UNIVERSIDADE DE ÉVORA

Curso de Biologia

Efeito de Práticas Culturais Sobre o Potencial Micorrízico de um Solo

Trabalho de Fim de Curso realizado por:

Pedro Alcântara de Melo Madeira Antunes

Évora

1999

UNIVERSIDADE DE ÉVORA

Curso de Biologia

Efeito de Práticas Culturais Sobre o Potencial Micorrízico de um Solo

Trabalho de Fim de Curso realizado por:

Pedro Alcântara de Melo Madeira Antunes

Évora

1999

Este trabalho não inclui as observações e críticas feitas pelo júri.

AGRADECIMENTOS

À Eng. Isabel Brito, pela orientação e ajuda neste estágio, por ter sido sempre

incansável, disponível e também pelo apoio e conselhos sobre muitos aspectos

que transcendem o próprio trabalho em si, mas fazem o dia a dia durante um ano

nesta fase particular da vida.

Ao Professor Figueiredo Marques, pelo cuidado com que me encaminhou para

este estágio, pelos ensinamentos e entusiasmo que sempre teve pelo que eu

estava a fazer.

Ao Eng. Luís Alho, pela permissão em trabalhar no laboratório de que é

responsável, e pela enorme paciência que teve a refazer matrizes e “aturar” o

computador.

Aos meus pais, por serem tão meus amigos e aos meus tios por me terem

“suportado” 5 anos em Évora.

À “avó Tina” e Verediana que se preocuparam sempre comigo.

A todos os que trabalham no Laboratório de Microbiologia do Solo (ICAM).

Ao Eng. Casas Novas e Eng. Nuno Riscado, da Herdade da Revelheira, pela

ajuda que sempre disponibilizaram.

Ao Dr. Luís Dias, pela ajuda na estatística do MPN. À minha colega e amiga Catarina, pela ajuda e companhia.

Aos meus amigos, João, Miguel, Tarcísio, Roca e Rute que sempre me apoiaram

desde que vim para Évora.

À Joana.

E finalmente a todos aqueles que contribuíram para a realização deste estudo e

me esqueci de agradecer.

Na capa: adaptação de uma aguarela de António Eiras

A meus pais e a meus tios, Rogério e Elsa

1 – SUMÁRIO

Não existem entre nós até hoje dados relativos a experiências sobre a

forma como as práticas culturais no Alentejo influenciam os fungos micorrízicos

arbusculares (AMF). O estudo que se apresenta consiste numa primeira

abordagem na tentativa de avaliação desta influência. Inseriu-se num projecto

mais vasto que visa estudar sistemas alternativos à rotação de culturas e

mobilização tradicional alentejanas.

Neste sentido, realizou-se um ensaio de MPN (Most Probable Number),

quantificaram-se esporos e acompanhou-se a taxa de colonização das raízes

pelos referidos fungos nas diferentes culturas e para as diferentes mobilizações.

Verificou-se que, tanto o antecedente cultural como o tipo de mobilização e

a época do ano inerente às culturas, tiveram diferentes impactos na população de

esporos de AMF, assim como na micorrização. Uma curta interrupção entre a

sucessão de culturas na rotação, conjuntamente com uma mobilização

alternativa, menos intensa, parece favorecer a micorrização. Tal, foi mais

evidente nos cereais de Inverno do que na cultura de Primavera.

A informação que sobressai deste estudo será importante no delineamento e

interpretação em futuras abordagens sobre esta matéria.

1

2 - INTRODUÇÃO

A produção agrícola em Portugal, e em particular no Alentejo, região

onde teve lugar este trabalho, para além de acompanhar a crescente

necessidade mundial em alimentos, vê-se confrontada com medidas

económicas competitivas impostas pela União Europeia (Basch, 1991). Tais

factos, em conjunto com as dificuldades do clima Mediterrânico, que se

traduz num Inverno chuvoso e numa secura estival pronunciada (Rivas–

Martinez, 1990), e com as pobres características pedológicas, com uma

elevada percentagem de solos pouco profundos e férteis, contribuíram para o

desenvolvimento de sistemas agrícolas intensivos, onde muitas vezes se

utilizam práticas culturais desadequadas e quantidades significativas de

fertilizantes inorgânicos e pesticidas (Hooker e Black, 1995). Contudo, há

uma crescente preocupação com os custos ambientais infligidos por estes

sistemas intensivos, o que tem conduzido a uma tentativa de mudança que

consiste na sua substituição por sistemas agrícolas sustentáveis, que

maximizem o aproveitamento dos mecanismos naturais vantajosos existentes

no solo (Brito, 1997). Hooker e Black (1995), adiantaram que um sistema

agrícola sustentável, para além de ser aquele que continua sempre a

produzir, tem de ir ao encontro das necessidades da actual geração sem

comprometer as das gerações vindouras. Os mesmos autores, acreditam que

a rapidez desta mudança depende em parte da economia e da legislação,

mas também do esforço ao nível da investigação científica. É exactamente

neste último aspecto que se encontra a aplicabilidade deste trabalho.

Os fungos micorrízicos arbusculares (AMF-Arbuscular Mycorrhizal

Fungi) são microorganismos simbióticos benéficos, que se desenvolvem ao

2

nível da raiz e contribuem para o aumento da maioria das produções

agrícolas (Menge, 1983). Segundo Abbott et al. (1995), a eficaz utilização das

simbioses micorrízicas na agricultura Mediterrânica, depende do

desenvolvimento dos conhecimentos sobre várias relações chave, entre os

componentes da simbiose e as condições do solo.

A experiência aqui relatada, foi levada a cabo no Laboratório de

Microbiologia do Solo (ICAM), instalado na Universidade de Évora, e num

campo de ensaios da Herdade da Revelheira, pertencente à Direcção

Regional de Agricultura do Alentejo. Nesse campo de ensaios, desde

1995/96 que se aplica um sistema de rotação de culturas trienal, tradicional

nesta região, o qual consiste na utilização de 2 anos de cereal (trigo –

Triticum durum var. Centauro e triticale – X. triticosecale Wittmark e de uma

cultura de Primavera (o girassol – Helianthus annuus L.). Em cada um dos

campos do sistema de rotação aplicam-se, desde esse ano, diferentes

sistemas de mobilização do solo (e.g. lavoura, escarificação e sementeira

directa). O objectivo visa descobrir alternativas à mobilização tradicional, que

contribuam, ao mesmo tempo, para a preservação dos solos, melhoria nas

produções e redução nos custos. Foi neste contexto que se inseriu este

trabalho e se delinearam os seus objectivos para estudar os AMF. Estes,

foram tentar compreender por um lado, tendo em conta o sistema de rotação,

qual a influência que a cultura antecedente pode ter tido na cultura seguinte e

no solo, e, por outro, qual foi o tipo de mobilização do solo mais vantajosa

para o desenvolvimento da simbiose. Para se alcançarem estes objectivos

cumpriram-se várias etapas, que numa primeira fase consistiram em avaliar o

inóculo inicial de AMF. Para isso quantificaram-se os esporos de AMF e

realizou-se um ensaio de MPN (Most Probable Number). Numa segunda

3

fase, pretendeu-se detectar em que momento e com que taxa se estabeleceu

a colonização micorrízica e daí em diante, acompanhar as alterações nesta

taxa ao longo do desenvolvimento das culturas. Por fim, tentou-se averiguar

se houve alguma relação de causa-efeito entre os níveis de micorrização

observados e as produções obtidas. Durante o decorrer do trabalho, verificou-

se a necessidade de testar diferentes procedimentos experimentais de

coloração de raízes, para seleccionar aquele que melhor se adaptava às

raízes estudadas.

4

3 - MICORRIZAS

3.1 - Caracterização e tipos

As micorrizas representam uma das menos compreendidas, mais

ubíquas e mais importantes simbioses biológicas na Terra. O termo

“symbiotismus” foi usado pela primeira vez pelo Professor A. B. Frank em

1877. Simbiose (do gr. syn, juntamente, e bios, vida), é uma associação entre

dois ou mais organismos diferentes, os simbiontes. Este tipo de associação

pode ter diversos benefícios e custos para os simbiontes, o que faz com que

se reconheçam diferentes tipos de simbioses. Foi deBary, em 1887, que

formalizou estes diferentes tipos, utilizando os sinais + / 0 / - respectivamente

para os casos em que as interacções são benéficas, indiferentes ou

prejudiciais (Allen, 1996) (Quadro 1).

Quadro 1 – Tipos de simbiose entre organismos (deBary, 1887 in Allen, 1996).

Esp

écie

2

Espécie 1

+ 0 -

+ Mutualismo Comensalismo Parasitismo

0 Comensalismo Neutralismo Amensalismo

- Parasitismo Amensalismo Antagonismo

Daí para cá, o termo simbiose passou a ser usado para definir

associações benéficas e o parasitismo tornou-se quase sinónimo de

patogenecidade (Smith e Read, 1997).

Para Jean-Marie Pelt (1996), os fenómenos de simbiose, que têm

vindo a atrair cada vez mais a atenção dos biólogos, são eminentemente

construtores, e é pela sua acção contínua que se estruturam as organizações

complexas, as quais, ao atingirem um certo nível de complexidade, se tornam

o centro de propriedades novas e construtoras. Tais considerações vêm ao

5

encontro da teoria endosimbiótica, cuja base de sustentação passa por

admitir que os organelos dos eucariotas tiveram origem em procariotas

simbiontes que se modificaram (Margulis e Bermudes, 1985).

Foi também o Professor Frank que, no ano de 1885, utilizou pela

primeira vez o nome “mykorhiza” (do gr. mykes, fungo, e rhiza, raiz), para

descrever a união de dois seres diferentes com a finalidade de formar um

único órgão morfológico, no qual a planta alimenta o fungo e este a planta

(Sieverding, 1991). Hoje sabe-se que a micorriza, descrita como uma

associação mutualista altamente evoluída entre certos fungos existentes no

solo e raízes de plantas (Brundrett et al., 1996), é a simbiose mais comum no

mundo vivo.

Há registos fósseis de micorrizas a colonizar plantas primitivas como a

Rynia ou o Psilophyton, pelo que se pensa que o seu aparecimento terá

ocorrido há cerca de 353 a 462 milhões de anos. Assim, é provável que o

aparecimento das micorrizas tenha tido um papel fundamental na colonização

terrestre das plantas vasculares (Simon et al., 1993).

As micorrizas podem ser encontradas numa multiplicidade de habitats,

que vão desde os aquáticos (e.g. Sondergaard e Laegaard, 1979 in Allen,

1996), aos desérticos (e.g. Singh e Varma, 1991, in Allen, 1996), na floresta

tropical (e.g. Janos, 1987 in Allen, 1996), nas latitudes (e.g. Christie e

Nicolson, 1983 in Allen, 1996) e altitudes elevadas (e.g. Read e

Haselwandter, 1981 in Allen, 1996). Este facto, aliado à universalidade desta

simbiose, a qual se pode encontrar em praticamente todas as famílias do

reino Plantae (95% das espécies conhecidas), muitas vezes em taxas

elevadas, suporta ainda mais a sua importância e ancestralidade. Uma

6

estimativa sugere que existem entre 5000 a 6000 espécies de fungos

micorrízicos (Molina et al., 1992 in Brundrett et al., 1996).

A transferência bidireccional de nutrientes é a base desta simbiose

mutualista. O fungo envolvido, ou micobionte, promove a aquisição de

nutrientes e água para a planta e protege o sistema radicular de muitos

patógenos (Killham, 1995). A planta fornece carbono orgânico ao micobionte,

do qual este é completamente dependente (Smith e Read, 1997).

Existem pelo menos sete tipos diferentes de associações micorrízicas

(que se agrupam em ectomicorrizas e endomicorrizas), envolvendo diferentes

grupos taxonómicos de fungos e plantas e diferentes padrões de alterações

morfológicas, que ocorrem durante o estabelecimento da colonização pelo

fungo (Brundrett et al., 1996).

3.1.1 - Ectomicorrizas

A maioria dos fungos micorrízicos formam ectomicorrizas. São mais de

4000 espécies, que pertencem predominantemente às classes Ascomiceta e

Basidiomiceta (Brundrett et al., 1996).

Este tipo de associação caracteriza-se pela ocorrência de três

componentes estruturais. São eles a presença de um manto ou escudo de

tecido fúngico que envolve a raiz, uma rede micelial que se desenvolve

intercelularmente na zona cortical sem nunca penetrar nas células, a qual se

denomina por rede de Hartig e por um sistema externo de hifas que se ligam

ao solo e aos corpos frutíferos típicos destes fungos (Smith e Read, 1997).

As plantas assim colonizadas, apresentam normalmente alterações

morfológicas nas raízes, que se traduzem num crescimento mais lento e em

7

espessamentos terminais que aumentam a superfície de absorção. Uma vez

que os simbiontes plantas mais comuns deste tipo de micorriza são árvores e

as ectomicorrizas constituem uma importante componente da biomassa nos

mais variados ecossistemas florestais (das florestas de coníferas às savanas

e florestas húmidas), as ectomicorrizas contribuem fortemente para a nutrição

e reciclagem de nutrientes (Brundrett et al., 1996).

3.1.2 - Endomicorrizas

Neste tipo de micorrizas, os fungos desenvolvem-se inter e

intracelularmente, formando no interior das células corticais estruturas

específicas, a saber:

a) Micorrizas ericoides – este tipo envolve apenas plantas da ordem Ericales.

As células epiteliais das raízes destas plantas não produzem pêlos

radiculares. Em vez disso, muitas são colonizadas por fungos micorrízicos

chamados ericóides, os quais formam enrolamentos de hifas

intracelulares. Apesar de ainda haver alguma controvérsia sobre esta

matéria, é geralmente aceite que os fungos que formam este tipo de

micorriza são septados, sobretudo pertencentes à classe Ascomiceta.

Muitas ericaceas crescem em solos ácidos e pobres em matéria orgânica,

tendo vindo a tornar-se claro que o fungo tem um papel considerável na

mobilização de nutrientes com vista a torná-los disponíveis para a planta

(Allen, 1996).

8

b) Micorrizas orquideáceas – este tipo envolve apenas plantas da família

Orchidaceae. A diversidade e distribuição desta família é enorme. Estas

plantas têm sementes pequenas, com poucas reservas, e muitas, parcial

ou completamente, são aclorofiladas durante parte do seu ciclo de vida.

Assim, são colonizadas logo após a germinação e, as aclorofiladas,

dependem do fornecimento de carbohidratos e nutrientes minerais deste

tipo de fungos micorrízicos. Estes, pertencem à classe Basidiomiceta e

também formam enrolamentos de hifas no interior das células radiculares

(Smith e Read, 1997).

c) Micorrizas arbusculares – tipo de associação que constitui o objecto de

estudo central deste trabalho, e passa a analisar-se e descrever de forma

mais pormenorizada no capítulo seguinte.

d) Ectendomicorrizas, arbutóides e monotropóides – estes tipos possuem

características pertencentes às ectomicorrizas, como a rede de Hartig, e

às endomicorrizas, como designadamente a penetração e formação de

estruturas no interior das células. As micorrizas arbutóides e

monotropódes surgem respectivamente nas famílias Ericaceae e

Monotropaceae.

9

4 – MICORRIZAS ARBUSCULARES

4.1 – Biologia

As micorrizas arbusculares, são o tipo mais comum de endomicorrizas

existentes no solo. Apesar de colonizarem uma enorme variedade de plantas

(Gimnospérmicas, Angiospérmicas, Pteridófitas e até Briófitas), as herbáceas

são aquelas que lhes estão mais associadas. Apesar de não haver

especificidade fungo-planta, reconhece-se haver preferências (Mosse, 1975).

Ao contrário do que sucede com as ectomicorrizas, as micorrizas

arbusculares não produzem estruturas sexuadas e não podem desenvolver-

se em cultura axénica. Tal deve-se ao facto de serem simbiontes obrigatórios

(Peterson e Bonfante,1994 in Brito, 1997), pelo que o estudo destes

organismos tem necessariamente de ultrapassar algumas dificuldades (Brito,

1997).

Inicialmente, começou por usar-se a designação VAM (Vesicular

Arbuscular Mycorrhiza) para este tipo de endomicorriza, devido às estruturas

características que desenvolvem, as vesículas e os arbúsculos. Actualmente

utiliza-se a designação micorrizas arbusculares (AM – Arbuscular

Mycorrhiza), uma vez que se sabe não serem produzidas vesículas nas

espécies pertencentes à sub-ordem – Gigasporinae (Walker, 1995) (ver 4.2).

