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Efeito de um extracto do cogumelo Maitake sobre a
viabilidade celular e apoptose de células de cancro da
mama
Effect of Maitake mushroom extract in breast cancer cells
viability and apoptosis
Autora: Manuela Meireles
Orientada por: Professora Doutora Raquel Soares
Trabalho de Investigação
FCNAUP, Julho de 2009
i
Dedicatória
Dedico este trabalho à pessoa que me fez desejar compreender esta área, para
que saiba que estará sempre presente nas minhas escolhas. À minha Mãe…
ii
Agradecimentos
Aproveito aqui para agradecer às pessoas que permitiram directamente
que a realização deste trabalho de investigação fosse possível. Agradeço:
À Professora Raquel Soares, minha orientadora, por me ter proporcionado
investigar um tema tão interessante e adequado, pela prontidão com que sempre
me atendeu e pela visão e orientação científica que concedeu a este trabalho.
À Professora Conceição com quem tive o primeiro contacto e me
encaminhou pelo melhor caminho para cumprir os meus objectivos. Agradeço à
Directora do Serviço na altura, Professora Doutora Isabel Azevedo, por me ter
acolhido no serviço e permitido realizar este trabalho de investigação.
Acolhimento que foi continuado pela actual Directora do Serviço, Professora
Doutora Fátima Martel, a quem também agradeço.
À Sofia, pela confiança e autonomia que me concedeu e pela forma
paciente com que acompanhou o meu estágio e a todos os meus colegas e
pessoal no laboratório, por terem facilitado a minha integração, quer como
investigadora, quer como pessoa. Não posso deixar de dar um agradecimento
especial à Raquelita, pela presença constante, pelos ensinamentos, pelo espírito
crítico em relação ao meu trabalho, pela ajuda incondicional e pela amizade, este
trabalho não teria sido o mesmo sem ti.
Não esquecendo todos os que contribuíram de forma indirecta, pelo apoio
contínuo que me prestaram. A eles tive já oportunidade de agradecer no relatório
de estágio, e reforço aqui essa gratidão. Amigos de sempre, amigos de curso,
família e Filipe, obrigada!!
iii
Índice
Dedicatória .......................................................................................................... i
Agradecimentos ................................................................................................ iii
Lista de Abreviaturas ...................................................................................... ivv
Resumo ............................................................................................................. vi
Abstract ............................................................................................................. viii
Introdução ........................................................................................................... 1
Objectivos ........................................................................................................... 5
Material e Métodos ............................................................................................. 6
Culturas celulares ..................................................................................... 6
Composto e tratamento ............................................................................ 7
Avaliação da viabilidade celular por ensaio de MTS ................................. 8
Ensaio de apoptose por TUNEL ............................................................... 9
Extracção de proteínas e fraccionamento celular ................................... 10
Quantificação de proteínas ..................................................................... 11
Avaliação da expressão proteica por western blotting ........................... 12
Análise estatística ................................................................................... 12
Resultados ........................................................................................................ 13
Ensaio de viabilidade por MTS ............................................................... 13
Ensaio de apoptose por TUNEL ............................................................. 15
Análise da Expressão de Bak por Western Blotting ................................ 17
Discussão ......................................................................................................... 20
Conclusão ......................................................................................................... 25
Referências Bibliográficas ................................................................................ 26
iv
Lista de Abreviaturas
Apaf1- Factor activador das proteases apoptóticas
Bad- “Bcl2 antagonist of cell death”
BAK- “Bcl2-antagonist killer”
Bax- “Bcl2 associated x protein”
BCA- ácido bicinconínico
Bcl2- Células B do linfoma 2
Bcl-B- “bcl2-like 10 protein”
Bid- “Bcl2 interacting domain death agonist”
Bik- “Bcl2 interacting killer-like”
Bim- “Bcl-2 interacting mediator of cell death”
Bmf- factor modificador da apoptose
CO2- Dióxido de carbono
DAPI- 4-Diamino 2-fenilindole
DTT- ditiotreitol
EDTA- Ácido etilenodiaminotetracético
EGTA- Ácido etileno-glicol-tetracético
HEPES- “4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid “
Hrk- “harakiri, Bcl2 interacting protein”
IFN-γ- Interferão gama
IL-12- Interleucina 12
KCl- Cloreto de Potássio
Mcl-1- “Myeloid cell leukemia sequence 1 protein”
v
MEM- “Minimal essential medium”
MgCl2- Cloreto de Magnésio
MTS- sal de tetrazólio “(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-
2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)”
MTT- sal de tetrazólio “3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide”
NGFR- “nerve growth factor receptor”
NK- “natural killer”
PES- Fenazina etosulfato
PI Cocktail- “Protease Inibitor Cocktail”
Puma- “p53-upregulated modulator of apoptosis”
SDS- “Sodium Dodecyl Sulfate”
TNFS19- “Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 19”
TNFSF21- “Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 21”
TUNEL- “Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling”
UV- Ultra-violeta
XTT- sal de tetrazólio
vi
Resumo
Os cogumelos têm sido usados empiricamente, na medicina tradicional
para o tratamento de várias enfermidades, desde há muitos anos. Das mais de 50
espécies de cogumelos com compostos bioactivos, destaca-se o cogumelo
Maitake pelo seu poder imunomodulador e antitumoral. Este cogumelo edível, tem
proporcionado o isolamento de vários compostos da sua composição, e que têm
sido alvo de vários estudos. Um desses compostos, a fracção-D, mostrou já ser
capaz de diminuir a proliferação celular em tumores, quer pela estimulação do
sistema imunitário como pela sensibilização a agentes imunoterapêuticos.
