Embed Size (px)
Citation preview
1
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MARISA JÁDNA SILVA FREDERICO
EFEITO TERAPÊUTICO DO INIBIDOR DA PROTEÍNA
1C LIGADORA DO ELEMENTO REGULATÓRIO DE
ESTEROL (SREBP-1C) EM CAMUNDONGOS OBESOS
COM ESTEATOSE HEPÁTICA.
CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
MARISA JÁDNA SILVA FREDERICO
EFEITO TERAPÊUTICO DO INIBIDOR DA PROTEÍNA
1C LIGADORA DO ELEMENTO REGULATÓRIO DE
ESTEROL (SREBP-1C) EM CAMUNDONGOS OBESOS
COM ESTEATOSE HEPÁTICA.
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós Graduação em Ciências da
Saúde para a obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde.
Orientador: Professor Doutor Cláudio
Teodoro de Souza.
CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010
3
Dedico esta dissertação aos meus pais,
Paulo e Jádna pelo apoio,
compreensão e dedicação durante esta
etapa de minha vida a fim de realizar
um de meus maiores objetivos.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus;
Aos meus pais os quais são a minha maior riqueza;
Ao Prof. Dr. Claudio Teodoro de Souza, pela orientação, conhecimento e sabedoria na
orientação deste trabalho;
Ao prof. Dr. Lício Velloso e Dr. Dennys Cintra pela colaboração no desenvolvimento
deste trabalho;
Ao Prof. Dr. João Luciano de Quevedo pela disponibilidade e incentivo nos momentos
difíceis;
A todos os integrantes do grupo LAFIBE, em especial aos colegas Luciano, pela sua
receptividade junto ao grupo de pesquisa, Marcelo, Patrícia e Simone pela parceria e
amizade no andamento dos procedimentos do laboratório.
À Samira, que no ano de 2009 mostrou ser uma grande amiga, estando comigo nos
maus e bons momentos;
Aos Profs. Dra. Gaspar, Dr. Ricardo e Dra. Carina pelos ensinamentos e amizade;
E, à todas as pessoas que participaram de alguma forma deste trabalho.
5
“Somente seres humanos excepcionais e irrepreensíveis suscitam idéias generosas e
ações elevadas”.
Albert Einstein
6
RESUMO
Várias evidências sugerem que acumulo de lipídeos no fígado está relacionado ao mau
hábito alimentar, como a ingestão de uma dieta rica em gordura. Esta elevada deposição
de gordura nos tecidos hepáticos é designada como doença do fígado gorduroso não-
alcoólica (NAFLD) afeta cerca de 20 milhões de pacientes nos Estados Unidos dos
quais 75% são obesos e possuem diabetes. Por outro lado, o fator de transcrição
SREBP-1c desempenha importante função no metabolismo de triglicérides e glicose
hepáticos e sua atividade pode ser fator chave envolvido na esteatose hepática. Esta
proteína induz a transcrição de quase todos os genes que codificam enzimas envolvidas
na síntese de ácidos graxos e na esterificação de ácidos graxos em triglicérides. A
SREBP-1c tem sido implicada no desenvolvimento humano da fisiopatologia das
síndromes metabólica tais como obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia, aterosclerose e
lipodistrofia. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da inibição da
expressão de SREBP-1c, através do uso do oligonucleotídeo antisense, na reversão da
resistência à ação da insulina e esteatose hepática. Para isto camundongos swiss foram
tratados por dois meses com dieta rica em gordura saturada. Após este período
observou-se elevado acúmulo de lipídeos no fígado comprovado por histologia e teste
de lipídeos totais e resistência hepática a insulina comprovada através do imunoblot,
contudo sem o desenvolvimento do diabetes tipo 2. O tratamento com oligonucleotídeo
antisense SREBP-1c atenua fígados gordurosos, mas não obesidade e resistência à
insulina em camundongos obesos induzidos por dieta. Nós observamos que SREBP-1c
desempenha papel crucial na regulação da expressão de genes lipogenicos e no acúmulo
de triglicérides no fígado. Sendo assim a inibição da SREBP-1c é um atraente alvo
terapêutico para o tratamento da NAFLD.
Palavras Chaves: esteatose hepática, lipogenese de novo, SREBP-1c.
7
ABSTRACT
Evidence suggests that accumulation of lipids in the liver is related to poor
eating habits such as high fat diet. This high fat deposition in liver tissue is known as
Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) affects approximately 20 million patients in
the United States of which 75% are obese and have diabetes. Furthermore, the
transcription factor SREBP-1c plays an important role in the metabolism of
triglycerides and hepatic glucose and its activity may be key factor involved in hepatic
steatosis. This protein induces the transcription of almost all the genes that encode
enzymes involved in fatty acid synthesis and esterification of fatty acids in triglycerides.
The SREBP-1c has been implicated in human development of the pathophysiology of
metabolic syndromes such as obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, atherosclerosis and
lipodystrophy. In this sense, the objective was to evaluate the effects of inhibiting the
expression of SREBP-1c, using the antisense oligonucleotide, in reversing the resistance
to insulin and hepatic steatosis. For this swiss mice were treated for two months with a
diet rich in saturated fat. After this period showed high lipid accumulation in liver
histology and confirmed by test lipid and hepatic insulin resistance demonstrated by
immunoblot, but without the development of type 2 diabetes. Treatment with antisense
oligonucleotide attenuates SREBP-1c fatty livers but not obesity and insulin resistance
in obese mice induced by diet. We observed that SREBP-1c plays a crucial role in
regulating the expression of lipogenic genes and the accumulation of triglycerides in the
liver. Thus the inhibition of SREBP-1c is an attractive therapeutic target for the
treatment of NAFLD.
Key Words: hepatic esteatosis, lipogenesis de novo, SREBP-1c
8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACC - acetil-CoA carboxilase
AICAR – ativador de AMPK
Akt - proteína quinase B
ALT - transaminase pirúvica
AMPK - proteína quinase ativada por AMP
AP2-nSREBP-1c - expressão constitutiva da forma ativa de SREBP1c
AST - transaminase oxalacética
ChREBP - proteína ligadora do elemento responsivo ao carboidrato
CPT-1 - carnitina palmitoil transferase
DIO - animais que serão alimentados com dieta hiperlipídica
DTT - Ditiotritol
FAS - ácido-graxo sintase
FASKOL - camundongos/nocaute/FAS específica do fígado
HMGCoA redutase - 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase
INSIG-2 - gene induzido pela insulina
IP - intraperitoneal
IR - receptor de insulina
IRS-1 serina - substrato do receptor de insulina fosforilado em serina
IRS-1 - substrato do receptor de insulina 1
IRS-2 - substrato do receptor de insulina 2
Lepob
/Lepob
– camundongos deficientes de leptina
NAFLD - do inglês non-alcoholic fatty liver disease (doença do fígado gorduroso não
alcoólica)
NASH - do inglês nonalcoholic steatohepatitis (esteato hepatite não alcoólica)
NF-kB - do inglês nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (fator
nuclear kappa B)
pACC - acetil-CoA carboxilase fosforilada
pAkt - proteína quinase B fosforilada
pAMPK - proteína quinase ativada por AMP fosforilada
PEPCK - fosfoenolpiruvatocarboxiquinase
PFK - fosfofrutoquinase
pFoxo1 - Forkhead box O1A fosforilada
9
PI 3K - fosfatidilinositol 3-quinase
pIkBα - do inglês fator inibidor do fator nuclear kappa B fosforilado do inglês nuclear
factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha
pIKK - Quinase ativadora do fator nuclear kappa B fosforilada do ingles: Nuclear
functions for IκB kinase (IKK)
pIR - receptor de insulina fosforilado
pIRS1 - substrato do receptor de insulina 1 fosforilado
pIRS2 - substrato do receptor de insulina 2 fosforilado
pJNK - c-Jun N-terminal kinases fosforilado
PTP1b - proteína tirosina fosfatase 1b
S1P - protease sítio 1
S2P - protease sítio 2
SCAP - proteína ativadora da clivagem de SREBP
SCD-1 - esteril-CoA desaturase 1
SDH - succinato desidrogenase
SDS-PAGE - gel de poliacrilamida
SREBP-1c - proteína 1c ligadora do elemento regulatório de esterol
UCPs: proteínas de desacoplamento
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
2 OBJETIVOS..................................................................................................................2
2.1 Objetivo Geral..........................................................................................................22
2.2 Objetivos Específicos................................................................................................22
3 MANUSCRITO ENVIADO: SHORT-TERM INHIBITION OF SREBP-1C
EXPRESSION REVERSES DIET-INDUCED NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER
DISEASE IN MICE…………………………………………………………………….23
4 DISCUSSÃO................................................................................................................55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................66
11
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Estima-
se que aproximadamente um terço da população dos Estados Unidos são obesas
(Mokdad 2003). Esta doença decorre de um distúrbio multifatorial, porém determinado
pelo padrão alimentar ou ausência de exercício físico ou ambos. Trata-se de um risco
potencial para todas as populações, especialmente nos grandes centros urbanos. A
obesidade está associada a diversas outras doenças tais como: diabetes mellitus tipo 2 e
a doença do fígado gorduroso não-alcoólica, uma das doenças hepáticas que mais
acometem pessoas nos países ocidentais (Clark., 2006 e Marchesini & Babini., 2006).
A resistência à insulina é fator chave na patogênese do diabetes mellitus tipo 2.
A resistência à insulina é uma condição genética ou adquirida, na qual concentrações
fisiológicas de insulina resultam em uma resposta subnormal na captação de glicose
pelas células, especialmente nas musculares e gordurosas e na produção de glicose pelo
fígado. Dessa forma, a hiperglicemia resultante está relacionada à diminuição na
captação de glicose pelos tecidos periféricos e a um aumento na produção hepática de
glicose. Em indivíduos com função da célula beta normal, aumentos na demanda de
insulina devido à resistência periférica ao hormônio são compensados por um aumento
coordenado na secreção de insulina, mantendo assim os níveis de glicose plasmática
dentro da normalidade. Em indivíduos geneticamente predispostos ao diabetes mellitus
tipo 2, a falha da célula beta em compensar o aumento na demanda, resulta em
progressiva elevação dos níveis de glicose e determina o início do quadro clínico da
doença (Donath & Halban, 2004).
Vários autores têm observado grande associação entre resistência à insulina e a
elevada deposição de gordura em tecidos hepático; designada como doença do fígado
12
gorduroso não-alcoólica (NAFLD do inglês non-alcoholic fatty liver disease) (Saloranta
et al., 1993; Rebrin et al., 1995; Lam et al., 2003 e Samuel et al., 2004). NAFLD afeta
cerca de 20 milhões de pacientes nos Estados Unidos dos quais 75% são obesos e
possuem diabetes (Ahmed & Byrne., 2007). O risco de NAFLD é quase 5 vezes mais
elevado em pessoas com índice de massa corporal (IMC) ≥ 30 kg/m2 (Bellentani et al,
2000 ). O espectro de NAFLD pode variar de um simples fígado gorduroso (esteatose
hepática), com prognóstico benigno; para a forma potencialmente progressiva, a
esteatohepatite não-alcoólica (NASH do inglês nonalcoholic steatohepatitis), a qual
pode levar a uma fibrose hepática e cirrose resultando num aumento da morbidade e
mortalidade. Day & James (1998) propuseram um modelo que envolve duas fases na
progressão desta patologia. Na primeira fase é o desenvolvimento da esteatose hepática:
acúmulo de triglicérides nos hepatócitos. Na segunda fase ocorre a transição de NAFLD
para NASH como resultado das ações de moléculas inflamatórias e espécies reativas de
oxigênio. No entanto, a inflamação em si é o principal fator na transição de NAFLD
para NASH (Jansen., 2004).
A possibilidade de lipídeos hepáticos poderem iniciar resistência à insulina foi
primeiro sugerido por Kraegen e colaboradores no ano de 1991. Isto foi mais
recentemente confirmado por Samuel et al (2004) baseados em estudos de ratos
submetidos a dieta rica em gordura. Os lipídios estão amplamente implicados no
desenvolvimento da resistência à insulina por mecanismos que envolvem a competição
por substrato, antagonismo da sinalização da insulina ou lipotoxicidade (Schmitz-
Peiffer., 2000; Cho et al., 2006; Guo., 2008; Riant et al., 2009; Lionetti et al., 2009).
Para o melhor entendimento da resistência à insulina se faz importante o
conhecimento da ação da insulina desde sua ativação molecular até seus efeitos
fisiológicos finais. A insulina é um hormônio polipeptídico anabólico secretado pelas
13
células beta do pâncreas, cuja síntese é ativada primariamente pelo aumento dos níveis
circulantes de glicose e modulada também por aminoácidos, ácidos graxos e estímulos
neurais. Uma vez liberada na corrente sanguínea, este hormônio age em diferentes
tecidos periférico, incluindo fígado, músculo esquelético e tecido adiposo. Seus efeitos
metabólicos imediatos incluem: aumento da captação de glicose, principalmente em
tecido muscular e adiposo, síntese de proteínas, ácidos graxos e glicogênio, bem como
bloqueio da produção hepática de glicose, da proteólise e da lipólise, entre outros
(Saltiel & Kahn, 2001).
A sinalização intracelular da insulina começa com sua ligação a um receptor
específico de membrana, uma proteína heterotetramérica com atividade quinase,
composta por duas subunidades alfa e duas subunidades beta, denominado receptor de
insulina (IR) (Kasuga, 1982; Saltiel & Kahn, 2001). A ativação do IR resulta em
fosforilação em tirosina de diversos substratos, incluindo substrato do receptor de
insulina 1 (IRS-1) e 2 (IRS-2) (White, 1998). A fosforilação das proteínas IRSs cria
sítios de ligação para outra proteína citosólica denominada fosfatidilinositol 3-quinase
(PI 3K), promovendo sua ativação. A PI 3K é importante na regulação da mitogenese,
diferenciação celular e efeitos metabólicos estimulada pela insulina (Saad et al., 1993;
Shepherd e tal., 1995). A PI 3K foi originalmente identificada como um dímero
composto de uma subunidade catalítica (p110) e uma subunidade regulatória (p85). A
fosforilação dos sítios de tirosina das proteínas IRSs ao domínio SH2 da subunidade
p85 da PI 3K ativa o sítio catalítico associado (Myers et al, 1992) A enzima catalisa a
fosforilação dos fosfoinositídeos na posição 3 do anel de inositol produzindo
fosfatidilinositol -3 fosfato, fosfatidilinositol – 3,4 difosfato e fosfatidilinositol -3,4,5
trifosfato. A ativação da PI 3K aumenta a fosforilação em serina da proteína quinase B
(Akt).
14
A proteina quinase B, ou Akt, é uma serina treonina quinase que possui três
isoformas (Akt1, Akt2 e Akt3) todas expressas em tecido muscular e hepático (Datta et
al., 1999). A proteína AKT tem a habilidade de fosforilar e ativar vários alvos
metabólicos. A AKT estimula captação de glicose, síntese de glicogênio e de proteínas.
A AKT possui outras funções não metabólicas, tais como a inibição de apoptose e
degradação protéica em músculo esquelético através da fosforilação e inativação da Bad
e fatores de transcrição como a FoxO, respectivamente (Ogg et al., 1997).
A Foxo1 foi inicialmente identificada em C elegans como um fator de
transcrição ativado pela insulina e que se localiza distalmente a via da PI 3K. Este fator
de transcrição é fosforilado pela Akt em três resíduos de serina e treonina; Thr24
, Ser256
e Ser319
. A fosforilação desses três sítios da Foxo resulta em sua extrusão nuclear e sua
conseqüente inativação (Ogg et al., 1997; Biggs et al., 1999; Brunet et al., 1999; Kops et
al., 1999; Barthel et al., 2001).
A insulina é essencial para a manutenção da homeostasia de lipídeos e
carboidratos. Uma grande fração de glicose absorvida a partir do intestino delgado é
imediatamente captada pelos hepatócitos, e convertida em glicogênio. No entanto,
quando os níveis de glicogênio hepáticos estão saturados (aproximadamente 5% de
massa hepática), qualquer acréscimo de glicose no hepatócito é direcionado para a via
glicolítica e assim fornece carbono para a um processo designado lipogênese; no qual
ocorre a síntese de ácidos graxos a partir de carboidratos e lipídeos, os quais serão
esterificados a triglicérides para ser exportado ao tecido adiposo como lipoproteínas de
muito baixa densidade (VLDLs).
Poucos estudos têm sido desenvolvidos para determinar a contribuição da
lipogênese na evolução da esteatose hepática. Donnelly e colaboradores (2005)
estimaram a contribuição da síntese do conteúdo de gorduras hepáticas em pacientes
15
com NAFLD. O conteúdo de triglicérides contido no fígado destes pacientes, 60%
surgiu a partir de ácidos graxos não esterificados, um pouco mais de 10% da dieta, e
próximo de 30% vieram da lipogênese de novo, ressaltando a importância da síntese de
gordura na patologia de NAFLD.
A lipogênese é a síntese de ácidos graxos no organismo a partir da acetil CoA. A
glicose derivada do metabolismo dos carboidratos da dieta é o substrato básico para a
síntese de ácidos graxos. No fígado, essa síntese também pode ocorrer a partir de
frutose, galactose, aminoácidos, lactato e piruvato. Assim, os ciclos que envolvem esses
substratos estão em dinâmica inter-relação com a lipogênese (Girard et al., 1997). As
principais reações de síntese de ácidos graxos envolvem a acetil-CoA carboxilase
(ACC) e a ácido-graxo sintase (FAS) ocorrem no citoplasma. Elas catalisam a
conversão de acetil CoA a palmitato. Sob as condições que favorecem a síntese de
ácidos graxos, a citrato sintase mitocondrial catalisa a formação de citrato a partir de
acetil-CoA e oxaloacetato. Esse citrato deixa a mitocôndria através da lançadeira de
citrato e é clivado a acetil-CoA e oxaloacetato em uma reação catalisada pela ATP-
citrato-liase. Esse acetil-CoA é substrato para a síntese de ácidos graxos. O outro
substrato, o NADPH, é sintetizado em 2 ciclos no citoplasma. O oxaloacetato oriundo
da clivagem do citrato é reduzido a malato pela NAD-malato desidrogenase do citosol.