10

4.1.1 – Fontes de inóculo

A colonização das raízes pelos AMF pode ter início a partir de

diferentes fontes de inóculo. Estas podem ser os esporos, as hifas ou

quaisquer outros elementos que as tenham, como acontece com os

fragmentos de raízes colonizadas. Todas estas fontes têm colectivamente o

nome de propágulos.

Os AMF não conseguem decompor matéria orgânica e conforme já foi

referido, estão dependentes da simbiose para a manutenção do seu

crescimento vegetativo. Nestas circunstâncias, a eventual falta de um

simbionte planta torna-se um exercício de sobrevivência para o fungo,

normalmente alcançado através da formação de esporos (Killham, 1995). Os

esporos (fig. 1), que se pensou serem, durante muitos anos, a única fonte de

inóculo, são estruturas de resistência, que poderão permitir a sobrevivência

do fungo a longo prazo (anos), persistindo no solo em estado latente até

surgirem as condições adequadas para a sua germinação. O seu diâmetro,

que depende das espécies de AMF, pode variar entre os 10µm e os 1000µm.

Possuem substanciais capacidades de armazenamento energético, contendo

lípidos e carbohidratos. Albergam também uma elevada quantidade de

informação genética, possuindo milhares de núcleos (Giovannetti e

Gianinazzi-Pearson, 1994). Estas características supõe-se que lhes confiram

vantagens selectivas que ainda se encontram em discussão.

O recrescimento de hifas a partir de fragmentos de raízes colonizadas

foi observado por diversos autores (e.g. Magrou, 1946; Williams, 1990 in

Smith e Read, 1997). Os trabalhos de Tommerup e Abbot (1981), sugerem

11

que as hifas podem sobreviver em raízes mortas, pelo menos durante 6

meses em solos secos.

Após o estabelecimento da colonização micorrízica e durante a sua

evolução, forma-se uma rede micelial de hifas extraradicais, que crescem

através do solo a partir das raízes colonizadas. Esta rede, para além de

também constituir mais uma importantíssima fonte de inóculo, ou propágulo

(capaz de se manter no solo com capacidade de colonização, durante

períodos em que as condições não são favoráveis), é o elemento mais

importante na apreensão e transporte de nutrientes do solo para a planta. É

sobretudo na rede extraradical que se formam os esporos. A sua formação,

pode ocorrer logo passadas 3 a 4 semanas após a colonização, ou passados

mais de 6 meses, dependendo dos géneros de AMF.

É difícil, numa situação de campo, distinguir quais são as contribuições

relativas dos diferentes tipos de propágulos para a colonização de raízes.

Assim, se há situações em que são os esporos a principal fonte de inóculo,

havendo uma correlação entre o seu número e a extensão da colonização,

situações há em que tal não acontece (Smith e Read, 1997). É por esta razão

que, para se avaliar o potencial micorrízico de um solo, não basta apenas

quantificar o número de esporos, mas é necessário quantificar todos os

propágulos. Este facto é evidenciado por Porter (1979), num ensaio em que

Figura 1 - Esporos de micorrizas arbusculares. (Ampliação 400x)

12

quantifica o número de propágulos de dois solos, através do método do

número mais provável (MPN – Most Probable Number, ver 7.2.1), e compara

os resultados com a contagem de esporos, extraídos pelo método de

crivagem húmida e centrifugação em gradiente de sacarose (ver 7.2.2). Nos

dois solos, a contagem de esporos revelou 95 e 499 esporos em 50 g de solo

e respectivamente, o MPN, 230 e 752 propágulos em 50 g de solo. Também

An et al. (1990), no seu estudo sobre populações micorrízicas utilizaram os

dois métodos. Com o MPN detectaram 17 espécies, enquanto com a

contagem de esporos detectaram apenas 10 espécies. Estes resultados

explicam-se pelo facto de, para além de haver no solo outros propágulos

diferentes dos esporos conforme já foi referido, haver esporos que se formam

dentro das raízes, outros que já não estão viáveis e outros que são muito

pequenos. Há espécies que apenas se desenvolvem na presença de certas

plantas, dependendo da época de recolha de amostras de solo. Os esporos

podem apenas ser um indicador do passado e não do potencial actual. Por

estas razões, estes investigadores consideram que vale a pena o trabalho

extra de realizar um ensaio de MPN e que, para estudos de ecologia, como é

o caso, o uso dos dois métodos é recomendável.

4.1.2 – Como se inicia e evolui a colonização

Segundo Sieverding (1991), o processo pelo qual se gera a

colonização pode ser separado em três fases distintas: - a pré-colonização, a

penetração e a formação de arbúsculos e vesículas. Durante a pré-

colonização, estabelecem-se as trocas de sinais químicos entre os

simbiontes dependendo das condições favoráveis do solo, que, em conjunto,

13

contribuem para o despoletar da colonização micorrízica. Em termos de

trocas químicas, vários trabalhos indicam que são os compostos orgânicos

produzidos pelas plantas e exudados para a rizosfera que estimulam a

germinação dos propágulos (Koske e Gemma, 1992 in Brito, 1997). As

condições favoráveis presumivelmente são sobretudo determinadas pelo teor

em nutrientes e humidade do solo, a luz, a temperatura e o pH. Estes factores

ambientais continuarão a influenciar a colonização depois de ultrapassada

esta fase inicial do seu estabelecimento.

Dos nutrientes presentes no solo o fósforo (P) é aquele que tem maior

influência a este nível. É unanime que quando se verificam níveis elevados

de P disponível para as plantas há uma redução na colonização micorrízica

(Hayman, 1983). Por outro lado, se o solo for demasiado pobre em P, a

utilidade de AMF neste domínio deixa de ser necessária e também é reduzida

(Koide, 1993). A intensidade luminosa assim como o fotoperíodo têm uma

forte influência nas plantas e consequentemente nos AMF, conforme é

evidenciado por alguns estudos (e.g. Finlay e Söderström, 1992; Harley e

Smith, 1983; Hayman, 1983 in Brito, 1997), em que se verificou haver maior

intensidade da colonização micorrízica quando a luminosidade era mais

intensa e prolongada. Os efeitos da temperatura são complexos e as

respostas variam de acordo com as espécies de plantas e fungos envolvidos.

Ainda assim, é aceite que a temperatura óptima para o desenvolvimento da

colonização se situa pelos 30ºC (Smith e Read, 1997), e que naturalmente

com o aumento da temperatura até ao óptimo a rapidez com que esta ocorre

é superior. Segundo Graw (1979), os efeitos do pH nos AMF variam de

acordo com o tipo de solo e simbiontes em causa. No entanto, este autor

assim como outros por si referidos (e.g. Mosse, 1971; Strzemsk, 1973;

14

Hayman e Mosse, 1971), indicam que a micorrização ocorre perfeitamente

em solos com valores de pH entre 4 e 7.

A colonização primária, ocorre quando se dá a penetração da raiz por

parte do tubo germinativo ou hifa de germinação de um esporo ou de

qualquer outro propágulo. À colonização por uma hifa que já adquire energia

a partir da planta, chama-se colonização secundária. Normalmente, logo após

o contacto do fungo com a raiz, forma-se frequentemente um apressório

(estrutura espessa e rica em lípidos), cuja função consiste em provocar o

espessamento das paredes das células da epiderme para facilitar a

proliferação da hifa. Após a penetração, que ocorre entre as células da

epiderme, o fungo abandona a sua curta fase autosuficiente. As hifas

desenvolvem-se intercelularmente e em 2 a 5 dias inicia-se a penetração das

células corticais e a formação de arbúsculos no seu interior. Os arbúsculos

(fig. 2-A), são ramificações terminais das hifas que se dicotomizam

profusamente, produzindo uma estrutura sob a forma de árvore. A membrana

citoplasmática da célula da raiz molda-se em torno das ramificações, sem

nunca ser perfurada, constituindo-se um espaço apoplástico, com uma larga

superfície de contacto, onde, presumivelmente, se dão as trocas

bidireccionais de nutrientes. Os arbúsculos vivem apenas entre 4 a 15 dias,

findos os quais as células restabelecem o seu funcionamento normal uma vez

que a sua actividade metabólica se encontrava aumentada (Sieverding,

1991). Como o processo de formação e degeneração de arbúsculos está

permanentemente a ocorrer, é possível observar os diferentes estadios do

seu desenvolvimento sempre que se observa uma raiz. Ao mesmo tempo que

se formam os arbúsculos, ou um pouco depois, alguns AMF formam

vesículas (fig. 2-B). Estas são estruturas globosas formadas nas hifas,

15

Figura 3 - Representação da colonização por AMF e suas principais estruturas. (Adaptado de Brundrett et al., 1994)

ocorrem mais frequentemente intercelularmente, e têm como função

armazenar substâncias lipídicas para alimento de reserva do fungo em

situações de stress. Alguns autores defendem que as vesículas podem

também ser uma fonte de inóculo para o fungo (e. g. Strullu e Plenchette,

1991).

O aspecto da colonização micorrízica, e suas principais estruturas

pode observar-se na fig. 3.

A evolução da colonização por AMF no sistema radicular é um

processo dinâmico em que,

tanto os componentes do fungo

como os da raiz, se vão

desenvolvendo de forma

interrelacionavel. De acordo

com os trabalhos de vários

autores (e.g. Sanders et al,

1977 in Smith e Read, 1997;

Toro, 1986 in Sieverding, 1991),

a taxa de colonização ao longo do tempo representa-se por uma curva

sigmóide (fig. 4). Segundo Sieverding (1991), a fase inicial (fase de latência)

A B Figura 2 - A – Arbúsculo (ampliação 1000x); B – Vesícula (ampliação 1000x).

16

representa o momento em que está a decorrer a colonização primária e a

fase exponencial, o momento em que o fungo está em plena expansão, tanto

inter como intracelularmente, como ainda através da rede extraradical. Na

fase de estabilização (fase estacionária), o crescimento do fungo e da raiz

mantém uma taxa de crescimento paralelo. Smith e Read (1997), referem

investigações em que se observou uma fase de declínio por parte do fungo.

4.2 – Taxonomia

Segundo Morton e Bentivenga (1994), as características morfológicas

associadas com a formação dos esporos e com a sua estrutura, são

suficientemente estáveis e diversas para se reconhecerem pelo menos 150

espécies de micorrizas arbusculares. A sua taxonomia, segundo Morton e

Benny (1990), encontra-se organizada do seguinte modo:

Figura 4 - Fases da colonização por AMF do sistema radicular de Sorgo após inoculação com 2 esporos por grama de solo. A linha a tracejado corresponde aos esporos (nº/g de solo seco) e a linha contínua à percentagem de colonização da raíz. (Adaptado de Toro, com. pess., in Sieverding, 1991).

17

REINO - Fungi

DIVISÃO – Zygomycotina

ORDEM – Glomales

SUB-ORDEM – Glomineae

FAMÍLIA – Glomaceae

GÉNERO – Glomus

FAMÍLIA – Acaulosporaceae

GÉNERO – Acaulospora

GÉNERO – Entrophospora

SUB-ORDEM – Gigasporinae

FAMÍLIA – Gigasporaceae

GÉNERO – Gigaspora

GÉNERO - Scutellospora

A divisão da ordem Glomales em duas sub-ordens, baseia-se

principalmente na presença e ausência de vesículas, respectivamente em

Glomineae e Gigasporinae.

Na família Glomaceae os esporos formam-se nas extremidades das

hifas. Têm em geral uma organização interna simples, apresentando apenas

uma a duas paredes.

Na família Acaulosporaceae, observa-se um sáculo esporífero que

cresce terminalmente em hifas especializadas. Este coalesce à medida que o

esporo se vai desenvolvendo, deixando-lhe cicatrizes características. Os

esporos deste grupo, para além de também possuírem uma parede rígida

com três camadas, têm uma sequência de várias paredes internas flexíveis.

Nas espécies pertencentes ao género Acaulospora os esporos formam-se

lateralmente em relação à hifa que os origina, pelo que ficam com uma

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cicatriz nessa região. As espécies do género Entrophospora são idênticas

aos de Acaulospora, mas com duas cicatrizes nos pólos opostos dos

esporos.

A família Gigasporaceae, caracteriza-se sobretudo pela existência de

uma estrutura globosa na zona em que a hifa de ligação sai do esporo. No

género Gigaspora (que nunca foi descrito na Europa), os esporos possuem

uma parede com duas camadas. Os esporos das espécies pertencentes ao

género Scutellospora, tal como acontece com as de Acaulospora, possuem

várias paredes internas, mas caracterizam-se sobretudo pela presença de um

escudo germinativo, que é uma estrutura formada pela intrusão de citoplasma

do esporo entre as camadas da parede membranosa interior.

4.3 – Benefícios decorrentes da micorrização

4.3.1 - Para a planta

Se, conforme já se referiu, as micorrizas tiveram um papel fundamental

na colonização do meio terrestre por parte das plantas, é porque lhes

trouxeram benefícios que permitiram ultrapassar os obstáculos impostos pelo

novo meio.

A rede extraradical de micélio, juntamente com a capacidade de

dispersão das hifas, por entre as partículas de solo, proporcionam à planta

micorrizada maior volume de solo explorado. Segundo Sieverding (1991) 1

cm de raiz não micorrizada pode explorar apenas 1 a 2 cm3 de solo, a

mesma, poderá usufruir de 12 a 15 cm3 caso esteja colonizada. De facto, o

micobionte proporciona não só maior acessibilidade como também maior

eficiência na aquisição de nutrientes, em particular dos que são menos

19

móveis no solo (P, Zn, Cu). Destes, o P é particularmente importante, porque

é um macronutriente principal, que na maioria dos solos se encontra

disponível em quantidades limitadas. A sua importância advém sobretudo do

facto de entrar na composição de um grupo importante de compostos

fundamentais para o metabolismo das plantas, ATP e NADPH. Estas,

absorvem este nutriente sobretudo na forma de ortofosfato primário, H2PO4-,

o qual é absorvido em torno da raiz mais rapidamente do que consegue ser

reposto por difusão (Santos, 1991). São as hifas de AMF, que crescem para

além desta zona, que o conseguem captar a partir de zonas inacessíveis à

raiz (Allen, 1996).

É unanimemente aceite que a presença do micobionte favorece a

planta nas suas necessidades de água, tornando-a mais resistente à seca

(Kothari et al., 1990). Este proporciona uma absorção de água facilitada, não

só porque as hifas extraradicais têm acesso a maior volume de solo do que a

raiz, como conseguem penetrar em poros de menores dimensões, uma vez

que o seu diâmetro (cerca de 5µm) é inferior ao dos pêlos radiculares mais

finos (cerca de 500µm). No entanto, há alguma controvérsia sobre este

assunto, havendo quem suporte que a absorção de água não é realizada

directamente pelas hifas, e que o seu papel benéfico nas relações água-

planta se deve às alterações induzidas na nutrição e outros efeitos

secundários (Faber et al., 1991).

Da interacção dos AMF com outros organismos do solo surgem

benefícios, umas vezes resultantes da modificação das interacções entre as

plantas e organismos patogénicos, como nemátodes, que se provou serem

fortemente inibidos pela presença de AMF (Ingham, 1988), ou fungos (e.g.

Fusarium spp.), outras vezes resultantes de efeitos sinérgicos com outros

20

agentes benéficos, como é o caso da simbiose mutualista em que a fixação

de azoto é realizada por bactérias do género Rhizobium (Fitter e Garbaye,

1994).

Todos estes efeitos, em conjunto, conduzem naturalmente ao

desenvolvimento de plantas mais robustas, o que resulta em melhores

hipóteses na obtenção de boas colheitas.

4.3.2 – Para o solo e ecossistema

O solo é um meio complexo tridimensional, que consiste em partículas

cujas dimensões podem variar entre diâmetros inferiores a 2µm (argila) até

vários centímetros (pedras). A chave da sua estabilidade e conservação é a

presença de agregados. Estes, são componentes resistentes do solo,

formados pela ligação das suas partículas. Segundo Harris et al. (1966),

solos bem agregados asseguram boa resistência à erosão, condições físicas

adequadas para a penetração, crescimento, e apoio das raízes. A

estabilização dos agregados é fundamental para que nos espaços entre

estes, os poros, possa haver capacidade de retenção de água, nutrientes,

trocas gasosas e actividade biológica equilibrada. Agregados e poros em

conjunto constituem o que se denomina por estrutura do solo.

