológicos ou secundária a um evento
inicial, como trauma, queimadura ou cirurgias eletivas (2009). Além disso, também
foram comparadas populações de diferentes faixas etárias, sendo incluídos estudos em
neonatos, crianças e adultos (Figura 3).
Os autores realizaram atribuições de peso para cada estudo conforme critérios de
qualidade estabelecidos e, apesar da dificuldade em comparar resultados de estudos
metodologicamente distintos e com populações diferentes, a metanálise demonstrou
associação entre o alelo TNF -308 A e susceptibilidade à sepse (OR=2,15; p<0.01),
porém ausência de significância estatística para a associação do SNP a óbito (OR=1,48;
p=0.20) (Teuffel et al., 2009).
44
Figura 3 – Estudos de associação entre o SNP TNF -308 e choque séptico
incluídos na metanálise de Teuffel O e colaboradores.
Reproduzido de Teuffel O, Ethier MC, Beyene J, Sung L. Association between tumor necrosis factor-α promoter -308 A/G polymorphism and susceptibility to sepsis and sepsis mortality: a systematic review and meta-analysis. Crit Care Med 2009; 38 (1):276-282.
Alguns estudos avaliaram associação entre polimorfismos e doenças pulmonares,
como a associação entre um polimorfismo na antiquimotripsina-α-1 e Doença Pulmonar
Obstrutiva Crônica (DPOC) (Ishii et al., 2000) e associações entre polimorfismos do
TNF e o desenvolvimento de pneumonite por hipersensibilidade (Schaaf et al., 2001),
sarcoidose (Seitzer et al., 1997), bronquite crônica (Huang et al., 1997) e DPOC (Sakao
et al., 2001). Em conjunto, tais estudos providenciam evidência de predisposição
genética ao desenvolvimento de doença pulmonar. No entanto, Waterer e colaboradores
não encontraram associação entre o SNP TNF -308 e insuficiência respiratória em 280
pacientes com pneumonia comunitária (2001).
45
Estudos publicados na literatura a respeito do papel do TNF na SDRA foram
conflitantes. Alguns estudos correlacionaram os níveis séricos de TNF com o
desenvolvimento e a mortalidade na SDRA (Marks et al., 1990; Poumen et al., 1993;
Meduri et al., 1995), enquanto outros não encontraram associações (Roten et al., 1991;
Donnely et al., 1994). Estas discrepâncias podem estar relacionadas à variação temporal
e regional na liberação de TNF (Gong et al., 2005; Suter et al., 1992; Hyers et al., 1991)
e às diferenças nas técnicas utilizadas para avaliação do TNF (Parsons et al., 1992).
Estudos de associação com polimorfismos também vêm sendo desenvolvidos em
SDRA, especialmente em genes relacionados à transcrição de proteínas associadas à
produção de surfactante (Lin et al., 2000; Gong et al., 2004). Em 2005, Gong e
colaboradores avaliaram a correlação entre a presença de SNPs para TNF -308 e LTA
NcoI em 212 pacientes portadores de SDRA, em um estudo caso-controle americano.
Na análise geral, o alelo TNF -308 A não estava associado com o desenvolvimento de
SDRA, porém após estratificação da população entre lesão pulmonar direta ou indireta,
o alelo TNF -308 A foi associado com menor chance de desenvolvimento de SDRA nos
pacientes com lesão pulmonar direta (OR=0.52; p=0.01). Ainda, o alelo TNF -308 A foi
associado com mortalidade em 60 dias aumentada na SDRA (OR=3.5; p=0.007).
Como o gene TNF se localiza em uma região densamente povoada por genes
envolvendo a resposta inflamatória, incluindo o da LTA e próximos aos loci do HLA,
Kilding e colaboradores em 2004 demonstraram que os polimorfismos nesta região dos
genes apresentam um alto grau de desequilíbrio de ligação. O desequilíbrio de ligação
ocorre quando polimorfismos em um mesmo gene ou ainda em diferentes genes, desde
que localizados em um mesmo cromossomo, são usualmente herdados em conjunto,
resultando em uma associação de um alelo em uma posição com outro alelo específico
46
em um SNP próximo, em uma frequência superior à esperada pelo acaso. Portanto, um
dado polimorfismo pode não estar diretamente causando a secreção aumentada de TNF,
mas ser um marcador para algum outro fator genético proximamente ligado (Dahmer et
al., 2005). Assim, outros polimorfismos em regiões próximas também relacionadas à
resposta inflamatória podem estar em desequilíbrio de ligação, como os loci HLA, os
genes responsáveis pela LT-α e LT-β, o complexo HSP70 e os genes responsáveis pelo
sistema complemento.
A combinação do alelo LTA +252 A com o alelo TNF -308 G é a mais frequente,
já que são estes os alelos mais frequentes em cada posição (Wunderink et al., 2003). Se
um marcador nesta região está associado com doença, este fato pode simplesmente
refletir o efeito de outro marcador, mais importante funcionalmente. Assim, torna-se
imprescindível a análise de desequilíbrio de ligação entre diferentes SNPs, a fim de
evitar conclusões inadvertidas, recomendando-se avaliar SNPs da LTA em conjunto com
SNPs do TNF. A Figura 4 demonstra a proximidade dos genes responsáveis pela
codificação do TNF e da LTA.
Figura 4 – Interações entre os genes TNF e LTA
Retirado de Tsytsykova AV, Rajsbaum R, Falvo JÁ, Ligeiro F, Neely SR, Goldfeld AE. Activation-dependent
intrachromosomal interactions formed by the TNF gene promoter and two distal enhancers. PNAS 2007; 104 (43):
16850-16855.
47
h) Polimorfismos da Linfotoxina-alfa – Posição +252
Próximo ao gene codificador do TNF, localiza-se o gene responsável pelo TNF-β,
atualmente conhecido como Linfotoxina-α (LTA – OMIN 153440). No primeiro íntron
deste gene, o polimorfismo de base única localizado na posição +252 (rs 909253), a
partir do sítio de transcrição da LTA, foi associado com a produção aumentada de TNF.
Este local é também conhecido como LT-α +250 ou alelo TNFB e se localiza 3,2kb
acima do gene codificador do TNF, podendo funcionar como uma região intensificadora
(Figura 5) (Waterer et al., 2005).
Figura 5 – Posição dos SNPs TNF -308 e LTA +252 ou NcoI
Retirado de Schade FU, Stüber F, Börgermann J, Majetschak M. Relation of the bi-allelic NcoI fragment length polymorphism
within the tumor necrosis factor B gene to the development of mediatinitis. Eur J Surg Suppl. 1999; 584: 73-79.
O SNP LTA +252 é um polimorfismo de fragmento de restrição NcoI, e dependendo
da preservação ou não deste sítio de restrição, o alelo é denominado “TNFB1” (LTA
48
+252 G) ou “TNFB2” (LTA +252 A), respectivamente (Wheeler et al., 2001). A
presença de Adenina na posição +252 está associada com um aumento de TNF ex vivo
(Pociot et al., 1993). Assim, variações genéticas nas regiões regulatórias da LTA têm
influência na quantidade de TNF produzida, embora não se saiba quais os mecanismos
envolvidos nesta associação (Dahmer et al.,2005).
Pacientes LTA +252 homozigotos AA expressam maiores quantidades sistêmicas de
TNF durante o choque séptico e têm maior risco de mortalidade quando comparados aos
homozigotos GG ou heterozigotos GA. Assim, apesar de ser o genótipo selvagem, ou
mais frequente, a presença do homozigoto AA está associada a um risco aumentado de
choque séptico e desfecho fatal em adultos (Majestschak et al., 1999 e Stüber et al.,
1996) e em crianças com bacteremia (McArthur et al., 2002).
Os primeiros estudos de associação entre o SNP LTA +252 e sepse descritos foram
realizados em um grupo pequeno de pacientes. Em 1996, Stüber e colaboradores
avaliaram 40 pacientes com choque séptico, demonstrando que o genótipo LTA +252
AA estava associado com um risco substancialmente maior de óbito, sendo o mesmo
resultado encontrado posteriormente em outro estudo (Fang et al.,1999). A associação
entre o SNP LTA +252 e gravidade de sepse, evoluindo para choque séptico, também foi
descrita (Dianliang et al., 2003).
Em unidades de terapia intensiva pós-operatórias ou para tratamento de trauma,
pacientes que desenvolveram sepse secundária e eram homozigotos para A na posição
LTA +252, apresentavam maiores níveis de TNF circulantes, além de maior mortalidade
(Stüber et al., 1996, Stüber et al., 1996 2 e Majetschack et al., 1999). Outros estudos em
unidades intensivas pós-operatórias também apresentaram associação positiva entre
49
SNP LTA +252 e incidência de complicações infecciosas após cirurgias (Kahlke et al.,
2004 e Riese et al., 2003).
Conforme descrito para o gene TNF, muitos dos estudos do gene LTA realizados em
crianças são em neonatologia. Em prematuros e recém-nascidos a termo de alto risco,
um estudo piloto não demonstrou risco de evolução mais grave para os pacientes
portadores do alelo LTA +252 A que apresentaram bacteremia comprovada por culturas
(Weitcamp et al., 2000). Também não foi encontrada associação do mesmo SNP com
sepse neonatal precoce em estudo com 67 prematuros (Schueller et al., 2006).
Em meningococcemia, Balding e colaboradores não encontraram associação
entre SNPs de LTA e choque séptico ou óbito, em 193 crianças entre 2 meses e 15 anos
de idade, na Irlanda (Balding et al., 2003). Recentemente, em estudo multicêntrico
inglês com 1321 pacientes com meningococcemia, dos quais 959 eram menores de 16
anos, Read e colaboradores também não conseguiram encontrar associação entre o alelo
LTA +252 A e susceptibilidade a sepse ou óbito (2009).
Na faixa etária pediátrica, em um dos poucos estudos que não versavam sobre
meningite ou meningocccemia, McArthur e colaboradores demonstraram, em uma
coorte pequena de 34 crianças com bacteremia, a associação entre o alelo A na posição
LTA +252 e níveis séricos de TNF, além de mortalidade maior nos homozigotos AA
(2002).
Apesar de muitos estudos de associação terem encontrado resultados positivos,
muitos outros não foram capazes de demonstrar associação com susceptibilidade à sepse
ou óbito na sepse primária (Nuntayanuwat et al., 1999; Schröder et al., 2000; Schaaf et
al., 2003; Rauschwalbe et al., 2004; Gordon et al., 2004; Garnacho-Montero et al.,
50
2006; Pappachan et al.,, 2009), na sepse secundária em pacientes em pós-operatório
(Calvano et al., 2003; Nakada et al., 2005)
Mais recentemente, Watanabe e colaboradores publicaram estudo multicêntrico
americano com 854 pacientes com sepse grave, em que avaliaram a associação de
diversos SNPs com gravidade de sepse e óbito. Os autores encontraram associação entre
o SNP LTA +252 e sepse grave quando os resultados eram estratificados para gênero e
idade, sendo os mesmos positivos apenas para homens e em pacientes idosos acima de
60 anos (Watanabe et al., 2009).
Devido às contradições encontradas na literatura acerca da associação entre o
SNP LTA +252 e susceptibilidade à sepse e óbito, o grupo de pesquisa do Laboratório
de Fisiopatologia Humana (IFF/Fiocruz) desenvolveu uma revisão sistemática de
estudos publicados na literatura, com o objetivo de realizar uma metanálise e esclarecer
as divergências atualmente encontradas. A tabela abaixo apresenta comparação entre os
estudos incluídos na revisão sistemática, que está sendo submetida a periódico clínico
na área de terapia intensiva (Tabela 1).
Poucos estudos correlacionaram polimorfismos relacionados às citocinas
inflamatórias e lesão pulmonar aguda ou SDRA. Em 2001, foi publicado estudo
americano em 280 pacientes adultos com pneumonia comunitária. A presença do
genótipo +252 LTA AA apresentou risco relativo de 2.48 para o desenvolvimento de
choque séptico (p=0.01). No entanto, quando o desfecho avaliado foi insuficiência
respiratória na ausência de choque, os autores encontraram forte correlação com o
genótipo oposto, já que o genótipo LTA +252 GG foi associado à insuficiência
respiratória do tipo I (p=0.03) (Waterer et al., 2001). Similarmente, no estudo de Gong
em 2005, a presença do genótipo LTA +252 GG foi relacionada à proteção ao
51
desenvolvimento de SDRA (OR: 0.47; p=0.01). No entanto, quando os pacientes foram
estratificados em SDRA secundária à lesão pulmonar e extra-pulmonar, apenas a
associação do genótipo LTA +252 GG e SDRA extra-pulmonar permaneceu
significativa (OR=0.48; p<0.01).
Tabela 1 – Estudos de associação entre o SNP LTA +252, choque séptico e óbito
Estudo Ano País No. de Pacientes Etnia Grau de
Sepse Condição
Clínica No. de
Controles Tipo de Controles
Dianling 2003 China 102 Mongolóides Choque Séptico Pancreatite 116 Pacientes Saudáveis
Fang 1999 Alemanha 93 Caucasóides Sepse Grave Mista 261 Doadores de Sangue
Garnacho-Montero 2006 Espanha 224 ND Misto Mista 101 Doadores de Sangue
Gordon 2004 Inglaterra Austrália 213 Caucasóides Misto Mista 354 Pacientes Saudáveis
Nakada 2005 Japão 86 Mongolóides Sepse Grave Mista 214 Pacientes Saudáveis
Rauschwalbe 2004 Alemanha 79 ND Misto Pós-Operatório 0 ND
Read 2009 Inglaterra 442 ND Sepse Meningococcemia 1280 Doadores de Sangue
Schaaf 2003 Alemanha 51 Caucasóides Sepse Infecção
Pneumocócica
50 Pacientes Saudáveis
Stüber 1995 Alemanha 80 Caucasóides Sepse Grave Mista 153 Doadores de Sangue
Watanabe 2009 EUA 854 Misto Sepse Grave Mista 854 Pacientes Saudáveis
Watanabe 2005 Japão 112 Mongolóides Choque Séptico ND 150 Pacientes Saudáveis
Waterer 2001 Austrália 31 Misto Choque Séptico
Pneumonia Comunitária 0 ND
Balding 2003 Irlanda 193 Misto Sepse Meningococc
emia em Crianças
389 Doadores de Sangue
Calvano 2003 EUA 28 ND Misto Pós-Operatório 0 ND
Kahlke 2004 Alemanha 16 ND Sepse Pós-Operatório 0 ND
Riese 2003 Alemanha 18 ND Sepse Pós-Operatório 0 ND
Schröder 2000 Alemanha 201 ND Sepse Pós-Operatório 0 ND
Flach 1999 Alemanha 10 ND Sepse Trauma 20 Pacientes Saudáveis
Majestschak 1999 Alemanha 53 ND Sepse Trauma 57 Pacientes com trauma e sem complicações
Majestschak 2002 Alemanha 14 ND Sepse Grave Trauma 56 Pacientes sem sepse
Menges 2008 Alemanha 70 ND Sepse Trauma 76 Pacientes Saudáveis
52
Estes estudos têm importantes implicações para as definições clínicas de sepse grave
e SIRS. Tais dados sugerem que a predisposição genética ao choque séptico pode ser
diferente da predisposição a outras manifestações da sepse grave, como hipoxemia e
SDRA (Wunderink et al., 2003). Assim, a sepse grave pode não significar simplesmente
um estágio inicial do choque séptico (Waterer et al., 2005).