Com este estudo pretendeu-se analisar o efeito da fracção-D, isolada,
directamente sobre células de carcinoma mamário humano, MCF7, verificando o
seu efeito sobre a viabilidade e apoptose. Pretendeu-se ainda relacionar esse
efeito nas células tumorais com a expressão de uma proteína pró-apoptótica Bak.
As células MCF7 foram tratadas com concentrações crescentes de extracto
de Maitake (fracção D) : 0 μg/mL; 18 μg/mL; 36 μg/mL; 91 μg/mL; 183 μg/mL; 367
μg/mL durante 24 horas. Foi realizado o ensaio de MTS para determinar a
viabilidade e o ensaio de TUNEL para avaliar a apoptose. A expressão proteica
de Bak foi analisada por Western Blotting.
Verificou-se que o extracto de Maitake é capaz de diminuir a viabilidade
celular, sendo essa diminuição estatisticamente significativa para a concentração
de 367 μg/mL. Verificou-se ainda uma indução da apoptose estatisticamente
significativa mesmo a baixas concentrações, sendo essa apoptose praticamente
total nas concentrações mais elevadas. Não foi possível, no entanto, explicar o
vii
aumento de apoptose com o aumento da expressão de Bak, sendo necessários
mais estudos para confirmar essa relação.
Estes resultados apontam mais uma vez para a presença de propriedades
anti-tumorais em compostos de origem alimentar.
Palavras-Chave
Cogumelos; Maitake; Fracção D; apoptose; Bak; viabilidade; células cancro da
mama
viii
Abstract
Mushrooms have been used empirically in traditional medicine for the
treatment of several diseases for many years. Among more than 50 species of
mushrooms with bioactive compounds, highlights the mushroom Maitake with its
immunomodulatory and antitumoral power. This edible mushroom has provided
the isolation of several compounds, which have been the target of several studies.
One of these compounds, fraction-D, had already showed to be able to reduce cell
proliferation in tumors, both by stimulating the immune system or by increasing
awareness of immunotherapeutic agents.
This study sought to analyze the effect of isolated D-fraction, directly on
human breast carcinoma cells’ (MCF7) viability and apoptosis. Secondly, it is also
aimed at examining whether fraction-D modulates the expression of a pro-
apoptotic protein -BAK.
The MCF7 cells were treated with increasing concentrations of the extract
of Maitake (fraction D): 0 mg / mL, 18 mg / mL, 36 mg / mL, 91 mg / mL, 183 mg /
mL, 367 mg / mL for 24 hours. MTS assay was performed to determine cell
viability and TUNEL assay to assess apoptosis. The expression of Bak protein
was analyzed by Western Blotting.
MCF7 incubation with the Maitake extract resulted in a decrease in cell
viability, with a statistically significant reduction at the concentration of 367 μg/mL.
There was also a statistically significant induction of apoptosis at low
concentrations, whereas practically every cell developed apoptosis at higher
concentrations. This study was, however, unable to explain the increase in
ix
apoptosis with increasing expression of Bak. More studies are needed to confirm
this association.
These results point once more to the presence of anti-tumor properties of
compounds in food sources.