A pesquisa desenvolvida nos últimos 15 a 20 anos, tem revelado que

os AMF têm um importante papel na formação, melhoria e manutenção da

estrutura do solo. Foi sugerido um modelo que suportava que a rede

extraradical de hifas, actuava como um agente de ligação, devido à

mucilagem de polissacáridos que as hifas exudam entre partículas (Tisdall e

Oades, 1982), e entre microagregados (diâmetro inferior a 250µm), os quais

21

são formados por bactérias e processos químicos, transformando-os em

macroagregados (diâmetro superior a 250µm) (Tisdall e Oades, 1991),

contribuindo assim para a sua estabilização. Agregados maiores originam

poros mais largos, os quais suportam condições imprescindíveis para os

diferentes processos que ocorrem no solo.

Os AMF desempenham um papel benéfico de relevo nos

ecossistemas, nomeadamente nos agroecossistemas, sobretudo ao nível da

reciclagem de nutrientes conforme se representa esquematicamente na fig. 5.

Para Hooker e Black (1995), este papel embora também seja importante num

sistema agrícola convencional de elevados “inputs” é-o ainda mais à medida

que esses “inputs” são reduzidos.

Estes fungos são vias por onde fluem para as plantas e entre estas

(Francis e Finlay, 1985 in Killham, 1995), os nutrientes disponíveis no solo,

que entre outras fontes são fruto da actividade biológica de outros

organismos (e.g. bactérias decompositoras, fungos saprófitas) ou do

transporte efectuado por agentes erosivos.

Figura 5 - Diagrama esquemático do papel dos AMF na reciclagem de nutrientes. (Adaptado de Hooker e Black, 1995)

AMF RAÍZES

Nutrientes disponíveis no solo

Decomposição Mineralização

Fixação de N2

Lexiviação Erosão

22

5 – PRÁTICAS CULTURAIS

5.1 - Rotação de culturas

Um sistema de rotação é uma sucessão ordenada de culturas num

afolhamento, ou seja, consiste em fazer as culturas da sucessão em

parcelas, ou folhas diferentes, ao mesmo tempo ou não, consoante as

características das culturas em rotação.

Esta prática começou a ser utilizada, a partir do momento em que o

Homem se tornou sedentário e começou a verificar que, repetindo várias

vezes uma cultura no mesmo terreno, a produção ia diminuindo. Até há

poucos anos, os agricultores atribuíam tal facto ao “cansaço da terra” e,

mesmo os técnicos, apenas tinham uma vaga ideia de que o solo perdia

“forças” para sustentar a cultura.

Quando, há relativamente poucos anos, se descobriu, que o “cansaço

da terra”, que se verificava ao praticar-se a monocultura antes de se recorrer

ao sistema de rotação, era provocado pelo consumo dos nutrientes do solo

por parte das culturas, tentou-se abandonar o sistema de rotação, voltando a

substituí-lo pela prática da monocultura intensiva, com o auxílio de

fertilizantes. Apesar das produções serem boas durante algum tempo,

voltavam a diminuir. As causas eram variadas (doenças, pragas, infestantes,

etc.), mas a sua razão de ser era apenas uma: o facto de todos os anos estes

flagelos encontrarem condições favoráveis à sua propagação. Isto obrigava a

operações dispendiosas, que também implicavam custos ambientais.

Assim, pode considerar-se que o papel da rotação é essencialmente

assegurar uma melhor nutrição, menor nível de infestantes, maior

23

probabilidade de ataques pouco intensos de pragas e impedimento da

acumulação de outros factores inibitórios das culturas, quando elas se

sucedem em prazos inferiores aos que conduzem a essa acumulação. A

pesquisa de melhores sequências culturais, que tirem maior vantagem dos

efeitos da rotação, é uma prioridade para se alcançar uma agricultura

sustentável.

A rotação tradicional no Alentejo constitui-se por uma alternância de

um a dois anos de cultivo cerealífero, com normalmente dois a quatro anos

de pousio. No primeiro ano de cereal cultiva-se geralmente o trigo e como

segunda cultura cerealífera segue-se muitas vezes a aveia, antes da terra

voltar a ficar em pousio. A aveia tem vindo a ser substituída por outro cereal

de maior interesse, o triticale. Em solos melhores a rotação altera-se, não é

considerado um período de pousio na rotação, mas é realizado o chamado

alqueive revestido, constituído de uma lavoura (ver 5.2.1) no fim do Verão

para a cultura seguinte de Primavera. Assim, encontra-se muito

frequentemente uma rotação de culturas trienal, a qual consiste em dois anos

de cereal e de uma cultura de Primavera, geralmente o girassol.

5.2 - Mobilização do solo

A necessidade de mobilizar os solos antes da sementeira, surgiu

também com a evolução da agricultura, nomeadamente com os sistemas de

rotação de culturas.

No meio natural, quando as plantas morrem permanecem sobre o solo,

onde são lentamente decompostas, permitindo a libertação gradual de

elementos orgânicos e minerais que contribuem para o seu equilíbrio

24

nutritivo. A colheita retira do solo esta possibilidade. Quanto à rotação, para

além das vantagens já descritas, também mostrou inconvenientes. Com o

seu decorrer, as infestantes iam acumulando as suas sementes e tornavam-

se cada vez mais competitivas face às plantas das culturas, retirando-lhes

nutrientes, água e luz.

O processo de fazer frente a estas dificuldades, consistia em arrancar

manualmente as plantas indesejáveis, processo que se tornava tanto mais

fácil quanto mais solto estivesse o solo. Por outro lado, enterrando as

infestantes antes que produzissem sementes, reduzia o seu número e

facilitava o arranque das que apareciam, pois a camada superficial de solo

estava mais solta. Outra função das mobilizações, pelo menos das mais

tradicionais, tem a ver com a preparação da chamada “cama da semente”.

Quanto mais solto estiver o solo, mais pontos de contacto há entre este e a

semente, que fica mais “aconchegada”, permitindo mais pontos de passagem

de água do solo para a semente, o que irá induzir a sua germinação.

Assim, criaram-se ao longo dos anos processos de mobilização dos

solos, destinados a garantir terrenos limpos, proporcionando-se mais luz,

água e minerais às culturas, que se tornam mais produtivas.

Naturalmente, as mobilizações também trouxeram inconvenientes,

sobretudo a lavoura (ver 5.2.1), que é utilizada na quase totalidade da área

agrícola alentejana, mas em que apenas cerca de 40 % dos solos mostram

características adequadas para a sua prática (Wienberg, 1982 in Basch,

1991). O problema essencial é que sucessivas mobilizações, ao longo dos

anos, destroem os solos mais finos, os quais ficam rapidamente saturados

com as chuvas. Isto dificulta o arejamento e impede a infiltração da água

pelos canalículos existentes entre as partículas. Como a forma de ultrapassar

25

Figura 6 - Charrua

estas dificuldades consiste em fazer mais mobilizações, implantou-se um

ciclo vicioso, cujos efeitos negativos são manifestos. Por essa razão há cada

vez mais quem condene quaisquer mobilizações.

5.2.1 – Lavoura

Define-se lavoura como a mobilização em que se procede ao

reviramento do solo, isto é, a parte que estava à superfície é voltada para

baixo, trazendo-se para a superfície a parte inferior do solo que estava à

profundidade atingida por esta mobilização. A finalidade principal, como já foi

referido, é enterrar as ervas infestantes para as destruir. Ao mesmo tempo, a

acção de romper e revolver o solo, desfaz a sua compactação, permitindo

melhor infiltração de água e fácil desenvolvimento das raízes na camada de

intervenção.

A lavoura consiste em duas fases de mobilização: uma primária, em

que a alfaia utilizada é a charrua, e outra

secundária, em que se procede à gradagem.

Existem diversos tipos de charruas, especializadas

nos mais diversos objectivos. A que foi utilizada nas

folhas de rotação da Herdade da Revelheira, onde

decorreu este estudo, é o tipo mais generalizado,

em que a tracção é mecânica e os órgãos activos

são constituídos por duas aivecas (fig. 6). Após a passagem com a charrua, é

necessário regularizar a superfície do terreno que ficou armada e com

torrões. Para isso procede-se à gradagem, que, no caso em estudo, foi feita

com uma grade de discos em V (fig. 7).

26

Figura 8 - Escarificador

Figura 7 – Grade de discos

A sucessiva utilização da charrua,

tem como consequência a repetida

passagem das aivecas à mesma

profundidade. Isto cria uma camada de

solo compactada, que se denomina “calo”

da lavoura. Este, que fica ainda mais pronunciado devido à compactação

exercida pelo peso do tractor, é praticamente impenetravel pelas raízes e

pela água. A capacidade de absorção é reduzida, assim como a espessura

efectiva do solo.

5.2.2 - Escarificação

Esta operação de mobilização pode servir para completar a lavoura,

substituindo a gradagem nos casos em que os torrões são grandes ou,

entretanto surgiram ervas. Pode também

substituir a lavoura em casos muito

favoráveis, servindo para enterrar

sementes e adubos. O escarificador (fig.

8), é uma alfaia agrícola que consiste

num quadro onde se fixam teirós, neste caso chamados dentes. Estes, são

compridos e estreitos e realizam o trabalho a uma profundidade de cerca de

10cm. O escarificador rasga o solo, mas quase não o revolve à superfície.

27

Figura 9 – Sistema de triplo disco. (Adaptado de Basch, 1991)

5.2.3 - Sementeira directa

Nesta prática cultural, a mobilização de solo efectuada previamente à

sementeira é nula. A semente é enterrada, se necessário juntamente com

fertilizantes, à profundidade desejada, por um semeador especial,

normalmente com um sistema de triplo disco (fig. 9), preparado para

ultrapassar as dificuldades de penetração das sementes. A sua cobrição, é

feita por rodas ou rolos compressores

apenas ao longo da estreita faixa que

constitui a linha, pelo que praticamente

não há perturbação do solo.

Segundo Carvalho e Basch

(1995), que compararam os efeitos

provocados no solo pela mobilização tradicional e sementeira directa, as

condições físicas, químicas e biológicas do solo, melhoravam após alguns

anos de sementeira directa. Estes investigadores, verificaram que apesar da

camada superficial de solo (primeiros 10cm) ficar mais compactada (devido a

não haver remeximento e à passagem do tractor), com menor

macroporosidade e maior densidade relativa, esse efeito era oposto para as

camadas inferiores. Assim, é natural que as plantas tenham inicialmente mais

dificuldades de desenvolvimento devido à resistência à penetração do solo.

No entanto, ultrapassadas as dificuldades, as plantas vão poder usufruir de

melhores condições relativamente às proporcionadas pela mobilização

tradicional. Estas condições, passam por uma maior capacidade de absorção

e retenção de água, uma vez que a interface solo atmosfera não foi

perturbada, os poros mais finos exercem maior retenção e há resíduos sobre

28

o solo que actuam como esponja, libertando depois a água lentamente.

Passam também por haver mais matéria orgânica, disponibilidade de P e

capacidade de troca catiónica, por se verificar menos lavagem de

fertilizantes, embora também seja mais difícil passarem para as camadas

inferiores onde se encontram as raízes, por existir uma menor probabilidade

de encharcamento em períodos chuvosos, por não se formar o “calo da

lavoura” e por uma maior homogeneidade ao longo do perfil.

O impacto dos agentes erosivos e em particular das gotas de chuva,

seguidas pelo transporte e perda de partículas finas do solo, é um processo

grave nos solos sujeitos a mobilizações profundas, em que a crosta natural

existente à superfície é substituída por agregados soltos. A sementeira

directa minimiza estas acções erosivas, uma vez que a crosta é mantida e os

resíduos atenuam a acção das gotas de chuva (Groβ, 1995).

Para concluir, pode dizer-se que as consequências em termos de

resposta das culturas à sementeira directa dependem da própria cultura e do

clima. No geral obtêm-se melhores resultados em culturas de Inverno do que

de Primavera, sobretudo devido a uma maior resistência à penetração do

solo. De qualquer forma, para além das referidas vantagens, em termos de

custos a sementeira directa também é mais vantajosa do que a mobilização

tradicional, permitindo uma maior economia de tempo, combustível, mão-de-

obra e equipamento.

29

6 – MICORRIZAS ARBUSCULARES E PRÁTICAS CULTURAIS

As várias práticas culturais que a preparação e o uso da terra

envolvem, têm impactos na maneira como as micorrizas arbusculares se

formam e funcionam.

Começando por abordar este assunto duma perspectiva geral

passando depois para aspectos mais específicos, pode dizer-se que um tipo

de agricultura intensiva provoca um decréscimo no potencial de AMF, ao

passo que um tipo mais sustentável faz com que ocorra o oposto. Neste

último, em vez de se recorrer à monocultura, típica num sistema intensivo,

opta-se pelo sistema de rotação de culturas. Para um dado sistema poder ser

sustentável, é muito importante compreender-se a dinâmica dos AMF nos

solos agrícolas quando influenciados pelas diferentes práticas culturais

utilizadas, nomeadamente, não só pela rotação em si mas também pelas,

mobilizações e fertilizações.

O passado dum sistema de rotação de culturas é determinante na

ocorrência de micorrizas de um ano para o outro (Abbot et al., 1995).

Conforme foi referido, há plantas mais micotróficas que outras e é natural que

determinada escolha de culturas tenha como resultado a reposição dos níveis

de AMF, no ano seguinte a uma cultura menos micotrófica. Harinikumar e

Bagyaraj (1988), estudaram os efeitos que uma rotação, com uma cultura

micotrófica (“feijão fradinho” – Vigna unquiculata L.), não micotrófica

(mostarda – Brassica juncea L.) e pousio (solo não cultivado), provocava no

número de propágulos de AMF. Chegaram à conclusão que, após a cultura

de feijão fradinho, houve um acréscimo de 12% no número de propágulos e

que, após a cultura de mostarda e o pousio, houve respectivamente uma

30

redução nesse número da ordem dos 13% e 40%. A drástica redução

verificada após o pousio poder-se-á explicar não só pela ausência da cultura,

mas também porque muitas das robustas plantas silvestres são

provavelmente pouco micotróficas.

Estes resultados, conduzem ao problema dos efeitos que o sistema de

rotação de culturas pode produzir a nível da agregação e manutenção da

estabilidade estrutural do solo. Segundo Tisdall e Oades (1980), a

macroagregação é controlada pelas práticas culturais (i.e. rotação de

culturas). Estes autores chegaram a esta conclusão, pois após 50 anos de

rotação de culturas, a estabilidade dos macroagregados decrescia

juntamente com a quantidade de hifas de AMF. Ao compararem um solo que

nunca havia sido cultivado, solos em rotação sem pousio e solos em rotação

com pousio, verificaram que, do primeiro para o último, o comprimento das

hifas era respectivamente de 19 m/g de solo, 13mg-1 e 5mg-1.

As perturbações provocadas pelas mobilizações, são outro factor

inerente às práticas culturais, com consequências nos AMF, nomeadamente

ao nível da quebra da rede extraradical de micélio. Os estudos sobre o

envolvimento da rede extraradical nos efeitos resultantes da perturbação do

solo, são muito recentes e começaram a ser elaborados com solos

artificialmente perturbados em laboratório. Só desde há cerca de 5 anos, se

tem vindo a publicar as poucas tentativas realizadas, para estudar aquele

envolvimento em condições de campo.

Evans e Miller (1990), foram dos primeiros a fazer a ligação entre as

reduções verificadas a nível da absorção de P e zinco em milho (Zea mays

L.), após a perturbação artificial de um solo e o decréscimo de colonização

micorrízica. O seu estudo levou-os a pensar que a causa mais provável para

31

essa redução estava na destruição da rede extraradical. No entanto, estes

investigadores admitiram que a importância das suas descobertas haveria de

ficar incerta, até que se determinasse até que ponto um solo tem de ser

perturbado, para que se façam sentir efeitos a este nível. Questionava-se

então: será que as mobilizações provocam alterações suficientes para que se

produzam efeitos nos AMF? Se sim, quais são essas alterações e quais são

os seus efeitos? Kabir et al. (1998a), estudaram em paralelo os efeitos que as

mobilizações exercem sobre a tomada de nutrientes pelas plantas, densidade

e distribuição espacial de hifas extraradicais no campo, para uma cultura de

milho (Zea mays L.). Para isso, acompanharam ao longo de 11 anos os

talhões da cultura, não mobilizados (NM-sementeira directa), os que tiveram

mobilização reduzida (MR-grade de discos) e os de mobilização convencional

(MC-lavoura). Observaram que a densidade de hifas era superior nos talhões

NM do que nos MC, enquanto que os talhões (MR) continham uma densidade

de hifas intermédia. As concentrações de P, Zn e Cu nas plantas, também

eram superiores em NM e MR do que em MC, ao passo que as

concentrações de K, Ca e Mg não variavam entre mobilizações, o que

indicava a influência dos AMF. Quanto à distribuição espacial, verificaram que

as maiores densidades de hifas se localizavam junto às raízes ao longo das

linhas de cultivo.