Assim, há resultados conflitantes na literatura acerca da associação de
polimorfismos genéticos relacionados à resposta inflamatória sistêmica. Além disso, são
pouquíssimos os estudos encontrados na literatura sobre o tema na população pediátrica.
53
3. Hipótese do Estudo
Os polimorfismos de base única na região promotora do Fator de Necrose
Tumoral localizado na região -308 e no primeiro íntron da Linfotoxina-Alfa localizado
na região +252 estariam relacionados à maior gravidade de doença e pior evolução
clínica em pacientes pediátricos gravemente enfermos.
54
4. Objeto de Estudo
Associação entre polimorfismos genéticos de base única nos genes do Fator de
Necrose Tumoral (TNF) e da Linfotoxina-Alfa (LTA) e evolução clínica em pacientes
pediátricos críticos em ventilação mecânica.
55
5. Objetivo Geral
Avaliar a relação entre polimorfismos genéticos de base única nos genes do
Fator de Necrose Tumoral (TNF) e da Linfotoxina-Alfa (LTA) e a evolução clínica
de pacientes pediátricos criticamente enfermos em ventilação mecânica, em uma
unidade de terapia intensiva pediátrica pública de alta complexidade no Rio de
Janeiro.
56
6. Objetivos Específicos
1. Descrever as características demográficas de crianças saudáveis acompanhadas
pelo setor de puericultura do Instituto Fernandes Figueira / Fiocruz.
2. Descrever as características demográficas e clínicas de pacientes pediátricos
criticamente enfermos em ventilação mecânica com atenção especial à idade,
gênero, cor da pele, tempo de internação na UTI pediátrica, escores de gravidade
à admissão (PIM 2 e PRISM), presença de choque séptico, SDRA e disfunção
orgânica, mortalidade, identificação de agentes etiológicos, causa de admissão e
co-existência de doenças crônicas.
3. Avaliar as frequências genotípicas, alélicas e haplotípicas dos polimorfismos de
base única nos genes responsáveis pela codificação das citocinas inflamatórias
TNF (Posição -308) e Linfotoxina-α (Posição +252) em pacientes pediátricos
criticamente enfermos sob suporte ventilatório.
4. Avaliar as frequências genotípicas, alélicas e haplotípicas dos polimorfismos de
base única nos genes responsáveis pela codificação das citocinas inflamatórias
TNF (Posição -308) e Linfotoxina-α (Posição +252) em crianças saudáveis para
estimar as frequências dos diferentes alelos na população em geral.
57
5. Analisar a possível associação de alelos de TNF e LTA com a ocorrência de
choque séptico no grupo de pacientes.
6. Analisar a possível associação de alelos de TNF e LTA com a ocorrência de
Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) no grupo de pacientes.
7. Analisar a possível associação de alelos de TNF e LTA com a ocorrência de
óbito no grupo de pacientes.
58
7. Justificativa
A intensidade da resposta inflamatória sistêmica contribui significativamente
para a morbidade e mortalidade de pacientes em unidades de terapia intensiva, havendo
um alto nível de variação interindividual na mesma.
Respostas primárias na inflamação são mediadas por citocinas pró-inflamatórias,
como fator de necrose tumoral e interleucina-1. Por outro lado, mediadores
antiinflamatórios induzem um estado de imunossupressão na sepse, que é chamado
imunoparalisia ou anergia. Assim, as respostas pró- e anti- inflamatórias contribuem
para o desfecho de pacientes com inflamação sistêmica e sepse em humanos. Portanto,
todos os genes que codificam proteínas envolvidas na transdução de processos
inflamatórios podem ser responsabilizados pelas diferenças interindividuais na resposta
inflamatória sistêmica a uma agressão (Stüber et al., 2002).
A grande variabilidade na evolução clínica entre os pacientes diagnosticados
com sepse, choque séptico, SDRA ou DMOS gera frustração no cenário de todas as
unidades de terapia intensiva, quando pacientes com mesma idade e comorbidades, sob
a influência de fatores desencadeantes comuns, tratados pela mesma equipe de saúde
com protocolos clínicos similares evoluem de formas distintas, muitas vezes
desfavoravelmente para DMOS e êxito letal (Wheeler et al., 2001).
O estudo dos SNPs TNF -308 e LTA +252 em sepse se justifica pela
possibilidade de identificar um subgrupo de pacientes com evolução clínica distinta
através de um marcador molecular. Desta forma, pode resultar em novos estudos
59
fisiopatológicos, com o objetivo de esclarecer o mecanismo responsável pela associação
de tais genótipos com diferentes desfechos clínicos. O conhecimento da fisiopatologia
baseada em estudos moleculares e imunológicos poderá permitir a estratificação dos
pacientes com potencial de maior gravidade e, portanto, alvo de uma terapêutica mais
específica.
Seria de grande valor socio-econômico identificar, com o auxílio da
genotipagem de polimorfismos em genes relacionados à inflamação, quais populações
de pacientes apresentam um alto risco de desenvolver sepse grave e disfunção orgânica
múltipla após uma situação ou agressão que gere resposta inflamatória sistêmica.
Assim, a associação entre os genótipos estudados e graves desfechos clínicos poderia
resultar em estudos sobre a utilidade da prevenção por meio de campanhas educativas
visando diminuir a exposição infecciosa.
60
8. Metodologia
a) Linha de Pesquisa Clínica
Este estudo é recorte de um projeto maior sobre biomarcadores que vêm sendo
desenvolvido na UPG/IFF desde 2003, intitulado: “Avaliação respiratória, metabólica e
parâmetros inflamatórios em crianças submetidas à ventilação mecânica na Unidade
de Pacientes Graves do IFF-Fiocruz. Desenvolvimento de protocolos clínicos para
evidenciar marcadores prognósticos”, sob a gerência de Dra. Zina Maria Almeida de
Azevedo, coordenadora-médica da UPG/IFF. Este projeto foi atualizado junto ao
Comitê de Ética do Instituto Fernandes Figueira em novembro de 2009 sob o titulo
“Validação de protocolos clínicos para evidenciar marcadores prognósticos para a
rede de assistência ao paciente pediátrico crítico” e aprovado com registro CAAE
0032.0.008.000-09.
b) Instituições e Setores onde foi realizado o estudo:
A Unidade de Pacientes Graves (UPG) do IFF/Fiocruz é uma unidade de terapia
intensiva pediátrica pública, conveniada ao Sistema Único de Saúde (SUS), que possui
capacidade de seis leitos e atende pacientes na faixa etária de um mês a dezessete anos
de vida, portadores das mais variadas patologias clínicas e cirúrgicas. É uma unidade de
terapia intensiva pediátrica de alta complexidade, bem equipada, com média
ocupacional de 190 pacientes ao ano e taxa de mortalidade de 6,8%, comprometida com
ensino e pesquisa. A internação na UPG ocorre a partir da demanda interna dos
61
ambulatórios de pediatria e de especialidades pediátricas, enfermarias de pediatria e
cirurgia, centro cirúrgico, Berçário de Alto Risco e Unidade Intermediária. A demanda
externa é proveniente da rede de assistência do SUS cujos pacientes são referidos pela
central de regulação de vagas ou pela solicitação direta de profissionais de saúde das
unidades públicas ou, em menor proporção, pelas unidades privadas.
O IFF foi a instituição em que foram acompanhados todos os indivíduos estudados,
onde foram coletadas amostras e registrados os dados clínicos dos pacientes e crianças
saudáveis incluídos no estudo. Para os pacientes criticamente enfermos, a origem foi a
UPG. Para as crianças saudáveis, a origem foram os ambulatórios de pediatria,
puericultura e cirurgia pediátrica.
Para estudos de genotipagem e outras análises laboratoriais, amostras coletadas e
processadas no Laboratório de Fisiopatologia Humana (IFF/Fiocruz) foram submetidas
a estudos moleculares no Laboratório de Hanseníase do Instituo Oswaldo Cruz
(IOC/Fiocruz).
c) Desenho de Estudo:
Trata-se de um estudo prospectivo de corte transversal, relativo às frequências de
diferentes alelos identificados por SNPs nas posições -308 do gene do TNF e na posição
+252 do gene da LTA, a partir de uma amostra de conveniência de pacientes internados
na UPG e submetidos à ventilação mecânica. Os dados genotípicos encontrados foram
correlacionados com características demográficas e clínicas dos pacientes e crianças
saudáveis.
62
d) População:
Foram incluídos no estudo pacientes pediátricos criticamente enfermos submetidos à
ventilação mecânica, compreendendo a faixa etária de um mês a adolescentes de até
dezessete anos, recrutados na UPG, de janeiro de 2003 a dezembro de 2009.
O grupo de crianças saudáveis também compreendeu a faixa etária de um mês a
dezessete anos, sendo constituído de crianças provenientes do ambulatório de
puericultura e submetidas a cirurgias eletivas tais como correção de fimose, hérnia
inguinal/umbilical, criptorquidia. Foram excluídos todos os portadores de doenças
crônicas ou em investigação clínica para diagnóstico das mesmas, além de crianças que
eram filhos dos mesmos pais. Esta escolha teve o intuito de conhecer a prevalência de
tais polimorfismos em crianças provenientes de uma amostra similar, isto é,
freqüentadoras do IFF/Fiocruz e evitar confundimento nas frequências genotípicas em
questão.
O cálculo da amostra baseou–se no número de internações/ano da UPG, sendo
considerada também a freqüência do alelo A para o SNP TNF −308 na população
brasileira, que está em torno de 13% (Visentainer et al., 2008) e do alelo A para o SNP
LTA +252, que está em torno de 57,4% (Roxo et al., 2003).
63
e) Classificação de Crianças e Pacientes incluídos no Estudo
i. Classificação Demográfica
As crianças foram classificadas conforme gênero, idade e cor da pele. A idade foi
analisada inicialmente em meses, através de média e mediana, sendo posteriormente
agrupada em faixas etárias, conforme determinação da Organização Mundial de Saúde:
Lactentes (0 a 2 anos), Pré-Escolares (2 a 6 anos), Escolares (6 a 10 anos) e
Adolescentes (a partir de 10 anos).
Foi realizada a classificação da raça das crianças conforme determinação do IBGE
(2008) em Brancos, Pardos, Negros, Amarelos e Índios. Devido à ausência de crianças
indígenas e presença de apenas um paciente no grupo amarelo, as crianças pardas,
negras e amarelas foram analisadas em conjunto, sendo o grupo dividido entre Brancos
e Não-Brancos.
ii. Classificação Clínica dos Pacientes
Procedeu-se a classificação dos pacientes segundo os critérios estabelecidos para
SIRS, Sepse, Sepse Grave e Choque Séptico, de acordo com o Consenso Internacional
Pediátrico de Sepse (Goldstein et al., 2005) – Anexo C, cujos critérios também foram
utilizados para a classificação de disfunção orgânica. O número de disfunções
64
identificadas fundamentou a divisão em faixas conforme o número de órgãos
acometidos (até 2 órgãos e 3 ou mais órgãos).
Os pacientes incluídos no estudo foram ventilados de acordo com a faixa etária e
com a patologia desencadeante da insuficiência respiratória nos seguintes respiradores:
Inter 3, Inter 5, Intermed plus, Bird 8400 STi- volume ventilator, Bird 8400 STi flow
support/pressure control/VAPS e Servo-i.
Em relação à lesão pulmonar, os pacientes foram classificados em LPA e SDRA
conforme o Consenso de SDRA (Bernard et al., 1994), além de analisado o Escore de
Murray (Murray et al., 1988). Aqueles pacientes que preencheram critérios para LPA,
mas se encontravam sob ventilação mecânica foram definidos como suporte, enquanto
os que apresentaram edema pulmonar cardiogênico ou hiperfluxo pulmonar foram
classificados como cardiogênicos, já que apesar de necessitarem ventilação mecânica,
sua condição clínica invalidava a classificação da injúria pulmonar.
O tempo de internação na UPG foi definido em dias, sendo apresentado através de
média e mediana e agrupado em duas diferentes faixas: internação curta (0 a7 dias) e
internação prolongada (acima de 7 dias).
Os escores prognósticos PIM e PRISM foram calculados para a avaliação de
probabilidade de óbito nos pacientes, sendo os resultados categorizados em duas faixas:
de menor gravidade (0 a 15%) e de maior gravidade (acima de 15%).
Os pacientes foram categorizados quanto à presença ou ausência de doenças de base
preexistentes, sendo as mesmas, quando detectadas, agrupadas segundo o sistema
orgânico predominantemente acometido.
65
O diagnóstico primário principal de cada paciente foi classificado segundo o CID-
10, conforme a causa de admissão na UPG/IFF. O tipo de internação também foi
categorizado em origem clínica ou cirúrgica.
Os agentes etiológicos identificados foram descritos como bactérias, vírus, fungos,
parasitas e micobactérias, sendo as bactérias subdivididas em gram-positivas e gram-
negativas.
f) Análise pelo Comitê de Ética
O projeto atual, recorte do projeto principal anteriormente descrito, intitulado:
“Correlação entre polimorfismos genéticos do Fator de Necrose Tumoral e
Linfotoxina-alfa e evolução clínica em pacientes pediátricos sépticos sob ventilação
mecânica” foi submetido novamente ao Comitê de Ética em Pesquisa do IFF/Fiocruz,
sendo aprovado com Registro CAAE: 00710.008.000-09; No da Folha de Rosto:
285276; Registro CEP: 007109; Parecer 071/2009.
As amostras de pacientes ou crianças saudáveis somente foram coletadas após a
obtenção da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
(Anexos A e B) pelos responsáveis pelas crianças e foram aprovados pelo CEP
previamente ao início de sua utilização, quando o projeto principal foi submetido à
avaliação pelo comitê.