Keywords
Mushrooms; maitake; D-fraction; apoptosis; Bak; viability; breast cancer cells;
1
1-Introdução
Os cogumelos têm sido usados na medicina tradicional em alguns países
asiáticos, como a China e a Índia, para o tratamento de várias enfermidades.(1-3)
Existem centenas de espécies diferentes e mais de 700 têm sido descritas como
tendo propriedades farmacológicas.(2) Mais de 50 espécies de cogumelos contém
compostos bioactivos que exibem actividade anti-tumoral in vitro e in vivo, em
modelos animais. Alguns desses compostos têm sido investigados também em
neoplasias humanas.(4) Os grandes esforços dos últimos anos têm passado por
conseguir isolar e purificar esses componentes activos, a maioria dos quais
compostos polissacarídicos ou β-glicanos.(5)
Uma das espécies de cogumelos edíveis que têm sido estudado pelo seu
efeito anti-tumoral é Grifola Frondosa, vulgarmente denominada por Maitake. (6-8)
Cogumelo este, também estudado por outras propriedades benéficas para a
saúde como pelo seu efeito regulador da glicemia, anti-aterosclerótico e
antihipertensivo.(9-13)
De entre os vários extractos já isolados no Maitake, a fracção-D, um
composto polissacarídico de ligação proteica, demonstrou ser o mais potente a
estimular o sistema imunitário via administração oral e injecção, levando a uma
maior redução na proliferação tumoral,(14) e consequentemente no volume
tumoral.(15-17) Estudos com este extracto de Maitake têm demostrado o seu grande
poder imunomodulador. Ele é capaz de aumentar a resposta das células Natural
Killer (NK) (17-19), dos macrófagos, a actividade citotóxica das células T, a resposta
antigénio-anticorpo e ainda mostrou capacidade de activar o sistema do
complemento.(7, 14) A própria apresentação antigénica parece ser modulada por
2
este extracto. O extracto de Maitake mostrou ainda capacidade de aumentar a
produção de interferão-gama (INF-γ) e IL-12 pelos macrófagos.(7, 8, 14)
Apesar deste composto, fracção D, já ter sido estudado pelos seus efeitos
imunomoduladores e anti-inflamatórios, pouco se sabe acerca da sua capacidade
anti-tumoral directamente sobre as células tumorais. Já foi estudado também em
conjunto com agentes imunoterapêuticos, em células de cancro da próstata,
apresentando uma redução significativa na proliferação celular. Esta acção
sinérgica mostrou ser mais efectiva que a acção isolada deste composto na
proliferação celular, ainda pouco estudada.(20)
De todos os cancros com possível interesse para este estudo, destaca-se o
cancro da mama. Sendo o cancro mais frequente entre as mulheres (23% de
todos casos de cancro) é também o segundo mais frequente no total da
população, logo após o cancro do pulmão. Só em 2002 o número estimado de
novos casos foi de 1,15 milhões a nível mundial.(21) Mais de metade dos novos
casos ocorrem em países industrializados, onde, à excepção do Japão, as taxas
de incidência são elevadas. Apesar da incidência ter vindo a aumentar a taxa de
mortalidade deste cancro diminuiu de 36% (22) em 2000 para 27% em 2002. (21)
Esta diminuição é atribuída à evolução das técnicas de diagnóstico precoce,
assim como ao facto da população em geral se encontrar mais alerta para esta
patologia. No entanto, a morbilidade e mortalidade associada a esta neoplasia é
ainda demasiado elevada, tornando-se urgente e fundamental continuar a estudar
este tipo de cancro, para poder contribuir para uma redução ainda maior da sua
mortalidade.
Estudos preliminares do nosso grupo, utilizando ensaios de microarrays,
demonstraram que o polissacarídeo do Maitake (fraccção D) induzia a expressão
3
de mais 4321 genes nas células MCF7. Estes genes estavam relacionados com
apoptose, sistema imunitário, transcrição genética, ciclo celular e regulação
negativa da progressão deste. Dos genes encontrados, 29 estavam relacionados
com a apoptose, embora desses apenas 4 tivessem um aumento da expressão
estatisticamente significativo (p<0,05 vs controlo). Foram eles os “BCL2-
antagonist/killer 1 (BAK); um receptor da família de receptores do Factor de
Crescimento Neuronal (NGFR); e dois receptores da Superfamília do Factor de
Necrose Tumoral, nomeadamente o membro 19 (TNFSF9) e o membro 21
(TNFSF21).
Neste estudo, o interesse foi focado na proteína BAK, cujo gene mostrou
um aumento de expressão de até 30x após tratamento. Esta proteína pertence à
superfamília das proteínas Bcl-2, responsáveis por determinar quando uma célula
entra ou não em apoptose (morte celular programada). A apoptose é um processo
indispensável para remover células danificadas ou não necessárias para o
desenvolvimento e manutenção da homeostasia tecidual.(23) Um desarranjo da
maquinaria que controla este processo pode levar à patogénese de várias
doenças, incluindo cancro.(24)
Existem duas vias de condução à apoptose: a extrínseca, mediada por
receptores de superfície celular e a intrínseca ou mitocondrial, mediada pelas
proteínas Bcl-2. (25, 26)
A superfamília das proteínas Bcl-2 divide-se em três grupos; as pró-
sobreviventes ou anti-apoptóticas, entre elas Bcl-2;Bcl-xl; Bcl-W; Mcl-1, A1 e Bcl-
B; as pró-apoptóticas onde se incluem as proteínas BAK e BAX e as proteínas
iniciadoras, também conhecidas como “BH3 only-proteins”. Algumas destas
últimas, já estão bem caracterizadas como Bad, Bik, Bid, Hrk, Bim, Noxa, Puma e
4
Bmf e como o próprio nome indica têm um papel determinante na iniciação do
processo de apoptose. (27, 28)
A proteína BAK é uma proteína que se localiza na membrana externa da
mitocôndria e quando activada sofre homo-oligomerização que vai provocar uma
destabilização da membrana mitocondrial.(29, 30) Dessa alteração membranar
resulta a abertura de poros que vão libertar o citocromo c para o citoplasma, este
por sua vez vai ligar-se a uma proteína, a Apaf1, responsável pela activação das
caspases, proteínas proteolíticas que conduzem à apoptose.(26) É assim uma
proteína de elevada relevância no processo apoptótico cuja indução pode
contrariar o escape à apoptose provocado por aumento da expressão das
proteínas da Bcl-2 pró-sobreviventes. Essa expressão proteica aumentada é
frequentemente encontrada em muitos tipos de tumores humanos.(31)
5
2-Objectivos
O objectivo deste estudo é determinar a influência de um polissacarídeo
(fracção D), extraído do cogumelo Maitake, na viabilidade, proliferação e apoptose
de células de cancro de mama após 24 horas de tratamento. A identificação dos
efeitos deste composto em células de carcinoma mamário é um ponto de partida
para a recomendação da sua utilização como suplemento alimentar e a
determinação da dose a partir do qual a sua aplicação é efectiva. Com este
estudo pretende-se também verificar a possível relação entre a acção deste
composto e a expressão da proteína pró-apoptótica BAK, encontrando uma
possível explicação para o seu mecanismo de acção.