Esse malato sofre descarboxilação oxidativa a piruvato e CO2, através da ação da
enzima málica, o que gera NADPH. As duas primeiras enzimas do ciclo da pentose
fosfato, a glicose-6-fosfato desidrogenase e a 6-fosfogliconato-desidrogenase, também
são fontes de NADPH para a síntese de ácidos graxos. (Goodridge, 1987). A própria
glicose, por ser convertida a acetil-CoA através da via glicolítica, estimula a lipogênese
pelo fato de ser um importante substrato para o processo. Além disso, a glicose
plasmática estimula a lipogênese por agir no processo de liberação de insulina. A
16
insulina é, provavelmente, o hormônio mais importante na lipogênese, estimulando-a de
maneira muito eficaz, aumentando a captação de glicose pelas células adiposas — via
recrutamento de transportadores de glicose para a membrana plasmática — bem como
ativando enzimas glicolíticas e lipogênicas (Hillgartner, et al., 1995).
Schwarz e colaboradores (2003) demonstraram que indivíduos obesos
hiperinsulinêmicos alimentados com dieta de alto teor em gordura e baixo em
carboidrato, apresentaram maior lipogênese de novo quando comparados a ambos os
indivíduos magros ou obesos normoinsulinêmicos. Estes resultados mostram que
indivíduos obesos hiperinsulinêmicos recebem energia da dieta com alto teor em
gordura. Existem duas hipóteses para este fenômeno. A primeira é que lipogênese de
novo é o resultado de reduzida recaptação de glicose pelos tecidos extrahepáticos, o que
conduz a aumento de reserva e da disponibilidade glicídicas para o metabolismo
hepático. Além disso, precursores gliconeogenicos, estão aumentados com a resistência
à insulina (Felig et al., 1978; Zawadzki et al., 1988; Reaven et al., 1988), o que pode
fornecer uma fonte adicional de carbono para a síntese hepática de gordura. A segunda
hipótese é de que a hiperinsulinemia leva a um aumento da lipogênese de novo em
indivíduos obesos. Este mecanismo é controlado por um fator de transcrição chamado
SREBP-1c (proteína 1c ligadora do elemento regulatório de esterol) que permanecem
sensíveis à insulina levando a um aumento do RNA mensageiro para importantes
enzimas lipogênicas tais como a Esteril Coa Desaturase (SCD1), enzima málica, ACC, e
FAS. Portanto os níveis aumentados de insulina presentes na resistência à insulina,
exacerbam a ativação de SREBP-1c resultando no aumento da lipogênese.
Ahmed & Byrne (2007) sugerem que SREBP-1c desempenha importante função
no metabolismo de triglicérides e glicose hepáticos e sua atividade pode ser fator chave
envolvido na acumulação de lipídeos em esteatose hepática. SREBPs são também
17
importantes fatores de transcrição que regulam a homeostase do colesterol no
hepatócito. A superexpressão de SREBP-1c no fígado de camundongos transgênicos
leva a um aumento marcante da lipogênese de novo e desenvolvimento de fígado
gorduroso (Shimomura et al., 1999).
SREBP-1c pertence a uma família de fatores de transcrição originalmente
envolvidos na regulação de genes pela disponibilidade celular de colesterol (Wang et al
1994). Três membros da família SREBPs têm sido descritos em mamíferos, SREBP-1a,
-1c e -2. SREBP-1a e -1c são codificados por um único gene, através do uso de sítios
iniciadores alternativos de transcrição e diferem pelo seu primeiro exon durante a
tradução nos ribossomos (Hua et al., 1995). Outra grande diferença entre as isoformas -
1a e -1c é a sua distribuição tecidual. SREBP-1c está expressa na maioria dos tecidos de
camundongos e humanos especialmente no fígado, tecido adiposo branco, glândula
adrenal e cérebro (Shimomura et al., 1997). SREBP-1c apresenta níveis consideráveis
em músculos, de ratos e humanos (Ducluzeau et al., 2001; Guillet-Deniau et al., 2002).
Em contrapartida, SREBP-1a está expressa principalmente em linhagens celulares e em
alguns tecidos, tais como baço e intestino (Shimomura et al., 1997). O terceiro membro
da família, SREBP-2 é derivado de um diferente gene e apresenta 50% de homologia
com a seqüência de aminoácidos de SREBP-1. As três isoformas têm uma estrutura
comum: (i) um fragmento amino-terminal de 480 aminoácidos os quais são de fato um
fator de transcrição, (ii) uma região de 80 aminoácidos contendo dois domínios
transmembrana separados por 31 aminoácidos os quais se encontram no lúmen do
retículo endoplasmático e um regulador C-terminal do domínio 590 aminoácidos.
O promotor do gene SREBP-1c contém elementos de resposta à insulina,
glucagon e receptores X no fígado. Em adição, camundongos nocaute para as SREBPs,
tem alterações letais ainda no desenvolvimento embrionário. Nocautes específicos de
18
SREBP-2 também resultam em letalidade embrionária. A deleção de SREBP-1a permite
alguns fetos sobreviver, em que parece acarretar pequena conseqüência (Kim et al.,
1998). A superexpressão de SREBP-1c em fígado de camundongos trangênicos produz
fígado gorduroso, enquanto que a superexpressão SREBP-2 em camundongos
trangênicos resultam em um aumento de 28 vezes da síntese de colesterol (Matsuda et
al., 2001). Isso demonstra que essas moléculas são fatores de transcrição cruciais para a
lipogênese hepática e a síntese de colesterol, respectivamente (Horton et al., 2002). Foi
observado que SREBPs ativam a expressão de mais de 30 genes que regulam a síntese e
captação de colesterol, ácidos graxos, triglicérides e fosfolipídios, bem como o cofator
NADPH necessário a síntese destas moléculas (Horton et al., 1998 e Shimomura et al.,
2000).
SREBP-1c é sintetizado como uma proteína precursora inativa embebida na
membrana do retículo endoplasmático. Após a diminuição do conteúdo de colesterol
celular, a proteína SREBP-1c imatura é translocada para a membrana do complexo de
Golgi, associada com a SCAP (proteína ativadora da clivagem de SREBP) (Nohturfft et
al., 1999; Nohturfft et al., 2000). No complexo de Golgi, a isoforma SREBP-1c é
clivada para a forma madura, por um processo mediado pela protease sítio 1 (S1P)
(Duncan et al., 1997; Sakai et al., 1998) e protease sítio 2 (S2P) que são proteínas
sensores para níveis da concentração de colesterol (Rawson et al., 1997; Duncan et al.,
1998). SREBP-1c é translocada na forma madura para o núcleo onde se liga diretamente
a elementos regulatórios de esterol, situado na região promotora de vários genes. Esta
proteína induz a transcrição de quase todos os genes que codificam enzimas envolvidas
na síntese de ácidos graxos e na esterificação de ácidos graxos em triglicérides (Horton
et al., 2002). Camundongos nocaute SREBP-1c mostram acentuada diminuição dos
19
níveis de RNA mensageiro de todos esses genes (Horton et al., 2002; Liang et al.,
2002).
SREBP-1c tem sido implicada no desenvolvimento humano da fisiopatologia
das síndromes metabólica tais como obesidade, diabetes tipo 2, dislipidemia,
aterosclerose, e lipodistrofia. Em tecido adiposo de obesos e diabéticos tipo 2, a
expressão do RNA mensageiro de SREBP-1c foi diminuída em comparação a
indivíduos magros (Ducluzeau et al., 2001; Kolehmainen et al., 2001; Diraison et al.,
2002; Oberkofler et al., 2002; Sewter et al., 2002; Yang et al., 2004). Recente estudo
confirmou que transcrição e ativação de SREBP-1c são regulados pela insulina
(Schmitz-Peiffer et al., 2000), através de um mecanismo dependente da PI 3K
(Fleischmann & Iynedjian., 2000). Os efetores downstream permanecem obscuros, mas
evidências sugerem que PKB/Akt (Fleischmann & Iynedjian., 2000) e PKC (Matsumoto
et al., 2003, Taniguchi et al., 2006) podem estar envolvidos. O efeito da insulina sobre a
translocação nuclear é, pelo menos em parte, devido ao efeito da diminuição dos níveis
da SCAP e proteínas inibidora INSIG-2 (Yabe et al., 2003). Adicionalmente, a insulina
reduz a taxa do turnover nuclear de SREBP-1c (Yellaturu et al., 2005). No jejum,
quando os níveis de insulina são baixos, a expressão dos genes lipogenicos está
diminuída assim como de SREBP-1c (Horton et al., 1998). A superexpressão hepática
de SREBP-1c em camundongos reverte os efeitos do jejum sobre a expressão gênica
desta molécula e das enzimas lipogenicas controladas por ela (Horton et al., 1998),
sugerindo que SREBP-1c é um regulador chave da resposta rápida do fígado à insulina.
Em se tratando de doenças metabólicas, SREBP-1c pode ser considerada a partir de
duas perspectivas opostas. Em primeiro lugar, como um fator de transcrição central para
as ações de insulina sobre o metabolismo de carboidratos e lipídios, e uma perda da
função, em última instância, deverá conduzir a um fenômeno da resistência à insulina
20
(Ferré & Foufelle 2007). Em adição, camundongos ob/ob (deficientes do gene da
leptina) mostram elevados triglicérides hepáticos e aumento dos níveis de glicose e
insulina sanguíneos (Bandsma et al., 2004), como também crescentes níveis protéicos
nucleares de SREBP-1c, apesar da severa resistência à insulina hepática (Shimomura, et
al., 2000). Isso sugere que SREBP-1c é muito sensível para as ações da insulina, mesmo
sob condições de reduzida sensibilidade à insulina em todo organismo. Isto é, em parte,
explicada pelo fato de que efeitos da insulina sobre a produção de glicose são mediados
via IRS2, que está menos ativo em animais insulino-resistentes, enquanto que os efeitos
da insulina sobre o metabolismo lipídico são amplamente regulados via IRS1
(Taniguchi et al., 2005). Shimomura e colaboradores (2000) mostraram que, apesar da
deficiência de IRS2 devido à crônica hiperinsulinemia em camundongos ob/ob, a
insulina estimulou a transcrição de SREBP-1c. Alternativamente a clivagem de SREBP-
1c poderia ser secundária a outra via de sinalização. Estudos têm invocado a ativação do
estresse de retículo endoplasmático (Schroder & Kaufman., 2005; Flowers et al., 2008).
Conforme relatado anteriormente insulina e SREBP-1c estimulam genes
lipogenicos chave, incluindo aqueles que codificam ACC e a FAS (Shimomura et al.,
2000). Em tais condições ambas reduzem a oxidação de ácidos graxos e aumentam a
síntese de ácidos graxos contribuindo para a acumulação de gordura no fígado em
indivíduos insulino-resistentes. Neste sentido o aumento na atividade da ACC leva à
acumulação do conteúdo de malonil-CoA. Este substrato por sua vez inibe
alostericamente (quando a atividade da enzima se modifica através de uma ligação não-
covalente com uma molécula em local diferente do sítio ativo) a atividade da carnitina
palmitoil transferase (CPT-1), o que resulta em oxidação mitocondrial diminuída (Nicot
et al., 2004; Kerner et al., 2004). CPT-1 regula a transferência de acil-CoAs de cadeia
longa do citosol para mitocôndria, onde eles são oxidados. Malonil-CoA, é, portanto, o
21
regulador crucial tanto para a síntese (Wakil et al., 1983) quanto oxidação (McGarry &
Brown., 1997). Existem duas isoformas de ACC em roedores e humanos; ACC-1 é
altamente expressa no fígado e tecido adiposo e ACC-2 é predominantemente expressa
no coração e músculo esquelético e em menor extensão no fígado (Abu-Elheiga et al.,
2001). A diferença estrutural primária entre os dois é um domínio hidrofóbico em ACC-
2 que parece facilitar sua localização na membrana mitocondrial (Abu-Elheiga et al.,
2001), onde se acredita regular níveis de malonil-CoA, atividade da CPT-1 e oxidação
do ácido graxo. Camundongos nocaute ACC-2 (ACC2 -/-
) são mais magros que
controles devido a um aumento da oxidação de gorduras no músculo cardíaco e
esquelético (Abu-Elheiga et al., 2001). Interessantemente em camundongos ACC2 -/-
a
oxidação de gorduras hepáticas está também aumentada e esteatose hepática diminuída
apesar dos níveis normais de malonil-CoA. Os autores postularam que isto pode ser
conseqüência da diminuição dos níveis locais de malonil-CoA; nas proximidades da
mitocôndria e CPT-1, uma mudança não discernível em um homogeneizado celular.
(Abu-Elheiga et al., 2001).
A FAS é responsável pela síntese de ácidos graxos de novo, sendo uma das
principais enzimas lipogênicas também estimuladas pelo fator de transcrição SREBP-1c
(Hillgartner et al., 1995; Wakil., 1989). FAS catalisa todos os passos da reação na
conversão de acetil-CoA e malonil-CoA para palmitato. A atividade de FAS não é
conhecida por ser regulada por efetores alostéricos ou modificação covalente (Volpe &
Vagelos 1974). Observa-se aumento do RNA mensageiro de FAS quando animais
previamente mantidos em restrição alimentar são alimentados ad libitum, sugerindo que
está molécula é modulada de acordo com estados nutricionais (Laux & Schweizer.,
1990; Iritani., 1992). Em adição, a deleção do gene que codifica a FAS resultou em
letalidade embrionária (Chirala et al., 2003).
22
Chakravarthy e colaboradores (2005) mostraram que camundongos nocaute da
FAS (FASKOL) específica do fígado resultaram em camundongos mutantes que
possuem um fenótipo semelhante aos animais controles, quando alimentados com ração
normal. Quando camundongos FASKOL foram alimentados com dieta rica em
carboidrato e zero em gordura por 4 semanas, desenvolveram esteatose hepática, devido
a uma redução da β-oxidação, evidenciada pelo aumento de 3 vezes da concentração de
malonil-CoA e significante diminuição dos corpos cetonicos.
Outra importante enzima que SREBP-1c atua como fator de transcrição é a
SCD-1 (Sampath et al., 2007). Esta é uma enzima chave envolvida na síntese de ácidos
graxos monoinsaturados e catalisa a inserção de uma dupla ligação entre os carbonos 9 e
10 na cadeia de ácidos graxos longos saturados (Ntambi & Miyazaki., 2004). A SCD-1
possui especificidade para os substratos palmitoil e esteril-CoA, convertendo-os em
palmitato e oleil-CoA, respectivamente. (Ntambi & Miyazaki 2004). Camundongos
nocaute SCD1-/-
são magros estão protegidos da obesidade induzida por dieta e
resistência à insulina (Miyazaki et al., 2001; Ntambi et al., 2002 e Rahman, et al., 2005).
Estes camundongos apresentam reduzida deposição de lipídeos corporal total e em
especial no fígado quando comparados ao controle. Isto é acompanhado por uma
notável redução nos ácidos graxos 16:1 e 18:1, diminuição das taxas de lipogênese, bem
como aumento na taxa metabólica e na oxidação lipídica (Rahman et al., 2003;
Miyazaki et al., 2004; Rahman et al., 2005), sugerindo uma possível correlação entre os
produtos monoinsaturados de SCD-1 e o processo da esteatose hepática.
Recentes evidências sugerem que SCD-1 desempenha um papel crucial no
metabolismo lipídico e controle do peso corporal (Cohen et al., 2003 e Dobrzyn &
Ntambi., 2004). Camundongos asebia são homozigotos para uma mutação que resulta
naturalmente na falta da expressão de SCD-1 (Zheng et al., 1999). Esses camundongos
23
manifestam alterações na síntese hepática de ésteres de colesterol e triglicérides
(Miyazaki et al., 2000), são magros, hipermetabólicos, e apresentam diminuição da
esteatose hepática (Cohen et al., 2002). Semelhantes fenótipos foram relatados em
camundongos nocaute SCD-1, que são também protegidos da resistência à insulina
induzida por dieta (Ntambi et al., 2002). Finalmente, a deficiência SCD-1 também reduz
a esteatose hepática em camundongos com liposdrofia AP2-nSREBP-1c (expressão
constitutiva da forma ativa de SREBP1c) (Asilmaz et al., 2004).
O mecanismo detalhado pelo qual a deficiência de SCD-1 afeta peso corporal e a
obesidade não é totalmente compreendido. Camundongos nocaute SCD-1 tiveram
aumento da atividade da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), os quais podem
ser responsáveis pela regulação de alguns dos importantes genes no metabolismo
lipídico (Dobrzyn et al., 2004). Dessa forma parece que AMPK tem importante papel na
lipogênese hepática por estar envolvida na lipólise sendo importante neste processo
(Ouadda et al., 2008). Em adição, foi demonstrado que a deficiência de SCD-1 aumenta
a expressão basal de proteínas de desacoplamento (UCPs) 1-3, de receptores β-
adrenérgicos em tecido adiposo marrom e aumenta a termogênese basal em
camundongos (Lee et al., 2004). Os estudos acima citados sugerem que a deficiência
SCD-1 reduz o peso corporal, adiposidade e a esteatose hepática, aumentando o
metabolismo basal em camundongos.