Os TCLE foram lidos e explicados com detalhes aos responsáveis pelos
pacientes elegíveis para o estudo e foram elucidadas todas as dúvidas a respeito da
66
pesquisa, bem como disponibilizados contatos telefônicos e eletrônicos do pesquisador
responsável pelo projeto. A aplicação do termo de consentimento foi realizada por
médicos-residentes e plantonistas da UPG treinados para a realização do mesmo. Os
responsáveis que consentiram com a participação do paciente no estudo assinaram o
termo de consentimento em duas vias, ficando uma via em seu poder e a outra anexada
ao protocolo do projeto e foram contactados posteriormente para esclarecimento acerca
dos resultados obtidos.
No grupo controle, como as amostras foram coletadas no mesmo dia das
consultas de puericultura ou pré-operatória para cirurgias eletivas no ambulatório de
cirurgia pediátrica, não foi necessário o comparecimento do paciente ao Instituto
Fernandes Figueira com propósito único de participar da pesquisa clínica.
g) Coleta e Processamento do Material:
i) Coleta das Amostras
1. Grupo de Pacientes
Foram coletados aproximadamente 2,0mL de sangue dos pacientes nas primeiras
24h de admissão na UPG, em tubos contendo EDTA, sendo devidamente etiquetados e
numerados de acordo com o banco de dados especialmente desenvolvido para o projeto.
Em seguida, as amostras foram congeladas a -20º C em freezer no Laboratório Geral do
IFF/Fiocruz. A coleta foi realizada por médicos-residentes e plantonistas da Unidade de
67
Pacientes Graves devidamente treinados para realizar tal tarefa, juntamente com os
exames rotineiramente coletados na admissão de qualquer paciente criticamente
enfermo em uma UTI, não necessitando punção venosa periférica exclusivamente para a
coleta de amostra para o estudo.
Nas crianças que receberam hemotransfusão nos 28 dias que antecederam a
internação na UPG, foram coletadas duas amostras de swab de mucosa oral ou jugal,
também devidamente etiquetadas e numeradas, sendo posteriormente congeladas e
armazenadas a -20oC no freezer do Laboratório Geral do IFF/Fiocruz, a fim de evitar
interferência nos resultados secundária à transfusão de sangue exógeno.
2. Grupo de Crianças Saudáveis
As amostras das crianças saudáveis foram coletadas através de dois swabs de
mucosa oral ou jugal, nos Ambulatórios de Cirurgia Infantil e Puericultura do IFF, pela
equipe de pesquisa da UPG, identificadas e estocadas a -20ºC no freezer do Laboratório
Geral do IFF. Em seguida, as amostras foram etiquetadas e numeradas conforme banco
de dados desenvolvido pela equipe de pesquisa da unidade.
ii) Processamento das Amostras, Extração de DNA e Genotipagem
As amostras de pacientes e crianças saudáveis devidamente etiquetadas e numeradas
foram enviadas para o Laboratório de Fisiopatologia Humana do IFF/Fiocruz, onde foi
realizada a extração do DNA.
68
Os protocolos de extração de DNA de células da mucosa oral coletadas com swab e
a partir de amostras de sangue estão descritos nos Anexos D e E, em formato de
Procedimento Operacional Padrão (POP).
Após processamento e extração, as amostras de DNA foram posteriormente
transferidas para o Laboratório de Hanseníase do Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz, onde
foi efetuada a genotipagem do material por um profissional biomédico especialista.
A determinação do SNP LTA +252 foi realizada através da técnica de PCR-RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e está descrita no Anexo D, em formato
de POP.
A determinação do SNP TNF -308 foi realizada inicialmente através de PCR-RFLP
e posteriormente pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
(PCR-RT), ambas descritas no Anexo E, em formato de POP.
h) Variáveis analisadas
Foram avaliadas as seguintes variáveis clínicas e demográficas a partir de revisão de
banco de dados construído no programa Microsoft® Access 2000, versão 9.0.2812:
• Gênero
o Masculino e Feminino
• Cor da Pele
o Brancos e Não-Brancos
• Idade
o Lactentes, Pré-escolares, Escolares e Adolescentes
69
• Tempo de internação na UTI Pediátrica
o Faixas: 0 a 7 dias e acima de 7 dias
• Escores prognósticos PIM II e PRISM I
o Faixas: 0 a 15% e acima de 15%
• Doença de base preexistente
• Tipo de Internação
o Clínica ou Cirúrgica
Diagnóstico primário principal
Gravidade do quadro infeccioso
o Sepse, Sepse Grave e Choque Séptico
Agentes etiológicos isolados
o Bactérias, Vírus, Fungos, Parasitas ou Micobactérias
o Subdivisão em Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
Grau de disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (DMOS)
o Faixas: 0 a 2 órgãos ou acima de 3 órgãos acometidos
Classificação da insuficiência respiratória
o LPA ou SDRA
Evolução clínica
o Altas e Óbitos
Foram também analisadas as frequências dos diferentes alelos definidos para os
genes de TNF e LTA com base nos SNPs em TNF -308 e LTA +252.
70
i) Análise Estatística
Todos os dados foram coletados em formulário padronizado e transferidos para
banco de dados desenvolvido para o projeto no Microsoft® Access 2000, versão
9.0.2812. A planilha gerada pelo Access foi formatada para Excell (versão Windows
Vista) e os dados e gráficos foram gerados a partir desta.
Foram calculadas as freqüências genotípicas, alélicas e haplotípicas para LTA +252
e TNF -308 em todas as crianças. Os pacientes portadores do alelo TNF -308 A, além de
analisados individualmente como heterozigotos e homozigotos, também foram
agrupados e analisados em conjunto, sendo denominados carreadores A. Para a LTA
+252, foram agrupados os pacientes portadores do alelo G, sendo analisados como
carreadores G, além de analisados os alelos A e genótipos individualmente.
Foram utilizados como referência para a análise estatística o homozigoto GG
para o TNF -308 e o homozigoto AA para o LTA +252, além dos alelos G para o TNF -
308 e A para a LTA +252, baseados em sua maior frequência em populações e estudos
descritos na literatura.
Para analisar se as frequências genotípicas estabelecidas correspondiam às
esperadas pela Lei de Hardy-Weinberg, foi realizado o Teste χ2 no grupo de crianças
saudáveis e pacientes, sendo consideradas em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) as
populações que apresentaram resultados abaixo de 3,84.
Variáveis quantitativas foram apresentadas como médias aritméticas, desvios-
padrão e medianas. O Teste χ2 foi utilizado para analisar as diferenças nas variáveis
71
demográficas categóricas (idade, gênero e cor da pele) entre as crianças saudáveis e os
pacientes da UPG e para avaliar as variáveis clínicas categóricas (tempo de internação,
escores prognósticos, doença de base, gravidade do quadro infeccioso, grau de lesão
pulmonar, grau de disfunção orgânica e evolução clínica) dentro do grupo de pacientes
da UPG.
Foram realizadas análises estatísticas contemplando genótipos, carreadores,
alelos e haplótipos. A Razão de Chances (OR - Odds Ratio), com Intervalos de
Confiança de 95% (95% IC), foi obtida através dos modelos de regressão logística
GLM e LRM (do inglês “generalized linear model” e “logistic regression model”),
controlando os potenciais fatores de confundimento: cor da pele, idade, gênero e doença
de base.
As freqüências haplotípicas foram estimadas através do método de Máxima
Verossimilhança e comparadas através do mesmo modelo de regressão logística
conduzidos para cada SNP isoladamente.
A presença de um desequilíbrio de ligação foi avaliada através do método
estatístico R2, utilizando freqüências genotípicas de pacientes e crianças saudáveis.
Foram considerados estatisticamente significativos resultados com P-valor <
0.05.
Todos as análises foram realizadas utilizando o programa estatístico R (The R
Foundation for Statistical Computing, versão 2.10.0, 2009 – CRAN Fiocruz/RJ), com
os pacotes “genetics” e “haplo.stats”, com a colaboração da equipe do Laboratório de
Hanseníase do IOC/Fiocruz.
73
9. Resultados
Seção 1 – Pacientes e Crianças Saudáveis – Variáveis Demográficas e Frequências
Alélicas, Genotípicas e Haplotípicas
De Janeiro de 2003 a Dezembro de 2009 foram internados 1342
pacientes na Unidade de Pacientes Graves do IFF/Fiocruz, sendo a média durante este
período de 191,7 pacientes/ano e a taxa de óbitos de 15,5 óbitos/ano. Destes, foram
elegíveis para o estudo apenas pacientes que necessitaram suporte ventilatório invasivo
e cujos responsáveis autorizaram a sua inclusão no projeto de pesquisa. Foram
considerados como perdas 96 pacientes elegíveis que não foram incluídos por
impossibilidade de obtenção da autorização ou que foram incluídos e cujas amostras se
extraviaram ou contaminaram.
Assim, foram incluídos 455 pacientes no estudo, 9 dos quais foram depois
excluídos por apresentarem doenças relacionadas ao sistema imunológico (2 lactentes
expostos ao HIV, 6 portadores de SIDA e 1 pré-escolar com imunodeficiência
congênita). Ainda, observou-se que apenas 22 não apresentavam sepse (11 pacientes
SIRS e 11 não-SIRS/não-sepse), sendo os mesmos excluídos devido ao pequeno grupo
amostral para análise de frequências genotípicas. Desta forma, foram incluídos no
estudo 424 pacientes pediátricos sépticos criticamente enfermos, ventilados
invasivamente.
74
Paralelamente, foram coletadas amostras de 590 crianças saudáveis. Deste
grupo, foram subsequentemente excluídas 37 crianças portadoras de doença de base,
totalizando 553 crianças saudáveis.
Em relação ao gênero, não foi observada diferença estatisticamente significativa
entre o grupo de pacientes e crianças saudáveis, no referente à proporção entre os
gêneros masculino e feminino, nem em relação à classificação por cor da pele (tabela 2).
A mediana de idade dos pacientes avaliados foi de 11 meses, sendo o intervalo
de 1 mês a 16 anos e 4 meses (196 meses). A média de idade foi de 31,7 meses. Após a
estratificação dos pacientes em faixas etárias, observou-se um predomínio importante de
lactentes nos dois grupos. A mediana de idade das crianças saudáveis foi de 8 meses,
sendo o intervalo de 1 a 16 anos e 7 meses (199 meses) e a média de 19,6 meses. Após
análise estatística com o teste χ2, observou-se diferença significativa entre o grupo de
pacientes e crianças saudáveis quanto à distribuição em faixas etárias (p<0.000003)
(tabela 2).
No grupo de crianças saudáveis foram genotipadas 547 amostras a partir de
material obtido por coleta de swab oral e 6 amostras de DNA extraído a partir de
sangue. Destas 553 crianças saudáveis, 548 amostras foram genotipadas para TNF -308
e 238 para LTA +252. A distribuição dos genótipos correspondentes a cada um destes
polimorfismos encontrava-se dentro das freqüências esperadas com base no Equilíbrio
de Hardy-Weinberg. Nas crianças saudáveis, o polimorfismo relacionado à posição TNF
-308 mostrou predominância do genótipo GG (81%). A análise do polimorfismo
relacionado à posição LTA +252 mostrou proporções comparáveis do genótipo AA
(41%) e do genótipo GA (47%) (tabela 3).
75
Tabela 2: Características demográficas de crianças saudáveis e pacientes internados na UPG / IFF sob ventilação mecânica.
Características Crianças Saudáveis n (%)
Pacientes UPG n (%)
P‐valor#
Total de Indivíduos 553 424
Gênero
Masculinos 286 (0.52) 229 (0.54)
Femininos 267 (0.48) 195 (0.46)
p = 0.52
Cor da Pele
Brancos 264 (0.48) 210 (0.49)
Não‐Brancos 289 (0.52) 214 (0.51)
p = 0.62
Idade
Lactentes 437 (0.79) 281 (0.66)
Pré‐Escolares 77 (0.14) 70 (0.16)
Escolares 26 (0.05) 45 (0.11)
Adolescentes 13 (0.02) 28 (0.07)
p < 0,000003
#Valor de p associado ao Teste χ2 (Pearson).
No grupo de pacientes foram genotipadas 153 amostras a partir de material
obtido por coleta de swab oral e 271 amostras a partir de DNA extraído de sangue.
Destes 424 pacientes incluídos no estudo, 410 amostras foram genotipadas para TNF -
308 e 355 foram genotipadas para LTA +252. A distribuição dos genótipos de LTA +252
mostrou estar dentro das freqüências esperadas com base no Equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Contudo, isto não foi observado com os genótipos de TNF -308, visto que o
χ2 foi superior a 3,841, não estando esta população em EHW, no referente a este
polimorfismo. Nos pacientes, a análise do polimorfismo relacionado à posição TNF -
76
308 mostrou predomínio do genótipo GG (79%). Já a análise do polimorfismo
relacionado à posição LTA +252 mostrou frequências próximas entre o genótipo AA
(36%) e o genótipo GA (48%) (tabela 3).
Quando comparadas as frequências de genótipos entre o grupo de crianças
saudáveis e o grupo de pacientes, não foi observada diferença estatisticamente
significativa nem para o LTA +252, nem para o TNF -308, como se observa na tabela 3.
Não houve alteração nos resultados quando as análises foram refeitas com ajuste para as
covariáveis de gênero, raça, idade e doença crônica. O padrão de risco para o
desenvolvimento de sepse sugerido pelos genótipos TNF -308 AA e LTA +252 GG não
alcançou significância estatística. A comparação das frequências dos demais genótipos,
alelos, carreadores e haplótipos entre o grupo de pacientes e o de crianças saudáveis está
detalhada na tabela 3.
Foi analisado o Desequilíbrio de Ligação entre LTA +252 e TNF -308 nos
pacientes e nas crianças saudáveis. Para os pacientes, o D’ foi de 0,8006 e o R2 =
0,1282. Já nas crianças saudáveis, o D’ foi de 0,8193 e o R2 =0,1377, o que indica a
ausência de desequilíbrio de ligação entre os SNPs em ambos os grupos.