6
3-Materiais e Métodos
3.1-Culturas celulares
As células MCF-7 de carcinoma mamário humano foram obtidas da
American Type Culture Collection (ATCC, Barcelona, Spain) e usadas entre as
passagens 29 e 40. Foram cultivadas em placas de poliestireno com meio Eagle's
Minimum Essential Medium (MEM, Sigma, St Louis, Mo, USA) ao qual foi
adicionado 10% de Soro Bovino Fetal e 1% de antibiótico/antimitótico
penicilina/estreptomicina também adquiridos à Sigma.
Foram mantidas a 37ºC sob uma atmosfera húmida com 5% CO2 . O meio
foi trocado a cada 2-3 dias e as subculturas realizadas sempre que as células se
apresentavam com uma confluência superior a 80%.
7
3.2-Composto e Tratamento
O extracto de maitake foi cedido pela Doutora Gabriela Balogh (CONICET,
Buenos Aires, Argentina), tendo sido preparado por um processo standardizado
desenvolvido por Maitake Products, Inc. (Ridgefield, New Jersey).
Todos os tratamentos foram realizados durante 24 horas, testando
diferentes quantidades do composto, dissolvido no meio de cultura das MCF7
atrás descrito, de forma a obter as seguintes concentrações: 0 μg/mL; 18 μg/mL;
36 μg/mL; 91 μg/mL; 183 μg/mL; 367 μg/mL. Para a extracção proteica usaram-se
15 ml de meio com o extracto de Maitake dissolvido, nas diferentes
concentrações, em cada uma das placas de 10 cm Ø. Para o ensaio de
viabilidade usaram-se placas de 96 poços com 100 μL das dissoluções e para o
ensaio de TUNEL usaram-se placas de 24 poços com dissoluções de 500 μL
cada.
8
3.3-Avaliação da viabilidade celular por ensaio de MTS
Foi feito split às células, de acordo com o estabelecido nas subculturas
celulares. As células foram semeadas em placas de 96 poços de poliestereno,
aproximadamente 1x105 células por poço e colocadas na estufa a 37ºC numa
atmosfera húmida e com 5% CO2. Os tratamentos com as diferentes
concentrações do extracto foram realizados no dia seguinte, e durante 24 horas.
Posteriormente, determinou-se a viabilidade das MCF7 pelo ensaio de MTS
(CellTiter 96TM Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Promega, Madison, WI).
Para tal, adicionaram-se 20 μL da solução de “CellTiter 96 AQueous ONE
Solution Reagent” directamente a cada um dos poços contendo as culturas e
ainda a três poços com 100μL meio, sem células (controlo negativo). De seguida
incubou-se durante três horas com uma solução contendo um composto de
tetrazólio, MTS, [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil) -2-(4sulfofenil)-
2H-tetrazólio] e um reagente de junção de electrões, PES (fenazina etosulfato).
A leitura foi realizada no leitor de microplacas (Multiscan Ascent thermo
electron Corporation) a 490 nm.
Este método permite identificar o número de células viáveis através da
bioredução, pelas células, do composto de tetrazólio, MTS, num produto
formazólico colorido que é solúvel em meio de cultura e que tem absorvãncia
máxima a 490 nm. Este ensaio de MTS vem aperfeiçoar outros também com
compostos de tetrazólio como MTT e XTT, traduzindo-se numa maior simplicidade
na metodologia e rapidez de resultados. (32) Este ensaio já foi usado por outros
autores para o estudo da viabilidade em células de cancro da mama.(33)
9
3.4-Ensaio de apoptose por TUNEL
As células foram semeadas em placas de 24 poços sobre lamelas
(previamente lavadas em etanol a 70% e deixadas 15 minutos sobre os raios UV).
Esta subcultura foi feita de forma a obter aproximadamente 4x104 células/mL e
deixou-se crescer na estufa a 37ºC com atmosfera húmida e 5%CO2.
No dia seguinte, aspirou-se o meio e acrescentaram-se os tratamentos nas
diferentes concentrações, aos quais as células estiveram sujeitas durante 24
horas. A marcação in situ da fragmentação do genoma, usando o ensaio de
TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling)
usando o kit de detecção de morte celular in situ (Roche Diagnostics, Basel,
Switzerland), de acordo com as instruções do fabricante, e tal como foi descrito
em estudos anteriores do grupo.(34-36) Os núcleos foram corados com diamidino-2-
fenilindole (DAPI) (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) como contraste. A
percentagem de células coradas pela enzima de TUNEL foi calculada em relação
ao número total de núcleos, corados com DAPI, sob visualização do microscópio
de fluorescência (Olympus, BH-2, UK). Foram contados 25 campos com a
ampliação de 200x. As experiências foram feitas em triplicado e repetidas duas
vezes.