Estima-se que a prevalência de fígado gorduroso nos Estados Unidos está em
torno de 14 a 20%. Isto é causado por acúmulo de triglicérides no fígado e está
fortemente associado com obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e síndrome
metabólica. Várias evidências sugerem que acumulo de lipídeos no fígado causa
resistência hepática à insulina e que por fim pode levar ao diabetes. Após o maior
reconhecimento da esteatose hepática e distúrbios associados como problema de saúde
24
publica, tem crescido rapidamente o interesse de pesquisadores e clínicos envolvidos no
estudo e tratamento dessa doença. Porém, a prevalência desse distúrbio tem superado
em muito o avanço científico na área. Neste sentido, pesquisas que tem como objetivo
investigar mecanismos alvos para novas intervenções terapêuticas é de grande
importância no que concerne à esteatose hepática. Em razão do significante papel do
metabolismo hepático sobre o metabolismo corporal total acredita-se que a completa
caracterização da integração entre eventos bioquímicos e moleculares induzidos pelo
consumo de dieta hiperlipídica e metabolismo hepático permita que se obtenham
avanços na caracterização dos mecanismos fisiopatológicos da esteatose hepática. Dessa
forma, o presente projeto visou estudar se a inibição in vivo da proteína SREBP-1c
reverte à resistência à ação da insulina e a esteatose em fígado de camundongos com
obesidade induzida por dieta hiperlídica. Os resultados obtidos a partir deste estudo
direcionam para um potencial alvo terapêutico na reversão da esteatose hepática não
alcoólica.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos da inibição da expressão de SREBP-1c sobre os
parâmetros de hiperglicemia e esteatose hepática em camundongos obesos
induzidos por dieta rica em gordura.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar os efeitos da inibição da expressão de SREBP-1c sobre a via
molecular de ação da insulina;
Avaliar os efeitos da inibição da expressão de SREBP-1c sobre os
parâmetros glicêmicos e lipídicos no tratamento da esteatose hepática induzida
por dieta hiperlipídica;
Avaliar os efeitos da dieta hiperlipídica sobre a expressão da SREBP-1c;
Avaliar os efeitos da inibição da SREBP-1c sobre a expressão e a
atividade das enzimas lipogenicas tais como ACC-1, FAS, SCD-1 bem como de
enzimas lipolíticas tais como AMPK e CPT-1.
26
CAPÍTULO 3
SHORT-TERM INHIBITION OF SREBP-1C
EXPRESSION REVERSES DIET-INDUCED
NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE
IN MICE
Marisa JS Frederico, Marcelo F. Vito, Patrícia Cesconetto, Gabrielle da Luz,
Sabrina da
Silva, Tamires Viana, Dennys K. Cintra, Ricardo A. de Pinho, Lício A. Velloso,
Cláudio T. De Souza
Submetido ao
British Journal of Pharmacology
27
Short-term inhibition of SREBP-1c expression reverses diet-
induced non-alcoholic fatty liver disease in mice
1Marisa JS Frederico,
1Marcelo F. Vito,
1Patrícia Cesconetto,
1Gabrielle da Luz,
1Sabrina da
Silva, Tamires Viana, 2Dennys K. Cintra,
1Ricardo A. de Pinho,
2Lício A. Velloso, *
1Cláudio T.
De Souza
1Exercise Biochemistry and Physiology Laboratory, Postgraduate Program in Health Sciences,
Health Sciences Unit, University of Southern Santa Catarina, Criciúma, SC, Brazil.
2Departament of Internal Medicine, Faculty of Medical Sciences (FCM), State University of
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
RUNNING TITLE: Inhibition of SREBP-1c expression reverses hepatic steatosis.
KEYWORDS: SREBP-1c; steatosis; resistance to insulin; lipogenese de novo.
*Please address correspondence to: Claudio Teodoro de Souza, PhD. Laboratório de Fisiologia e
Bioquímica do Exercício, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brasil.
Fax: + 55 48 3431-2539
E-mail: [email protected]
28
ABSTRACT
Background/Aims: Sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP-1c) plays
a pivotal role in the regulation of most hepatic lipogenic genes. However, effects of
short-inhibition SREBP-1c on non-alchoolic fatty liver desease (NAFLD) not have
been investigated. Thus, in this study we investigated the SREBP-1c expression
and proteins related in obese and resistance to insulin mice treated with SREBP-
1c oligonucleotide (SREBP-1c/AS).
Methods: Swiss male mice became obese and insulin resistant after 8 weeks of a
high-fat diet and were treated for 14 days with 3nmol antisense oligonucleotide
SREBP-1c (SREBP-1c/AS). After the animals were killed and were used glucose
tolerance tests, insulin tolerance tests, immunoprecipitation assays and
immunoblotting assays in this investigation.
Results: After 8 weeks, with a high-fat diet mice developed resistance to insulin and
non-alcoholic fatty liver disease, which is characterized by increased hepatic fat
deposition. This was accompanied by an increased hepatic n of SREBP-1c
expression, expression and function of a series of proteins involved in lipogenesis,
increased inflammatory proteins, and by an impaired insulin signal transduction
through the insulin receptor/IRS1-IRS2/PI3-kinase/Akt/FOXO1 signaling
pathway. Treatment by SREBP-1c/AS significantly reduced SREBP-1c expression
in liver, muscle and adipose tissue. There was reduction ACCSer79
activity, FAS,
SCD-1, PPARγ expression and increased AMPK activity and CPT1 expression in
liver. In addition mice treated with SREBP-1c/AS presented an outstanding
reduction of macroscopic and microscopic features of hepatic steatosis. However,
there was no changed glucose, constant of glucose decay (Kitt) during an insulin
tolerance test, body weight, insulin blood levels, molecular pathway of insulin and
inflammatory proteins.
Conclusions: The reduction of SREBP-1c expression attenuated fatty livers but not
obesity or insulin resistance in obese mice induced by diet. It was revealed that
SREBP-1c plays a crucial role in the regulation of lipogenic gene expression and
triglyceride accumulation in the liver. SREBP-1c is an attractive target for
pharmacological therapeutics in NAFLD.
29
1. Introduction
The worldwide prevalence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is
presently estimated at 30% of the general population and affects a majority of patients
with obesity and type 2 diabetes [1]. NAFLD is caused by triglyceride accumulation
within the liver, and recent reports indicate that in turn is responsible by hepatic insulin
resistance. For example, increasing hepatic lipid stores in mice by overexpressing
lipoprotein lipase in the liver [2] and in rats by short term high fat feeding [3] resulted in
liver-specific fat accumulation and hepatic insulin resistance. It has been reported that
lipogenesis in both liver and adipose tissue is greater in obese animals than in lean
controls [4,5]. The livers of high fat diet mice have an increase in triglyceride content,
probably due to the increased lipogenesis paralleled by elevated mRNA expression and
enzymatic activity of several lipogenic enzymes such as fatty acid synthase (FAS) and
Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) [6,7]. Moreover, dysregulations in hepatic lipid
synthesis have been associated with NAFLD [8]. Thus, the perfect understanding of the
regulation of lipogenesis de novo seems crucial in both physiology and physiopathology
of NAFLD and associated diseases.
Based on the premises that obesity-associated NAFLD is primarily driven by
high fat diet inducing TG accumulation within the liver, we argued that blocking crucial
transcription factor responsible of lipogenesis should prevent or reverse hepatic
steatosis. This way, sterol regulatory element binding proteins (SREBPs) has been a
master transcription factors that belong to the basic helix-loop-helix leucine zipper
family and regulate enzymes responsible for the synthesis of cholesterol, fatty acids,
and triglycerides [9]. To date, three SREBP isoforms, SREBP-1a, -1c, and -2, expressed
in liver. Whereas SREBP-2 is relatively selective in transcriptionally activating
cholesterol biosynthetic genes, SREBP-1c has a greater role in regulating fatty acid
synthesis [10,11,12,7].
SREBP-1c plays a pivotal role in the dietary regulation of most hepatic lipogenic
genes such as FAS, ACC, and stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1). Recent reports,
evaluated the expression of genes associated with fatty acid metabolism in NAFLD, and
founded that increased lipogenesis de novo led to the increased accumulation of fatty
acids in hepatocytes [8]. The contribution of lipogenesis de novo to hepatic fat content
in NAFLD patients was estimated close to 30%, underlying the importance of fat
synthesis in this pathology [13]. In the process of lipogenesis de novo, ACC converts
acetyl-CoA, an essential substrate of fatty acids, to malonyl-CoA. This way, FAS
30
utilizes both acetyl-CoA and malonyl-CoA to form palmitic acid (C16:0). In addition
SCD-1, through the conversion of saturated fatty acids to monounsaturated fatty acids,
contributes to abnormal partitioning of fatty acids by increasing ACC activity and
decreasing fatty acid oxidation, shunting substrate towards fatty acid synthesis [14].
Some techniques were performed to direct or indirect inhibition of SREBP-1c
such as liver-specific knockout mice SCAP [15]; S1P [16] and SREBP-1 [17] or
germline knockout mice SREBP-1a and 1c [10] and SREBP-1c [6]. However, the
pharmacological inhibition of this protein by antisense oligonucleotide has not been
investigated. This technique is similar to pharmacologic treatment in humans, once the
treatment begins after the onset of the disease. It is pathophysiologically intriguing and
of clinical relevance to evaluate the possible involvement of SREBP-1c in the
development of NAFLD and its related syndromes, since SREBP-1c could be a
potential therapeutic target in these pathological states. These considerations prompted
us to investigate the effects of SREBP-1c inhibition on obese mice by oligonucleotide
antisense.
2. Material and methods
2.1. Antibodies, chemicals and buffers
Reagents for SDS-PAGE and immunoblotting were from Bio-Rad (Richmond,
CA, USA). Aprotinin, dithiothreitol, Triton X-100, Tween 20, glycerol and bovine
serum albumin (fraction V) were from Sigma (St Louis, MO, USA). Nitrocellulose
paper (BA85, 0.2 μm) was from Amersham (Aylesbury, UK). Sodium thiopental and
human recombinant insulin (Humulin R) were from Lilly (Indianapolis,IN, USA). Anti-
insulin receptor (IR) (sc-711, rabbit polyclonal), anti-insulin receptor substrate 1 (IRS1)
(sc-559, rabbit polyclonal), anti-insulin receptor substrate 2 (IRS2) (sc-8299, rabbit
polyclonal), anti-Akt (sc-1618, goat polyclonal), anti-phosphotyrosine (pY) (sc-508,
mouse monoclonal), anti-phospho[Ser473]Akt (sc-7985-R, rabbit polyclonal), anti-
phosphoFoxo1 (sc-1618, goat polyclonal), anti-SREBP-1 (sc-8984, rabbit polyclonal),
anti-peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) (sc-7273, mouse
monoclonal), anti-β-actin (sc-130656, rabbit polyclonal), anti-ACC (sc-137104, mouse
monoclonal), anti-AMP-activated kinase (AMPK) (sc-19128, goat polyclonal), anti-
FAS (goat polyclonal, sc-16146), anti-SCD-1 (goat polyclonal, sc-14719), anti-carnitine
palmitoyl transferase-1 (CPT-1 goat polyclonal, sc-20514), anti-phosphoJNK (sc-
12882, rabbit polyclonal), anti JNK (sc-137018, mouse monoclonal), anti-NF-kB (sc-
31
372, rabbit polyclonal), anti-phospho-IkBα (sc-7977, rabbit polyclonal) and anti-IkBα
(sc-371, rabbit polyclonal) antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (Santa
Cruz, CA, USA). Anti-Foxo1 (rabbit polyclonal, no. 256S) and anti-phospho
[Thr172]AMPK (rabbit polyclonal, no. 2531S) antibodies were from Cell Signaling
Technology (Beverly, MA, USA) and anti-phospho [Ser79]ACC (rabbit polyclonal, no.
07-184) was from Upstate Biotechnology (Charlottesville, VA, USA).
2.2. Experimental protocols
Male, 4-week-old Swiss, were obtained from our breeding colony (UNESC) and
maintained on a 12-h artificial light–dark cycle and housed in individual cages. The
investigation followed the University guidelines for the use of animals in experimental
studies and conformed to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals
published by the US National Institutes of Health (NIH publication no. 85-23, revised
1996). The animals were maintained on a 12:12 h artificial light–dark cycle and housed
in individual cages. After random selection, 4-week-old mice (21 ± 2 g) were
introduced to control (C) or high-fat diets (DIO) (Table 1). After 8 weeks on a high fat
diet, all mice presented severe hepatic steatosis and defective insulin signal transduction
as demonstrated in previous studies [18,19]. After this period, a second part of the study
was started. To evaluate the efficiency of oligonucleotide antisense was administered
intraperitoneally doses of 0.0, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 nmol, daily, for 5 days. On the sixth
day the animals were killed and fragments of hepatic tissue were excised for western
blot analyses. Chosen the dose of 3.0 nmol, mice were treated either with a daily dose of
oligonucleotide dilution vehicle/500uL saline, with SREBP-1c/S oligonucleotides or
with SREBP-1c/AS oligonucleotides from the 8th week of the diet onwards. At day 14
of oligonucleotide treatment, insulin tolerance tests were performed. Finally, mice were
employed for evaluation of liver enzymes in serum; fasting insulin serum, blood
glucose, and total triglycerides serum; ITT; histological examination; epididimal fat and
determination of proteins of the lipolitic and lipigenic pathways, insulin signal
transduction and expression and inflammatory protein expression.
2.3. Sense and antisense oligonucleotide treatment protocols
Sense and antisense oligonucleotides (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were
diluted to a final concentration of 3.0 μmol/l in dilution buffer containing 10 mmol/l
Tris–HCl and 1.0 mmol/l EDTA. The mice were injected (i.p.) with one daily dose of
500 μl dilution buffer (vehicle) containing, or not, sense (SREBP-1c/S) or antisense
(SREBP-1c/AS) oligonucleotides. Phosphorothioate-modified oligonucleotides were
32
designed according to the Mus musculus and C57BL/6 of sterol regulatory element
binding transcription factor 1 (Srebf1) sequences deposited at the NIH-NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) under the designation NM 011480, chromosome
11 gene 1..4299, and were composed of sense (5′- CGG TGA GGC GGC TCT GGA
AC-3′) and antisense (5′- GTT CAA GAG CCG CCT CAC CG -3′).
2.4. Hormone and biochemical measurements
Was performed after fasting of six hours. Insulin was determined in serum from each
sample using a commercially available ELISA kit (Pierce Biotechnology, Inc.,
Rockford, IL, USA). Blood glucose was measured by glucosimeter. Liver total lipids
were measured by the gravimetric method [20]. Aspartate (AST) and alanine (ALT)
amino transferases in serum were determined using a commercially available kit from
Labtest (Lagoa Santa, MG, Brazil), according to the manufacturer’s guidelines. Serum
triglycerides were measured colorimetrically using a commercial kit (Thermo Electron
Corporation, Melbourne, Vic., Australia).
2.5. Intraperitoneal insulin tolerance test (ipITT)
An inperitoneal (i.p.) ITT was carried out at the end of 8th
week of the high fat diet and
of the treatment with SREBP-1c/AS. Food was withdrawn 6 h before the test and the
mice were anaesthetized as described above. Insulin (2U/kg body weight) was injected
via i.p. and blood samples were collected from the tail at 0, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min
for serum glucose determination. The constant rate for glucose disappearance (Kitt) was
calculated using the formula 0.693/t1/2. The glucose t1/2 was calculated from the slope
of the least-square analysis of the plasma glucose concentrations during the linear decay
phase [21].
2.6. Liver histology
Hydrated, 5.0-μm sections of paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded liver
fragments were stained with haematoxylin–eosin, and analysed and photo-documented
using an Olympus BX60 microscope.
2.7. Protein analysis by immunoblotting
As soon as anesthesia was assured by the loss of pedal and corneal reflexes the
abdominal cavity was opened. Mice were opened and the animals received an infusion
of insulin (+) (200 μl, 10−6 mol/l) or saline (-) (200 μl) through the cava vein, when it
was made the analysis of the pathway of insulin. After, fragments of hepatic tissue,
muscle gastrocnemius and adipose were excised. The tissues were pooled, minced
33
coarsely and homogenized immediately in extraction buffer (mM) (1% Triton-X 100,
100 Tris, pH 7.4, containing 100 sodium pyrophosphate, 100 sodium fluoride, 10
EDTA, 10 sodium vanadate, 2 PMSF and 0.1 mg of aprotinin/ml) at 4 ºC with a
Polytron PTA 20S generator (Brinkmann Instruments model PT 10/35) operated at
maximum speed for 30 sec. The extracts were centrifuged at 11000 rpm and 4°C in a
Beckman 70.1 Ti rotor (Palo Alto, CA) for 40 min to remove insoluble material, and the
supernatants of these tissues were used for protein quantification, using the Bradford
method [22]. Proteins were denaturated by boiling in Laemmli [23] sample buffer
containing 100 mM DTT, run on SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes.
Membranes were blocked, probed and developed, as described previously [24]. In direct
immunoblot experiments, 0.25 mg of protein extracts obtained from each tissue were
separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes and blotted with anti-
SREBP-1c, anti-ACC, anti-phospho [Ser79] ACC, anti-FAS, anti-SCD-1, anti- PPARγ,
anti-AMPK, anti-phospho [Thr172]AMP, anti-CPT-1, anti-IR, anti-IRS1, anti-IRS2,
anti-Akt, anti-phospho[Ser473]Akt, anti-Foxo1, anti-phosphoFoxo1, anti-phosphoJNK,
anti-phosphoIkBα, anti-NF-kB and anti-β-actin antibodies. Chemiluminescent detection
was performed with horseradish peroxidase-conjugate secondary antibodies.
Visualization of protein bandswas performed by exposure of membranes to RX-films.
2.8. Statistical analysis
The results were expressed as the means ± SEM. Differences between the DIO and
SREBP-1c/AS group after treatment were evaluated using one-way analysis of variance
(ANOVA). When the ANOVA indicated significance, a Bonferroni post hoc test was
performed.
3. Results
3.1. Dose–response SREBP-1c/AS in liver and SREBP-1C expression in adipose,
muscle and hepatic tissue in obese mice.
The efficiency of the phosphorothioate-modified antisense oligonucleotide to
SREBP-1c (SREBP-1c/AS) was tested in a dose–response experiment. As shown in Fig.