77
Tabela 3: Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF ‐308 e LTA +252 de crianças saudáveis e pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Genótipo / Alelo Crianças Saudáveis
n (%) Pacientes UPG
n (%) OR (IC 95%; p‐valor) OR (IC 95%; p‐valor)*
TNF ‐308
GG 443 (0.81) 324 (0.79) Referência Referência
GA 98 (0.18) 76 (0.19) 1.06 (0.76 – 1.48; p = 0.73) 1.12 (0.80 – 1.57; p = 0.49)
AA 7 (0.01) 10 (0.02) 1.95 (0.74 – 5.19; p = 0.18) 1.84 (0.68 – 4.96; p = 0.23)
Total# 548 410 p‐global = 0,3847 p‐global = 0,3847
Alelo A 112 (0.10) 96 (0.12) 1.16 (0.77 – 1.75; p = 0.46) 1.20 (0.80 – 1.82; p = 0.38)
Alelo G 984 (0.90) 724 (0.88) Referência Referência
Carreador A
105 (0.19) 86 (0.21) 1.12 (0.81 – 1.54; p = 0.49) 1.17 (0.85 – 1.62; p = 0.33)
LTA +252
AA 115 (0.41) 129 (0.36) Referência Referência
GA 134 (0.47) 169 (0.48) 1.12 (0.80 – 1.58; p = 0.50) 1.09 (0.77 – 1.53; p = 0.63)
GG 34 (0.12) 57 (0.16) 1.49 (0.91 – 2.45; p = 0.11) 1.49 (0.90 – 2.44; p = 0.12)
Total## 283 355 p‐global = 0,2739 p‐global = 0,2739
Alelo A 364 (0.64) 427 (0.60) Referência Referência
Alelo G 202 (0.36) 283 (0.40) 1.19 (0.86 – 1.65; p = 0.28) 1.18 (0.85 – 1.64; p = 0.31)
Carreador G
168 (0.59) 226 (0.64) 1.20 (0.87 – 1.65; p = 0.27) 1.17 (0.84 – 1.65; p = 0.35)
Haplótipos
+252 A / ‐308 A 0,01141 0,01417 0.64 (0.20 – 2.04; p = 0.45) 0.69 (0.21 – 2.25; p = 0.58)
+252 A / ‐308 G 0,62380 0,58892 Referência Referência
+252 G / ‐308 A 0,09106 0,10316 0.69 (0.46 – 1.03; p = 0.07) 0.68 (0.45 – 1.01; p = 0.06)
+252 G / ‐308 G 0,27373 0,29375 0.87 (0.67 – 1.13; p = 0.29) 0.89 (0.68 – 1.16; p = 0.39)
*OR e p‐valores adjustados para as covariáveis gênero, raça e idade. # 5 Crianças Saudáveis e 14 Pacientes não foram genotipados para TNF ‐308. ## 270 Crianças Saudáveis e 69 Pacientes não foram genotipados para LTA +252.
78
Seção 2 – Pacientes – Apresentação e Evolução Clínica
Os 424 pacientes incluídos no estudo apresentavam sepse, sendo que 63%
preencheram os critérios para choque séptico. Em relação à frequência dos vários tipos
de lesão pulmonar, houve predomínio da incidência de lesão pulmonar aguda, seguida
de síndrome do desconforto respiratório agudo. O tempo médio de internação dos
pacientes foi de 14,5 dias, sendo a mediana de 10 dias. Foi observado um predomínio de
tempos de internação maiores que sete dias (tabela 4).
Os escores prognósticos PIM e PRISM foram apresentados em duas faixas de
probabilidade de óbitos: de 0-15% e > 15%, tendo sido observado predomínio da faixa
de 0-15% para ambos os escores prognósticos como apresentado na tabela 4.
Os pacientes com disfunção de múltiplos órgãos e sistemas foram distribuídos de
forma semelhante nas duas faixas agrupadas e o principal órgão em disfunção foi o
aparelho respiratório, seguido do cardiovascular, conforme demonstrado na figura 6.
Em relação ao desfecho clínico, 8% dos pacientes incluídos no estudo evoluíram para o
óbito (tabela 4).
Figura 6 – Frequência de disfunções orgânicas nos pacientes incluídos no estudo.
79
Tabela 4: Características clínicas de pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Características
Pacientes n (%)
Total de Indivíduos 424
Gravidade da Sepse
Sepse 78 (0.19)
Sepse Grave 77 (0.18)
Choque Séptico 269 (0.63)
Lesão Pulmonar
Suporte 35 (0.08)
LPA 244 (0.57)
SDRA 121 (0.28)
Cardiogênico 24 (0.07)
PIM#
0 a 15% 335 (0.84)
> 15% 66 (0.16)
PRISM##
0 a 15% 330 (0.78)
> 15% 93 (0.22)
Tempo de Internação
0 a 7 dias 161 (0.38)
> 7 dias 263 (0.62)
Faixas de DMOS
0 a 2 órgãos 243 (0.57)
≥ 3 órgãos 181 (0.43)
Evolução
Alta 388 (0.92)
Óbito 36 (0.08)
# 23 Pacientes não tiveram o escore PIM calculado. ##1 Paciente não teve o escore PRISM calculado.
80
Dos 424 pacientes incluídos no estudo, 49% eram portadores de doenças
crônicas não relacionadas ao sistema imunológico. Não foi observado predomínio
específico de doenças de base, sendo as categorias mais frequentes, com valores muito
próximos, as afecções do sistema gastrointestinal, as neurológicas e as doenças
genéticas, conforme descreve a figura 7.
Figura 7 – Frequência das doenças de base dos pacientes incluídos no estudo.
Os pacientes também foram avaliados quanto à causa de admissão, sendo
divididos entre pacientes clínicos e cirúrgicos. Foram incluídas no grupo cirúrgico todas
as patologias que necessitaram intervenção cirúrgica, apesar de apresentarem
concomitantemente sepse, como apendicite, invaginação intestinal, enterocolite
necrosante; bem como pacientes que se submeteram a cirurgias eletivas e evoluíram
com infecção secundária, como transposição gástrica, abdominoplastia, rebaixamento
de cólon, entre outras. No entanto, apesar do grupo cirúrgico incluir sepse primária e
secundária, ainda assim houve predomínio de internações clínicas (80%), denotando o
perfil de pacientes da unidade como principalmente clínico.
81
As principais causas de internação foram as doenças do sistema respiratório, que
incluíram pneumonia bacteriana, bronquiolite, pneumonia viral, DPOC com agudização
por infecção respiratória aguda, pós-operatório de cirurgias torácicas, como
transposição gástrica, entre outras doenças. No entanto, dentre os pacientes estudados, o
diagnóstico mais frequente foi Pneumonia Comunitária. A figura 8 apresenta as
principais causas de internação dos pacientes incluídos no estudo.
Outras doenças infecciosas compreendiam as sepses de origem não específica,
varicela, artrite piogênica, piodermite, tétano, meningococcemia, febre hemorrágica e
choque devido ao vírus da dengue, entre outras. As doenças gastrointestinais
compreendiam peritonite aguda, apendicite, volvo, invaginação intestinal, obstrução
intestinal aguda, gastroenterites e pós-operatório de cirurgias abdominais. As doenças
neurológicas incluiam as meningites, encefalites, abscessos cerebrais, disfunção de
shunt ventriculo-peritonial e hipertensão intracraniana, entre outras (figura 8).
Foram agrupados no grupo de pacientes onco-hematológicos aqueles em pós-
operatório de tumores neurocirúrgicos, abdominais e de mediastino. As doenças do
sistema cardiovascular compreendiam as miocardites e insuficiências cardíacas
congestivas em portadores de cardiopatias congênitas. Os pacientes com intoxicações
exógenas, síndrome de maus tratos, afogamento, choque secundário a complicações
anestésicas foram agrupados como miscelânia (figura 8).
82
Figura 8 – Diagnósticos principais à admissão na UPG
Foram identificadas 32% de culturas positivas para bactérias, sendo metade
gram-positivas e metade gram-negativas. 17% dos pacientes estudados tiveram vírus
isolados. A figura 9 descreve os principais tipos de germe isolados nos pacientes
durante a internação na UPG.
Figura 9 – Germes isolados durante a internação dos pacientes incluídos no estudo.
83
A tabela 5 compara os pacientes que não apresentaram SDRA com os que
apresentaram e destes, os que sobreviveram com os que evoluíram para o óbito. Não
houve diferença estatisticamente significativa na distribuição de cor da pele, gênero,
idade e doença de base entre nenhum dos grupos comparados.
Dentre os pacientes que apresentaram SDRA, nenhum apresentou sepse apenas,
já que pela definição do Consenso Internacional de 2005, qualquer paciente que
preencha critérios clínicos para sepse e SDRA já será classificado como sepse grave. Ao
analisar a gravidade da sepse distribuída como sepse grave e choque séptico no grupo
SDRA e no grupo que não apresentou SDRA não houve diferença estatisticamente
significativa, assim como entre sobreviventes e não-sobreviventes com SDRA. No
entanto, o grupo SDRA apresentou mais disfunções orgânicas que o grupo não SDRA
(p=0.00025), sendo o mesmo observado entre os pacientes SDRA que evoluíram para o
óbito quando comparados aos que sobreviveram (p=0.0009) – Tabela 5.
Houve diferença do tempo de internação entre os grupos, sendo mais prolongado
entre os pacientes com SDRA, quando comparado com os que não apresentaram SDRA
(p=0.0029). Entretanto, o tempo de internação dos pacientes com SDRA que evoluíram
para óbito foi mais breve (0 a 7 dias) quando comparado aos sobreviventes
(p=0.00000001) (tabela 5). Em relação à causa de internação, o sistema respiratório
predominou nos pacientes com SDRA, em comparação com os pacientes que não
apresentaram SDRA (p=0.0008).
Ao se avaliar os escores PIM e PRISM dentre os pacientes com SDRA que
evoluíram para o óbito, não houve diferença na distribuição entre as duas faixas de
gravidade estabelecidas para o PIM e para o PRISM. No entanto, houve diferença
84
estatisticamente significativa na distribuição das faixas do escore PIM entre pacientes
com SDRA que sobreviveram e que não sobreviveram (p=0.0019), o que não foi
observado em relação ao escore PRISM (tabela 5).
A tabela 6 compara os pacientes que apresentaram choque séptico com os que
não apresentaram, em relação às características demográficas e clínicas, como também
compara pacientes com choque que evoluíram para o óbito, com os que sobreviveram.
As frequências de cor da pele, gênero, idade e doença crônica não apresentaram
diferenças estatisticamente significativas em nenhuma destas comparações.
Os pacientes com choque séptico apresentaram frequência maior de SDRA do
que os que não apresentaram choque (p< 0.000008), sendo o mesmo observado entre os
pacientes com choque séptico que não sobreviveram. Também houve maior frequência
de disfunções orgânicas no grupo com choque séptico e no grupo de não-sobreviventes
com choque (tabela 6).
A distribuição da probabilidade de óbito nas duas faixas: 0-15% e >15% para os
escores PIM e PRISM foi semelhante no grupo de não sobreviventes. No entanto, esta
distribuição foi diferente entre os sobreviventes e também quando estes foram
comparados aos não sobreviventes, mostrando predominio da distribuição de ambos os
escores na faixa de 0-15% nos sobreviventes, como pode ser observado na tabela 6.
Não houve diferença significativa em relação ao tempo de internação na UTI
Pediátrica entre pacientes com e sem choque, porém 84% dos pacientes com choque
séptico que evoluíram para óbito tiveram tempo de internação menor ou igual a 7 dias
(p<0.0000003).
85
Tabela 5: Características clínicas de pacientes com insuficiência respiratória aguda, sobreviventes e óbitos em SDRA, internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Desenvolvimento de SDRA Mortalidade na SDRA
Características Não‐SDRA
n (%)
SDRA
n (%)
P‐valor Sobreviventes
n (%)
Não‐Sobreviventes
n (%)
P‐valor####
Total de Indivíduos 303 (0.71) 121 (0.29) 99 (0.82) 22 (0.18)
Gravidade da Sepse#
Sepse Grave 54 (0.18) 23 (0.19) 22 (0.22) 1 (0.05)
Choque Séptico 171 (0.56) 98 (0.81)
p = 0.35
77 (0.78) 21 (0.95)
p = 0.11
DMOS
0 a 2 órgãos 191 (0.63) 52 (0.43) 50 (0.51) 2 (0.09)
≥ 3 órgãos 112 (0.37) 69 (0.57)
p = 0,00025
49 (0.49) 20 (0.91)
p = 0.00093
Tempo de Internação
0 a 7 dias 129 (0.43) 32 (0.26) 15 (0.15) 17 (0.77)
> 7 dias 174 (0.57) 89 (0.74)
p = 0,0029
84 (0.85) 5 (0.23)
p = 0.00000001
Causa de Internação
Respiratória 139 (0.46) 78 (0.64) 71(0.72) 7 (0.32)
Outros Sistemas 164 (0.54) 43 (0.36)
p = 0,0008
28 (0.28) 15 (0.68)
p = 0,000003
PIM##
0 a 15% ‐ ‐ 75 (0.81) 10 (0.45) p = 0.0019
> 15% ‐ ‐
‐
18 (0.19) 12 (0.55)
PRISM###
0 a 15% ‐ ‐ 72 (0.73) 11 (0.50) p = 0.068
> 15% ‐ ‐
‐
27 (0.27) 11 (0.50)
# O grupo Não‐SDRA apresentou 78 Pacientes com sepse apenas (26%), porém não demonstrados na tabela para comparação com o grupo SDRA, já que Sepse associado a SDRA já define Sepse Grave. ##17 Pacientes sem SDRA e 6 Pacientes com SDRA não tiveram o escore PIM calculado. 6 Pacientes com SDRA Sobreviventes não tiveram o escore PIM calculado. ###1 Paciente sem SDRA não teve o escore PRISM calculado. ####Valor de p associado ao Teste χ2 (Qui‐Quadrado).
86
Em relação à existência de uma doença crônica, houve diferença significativa
entre os pacientes que apresentaram choque séptico e os sem choque (45% vs 56%,
respectivamente; p=0.04). No entanto, esta diferença não foi observada com relação ao
desfecho óbito entre os pacientes com choque séptico (tabela 6).
Devido ao fato de ter sido encontrada uma diferença estatísticamente
significativa entre o grupo de pacientes com e sem choque em relação à presença de
doença de base, foi realizada estratificação destes em dois subgrupos para análise
genotípica. Como não houve diferença estatística entre a presença ou ausência de
doença de base no grupo choque e não-choque em relação aos genótipos, alelos,
carreadores e haplótipos, foi apresentada a análise no grupo completo sem estratificação
para doença de base, sendo a mesma apenas utilizada como covariável.
A tabela 7 compara dentre todos os pacientes, aqueles que sobreviveram com os
que não sobreviveram. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois
grupos no referente à classificação por cor da pele, gênero e idade e nem quanto à
presença de uma doença crônica . Já a distribuição das categorias de gravidade de sepse
foi significativamente diferente entre os sobreviventes e os não-sobreviventes
(p=0.0045). O mesmo padrão foi observado em relação ao tipo de lesão pulmonar, com
predomínio de SDRA no grupo de não-sobreviventes e de LPA no grupo de
sobreviventes (p=0.000013) - Tabela 7.