A abundância de hifas de AMF nos solos agrícolas varia com as

estações do ano, embora essa esteja dependente de vários factores (e.g.

edáficos, climáticos) entre os quais estão as mobilizações. Pouco se conhece

sobre as variações sazonais no desenvolvimento micorrízico nas culturas

agrícolas e na abundância de hifas extraradicais, quando influenciadas pelas

mobilizações. Kabir et al. (1997), também investigaram sobre as variações na

32

densidade de hifas e colonização das raízes ao longo do ano para os

mesmos campos de cultivo. A mais reduzida taxa de colonização por AMF foi

verificada no início da Primavera, sobretudo em lavoura, pelo que esta perda

de vigor de AMF poder-se-á atribuir, não só ao rompimento da rede

extramatricial, mas também à exposição dos propágulos ao ar, fruto do

revolvimento do solo, sofrendo as condições adversas do Inverno.

Douds et al. (1995), realizaram um estudo de dinâmica populacional e

de distribuição vertical de esporos em sistemas de altos (convencional) e

baixos “inputs”, cada um sujeito a três tipos de mobilização (lavoura, chisel e

sementeira directa). Verificaram que tanto o tipo de sistema como o tipo de

mobilização tinham influência na dinâmica populacional de AMF e chegaram

à conclusão, que em sistemas de baixos “inputs” o número de esporos era

superior relativamente ao sistema convencional, sobretudo nas camadas

superfíciais e em sementeira directa.

Mas nem todos os estudos são tão evidentemente conclusivos no que

respeita aos efeitos da lavoura e da sementeira directa nos AMF. Mozafar et

al. (1998), que também investigaram os efeitos provocados pelos mesmos

tipos mobilizações num sistema de rotação com trigo de Inverno, milho e

colza, não verificaram alterações significativas no número total de esporos

entre mobilizações, apesar de terem notado existir esporos mais pequenos

nos campos sujeitos a sementeira directa. Referiram também que nas raizes

de milho, cultivado em sementeira directa, a colonização micorrízica foi

detectada mais cedo e a sua taxa havia sido superior ao longo do tempo

relativamente às outras mobilizações.

A passagem sucessiva das máquinas agrícolas sobre o solo ao longo

dos anos, é um factor de compactação cuja influência nos AMF, foi

33

investigada conjuntamente com mobilizações (NM, RM e CM) por Entry et al.

(1996) em milho (Zea mays L.). Após 7 anos de tratamentos, combinados

entre compactação e mobilização, não se verificaram diferenças entre

tratamentos tanto ao nível de concentrações de nutrientes nas plantas, como

nas produções. No entanto, verificaram-se reduções na biomassa de raízes e

raízes micorrizadas nos solos sujeitos a maior compactação e mobilização.

Nadian et al, (1996), também realizaram um estudo parecido, aferindo sobre

os efeitos, nos AMF, da compactação e tomada de P em trevo (Trifolium

subterraneum). Observaram que a colonização micorrízica aumentava em

todos os níveis de compactação e tratamentos com P, mas que esse

aumento decrescia com a subida dos níveis de compactação e P. Estas

observações levara-os a concluir que o declínio no benefício da colonização

micorrízica em solos extremamente compactados poder-se-ia dever, em

parte, à inibição do crescimento da raiz, também observada por Entry et al.

(1996), e consequentemente à redução na superfície disponível para a

colonização. Kabir et al. (1998b), compararam os efeitos provocados na

distribuição vertical (0-25cm) de raízes de milho (Zea mays L.) colonizadas,

em sistemas sujeitos a lavoura e sementeira directa. Concluíram que a

mobilização não teve efeitos na colonização da raiz, e que, quanto aos

esporos e densidade de hifas, apenas houve diferenças significativas,

respectivamente menos 50 e 40% em lavoura, nos 5cm superficiais. É

exactamente nesta camada superficial que os agentes erosivos actuam mais

violentamente. É também aí que se localizam maioritariamente os propágulos

(Powel, 1980).

34

Da análise dos estudos descritos extraí-se que a sementeira directa

será porventura o melhor método de conservação, não só dos AMF mas

também de outros aspectos associados aos mecanismos do solo.

Apesar da literatura sobre os efeitos que os fertilizantes têm sobre os

AMF ser contraditória (Hooker e Black, 1995), é cada vez mais evidente que

há maior potencial de AMF em sistemas agrícolas de baixos “inputs”(Abbot et

al., 1995).

A agricultura moderna desenvolveu novas variedades de plantas, mais

robustas, resistentes e adaptadas para elevados desempenhos sob sistemas

convencionais de elevados “inputs”. É sugerido por alguns investigadores

(Azcón e Ocampo, 1981), que estes processos de melhoramento

seleccionaram genótipos menos micotróficos. Assim, a utilização destas

variedades em sistemas agrícolas sustentáveis, podem desfavorecer

algumas das potencialidades biológicas que o meio fornece, como é o caso

da simbiose por AMF.

35

7 - MATERIAL E MÉTODOS

7.1 - Caracterização do local de estudo

7.1.1 - Situação geográfica

A Herdade da Revelheira, localizada geograficamente a 38º 28’ N e 7º

28’ W, pertence, administrativamente, à freguesia de Corval, ao concelho de

Reguengos de Monsaraz e ao distrito de Évora, portanto no sul da região Alto

Alentejo. Segundo Rivas–Martinez (1990), em termos biogeográficos,

encontra-se na Região Mediterrânica, Província Luso – Extremadurence e no

Sector Marianico – Monchiquense. A fig. 10 representa parte da área

ocupada pela herdade, sendo possível distinguir os dois montes que dela

fazem parte (Revelheira e Barroqueira), bem como o local onde se encontra o

campo de ensaios de mobilização alvo deste trabalho.

7.1.2 - Clima

Segundo Rivas–Martinez (1990), trata-se duma região pertencente ao

piso bioclimático Mesomediterrânico, pois a temperatura média anual do ar

Figura 10 - Adaptado da Carta Militar de Portugal nº 473 (Reguengos de Monsaraz) – Serviço Cartográfico do Exército.

Localização do campo de ensaios de mobilização

36

(T) é de 15,4 ºC, a temperatura média das mínimas do mês mais frio (m) é de

3,8 ºC e em que a temperatura média das máximas do mês mais frio (M) é de

13,4 ºC. A estes valores corresponde um índice de termicidade (It), em que It

=(T+m+M)x10, de 326 o que significa que a região pertence ao horizonte

bioclimático Mesomediterrânico-inferior que se caracteriza por ter

possibilidades de geadas entre os meses de Outubro a Abril. O clima é

considerado seco pois a precipitação total anual é inferior a 600 mm.

Nos quadros seguintes são apresentadas as médias mensais de

temperatura e totais mensais de precipitação, para o local experimental,

durante o período do ensaio e os valores correspondentes de 30 anos*.

Quadro 2 - Precipitação (mm) no período do ensaio e média (∅) de 30 anos (totais mensais).

Mês N D J F M A M J J

∅ 30 anos 69,9 74,7 77,6 76,7 83,3 44,9 33,5 24,8 3,5

98/99 25,1 63,0 63,2 13,5 85,4 50,7 26,2 0,8 0,0

Quadro 3 - Temperatura média anual (ºC) no período do ensaio e média (∅) de 30 anos.

Mês N D J F M A M J J

∅ 30 anos 12,4 9,7 9,3 9,9 11,5 13,6 16,6 19,9 22,8

98/99 12,8 8,1 8,0 8,7 11,8 14,7 17,8 22,5 25,0

Verifica-se que este ano agrícola foi menos chuvoso e mais frio no

Inverno relativamente à média de 30 anos.

∗ Os valores climatológicos de temperatura, média de 30 anos (1951 a 1980), são da Estação Meteorológica de Évora (a mais próxima de Reguengos de Monsaraz), e todos os valores climatológicos de precipitação são da Estação Udométrica de Reguengos de Monsaraz. A fonte das médias de 30 anos foi do Instituto Nacional de Meteorologia e Geofísica (1991), e das médias de 98/99 da página da internet do Departamento de Física da Universidade de Évora.

37

7.1.3 – Caracterização do solo

Segundo a classificação portuguesa, o solo no local experimental é um

‘Solo Mediterrâneo Vermelho e Amarelo de dioritos ou quartzodioritos ou

rochas microfaneríticas afins’ (Vm) (Cardoso, 1965). Segundo este autor, é

um solo que, entre outras características, se desenvolve em relevo normal,

cuja textura é ligeira ou mediana nas camadas superficiais, entre os 15cm e

os 50cm a percentagem de argila aumenta muito, o pH nunca é inferior a 5,0,

o grau de saturação é elevado e a capacidade de troca catiónica é baixa ou

muito baixa.

No período entre as mobilizações e a sementeira, foi realizada uma

análise do pH do solo em todos os talhões, verificando-se que o seu valor

variou entre 5 e 6, pelo que, conforme foi referido, não são valores que

impeçam a micorrização.

7.1.4 - Organização das folhas do ensaio

Cada uma das três folhas (R1, R2 e R3), onde decorre o sistema de

rotação ocupa uma área de aproximadamente 8000 m2.

A folha R1 recebeu neste ano (98/99) a cultura de triticale, tendo no

ano anterior (97/98) permanecido em pousio porque, devido à pluviosidade

intensa que encharcou o solo, não foi possível realizar a sementeira de trigo.

Este efeito, não foi tão pronunciado nas folhas R2 e R3, que seguiram o plano

de rotação em 97/98. A folha R2, foi este ano semeada de girassol. Esta folha

tinha acolhido o trigo no ano anterior. Na folha R3 decorreu este ano a cultura

de trigo, após o girassol de 97/98.

38

Figura 12 - Semeador

Cada folha está dividida em 12 talhões (cada um com as dimensões

de 75m x 6m e uma distância entre talhões de 1m, 2 entre repetições),

agrupados em 3 grupos de 4, cada grupo constituindo uma repetição. Apenas

se considerou metade das dimensões dos talhões uma vez que na metade

não contemplada neste estudo, foi realizada uma calagem previamente às

mobilizações.

Assim, em cada repetição, existe um talhão em que foi aplicada a

lavoura, outro que foi passado com um chisel, que não foi objecto de estudo

deste trabalho, um terceiro que foi escarificado e um quarto em que foi

efectuada sementeira directa. O croquis do campo de ensaios de

mobilizações pode ser consultado na página seguinte (fig. 11).

7.1.5 – Operações culturais

As mobilizações foram efectuadas poucos dias antes da sementeira.

Para a lavoura utilizou-se a charrua e a grade de discos representadas nas

figs. 6 e 7 respectivamente. O escarificador utilizado está representado na fig.

8.

A sementeira de trigo e triticale foi feita no dia 24 de Novembro, e a do

girassol ocorreu no dia 3 de Março. O semeador JOHN DEERE, representado

na fig. 12, capaz de realizar sementeira

directa, foi a máquina agrícola que realizou

a sementeira para todas as culturas. Este

semeador tem 3m de largura efectiva e 16

órgãos semeadores pelo que o

espaçamento entre linhas é de 18 cm.

39

Campo R2 Campo R3 15

D1 C1 B1 A1

D2 C2 B2 A2

D3 C3 B3 A3

E2 E3

Campo R1

E1 E2

D1 C1 B1 A1

D2 C2 B2 A2

D3 C3 B3 A3

E3

Tc - Triticale Tg - Trigo G - Girassol Figura 11 – Croquis do campo de ensaios de mobilizações.

E1

1 2 3 4

5 6 7 8

9 10 11 12

13 14

1b 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1a E1 D3 C3 B3 A3 D2 C2 B2 A2 D1 C1 B1 A1 E1

14 E2

15 E3

3 4 5 6

7 8 9 10

11 12 13 14

1 2

15

A - Lavoura (sempre) B - Chisel (sempre) – n/estudado C - Escarificador (sempre) D - Sementeira directa E – n/estudados

R1 R2 R3 95/96 Tc G Tg 96/97 G Tg Tc 97/98 Tg Tc G 98/99 Tc G Tg

Estrada

40

A densidade de sementeira do triticale foi de 190 kg de sementes por ha, do

trigo 200 kg/ha e para o girassol realizou-se a sementeira com o objectivo de

se atingir uma densidade de 110 mil plantas por ha.

A adubação aplicada foi igual para o trigo e triticale. À sementeira,

foram aplicados 220 kg/ha de um adubo 18:46:0 e no início de Fevereiro

aplicaram-se 115 kg/ha de Nitrocalciamon. Este adubo tem 26% de azoto e

uma quantidade desconhecida de cálcio.

Para controlo de infestantes utilizou-se uma mistura de 2 herbicidas, o

Illoxan, 3l/ha (pós emergência – anti-gramínea mas específico para o trigo), e

o Granstar, 20 g/ha (dicotiledóneas).

A colheita do trigo realizou-se a 15 de Junho e a de triticale a 1 de

Julho. Não se chegou a colher o girassol devido não só à forte seca que se

fez sentir sobretudo nos meses de Junho e Julho, o que não permitiu o

normal desenvolvimento das plantas a partir de certo ponto, como também

devido ao rápido, contínuo e voraz “ataque” de aves às sementes motivado,

segundo os agricultores da região, pelo isolamento desta cultura neste local.

Os parâmetros de produção medidos foram o peso de 1000 grãos, a

produção de grão e de palha.

7.2 – Organização e execução dos ensaios

7.2.1 – MPN (Most Probable Number)

Este método, também chamado de diluição à extinção, permite estimar

a densidade de uma população sem ser necessário contar, um a um, os seus

indivíduos, tratando-se por isso de um método indirecto de contagem. A

técnica do MPN baseia-se na determinação da presença ou ausência de

41

microorganismos, neste caso de colonização micorrízica, em vários vasos

individuais, contendo uma certa quantidade de inóculo em séries de diluição.

É assim possível, calcular o número mais provável de propágulos naquela

quantidade de inóculo, com base na teoria da probabilidade. Através da

combinação de resultados das diferentes diluições, também é possível obter

apenas um único valor (propágulos/g de solo), para o número mais provável

de propágulos, existentes no solo do local onde foi recolhido o inóculo.

Basicamente, é necessário confrontar os resultados de raízes positivos (em

que se detectou colonização) e negativos (em que não foi detectada

colonização), com uma tabela estatística adaptada para o factor de diluição e

número de repetições por diluição (Alexander, 1965). Quanto menor fôr o

factor de diluição e maior o número de repetições, maior será a precisão do

teste. No entanto, por questões logísticas que requerem um compromisso

entre o grau de precisão e a exequibilidade do ensaio, é geralmente

adequado utilizarem-se 4 diluições, com 5 vasos ou repetições, por diluição.

O método tem como pré-requesitos, para além da necessidade de os

organismos, cuja população vai ser estimada, possuírem características que

permitam detectá-los fácil e rapidamente, os propágulos devem estar

distribuídos aleatoriamente por todo solo onde se recolhem os inóculos, os

que estão presentes no inóculo devem colonizar a planta durante o período

em que decorre o ensaio e as condições devem ser apropriadas, para que

não se desenvolvam outros organismos inibidores dos que se pretendem

estudar. Tendo em conta o que já se referiu em 4.1 sobre a existência de

preferências de plantas por parte das espécies de AMF, deve escolher-se

para hospedeiro uma planta, que à partida se saiba ser micotrófica e que

tenha um desenvolvimento radicular rápido (Porter, 1979).

42

Para Wilson e Trinick (1982), o sucesso método de MPN está muito

dependente das condições da experiência. Estes investigadores, consideram

que a temperatura e o momento do levantamento do ensaio influenciam

fortemente os seus resultados, porque interferem com o desenvolvimento dos

simbiontes. Em grande parte da bibliografia consultada, este tipo de ensaio,

tem a duração de aproximadamente seis semanas. Quando as condições

não são apropriadas, está a subestimar-se a verdadeira densidade da

população. É natural, sobretudo no caso dos AMF, que não se consiga reunir

em laboratório e em simultâneo as condições óptimas, nomeadamente

temperatura, intensidade luminosa, fotoperíodo e humidade, durante o

decorrer do ensaio. No entanto, mesmo havendo subestimação, esta

acontece para todo o ensaio por igual, o que significa que é possível tirar

conclusões em termos comparativos sobre o número mais provável de

propágulos existente em cada folha e em cada tipo de mobilização. Contudo,

o valor de MPN, pode ser utilizado apenas para comparações com outros

testes efectuados dentro da mesma experiência, uma vez que pessoas,

manipulações, condições ambientais e tipo de inóculo diferentes, conduzem

necessariamente a resultados que se enquadram apenas dentro do contexto

dessa própria experiência.