1A, a daily dose of 4.0 nmol SREBP-1c/AS was sufficient to inhibit SREBP-1c
expression by 94±7% (n=4,p<0.05), while 2.0 nmol/day resulted in 76±11% (n=4,
p<0.05) inhibition of SREBP-1c expression in the liver. One daily dose of 3.0 nmol
SREBP-1c/AS was sufficient to inhibit SREBP-1c expression by 84±12% (n=4, p<0.05)
in the liver of swiss mice, respectively (n=4, p<0.05), and was therefore used in the
remaining experiments. SREBP-1c/AS promoted no significant changes in the
34
expression of the structural proteins actin in the liver (Fig 1A). After the choice of the
optimal dose, the next step was to evaluate the effect of the inhibition of SREBP-1c/AS
expression in different tissues of obese and resistant to insulin mice. Eight weeks after
the introduction of the fat-rich diet, swiss mice became obese with increased fat
epididimal and insulin resistant as confirmed by ITT (data is not demonstrated), we
decided to begin SREBP-1c/AS treatment. Treatment with antisense oligonucleotide
SREBP-1c by 14 days, once a day, markedly reduced the expression of SREBP1c in
liver by 2.7-fold (Fig 1B), adipose tissue by 2.5-fold (Fig 1C), and skeletal muscle by
2.4-fold (Fig 1D), respectively, when compared with DIO mice group.
3.2 Physiological and metabolic parameters
The next step was to evaluate the effect of the inhibition of SREBP-1c/AS
expression on metabolic and physiological parameters in DIO mice. Moreover we
analyzed hepatic damage through of liver enzymes in serum. Table 2 shows
comparative data regarding control, diet-induced obesity (DIO) mice, DIO mice injected
(i.p.) with sense (SREBP-1c/S) and antisense (SREBP-1c/AS) oligonucleotides. The
DIO mice have a greater body weight, epididymal fat and fasting serum insulin, fasting
glucose, ITT, total plasma triglycerides, and liver triglycerides than age matched
controls. Treatment by SREBP-1c/AS did not alter body weight, epididymal fat and
parameters in glucose homeostasis, but we observed drastic reduction of total plasma
triglycerides, and liver triglycerides. These results indicate that the inhibition of
SREBP-1c is not sufficient to alter glucose homeostasis. There was no difference in
ALT and AST between the groups.
3.3. SREBP-1c/AS treatment reduces lipogenic enzymes expression, increase oxidative
enzyme expression and reduces steatosis in liver of DIO mice.
Given these results, we analyzed the expression of SREBP-1c target genes,
including FAS, SCD-1 and ACC activity. In addition PPARγ expression was analyzed
because your expression increased in the liver is known to promote hepatic steatosis
development [25] and can stimulate lipogenesis [26]. The fat-rich feeding inhibited the
molecular activation of ACC (6.5 -fold), as measured by [Ser79]-phosphorylation,
demonstrated increased activity these enzyme (Fig 2A). Treatment by SREBP-1c/AS
reverse exacerbate increase of ACC activity by 3.7 -fold (Fig 2A). In adittion, mice
treated with high fat diet was increased ACC protein level (Fig. 2A – lower panel). High
fat diet induced an increase in FAS expression. In the liver from DIO mice, FAS
35
expression was increase by 5.6 -fold, when compared with control group (Fig 2B). In
the liver SREBP-1c/AS group, FAS reduced by 1.8- fold, compared with DIO group
(Fig 2B). The SCD-1 play pivotal role in fatty acid synthesis. In figure 2C, we observed
which DIO mice group show increases by 5.5 –fold when compared with control group
and treatment with oligonucleotide reduces of 2.2 –fold when compared with DIO
group. The PPARγ expression is increased in DIO group (Fig 2D). Treatment by
SREBP-1c/AS reverses increase of PPARγ expression by 1.6-fold (Fig 2D).
AMP-activated protein kinase (AMPK) is an energy sensor that regulates
cellular metabolism including lipid metabolism [27]. AMPK is activated by increased
levels of cellular AMP, a marker of cellular energy stores [27]. Studies show that
activation of AMPK improves hepatic steatosis [28,29,30]. In view of this, we decided
to analyze the activation status of AMPK in obese mice treated with SREBP-1c/AS. In
swiss mice fed on a high fat diet, the phosphorylation of AMPK is reduced figure 3A. In
obese mice treated with SREBP-1c/AS there was great increase in phosphorylation of
AMPK (3.7-fold, Fig 3A) and no change in protein level (Fig 3A – lower panel). With
these results can suggest a decrease in liver triglycerides was involved in this process,
and that treatment with oligonucleotide improves the cellular energy status. Liver of
DIO mice group show reduced CPT1 expression of 2.5 –fold when compared with
control group (Fig 3B). Interestingly, treatment with SREBP-1c/AS increased CPT1
expression in 2.3 –fold (Fig 3B), demonstrated similar alteration ACC phosphorylation.
In all figure, the membrane was stripped and immunoblotted with anti-β-actin as
loading protein.
During the preceding experiments, we observed modification in the livers of
DIO mice. The livers of DIO mice were yellowish in colour. Four obese mice treated
with SREBP-1c/AS, SREBP-1c/S or vehicle for 14 days were randomly selected for
histological analysis of the liver. As shown in figure 3C, obese mice treated with
vehicle or SREBP-1c/S for 14days presented a steatotic liver, with intra-hepatocyte fat
depots predominantly in the perivenular zone with extension to the external areas of the
lobule. Treatment with SREBP-1c/AS almost completely restored the microscopic
aspect of the liver (Fig 3C).
3.4. Effect of SREBP-1c/AS treatment on the insulin signal in the liver of obese mice.
The effects of in vivo i.v. insulin injection on insulin signaling was examined in
the liver of C, DIO mice and DIO mice treated with SREBP-1c oligonucleotide
36
antisense. In the first part we analyze IR, IRS-1 and IRS-2 phosphorylation. Insulin
induced an increase in IR, IRS-1 and IRS-2 phosphorylation (Fig 4A, B and C
respectively). High fat diet induced a reduction IRS phosphorylation. Treatment with
SREBP-1c/AS did not because significant changes in the expression of IR, IRS-1 and
IRS-2 phosphorylation.
Given these results and combining the results of glucose homeostasis, we
decided to analyze two pivotal markers pathway of insulin, the phosphorylation Aktser473
and Foxo1. Insulin induced an increase in Akt [serine 473] phosphorylation in the liver
of C group when compared to saline injection (Fig 4D). In DIO mice, Aktser473
phosphorylation was reduced, when compared with control (Fig 4D). Results of the
equal magnitude occur in the phosphorylation of Foxo1 (Fig 4E). As a result of the
sequence of state of insulin resistance described above in the livers of SREBP-1c/AS
group, Aktser473
and Foxo 1 phosphorylation not changed (Fig 4D and E). There was no
difference in basal levels of both Aktser473
and Foxo1 phosphorylation between the
groups. The Akt and Foxo1 protein levels did not differ between the groups (Fig 4D and
E -lower panels). These results show that treatment with SREBP-1c does not change the
transduction pathway insulin and thus we suggest that SREBP1c would not be a link
between NAFLD and diabetes.
3.5. SREBP-1c/AS treatment does not interfere on the inflammatory protein expression.
Studies recent shown that high fat diet activates the two principal inflammatory
pathways that impair the action of insulin JNK and IkBα/NF-kB. To verify the relation
between fatty liver and does not change resistance to insulin we analyzed inflammatory
protein expression. This study, we investigated the JNK, IkBα phosphorylation and NF-
kB expression in hepatic tissue. JNK activation was determined by monitoring
phosphorylation of JNK. The high-fat diet induced an increase in JNK phosphorylation
in hepatic of DIO mice by 3.9-fold when compared with control mice (Fig 5A).
Treatment with SREBP-1c/AS did not cause significant changes in the JNK
phosphorylation (Fig 5A). The high-fat diet increased both IkBα phosphorylation 2.5-
fold and NF-κB expression 3.1-fold) in hepatic tissue when compared to the control (Fig
5B and C, respectively). Treatment with SREBP-1c/AS did not cause significant
changes in the both IkBα phosphorylation and NF-κB expression groups when
compared with respective control groups (Fig 5B and C, respectively).
37
4. Discussion
It has been reported that NAFLD is associated with insulin resistance and
hyperinsulinemia even in lean subjects with normal glucose tolerance [31]. Fatty liver
disease and insulin resistance in these patients might represent an initial stage of the
metabolic syndrome [32]. Fat accumulation in the liver can occur as a result of
increased fat delivery, increased fat synthesis, reduced fat oxidation, and/or reduced fat
export in the form of lipoproteins [33]. Previously, the fatty liver was considered
benign. However, recently it became clear that fatty liver is a precursor to more
advanced liver disease nonalcoholic steatohepatitis, a condition that may progress to
cirrhosis in up to 25% of patients [34]. Unfortunately, lifestyle modification is
notoriously difficult to sustain, necessitating the development of additional strategies for
the treatment of NAFLD and hepatic insulin resistance. To date, the majority of studies
have targeted fat oxidation with few attempts to reduce fat synthesis in the liver. Several
studies have shown that the accumulation of fat in the liver is associated with high
protein levels of SREBP-1c, so in the present study we analyzed the impact of antisense
oligonucleotide-mediated reduction of SREBP-1c in DIO mice, an intervention that
primarily influences TG synthesis.
Previously was showed that SREBP-1c is highly dependent on insulin for its
expression and maturation in the liver [12]. Insulin stimulates both SREBP-1c
transcription and proteolytic cleavage in hepatocytes [35,36]. Intriguingly, it was
observed that the nuclear form of SREBP-1c is highly abundant in livers of ob/ob and
aP2–SREBP-1c lipodystrophic mice, models characterized by severe hepatic insulin
resistance and steatosis [35]. In a study where was used the technique of homologous
recombination to generate mice with disruptions in the gene encoding the SREBP-1c
the fatty acid synthesis was decreased in livers of the mutant mice [10]. Matsuda et al.
[15] produced a conditional deficiency of SREBP cleavage-activating protein (SCAP)
in mouse liver by genomic recombination mediated by inducible Cre recombinase.
SCAP-deficient mice showed an 80% reduction in basal rates of fatty acid synthesis in
liver, owing to decreases in mRNAs encoding multiple biosynthetic enzymes. In
another study Yang et al. [16] disrupt the site-1 protease (S1P) gene in mice. S1P
cleaves membrane-bound sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs),
allowing their transcription-stimulating domains to translocate to the nucleus where
they activate genes governing lipid synthesis. Thus, nuclear SREBPs declined, as did
38
mRNAs for SREBP target genes and fatty acid biosynthesis in hepatocytes. Liang et al.
[6] eliminated the exon encoding SREBP-1c from the mouse genome. On a normal diet,
livers of SREBP-1c(-/-)
mice manifested reductions in multiple mRNAs encoding
enzymes of fatty acid and triglyceride synthesis, including ACC and FAS. In contrast,
SREBP-1c(-/-)
livers showed a compensatory increase in hepatic SREBP-2 mRNA,
accompanied by increased mRNA levels for cholesterol biosynthetic enzymes. Yahagi
et al. [17] founded that disruption of SREBP-1 caused a significant reduction in hepatic
expression of a battery of lipogenic genes and prevented fatty livers in Lepob
/Lepob
mice, indicating that SREBP-1 controls triglyceride accumulation in the liver by
regulating the expression levels of lipogenic enzymes. In addition, mice overexpressed
SREBP-1c, the predominant SREBP-1 isoform, had a great increase in the rate of fatty
acid synthesis and levels for the lipogenic genes [10,12]. SREBP-1c induces
transcription of almost all genes encoding for enzymes involved in both de novo fatty
acid synthesis and esterification of fatty acids into TG [11]. Moreover, most of the
studies cited above on inhibition of SREBP-1c in animal models show markedly
decreased mRNA levels of all of these genes. In our model of steatosis induced by high
fat diet was observed that the SREBP-1c protein level is highly abundant in livers. The
oligonucleotide antisense is an effective treatment that has been used in several studies
[37,38], including our group [17,18,39] and is based on the inhibition of translation of
ribosomal protein in question. Treatment with oligonucleotide was effective in reducing
expression of SREBP-1c in liver, as demonstrated in our results by immunoblot.
Moreover, this treatment reduced expression SREBP-1c in adipose tissue that has high
expression of SREBP-1c in a high-fat diet (Fig. 1C) and skeletal muscle, contributing to
response to treatment. In the same way, fatty acid synthetic enzymes such as ACC,
FAS, SCD-1, which are directly activated by SREBP-1c in liver, also were changed.
ACC catalyzes the carboxylation of acetyl-CoA to form malonyl-CoA. In the
present study, we observed higher phosphotylation ACC, which demonstrate minor
activity it. Thus we suggest that there is less formation of malonyl-CoA decreases
substrate for the synthesis of long chain saturated fatty acids by FAS. In agreement with
this finding, FAS expression is decreased. Moreover less formation of malonyl-CoA
reduces the allosterica inhibition on CPT-1 thereby increasing fatty acid entry into the
mitochondria for oxidation. For instance, etomoxir, a CPT-1inhibitor, inhibits fatty acid
oxidation and induces steatosis [40]. With suggested that the treatment by
oligonucleotide would decrease substrates for fatty acid synthesis, the next step was to
39
evaluate the expression of SCD-1, an enzyme precursor in the synthesis of
monoacylglycerols. In a previous study [41] SCD-1-knockout mice had decreased de
novo lipogenesis with increased mitochondrial fat oxidation. These mice were protected
from diet-induced obesity, fatty liver and insulin resistance when fed a high-fat and
high-calorie diet. Oligonucleotide inhibition of SCD-1 in liver and adipose tissue also
showed similar results with the SCD-1-knockout mice [37]. In another study liver-
specific SCD-1- knockout mice were shown to have decreased gene expression for key
lipogenic enzymes (ACC and FAS), with decreased de novo lipogenesis, and were also
protected from diet-induced hepatic steatosis [42]. Additionally, the reduction in SCD-1
activity had a marked decrease in the nuclear content of two key transcription factors for
lipogenesis SREBP-1c and ChREBP. In the present study SCD-1 protein level was
reduced possibly for reduction of substrate, as malonyl-CoA. Previous studies have
demonstrated that PPARγ overexpression is both necessary and sufficient to induce
fatty liver [25,26,43]. Hepatic PPARγ expression is up-regulated in animal models of
severe obesity and lipoatrophy, concurrent with development of steatosis. Under those
circumstances, treatment with TZD further aggravates hepatic steatosis, whereas
deletion of PPARγ decreases hepatic fat storage. This positive link between PPARγ and
liver fat storage is supported by studies by Yu et al. [26], which showed that PPARγ1
overexpression in liver cause hepatic steatosis and induction of adipocyte-specific gene
expression. In our results, treatment with oligonucleotides SREBP-1c reduced PPARγ
expression.
The overexpression of AMPKα1 ameliorates fatty liver in hyperlipidemic
diabetic rats [30]. The role of AMPK has been confirmed by the decrease in liver TG
content in lean and obese rodents during AICAR infusion [28] and treatment with direct
AMPK activator A-769662 [29]. Treatment with SREBP-1c increased AMPK
phosphorilation. Moreover, studies show that the phosphorylation of AMPK inactivates
ACC [27,29,30], These results collaborate with the response to treatment short-term
inhibition of SREBP-1c expression by antisense oligonucleotide to reverse the non-
alcoholic fatty liver disease.
We believe that lipid synthesis de novo is crucial in the pathology of NAFLD
[13], and the effects of inhibition of SREBP-1c by antisense oligonucleotide is
achieved, at least in part, by the reduction of this process. Schwarz et al. [44] showed
that obese hyperinsulinemic subjects fed a high fat diet, had a higher de novo
lipogenesis when compared to either lean or obese normoinsulinemic individuals.
40
Moreover, there is the close relationship this phenomenon with the deposit of hepatic
lipids [8]. In our study a remarkable reversal of hepatic steatosis and liver triglycerides
are effects of inhibition of SREBP-1c and de novo lipogenesis.
SREBP-1c promotes fatty acid synthesis and lipid deposition. Since lipids have
been largely implicated in the development of insulin resistance by mechanisms
involving substrate competition, antagonism of insulin signalling or lipotoxicity [45,
46,47], SREBP-1c could also be considered as a factor responsible for insulin
resistance. However, our results showed that, the inhibition of SREBP-1c expression
was not accompanied by improved in the transduction of insulin, evidenced by no
changes in IR and Akt phosphorylation in the liver tissue. In addition, the treatment by
oligonucleotide is not changed plasma glucose and plasma insulin. Thus, the inhibition
of SREBP-1c was not enough to reverse insulin resistance in obese and insulin
resistance animals. Several studies have revealed the connection between pro-
inflammatory pathways and obesity and insulin resistance [3,47]. Furthermore, it has
been reported on literature that obese animals showed high levels cytokine in liver
[3,43]. We suggest that treatment with SREBP-1c did not reverse insulin resistance
because it was obtained modification of inflammatory proteins induced by high-fat diet.
So, we suggest that only by reducing the intrahepatic lipid deposition would not be an
effective way to reduce insulin resistance, since it starts the inflammatory process, it is
continuously activated by obesity. Grefhorst et al. [48] showed that, acute hepatic
steatosis in mice by blocking β-oxidation does not reduce insulin sensitivity of very low
density lipoprotein production. Other studies have demonstrated the dissociation
between hepatic steatosis and insulin resistance [49,50,51]. Moreover, studies reported
that SREBP-1c is by itself insufficient for full transcription activity of fatty acid
synthesis. In this study, we were able to segregate fatty liver disease from insulin
resistance syndromes by the inhibition of SREBP-1c, an indication that excess
triglyceride accumulation in the liver is not a cause but rather the result of insulin
resistance. These results suggest that SREBP1c is not the link between NAFLD and
insulin resistance, and that lipogenesis is not a determinant of obesity in DIO mice.
In summary, we demonstrated that the inhibition of SREBP-1 attenuated fatty
livers but not obesity or insulin resistance in DIO mice. The inhibition by
oligonucleotide antisense resembles the pharmacological treatment in humans where it
is made reversible inhibition of certain protein, after the establishment of the disease.
We suggest that SREBP-1c plays a crucial role in the regulation of enzymes lipogenic
41
protein level and triglyceride accumulation in the liver. The inhibition of SREBP-1c is
an attractive target for pharmacological therapeutics in NAFLD.