87
Tabela 6: Características clínicas de pacientes com e sem choque séptico, sobreviventes e óbitos em choque séptico, internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Desenvolvimento de Choque Mortalidade no Choque
Características Não‐Choque
n (%) Choque n (%)
P‐valor Altas n (%)
Óbitos n (%)
P‐valor###
Total de Indivíduos 155 (0.37) 269 (0.63) 238 (0.88) 31 (0.12)
Lesão Pulmonar
Suporte 19 (0.12) 16 (0.06) 16 (0.07) 0 (0.00)
LPA 106 (0.68) 138 (0.51) 132 (0.55) 6 (0.19)
SDRA 23 (0.15) 98 (0.36)
p < 0.000008
77 (0.32) 21 (0.68)
Cardiogênico 7 (0.05) 17 (0.06) 13 (0.06) 4 (0.13)
p = 0.00011
DMOS
0 a 2 órgãos 138 (0.89) 105 (0.39) 101 (0.42) 4 (0.13)
≥ 3 órgãos 17 (0.11) 164 (0.61) p < 0.0000001
137 (0.58) 27 (0.87) p = 0.0029
Tempo de Internação
0 a 7 dias 55 (0.35) 106 (0.39) 80 (0.34) 26 (0.84)
> 7 dias 100 (0.65) 163 (0.61)
p = 0,49
158 (0.66) 5 (0.16)
p < 0,0000003
Doença de Base
Sim 87 (0.56) 122 (0.45) 108 (0.45) 14 (0.45)
Não 68 (0.44) 147 (0.55)
p = 0.04
130 (0.55) 17 (0.55)
p = 0.87
PIM
0 a 15% ‐ ‐ 191 (0.85) 17 (0.57)
> 15% ‐ ‐
‐
34 (0.15) 13 (0.43)
p = 0.00047
PRISM
0 a 15% ‐ ‐ 187 (0.79) 15 (0.48)
> 15% ‐ ‐
‐
51 (0.21) 16 (0.52)
p = 0.00059
# 9 Pacientes sem Choque Séptico e 14 Pacientes com Choque Séptico não tiveram o escore PIM calculado. 1 Paciente com Choque Séptico que não sobreviveu e 13 Pacientes com Choque Séptico que sobreviveram não tiveram o escore PIM calculado. ##1 Paciente sem choque séptico não teve o escore PRISM calculado. ###Valor de p associado ao Teste χ2 (Qui‐Quadrado).
88
Com relação à disfunção de órgãos, no grupo de não-sobreviventes predominou
o comprometimento de mais de 3 órgãos, enquanto 61% dos sobreviventes
apresentaram comprometimento de até dois órgãos (p=0.000019). Em relação ao tempo
de internação, também houve diferença estatisticamente significativa entre os pacientes
que sobreviveram e não sobreviveram, com predomínio de tempo de internação mais
breve (0 a 7 dias) nos não sobreviventes (p=0.000004) – Tabela 7.
Entre os não-sobreviventes, a frequência de pacientes com escore prognóstico
PIM na faixa de 0 a 15% e na faixa acima de 15% foi similar, sendo o mesmo padrão
observado em relação ao escore PRISM. No entanto, ao comparar o grupo de
sobreviventes com o grupo de não-sobreviventes, foi observada uma diferença
estatisticamente significativa na distribuição das faixas dos escores PIM e PRISM -
Tabela 7.
Seção 3 – Relação entre SDRA e Marcadores Genéticos
Através do modelo GLM utilizando distribuição genotípica foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os pacientes com e sem SDRA, quando
analisado o SNP TNF -308 (p-global=0.002626, com e sem correção) – Tabela 8.
89
Tabela 7: Características clínicas de sobreviventes e não‐sobreviventes, dentre pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Características Sobreviventes
n (%) Não‐Sobreviventes
n (%) P‐valor###
Total de Indivíduos 388 (0.92) 36 (0.08)
Gravidade da Sepse
Sepse 78 (0.20) 0 (0.00)
Sepse Grave 72 (0.19) 5 (0.14)
Choque Séptico 238 (0.61) 31 (0.86)
p = 0,0045
Lesão Pulmonar
Suporte 34 (0.53) 1 (0.03)
LPA 235 (0.53) 9 (0.25)
SDRA 99 (0.20) 22 (0.61)
Cardiogênico 20 (0.53) 4 (0.11)
p =0.000013
DMOS
0 a 2 órgãos 235 (0.61) 8 (0.22)
≥ 3 órgãos 153 (0.39) 28 (0.78)
p =0.000019
Tempo de Internação (dias)
0 a 7 dias 134 (0.34) 27 (0.75)
> 7 dias 254 (0.66) 9 (0.25)
p = 0,000004
PIM#
0 a 15% 316 (0.86) 19 (0.54)
> 15% 50 (0.14) 16 (0.46)
p < 0,000003
PRISM##
0 a 15% 313 (0.81) 17 (0.47)
> 15% 74 (0.19) 19 (0.53)
p < 0,000008
# 22 Sobreviventes e 1 Não‐Sobrevivente não tiveram o escore PIM calculado. ##1 Sobrevivente não teve o escore PRISM calculado. ###Valor de p associado ao Teste χ2 (Qui‐Quadrado).
90
Foi observada diferença estatisticamente significativa (p=0.023) na frequência
de heterozigotos TNF -308 GA entre os grupos SDRA e não-SDRA, com OR=0.33, o
que sugere um efeito protetor para o genótipo GA, quando comparados com os
homozigotos GG (referência). Ao se corrigir esta análise para gênero, cor da pele, idade
e presença de doença de base, o resultado se manteve estatisticamente significativo (OR
ajustada=0,33; p=0.0024; p-valor global=0.0026). As análises com carreadores do alelo
TNF -308 A foram consistentes com esta interpretação, indicando que ser carreador do
alelo A confere proteção contra o desenvolvimento de SDRA, quando comparado aos
carreadores G, com e sem correção (OR ajustada=0.43; p=0.0076). O padrão de
susceptibilidade para o desenvolvimento de SDRA apresentado pelo genótipo TNF -308
AA não alcançou significância estatística.
Em relação ao SNP LTA +252 não foram observadas diferenças estatisticamente
significativas entre os pacientes que desenvolveram SDRA e os que não desenvolveram
(p-global=0.4438, com e sem correção). A frequência dos genótipos LTA +252 GA e
GG, bem como do alelo G e carreador G não apresentaram diferença estatisticamente
significativa entre os dois grupos (tabela 8).
O haplótipo +252 G/-308 A apresentou um padrão de susceptibilidade ao
desenvolvimento de SDRA (OR ajustada=1.78), porém com um nível de significância
estatística limítrofe (p=0.07) - Tabela 8.
91
Tabela 8: Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF ‐308 e LTA +252 de pacientes com insuficiência respiratória aguda internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Desenvolvimento de SDRA
Genótipo / Alelo Não‐SDRA
n (%) SDRA n (%)
OR (IC 95%; p‐valor) OR (IC 95%; p‐valor)*
TNF ‐308
GG 223 (0.76) 101 (0.88) Referência Referência
GA 66 (0.22) 10 (0.09) 0.33 (0.16 – 0.68; p = 0.0023) 0.33 (0.16 – 0.68; p = 0.0024)
AA 6 (0.02) 4 (0.03) 1.47 (0.40 – 5.33; p = 0.56) 1.47 (0.40 – 5.38; p = 0.56)
Total# 295 115 p‐global = 0,002626 p‐global = 0,002626
Alelo A 78 (0.13) 18 (0.08) 0.56 (0.26 – 1.19; p = 0.13) 0.56 (0.26 – 1.19; p = 0.13)
Alelo G 512 (0.87) 212 (0.92) Referência Referência
Carreador A
72 (0.24) 14 (0.12) 0.43 (0.23 – 0.80; p = 0.0074) 0.43 (0.23 – 0.80; p = 0.0076)
LTA +252
AA 87 (0.35) 42 (0.40) Referência Referência
GA 124 (0.50) 45 (0.42) 0.75 (0.45 – 1.24; p = 0.26) 0.75 (0.45 – 1.25; p = 0.27)
GG 38 (0.15) 19 (0.18) 1.04 (0.53 – 2.01; p = 0.92) 1.05 (0.53 – 2.04; p = 0.89)
Total## 249 106 p‐global = 0,4438 p‐global = 0,4438
Alelo A 298 (0.60) 129 (0.61) Referência Referência
Alelo G 200 (0.40) 83 (0.39) 0.96 (0.60 – 1.53; p = 0.86) 0.97 (0.60 – 1.54; p = 0.88)
Carreador G
162 (0.65) 64 (0.60) 0.82 (0.51 – 1.31; p = 0.40) 0.82 (0.51 – 1.32; p = 0.41)
Haplótipos
+252 A / ‐308 A 0,01471 0,01175 1.32 (0.29 – 5.98; p = 0.72) 1.39 (0.30 – 6.37; p = 0.68)
+252 A / ‐308 G 0,58625 0,59762 Referência Referência
+252 G / ‐308 A 0,11732 0,06738 1.80 (0.96 – 3.38; p = 0.0665) 1.78 (0.95 – 3.33; p = 0.07)
+252 G / ‐308 G 0,28173 0,32324 0.93 (0.64 – 1.34; p = 0.69) 0.91 (0.62 – 1.34; p = 0.64)
*OR e p‐valores adjustados para as covariáveis gênero, raça, idade e doença de base. # 8 Pacientes sem SDRA e 6 Pacientes com SDRA não foram genotipados para TNF ‐308. ## 54 Pacientes sem SDRA e 17 Pacientes com SDRA não foram genotipados para LTA +252.
92
Seção 4 – Relação entre Choque Séptico e Marcadores Genéticos
Através do modelo GLM utilizando distribuição genotípica não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas entre os pacientes com choque e
sem choque, quando analisado o SNP TNF -308 (p-global=0.07957, com e sem
correção) – Tabela 9.
A frequência de heterozigotos TNF -308 GA foi menor nos pacientes com
choque, apresentando um nível de significância estatística limítrofe (OR
ajustada=0.62;p=0.066), o que sugere um efeito protetor deste genótipo quando
comparado ao genótipo GG (referência). O padrão de proteção para o desenvolvimento
de choque séptico sugerido pelos alelos TNF -308 A e carreadores A não alcançou nível
de significância estatística, assim como o padrão associado ao risco de choque séptico
apresentado pelos homozigotos TNF -308 AA, quando comparados com os alelos G,
carreadores G e homozigotos GG, respectivamente - Tabela 9.
Em relação ao SNP LTA +252 não foram observadas diferenças estatisticamente
significativas entre os pacientes que desenvolveram choque e os que não desenvolveram
choque (p-global=0.7138, com e sem correção). A frequência dos genótipos LTA +252
GA e GG, bem como do alelo G e carreador G não apresentaram diferença
estatisticamente significativa entre os dois grupos (tabela 9).
93
Tabela 9: Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF ‐308 e LTA +252 de pacientes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica que evoluiram com e sem choque séptico.
Desenvolvimento de Choque
Genótipo / Alelo Não‐Choque
n (%) Choque n (%)
OR (IC 95%; p‐valor) OR (IC 95%; p‐valor)*
TNF ‐308
GG 115 209 (0.81) Referência Referência
GA 36 (0.24) 40 (0.16) 0.61 (0.37 – 1.01; p = 0.056) 0.62 (0.37 – 1.03; p = 0.066)
AA 2 (0.01) 8 (0.03) 2.20 (0.46 – 10.54; p = 0.32) 1.87 (0.38 – 9.06; p = 0.43)
Total# 153 257 p‐global = 0,07957 p‐global = 0,07957
Alelo A 40 (0.13) 56 (0.11) 0.81 (0.44 – 1.50; p = 0.51) 0.79 (0.43 – 1.47; p = 0.46)
Alelo G 266 458 (0.89) Referência Referência
Carreador A
38 (0.25) 48 (0.19) 0.69 (0.43 – 1.13; p = 0.14) 0.69 (0.42 – 1.12; p = 0.14)
LTA +252
AA 43 (0.34) 86 (0.38) Referência Referência
GA 64 (0.50) 105 (0.46) 0.82 (0.51 – 1.33; p = 0.42) 0.86 (0.53 – 1.41; p = 0.56)
GG 21 (0.16) 36 (0.16) 0.86 (0.45 – 1.64; p = 0.64) 0.91 (0.47 – 1.76; p = 0.78)
Total## 128 227 p‐global = 0,7138 p‐global = 0,71379
Alelo A 150 277 (0.61) Referência Referência
Alelo G 106 177 (0.39) 0.90 (0.58 – 1.41; p = 0.65) 0.94 (0.60 – 1.47; p = 0.78)
Carreador G
85 (0.66) 141 (0.62) 0.83 (0.53 – 1.31; p = 0.42) 0.88 (0.55 – 1.40; p = 0.58)
Haplótipos
+252 A / ‐308 A 0,02142 0,00984 2.22 (0.55 – 8.90; p = 0.26) 2.45 (0.59 – 10.24; p = 0.22)
+252 A / ‐308 G 0,57034 0,59928 Referência Referência
+252 G / ‐308 A 0,10882 0,09986 1.33 (0.80 – 2.21; p = 0.27) 1.34 (0.80 – 2.23; p = 0.27)
+252 G / ‐308 G 0,29942 0,29102 1.11 (0.77 – 1.59; p = 0.57) 1.05 (0.72 – 1.52; p = 0.81)
*OR e p‐valores adjustados para as covariáveis gênero, raça, idade e doença de base. # 2 Pacientes Sem Choque Séptico e 12 Pacientes com Choque Séptico não foram genotipados para TNF ‐308. ## 27 Pacientes Sem Choque Séptico e 42 Pacientes com Choque Séptico não foram genotipados para LTA +252.
94
Seção 5 – Relação entre Óbito e Marcadores Genéticos
Apesar do teste global, realizado através do modelo GLM de distribuição
genotípica, demonstrar valor estatísticamente significativo entre as frequências dos
genótipos do SNP TNF -308 nos pacientes que evoluíram para alta e óbito (p-
global=0.04413, com e sem correção – Tabela 10), quando individualmente analisados
os genótipos e alelos, não foi observada associação estatisticamente significativa.
O padrão de proteção para a evolução para o óbito apresentado pelos
heterozigotos TNF -308 GA (OR ajustada=0.26; p=0.07), alelos TNF -308 A e
carreadores A não alcançou significância estatística, quando comparados com
homozigotos GG, alelos G e carreadores G, respectivamente (referências). O padrão de
risco sugerido pelos homozigotos TNF -308 AA, quando comparados com os
homozigotos GG, também não foi estatisticamente significativo (OR ajustada=2.18;
p=0.34) (tabela 10).
Em relação ao SNP LTA +252 foi observada a mesma situação. Apesar de um
teste global apresentar resultado significativo entre os pacientes que sobreviveram e os
que não sobreviveram (p-global=0.02745, com e sem correção), as frequências dos
genótipos e alelos analisados individualmente não apresentaram diferença
estatisticamente significativa entre os dois grupos (tabela 10).