O ensaio de MPN, começou a ser preparado a 18 de Novembro, dias

antes das mobilizações e sementeira das folhas R1 e R3, as quais foram o

alvo do ensaio. Devido à logística que um ensaio desta dimensão envolveu,

começou por estabelecer-se qual a quantidade de vasos, solo e areia

necessários, entre outros materiais logísticos como sacos de plástico e

suportes para os vasos. Como se fizeram 4 diluições, cada uma com 5

43

repetições, para cada um dos 18 talhões entre a folhas R1 e R3, foram

necessários de um total de 360 vasos para este ensaio. Na realidade 370,

uma vez que se prepararam 10 vasos para controlo.

O procedimento seguido foi o seguinte:

Recolheram-se cerca de 100 Kg de solo, no campo R1, ainda antes de

serem efectuados os trabalhos de mobilização. Este solo foi passado por um

crivo com 4 mm de malha e foi depois distribuído por vários tabuleiros para

secar ao ar.

Logo após as mobilizações e antes da sementeira, recolheram-se as

amostras de solo que serviriam não só como inóculo para o ensaio de MPN,

como para a contagem de esporos destas duas folhas. Cada amostra era

constituída por cerca de 5 Kg de solo, recolhido em 4 locais diferentes na

zona central de cada um dos 18 talhões, sujeitos a este estudo, entre as

folhas R1 e R3. A amostragem incidiu sobre os 15 a 20 cm superficiais de

solo. Todas as amostras passaram também pelo crivo de 4 mm de malha.

Depois do solo, que se havia distribuído em tabuleiros, estar seco,

uma parte foi misturada com areia (1:1) e, tanto o restante como a mistura,

foram esterilizados. A esterilização consistiu em colocar separadamente o

solo e a mistura solo-areia dentro de fronhas e proceder a 2 ciclos de

esterilização espaçados de 24 horas, de maneira a eliminar qualquer

estrutura biológica de resistência que eventualmente ainda tivesse ficado

activa. No fundo de cada vaso, foram colocados 230g de mistura solo-areia

(1:1) e a esterilização foi aí feita, também com 2 ciclos de 24 horas. Cada

ciclo de esterilização, teve a duração de 25 minutos a 120 ºC e realizou-se

em autoclave (AJC, modelo Uniclave 88). O solo, serviria para misturar com o

44

inóculo nas diferentes diluições. A mistura, para além de ficar no fundo,

serviria também para cobrir o inóculo.

Seguidamente, o inóculo, de 30g de solo, foi introduzido no vaso.

Estes 30g, consistem nas diferentes diluições do solo estéril, com o solo das

amostras recolhidas nos talhões do campo de ensaios. As misturas foram

efectuadas em sacos de plástico, que se agitaram fortemente para assegurar

uma boa distribuição. Houve o cuidado de se começar a pôr o inóculo nos

vasos, da diluição maior para a menor, de modo a evitar eventuais

contaminações. Também para prevenir essa possibilidade, lavaram-se todos

os utensílios entre séries de diluição. Para cada amostra recolhida por talhão

fizeram-se 4 diluições (50, 5-1, 5-2, e 5-3 respectivamente, da diluição mais

baixa para a mais alta), conforme se demostra na fig.13. Os 10 vasos de

controlo foram inoculados apenas com solo estéril, para posteriormente se

garantir que todo o substracto estéril não continha propágulos viáveis.

Figura 13 – Esquema representativo de como foi distribuído o solo para fazer as diluições.

45

Em todos os vasos o inóculo foi coberto com 80g da mistura de solo–

areia (1:1) estéril. As quantidades de mistura que envolveram o inóculo,

foram escolhidas de maneira a que este não ficasse nem muito no fundo do

vaso, o levaria algum tempo até ser interceptado pelas raízes, nem

demasiado à superfície, não só para estar na zona de maior ramificação da

raiz como para prevenir contaminações.

A planta hospedeira utilizada foi o trigo (Triticum durum), da mesma

variedade daquele que foi semeado no campo R3, tendo sido colocadas 2

sementes, previamente esterilizadas e pré-germinadas, em cada um dos

vasos. A esterilização das sementes, teve por finalidade eliminar o máximo

de microrganismos que, sendo uma fonte de contaminação, poderiam

interferir no desenvolvimento da planta e no processo de micorrização.

Testaram-se diferentes concentrações de hipoclorito de cálcio, para saber

qual era a mais eficaz em termos da relação taxa de germinação e

contaminação das sementes. O protocolo de esterilização das sementes

testado foi o seguinte:

1. Preparou-se de 200ml de hipoclorito de cálcio a 7% e 14%;

2. Mergulharam-se 200 sementes de trigo na solução a 7% e outras 200, na

solução a 14%. Estas permaneceram nas respectivas soluções durante 45

minutos;

3. Lavaram-se as sementes em 5 passagens de água esterilizada, deixando-

as em embebição na última lavagem durante duas horas, numa estufa a

28 ºC;

46

Figura 14 – Aspecto do ensaio na estufa.

4. Distribuíram-se as sementes, com a ajuda de uma ansa esterilizada, num

tabuleiro com algodão embebido em água estéril;

5. Colocaram-se na estufa a 28 ºC e após dois dias, as plantulas estavam

suficientemente desenvolvidas para se tirarem conclusões.

Também se fizeram germinar 200 sementes sem as fazer passar por

hipoclorito de cálcio (passos 4 e 5), para se saber se valeria a pena

esterilizar. Estas sementes apesar de terem tido uma taxa de germinação de

quase 100% estavam muito contaminadas e passado pouco tempo muitas

plantulas morreram. A diferença verificada entre as sementes esterilizadas a

7% e 14% foi a nível da contaminação e da rapidez de desenvolvimento, ou

seja, ambas tiveram taxas de germinação de quase 100% mas as segundas,

apesar de terem inicialmente um desenvolvimento mais lento que as

primeiras, praticamente não apresentaram contaminações. Atendendo a que

se iriam colocar 2 sementes por vaso, era necessário ter disponíveis 780

sementes pré-germinadas. Assim, esterilizaram-se cerca de 1200 sementes

com hipoclorito de cálcio a 14%.

Com a ajuda de uma vareta, as sementes pré-germinadas foram

colocadas nos vasos, também da diluição maior para a menor e lavando a

vareta entre as séries de diluição.

Depois de preparado (o que

aconteceu a 24 de Dezembro), o

ensaio (fig. 14), foi levado para uma

estufa exterior onde permaneceu

durante 7 semanas. Os vasos foram

regados de acordo com as

necessidades, alternadamente com água destilada e uma solução nutritiva.

47

Esta solução nutritiva era composta por uma mistura de 4 soluções. A

descrição dos seus componentes e respectivas concentrações pode

consultar-se no quadro 4.

Após o corte da parte aérea das plantas, todo o ensaio foi colocado em

câmaras frigoríficas a 4 ºC com o objectivo de estagnar a proliferação

micorrízica, uma vez que o processo de obtenção, coloração e observação

das raízes para 370 amostras foi necessariamente moroso.

Quadro 4 - Soluções nutritivas utilizadas para regar o ensaio de MPN (Bronghton e Dilworth, 1970 in Somasegaran e Hoben, 1994)

Soluções Componentes Concentrações (g/L)*

1 CaCl2 2H2O 294,1

2

FeC6H5O7 3H2O

Mg SO4 7H2O

K2SO4

MnSO4 H2O

6,7

123,3

87,0

0,338

3

H3BO3

ZnSO4 7H2O

CuSO4 5H2O

CoSO4 7H2O

Na2MoO2 2H2O

0,247

0,288

0,100

0,056

0,048

4 KNO3 0,5

* - Na preparação da solução de rega misturaram-se 5 ml de cada solução em 5 litros de água destilada, juntando-se de seguida esta mistura a mais 5 litros de água destilada.

O procedimento de levantamento do ensaio foi o seguinte:

1. Tirou-se o conteúdo de cada vaso em bloco e separou-se o substracto

das raízes, com um jacto de água sob pressão;

2. Com uma tesoura, cortou-se uma porção raízes, ao longo do eixo vertical

de desenvolvimento;

48

3. As amostras de raízes foram posteriormente coradas (ver 7.2.3.3) e

observadas numa placa de Petri com glicerol 50% ao microscópio

estereoscópico (LEICA–MZ 12).

Começou a levantar-se o ensaio pelos vasos de controlo e seguindo-

se depois das menores para as maiores diluições.

7.2.2 – Esporos

7.2.2.1 - Amostragem

Foi a partir das amostras de solo, recolhidas após as mobilizações e

antes da sementeira, que se extraíram e contaram os esporos de AMF.

Conforme já foi descrito, essas recolhas foram realizadas na mesma altura

nas folhas R1 e R3, ao passo que na folha R2 o mesmo procedimento foi

efectuado mais tarde, pouco antes do estabelecimento da cultura de girassol.

7.2.2.2 – Extracção e contagem

Em todas as amostras, realizaram-se separadamente duas extracções

de esporos, a partir de duas sub-amostras de 100g de solo cada. O objectivo

foi obter um único valor (nº de esporos em 100 g de solo - média das duas

sub-amostras), por amostra, com um erro em princípio menor. As extracções

foram feitas, recorrendo-se ao método de crivagem húmida em gradiente de

sacarose, adaptado do método padrão de Tommerup (1992), que

seguidamente se descreve:

49

1. Pesou-se para um copo, 100 g de solo de uma das amostras;

2. Perfez-se o volume para 1 l de água da torneira;

3. Para suspender o solo, misturou-se a solução com uma colher e esperou-

se 1 minuto, para permitir que as partículas mais pesadas se

depositassem;

4. Seguiu-se a decantação do conteúdo do copo através de dois crivos, um

com uma malha de 1 mm, onde ficaram retidas as partículas de maiores

dimensões, e outro com uma malha de 45 µm, onde ficaram os esporos

de AMF;

5. Repetiram-se mais duas vezes os passos 2, 3 e 4, desta vez esperando-

se apenas 30 segundos, para que as partículas mais pesadas

assentassem;

6. Fez-se passar água sob pressão no crivo de 1mm, para que qualquer

esporo que aí pudesse ter ficado retido passasse para o crivo de malha

mais fina;

7. Com a ajuda de um esguicho de água, concentrou-se o conteúdo retido

no crivo de 45 µm e transferiu-se, em quantidades idênticas, para dois

tubos de centrífuga de 80 ml;

8. Perfez-se o volume do tubo até 40 ml com água da torneira;

Repetiram-se todos os passos executados até aqui para a segunda

sub-amostra.

9. Com a ajuda de uma seringa, na qual foi adaptado um tubo de borracha

que chega ao fundo dos tubos de centrífuga, foram adicionados em cada

50

um mais 40ml, desta vez de uma solução de sacarose a 70% (p/v)∗. Esta

solução, por ser mais densa que a água, permanece no fundo do tubo,

criando-se uma zona de interface com a água, que fica no topo. É nesta

zona que, depois da centrifugação, vão ficar os esporos. Isto acontece

porque a sua densidade é idêntica à da referida solução. Antes de se

injectar a solução de sacarose, com o auxílio do tubo adaptado à seringa,

agitou-se o conteúdo para os esporos se libertarem o mais possível das

partículas de solo. Depois de injectada a solução açucarada, houve o

cuidado de não introduzir bolhas e fazer movimentos bruscos ao remover

a seringa, para não perturbar a interface criada;

10. Recorrendo a uma balança (OHAUS–Portable Advanced) e a um

esguicho corrigiram-se, cuidadosamente com água contra as paredes dos

tubos mais leves, as diferenças de peso entre os tubos, de maneira a

evitar desequilíbrios durante a centrifugação;

11. A centrifugação decorreu durante 3 minutos a 2500 rpm (centrífuga -

SIGMA – 2-15). Foi usado uma velocidade de travagem intermédia (5),

mais uma vez com o objectivo de reduzir as perturbações na interface

criada;

12. Após a centrifugação, novamente com a ajuda da seringa, que se

introduziu até à zona de interface, sugaram-se os esporos que foram de

seguida transferidos para o crivo de 45 µm, onde foram imediatamente

passados por água corrente para remover a solução de sacarose e evitar

que esta os danificasse devido ao stress osmótico;

∗ Solução de sacarose: Sacarose (ou açúcar comercial) 700g Água 1 l

51

13. Com a ajuda do esguicho, passou-se o conteúdo do crivo para uma placa

de Petri com pistas concêntricas, onde os esporos foram contados

recorrendo-se ao microscópio estereoscópico.

Antes de se iniciarem as contagens das amostras cujos valores constam

dos resultados deste trabalho, realizaram-se algumas extracções de esporos

a partir do solo do campo, com o objectivo de haver uma maior familiarização

com a técnica e com o material em estudo. Esta acção é importante na

medida em que, no material do campo, aparecem muitas vezes elementos

que podem ser confundidos com os esporos de AMF (e.g. partículas de solo,

ovos de nemátodes ou de insectos, algas unicelulares).

7.2.2.3 - Preparações semi-definitivas

Fizeram-se preparações semi-definitivas dos tipos de esporos que

apareceram em maior quantidade. O procedimento utilizado foi o seguinte:

1. Colocaram-se duas gotas de água numa lâmina de microscópio, uma em

cada extremo;

2. À lupa, com uma pinça de pontas finas (VOMM GmbH), transferiram-se

cerca de 10 esporos do mesmo tipo, para cada uma das gotas de água

colocadas na lâmina;

3. Depois das gotas de água secarem, colocaram-se os meios de

montagem, PVLG (Polivinil álcool-lactoglicerol) e reagente de Melzer (os

seus componentes e concentrações podem consultar-se no quadro 5),

sobre os esporos. Para tal verteu-se uma gota de PVLG sobre os esporos

52

que estavam num dos lados da lâmina e uma lamela. Sobre os esporos

do outro extremo da lâmina colocou-se uma gota de reagente de Melzer e

uma lamela. O PVLG serve como conservante e o reagente de Melzer,

que é PVLG com corante, serve para criar contraste entre algumas

paredes dos esporos;

4. Com um objecto pontiagudo, pressionou-se ligeiramente as lamelas para

rebentar os esporos, de modo a evidenciar as suas paredes internas;

Quadro 5 – Meios de montagem utilizados nas preparações semi-definitivas dos esporos.

Meios de montagem Componentes Quantidades

Polivinil lacto glicerol (PVLG) (Koske e Tessier in Brundrett, 1996)

Polivinil álcool

Água destilada

Ácido láctico

Glicerol

8,33 g

50 ml

50 ml

5 ml

Reagente de Melzer* (Morton, 1992 in Brundrett, 1996)

Iodeto de potássio

Iodo

Água destilada

5 g

1,5 g

100 ml

*Mistura 1 : 1 (v/v) com PVLG

5. Observaram-se as lâminas num microscópio óptico (OLYMPUS-BX 50) e

tiraram-se fotografias (Máquina fotográfica OLYMPUS-DP10);

6. Através das características morfológicas observadas, procurou-se

identificar taxonomicamente os tipos observados.

53

7.2.3 - Raízes

7.2.3.1 – Amostragem

A amostragem de raízes fez-se com o auxílio de uma sonda, que

perfurou o solo até cerca de 20 cm. Recolheu-se dessa forma um “core” de

solo, com 4 cm de diâmetro, junto do caule da planta, cujas raízes que se

pretendia analisar.

Houve dois períodos distintos de amostragem nas folhas R1 e R3.

Estes realizaram-se primeiro semanalmente, desde o estabelecimento das

culturas, e posteriormente, a partir do momento em que foram detectadas

raízes micorrizadas, com uma periodicidade quinzenal. Durante o primeiro

período, era extraído um “core” em apenas seis talhões, um de cada

mobilização para as duas folhas. Durante o período de amostragem

quinzenal, extraiam-se três amostras (cada uma correspondente a um “core”),

aleatoriamente dentro de cada talhão, num total de 27 amostras por folha (9

talhões x 3 amostras). As recolhas quinzenais, realizaram-se entre 7 de Abril

e 2 de Junho.

A metodologia de amostragem para a cultura de girassol da folha R2,

consistiu na extracção de pelo menos três “cores” por talhão, que foram

misturados numa única amostra. Optou-se por esta forma de amostragem,

porque as raízes do girassol são espessas e dispersas, pelo que não se

extraía uma quantidade suficientemente representativa por “core”. A recolha

de amostras da folha de girassol também se realizou quinzenalmente, entre

os dias 19 de Maio e 14 de Julho.