5. References
[1] Browning JD, Szczepaniak LS, Dobbins R, Nuremberg P, Horton JD, Cohen JC,
Grundy SM, Hobbs HH. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in
the United States: impact of ethnicity. Hepatol 2004;40:1387–1395.
[2] Kim JK, Fillmore JJ, Chen Y, Yu C, Moore IK, Pypaert M, Lutz EP, Kako Y,
Velez-Carrasco W, Goldberg IJ, Breslow JL, Shulman GI Tissue-specific
overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc
Natl Acad Sci U S A 2001;98:7522-7527.
[3] Samuel VT, Liu ZX, Qu X, Elder BD, Bilz S, Befroy D, Romanelli AJ, Shulman
GI. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. J
Biol Chem 2004;279:32345–32353.
[4] Herberg, L, Coleman DL. Laboratory animals exhibiting obesity and diabetes
syndromes. Metabolism 1977;26:59–99.
[5] Bray GA, York DA. Effect of estradiol on uterine weight, thyroid function food
intake, and pituitary weight of genetically obese (fatty-Zucker) and lean rats.
Physiol Rev 1979;59:719–809.
[6] Liang G, Yang, J, Horton, JD, Hammer, RE, Goldstein, JL, Brown, MS:
Diminished hepatic response to fasting/refeeding and liver X receptor agonists in
mice with selective deficiency of sterol regulatory element-binding protein-1c. J
Biol Chem 2002;277:9520-9528.
[7] Shimano H, Yahagi N, Amemiya-Kudo M, Hasty AH, Osuga J, Tamura Y,
Shionoiri F, Iizuka Y, Ohashi K, Harada K, Gotoda T, Ishibashi S, Yamada N.
Sterol regulatory elementbinding protein-1 as a key transcription factor for
nutritional induction of lipogenic enzyme genes. J Biol Chem 1999;274:35832–
35839.
[8] Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis
and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J Clin Invest
2008;3:829-838.
[9] Yokoyama C, Wang X, Briggs MR, Admon A, Wu J, Hua X, Goldstein JL, Brown
MS. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls
transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell 1993;75:187–197.
42
[10] Shimano H, Horton JD, Shimomura I, Hammer RE, Brown MS, Goldstein JL.
Isoform 1c of sterol regulatory element binding protein is less active than isoform
1a in livers of transgenic mice and in cultured cells. J Clin Invest 1997 1;99:846-
854.
[11] Horton JD, Shimomura I, Brown MS, Hammer RE, Goldstein JL, Shimano H.
Activation of cholesterol synthesis in preference to fatty acid synthesis in liver and
adipose tissue of transgenic mice overproducing sterol regulatory element-binding
protein-2. J Clin Invest 1998;101:2331-2339.
[12] Shimomura I, Shimano H, Korn BS, Bashmakov Y, Horton JD. Nuclear sterol
regulatory element-binding proteins activate genes responsible for the entire
program of unsaturated fatty acid biosynthesis in transgenic mouse liver. J Biol
Chem 1998;273:35299-306.
[13] Donnelly KL, Smith CI, Schwarzenberg SJ, Jessurun J, Boldt MD, Parks EJ.
Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with
nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest 2005; 115:1343–1351.
[14] Dobrzyn P, Dobrzyn A, Miyazaki M, Cohen P, Asilmaz E, Hardie DG, Friedman
JM, Ntambi JM. Stearoyl-CoA desaturase 1 deficiency increases fatty acid
oxidation by activating AMP-activated protein kinase in liver. Proc Natl Acad Sci
U S A 2004;17:6409-6414.
[15] Matsuda M, Korn BS, Hammer RE, Moon YA, Komuro R, Horton JD, Goldstein
JL, Brown MS, Shimomura I. SREBP cleavage-activating protein (SCAP) is
required for increased lipid synthesis in liver induced by cholesterol deprivation
and insulin elevation. Genes Dev 2001;15:1206–1216.
[16] Yang J, Goldstein JL, Hammer RE, Moon YA, Brown MS, Horton JD. Decreased
lipid synthesis in livers of mice with disrupted Site-1 protease gene. Proc Natl Acad
Sci USA 2001;98:13607–13612.
[17] Yahagi N, Shimano H, Hasty AH, Matsuzaka T, Ide T, Yoshikawa T, Amemiya-
Kudo M, Tomita S, Okazaki H, Tamura Y, Iizuka Y, Ohashi K, Osuga J, Harada K,
Gotoda T, Nagai R, Ishibashi S, Yamada N. Absence of sterol regulatory element-
binding protein-1 (SREBP-1) ameliorates fatty livers but not obesity or insulin
resistance in Lep(ob)/Lep(ob) mice. J Biol Chem 2002;277:19353-19357.
[18] De Souza CT, Araújo EP, Prada PO, Saad MJ, Boschero AC, Velloso LA. Short-
term inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-
43
1alpha expression reverses diet-induced diabetes mellitus and hepatic steatosis in
mice. Diabetologia. 2005;48:1860-18671.
[19] Cintra DE, Pauli JR, Araújo EP, Moraes JC, de Souza CT, Milanski M, Morari J,
Gambero A, Saad MJ, Velloso LA. Interleukin-10 is a protective factor against
diet-induced insulin resistance in liver. J Hepatol 2008;48:628-637.
[20] De Souza CT, Araujo EP, Bordin S, Ashimine R, Zollner RL, Boschero AC, Saad
MJ, Velloso LA. Consumption of a fat-rich diet activates a proinflammatory
response and induces insulin resistance in the hypothalamus. Endocrinol
2005;146:4189–4191.
[21] Bonora E, Manicardi V, Zavaroni I, Coscelli C, Butturini U (1987) Relationships
between insulin secretion, insulin metabolism and insulin resistance in mild glucose
intolerance. Diabet Metab 13:116–121.
[22] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem
1976;72:248–254.
[23] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 1970;227:680–685.
[24] De Souza CT, Gasparetti AL, Pereira-da-Silva M, Araújo EP, Carvalheira JB, Saad
MJ, Boschero AC, Carneiro EM, Velloso LA. Peroxisome proliferator-activated
receptor gamma coactivator-1-dependent uncoupling protein-2 expression in
pancreatic islets of rats: a novel pathway for neural control of insulin secretion.
Diabetologia 2003;11:1522-1531.
[25] Gavrilova O, Haluzik M, Matsusue K, Cutson JJ, Johnson L, Dietz KR, Nicol CJ,
Vinson C, Gonzalez FJ, Reitman ML. Liver peroxisome proliferator-activated
receptor gamma contributes to hepatic steatosis, triglyceride clearance, and
regulation of body fat mass. J Biol Chem 2003;278:34268–34276.
[26] Yu S, Matsusue K, Kashireddy P, Cao WQ, Yeldandi V, Yeldandi AV, Rao MS,
Gonzalez FJ, Reddy JK 2003 Adipocyte-specific gene expression and adipogenic
steatosis in the mouse liver due to peroxisome proliferator-activated receptorγ1
(PPARγ1) overexpression. J Biol Chem 278:498–505.
[27] Long YC, Zierath JR. AMP-activated protein kinase signaling in metabolic
regulation. J Clin Invest 2006;116:1776-1783.
[28]Bergeron, R., Previs, S.F., Cline, G.W., Perret, P., Russell, R.R., 3rd, Young, L.H.
& Shulman, G.I. Effect of 5-aminoimidazole- 4-carboxamide-1-beta-d
44
ribofuranoside infusion on in vivo glucose and lipid metabolism in lean and obese
Zucker rats. Diabetes 2001;50:1076–1082.
[29] Cool B, Zinker B, Chiou W, Kifle L, Cao N, Perham M, Dickinson R, Adler A,
Gagne G, Iyengar R, et al. Identification and characterization of a small molecule
AMPK activator that treats key components of type 2 diabetes and the metabolic
syndrome. Cell Metab 2006;3:403–416.
[30] Seo E, Park EJ, Joe Y, Kang S, Kim MS, Hong SH, Park MK, Kim DK, Koh H,
Lee HJ. Overexpression of AMPKalpha1 Ameliorates Fatty Liver in
Hyperlipidemic Diabetic Rats. Korean J Physiol Pharmacol 2009;13:449-454.
[31] Lee JH, Rhee PL, Lee JK, Lee KT, Kim JJ, Koh KC, Paik SW, Rhee JC, Choi KW.
Role of hyperinsulinemia and glucose intolerance in the pathogenesis of
nonalcoholic fatty liver in patients with normal body weight. Korean J Intern Med
1998;13:12–14.
[32] Marchesini G, Brizi M, Morselli-Labate AM, Bianchi G, Bugianesi E, McCullough
A J, Forlani G, Melchionda N. Association of nonalcoholic fatty liver disease with
insulin resistance. Am J Med 1999;107:450–455.
[33] Shulman GI. Cellular mechanisms of insulin resistance. J Clin Investig
2000;106:171–176.
[34] Bacon BR, Farahvash MJ, Janney CG, Neuschwander-Tetri BA. Nonalcoholic
steatohepatitis: an expanded clinical entity. Gastroenterol 1994;107:1103–1109.
[35] Shimomura I, Bashmakov Y, Horton JD. Increased levels of nuclear SREBP-1c
associated with fatty livers in two mouse models of diabetes mellitus. J Biol Chem
1999;274:30028–30032.
[36] Hegarty BD, Bobard A, Hainault I, Ferré P, Bossard P, Foufelle F. Distinct roles of
insulin and liver X receptor in the induction and cleavage of sterol regulatory
element-binding protein-1c. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:791–796.
[37] Jiang G, Li Z, Liu F, Ellsworth K, Dallas-Yang Q, Wu M, Ronan J, Esau C,
Murphy C, Szalkowski D, Bergeron R, Doebber T, Zhang BB. Prevention of
obesity in mice by antisense oligonucleotide inhibitors of stearoyl-CoA desaturase-
1. J Clin Invest 2005;115:1030-1038.
[38] Savage DB, Choi CS, Samuel VT, Liu ZX, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Cline
GW, Yu XX, Geisler JG, Bhanot S, Monia BP, Shulman GI. Reversal of diet-
induced hepatic steatosis and hepatic insulin resistance by antisense oligonucleotide
inhibitors of acetyl-CoA carboxylases 1 and 2. J Clin Invest 2006;116:817-824.
45
[39] Ropelle ER, Pauli JR, Prada P, Cintra DE, Rocha GZ, Moraes JC, Frederico MJ, da
Luz G, Pinho RA, Carvalheira JB, Velloso LA, Saad MA, De Souza CT. Inhibition
of hypothalamic Foxo1 expression reduced food intake in diet-induced obesity rats.
The Journal of Physiology 2009;587:2341-2351.
[40] Koteish A, Diehl AM. Animal models of steatosis. Semin Liver Dis 2001; 21: 89-
104.
[41] Ntambi JM, Miyazaki M, Stoehr JP, Lan H, Kendziorski CM, Yandell BS, Song Y,
Cohen P, Friedman JM, Attie AD. Loss of stearoyl-CoA desaturase-1 function
protects mice against adiposity. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:11482–11486.
[42] Miyazaki M, Flowers MT, Sampath H, Chu K, Otzelberger C, Liu X, Ntambi JM.
Hepatic stearoyl-CoA desaturase-1 deficiency protects mice from carbohydrate-
induced adiposity and hepatic steatosis. Cell Metab 2007;6: 484–496.
[43] Matsusue K, Haluzik M, Lambert G, Yim SH, Gavrilova O, Ward JM, Brewer Jr
B, Reitman ML, Gonzalez FJ. Liver-specific disruption of PPARγ in leptin-
deficient mice improves fatty liver but aggravates diabetic phenotypes. J Clin Invest
2003;111:737–747.
[44] Schwarz JM, Linfoot P, Dare D, Aghajanian K. Hepatic de novo lipogenesis in
normoinsulinemic and hyperinsulinemic subjects consuming high-fat, low-
carbohydrate and low-fat, high-carbohydrate isoenergetic diets. Am J Clin Nutr
2003;1:43-50.
[45] Cho CY, Koo SH, Wang Y, Callaway S, Hedrick S, Mak PA, Orth AP, Peters EC,
Saez E, Montminy M, Schultz PG, Chanda SK. Identification of the tyrosine
phosphatase PTP-MEG2 as an antagonist of hepatic insulin signaling. Cell Metab
2006;367-378.
[46] Guo Z. Intramyocellular lipids: maker vs. marker of insulin resistance. Medical
Hypotheses 2008;70:625-629.
[47] Lionetti L, Mollica MP, Lombardi A, Cavaliere G, Gifuni G, Barletta A. From
chronic overnutrition to insulin resistance: The role of fat-storing capacity and
inflammation. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2009;19:146-52.
[48]Grefhorst A, Hoekstra J, Derks TG, Ouwens DM, Baller JF, Havinga R, Havekes
LM, Romijn JA, Kuipers F. Acute hepatic steatosis in mice by blocking beta-
oxidation does not reduce insulin sensitivity of very-low-density lipoprotein
production. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005;289:G592-G958.
46
[49] Rinella ME, Green RM. The methionine-choline deficient dietary model of
steatohepatitis does not exhibit insulin resistance. J Hepatol 2004;40:47–51.
[50] Monetti M, Levin MC, Watt MJ, Sajan MP, Marmor S, Hubbard BK, Stevens RD,
Bain JR, Newgard CB, Farese RV Sr, Hevener AL, Farese RV Jr. Dissociation of
hepatic steatosis and insulin resistance in mice overexpressing DGAT in the liver.
Cell Metab 2007;6:69–78.
[51] Buettner R, Ottinger I, Scholmerich J, Bollheimer LC. Preserved direct hepatic
insulin action in rats with diet-induced hepatic steatosis. Am J Physiol Endocrinol
Metab 2004;286:E828–E833.
47
Table 1. Components of rat diet and rat chow.
IngredientsStandard chow
(g/Kg)Kcal/Kg
High fat diet
(g/Kg)Kcal/Kg
Cornstarch (Q.S.P) 397,5 1590 115,5 462
Casein 200 800 200 800
Sucrose 100 400 100 400
Dextrinated starch 132 528 132 528
Lard - - 312 2808
Soybean Oil 70 630 40 360
Cellulose 50 - 50 -
Mineral Mix 35 - 35 -
Vitamin Mix 10 - 10 -
L-cystine 3 - 3 -
Choline 2,5 - 2,5 -
Total 1000 3948 1000 5358
Table 2. Metabolic characteristics of Swiss mice after 2 months of high-fat diet (DIO), SREBP-1c/S and SREBP-1c/AS
and their age-mached controls.
Control DIO SREBP1c/S SREBP1c/AS
Serum AST (U/L)
104,27±4,36
114,13±3,28
108,99±2,61
103.81±5,54
Serum ALT (U/L)
16,1±2,81 18,06±1.99 15,82±0.98 17.51±1.55
Body weight (g)
40,19 ± 1,0 48,11± 1,57* 49,21± 1,31* 42,14 ± 1,48
Epididimal fat (g)
1,61±0,32 4,84±0,78* 4,46±0,18* 3,92±0,95
Fasting insulin (pmol/L)
200±4,00 330±1,48* 320±0,78 302±2,10
Serum Glucose (mmol/L)
6,6±0,41 16,6±1,81 15,4±1,81 16,2 ±1,81
Kitt (%/min)
4,00±0,33 2,36±0,22* 2,12±0,05* 2,45±0,24
Total serum triglycerides
(mmo/L)l)
1,12±0,02 2,82±0,24 2,542±0,60 0,98±0,12#
Liver triglycerides
(g/100g tissue)
2±0,01
25±2,32
25±1,62
5±0,51#
Groups bearing common superscripts are not significantly different. Symbols represent statistical significance:
*P<0.05 Diet-induced obesity swiss mice (DIO) versus controls. #P<0.05 Diet-induced obesity swiss mice (DIO)
versus SREBP-1c/S and SREBP-1c/AS. n= 8 per group. ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate
aminotransferase; Kitt, constant of glucose decay.
48
Legends
Fig. 1. Molecular effects of SREBP-1c/AS treatment. (A, B, C and D) Immunoblot
evaluation of SREBP-1c expression in the liver, adipose tissue and skeletal muscle
of swiss mice fed a normal diet (C) or fed a fat-rich diet treated with a every other
day dose of sense (S) or antisense (AS) SREBP-1c oligonucleotide. A Dose–
response to SREBP-1cAS; doses employed are depicted in the panel. B, C, and D
the dose of SREBP-1c/S and SREBP-1c/AS was 3.0nmol/day. Liver, adipose tissue
and skeletal muscle protein extracts were obtained after 14 days of treatment and
samples containing 0.2 mg protein were resolved by SDS-PAGE, transferred to
nitrocellulose membranes and blotted with anti-SREBP-1c or anti-β-actin
antibodies. Results are presented as means±SEM of n=4 (a, b) *p<0.05 vs. C.
Fig. 2. Effects of SREBP-1c/AS on metabolic parameters in the liver. (A, B, C and
D). The protein levels of FAS, SCD-1, PPARγ, and the [Ser79]-phosphorylation of
ACC were measured in the livers of swiss mice fed a control (C) or fat-rich diet
(DIO), and treated (DIO+SREBP-1c/AS) with the SREBP-1cAS oligonucleotide by
immunoblot (IB) of nitrocellulose membranes containing the transfers of liver total
protein extracts resolved by SDS-PAGE. Results are presented as means±SEM for
n=4 *p<0.05 vs. C.
Fig. 3. Effects of SREBP-1c/AS on metabolic and histological parameters in the
liver. (A, B and C). The protein amount of CPT1, and the [Thr172]-
phosphorylation of AMPK were measured in the livers of swiss mice fed a control
(C) or fat-rich diet (DIO), and treated (DIO +SREBP-1c/AS) with the SREBP-
1cAS oligonucleotide by immunoblot (IB) of nitrocellulose membranes containing
the transfers of liver total protein extracts resolved by SDS-PAGE. Results are
presented as means±SEM for n=6 *p<0.05 vs. C. (C), haematoxylin staining of 5.0-
μm sections of livers obtained from of swiss mice fed a control (C) or high fat diet
(DIO), and treated with vehicle or antisense oligonucleotide to SREBP-1c for 14
days.