Este ensaio consegue identificar as zonas de DNA fragmentado, resultante
da apoptose, pela adição de nucleotídeos marcados com fluorescência às
extremidades clivadas. Esta reacção é catalisada pela enzima de TUNEL.(37)
10
3.5-Extracção de proteínas e fraccionamento celular
As proteínas foram extraídas após 24 horas de tratamento com o extracto
de Maitake, de acordo com o protocolo de fraccionamento celular da Abcam®
cedido pelo Tufts-New England Medical Centre e Molecular Cardiology Research
Centre (Boston, MA, USA).(38)
A solução de fraccionamento subcelular usada foi obtida a partir de uma
mistura com a seguinte constituição: sacarose 250 mM, HEPES 20 mM (pH7.4),
KCl 10 mM; MgCl2; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM. Na altura de usar foi adicionado, a
10 mL deste tampão, 10μL de DTT e 50 μL de PI Cocktail.
As células foram lisadas com 500μL da solução final de fraccionamento
celular e colocadas em tubos eppendorf de 1,5mL. Após várias passagem por
uma seringa de 1mL (26G), o lisado celular foi mantido durante 20 minutos em
gelo, e centrifugado durante 5 minutos a 3000rpm para separação do pellet
nuclear. O sobrenadante foi removido e centrifugado novamente, a 8000rpm
durante 10 minutos. Desta operação obteve-se a fracção citoplasmática,
correspondente ao sobrenadante, e a fracção mitocondrial correspondente ao
pellet. Cada pellet, nucleares e mitocondriais, foram lavadas com 500μL de
solução de fraccionamento e passados por uma seringa de 1 mL (26G) 10 vezes.
Após 10 minutos de centrifugação a 3000 rpm a solução foi rejeitada e
ressuspenderam-se novamente as pellets em solução de fraccionamento
acrescentada com 10% glicerol e 1% SDS.
O fraccionamento celular permitiu a realização de western blotting para as
diferentes fracções.
11
3.6-Quantificação de proteínas
As proteínas foram quantificadas recorrendo ao kit de ensaio de proteína
BCA (Pierce Biotecnology, Rockford, USA) e incubando 30 minutos a 37ºC, de
acordo com as instruções do fabricante. Este método colorimétrico baseia-se na
detecção e quantificação de proteínas totais através da bem conhecida redução
de Cu2+ a Cu1+ pelas proteínas em meio alcalino (reacção de biureto). A detecção
do Cu1+ é feita com a adição do ácido bicinconínico (BCA). Esta adição forma um
complexo que exibe uma forte absorvãncia a 562 nm e que foi medida no leitor de
microplacas (Multiscan Ascent thermo electron Corporation).
12
3.7- Avaliação da expressão proteica por Western Blotting
A iguais quantidades de proteínas (20μg, correspondente a uma amostra
entre 8 a 10μl) foram adicionados 3,75 μl de loading buffer (LB), 0,75 de ditiotreitol
(DTT) e água destilada até perfazer um volume total de 15 μl. A mistura foi
aquecida a 95-100ºC durante 90 segundos e sujeita a electroforese em gel de
acrilamida a 15%.
De seguida, foi feita a transferência para uma membrana de nitrocelulose
“Hybond” (Amersham Biosciences, Arlington, USA) usando um mini transfer
(Amersham Biosciences, Arlington, USA). A imunodetecção foi feita com os
anticorpos para Bak e β−Actina e os respectivos anticorpos secundários (Santa
Cruz Biotechnology, inc, CA, USA) usando quimioluminiscência (kit ECL,
Amersham Biosciences, USA). A intensidade de cada uma das bandas foi
quantificada com recurso a um software específico (Launch UVP Framework) e
normalizadas com a β−Actina.
3.8- Análise estatística
A análise estatística e as representações gráficas foram efectuadas com
recurso ao software Graph Pad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, CA, USA).
Para analisar as diferenças estatísticas foi usado o teste t de student e foram
consideradas diferenças estatisticamente significativas sempre que p<0,05 vs
controlo.
13
4-Resultados
4.1-Ensaio de viabilidade por MTS
Fig.1- Imagem representativa das culturas celulares, após 24h de tratamento com
diferentes concentrações de Maitake (C0=controlo; C1=18 μg/mL; C2=36 μg/mL; C3=91 μg/mL;
C4=183 μg/mL; C5=367 μg/mL) e três horas de incubação com a solução de MTS.