54

7.2.3.2 - Preparação

Para limpar e separar as raízes do solo, colocaram-se as amostras

num crivo de 1 mm de malha, fazendo-se incidir sobre elas um jacto de água

sob pressão. Depois de desaparecer a maior parte de limo e argila, as raízes

ficam retidas e bem visíveis no crivo, juntamente com as partículas de solo

superiores a 1 mm, de onde são retiradas com uma pinça para recipientes

próprios de coloração. Evitou-se juntar demasiadas raízes de maneira que os

reagentes utilizados posteriormente, no processo de coloração, ficassem

uniformemente em contacto com a raiz.

7.2.3.3 - Coloração

Características como a rigidez, espessura, opacidade e pigmentação

dos tecidos das raízes, não permitem que as estruturas das AM possam ser

observadas directamente em raízes frescas num microscópio estereoscópico

(Brundrett, 1996), pelo que é necessário realizar-se um procedimento de

coloração que permita ultrapassar estes obstáculos. Segundo Koske e

Gemma, 1980, como as características referidas variam entre diferentes

espécies de plantas e os procedimentos de coloração são morosos, antes de

se iniciarem as colorações em massa, devem-se testar diferentes

procedimentos de coloração de raízes, de maneira a escolher aquele que

torna mais nítida a observação das estruturas micorrízicas. Este tipo de

testes foi efectuado e o protocolo dessa experiência pode ser consultado no

quadro 6.

55

Seja qual for o processo de coloração escolhido, este tem 3 etapas

fundamentais: - a remoção dos conteúdos celulares, a coloração e a

descoloração. A remoção dos conteúdos celulares serve para eliminar a

opacidade e a pigmentação, provocadas respectivamente pelos conteúdos e

pigmentos naturais das paredes das células. Faz-se, mergulhando as raízes

numa solução básica de KOH, que remove aqueles conteúdos das células. A

sensibilidade das raízes ao KOH depende da sua concentração, do tempo na

solução e da temperatura. É necessário estabelecer um equilíbrio entre estes

factores, caso contrário as raízes podem desfazer-se ou ficar mal lavadas, o

que levaria a que o corante viesse a ligar-se indiferentemente às estruturas

fúngicas e aos conteúdos celulares, inibindo um bom contraste.

Quadro 6 - Testes efectuados para determinar o método de coloração mais eficaz para as raízes em estudo.

Etapa Componentes Concentração Procedimento*

Remoção dos conteúdos celulares

KOH**

10%

10%

1 M

10%

Ciclo de autoclave (121 ºC durante 20 minutos). Temperatura ambiente pelo menos 24h. Breve fervura e deixar durante pelo menos 12 horas à temperatura ambiente. A 65 ºC durante 15 minutos.

HCl

-

2 N

1 %

Sem tratamento de HCl À temperatura ambiente durante 20 minutos. Seguidamente passar por água. À temperatura ambiente durante alguns segundos.

Coloração Tripano Azul

0,05 %

0,1 %

A 65 ºC durante cerca de 5 minutos. A 65 ºC durante cerca de 5 minutos.

Azul de Metileno 1% Temperatura ambiente durante 15

minutos.

Descoloração Lactoglicerol

Glicerol

(1 : 1 : 1)***

50 %

Deixar durante a noite. Deixar durante a noite.

* - Testaram-se todas as combinações possíveis dos diferentes procedimentos para cada etapa. Por essa razão foram necessárias 24 amostras de raízes. O procedimento a negro pronunciado, que foi sugerido por Walker (com. pess.), não entrou nas combinações pelo que só foi necessária mais uma amostra de raízes. ** - Após os tratamentos com KOH as raízes foram passadas por água corrente. *** - Lactoglicerol (1:1:1) – Ácido láctico : Glicerol : Água

56

Após o tratamento com KOH as raízes ficam bastante alcalinas e

devem ser acidificadas em HCl, para garantir que o corante se ligue às

estruturas fúngicas (Jensen, 1962). Considerou-se este tratamento

dispensável, uma vez que não se observaram diferenças nas raízes tratadas

com e sem HCl. Talvez o facto das raízes terem sido passadas por água

corrente após o tratamento com KOH, tenha tido alguma influência na sua

melhor remoção, reduzindo a necessidade de neutralização.

Seguidamente, passa-se ao processo de coloração, em que as

estruturas de AMF são ligadas a um corante. O corante mais utlizado é o

tripano azul em lactofenol (Phillips e Hayman, 1970). Uma vez que o fenol é

extremamente tóxico, foi substituído com sucesso por lactoglicerol (Kormanik

et al., 1980). O tripano azul, apenas se liga às estruturas quitinosas do fungo

e não aos tecidos da raiz, o que cria contraste. Podem usar-se diferentes

concentrações de tripano azul. No teste realizado, nas raízes coradas com

tripano azul em lactoglicerol a 0,05%, as estruturas fúngicas não ficaram tão

evidenciadas como aconteceu naquelas em que se utilizou a concentração

de 0,1%.

Por fim, a descoloração é o processo em que o corante que não se

ligou a quaisquer estruturas é removido dos tecidos da raiz, criando-se o

contraste entre as estruturas fúngicas e as células, necessário para a

observação. A descoloração faz-se mergulhando as raízes já lavadas e

coradas em lactoglicerol. No entanto, também há quem recomende glicerol

50% (Brundrett et al., 1996). Chegou-se à conclusão que ambas as soluções

foram igualmente eficiêntes. No entanto, como o ácido láctico é um reagente

dispendioso, optou-se pelo glicerol 50%.

57

De seguida descreve-se detalhadamente o método que foi considerado

mais eficaz para corar as raízes deste estudo:

1. O suporte, contendo os copos de coloração com as amostras de raízes

previamente limpas, foi colocado num pirex imerso em solução de KOH 10

%, que ficou a cobrir totalmente as amostras. Seguidamente, o pirex foi

colocado na autoclave e efectuou-se um ciclo de 20 minutos a 121 ºC;

2. O pirex foi retirado do autoclave e aberto na Hott (MACRISAN), para evitar

respirar os vapores da solução de KOH. O suporte, depois de bem

escorrido, foi retirado do pirex e passou-se água corrente pelos copos

para retirar o excesso de KOH;

3. Colocou-se o suporte noutro pirex, que continha solução de azul tripano

0,1% em lactoglicerol, em banho maria (KÖTTERMANN) a 65 ºC. O

tempo de coloração foi de cerca de 5 minutos. O banho maria foi posto na

Hott, para evitar a inalação dos vapores tóxicos do azul tripano;

4. Ao fim dos cerca de 5 minutos da coloração, transferiu-se directamente o

suporte das amostras para outro pirex com glicerol 50 %, onde as raízes

permaneceram a descorar, à temperatura ambiente, pelo menos de um

dia para o outro.

7.2.3.4 - Taxa de colonização

Depois das raízes estarem coradas, ficaram prontas para se poder

observar as estruturas dos AMF e estimar qual a taxa de colonização (%). O

método escolhido para o fazer, foi o método de intersecção de grelha, que é

geralmente o mais utilizado. Giovannetti e Mosse (1980), que avaliaram

58

diferentes métodos de quantificação da colonização micorrízica das raízes,

concluíram que este método é aquele cujo erro padrão cometido é menor.

Segundo estas investigadoras, o método, consiste em distribuir as amostras

de raízes coradas sobre uma placa de Petri com uma grelha no fundo e

contar qual o número de pontos de intersecção, entre as linhas da grelha e as

raízes, com estruturas de AMF e sem estruturas (fig. 15).

Giovannetti e Mosse (1980), referiram ser necessário contabilizar pelo

menos 100 intersecções para se obter um mínimo de fiabilidade do método.

Quando tal não é possivel aconselham a redistribuir as raízes. Para o trigo e

triticale não foi necessário fazer qualquer redistribuição, pois as raízes nestas

plantas são abundantes, pelo que se contabilizaram sempre pelo menos 200

intersecções. Houve o cuidado de não colocar demasiadas raízes na placa de

Petri, de maneira a não haver muitas sobreposições, o que dificulta a

observação. No caso do girassol, em que as raízes são grossas e pouco

Figura 15 – Método intersecção de grelha (Adaptado de Brundrett, 1994)

59

abundantes na camada de solo em que se procedeu à amostragem, por

vezes, embora poucas, houve necessidade de redistribuir as raízes.

Das contagens efectuadas para as três amostras de raízes obtidas em

cada talhão nas folhas R1 e R3 (onde se realizaram este ano as culturas de

triticale e trigo respectivamente), resultou um único valor de taxa de

colonização (média das três amostras) que necessariamente será mais fiel à

realidade.

60

8 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

8.1 – Tratamento estatístico

8.1.1 – Análise de variância - ANOVA

A análise de variância (ANOVA) foi o método utilizado para comparar

as médias do número de esporos, taxa de colonização e parâmetros de

produção. A ANOVA permite, num único teste, fazer comparações entre

qualquer número de médias amostrais (Fowler e Cohen, 1994). Considerou-

se p<0,05 (5%) como nível de significância. Os resultados obtidos nas folhas

R1 e R3 (antecedentes pousio e girassol e culturas de triticale e trigo

respectivamente), foram analisados separadamente dos resultados aferidos

em R2 (antecedente triticale e cultura de girassol), uma vez que as recolhas

de amostras ocorreram em momentos diferentes. O programa informático

utilizado foi o MSTAT–C versão 1.42 da Michigan State University.

Realizaram-se diferentes modelos experimentais, adaptados ao delineamento

da experiência, para as seguintes comparações:

Entre médias do número de esporos para averiguar as diferenças

entre mobilizações e antecedentes: Modelo para os antecedentes

pousio e girassol – Delineamento em blocos completamente aleatórios

para um factor (mobilizações) combinado sobre locais (antecedentes

culturais). Modelo para o antecedente triticale – ANOVA simples

agrupada sobre uma variável (mobilizações).

Entre médias da taxa de colonização para averiguar sobre as

diferenças entre mobilizações e culturas em cada uma das datas de

61

amostragem: Modelo para as culturas de triticale e trigo -

Delineamento em blocos completamente aleatórios para um factor

(mobilizações) combinado sobre locais (antecedentes culturais).

Modelo para a cultura de girassol - ANOVA simples agrupada sobre

uma variável (mobilizações).

Entre médias da taxa de colonização para averiguar sobre as

diferenças entre mobilizações e culturas ao longo do período em que

se realizaram as amostragens: Modelo para as culturas de triticale e

trigo – Delineamento em blocos completamente aleatórios para dois

factores (mobilizações e datas) em talhões subdivididos, combinados

sobre locais (culturas). Modelo para a cultura de girassol –

Delineamento em blocos para o factor A (mobilizações) com o factor B

(datas de amostragem) em talhões subdivididos em A.

Uma vez estabelecido que numa ANOVA as médias diferem

significativamente entre si, em regra o passo seguinte é investigar qual ou

quais as médias que diferem (Dias, 1996). Para tal efectuou-se o teste

múltiplo de amplitudes de Duncan (DMRT).

8.1.2 – Análise de regressão

Para que se possam realizar previsões sobre uma variável a partir de

outra é necessário que entre as duas se verifique uma relação funcional, de

causa efeito, em que a variação de uma se possa atribuír à variação de outra

(Sokal e Rohlf, 1997). Neste estudo, pretendeu-se verificar se existiu uma

correlação significativa entre o número de esporos e a taxa de colonização

62

micorrízica que se veio a quantificar mais tarde, e entre esta e a produção de

biomassa, ou seja, respectivamente, se a taxa de colonização aumenta

significativamente com o aumento do número de esporos e se a biomassa

aumenta significativamente com o aumento da taxa de colonização. Para tal

traçaram-se as rectas de regressão linear entre as variáveis dependente (y–

taxa de colonização1; biomassa2) e independente (x–número de esporos1;

taxa de colonização2), com o auxílio do programa informático EXEL versão de

97 da Microsoft Corporation. Para cada recta determinou-se o respectivo

Coeficiente de Correlação, r, que é uma medida da intensidade da

associação entre as duas variáveis, variando entre –1 e1.

A significância da análise de regressão foi realizada pelo teste de

significância de Pearson. H0:ρ=0 e HA: ρ>0; equação aplicada tr=(r√n-2/√1-r2).

A H0 é rejeitada se tr>t0,05(n-1).

8.2 – MPN

Ao fim das sete semanas em que se desenvolveu o trigo nos vasos do

ensaio, não se detectou colonização por AMF. Depois de se proceder

inicialmente à coloração de raízes e sua observação nas plantas de controlo,

as quais não foram colonizadas, começou a fazer-se o mesmo para a diluição

50, onde seria mais provável encontrar colonização micorrízica. No entanto,

não se visualizaram quaisquer estruturas de AMF nem nesta diluição, nem

nas raízes de qualquer outra planta do ensaio.

Apesar das razões que conduziram ao não despoletar da colonização

poderem ser variadas, será conveniente formular algumas hipóteses sobre

quais poderão ter sido as mais importantes, para que num ensaio futuro

63

aumentem um pouco mais as probabilidades de sucesso. Assim, poder-se-á

pôr a questão se sete semanas terá sido o tempo suficiente para que se

iniciasse a colonização. Nada o faria prever, pois de acordo com a bibliografia

consultada, previamente referida, verifica-se que o tempo médio deste tipo de

ensaios é de seis semanas. De qualquer forma, talvez seja pertinente no

futuro preparar vasos de controlo positivos, que sirvam como indicadores de

quando ocorre colonização. Mas, se noutros ensaios de MPN se obtiveram

resultados ao fim de seis semanas, porque é que isso não aconteceu neste?

As razões só poderiam ser encontradas seguindo o que foi sugerido por

Wilson e Trinick (1982), ou seja, nas condições em que decorreu a

experiência. De facto, a estufa utilizada não é climatizada artificialmente, pelo

que na época do ano em que decorreu o ensaio (Dezembro; Janeiro), para

além do fotoperíodo e intensidade luminosa serem baixos, as temperaturas,

apesar de durante o dia poderem alcançar os 25-30ºC, desciam

consideravelmente durante a noite. Esta poderá de facto ter sido a principal

causa do insucesso do ensaio, e consequentemente terá de ser tida em

conta numa abordagem futura.

8.3 - Esporos

Uma vez que a amostragem de esporos ocorreu antes das

sementeiras, analisam-se os resultados em termos de antecedentes culturais

e não de culturas.

64

Quadro 7 – Médias* das contagens de esporos (nº de esporos/100g de solo) recolhidos nas folhas R1 e R3 (antecedentes pousio e girassol respectivamente), em cada tipo de mobilização.

Lavoura Escarificação S. Directa Média

Pousio 128,3C 184,8B 144,2BC 152,4B

Girassol 167,8BC 188,0B 248,7A 201,5A

Médias 148,1B 186,4A 194,4A

* -Cada valor representa a média de 6 amostras (2 amostras por talhão x 3 repetições). Antecedentes f=47,8 p<0,002 Mobilizações f=5,1 p<0,04 Inter. f=5,1 p<0,04

O número de esporos contabilizados para os antecedentes são

significativamente diferentes entre si. O significativo menor valor verificado no

pousio, poder-se-á dever a factores que vêm na linha dos trabalhos de

Harinikumar e Bagyaraj (1988) e Tisdall e Oades (1980) (ver 6), acrescidos

possivelmente pelo encharcamento a que esta folha esteve sujeita, o que

pode ter contribuído como mais um factor de degradação e destruição dos

esporos. Esta análise é reforçada pelo facto do antecedente do pousio ter

sido girassol, ou seja, o único factor a variar entre folhas foi o pousio, pelo

que é improvável que as diferenças possam ser atribuídas a outros factores

(e.g. diferenças micotróficas entre culturas).

No que respeita a mobilizações, relativamente aos dois antecedentes

em conjunto, verifica-se que, em lavoura, o número de esporos quantificados

é significativamente inferior face à escarificação e sementeira directa, as

quais não diferem entre si. Tal indica mais uma eventual desvantagem

daquele tipo de mobilização, o que vem no seguimento dos estudos de Kabir

et al. (1997,1998a,b) (ver 6). O valor obtido no antecedente girassol para

sementeira directa é significativamente superior relativamente a todas as

outras mobilizações, o que poderá indiciar uma vantagem clara deste tipo de

65

mobilização a este nível e nestas circunstâncias. Este resultado não está de

acordo com o trabalho de Mozafar et al. (1998), os quais não detectaram

diferenças entre mobilizações para o número de esporos, mas está de acordo

com o de Douds et al. (1995), que também observaram mais esporos em

sementeira directa num caso particular do seu estudo (ver 6).