Devido ao número reduzido de pacientes que não sobreviveram, não foi possivel
realizar a análise estatística dos haplótipos, já que os subgrupos representantes de cada
haplótipo apresentaram números amostrais muito pequenos, o que não foi comportado
pelo modelo estatístico utilizado.
95
Tabela 10: Frequências de genótipos, alelos, carreadores e haplótipos para SNPs TNF ‐308 e LTA +252 de pacientes sobreviventes e não‐sobreviventes internados na UPG/IFF sob ventilação mecânica.
Genótipo / Alelo Altas
n (%) Óbitos n (%)
OR (IC 95%; p‐valor) OR (IC 95%; p‐valor)*
TNF ‐308
GG 293 (0.78) 31 (0.89) Referência Referência
GA 74 (0.20) 2 (0.06) 0.25 (0.06 – 1.09; p = 0.06) 0.26 (0.06 – 1.10; p = 0.07)
AA 8 (0.02) 2 (0.06) 2.36 (0.48 – 11.62; p = 0,29) 2.18 (0.44 – 10.88; p = 0,34)
Total# 375 35 p‐global = 0,04413 p‐global = 0,04413
Alelo A 90 (0.12) 6 (0.09) 0.69 (0.20 – 2.34; p = 0.55) 0.68 (0.20 – 2.31; p = 0.53)
Alelo G 660 (0.88) 64 (0.91) Referência Referência
Carreador A
82 (0.22) 4 (0.11) 0.46 (0.16 – 1.34; p = 0.156) 0.46 (0.16 – 1.34; p = 0.15)
LTA +252
AA 116 (0.36) 13 (0.43) Referência Referência
GA 161 (0.50) 8 (0.27) 0.44 (0.18 – 1.10; p = 0.08) 0.46 (0.18 – 1.16; p = 0.10)
GG 48 (0.15) 9 (0.30) 1.67 (0.67 – 4.17; p = 0.27) 1.78 (0.70 – 4.54; p = 0.22)
Total## 325 30 p‐global = 0,02745 p‐global = 0,02745
Alelo A 393 (0.60) 34 (0.57) Referência Referência
Alelo G 257 (0.40) 26 (0.43) 1.17 (0.55 – 2.49; p = 0.68) 1.22 (0.57 – 2.62; p = 0.61)
Carreador G
209 (0.64) 17 (0.57) 0.73 (0.34 – 1.55; p = 0.41) 0.76 (0.35 – 1.65; p = 0.48)
Haplótipos
+252 A / ‐308 A 0,01612 0,00000 ND ND
+252 A / ‐308 G 0,58941 0,57799 ND ND
+252 G / ‐308 A 0,10380 0,08920 ND ND
+252 G / ‐308 G 0,29068 0,33281 ND ND
*OR e p‐valores adjustados para as covariáveis gênero, raça, idade e doença de base. # 13 Sobreviventes e 1 Não‐Sobrevivente não foram genotipados para TNF ‐308. ## 63 Sobreviventes e 6 Não‐Sobreviventes não foram genotipados para LTA +252. ND – Resultado Não‐Disponível.
96
10. Discussão
O estudo em questão permitiu a observação das frequências genotípicas, alélicas
e haplotípicas de polimorfismos dos genes do TNF na posição -308 e da LTA na posição
+252, em crianças saudáveis e pacientes pediátricos criticamente enfermos, além de
correlação com características demográficas e clínicas dos pacientes.
Com relação ao gênero, não foi observada diferença estatisticamente
significativa entre o grupo de crianças saudáveis e o grupo de pacientes, assim como
entre os pacientes que desenvolveram choque séptico ou SDRA. Muitos autores
também não encontraram diferenças estatisticamente significativas em relação às
características demográficas de pacientes ao correlacionar os SNPs TNF -308 e LTA
+252 com infecção (Azim et al., 2007; Barber et al., 2006; Gordon et al., 2004; Kahlke
et al., 2004; Mira et al., 1999; Nakada et al., 2005; Shallub et al., 2009). No entanto,
estes resultados conflitam com outros dados na literatura que sugerem uma maior
susceptibilidade à sepse para o sexo masculino (Martin et al., 2003), bem como de sepse
e disfunção orgânica após trauma (Oberholzer et al., 2000), além de maior mortalidade
em homens que em mulheres com sepse grave (Adrie et al., 2007). Apesar da relativa
escassez de dados na população pediátrica, Watson e colaboradores demonstraram uma
taxa significativamente mais alta de sepse grave em meninos com menos de dez anos de
idade, que em meninas (2005). Hipotetiza-se que os hormônios sexuais possam exercer
efeitos reguladores potentes em funções imunes variadas, sendo os androgênios
imunossupressores e os estrogênios protetores, em sepse induzida em modelos animais
(Oberholzer et al., 2000). Estudos genéticos também ressaltaram a vulnerabilidade do
97
sexo masculino, como o estudo de Schröder e colaboradores, que observou aumento da
taxa de letalidade estatisticamente significativa em homens homozigotos para o LTA
+252 AA quando comparadas aos outros genótipos (2000) e estudo americano que
mostrou predisposição à sepse grave no SNP LTA +252, modulada pelo gênero e idade
(Watanabe et al., 2010).
Com relação à faixa etária houve diferença estatisticamente significativa entre
crianças saudáveis e pacientes da UPG. O predomínio claro de lactentes (79%) no grupo
de crianças saudáveis pode ser explicado pelo fato de elas terem sido recrutadas, em sua
maioria, do ambulatório de puericultura (93%). Como se sabe, os lactentes constituem a
faixa etária com recomendação de consultas mais freqüentes para acompanhamento de
crescimento e desenvolvimento, com consultas mensais ou a cada dois meses, enquanto
a faixa etária escolar tem a sua recomendação de consulta pediátrica semestral a anual.
É importante ressaltar também que o grupo de adolescentes foi pouco encontrado na
população de crianças saudáveis do ambulatório de pediatria, em virtude do Instituto
Fernandes Figueira dispôr de um ambulatório próprio e especializado para esta faixa
etária, o qual não foi abordado.
O predomínio de lactentes (66%) encontrado no grupo de pacientes é similar ao
padrão descrito na literatura. A idade tem sido descrita como um dos fatores mais
influentes na freqüência de sepse grave nos EUA e outros países, tendo um estudo
evidenciado que a faixa etária de lactentes apresentava um risco 10 vezes maior para
desenvolvimento de sepse grave e choque séptico quando comparada com crianças
maiores (Watson et al., 2005).
98
Com relação à cor da pele, não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa entre pacientes e crianças saudáveis, assim como para o desenvolvimento
de choque séptico, SDRA e óbito. Alguns estudos já demonstraram a relação de
diferentes desfechos clínicos com raça, como freqüência maior na incidência de sepse
grave e letalidade secundária à sepse na população negra (Barnato et al., 2008), maior
mortalidade por SDRA em pacientes adultos não-brancos (TenHoor et al., 2001) e em
afro-americanos (Moss et al., 2002). É importante ressaltar que a classificação de raças
utilizadas nos sistemas norte-americano, onde foram conduzidos estes estudos leva em
consideração a ascendência, diferentemente do sistema brasileiro que classifica as
pessoas a partir de sua “aparência”. No Brasil, é possível distinguir duas formas de
classificação: a primeira é um estilo binário ou bipolar, em que há apenas duas
categorias - negros e brancos; enquanto na segunda há um estilo múltiplo, em que há
três categorias - negros, brancos e mulatos. Este é o tipo oficial do censo brasileiro
(IBGE), que solicita que as pessoas se classifiquem como “brancas”, “pretas”, “pardas”,
“amarelas” ou “indígenas” (Fry et al., 2005).
Diversos estudos tentaram caracterizar a ascendência da população brasileira
através de marcadores genéticos. Alves-Silva e colaboradores demonstraram
contribuição genética extremamente alta de ameríndios e africanos no DNAmt de
brasileiros (2000). Já Carvalho-Silva e colaboradores demonstraram que a maioria dos
cromossomos Y de homens brasileiros era de origem européia, com uma baixa
frequência de cromossomos africanos e completa ausência de contribuições ameríndias
(2001). Mais recentemente, Parra e colaboradores publicaram estudo que correlacionava
ancestralidade genômica com a cor da pele, através da utilização de um painel de alelos
específicos. Os autores demonstraram variações e sobreposições importantes entre as
99
categorias brancos, negros e pardos, sugerindo que, no Brasil, a cor da pele,
determinada por avaliação física, não é bom preditor de ancestralidade genômica
(2003).
Uma limitação de muitos estudos genéticos de associação é a composição da
população de pacientes e controles a partir de grupos étnicos diferentes. Atualmente,
sabe-se que a frequência de muitos polimorfismos varia entre diferentes grupos étnicos
e tais comparações só devem ser realizadas dentro de um mesmo grupo (Dahmer et al.,
2005), já que sua frequência pode ser influenciada pela ancestralidade, sendo
encontradas diferenças na distribuição alélica entre populações etnicamente distintas em
diversos estudos (Myles et al., 2008; Mattei et al., 2009; Pemberton et al., 2008;
Ioannidis et al., 2004; Spielman et al., 2007; Goddard et al., 2000; Hoffmann et al.,
2002).
Ao comparar frequências alélicas do TNF -308 entre o Brasil e outros países,
Franceschi e colaboradores encontraram diferenças, sendo o alelo A menos frequente
nas populações asiáticas (2,8%) quando comparado com os estudos brasileiros (13,4%)
(2009). Visentainer e colaboradores encontraram frequências dos genótipos do TNF -
308 muito similares entre a população brasileira e os europeus e caucasóides americanos
(2008). Dentro da população brasileira, Albuquerque e colaboradores compararam a
frequência do SNP TNF -308 entre a população do Rio de Janeiro e índios Terena,
ameríndios localizados na região centro-oeste do Brasil, demonstrando que 100% dos
índios apresentavam o genótipo TNF -308 GG e 0% de alelos A, enquanto entre a
população geral brasileira, a frequência do alelo A foi de 18,9%. No entanto, apesar da
população brasileira ser composta por grupos geneticamente heterogêneos, em estudo
recente não encontrou diferenças nas frequências do SNP TNF -308 entre populações
100
provenientes da região sul e sudeste do país (Visentainer et al., 2008). Assim, apesar da
influência da ancestralidade descrita na frequência dos alelos relacionados às citocinas,
ainda são poucos os dados publicados no Brasil e a correlação entre ancestralidade e
raça neste país é pouco definida.
No presente estudo, os pacientes e crianças saudáveis foram agrupados segundo
a cor da pele, sendo categorizada de forma binária, em “brancos” e “não-brancos”.
Ainda assim, por ser o grupo de “brancos” no Brasil altamente miscigenado e não ter
sido realizado estudo genético para determinação de ascendência, esta categorização
reflete apenas divisão de raça segundo o fenótipo, na população estudada.
Como não foi encontrada diferença estatisticamente significativa com relação às
características demográficas, não foi realizada estratificação dos pacientes segundo as
mesmas. Entretanto, como alguns estudos ressaltam sua importância, as características
demográficas foram mantidas como covariáveis e ajustadas em todas as análises
estatísticas realizadas. No entanto, a utilização destes critérios de correção alterou os
valores de OR minimamente, sugerindo que estas variáveis provavelmente não
constituíram fatores de confundimento na população estudada, através da abordagem
utilizada.
Neste estudo, foram analisadas características clínicas de todos os pacientes
incluídos e avaliados os principais desfechos relacionados à morbidade pela sepse:
choque séptico, SDRA e óbito.
Dos pacientes submetidos à ventilação mecânica incluídos no estudo, 63,4%
apresentaram choque séptico, sendo que destes, 11,5% não sobreviveram. Um estudo de
101
coorte americano realizado em 2003 descreveu uma taxa de mortalidade similar de
13,5% em crianças com choque séptico (Kutko et al., 2003).
A frequência de SDRA na população submetida à ventilação mecânica da
UPG/IFF envolvida neste estudo foi de 28%, o que foi menor do que a encontrada em
um estudo de Flori e colaboradores que mostrou uma incidência de 67% de SDRA
(2005). No entanto, o estudo de Flori avaliou pacientes já com diagnóstico de lesão
pulmonar aguda, sendo este utilizado como critério de inclusão, o que pode justificar
maior incidência de SDRA (Flori et al., 2005).
No grupo de pacientes avaliados, cerca de 99,3% apresentaram disfunção
orgânica, tendo a maior parte dos pacientes apresentado dois órgãos acometidos (35%).
Estes dados são diferentes dos apresentados em estudo americano com pacientes
pediátricos que apresentaram choque séptico, no qual disfunção orgânica estava
presente em 72,9% dos casos, porém estes dados refletem a análise de todos os
pacientes internados naquela UTI (Kutko et al., 2003).
A correlação encontrada entre choque séptico, SDRA e DMOS nas análises de
todos os subgrupos já era esperada, já que o mecanismo fisiopatológico para o
desenvolvimento das três patologias é semelhante, baseado na resposta inflamatória
sistêmica, insulto celular e tecidual. Desta forma, as frequências de SDRA e DMOS
foram maiores nos pacientes com choque séptico, assim como as três patologias foram
maiores nos pacientes que não sobreviveram (tabelas 5, 6 e 7).
Com relação ao tempo de internação, o tempo médio observado nos pacientes da
UPG foi de 14,5 dias, sendo a mediana de 10 dias. Dados similares foram obtidos em
um grande estudo epidemiológico americano, no qual o tempo médio de internação
102
hospitalar de crianças com sepse grave foi de 19 dias, apesar de incluir o tempo de
internação também fora da UTI (Watson et al., 2005). No presente estudo, foi
observado tempo de internação maior do que sete dias em: 62% do total de pacientes,
89% dos pacientes com SDRA e 60,5% dos pacientes com choque séptico. O tempo de
internação mais prolongado nos quadros de SDRA e choque séptico pode ser decorrente
da necessidade de tratamento clinico intensivo prolongado para conter o quadro
inflamatório sistêmico e pulmonar grave. No entanto, é importante ressaltar que, quando
são observados apenas os pacientes que não sobreviveram, percebe-se tempo de
internação mais curto, já que 75% dos pacientes que não sobreviveram faleceram nos
primeiros sete dias, tanto para o grupo geral de pacientes (tabela 7), quanto para os
pacientes com SDRA e choque séptico (tabelas 5 e 6, respectivamente). Este dado
ressalta a importância do tratamento em terapia intensiva, principalmente se instituído a
tempo, além de alertar para a possibilidade de que os pacientes que evoluíram para óbito
em tão pouco tempo de internação na UTI possam ter sido expostos a um insulto inicial
de máxima gravidade ou possam estar chegando muito tardiamente ao serviço.