O ensaio de MTS mostrou uma diminuição gradual da cor obtida, como é
visível na figura 1. Os valores de leitura de absorvância confirmam essas
reduções (figura 2). As reduções parecem ser mais marcadas com o aumento da
concentração do tratamento. Para a concentração de 18 μg/mL o valor médio de
viabilidade foi de 99% + 17; com 36 μg/mL foi de 92% + 34; com 91 μg/mL foi de
71% + 35,3%; com 183 μg/mL foi 45% + 47 e com 367 μg/mL foi 39% + 17. Os
resultados foram considerados estatisticamente significativos sempre que p < 0,05
vs controlo.
C5 C4 C3 C2 C1 C0
14
contro
l
18,3
μg/m
l
36μ
g/ml
91μ
g/ml
183μ
g/ml
367
μg/m
l0
25
50
75
100
*
Concentração do extracto de Maitake
Via
bili
dad
e ce
lula
r%
co
ntr
olo
Fig- 2- Representação gráfica da viabilidade das células MCF7, após tratamento de
24horas com as concentrações referidas. Resultados apresentados em percentagem do controlo
(média + SEM; n=12), (*p<0,05 vs controlo).
15
4.2- Ensaio de apoptose por TUNEL
contro
lo
18μg
/ml
36μ
g/ml
91μ
g/ml
183μ
g/ml
367
μg/m
l0
25
50
75
100 ****
*
***
Concentração do extracto de maitake
% a
po
pto
se
Fig3- Análise da apoptose em células MCF7 através do ensaio de TUNEL e após
tratamento de 24horas com extracto de Maitake nas concentrações mencionadas. Resultados
estão expressos em percentagem (média +SEM) de células coradas com a enzima de TUNEL
relativamente ao total de células (núcleos corados com DAPI), (*p < 0,05 e **p < 0,01 vs controlo).
Fig 4- Imagem representativa da apoptose em células MCF7, sem qualquer tratamento (A)
e após 24 horas de tratamento com extracto de Maitake (367 μg/ml), visível após ensaio de
TUNEL (B).
16
É visível um aumento significativo da apoptose nas células tratadas com o
extracto de Maitake (figura 4), sendo este efeito dependente da dose.
Os valores de percentagem de apoptose verificados após o ensaio são de
2,5 ± 1,3 para o controlo; 29,0 ± 5,2 para a concentração de 18 μg/mL; 26,7 ± 5,2
para 36 μg/mL; 63,7 ± 9,8 para a concentração de 91 μg/mL; 94,7 ± 0,3 para a
concentração de 183 μg/mL e 96 ± 0,5 para a concentração de 367 μg/mL
(figura3).
De realçar que, com o tratamento à concentração mais eleva, 367 μg/mL, a
apoptose é praticamente total (>95%) e que mesmo com a concentração anterior
de 183 μg/mL esse valor se aproxima muito da apoptose total.
17
4.3 Análise da expressão de Bak por Western Blotting
Na fracção citoplasmática não foi detectada a presença de Bak.
Na fracção nuclear não houve alterações significativas em relação à
expressão de Bak como pode ser visualizado na figura 5.
β-actina
Figura 5-Imagem representativa da expressão proteica de dímeros de Bak na fracção
nuclear, em células MCF7 e após tratamento de 24 horas com Maitake nas seguintes
concentrações: C0=controlo; C1=18 μg/mL; C2=36 μg/mL; C3=91 μg/mL; C4=183 μg/mL; C5=367
μg/mL.
Os valores de expressão de Bak obtidos, na fracção nuclear, após
quantificação utilizando o programa “Launch UVP Framework”, estão
representados no gráfico da figura 6. Os valores médios obtidos foram os
seguintes, 0,40 ± 0,08 para o controlo; 0,40 ± 08 para concentração de 18 μg/mL;
0,40 ± 0,14 para concentração de 36 μg/mL; 0,43 ± 0,12 para concentração de 91
μg/mL; 0,43 ± 0,18 para concentração de 183 μg/mL; 0,47 ± 0,18 para
concentração de 386 μg/mL.
C0 C1 C2 C3 C4 C5
C0 C1 C2 C3 C4 C5
Bak
18
Fracção nuclear
Control
g/ml
μμμμ18
g/m
l
μμμμ36
g/m
l
μμμμ91
g/m
l
μμμμ
183
g/ml
μμμμ
367
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Concentração do extracto de Maitake
Exp
ress
ão d
e B
ak
Fig.6- Quantificação da expressão de Bak na fracção nuclear de células MCF7,
determinada por Western Blotting, após 24 horas de tratamento com o extracto de Maitake, nas
concentrações referidas. Resultados expressos em média+SEM.
Na fracção mitocondrial também não foi detectada expressão proteica para
o peso molecular de 30Kb correspondente ao peso molecular da proteína Bak, foi
então quantificada a banda correspondente ao dobro do peso molecular, que
apareceu sempre com uma expressão muito forte, podendo tratar-se de dímeros
da proteína, uma vez que esta sofre homo-oligomerização (27). (figura 7)
Os valores obtidos, na fracção mitocondrial, após quantificação pelo
“Launch UVP Framework”, estão representados na figura 8. Não se verificaram
variações significativas, embora pareça haver uma ligeira diminuição da
expressão proteica com o aumento da concentração dos tratamentos. Os valores
médios obtidos foram os seguintes, 1,13 ± 0,14 para o controlo; 1,03 ± 0,06 para
concentração de 18 μg/mL; 1,04 ± 0,04 para concentração de 36 μg/mL; 1,01 ±
19
Bak
C0 C1 C2 C3 C4 C5
C C�
�
� �
�
� �
β�
�
����
� � �� �� �� ��� ���
� � � �� �� ��
C3 C4
0,07 para concentração de 91 μg/mL; 0,86 ± 0,07 para concentração de 183
μg/mL; 0,84 + 0,14 para concentração de 386 μg/mL.