Fig. 4. Effects of SREBP-1c/AS expression on insulin signaling in the liver of obese
mice. Analysis of insulin-induced tyrosine phosphorylation of the IRS (A, B and
C), [Ser473] phosphorylation of Akt (D) and phosphorylation of Foxo1 in the liver
(E) of SW/Uni mice fed a fat-rich diet and treated (AS) or not (C) with the
antisense oligonucleotide to SREBP-1c. Mice were treated for 14 days with a single
daily dose (3.0 nmol) of oligonucleotide (AS) or vehicle (C). Insulin (+) (200 μl,
10−6 mol/l) or a similar volume of saline (−) was injected through the cava vein,
and after fragments of liver were obtained for protein extraction. A, B and C,
samples containing 5.0 mg were used in immunoprecipitation (IP) experiments the
immunocomplexes obtained were separated by SDS-PAGE, transferred to
nitrocellulose membranes and immunoblotted (IB) with anti-pY antibodies. D and
E, 0.2 mg protein was resolved by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose
membranes and immunoblotted with anti-phospho[Ser473] Akt and anti-
phosphoFoxo1 antibodies, respectively. In all panels, the upper blots were obtained
by immunoblotting nitrocellulose transfers of 0.2 mg total protein extracts,
separated by SDS-PAGE, with anti-insulin receptor (A, B and C) or anti-Akt and
49
Foxo1 (D and E) antibodies. In all panels, the lower blots were obtained by
reprobing the original nitrocellulose transfers used for IR, Akt and Foxo1
assessment (upper blots) with anti-β-actin antibodies. Respective bands were
quantified by digital densitometry. For all experiments the results are presented as
means±SEM of n=4, *p<0.05 vs. C.
Fig. 5. Effects of SREBP-1c/AS on the inflammatory protein expression. (A, B and
C) The JNK and IKBα phosphorylation and protein amount of NF-kB were
measured in the livers of mice fed a high fat diet and treated (AS) or not (C) with
the antisense oligonucleotide to SREBP-1c for 14 days with a single daily dose (3.0
nmol), by immunoblot (IB) of nitrocellulose membranes containing the transfers of
liver total protein extracts resolved by SDS-PAGE. n=4.
Abbreviations
ACC: Acetyl CoA carboxylase
AMPK: anti-AMP-activated kinase
CPT-1: carnitine palmitoyl transferase-1
FAS: fatty acid synthase
NAFLD: non-alchoolic fatty liver disease
PPARγ: anti-peroxisome proliferator-activated receptor-γ
S1P: site-1 protease
SCAP: cleavage-activating protein SREBP
SCD-1: stearoyl-CoA desaturase-1
SREBP-1c/AS: SREBP-1c oligonucleotide antisense
SREBP-1c/S: SREBP-1c oligonucleotide sense
SREBP-1c: Sterol regulatory element-binding protein 1c
50
51
52
53
54
55
4 DISCUSSÃO
Tem sido relatado NAFLD está associada à resistência à insulina e
hiperinsulinemia, mesmo em indivíduos magros, com tolerância normal à glicose (Lee
et al., 1998). Doença do fígado gorduroso e resistência à insulina nestes pacientes
podem representar um estágio inicial da síndrome metabólica (Reaven, 1988;
Marchesini et al., 1999). Acúmulo de gordura no fígado pode ocorrer como resultado de
um aumento do depósito de gordura, aumento da síntese de gordura, redução da
oxidação de ácidos graxos, ou reduzida exportação de lipídeos sob a forma de
lipoproteínas (Shulman, 2000). Anteriormente, o fígado gorduroso era considerado
benigno. No entanto, recentemente se tornou claro que o fígado gorduroso é um
precursor da doença hepática mais avançada esteatohepatite não-alcoólica, uma
condição que pode progredir para cirrose em até 25% dos pacientes
(Lee, R.G. 1989; Bacon et al 1999). Infelizmente, a modificação do estilo de vida,
mostra ser uma dificuldade a ser atingida pelos pacientes, necessitando o
desenvolvimento de estratégias adicionais para o tratamento da esteatose hepática e
resistência à insulina. Até o momento, a maioria dos estudos tem como alvo a oxidação
de gordura, com algumas tentativas para reduzir a síntese de gordura no fígado.
Contudo, vários estudos têm mostrado que o acúmulo de gordura no fígado está
associado a níveis elevados de proteína SREBP-1c, por isso, no presente estudo, nós
analisamos o impacto farmacológico do tratamento com oligonucleotídeo antisense para
SREBP-1c em camundongos obesos induzidos por uma dieta rica em gordura, uma
intervenção que influencia principalmente a síntese de triglicerídeos.
Previamente, foi demonstrado que SREBP-1c é altamente dependente de
insulina para sua expressão e amadurecimento no fígado (Shimomura et al, 1998). A
insulina estimula a transcrição e clivagem proteolítica de SREBP-1c nos hepatócitos
56
(Foretz et al, 1999; Shimomura et al, 1999; Hegarty et al, 2005). Curiosamente,
observou-se que a forma nuclear de SREBP-1c é muito abundante em fígados de
camundongos ob/ob e AP2-SREBP-1c com lipodistrofia, modelos caracterizados por
resistência à insulina e severa esteatose hepática (Shimomura et al, 1999). Shimano e
colaboradores (1997) utilizaram a técnica de recombinação homóloga para gerar
camundongos com interrupções no gene que codifica o SREBP-1c. A síntese de ácidos
graxos foi diminuída no fígado destes animais. Contudo, a quantidade de tecido adiposo
branco não diminuiu significativamente, e os níveis de RNA mensageiro para as
enzimas lipogenicas não foram alterados em ambos os camundongos normais e
mutantes (-/-)
. Ainda assim, Matsuda e colaboradores (2001) produziram camundongos
com uma deficiência condicional de SREBP inibindo a proteína ativadora da clivagem
de SREBP (SCAP) no fígado através de recombinação genômica mediada por Cre
recombinase induzível. SCAP é uma proteína escolta regulada por esteróis que
transporta SREBP do seu sítio de síntese no retículo endoplasmático até ao seu sítio de
clivagem no complexo de Golgi. Os camundongos deficientes de SCAP mostraram uma
redução de 80% nas taxas de síntese de ácidos graxos no fígado, devido à diminuição de
RNAs mensageiros que codificam várias enzimas de biossíntese. Em outro estudo,
Yang e colaboradores (2001) interromperam o gene da protease sítio-1 (S1P) em
camundongos. S1P cliva membranas ligadas aos SREBPs, permitindo a transcrição
estimulando seus domínios a translocação para o núcleo, onde são ativados os genes que
regulam a síntese de lipídios. Desta maneira, as formas nucleares de SREBPs estão
diminuídas, bem como RNAs mensageiros para genes alvos SREBPs. Neste estudo a
biossíntese de ácidos graxos em hepatócitos está diminuída por volta de 75%. Liang e
colaboradores (2002) eliminaram o exon de codificação de SREBP-1c do genoma de
camundongos, deixando a transcrição de SREBP-1a intacta. Em uma dieta normal,
57
fígados de camundongo SREBP-1c(-/-)
manifestaram reduções em vários RNAs
mensageiros que codificam enzimas de síntese de ácidos graxos e triglicérides,
incluindo ACC e FAS. Em contraste, fígados de camundongos SREBP-1c(-/-)
apresentaram um aumento compensatório de RNA mensageiro para SREBP-2 em
hepatócitos, acompanhado pelo aumento dos níveis de RNA mensageiro para as
enzimas de biossíntese do colesterol. Yahagi e colaboradores (2002) descobriram que o
rompimento SREBP-1 causou redução significativa na expressão de vários genes
lipogenicos hepáticos e preveniu fígado gorduroso em camundongos Lepob
/Lepob
deficientes de leptina, indicando que SREBP-1 controla acúmulo de triglicerídeos no
fígado, regulando os níveis de expressão de enzimas lipogênicas. Em adição
camundongos que superexpressaram SREBP-1c, obtiveram um notável aumento na taxa
de síntese de ácidos graxos e nos níveis para os genes lipogenicos (Shimano et al, 1997;
Shimomura et al, 1998). Em outro estudo SREBP-1c induz a transcrição de quase todos
os genes que codificam enzimas envolvidas na lipogenese de novo e esterificação de
ácidos graxos em triglicerídeos (Horton et al, 2002). Como podemos observar a maioria
dos estudos citados acima em que houve inibição de SREBP-1c mostram acentuada
diminuição dos níveis de RNAs mensageiro e expressão para os genes lipogenicos. Em
nosso modelo de esteatose induzida por dieta rica em gordura foi observado que ocorre
aumento marcante da expressão da SREBP-1c no fígado. O oligonucleotídeo antisense é
um tratamento eficaz que tem sido utilizado em vários estudos (Savage et al., 2006 Yu
et al., 2005), inclusive em nosso grupo (Ropelle et al., 2009; Cintra et al., 2008; De
Souza et al; 2005) e se baseia na inibição da tradução ribossomal da proteína em
questão. O tratamento com oligonucleotídeo foi eficaz na redução da expressão SREBP-
1c, conforme demonstrado em nossos resultados por imunoblot. Além disso, este
tratamento reduz a expressão de SREBP-1c no tecido adiposo, que tem sua importância
58
devido a alta expressão de SREBP-1c neste tecido, sob a dieta rica em gordura (Fig.
1C). O tratamento de curto tempo com oligonucleotídeo antisense SREBP-1c também
reduziu a expressão de SREBP-1c no músculo esquelético, contribuindo para a resposta
ao tratamento. Da mesma forma, as enzimas de síntese de ácidos graxos tais como
ACC, FAS, SCD-1, que são diretamente ativadas por SREBP-1C no fígado, também
foram alteradas.
ACC catalisa a carboxilação do acetil-CoA para formar malonil-CoA, a qual é
uma molécula chave no controle do metabolismo dos ácidos graxos intracelulares, pois
a fosforilação da ACC a torna inativa. No presente estudo, nós observamos uma maior
fosforilação de ACC, o que demonstra sua menor atividade. Assim, nós sugerimos
apesar de não avaliarmos uma menor formação de malonil-CoA, diminuindo assim, o
substrato para a síntese de ácidos graxos saturados de cadeia longa pela FAS. No estudo
de Liang e colaboradores (2002) camundongos com deficiência seletiva de SREBP-1c
obtiveram redução marcante no RNA mensageiro de FAS, mesmo na presença de
insulina. Concordando com este achado, expressão de FAS está significativamente
diminuída no presente estudo. Além disso, a menor formação de malonil-CoA reduz a
inibição alostérica de CPT-1, aumentando a entrada de ácidos graxos na mitocôndria
para conseqüente oxidação. Em adição, em um estudo utilizando etomoxir, um inibidor
de CPT-1, observou-se inibição da oxidação dos ácidos graxos e indução da esteatose
hepática (Koteish e Diehl, 2001). Esses achados foram confirmados também em nosso
estudo.
Outra linha que sugerimos, foi que o tratamento com ASO diminuiria substratos
para a síntese de ácidos graxos, o próximo passo foi avaliar a expressão do SCD-1, uma
enzima precursora na síntese de monoacilgliceróis. Em um estudo anterior, Ntambi e
colaboradores (2002), produziram camundongos nocaute SCD-1 que tiveram diminuída
59
lipogênese de novo com o aumento da oxidação mitocondrial de lipídeos. Estes animais
foram protegidos da obesidade induzida pela dieta, fígado gorduroso e resistência à
insulina, quando alimentados com uma dieta rica em gordura e altamente calórica. A
inibição de SCD-1 por oligonucleotideo antisense no fígado e tecido adiposo de
camundongos também mostrou resultados semelhantes com camundongos nocaute
SCD-1 (Jiang et al, 2005). Em outro estudo, camundongos nocaute SCD-1 específicos
do fígado mostraram redução na expressão do gene para as principais enzimas
lipogenicas (ACC e FAS), com diminuição da lipogênese de novo, e prevenção do
aparecimento da esteatose hepática induzida por dieta (Miyazaki et al, 2007). Além
disso, a redução da atividade de SCD-1 teve uma redução acentuada no conteúdo
nuclear de dois fatores de transcrição-chave para a lipogênese, SREBP-1c e proteína
ligadora do elemento responsivo ao carboidrato (ChREBP). No presente estudo, nível
de proteína SCD-1 foi reduzido, possivelmente por redução de substrato, como malonil-
CoA, além da diminuição de sua expressão por oligonucleotidio antisense. Estudos
anteriores demonstraram que a superexpressão de PPARγ é necessária e suficiente para
induzir o fígado gorduroso (Gavrilova et al., 2003; Yu et al., 2003; Matsusue et al.,
2003). O aumento da expressão hepática de PPARγ em modelos animais de obesidade e
lipoatrofia grave são concomitantes com o desenvolvimento de esteatose. Nestas
circunstâncias, o tratamento com TZD agrava ainda mais a esteatose hepática, onde a
deleção de PPARγ diminui o armazenamento de gordura hepático. Esta relação positiva
entre PPARγ e armazenamento de gordura no fígado é suportada por estudos de Yu et
al. (2003), que mostrou que a superexpressão PPARγ1 no fígado causa esteatose
hepática e a indução da expressão do gene específico para adipócitos. Em nossos
resultados, o tratamento com oligonucleotídeo SREBP-1c reduziu a expressão de
PPARγ.
60
A superexpressão de AMPKα1 melhora fígado gorduroso em ratos
hiperlipidêmicos diabéticos (Seo et al., 2009). A função da AMPK foi confirmada pela
diminuição do conteúdo de triglicerídeos no fígado de roedores magros e obesos
durante a infusão AICAR (Bergeron et al., 2001) e um com um tratamento com ativador
direto de AMPK, A-769662 (Cool et al., 2006). O tratamento com SREBP-1c aumenta a
fosforilação da AMPK. Além disso, estudos mostram que a fosforilação da AMPK
inativa ACC (Long e Zierath, 2006; Cool, 2006; Seo et al., 2009). Estes resultados
colaboram com a resposta ao tratamento de curto prazo sobre a inibição da expressão de
SREBP-1c por oligonucleotídeo antisense, para reverter a NAFLD.
Nós acreditamos que a síntese de lipídeos de novo é fundamental para a
patologia da NAFLD (Donnelly et al, 2005). Schwarz e colaboradores (2003)
demonstraram que indivíduos obesos hiperinsulinêmicos alimentados com dieta rica em
gordura, apresentam maior lipogênese de novo quando comparados a ambos os
indivíduos magros ou obesos normoinsulinêmicos. Além disso, há a estreita relação
deste fenômeno com o depósito de lipídios hepáticos (Postic e Girard, 2008). Yahagi e
colaboradores mostraram que a ausência de SREBP-1 fortemente reprimiu as enzimas
lipogenicas no fígado em resposta a realimentação, enquanto que no tecido adiposo não
houve esta marcante alteração nas enzimas lipogenicas. Estes autores sugerem que
possam existir outros fatores de transcrição específicos para regular a lipogênese em
adipócitos sendo a contribuição de SREBP-1 de menor importância neste tecido
(Shimano et al., 1999). Neste trabalho, houve uma notável reversão da esteatose
hepática demonstrada pela histologia bem como pela redução dos triglicerídeos
hepáticos. Nós acreditamos que estes efeitos alcançados a partir da inibição da
expressão de SREBP-1c por oligonucleotídeo antisense se devem, pelo menos em parte,
pela redução do processo lipogenese de novo no tecido hepático.
61
SREBP-1c promove a síntese de ácidos graxos e deposição de lipídios. Lipídios
têm sido amplamente implicado no desenvolvimento da resistência à insulina por
mecanismos que envolvam a competição substrato, o antagonismo da insulina ou
lipotoxicidade (Schmitz-Peiffer., 2000; Lelliott e Vidal-Puig, 2004; Cho et al., 2006;
Guo., 2008; Riant et al., 2009; Lionetti et al., 2009). SREBP-1c também poderia ser
considerada como um fator responsável pela resistência à insulina. No entanto, nossos
resultados mostraram que a inibição da expressão SREBP-1c não foi acompanhada de
melhora na transdução do sinal da insulina, evidenciado por nenhuma alteração na
fosforilação de IR, Akt e Foxo1 no tecido hepático. Além disso, o tratamento com
oligonucleotídeo antisense para SREBP-1c não alterou níveis de glicose e insulina
plasmáticos. Assim, a inibição da SREBP-1c não foi suficiente para reverter à
resistência à insulina em animais obesos e resistentes à insulina. Contudo um estudo de
Liang e colaboradores (2002) em que foi feita a inibição hepática de SREBP-1c, as
conseqüências fisiológicas foram: o aumento no conteúdo de glicogênio hepático e
triglicerídeo e a marcada diminuição na hiperglicemia de camundongos diabéticos.