Com relação a análise dos óbitos, a taxa de mortalidade na população estudada
foi de 8,5%, dado similar ao obtido quando analisados todos os pacientes internados na
UPG/IFF no mesmo período (8,1%). Semelhantemente, um estudo com crianças
americanas que apresentavam sepse grave mostrou mortalidade hospitalar de 10,3%,
sendo 7,8% em crianças previamente saudáveis e 12,8% em crianças com doenças
crônicas (Watson et al., 2005). Angus e colaboradores também reportaram taxa de
mortalidade em unidades de terapia intensiva de 10% em crianças com sepse grave,
refletindo análises de dados coletados em sete estados americanos (2001).
103
A frequência de óbitos nos pacientes com SDRA (18,2%), no entanto, foi menor
do que a publicada na literatura, que aponta mortalidade de 20% em crianças com LPA
e entre 20-75% nas crianças com SDRA (Flori et al., 2004), chegando a alcançar 61%
de óbito em estudo chinês (Yu et al., 2009).
Com relação à disfunção orgânica, 78% dos pacientes que não sobreviveram
apresentaram mais de três órgãos em disfunção (p=0.000019) – Tabela 7. A correlação
entre DMOS e óbito já foi descrita em estudo americano, no qual pacientes
apresentando DMOS tiveram mortalidade siginificativamente mais alta, sendo que
DMOS estava presente em 100% dos pacientes que não sobreviveram e a taxa de
mortalidade para pacientes que apresentaram DMOS secundária ao choque séptico foi
de 18,6%, sendo 0% nos pacientes que não apresentaram DMOS (Kutko et al., 2003).
Por se localizar em um instituto materno-infantil de alta complexidade, sendo
referência municipal e estadual para várias especialidades médicas, como pré-natal de
alto risco fetal, neurologia e pneumonologia infantis, genética, neonatologia, e cirurgia
infantil, os pacientes assistidos na UPG têm perfil de doenças crônicas e complexas
(Penna e Costa, 2009). Portanto, já era esperado o percentual elevado de crianças
portadoras de doenças crônicas na população estudada (49%), apesar de não haver
predomínio de um sistema especificamente acometido. Este mesmo padrão foi descrito
nos EUA, onde 49% das crianças que desenvolveram sepse grave eram portadoras de
alguma doença crônica, sendo mais comuns as doenças pulmonares crônicas, as
cardiopatias congênitas em lactentes, as doenças neuromusculares em pré-escolares e
escolares e neoplasias em adolescentes (Watson et al., 2005). Não houve diferenças no
desfecho óbito entre pacientes com choque em relação à doença de base, o que foi uma
104
surpresa, já que era esperado que pacientes portadores de comorbidades e que já
apresentassem doença crônica tivessem evolução pior que os previamente hígidos.
Dentre os pacientes avaliados, as principais causas de internação foram as
doenças do sistema respiratório (51%) e o diagnóstico mais frequente foi pneumonia
comunitária. Este dado também é similar ao descrito na literatura e o sítio de infecção
varia com a idade, sendo que lactentes tendem a apresentar bacteremia primária,
enquanto quase metade das crianças maiores tem infecção do trato respiratório, sítio
mais frequentemente acometido em crianças (Watson et al., 2005). O predomínio do
sistema respiratório como causa de internação nos pacientes que evoluíram com SDRA
também era esperado (tabela 5), já que a infecção pulmonar contribui para a piora da
inflamação local associada com a sistêmica (Pelosi et al., 2003; Bernard et al., 1994).
Dos pacientes incluídos no presente estudo, 48% tiveram algum germe isolado
durante a internação na UPG, sendo as bactérias as mais frequentemente isoladas (32%).
Este percentual de germes isolados é similar ao publicado na literatura em outros
centros, sendo descritos 55,6% de culturas positivas provenientes de qualquer sítio em
pacientes adultos com pneumonia comunitária em estudo espanhol multicêntrico (Solé-
Violán et al., 2009). Ainda em relação aos agentes infecciosos, 17% dos pacientes
estudados apresentaram infecção viral documentada, o que demonstra uma frequência
alta de infecção viral grave com necessidade de atendimento intensivo em pacientes
pediátricos.
Os polimorfismos relacionados às posições -308 do gene do TNF e +252 do gene
da LTA foram escolhidos em virtude de sua associação descrita por vários estudos que
avaliavam susceptibilidade à sepse, evolução para choque séptico e óbito.
105
Em relação à distribuição do TNF -308, o predomínio em ambos os grupos de
homozigotos GG (aproximadamente 80%) e a presença de muito poucos homozigotos
AA (1 e 2%) entre a população estudada foi similar às frequências descritas na literatura
para a população brasileira (Franceschi et al, 2009; Santos et al, 2002; Visentainer et al.,
2008). Em relação ao SNP LTA +252, não houve predomínio claro de nenhum genótipo,
porém tanto pacientes, quanto crianças saudáveis apresentaram maior quantidade de
heterozigotos LTA +252 GA (48 e 47%, respectivamente) em relação ao homozigoto
AA (36 e 41%). A frequência do alelo A foi similar à descrita na literatura para a
população brasileira (Roxo et al., 2003), sendo mais frequente o alelo A em crianças
saudáveis (64%) e em pacientes (60%).
No grupo de crianças saudáveis, a análise dos genótipos e alelos demonstrou
distribuição de frequências genotípicas e alélicas em EHW, o que afasta possíveis erros
relacionados à genotipagem, permite a verificação da frequência dos genótipos
estudados em população similar aos pacientes envolvidos na análise, além de reafirmar
a qualidade do presente estudo. Um estudo inglês demonstrou que o desvio do EHW em
amostras aleatórias pode ser indicativo de problemas na genotipagem (Hosking et al.,
2004). Erros em dados genotípicos podem acontecer devido a uma variedade de
motivos, como desvios no grupo controle, trocas no manuseio das amostras e problemas
no processo de genotipagem. A presença de erros na genotipagem em dados de
indivíduos não relacionados tem impacto considerável na análise de dados
subsequentes, já que não há como checar consistência Mendeliana em tais dados. Ainda,
pequenos erros, mesmo ao redor de 3%, já podem afetar adversamente as medidas do
EHW (Hosking et al., 2004). Desta forma, é importante que a população estudada se
106
encontre em EHW, principalmente os controles, além da utilização de amostras-padrão
para validação do método de genotipagem utilizado (Pacheco e Moraes, 2009).
A população de pacientes da UPG também se encontrava em EHW para os
genótipos do LTA +252, no entanto, discretamente desequilibrada quando o mesmo teste
foi realizado para o genótipo TNF -308 (χ2= 4,38). Todas as amostras de pacientes e
crianças saudáveis homozigotos TNF -308 AA tiveram a genotipagem repetida e seus
resultados foram confirmados, além de terem sido excluídos todos os indivíduos que
apresentassem parentesco co-sanguíneo. No entanto, o EHW pode ser alterado por
outros fatores. Populações pequenas podem apresentar eventos causais que alterem
radicalmente uma frequência do alelo, assim como populações que contenham
subgrupos cujos membros optem por casar entre si preferencialmente. A violação da
suposição de acasalamento aleatório pode causar grandes desvios da frequência de
indivíduos homozigotos através de três fenômenos distintos: estratificação populacional,
casamento preferencial e consanguinidade. Por outro lado, mudanças na frequência de
alelos devido à mutação, seleção ou migração normalmente ocorrem lentamente e
causam menores e mais delicados desvios do EHW (Thompson & Thompson, 2007).
Portanto, o discreto desequilíbrio apresentado pelo gupo de pacientes em relação ao
TNF -308 pode sugerir associação com doença, relacionada ou não com o alelo em
investigação, diferenças na constituição da população, cruzamentos preferenciais e
outros processos independentes não-detectados.
Os pacientes heterozigotos TNF -308 GA apresentaram uma chance três vezes
menor de desenvolvimento de SDRA, quando comparados aos homozigotos GG
(OR=0.33; p-valor = 0.0024). O mesmo padrão de proteção à SDRA foi observado nos
carreadores TNF -308 A, que apresentaram 2,3 vezes menos chances de evoluir com
107
SDRA, quando comparados com os carreadores G (OR=0.43; p=0.0074). O padrão de
proteção apresentado para o desenvolvimento de SDRA em pacientes com o genótipo
TNF -308 GA foi similar ao sugerido por Gong e colaboradores, único estudo na
literatura que correlacionou este SNP com SDRA (2005). Efeitos deletérios do alelo
TNF -308 A quando em homozigose não foram estatisticamente significativos,
provavelmente pelo reduzido número de pacientes homozigotos AA.
O alelo A do TNF -308 está associado com uma maior produção da citocina
TNF (Dahmer et al., 2005; Terry et al., 2000; Wilson et al., 1997; Louis et al., 1998),
que quando muito aumentada resulta em desequilíbrio e resposta inflamatória sistêmica
exagerada (Ulloa et al., 2005; Dahmer et al., 2005; Tracey et al., 2005). No entanto, a
liberação inicial de TNF em quantidades aumentadas é essencial para uma resposta
imune adequada (Oberholzer et al., 2001). Assim, com base nos resultados encontrados
no presente estudo, o alelo TNF -308 A foi considerado como protetor para o
desenvolvimento de SDRA quando em heterozigose, o que poderia significar que para
que haja um efeito protetor da SDRA seria necessário ter uma produção forte o
suficiente de TNF para conter a infecção, mas não tão forte que causasse injuria
pulmonar grave. Como alguns estudos já demonstraram aumento da produção de TNF
em individuos portadores do alelo A, seria interessante avaliar se existem diferentes
níveis de produção baseados nos genótipos, o que não foi realizado no presente estudo.
Assim, é possivel que o genótipo TNF –308 GA possa estar relacionado com uma
produção intermediária de TNF, o TNF –308 AA com uma produção maior e o TNF –
308 GG com uma produção menor.
Outra possibilidade para justificar a menor frequência de desenvolvimento de
SDRA nos pacientes com genótipo TNF -308 GA pode ser a presença de “vantagem do
108
heterozigoto”. Um exemplo bem conhecido de vantagem do heterozigoto é a resistência
à malária nos heterozigotos para anemia falciforme, que não apresentam doença
falcêmica clínica e suas hemácias são inóspitas para o organismo da malária,
apresentando resistência a esta doença (Alisson e Phil, 1954). Assim, ao longo do
tempo, há aumento na frequência de um alelo mutante, que é extremamente prejudicial
quando em homozigose. A vantagem do heterozigoto também tem sido proposta para
explicar as altas frequências de fibrose cística em populações brancas e da Doença de
Tay-Sachs e outros distúrbios que afetam o metabolismo de esfingolipídeos na
população judaica Ashkenazi (Thompson & Thompson, 2008).
A vantagem do heterozigoto ocorre quando embora certos alelos mutantes sejam
deletérios quando em homozigose, há condições ambientais nas quais os heterozigotos
tenham aptidão aumentada não apenas sobre homozigotos para os alelos mutantes, mas
também para os alelos normais, culminando com seleção positiva dos heterozigotos
(Thompson & Thompson, 2008). Assim, no que diz respeito apenas às doenças, para
mutações e polimorfismos serem preservados no genoma humano, apesar da
predisposição a um desfecho deletério secundário a uma doença, uma vantagem na
sobrevivência a outra doença (outra infecção ou neoplasias, por exemplo) é possível ou
necessária (Waterer et al., 2005). Desta forma, é possivel que os homozigotos AA e GG
estejam relacionados a outros desfechos deletérios que envolvam o paciente
criticamente enfermo que não foram abordados neste estudo. A seleção positiva dos
heterozigotos ainda não causa impacto na distribuição genotipica da população geral, o
que pode ser justificado pela frequência rara do desfecho SDRA e associação do
genótipo GA com outro desfecho deletério mais frequente do que a SDRA.
109
Apesar da associação descrita por Gong e colaboradores entre o
desenvolvimento de SDRA e o SNP LTA +252 (2005), não foi encontrada associação
estatisticamente significativa entre este SNP e SDRA na população estudada.
O haplótipo LTA +252 A/TNF -308 G foi o mais frequente em pacientes com e
sem SDRA, conforme era esperado pela sua maior frequência na população. Houve uma
menor frequência dos haplótipos contendo TNF -308 A, nos pacientes com SDRA
quando comparados aos sem SDRA, sugerindo a proteção conferida pelos carreadores A
descrita anteriormente. No entanto, após realização de regressão logística, não houve
associação estatisticamente significativa entre haplótipos específicos e o
desenvolvimento de SDRA.
Com relação ao desenvolvimento de choque séptico, não foi encontrada
diferença estatisticamente significativa entre os genótipos relacionados ao SNP TNF -
308 e ao SNP LTA +252.
Com relação ao desfecho óbito, o p-valor global demonstrou diferença nas
frequências de genótipos tanto para TNF –308 quanto para LTA +252 entre os pacientes
que sobreviveram e os que não-sobreviveram (p=0.04413). No entanto, quando
analisado cada genótipo individualmente, nenhuma associação estatisticamente
significativa foi encontrada entre dados genotípicos e óbito secundário à sepse na
população estudada. Isto pode ser explicado devido ao pequeno número de pacientes
que não sobreviveram (36/424), existindo necessidade de aumento amostral para
definição correta do padrão sugerido. De fato, um ensaio clínico deveria incluir
aproximadamente 1.500 crianças com choque séptico para apresentar poder suficiente
na detecção de diferenças nas taxas de mortalidade (Burns et al., 2003). Desta forma, a
110
baixa incidência de óbito secundário à sepse pediátrica requer estudos em grandes
populações para determinar associações positivas entre causa e óbito em estudos em
crianças (Watson e Carcillo, 2005).
A análise estatística de associação entre os haplótipos e o desfecho óbito não foi
possível, devido ao número reduzido de pacientes que não sobreviveram. No entanto, ao
observar as frequências descritas, nenhum dos pacientes que não sobreviveram
apresentavam haplótipo LTA +252 A/TNF -308 A, além do haplótipo LTA +252 G/TNF
-308 G ser mais frequente nos pacientes que evoluiram para o óbito do que nos
sobreviventes. Este resultado sugere um padrão de proteção relacionado ao alelo TNF -
308 A, que no entanto não apresentou significância estatística após a regressão logística.
Os principais estudos publicados na literatura para avaliação da função genética
na infecção são estudos de associação, que comparam a incidência de variações
genéticas específicas em uma população com infecção e em uma população controle.
Mais de 80% dos estudos publicados na literatura utiliza desenhos caso-controle
utilizando marcadores genéticos, como SNPs, em genes escolhidos por sua associação
fisiológica e implicação biológica com a doença (genes candidatos) (Pacheco e Moraes,
2009). A evidência de estudos de associação não é tão forte e deve preencher rigorosos
critérios para aceitação. A variação genética deve ser suficientemente comum em uma
porção significativa da população, portanto, a maioria dos estudos de associação
genética examina polimorfismos. Os desfechos também devem ser suficientemente
frequentes e rígidos, a fim de permitir adequadas comparações. É por este motivo que a
maioria dos estudos foca em pneumonia, sepse e meningite, já que estas infecções estão
associadas com as maiores taxas de letalidade (Wunderink et al., 2003).