Fig. 7-Imagem representativa da expressão proteica de dímeros de Bak na fracção
mitocondrial, em células MCF7 e após tratamento de 24 horas com Maitake nas seguintes
concentrações: C0=controlo; C1=18 μg/mL; C2=36 μg/mL; C3=91 μg/mL; C4=183 μg/mL; C5=367
μg/mL.
Fig.8- Quantificação da expressão de Bak na fracção mitocondrial, em células de MCF7,
após 24 horas de tratamento com o extracto de Maitake, nas concentrações referidas. Resultados
expressos em média ± SEM.
Fracção mitocondrial
Control
g/ml
μμμμ
18,3
g/m
l
μμμμ36
g/m
l
μμμμ91
g/m
l
μμμμ
183
g/ml
μμμμ
367
0.0
0.5
1.0
1.5
Concentração do extracto de Maitake
Exp
ress
ão d
e B
ak
C5C2 C1 C0
β-actina
20
5-Discussão
A proliferação constante das células tumorais é devida em parte à
alteração dos mecanismos apoptóticos e fuga à morte celular programada,
tornando estas células praticamente imortais. Conseguir, selectivamente, alterar
esses mecanismos, tem sido uma das grandes apostas da investigação em
cancro da mama. Com este estudo encontrámos um composto que tem
capacidade para alterar esses mecanismos.
O desenvolvimento da cor no ensaio de MTS, (visível na figura 1) é
proporcional ao número de células viáveis, ao tempo de incubação com o MTS e
à temperatura de incubação (39). Neste estudo, tanto o tempo como a temperatura
de incubação foram facilmente controláveis, sendo o resultado obtido devido ao
número de células viáveis. Uma redução neste número, relativamente ao controlo,
pode significar uma diminuição da proliferação celular ou uma diminuição da
viabilidade celular ou aumento de apoptose (32). A falta de significância estatística
pode dever-se à grande variabilidade do método entre cada ensaio. No entanto, a
diminuição da viabilidade em cada ensaio, é visível a olho nu (figura1).
Os resultados de viabilidade foram concordantes com os resultados de
apoptose obtidos pela técnica TUNEL. Foi notável o aumento de apoptose com o
aumento das concentrações de Maitake. Se se analisarem as diferentes
concentrações usadas e os resultados obtidos em cada um dos métodos vemos
as células tratadas com concentrações a partir dos 91 μg/ml já sofrem alterações
marcadas. No entanto, essa alteração é indubitável em ambos os ensaios para a
concentração de 367 μg/mL. Outros estudos usando a fracção-D de Maitake
viram que o seu efeito na proliferação celular até à dosagem de 250 μg/mL era
21
considerado marginal, tornando-se essa dosagem efectiva a concentrações de
500 μg/mL e 1000 μg/mL.(20).
Estudos prévios demonstraram que a fracção D do Maitake apresenta
capacidade de aumentar a sensibilização a vários fármacos, não só no tratamento
de cancro, como no tratamento de infecções bacterianas como a Listeriose,(40)
mostrando também alguma capacidade antiviral.(41) Esta fracção D foi já purificada
dando origem a uma fracção MD, a qual tem sido também alvo de vários estudos.
Esta fracção foi estudada também pelo seu efeito estimulador do sistema
imunitário,(42, 43) e também como coadjuvante de drogas anti-tumorais,(8)
diminuindo inclusive os seus efeitos secundários ao nível da mielotoxicidade e
nefrotoxicidade,(44) Na verdade, a maioria dos estudos com este extracto de
maitake, (fracção-D), refere que o seu efeito anti-tumoral se deve à activação do
sistema imunitário.(16-19, 41, 45-48) Essa activação é de facto visível em vários
estudos. No entanto, com este trabalho podemos verificar que o maitake também
apresenta capacidade de provocar diminuição da viabilidade das células de
carcinoma mamário e aumento da apoptose das mesmas. Estes efeitos são
atribuídos a mecanismos independentes, alheios à activação do sistema
imunitário e ao sinergismo com fármacos.
Após confirmada a sua acção como agente único nas células MCF7
isoladas, tentou compreender-se um pouco melhor o mecanismo adjacente a este
efeito pró-apoptótico. Tendo em conta os ensaios de microarray previamente
realizados pelo nosso grupo, foi colocada a hipótese que este efeito seria devido
a um aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bak.