O valor obtido no antecedente pousio para escarificação é maior

relativamente à sementeira directa, e significativamente maior em relação à

lavoura. Tal poder-se-á dever a diferentes factores associados ao pousio (e.g.

erosão, ervas daninhas, encharcamento etc.), que talvez tenham actuado de

modo diferente sobre os talhões.

Quadro 8 – Médias* das contagens de esporos (nº de esporos/100g de solo) recolhidos na folha R2 (antecedente triticale).

Lavoura Escarificação S. Directa Média

Triticale 67,8A 26,0B 29,3B 41,1

* -Cada valor representa a média de 6 amostras (2 amostras por talhão x 3 repetições). Mobilizações f=4,7 p<0,05

Apesar de não se ter efectuado a análise dos três antecedentes em

conjunto, sobressai o facto de se terem contabilizado muito menos esporos

nesta folha do que em R1 e R3. Isto talvez possa ser explicado na linha do

que acontece para o pousio, ou seja, o antecedente triticale ter sido colhido

na Primavera de 1998 e desde essa época até à data desta amostragem não

ter havido qualquer cultura estabelecida. Mas como compreender que a folha

R1 (antecedente pousio), tenha maior número de esporos? Talvez porque,

conforme foi referido, antes do pousio a cultura antecedente foi girassol, a

qual parece ser muito micotrófica, como é admitido por Chandrashekara et al.

(1995), e também será sugerido pelos resultados da taxa de colonização.

66

Assim, possivelmente por esta razão e pela época quente, propícia à

micorrização, em que é cultivado o girassol, talvez este seja maior promotor

da esporulação de AMF que o triticale. Outro aspecto ainda, reside no facto

de o triticale ser um híbrido (trigo x centeio - Triticum sp. x Secale sp.),

sucessivamente melhorado e já de si resultante de plantas melhoradas

(Bellido, 1991), com as eventuais consequências ao nível da susceptibilidade

micotrófica preconizadas por Azcón e Ocampo (1981).

Também nestas circunstâncias não se verificaram diferenças

significativas entre escarificação e sementeira directa. No entanto, como

explicar que o número de esporos obtidos em lavoura tenha sido

significativamente superior relativamente às restantes mobilizações? Talvez

as camadas superiores de solo, de onde foram recolhidas as amostras,

tenham sido afectadas com a erosão ao longo de praticamente um ano em

que esta folha não foi cultivada, e o revolvimento do solo, fruto da lavoura,

tenha trazido mais à superfície esporos que se encontravam mais protegidos

em profundidade. Outra possível explicação que não deve ser posta de parte

encontra-se na eventualidade de as espécies de AMF, preferenciais para este

antecedente, façam a deposição de esporos mais em profundidade. Douds et

al. (1995), verificaram haver espécies de AMF cujos esporos se encontravam

a maior profundidade do que outras.

8.3.1 – Classificação taxonómica

Segundo a descrição feita em 4.2 e de acordo com as sugestões feitas

por Dodd (com. pess.), os esporos representados na fig. 16 pertencem ao

género Glomus.

67

A taxonomia não era, e não foi, um dos objectivos do presente

trabalho. Aliás, se o tivesse sido, seria necessário aprofundar bastante mais

esta questão, inundada de controvérsia e em que muito ainda está por definir.

Segundo Brito (1997), encontram-se frequentemente descrições de espécies

realizadas com material de campo, o qual está sujeito a factores ambientais

passíveis de induzir alterações morfológicas nos esporos (e.g. na forma,

esporos parasitados, sujos), que podem conduzir a interpretações erradas. A

solução para se ultrapassar estas dificuldades passa por se realizar culturas

armadilha, em que se faz crescer em vaso, com substracto estéril ao qual são

adicionados os esporos recolhidos do solo ou o próprio solo, uma planta que

se sabe ser micotrófica. A planta deve crescer sob condições óptimas durante

2 a 3 meses até que haja esporulação de AMF. Os esporos assim obtidos,

não deverão ter as alterações inerentes ao material de campo, e deverão ser

em número suficiente para que se possa aferir de todas as características

morfológicas a observar, para que se possa efectuar uma classificação

taxonómica dos AMF fiável. Este procedimento simples mas moroso

A B C

D E F Figura 16 – Esporos recolhidos nas folhas do ensaio. Nos esporos A, B, D e F utilizou-se reagente de Melzer como meio de montagem, nos esporos C e E PVLG. Ampliação - 400x.

68

começou a ser realizado durante este trabalho, esperando-se que no futuro

possam vir a tirar-se conclusões mais precisas sobre este assunto.

8.4 – Taxa de colonização

8.4.1 – Início da colonização

A colonização ocorreu no fim de Março nas culturas de trigo e triticale,

quando estas já se encontravam no final do período de encanamento, que

culmina com a floração, prestes a entrar no período de maturação, onde

ocorre a formação e enchimento do grão (Bellido, 1991).

Hetrick et al. (1984), referem que em estudos anteriores não se havia

detectado colonização por AMF em trigo de Inverno até ao fim de Abril

princípio de Maio. Uma vez, que até então, esta colonização tardia não havia

sido explicada, tentaram verificar se esta se poderia dever à resistência das

variedades à colonização, que havia sido sugerida por Azcón e Ocampo

(1981). Também observaram uma colonização tardia (em Maio) nas

experiências de campo, mesmo tendo inoculado o solo com diferentes

espécies de AMF, não observando benefícios directos nas produções ou

reduções nas doenças que afectam o trigo. No entanto, em todas as

variedades testadas em condições controladas, não foi detectada

colonização a 10ºC mas, a 25ºC, umas mais que outras, mas todas estavam

colonizadas ao fim de 10 semanas. Assim, atribuíram a colonização tardia

apenas às baixas temperaturas verificadas no Outono e no Inverno, as quais

poderiam ter inibido a germinação dos esporos e a colonização das raízes.

Dodd e Jeffries (1986), foram os primeiros a detectar picos de

desenvolvimento de micorrização em cereais de Inverno (e.g. trigo), tanto no

69

final do Outono como no início da Primavera, com uma quebra pronunciada

entretanto, durante os meses de Inverno. Também argumentam que os

estudos até aí realizados tinham sugerido ser pouco provável que a

micorrização pudesse influenciar significativamente o crescimento de cereais

de Inverno em climas temperados, pelo menos até ao período de floração e,

daí em diante, em virtude das baixas taxas de colonização sugeridas.

Contudo, contrapõem revelando que os seus estudos contradizem esta visão.

De facto os picos foram detectados em períodos cruciais do desenvolvimento

das plantas, e em épocas em que as temperaturas e a luminosidade ainda

não são demasiado baixas. O contrastante trabalho de Saif e Khan, (1975),

realizado no Paquistão, região muito mais quente, tendo também por base a

cultura de trigo de Inverno, em que foi detectada uma taxa de colonização

superior a 50% um mês após a sementeira, é mais uma contribuição para o

conceito de ser muito provável que os factores chave desta discussão sejam

a temperatura e a luminosidade.

Presumivelmente, como no presente estudo a sementeira foi tardia, o

que não aconteceu nos estudos de Dodd e Jeffries (1986), onde o trigo foi

semeado no início de Outubro, já não se verificaram as condições de

temperatura e luminosidade favoráveis para o estabelecimento da

colonização, o que só veio a acontecer no início da Primavera. Ainda assim,

relativamente à bibliografia consultada, a colonização foi detectada um pouco

mais cedo, pelo que, é provável que este aspecto se tenha devido ao facto

de, a esta latitude, as temperaturas não serem tão severas (mesmo tendo

sido um ano agrícola mais frio no Inverno) como acontece naquelas em que

foram realizados aqueles estudos. Por essa razão, as medidas a tomar para

70

Figura 17 – Aspecto do girassol quando teve início a colonização.

se tirar mais partido desta simbiose, talvez passem por se seleccionar

variedades mais micotróficas e semear o mais cedo possível.

Na cultura de girassol, a colonização foi detectada em meados de

Maio quando a cultura ainda se encontrava no primeiro período de

desenvolvimento fenológico, que, segundo Ripado (1997), vai desde a

sementeira até ao estadio de 5 ou 6 pares

de folhas (fig. 17). É nesta altura que a

planta coloca em acção todos os meios

que lhe permitem elaborar a produção do

sistema radicular, folhas e primórdios

florais. Esta colonização precoce vem na linha do que já foi referido

relativamente às temperaturas favoráveis à micorrização, que são próprias

desta época do ano, e ao micotrofismo do girassol que, talvez possa ser

explicado em termos evolutivos sobretudo devido às carências hídricas

próprias do clima estival.

Tanto no trigo como no triticale, assim como no girassol, não se

verificaram diferenças entre mobilizações relativamente ao despoletar da

colonização. Apesar de este facto não estar de acordo com as observações

de Mozafar et al. (1998), a realidade é que, nas circunstâncias deste estudo,

a terem ocorrido diferenças estas foram certamente de poucos dias.

8.4.2 – Evolução

A evolução das taxas de colonização ao longo do tempo em que

decorreram as amostragens, para cada uma das culturas de trigo e triticale

71

consoante o tipo de mobilização, encontram-se representadas nos gráficos e

quadros seguintes:

0

5

10

15

20

25

30

Tx.

Co

lon

izaç

ão (%

)

7/4/99 5/5/99 2/6/99

Data de amostragem

Triticale

Lavoura

Escarif icação

S. Directa

0

5

10

15

20

25

30

Tx.

Co

lon

izaç

ão (%

)7/4/99 5/5/99 2/6/99

Data de amostragem

Trigo

Lavoura

Escarif icação

S. Directa

Figura 18 - Evolução, ao longo do período de amostragem, da taxa de colonização das raízes para as culturas de triticale e trigo nos diferentes sistemas de mobilização. 3ª data (culturas f=4,6 p<0,1; Mobilizações f=5,6 p<0,03; Inter. f=7,1 p<0,02) 4ª data (culturas f=10,1 p<0,03; Mobilizações f=7,7 p<0,01; Inter. f=5,7 p<0,03). Quadro 9 - Médias* das taxas de colonização (%) para cada cultura (triticale e trigo) por datas de amostragem, independentemente das mobilizações.

7/4/99 21/4/99 5/5/99 19/5/99 2/6/99 Médias

Triticale 7,7AC 6,2AD 4,1CD 3,1D 5,0BD 5,2B

Trigo 6,2AD 8,9A 8,3AB 9,8A 9,1A 8,4A

Médias 6,9 7,5 6,2 6,4 7,1

* Cada valor representa a média de 27 amostras de raízes (3 cores por talhão x 3 mobilizações x 3 repetições). Culturas f=5,7 p<0,04 Datas f=0,4 n/s Inter. f=3,5 p<0,01

72

Quadro 10 – Médias* das taxas de colonização (%), para cada tipo de mobilização, das culturas de triticale e trigo conjuntamente e por datas de amostragem.

7/4/99 21/4/99 5/5/99 19/5/99 2/6/99 Médias

Lavoura 5,2CE 3,0E 2,7E 2,8E 4,4DE 3,6B

Escarificação 7,9AD 10,0AB 6,3AE 6,1AE 10,7A 8,2A

S. directa 7,6AD 9,7AC 9,6AC 10,3AB 6,1BE 8,6A

* Cada valor representa a média de 18 amostras de raízes (3 cores por talhão x 3 repetições x 2 folhas) Mobilizações f=5,6 p<0,03 Datas f=0,4 n/s Inter. f=2,1 p<0,05

Lavoura Escarificação S. Directa

Triticale 2,9C 8,9B 3,9C

Trigo 4,4C 7,5B 13,4A

O trigo teve uma taxa de colonização significativamente superior

relativamente ao triticale (quadro 9). Pode discutir-se este resultado segundo

três pontos de vista: por um lado talvez o trigo seja uma cultura mais

micotrófica que o triticale, por outro, o significativo maior número de esporos

quantificados na sua folha, em conjunto com outras fontes de inóculo não

quantificadas, poderão ter conduzido a este resultado, ou então ambos os

mecanismos actuam conjuntamente. O micotrofismo poderá ser um factor

importante, sobretudo depois de tudo o que já foi referido sobre este assunto,

nomeadamente pelo que foi observado para o número de esporos

relativamente aos antecedentes, em que se verificou haver menos esporos

para o antecedente triticale relativamente aos outros. No entanto, de modo

algum se poderá escamotear o factor número de esporos quantificados na

Quadro 11 - Médias das médias das taxas de colonização (%) ao longo do período de amostragem por mobilizações e culturas.

* Cada valor representa a média de 45 amostras (3 cores por talhão x 3 repetições x 5 datas). Culturas f=5,7 p<0,04 Mobilizações f=5,6 p<0,03 Inter. f=5,9 p<0,03

73

folha do trigo (antecedente girassol), sobretudo se se analisar o que se

verifica em relação às mobilizações (quadro 10). De facto, a

significativamente maior taxa de colonização verificada no trigo (quadro 9)

deve-se à superioridade observada em sementeira directa, que foi

significativa relativamente às outras mobilizações nas 3ª e 4ª datas de

amostragem (fig. 18). Ora, se se recordar que tinha sido observado um

significativo maior número de esporos nesta folha e mobilização (quadro 7), é

natural que a hipotese da relação entre o número de esporos e a taxa de

colonização seja reforçada. Por outro lado, é de realçar que, no trigo, cultura

que esteve instalada numa folha que havia recebido um antecedente há

relativamente pouco tempo (o girassol), e antes deste seguiu o plano normal

de rotação, a sementeira directa também foi claramente superior ao nível da

taxa de colonização. Talvez as vantagens descritas para a sementeira

directa, nomeadamente em que a rede extraradical de micélio é pouco

perturbada, bem como outras eventuais fontes de inóculo que a cultura de

girassol ajudou a desenvolver enquanto esteve estabelecida, tenham sido os

factores mais importantes para a referida superioridade da taxa de

colonização em sementeira directa verificada na cultura de trigo. No entanto,

pode ainda referir-se que a intensificação da diferença entre a sementeira

directa e as outras mobilizações a partir da 3ª data, coincidiu com o aumento

da temperatura (quadro 3), sugerindo mais uma vez que o aumento de

temperatura favorece a micorrização. Daí que, provavelmente, a resposta à

subida de temperatura seja maior e mais imediata quanto maior fôr o

potencial micorrízico de um solo, como parece ter acontecido nos talhões

sujeitos a sementeira directa.

74

Ao nível da taxa de colonização, a lavoura revelou-se como o tipo de

mobilização em que se verificaram valores de micorrização significativamente

inferiores relativamente às outras mobilizações (quadro 10). Tal, poder-se-á

dever ao significativamente menor número de esporos quantificados nas

folhas onde se estabeleceram estas culturas nos talhões sujeitos a lavoura

(quadro 7), sugerindo uma vez mais a existência de uma relação de causa-

efeito entre esporos e taxa de colonização, e também ao rompimento da rede

extraradical de micélio entre outros factores, conforme foi sugerido por Kabir

et al. (1997, 1998b).

Ainda relativamente às mobilizações, desde a 1ª até à 4ª data de

amostragem que não se verificam diferenças significativas entre escarificação

e sementeira directa quando se analisam as duas culturas em conjunto

(quadro 10), o que, para além das condições estruturais do solo serem mais

vantajosas para a proliferação de raízes e micorrização nestas mobilizações,

também vem no seguimento do que foi observado para os esporos (quadro

7).

No triticale apenas se verificou haver diferenças significativas entre

escarificação e as outras mobilizações (quadro 11), as quais foram iguais

entre si. Isto, mais uma vez, talvez possa ser atribuído à relação entre

número de esporos e taxa de colonização, pois na folha de triticale

(antecedente pousio), apesar da diferença entre o número de esporos

quantificados em escarificação e sementeira directa não ter sido significativa,

quantificaram-se mais esporos (quadro 7) em escarificação do que nas

restantes mobilizações. De qualquer forma, a ideia que mais transparece da

análise do quadro 11 é que, quando houve diferenças entre as duas culturas,

ela foi apenas patente na sementeira directa, indicando que, em situações de

75

igualdade de mobilização, o trigo tira melhor partido das condições

proporcionadas pela sementeira directa em termos de colonização

micorrízica.

Quanto à evolução da taxa de colonização ao longo do tempo e nos

períodos de amostragem, ao contrário de Dodd e Jeffries (1986), não se

observaram diferenças significativas, tanto em termos de culturas como de

mobilizações (quadros 9 e 10). No entanto, os picos de desenvolvimento de

micorrização detectados por aqueles investigadores, verificaram-se em fases

fenológicas distintas das plantas, ao passo que, neste estudo, o período de

amostragem apenas acompanhou a evolução da taxa de colonização a partir

do final do período de encanamento das culturas.