Estes animais, quando estavam sob condições de pós-absorção alimentar, os níveis de
RNA mensageiros para a enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) eram 3
vezes superiores à de camundongos controle. No mesmo estudo, foi suprimida a
expressão PEPCK em animais em jejum, normalmente por realimentação com uma
dieta rica em carboidratos, apesar da ausência de SREBP-1c (Liang et al, 2002). Com
estes achados, sugerimos que na ausência de SREBP-1c postula-se que exista um
aumento da expressão de PEPCK e, assim, o aumento da produção hepática de glicose,
contribuindo para altos níveis de glicose sanguíneos e o para o processo de resistência a
insulina. Esta seria uma possível explicação, pela qual em nosso trabalho, não se obteve
a reversão da hiperglicemia como sugerido em um dos objetivos do estudo. Em adição,
62
o modelo animal no estudo de Liang et al, 2002 foi diferente do modelo utilizado em
nosso estudo. Além disso, Grefhorst e colaboradores (2005) mostraram que, esteatose
hepática aguda causada pela inibição farmacológica da β-oxidação não está associada
com a redução da sensibilidade hepática à insulina, indicando que o aumento da
quantidade de gordura nas células hepáticas por si só não está causalmente relacionados
com a resistência à insulina. No mesmo estudo, esteatose hepática severa não alterou a
capacidade da insulina em suprimir a produção de lipoproteína de muito baixa
densidade (VLDL). Outra possibilidade que existe em nosso estudo para o melhor
entendimento de nenhuma alteração na via molecular da insulina seria pela não
diminuição das vias inflamatórias induzidas pela dieta rica em gordura. Estudos recentes
têm revelado a conexão entre vias pro-inflamatórias e vias controladoras do
metabolismo, especificamente, vias ativadas em resposta à insulina. As citocinas pro-
inflamatórias TNF- e IL-1 desempenham papel central nestas conexões. Agindo
através de TNFR1, TNF- ativa substratos intracelulares que participam do controle da
transcrição de genes de reposta inflamatória, modula proteínas participantes do controle
de apoptose e regula respostas de crescimento e diferenciação celular (Zhong et al.,
1998; MacEwan 2002). Um dos principais substratos intermediários da via de
sinalização do TNF- é a serina quinase JNK (Gupta, 2002). Uma vez ativada, a JNK
tem a função primária de induzir a associação dos produtos dos genes de resposta
imediata c-Jun e c-Fos, levando à formação do fator de transcrição dimérico AP-1
(Gupta, 2002). Entretanto, a atividade serina quinase de JNK pode agir sobre outros
substratos, inclusive os substratos tradicionais do receptor de insulina IRS-1 e IRS-2
(Shoelson et al., 2003). Uma vez fosforilados em serina pela JNK a possibilidade de
serem fosforilados em tirosina pelo receptor de insulina fica comprometida o que
contribui para resistência à transdução do sinal da insulina através desta via.
63
Além desta, outra via pró-inflamatória que pode levar à fosforilação em serina
de substratos do receptor de insulina é a via IKK/IκB/NF-κB (Dempsey et al., 2003).
Esta via pode ser ativada pelo TNF-, mas também por outras citocinas pró-
inflamatórias como IL-1 (Shoelson et al., 2003). A ativação de IKK promove a
dissociação do complexo IkB/NFkB. A ativação desta via resulta em uma cascata de
eventos celulares aberrantes que acaba por conduzir a insuficiência de sinalização de
insulina e resistência à insulina no fígado. Contudo em nosso estudo não houve
diminuição da expressão e atividade de ambas as vias pró-inflamatótias IKK/NF-kB e
JNK (dados não demonstrados). Desta maneira podemos postular que a resistência a
insulina hepática pela deposição de lipídeos inicia-se após a indução de vias
inflamatórias. Por isso, somente diminuindo a deposição lipídeos intrahepáticos não
seria uma maneira eficaz para a diminuição da resistência à insulina, uma vez que
iniciado o processo inflamatório, continuamente este é ativado pela obesidade.
Além disso, estudos relatam que SREBP-1c, por si só é insuficiente para a
atividade de transcrição completa da síntese de ácidos graxos. Isto se deve as distintas
funções hepáticas para SREBP-1 e SREBP-2. A superexpressão de nSREBP-1c no
fígado de camundongos transgênicos produz fígado gorduroso enriquecido com
triglicérides sem aumento do colesterol (Shimano et al., 1997). RNAs mensageiros para
enzimas de síntese de ácidos graxos e as taxas de síntese de ácidos graxos são quatro
vezes mais elevados neste tecido, enquanto que RNAs mensageiros para as enzimas de
síntese do colesterol e da taxa síntese de colesterol, não estão aumentados (Shimomura
et al., 1998). Inversamente, superexpressão de nSREBP-2 no fígado aumenta RNAs
mensageiros codificando todas as enzimas de biossíntese do colesterol; sendo mais
notável o aumento de 75 vezes no RNA mensageiro de HMG-CoA redutase (Horton et
al., 1998). RNAs mensageiros para as enzimas de síntese de ácidos graxos são
64
aumentados em menor medida, de acordo com a observação in vivo em que a taxa de
síntese de colesterol aumenta 28 vezes nestes fígados de animais transgênicos nSREBP-
2 enquanto que para a síntese de ácidos graxos, aumenta apenas quatro vezes. Os níveis
da forma nSREBP-2 hepática aumenta nestes camundongos, presumivelmente em
compensação pela perda de nSREBP-1. Como resultado, transcrição de genes de
biossíntese de colesterol aumentam, produzindo um aumento para o triplo de síntese
hepática do colesterol. Considerando que a síntese do colesterol depende quase
inteiramente de SREBPs, a síntese de ácidos graxos é apenas parcialmente dependente
destas proteínas. Isso tem sido demonstrado mais claramente em culturas de células
hepáticas, tais como em células de ovário de hamster chinês. Na ausência do
processamento de SREBP, como quando o SP-2 está deficiente, os níveis de RNAs
mensageiros codificando enzimas de biossíntese de colesterol diminuem as taxas de
síntese de colesterol quase a níveis indetectáveis, enquanto a taxa de síntese de ácidos
graxos está reduzida em apenas 30%.
Neste estudo, nós fomos capazes de desagregar a doença de fígado gorduroso
não alcoólica, da resistência à insulina através da inibição de SREBP-1c, uma indicação
de que a acumulação de excesso de triglicérides no fígado não é uma causa, mas sim o
resultado de resistência à insulina e hiperinsulinemia. Estes resultados sugerem que a
exacerbação de SREBP-1c não é a ligação entre NAFLD e resistência à insulina, e que a
lipogênese de novo não é determinante para a obesidade em camundongos obesos
induzidos por dieta. Além disso, estudos demonstram que a esteatose alcoólica parece
ter semelhanças em ambas progressão e características da patologia da NAFLD (Diehl
et al., 1988), inclusive quanto aos mecanismos moleculares (Ji et al, 2006). Na esteatose
alcoólica ocorre exacerbação da expressão de SREBP-1c (Ji et al, 2006). Em um estudo
de Tomita et al., (2005) demonstrou que AICAR um ativador de AMPK possui efeitos
65
protetores na esteatose hepática induzida por álcool em ratos e que este efeito se deve a
inibição indireta de AMPK sobre SREBP-1c. Sendo assim, sugerimos que a inibição da
expressão de SREBP-1c por oligonucleotídeo antisense reverteria a esteatose hepática
alcoólica.
Em resumo, nós demonstramos que a inibição da SREBP-1c atenua fígados
gordurosos, mas não obesidade e resistência à insulina em camundongos obesos
induzidos por dieta. Este trabalho foi feito com as condições de maior proximidade com
a patologia humana. O modelo de camundongos predispostos a desenvolver diabetes
tipo 2 induzido por dieta rica em gordura é o modelo animal mais semelhante a doença
em humanos. Da mesma forma, a inibição por oligonucleotídeo antisense assemelha-se
ao tratamento farmacológico em humanos onde é feito a inibição reversível de
determinada proteína, após o estabelecimento da doença. Nós comprovamos que
SREBP-1c, desempenha um papel crucial na regulação da expressão de genes
lipogenicos e acúmulo de triglicérides no fígado, e sua inibição é um excelente alvo
farmacológico para a fígado gorduroso. A inibição da SREBP-1c é um atraente alvo
terapêutico para o tratamento da NAFLD.
66
REFERÊNCIAS
ABU-ELHEIGA L; MATZUK MM; ABO-HASHEMA KA; WAKIL SJ. Continuous
fatty acid oxidation and reduced fat storage in mice lacking acetyl-CoA carboxylase
2. Science. 291:2613–2616. 2001.
ABU-ELHEIGA L; MATZUK MM; ABO-HASHEMA KA; WAKIL SJ. Continuous
fatty acid oxidation and reduced fat storage in mice lacking acetyl-CoA carboxylase
2. Science. 291:2613–2616. 2001.
AHMED MH; BYRNE CD. Modulation of sterol regulatory element binding proteins
(SREBPs) as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
Drug Discovery Today. 12:740–747. 2007.
ASILMAZ E; COHEN P; MIYAZAKI M; DOBRZYN P; UEKI K;
FAYZIKHODJAEVA G; SOUKAS AA; KAHN CR; NTAMBI JM; SOCCI ND;
FRIEDMAN JM. Site and mechanism of leptin action in a rodent form of
congenital lipodystrophy. The Journal Clinical Investigation. 113: 414–424.
2004.
BACON BR; FARAHVASH MJ; JANNEY CG; NEUSCHWANDER-TETRI BA.
1994. Nonalcoholic steatohepatitis: an expanded clinical entity. Gastroenterology.
107:1103–1109.
BANDSMA RHJ; GREFHORST A; VAN DIJK TH; VAN DER SLUIJS FH;
HAMMER A; REIJNGOUD D-J; KUIPERS F. Enhanced glucose cycling and
suppressed de novo synthesis of glucose-6-phosphate result in a net unchanged
hepatic glucose output in ob/ob mice. Diabetologia 47: 2022-2031. 2004.
BARTHEL A; SCHMOLL D; KRÜGER KD; BAHRENBERG G; WALTHER R;
ROTH RA; JOOST HG. Differential regulation of endogenous glucose-6-
phosphatase and phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression by the
forkhead transcription factor FKHR in H4IIE-hepatoma cells. Biochemical and
Biophysical Research Communications. 285: 897-902. 2001.
BELLENTANI S; SACCOCCIO G; MASUTTI F; GROCÈ LS; BRANDI G; SASSO F;
CRISTANINI G; TIRIBELLI C. Prevalence of and risk factors for hepatic steatosis
in northern Italy. Annals of Internal Medicine 132: 112-117. 2000.
BERGERON R; PREVIS SF; CLINE GW; PERRET P; RUSSELL RR 3RD
; YOUNG;
LH; SHULMAN GI. Effect of 5-aminoimidazole- 4-carboxamide-1-beta-d
67
ribofuranoside infusion on in vivo glucose and lipid metabolism in lean and obese
Zucker rats. Diabetes. 50:1076–1082. 2001.
BIGGS WH; MEISENHELDER J; HUNTER T; CAVENEE WK; ARDEN KC. Protein
kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged
helix transcription factor FKHR1. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 13: 7421-7426. 1999.
BRUNET A; BONNI A; ZIGMOND MJ; LIN MZ; JUO P; HU LS; ANDERSON MJ;
ARDEN KC; BLENIS J; GREENBERG ME. Akt promotes cell survival by
phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell. 6: 857-68,
1999.
CHAKRAVARTHY MV; PAN Z; ZHU Y; TORDJMAN K; SCHNEIDER JG;
COLEMAN T; TURK J; SEMENKOVICH CF. ―New‖ hepatic fat activates
PPARalpha to maintain glucose, lipid, and cholesterol homeostasis. Cell
Metabolism. 1: 309–322. 2005.
CHIRALA SS; CHANG H; MATZUK M; ABU-ELHEIGA L; MAO J; MAHON K;
FINEGOLD M; WAKIL SJ. Fatty acid synthesis is essential in embryonic
development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in
utero. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 100: 6358–6363. 2003.
CHO CY; KOO SH; WANG Y; CALLAWAY S; HEDRICK S; MAK PA; ORTH AP;
PETERS EC; SAEZ E; MONTMINY M; SCHULTZ PG; CHANDA SK.
Identification of the tyrosine phosphatase PTP-MEG2 as an antagonist of hepatic
insulin signaling. Cell Metabolism 367-378. 2006.
CINTRA DE; PAULI JR; ARAÚJO EP; MORAES JC; DE SOUZA CT; MILANSKI
M; MORARI J; GAMBERO A; SAAD MJ; VELLOSO LA. Interleukin-10 is a
protective factor against diet-induced insulin resistance in liver. Journal of
Hepatology. 48:628-637. 2008.
CLARK JM. The epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease in adults. Journal of
Clinical Gastroenterology. 40, Suppl. 1, S5–S10. 2006.
COHEN P; MIYAZAKI M; SOCCI ND; HAGGE-GREENBERG A; LIEDTKE W;
SOUKAS AA; SHARMA R; HUDGINS LC; NTAMBI JM; FRIEDMAN JM. Role
68
for stearoyl-CoA desaturase-1 in leptin-mediated weight loss. Science. 297: 240–
243. 2002.
COHEN P; NTAMBI JM; FRIEDMAN JM. Stearoyl-CoA desaturase-1 and the
metabolic syndrome. Current Drug Targets. Immune Endocrine and Metabolic
Disorders. 3:271–280. 2003.
COOL B; ZINKER B; CHIOU W; KIFLE L; CAO N; PERHAM M; DICKINSON R;
ADLER A; GAGNE G; IYENGAR R. Identification and characterization of a small
molecule AMPK activator that treats key components of type 2 diabetes and the
metabolic syndrome. Cell Metabolism. 3:403–416. 2006.
DATTA SR; BRUNET A; GREENBERG ME. Cellular survival: a play in three Akts.
Genes Development. 13: 2905-2927. 1999.
DAY CP; JAMES OF. Steatohepatitis: a tale of two "hits"? Gastroenterology 114:
842-845. 1998.
DE SOUZA CT; ARAÚJO EP; PRADA PO; SAAD MJA; BOSCHERO AC;
VELLOSO LA. Short-term inhibition of peroxisome proliferator-activated
receptor-γ coactivator-1α expression reverses diet-induced diabetes mellitus and
hepatic steatosis in mice. Diabetologia. 48: 1860–1871. 2005.
DEMPSEY PW; DOYLE SE; HE JQ; CHENG G. The signaling adaptors and pathways
activated by TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev 14:193-209. 2003.
DIEHL AM; GOODMAN Z; ISHAK KG. Alcohollike liver disease in nonalcoholics. A
clinical and histologic comparison with alcohol-induced liver injury.
Gastroenterology. 1988.
DIRAISON F; DUSSERRE E; VIDAL H; SOTHIER M; BEYLOT M. Increased
hepatic lipogenesis but decreased expression of lipogenic gene in adipose tissue in
human obesity. American Journal of Physiology. Endocrinology and
Metabolism. 282: E46–E51. 2002.
DOBRZYN A; NTAMBI JM. The role of stearoyl-CoA desaturase in body weight
regulation. Trends in Cardiovascular Medicine. 14: 77–81. 2004.
DOBRZYN P; DOBRZYN A; MIYAZAKI M; COHEN P; ASILMAZ E; HARDIE
DG; FRIEDMAN JM; NTAMBI JM. Stearoyl-CoA desaturase 1 deficiency
increases fatty acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase in liver.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 101: 6409–6414. 2004.
69
DONATH MY; HALBAN PA. Decreased beta-cell mass in diabetes: significance,
mechanisms and therapeutic implications. Diabetologia, 47 (3): 581-9, 2004.
DONNELLY KL; SMITH CI; SCHWARZENBERG SJ; JESSURUN J; BOLDT MD;
PARKS EJ. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in
patients with nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical
Investigation. 115: 1343- 1351. 2005.
DUCLUZEAU PH; PERRETTI N; LAVILLE M; ANDREELLI F; VEGA N; RIOU JP;
VIDAL H. Regulation by insulin of gene expression in human skeletal muscle and
adipose tissue. Evidence for specific defects in type 2 diabetes. Diabetes. 50: 1134–
1142. 2001.
DUNCAN EA; BROWN MS; GOLDSTEIN JL; SAKAI J. Cleavage site for sterol-
regulated protease localized to a leu-ser bond in the lumenal loop of sterol
regulatory element-binding protein-2. The Journal of Biology Chemistry. 272:
12778-12785. 1997.
DUNCAN EA; DAVÉ UP; SAKAI J; GOLDSTEIN JL; BROWN MS. Second-site
cleavage in sterol regulatory element-binding protein occurs at transmembrane
junction as determined by cysteine panning. The Journal of Biology Chemistry
273: 17801-17809. 1998.
FELIG P; WAHREN J; HENDLER R. Influence of maturity-onset diabetes on
splanchnic glucose balance after oral glucose ingestion. Diabetes. 27: 121–126.
1978.
FERRÉ P; FOUFELLE F. SREBP-1c Transcription Factor and Lipid Homeostasis:
Clinical Perspective. Hormone Reseach. 68: 72–82. 2007.
FLEISCHMANN M; IYNEDJIAN PB. Regulation of sterol regulatory-element binding
protein 1 gene expression in liver: role of insulin and protein kinase B/cAkt. The
Biochemical Journal. 349: 13–17. 2000.
FLOWERS MT; KELLER MP; CHOI Y; LAN H; KENDZIORSKI C; NTAMBI JM;
ATTIE AD. Liver gene expression analysis reveals endoplasmic reticulum stress
and metabolic dysfunction in SCD1-deficient mice fed a very low-fat diet.
Physiological Genomics. 13: 361-72. 2008.
FORETZ M; PACOT C; DUGAIL I; LEMARCHAND P; GUICHARD C; LE
LIÈPVRE X; BERTHELIER-LUBRANO C; SPIEGELMAN B; KIM JB; FERRÉ
P; FOUFELLE F. ADD1/SREBP-1c is required in the activation of hepatic
70
lipogenic gene expression by glucose. Molecular and Cellular Biology.19:3760–
3768. 1999.
GIRARD J; FOUFELLE F; FERRÉ P. Mechanisms by which carbohydrates regulate
expression of genes for glycolitic and lipogenic enzymes. Annual Review of
Nutrition 17: 325. 1997.
GOODRIDGE AG. Dietary regulation of gene expression: enzymes involved in
carbohydrate and lipid metabolism. Annual Review of Nutrition 7: 157-185. 1987.
GREFHORST A; HOEKSTRA J; DERKS TG; OUWENS DM; BALLER JF;
HAVINGA R; HAVEKES LM; ROMIJN JA; KUIPERS F. Acute hepatic steatosis
in mice by blocking beta-oxidation does not reduce insulin sensitivity of very-low-
density lipoprotein production. American Journal of Physiology Gastrointestinal
and Liver Physiology. 289:G592-598. 2005.
GUILLET-DENIAU I; MIEULET V; LE LAY S; ACHOURI Y; CARRE D; GIRARD
J; FOUFELLE F; FERRÉ P. Sterol regulatory element binding protein-1c
expression and action in rat muscles: insulin- like effects on the control of
glycolytic and lipogenic enzymes and UCP3 gene expression. Diabetes. 51: 1722–
1728. 2002.