No presente trabalho foi analisada a expressão desta proteína nas
diferentes fracções celulares: citoplasma, núcleo e mitocôndria. A fracção onde se
22
esperaria expressão significativamente aumentada seria a mitocondrial. A
expressão nuclear de Bak não foi alterada nas células tratadas com as diferentes
concentrações do composto relativamente ao controlo. No entanto, na fracção
mitocondrial, onde deveria aparecer o aumento da expressão de Bak relacionada
com a via intrínseca da apoptose, não foram visíveis nenhumas bandas para o
peso molecular do Bak isolado. Estes resultados poderiam ser devidos a uma
desnaturação proteica insuficiente, o que impediria a quebra de ligações entre os
dímeros ou oligómeros que se formam entre proteínas de Bak, necessários à sua
activação.(30) Porém, o concomitante aumento da expressão dos dímeros com o
aumento das concentrações de tratamento e da apoptose não foi encontrado.
Apesar de estar reportado que a ausência de Bak ou Bax isolados têm pequeno
efeito na indução de apoptose na maioria das células,(49) estes resultados não são
concordantes com os estudos preliminares com microarrays que verificaram
aumento da expressão genética de Bak após tratamento de 24horas com a
fracção-D do Maitake. Outra possibilidade para a discrepância destes resultados é
o próprio método de extracção e fraccionamento celular não ser o mais indicado
para este estudo, uma vez que se tratou de uma técnica ainda pouco explorada, e
cuja reprodutibilidade levanta algumas dúvidas.
Analisando os resultados obtidos neste estudo, há algumas questões que é
imperativo colocar. Uma das principais questões a discutir, sendo este composto
oriundo de um cogumelo comestível, seria a possibilidade de se atingirem com a
ingestão as quantidades de fracção-D necessárias para estes terem efeitos
fisiológicos no nosso organismo. De acordo com o descrito por Kodama et al,
2001,(40) sabemos que com 300g da parte reprodutiva do cogumelo seca e em
pó, é possível preparar 600mg de Fracção D de Maitake. Claro que é necessário
23
ter em conta que grande parte da composição do cogumelo é água, e que ao
desidratar o seu peso diminui imenso. Alguns produtores de Maitake dizem que a
dose necessária para ter efeito no organismo será de 0,5 a 1 mg/Kg peso
corporal(8). Apesar de não ser possível transpor linearmente para os humanos,
está descrito que em estudos com ratinhos 0,75mg/Kg peso de fracção D é
suficiente para exercer a sua actividade anti-tumoral e imunopotenciadora.(7)
Partindo destes valores poder-se-ia estimar que para um adulto de 70 Kg seriam
necessários cerca de 53mg de extracto. É fácil prever que é possível a ingestão
deste cogumelo em quantidades com efeitos significativos no organismo.
Estes valores reportam-nos para outra questão, a possível toxicidade. Não
foram reportados casos de toxicidade no estudo clínico de Deng et al, 2009 (50),
nem em estudos prévios em ratinhos de dietas contendo 2% de extracto de
cogumelo(5). No entanto, ainda são necessários mais estudos.
Além de verificarmos a sua eficácia no tratamento poderemos pensar
também na sua eficácia como prevenção do cancro da mama. O primeiro dado
que nos alerta para esse facto é a menor incidência de cancro da mama em
países onde este consumo é maior, como a China e o Japão(21). Alguns estudos
epidemiológicos têm também mostrado uma associação inversa entre o consumo
de cogumelos e o risco de cancro da mama (51).
Continua a haver uma falta de estudos clínicos sistemáticos que verifiquem
a eficácia e segurança do maitake em humanos. No entanto, com base no
conhecimento popular e na investigação básica que reporta alguns efeitos anti-
tumorais e imunomoduladores, entre outros, ele continua a ser comercializado(52).
Houve apenas um estudo clínico piloto com extracto de Maitake, aprovado em
1998 pela FDA (Food and Drug Association) e cujos resultados foram publicados
24
recentemente(50). Apesar de se terem verificado várias alterações imunológicas
após ingestão oral de Maitake, estas foram tão complexas que não é prudente
afirmar o seu efeito como sendo benéfico ou maléfico. O futuro da investigação
neste ponto, deverá passar por continuar a estudar isoladamente os compostos
deste cogumelo e assim garantir o conhecimento exacto dos efeitos de
determinado composto. Neste caso, o estudo da fracção-D, para que ela possa vir
a ser usada e recomendada pela FDA como suplemento e ou terapêutica no
tratamento ou prevenção de carcinomas mamários.
25
6-Conclusão
Com este estudo foi possível verificar que a fracção D do Maitake é capaz
de diminuir significativamente a viabilidade de células de carcinoma mamário e
aumentar muito significativamente a sua apoptose. Este efeito aumenta com o
aumento da concentração sendo um efeito dependente da dose. Não foi possível
ainda comprovar o mecanismo pelo qual o Maitake exerce a sua acção pró-
apoptótica, no entanto esta acção é indubitável.
Estes resultados vêm confirmar a presença de propriedades anti-tumorais
em compostos de origem alimentar. Apontam também a necessidade de mais
estudos, de forma a poder compreender melhor o mecanismo de acção deste
composto para que o seu uso como suplemento alimentar possa vir a ser
efectuado de forma racional.
26
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