Na página seguinte representam-se os gráficos de análise de

regressão (fig. 19), elucidativos da existência, ou não, de uma relação de

causa-efeito entre as variáveis número de esporos e taxa de colonização.

Verifica-se que tanto no triticale como no trigo houve uma

correlação significativa entre o número de esporos e a taxa de colonização.

Essa correlação foi significativa desde a primeira data de amostragem na

cultura de triticale (fig. 19-A) o que não aconteceu na cultura de trigo, em que

tal só ocorreu à 3ª data de amostragem (fig. 19-C). Foi nesta data que a

correlação foi mais forte relativamente às datas de amostragem anteriores

para ambas as culturas.

76

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300

nº de esporos

Tx.

col

oni

zaçã

o (%

) (7

/4/9

9)Triticale

Trigo

A Triticale y=0,1199x-10,614; r=0,62 Trigo y=0,0613x-6,1761; r=0,55

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300nº de esporos

Tx.

col

oni

zaçã

o (%

) (2

1/4/

99)

Triticale

Trigo

B Triticale y=0,1151x-11,344; r=0,71 Trigo y=0,0766x-6,5504; r=0,39

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300nº de esporos

Tx.

col

oni

zaçã

o (%

) (5

/5/9

9)

Triticale

Trigo

C Triticale y=0,0925x-9,9776; r=0,84 Trigo y=0,1139x-14,668; r=0,68

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300nº de esporos

Tx.

col

oni

zaçã

o (%

) (1

9/5/

99)

Triticale

Trigo

D Triticale y=0,0889x-10,473; r=0,74 Trigo y=0,1022x-10,853; r=0,67

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300nº de esporos

Tx.

de

col

oniz

ação

(%

) 2/

6/9

9

Triticale

Trigo

E Triticale y=0,1078x-11,379; r=0,84 Trigo y=0,0038x-8,339; r=0,03

Quadro 12 - Teste se significância de Pearson.

Triticale Trigo Gráficos tr P tr P

A 2,10 <0,05 1,76 N/S B 2,65 <0,02 1,12 N/S C 4,04 <0,01 2,46 <0,05 D 2,93 <0,02 2,39 <0,05 E 4,11 <0,01 0,08 N/S

Figura 19 - Gráficos com rectas de regressão linear e valores de correlação entre o número de esporos e a taxa de colonização, para as datas de amostragem – A - 7/4/99; B – 21/4/99;C – 5/5/99;D – 19/5/99; E – 2/6/99.

77

Talvez o facto de só à 3ª data se ter verificado correlação significativa

na cultura de trigo, indique que a colonização inicial tenha sido fruto,

sobretudo, de outros propágulos diferentes dos esporos. Como já foi

sugerido, o girassol foi o antecedente do trigo poucos meses antes deste ter

sido semeado. Assim, é natural que principalmente a rede extraradical de

micélio, mas também outras fontes de inóculo, estivessem ainda bem

estabelecidas no solo dos talhões sujeitos a sementeira directa, que foi onde

se verificou uma significativamente maior taxa de colonização, e que,

passado o Inverno, fossem inicialmente os responsáveis pela colonização.

No caso do triticale, talvez por este ter tido por antecedente pousio, as

fontes de inóculo diferentes dos esporos não estivessem já tão vigorosas.

Daí, os valores obtidos para sementeira directa não serem significativamente

superiores às outras mobilizações e desde o início se tenha verificado

correlação altamente significativa entre taxa de colonização e número de

esporos, os quais, ao contrário das outras fontes de inóculo, são estruturas

de resistência.

À 5ª data (fig. 19-E), a correlação no trigo já não foi significativa mas

continuou a sê-lo no triticale. Uma possível explicação para este resultado é o

facto de, nesta data, o trigo já estar praticamente seco, prestes a ser colhido,

enquanto o triticale ainda se encontrava atrasado cerca de 15 dias

relativamente à fase de desenvolvimento.

78

Seguidamente apresentam-se os resultados obtidos para a cultura de

girassol.

Média

Lavoura 20,8

Escarificação 20,2

S. directa 17,8

Quadro 14 – Médias* das taxas de colonização (%) da cultura de girassol por datas independentemente das mobilizações.

19/5/99 2/6/99 16/6/99 30/6/99 14/7/99 Média

Girassol 24,9 20,7 18,4 16,2 17,9 19,6

* Cada valor representa a média de 9 amostras (3 mobilizações x 3 repetições). Datas f=2,1 n/s

Os valores de taxa de colonização observados na cultura de girassol

confirmam o que já foi referido sobre o seu micotrofismo. É certo que as

condições climatéricas são mais favoráveis à micorrização na época em que

decorre esta cultura mas, apesar de não se estar a fazer comparações entre

o girassol e as culturas de trigo e triticale, não se pode deixar de notar que o

girassol foi estabelecido na folha (R2), cujo solo tinha menos esporos à

partida do que tinham os solos das folhas em que foram cultivados os

cereais, e que, desde cedo, se verificaram taxas de colonização

incomparavelmente superiores às observadas naquelas culturas.

0

5

10

15

20

25

30

Tx.

Co

lon

izaç

ão (

%)

19/5/99 2/6/99 16/6/99 30/6/99 14/7/99

Data de amostragem

GirassolLavoura

Escarif icação

S. Directa

Quadro 13 - Médias* das taxas de colonização (%) da cultura de girassol para todas as datas por mobilizações.

* Cada valor representa a média de 15 amostras (3 repetições x 5 datas). Mobilizações f=0,8 n/s

Figura 20 - Evolução, ao longo do período de amostragem, da taxa de colonização das raízes para a cultura de girassol nos diferentes sistemas de mobilização.

79

Não houve diferenças significativas entre mobilizações, quer em

termos globais (quadro 13), quer na análise que foi realizada data por data

(fig. 20). Também não se verificaram diferenças significativas entre datas

independentemente das mobilizações (quadro 14). Talvez isto signifique que,

quando as condições são favoráveis e a planta micotrófica, mesmo havendo

condições adversas para a micorrização provocadas pela mobilização do solo

(e.g. destruição de esporos, rompimento da rede extraradical de micélio),

estas sejam ultrapassadas. O mesmo é indicado pela análise de regressão

efectuada para verificar sobre a relação de causa-efeito entre esporos e taxa

de colonização. Efectivamente, não houve qualquer correlação nesta cultura,

ou seja, a taxa de colonização não aumentou significativamente com o

aumento do número de esporos, o que pode significar que, quando as

condições são favoráveis e a planta micotrófica, não é necessário que o solo

tenha um elevado potencial micorrízico para que a micorrização se

estabeleça fácil e fortemente. Ainda assim, na mobilização em que se

quantificaram mais esporos (lavoura) (quadro8), a taxa de colonização foi

ligeiramente superior a partir da 2ª data de amostragem (fig. 20) e em termos

globais (quadro 13).

80

8.5 - Produções

Nos gráficos da fig. 21 e no quadro 15, representam-se alguns

parâmetros de produção avaliados nas culturas de triticale e trigo. Não se

apresentam dados para a cultura de girassol uma vez que, pelas razões já

expostas, não se efectuou a colheita.

Figura 21 – Valores obtidos nos parâmetros de produção das culturas de triticale e trigo nos diferentes sistemas de mobilização.

Quadro 15 – Médias* da biomassa (g/m2) nas culturas de triticale e trigo.

Lavoura Escarificação S. Directa Média

Triticale 800,7A 729,0B 693,0B 740,9A

Trigo 496,0C 507,3C 498,0C 500,4B

Médias 648,3A 618,2AB 595,5B

* Cada valor representa a média de 3 amostras (3 repetições por mobilização). Culturas f=27,4 p<0,006 Mobilizações f=3,7 n/s Inter. f=4,4 p<0,05

A biomassa é um parâmetro de produção que resulta do somatório da

produção de grão e da produção de palha. O triticale alcançou uma biomassa

significativamente maior do que o trigo. Este resultado era de certo modo

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

g/m2

Produção degrão

Produção depalha

Biomassa

Triticale

Lavoura

Escarif icação

S. Directa

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

g/m2

Produção degrão

Produção depalha

Biomassa

Trigo

Lavoura

Escarif icação

S. Directa

81

esperado porque o triticale, como já foi referido, é um híbrido robusto e

melhorado com vista à obtenção de maiores produções.

Em relação às mobilizações, no triticale a lavoura mostrou-se como

aquela em que se obtiveram produções significativamente maiores

relativamente às outras mobilizações. O mesmo não se verificou na cultura

de trigo, em que não houve diferenças significativas entre mobilizações, pelo

que poder-se-á questionar se este facto não se terá devido às

significativamente maiores taxas de colonização verificadas em sementeira

directa nesta cultura. Da análise de regressão realizada para verificar se

houve uma relação de causa efeito entre as taxas de colonização e a

produção de biomassa, não se encontrou correlação significativa.

Efectivamente, sobretudo em condições de campo, há inúmeros factores para

além daqueles que se prendem com a micorrização a variar e a ter influência

sobre a produção de uma cultura. Deste ponto de vista, é natural que não se

tenha verificado haver correlação. Por outro lado, conforme já se descreveu e

está de acordo com o trabalho de Hetrick et al. (1984), supostamente a

micorrização ocorreu tardiamente, o que poderá também ser a causa de não

se ter verificado correlação.

82

9 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

O projecto de um dia se poder vir a produzir em condições controladas

quantidades suficientes de propágulos de AMF para se inocular os solos, e

daí se obterem benefícios quer nas produções quer na tentativa de

preservação dos mesmos no âmbito de uma agricultura mais sustentável, de

maneira a que se justifiquem os custos, ainda é técnica e economicamente

inviável. Daí que a única forma de, do ponto de vista agronómico, se tirar

partido desta simbiose é fazer um uso racional dos AMF que naturalmente

existem no solo. Para isso, será necessário tomar medidas adequadas à sua

maximização, o que só será possível se se compreenderem as influências

que as práticas culturais exercem sobre esta simbiose mutualista. As

conclusões que advém deste trabalho passam fortemente por este ponto de

vista.

Mesmo não se tendo obtido os resultados desejados no ensaio de

MPN, chegou-se à conclusão que a época do ano em que se faz a

sementeira, o tempo que medeia entre a sucessão de culturas numa folha, o

tipo de cultura e o tipo de mobilização, podem ser determinantes sobre os

AMF, e que estes factores não se podem dissociar quando se pretende tomar

medidas com vista aos objectivos referidos.

O facto de se ter verificado correlação entre o número de esporos e a

taxa de colonização, e de, devido ao pousio forçado do ano anterior numa

das folhas onde se semearam este ano os cereais, que fez com que este

tivesse sido o único factor a variar entre ambas as culturas (triticale e trigo),

minimizou o insucesso do MPN, pois poderam mesmo assim tecer-se

83

considerações estatisticamente suportadas sobre a influência dos

antecedentes culturais.

Ao contrário do que se verificou neste trabalho, verifica-se que, caso

se realize a sementeira dos cereais de Inverno mais cedo (e.g. início de

Outubro), a colonização talvez se possa iniciar logo nas primeiras etapas

fenológicas daquelas plantas, trazendo eventualmente consequências

benéficas nas produções. Ainda sobre os cereais de Inverno, o pousio

mostrou influenciar negativamente o potencial micorrízico do solo. Pelo

contrário, parece que, quando não se verificam interrupções prolongadas

entre culturas, se obtêm maiores níveis de colonização micorrízica. Tal não

se pode dissociar do factor mobilização pois estes maiores níveis de

micorrização ocorreram em sementeira directa, indicando que provavelmente

este é o tipo de mobilização mais aconselhável quando se pretende tirar o

máximo partido dos AMF, ao contrário da lavoura em que, relativamente às

restantes mobilizações, se verificaram níveis significativamente inferiores de

taxa de colonização. Isto indicou, conforme se prevera inicialmente, que, de

facto, uma mobilização intensa é passível de provocar danos na organização

estrutural de AMF no solo com consequências observáveis.

O micotrofismo foi mais um aspecto que parece ter tido algum peso

nos resultados obtidos. Presumivelmente foi este factor, aliado às favoráveis

condições climatéricas, que contribuiu para que na cultura de Primavera

(girassol) os eventuais problemas decorrentes das práticas culturais sobre os

AMF não se tenham verificado. Esta constatação poderá significar que,

provavelmente, deverá haver mais preocupação relativamente à acção das

práticas culturais nos AMF nas culturas de Inverno.

84

Este foi o primeiro ano em que se estudaram os AMF no campo de

ensaios de mobilizações da Herdade da Revelheira e, como tal, serviu para

se obter uma visão geral sobre este assunto. Inclusivamente, ajustaram-se

metodologias das quais se destaca o apuramento da técnica de coloração de

raízes. Daqui para a frente será mais fácil delinear novas estratégias de

abordagem para aprofundar melhor o conhecimento em pontos específicos

que ficaram por esclarecer. Apesar de ser impossível enumerar todos porque

ainda há muito por descobrir, podem deixar-se algumas perspectivas para um

futuro trabalho de continuação. A mobilização de escarificação, por não se ter

revelado em termos gerais significativamente diferente da sementeira directa,

talvez possa vir a deixar de ser alvo de estudo no futuro, concentrando-se o

tempo que se poupará sobretudo na montagem do MPN, o qual poderá

esclarecer mais claramente a importância dos propágulos diferentes dos

esporos sobretudo em sementeira directa, e noutras tarefas. Estas poderão

ser, por exemplo, o estudo da dinâmica populacional, seguindo-se a linha que

chegou a ser iniciada, ou até seguir-se o caminho da biologia molecular para

se tentar aferir quais as espécies envolvidas, quais as eventuais preferências

dos AMF para as culturas, e, caso de facto se verifiquem, como se

comportam as espécies nesta rotação e face a outras mobilizações. Outro

aspecto que ficou em aberto, reside em saber porque é que apareceram mais

esporos em lavoura relativamente às outras mobilizações na folha que

recebeu girassol. A tentativa de se esclarecer como se distribuem

verticalmente os esporos após a colheita de uma cultura, poderá ajudar na

interpretação deste facto. Apesar de ser logisticamente difícil, uma vez que

este ensaio se insere num projecto mais vasto, com o seu próprio

delineamento experimental, seria interessante poderem vir-se a realizar

85

alterações à época normal de sementeira, experimentar novas variedades

que se saiba não ser melhoradas e verificar qual o impacto destas medidas

na micorrização e nas produções.

Como os AMF não são os únicos agentes biológicos existentes no solo

e inclusivamente, conforme foi descrito, interagem fortemente com outros

organismos, seria importante que as abordagens futuras fossem

multidisciplinares, pois só assim se poderá, um dia, compreender o “todo”.

86

10 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBOTT, L. K., ROBSON, A. D. E SCHELTEMA, M. A. (1995). Managing Soils to Enhance Mycorrhizal Benefits in Mediterranean Agriculture. Critical Reviews in Biotechnology, 15(3/4), 213-228. ALEXANDER, M. (1965). Most-Probable-Number Method for Microbial Populations. Methods of Soil Analysis, Part 2, Chemical and Microbiological Properties, Ed., C.A. Black, Armer, Soc. Agronomy, Madison, Wisconsin, 1467-1472. ALLEN, M. F. (1996). The Ecology of Mycorrhizae. 3ª edição, Cambridge University Press, Cambridge, U.K. AN, Z.-Q., HENDRIX J. W., HERSHMAN, D. E. E HENSON G. T. (1990). Evaluation of the “Most Probable Number” (MPN) and Wet-Sieving Methods for Determining soil Bourne Populations of Endogonaceous Mycorrhizal Fungi. Mycologia, 82(5), 576-581. AZCÓN, R. E OCAMPO, J. A. (1981) Factors Affecting the Vesicular-Arbuscular Infection and Mycorrhizal Dependency of Thirteen Wheat Cultivars. New Phytol., 87, 677-685. BASCH, G. (1991). Alternativas para o Sistema Tradicional de Exploração da Terra, no Alentejo, tendo em Consideração Especial a Mobilização do Solo. Tese de Doutoramento, Universidade de Évora, Évora. BELLIDO, L. L. (1991). Cereales – Cultivos Herbaceos Vol. I. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, Espanha. BRITO, I. M. (1997). Micorrizas Arbusculares – Alguns Aspectos da sua Caracterização. Universidade de Évora. BRUNDRETT, M., MELVILLE, L. E PETERSON, L. (1994). Practical Methods in Mycorrhiza Research. Mycologue Publications Ltd., Waterloo. BRUNDRETT, M., BOUGHER, N., GROVE, T. E MALAJCZUK, N. (1996). Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. ACIAR (Australian Centre for International Agriculture Research) Monograph 32, Australia.

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