111
Há várias limitações nos estudos de associação genética entre polimorfismos e
sepse descritos na literatura. Em muitos destes estudos, a frequência do polimorfimo no
grupo de pacientes com sepse é comparada com a frequência do polimorfismo em uma
população controle saudável. Entretanto, o grupo controle pode não ter sido exposto aos
mesmos patógenos aos quais o grupo de pacientes com sepse foi exposto (Dahmer et
al., 2005). Não se pode concluir, a partir de tais comparações, que o grupo que
desenvolveu sepse tem um risco aumentado de sepse, sem que exista um grupo controle
similarmente exposto, escolhido a partir da mesma população-fonte que originou os
casos. Portanto, o grupo controle mais apropriado para comparação de estudos genéticos
de associação com doenças infecciosas seria um grupo de pacientes com infecção
similar que, no entanto, não desenvolveu sepse. Assim, o principal critério que define se
um indivíduo pode ou não ser utilizado como controle é o fato de ser um caso em
potencial (Cardon e Bell, 2001).
Vários problemas metodológicos podem explicar muitas das discrepâncias
encontradas entre os estudos de associação genética, como: poder estatístico limitado,
populações heterogêneas com fatores de confundimento não reconhecidos, definições
inadequadas dos fenótipos, presença de desequilíbrio de ligação e estratificação das
populações (Solé-Violán et al., 2009).
Os resultados divergentes encontrados em estudos de associação genética na
literatura vigente enfatizam a necessidade de estudos futuros com amostra maior,
incluindo múltiplos polimorfismos e melhor desenhados no que diz respeito ao grupo
controle, para identificar corretamente o grau de influência que a variabilidade genética
tem na sepse (Dahmer et al., 2005). Confirmações dos achados dos estudos já
publicados, bem como associações subsequentes com outros polimorfismos genéticos,
112
aguardam estudos populacionais de larga escala para esclarecer as relações entre fatores
genéticos e não-genéticos possivelmente relacionados a tais desfechos (Wunderink et
al., 2003). Conforme descrito por Pacheco e colaboradores, estudos de associação
genética devem apresentar tamanho amostral adequado para alcançar poder suficiente
para a detecção de diferença significativa entre casos e controles, porém ao mesmo
tempo cautelosos para não desperdiçar recursos com estudos superdimensionados
(2009).
O presente estudo incluiu crianças de um único centro, o que talvez crie um viés
na amostra em questão, dificultando a extrapolação dos resultados para outras
populações. No entanto, permitiu a uniformização do cuidado e a utilização de
protocolos clínicos universais e específicos, sendo criteriosamente utilizados consensos
e os padrões atualmente aceitos na literatura para definição de todos os desfechos
utilizados nas correlações com os genótipos estudados. Isto ajuda a minimizar os erros
de classificação demográfica e clínica, diminuindo eventuais fatores de confundimento
no tratamento clínico disponibilizado aos pacientes e assegurando que um paciente
definido como caso realmente apresente o desfecho em questão.
Uma limitação do estudo é a miscigenização da população brasileira, o que
impede a exclusão de fatores de confundimento relacionados à raça, também impedindo
a categorização criteriosa da população em questão. No entanto, como anteriormente
descrito, esta é uma característica da população brasileira, sendo necessários estudos
para determinação da ancestralidade e caracterização adequada dos grupos étnicos, a
fim de diminuir possíveis questionamentos.
A inclusão de pacientes com sepse primária clínica e secundária a cirurgias em
um mesmo grupo, também pode configurar certa limitação na extrapolação dos
113
resultados. No entanto, a sepse que evolui de forma desfavorável, com necessidade de
ventilação mecânica é muito menos frequente em pacientes pediátricos que em adultos,
o que culminaria em diminuição substancial na amostra de pacientes incluídos e poder
estatístico do estudo, caso fosse realizada esta estratificação da população. Isto também
impede que se realizem análises em pequenos subgrupos, como pacientes internados
com pneumonia, meningococcemia e dengue, devido ao reduzido número de pacientes
admitidos com uma mesma doença em um único centro, também resultando em
diminuição do poder estatístico do estudo.
Neste estudo, apenas dois polimorfismos relacionados à produção de citocinas
foram avaliados. A importância funcional de muitos destes polimorfismos ainda está
por ser elucidada e muitos SNPs podem simplesmente representar marcadores
genotípicos para outras variantes genéticas mais funcionalmente relevantes em
desequilíbrio de ligação, o que também é uma limitação do estudo (Solé-Violán et al.,
2009). Ainda, devem ser realizados estudos posteriores para comprovação do efeito
funcional dos SNPs estudados na população pediátrica, através de dosagens sanguíneas
seriadas das citocinas em questão.
Uma limitação de estudos de associação da distribuição de SNPs com evolução
clínica é que na maioria dos casos, investigadores descrevem a associação entre um
polimorfismo específico e susceptibilidade a uma doença ou evolução clínica.
Entretanto, o SNP que está sendo investigado pode não estar envolvido diretamente,
mas estar proximamente ligado a outra variante genética efetivamente causadora da
associação (Dahmer et al., 2005). Além disso, já foi amplamente descrita na literatura a
existência de uma forte associação entre os SNPs TNF -308 G e LTA +252 A, indicando
que tais polimorfismos não devem ser avaliados isolamente (Waterer et al., 2005).
114
Assim, outro ponto positivo de nosso estudo é a avaliação de ambos os SNPs na maior
parte dos pacientes, assim como a análise de haplótipos quando possível, a fim de evitar
possíveis conclusões inadvertidas.
Além do SNP TNF -308, polimorfismos adicionais foram descritos ainda na
região promotora do TNF e também podem influenciar a sua produção, incluindo TNF -
238, TNF -376, TNF -863 e TNF -1031. Em relação ao LTA, recentemente foi descrita
associação entre outro SNP, na posição LTA +80, e susceptibilidade à hanseníase,
especialmente em pacientes jovens (Alcaïs et al., 2007), o que pode sugerir possível
correlação entre este SNP e infecção em crianças, no entanto ainda não avaliados em
sepse. Nenhum estudo de associação genotipou todos os sujeitos para todos os loci
polimórficos ao mesmo tempo. Portanto, alguns destes polimorfismos podem apenas
estar em desequilíbrio de ligação, estando o verdadeiro SNP em um locus diferente
(Waterer et al., 2005). Ainda, a proximidade dos genes TNF e LTA com outros genes do
cromossomo 6, também imunologicamente importantes e localizados em área adjacente,
incluindo os loci HLA, sistema complemento e heat shock protein pode representar um
fator complicador. Assim mesmo analisando os SNPs TNF -308 e LTA +252
simultaneamente, pode ser que nenhum dos dois SNPs seja o verdadeiro causador do
desfecho, mas marcadores de outra variação importante nesta região rica em genes
relacionados à resposta inflamatória sistêmica (Waterer et al., 2003).
Apesar de algumas limitações, o presente estudo tem muitos pontos positivos.
Primeiramente, apesar de não ser uma coorte grande o suficiente para diminuir erros
estatísticos relacionados ao tamanho amostral, esta população é a maior já descrita para
estudos de associação de genótipos apenas em pacientes pediátricos sépticos (Balding et
al., 2003 – 183 crianças com doença meningocócica invasiva; Hedberg et al., 2004 –
115
173 recém-natos com extremo baixo peso com bacteremia; McArthur et al., 2002 – 34
crianças com hemocultura positiva; Schueller et al., 2006 – 67 recém-natos prematuros
com sepse; Sipahi et al., 2006 – 53 crianças com sepse grave e Weitkamp et al., 1999 –
23 recém-natos com bacteremia).
É sabido que o tamanho amostral é fator crucial em estudos de associação, já que
interfere diretamente no poder do teste e nas frequências dos alelos, que podem se
alterar em amostras muito reduzidas (Cardon e Bell, 2001). Assim, apesar de o estudo
em questão ter limitado poder para detectar diferenças estatisticamente significativas
para genótipos de menor frequência e desfechos mais raros, particularmente em
pequenos subgrupos de pacientes, um número substancial de pacientes desenvolveu
choque séptico (269 pacientes, 63%) e SDRA (121 pacientes, 28%). Mesmo levando em
consideração apenas as frequências de pacientes nos subgrupos com desfechos
estudados, ainda assim os números de pacientes analisados foram maiores que as
populações gerais descritas nos estudos que correlacionam SNPs e sepse em pediatria
na literatura.
Além de terem sido utilizados critérios rigorosos para a caracterização
demográfica e clínica da população estudada, foram levados em consideração os
possíveis fatores de confundimento que poderiam alterar o impacto das variantes
genéticas na gravidade e evolução das crianças sépticas em todas as análises estatísticas.
O presente estudo demonstrou associação entre o SNP TNF -308 e SDRA em
pacientes pediátricos criticamente enfermos, porém não foi realizado estudo funcional
para determinar e quantificar a produção de TNF em tais pacientes. Devido à
importância da identificação da associação e comprovação do seu significado funcional,
torna-se imprescindível a correlação do polimorfismo do TNF -308 com a produção do
116
TNF em pacientes pediátricos criticamente enfermos e com SDRA. Assim, estudos
laboratoriais devem ser realizados para definir quais polimorfismos são funcionais e
quais são marcadores de polimorfismos não identificados, com os quais estejam em
desequilíbrio de ligação. Apenas após um núcleo de marcadores genéticos bem
validados com significado funcional comprovado, os clínicos e pacientes passarão a
observar os benefícios dos estudos genéticos que estão sendo desenvolvidos neste
momento (Waterer et al., 2005).
117
11. Conclusões
1. Os resultados aqui apresentados sugerem que o SNP TNF -308 está associado ao
desenvolvimento de SDRA em pacientes pediátricos criticamente enfermos,
sendo que os heterozigotos GA e os carreadores A apresentam risco três vezes
menor de evoluir com SDRA, quando comparados aos homozigotos GG e
carreadores G.
2. Não há associação entre o SNP LTA +252 e o desenvolvimento de sepse, choque
séptico ou SDRA na população de pacientes pediátricos criticamente enfermos
estudada.
3. Não há associação entre o SNP TNF -308 e o desenvolvimento de sepse e
choque séptico na população de pacientes pediátricos criticamente enfermos
estudada.
4. Os SNPs TNF -308 GA e LTA +252 GA parecem também se comportar como
protetor para a evolução para o óbito em pacientes pediátricos criticamente
enfermos, no entanto, por ser este desfecho raro na população estudada, são
necessários estudos confirmatórios em populações maiores.
118
12. Perspectivas Futuras
A predisposição genética desempenha importante papel na definição da resposta
a um estímulo infeccioso e na determinação de um resultado após uma intervenção. A
capacidade em detectar polimorfismo genéticos confiavelmente e rapidamente não está
distante e permitirá o manuseio dos pacientes precocemente, preferivelmente de forma a
prevenir a doença, ao invés de tratar suas sequelas (Marshall et al., 2002). Além disso,
alguns autores sugerem que, futuramente, ensaios clínicos passem a definir populações
de pacientes de acordo com seu perfil de expressão de citocinas (Ulloa e Tracey, 2005)
e a incorporação do risco genético nas recomendações de imunizações passe a ser uma
estratégia clínica lógica (Waterer et al., 2005).
O estudo dos polimorfismos do TNF e LTA pode ser útil em selecionar, para
monitorização de cuidados intensivos ou tratamento profilático, pacientes de risco no
pré-operatório em situações sépticas. Além disso, o genótipo pode ser também utilizado
para selecionar pacientes para ensaios clínicos utilizando terapias anti-TNF. Embora
muitos polimorfismos candidatos tenham sido identificados, os dados atuais são
limitados pelo pequeno número de pacientes que foram estudados e pelos resultados
inconsistentes apresentados por diferentes grupos de pesquisa (Waterer et al., 2005).
Estratégias terapêuticas objetivando a modulação da resposta inflamatória do
hospedeiro necessitam levar em consideração a redundância da resposta inflamatória do
hospedeiro e as respostas heterogêneas entre diferentes indivíduos. Assim, poderá
permitir o uso mais racional de terapias imunomoduladoras, tanto com o objetivo de
aumentar, quanto de inibir a resposta imunoinflamatória específica (Wheeler et al.,
119
2001). Ainda, através da identificação de polimorfismos potencialmente deletérios, a
expressão dos genes envolvidos utilizando terapias gênicas específicas poderá ser
modulada (Marshall et al., 2002).
A terapia gênica representa uma nova abordagem para o tratamento da doença,
envolvendo a substituição ou adição de cópias normais de um gene mutante ou em falta
no tratamento de uma desordem relacionada a um único gene herdado (Wheeler et al.,
2001). Abordagens similares podem ser utilizadas no tratamento da sepse ou outras
doenças associadas com uma resposta inflamatória sistêmica alterada. Por exemplo, a
transferência de IL-10 mediada por adenovírus reduziu a resposta inflamatória em
modelos in vivo de lesão pulmonar aguda (Minter et al., 2000 e 2001). Em um outro
exemplo, a expressão de receptor solúvel para o TNF mediada por adenovírus conferiu a
camundongos proteção contra choque mediado por endotoxinas (Kolls et al., 1994).
Embora protocolos para ensaios clínicos que utilizam terapia gênica em humanos
tenham sido aprovados, muitas mudanças significativas ainda são necessárias para que
esta terapia promissora alcance sucesso (Wheeler et al., 2001).
Levando em consideração a rapidez do desenvolvimento na área de genômica e
os avanços continuados da tecnologia microarray, que possibilita o estudo do genoma,
ao invés de apenas um gene, espera-se que mais polimorfismos sejam descobertos em
um futuro próximo (Wheeler et al., 2001).
Assim, pode-se visualizar como perspectiva futura, a possibilidade de determinar
as crianças com potencial de evoluir de forma desfavorável, intensificando sua
vigilância e assistência primária, abordando-a em um momento inicial de um quadro
infeccioso e referindo-a para uma unidade especializada o mais precocemente possível.
Assim, futuramente, a monitorização molecular de acordo com o perfil da criança
120
admitida na Unidade de Pacientes Graves do IFF-FIOCRUZ poderá ser padronizada,
objetivando a estratificação dos pacientes com potencial de maior gravidade e, portanto,
alvo de uma terapêutica mais específica.
121
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14. Anexos
Anexo A
143
144
Anexo B
145
146
Anexo C
147
Anexo D
148
149
150
151
152
153
Anexo E
154
155
156
157
158
159
160