GUO Z. Intramyocellular lipids: maker vs. marker of insulin resistance. Medical
Hypotheses. 2008;70(3):625-9.
GUPTA S. Tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in T cells from aged
humans: a role of TNFR-I and downstream signaling molecules. Exp Gerontol
37:293-299, 2002.
HEGARTY BD; BOBARD A; HAINAULT I; FERRÉ P; BOSSARD P; FOUFELLE F.
Distinct roles of insulin and liver X receptor in the induction and cleavage of
sterol regulatory element-binding protein-1c. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America.102:791–796. 2005.
HILLGARTNER FB; SALATI LM; GOODRIDGE AG. Physiological and molecular
mechanisms involved in nutritional regulation of fatty acid synthesis. Physiological
Reviews 75: 47-76. 1995.
HORTON JD; BASHMAKOV Y; SHIMOMURA I; SHIMANO H. Regulation of sterol
regulatory element binding proteins in livers of fasted and refed mice. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95:
5987-5992. 1998.
71
HORTON JD; GOLDSTEIN JL; BROWN MS. SREBPs: activators of the complete
program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of
Clinical Investigation.109: 1125-1131. 2002.
HUA X; WU J; GOLDSTEIN JL; BROWN MS; HOBBS HH. Structure of the human
gene encoding sterol regulatory element binding protein-1 (SREBF1) and
localization of SREBF1 and SREBF2 to chromosomes 17p11.2 and 22q13.
Genomics. 25: 667–673. 1995.
IRITANI N. Nutritional and hormonal regulation of lipogenic-enzyme gene expression
in rat liver. European Journal of Biochemistry/FEBS. 205: 433–442. 1992.
JANSEN PLM. Nonalcoholic steatohepatitis. The Netherlands Journal of Medicine.
62: 217-224. 2004.
JI C; CHAN C; KAPLOWITZ N. Predominant role of sterol response element binding
proteins (SREBP) lipogenic pathways in hepatic steatosis in the murine intragastric
ethanol feeding model. J Hepatol. 45:717-724. 2006.
JIANG G; LI Z; LIU F; ELLSWORTH K; DALLAS-YANG Q; WU M; RONAN J;
ESAU C; MURPHY C; SZALKOWSKI D; BERGERON R; DOEBBER T;
ZHANG BB. Prevention of obesity in mice by antisense oligonucleotide
inhibitors of stearoyl-CoA desaturase-1. The Journal of Clinical Investigation.
115: 1030–1038. 2005.
KASUGA M; ZICK Y; BLITH DL; KARLSSON FA; HÄRING HU; KAHN CR.
Insulin stimulation of phosphorylation of the beta subunit of the insulin receptor.
Formation of both phosphoserine and phosphotyrosine. The Journal of Biology
Chemistry. 17: 9891-9894. 1982.
KERNER J; DISTLER AM; MINKLER P; PARLAND W; PETERMAN SM; HOPPEL
CL. Phosphorylation of rat liver mitochondrial carnitine palmitoyltransferase-I:
effect on the kinetic properties of the enzyme. The Journal of Biology Chemistry.
39: 41104-41113. 2004.
KIM JB; WRIGHT HM; WRIGHT M; SPIEGELMAN BM. ADD1/SREBP1 activates
PPARgamma through the production of endogenous ligand. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 8: 4333-4337.
1998.
72
KOLEHMAINEN M; VIDAL H; ALHAVA E; UUSITUPA MI. Sterol regulatory
element binding protein 1c (SREBP-1c) expression in human obesity. Obesity
Research. 11: 706-712. 2001.
KOPS GJ; DE RUITER ND; DE VRIES-SMITS AM; POWELL DR; BOS JL;
BURGERING BM. Direct control of the Forkhead transcription factor AFX by
protein kinase B. Nature. 6728: 630-634. 1999.
KOTEISH A; DIEHL AM. Animal models of steatosis. Seminars in Liver Diseases
21: 89-104. 2001.
KRAEGEN EW; CLARK PW; JENKINS AB; DALEY EA; CHISHOLM DJ;
STORLIEN LH. Development of muscle insulin resistance after liver insulin
resistance in high-fat-fed rats. Diabetes. 11: 1397-1403. 1991.
LAM TK; VAN DE WERVE G; GIACCA A. Free fatty acids increase basal hepatic
glucose production and induce hepatic insulin resistance at different sites.
American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 284: E281–
329. 2003.
LAUX T; SCHWEIZER M. Dietary-induced pre-translational control of rat fatty acid
synthase. The Biochemical Journal. 266: 793–797. 1990.
LEE RG. Nonalcoholic steatohepatitis: a study of 49 patients. Hum Path. 20:594–598.
1989.
LEE SH; DOBRZYN A; DOBRZYN P; RAHMAN SM; MIYAZAKI M; NTAMBI
JM. Lack of stearoyl-CoA desaturase 1 upregulates basal thermogenesis but causes
hypothermia in a cold environment. Journal of Lipid Reseach. 45:1674–1682.
2004.
LELLIOTT C; VIDAL-PUIG AJ. Lipotoxicity, an imbalance between lipogenesis de
novo and fatty acid oxidation. International Journal of Obesity and Related
Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the study
of Obesity. 28 Suppl 4:S22-S28. 2004.
LIANG G; YANG J; HORTON JD; HAMMER RE; GOLDSTEIN JL; BROWN MS.
Diminished hepatic response to fasting/ refeeding and liver X receptor agonists in
mice with selective deficiency of sterol regulatory element-binding protein-1c. The
Journal of Biology Chemistry. 277: 9520-9528. 2002.
LIONETTI L; MOLLICA MP; LOMBARDI A; CAVALIERE G; GIFUNI G;
BARLETTA A. From chronic overnutrition to insulin resistance: The role of fat-
73
storing capacity and inflammation. Nutrition Metabolism Cardiovascular
Diseases. 2009.
LONG YC; ZIERATH JR. AMP-activated protein kinase signaling in metabolic
regulation. The Journal Clinical Investigation.116:1776-1783. 2006.
MACEWAN DJ. TNF receptor subtype signalling: differences and cellular
consequences. Cell Signal 14:477-492, 2002.
MARCHESINI G; BABINI M. Nonalcoholic fatty liver disease and the metabolic
syndrome. Minerva Cardioangiologica. 54: 229 –239. 2006.
MATSUDA M; KORN BS; HAMMER RE; MOON YA; KOMURO R; HORTON JD;
GOLDSTEIN JL; BROWN MS; SHIMOMURA I. SREBP cleavage-activating
protein (SCAP) is required for increased lipid synthesis in liver induced by
cholesterol deprivation and insulin elevation. Genes Development. 10:1206-1216.
2001.
MATSUMOTO M; OGAWA W; AKIMOTO K; INOUE H; MIYAKE K;
FURUKAWA K; HAYASHI Y; IGUCHI H; MATSUKI Y; HIRAMATSU R;
SHIMANO H; YAMADA N; OHNO S; KASUGA M; NODA T. PKClambda in
liver mediates insulin-induced SREBP-1c expression and determines both hepatic
lipid content and overall insulin sensitivity. The Journal of Clinical Investigation.
112: 935–944. 2003.
MCGARRY JD; BROWN NF. The mitochondrial carnitine palmitoyltransferase
system. From concept to molecular analysis. Eurpean Journal of
Biochemistry/FEBS. 244: 1–14. 1997.
MIYAZAKI M; DOBRZYN A; MAN WC; CHU K; SAMPATH H; KIM HJ;
NTAMBI JM. Stearoyl-CoA desaturase 1 gene expression is necessary for fructose-
mediated induction of lipogenic gene expression by sterol regulatory element-
binding protein-1c-dependent and -independent mechanisms. The Journal of
Biology Chemistry. 279: 25164–25171. 2004.
MIYAZAKI M; KIM YC; GRAY-KELLER MP; ATTIE AD; NTAMBI JM. The
biosynthesis of hepatic cholesterol esters and triglycerides is impaired in mice with
a disruption of the gene for stearoyl-CoA desaturase 1. The Journal of Biology
Chemistry. 275:30132–30138. 2000.
MIYAZAKI M; KIM YC; NTAMBI JM. Oleoyl-CoA is the major de novo product of
stearoyl-CoA desaturase 1 gene isoform and substrate for the biosynthesis of the
74
Harderian gland 1-alkyl-2,3-diacylglycerol. The Journal of Biology Chemistry.
42: 39455-39461. 2001.
MOKDAD AH; FORD ES; BOWMAN BA; DIETZ WH; VINICOR F; BALES VS;
MARKS JS. Prevalence of obesity, diabetes, and obesity-related health risk factors.
The Journal of the American Medical Association. 1:76-79. 2001.
MYERS MG JR; BACKER JM; SUN XJ; SHOELSON S; HU P; SCHLESSINGER J;
YOAKIM M; SCHAFFHAUSEN B; WHITE MF. IRS-1 activates
phosphatidylinositol 3'-kinase by associating with src homology 2 domains of p85.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 21: 10350-10354. 1992.
NICOT C; NAPAL L; RELAT J; GONZALEZ S; LLEBARIA A; WOLDEGIORGS G.
MARRERO PF, HARO D. C75 activates malonyl-CoA sensitive and insensitive
components of the CPT system. Biochemical Biophysical Research
Communications. 3: 660-664. 2004.
NOHTURFFT A; DEBOSE-BOYD RA; SCHEEK S; GOLDSTEIN JL; BROWN MS.
Sterols regulate cycling of SREBP cleaving activating protein (SCAP) between
endoplasmic reticulum and Golgi. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 96: 11235-11240. 1999.
NOHTURFFT A; YABE D; GOLDSTEIN JL; BROWN MS; ESPENSHADE PJ.
Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER
membranes. Cell 102: 315-323. 2000.
NTAMBI JM; MIYAZAKI M. Regulation of stearoyl-CoA desaturases and role in
metabolism. Progress in Lipid Research 2: 91-104. 2004.
NTAMBI JM; MIYAZAKI M; STOEHR JP; LAN H; KENDZIORSKI CM;
YANDELL BS; SONG Y; COHEN P; FRIEDMAN JM; ATTIE AD. Loss of
stearoyl-CoA desaturase-1 function protects mice against adiposity. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America. 99: 11482–
11486. 2002.
OBERKOFLER H; FUKUSHIMA N; ESTERBAUER H; KREMPLER F; PATSCH W.
Sterol regulatory element binding proteins: relationship of adipose tissue gene
expression with obesity in humans. Biochimica et Biophysica Acta. 1575: 75–81.
2002.
75
OGG S; PARADIS S; GOTTLIEB S; PATTERSON GI; LEE L; TISSENBAUM HA;
RUVKUN G. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like
metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 6654:994-6659. 1997.
OUADDA ABD; LEVY E; ZIV E; LALONDE G; SANÉ AT; DELVIN E;
ELCHEBLY M. Increased hepatic lipogenesis in insulin resistance and type 2
diabetes is associated to AMPK signaling pathway upregulation in Psammomys
obesus. Bioscience Reports. 2008.
POSTIC C; GIRARD J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis
and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. The Journal of
Clinical Investigation. 118:829-838. 2008.
RAHMAN SM; DOBRZYN A; DOBRZYN P; LEE SH; MIYAZAKI M; NTAMBI
JM. Stearoyl-CoA desaturase 1 deficiency elevates insulin-signaling components
and down-regulates protein-tyrosine phosphatase 1B in muscle. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 100: 11110–
11115. 2003.
RAHMAN SM; DOBRZYN A; LEE SH; DOBRZYN P; MIYAZAKI M; NTAMBI
JM. Stearoyl-CoA desaturase 1 deficiency increases insulin signaling and glycogen
accumulation in brown adipose tissue. American Journal of Physiology.
Endocrinology and Metabolism. 288: E381–E387. 2005.
RAWSON RB; ZELENSKI NG; NIJHAWAN D; YE J; SAKAI J; HASAN MT;
CHANG TY; BROWN MS; GOLDSTEIN JL. Complementation cloning of s2p, a
gene encoding a putative metalloprotease required for intramembrane cleavage of
SREBPs. Molecular Cell. 1: 47-57. 1997.
REAVEN GM; HOLLENBECK C; JENG CY; WU MS; CHEN YD. Measurement of
plasma glucose, free fatty acid, lactate, and insulin for 24 h in patients with type 2
diabetes. Diabetes. 37: 1020–1024. 1988.
REBRIN K; STEIL GM; GETTY L; BERGMAN RN. Free fatty acid as a link in the
regulation of hepatic glucose output by peripheral insulin. Diabetes. 44: 1038–
1045. 1995.
RIANT E; WAGET A; COGO H; ARNAL JF; BURCELIN R; GOURDY P. Estrogens
protect against high-fat diet-induced insulin resistance and glucose intolerance in
mice. Endocrinology. 2009
76
ROPELLE ER; PAULI JR; PRADA P; CINTRA DE; ROCHA GZ; MORAES JC;
FREDERICO MJ; DA LUZ G; PINHO RA; CARVALHEIRA JB; VELLOSO LA;
SAAD MA; DE SOUZA CT. Inhibition of hypothalamic Foxo1 expression reduced
food intake in diet-induced obesity rats. The Journal of Physiology. 2009.
SAAD MJ; FOLLI F; KAHN JA; KAHN CR. Modulation of insulin receptor, insulin
receptor substrate-1, and phosphatidylinositol 3-kinase in liver and muscle of
dexamethasone-treated rats. The Journal of Clinical Investigation. 4: 2065-2072.
1993.
SAKAI J; RAWSON RB; ESPENSHADE PJ; CHENG D; SEEGMILLER AC;
GOLDSTEIN JL; BROWN MS. Molecular identification of the sterol-regulated
luminal protease that cleaves SREBPs and controls lipid composition of animal
cells. Molecular Cell. 2: 505-514. 1998.
SALORANTA C; KOIVISTO V; WIDEN E; FALHOLT K; DEFRONZO RA;
HARKONEN M; GROOP L. Contribution of muscle and liver to glucose-fatty acid
cycle in humans. The American Journal of Physiology. 264: E599–605. 1993.
SALTIEL AR; KAHN CR. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid
metabolism. Nature. 414: 799-806. 2001.
SAMPATH H; MIYAZAKI M; DOBRZYN A; NTAMBI JM. Stearoyl-CoA
Desaturase-1 Mediates the Pro-lipogenic Effects of Dietary Saturated Fat. The
Journal of Biology Chemistry. 4: 2483–2493. 2007.
SAMUEL VT; LIU ZX; QU X; ELDER BD; BILZ S; BEFROY D; ROMANELLI AJ;
SHULMAN GI. Mechanism of Hepatic Insulin Resistance in Non-alcoholic Fatty
Liver Disease. The Journal of Biology Chemistry. 31: 32345–32353. 2004.
SAVAGE DB; CHOI CS; SAMUEL VT; LIU ZX; ZHANG D; WANG A; ZHANG
XM; CLINE GW; YU XX; GEISLER JG; BHANOT S; MONIA BP; SHULMAN
GI. Reversal of diet-induced hepatic steatosis and hepatic insulin resistance by
antisense oligonucleotide inhibitors of acetyl-CoA carboxylases 1 and 2. The
Journal of Clinical Investigation. 116:817-824. 2006.
SCHMITZ-PEIFFER C. Signalling aspects of insulin resistance in skeletal muscle:
mechanisms induced by lipid oversupply. Cell Signal 12: 583–594. 2000.
SCHRODER M; KAUFMAN RJ. The mammalian unfolded protein response. Annual
Review of Biochemistry 74: 739–789. 2005.
77
SCHWARZ JM; LINFOOT P; DARE D; AGHAJANIAN K. Hepatic de novo
lipogenesis in normoinsulinemic and hyperinsulinemic subjects consuming high-
fat, low-carbohydrate and low-fat, high-carbohydrate isoenergetic diets. The
American Journal of Clinical Nutrition. 1:43-50. 2003.
SEO E, PARK EJ, JOE Y, KANG S, KIM MS, HONG SH, PARK MK, KIM DK,
KOH H, LEE HJ. Overexpression of AMPKalpha1 Ameliorates Fatty Liver in
Hyperlipidemic Diabetic Rats. The Korean Journal of Physiology and
Pharmacology.13:449-454. 2009
SEWTER C; BERGER D; CONSIDINE RV; MEDINA G; ROCHFORD J; CIARALDI
T; HENRY R; DOHM L; FLIER JS; O’RAHILLY S; VIDAL-PUIG AJ. Human
obesity and type 2 diabetes are associated with alterations in SREBP1 isoform
expression that are reproduced ex vivo by tumor necrosis factor-alpha. Diabetes.
51: 1035–1041. 2002.
SHEPHERD PR; NAVÉ BT; SIDDLE K. Insulin stimulation of glycogen synthesis and
glycogen synthase activity is blocked by wortmannin and rapamycin in 3T3-L1
adipocytes: evidence for the involvement of phosphoinositide 3-kinase and p70
ribosomal protein-S6 kinase. The Biochemical Journal. 305: 25-8. 1995.
SHIMOMURA I; BASHMAKOV Y; HORTON JD. Increased levels of nuclear srebp-
1c associated with fatty livers in two mouse models of diabetes mellitus. The
Journal of Biology Chemistry. 274: 30028-30032. 1999.
SHIMOMURA I; HAMMER RE; RICHARDSON JA; IKEMOTO S; BASHMAKOV
Y; GOLDSTEIN JL; BROWN MS. Insulin resistance and diabetes mellitus in
transgenic mice expressing nuclear SREBP-1c in adipose tissue: model for
congenital generalized lipodystrophy. Genes & Development. 1998.
SHIMOMURA I; MATSUDA M; HAMMER RE; BASHMAKOV Y; BROWN MS;
GOLDSTEIN JL. Decreased IRS-2 and increased SREBP-1c lead to mixed insulin
resistance and sensitivity in livers of lipodystrophic and ob/ob mice. Molecular
Cell. 6: 77–86. 2000.
SHIMOMURA I; SHIMANO H; HORTON JD; GOLDSTEIN JL; BROWN M.
Differential expression of exons1a and 1c in mRNAs for sterol regulatory element
binding protein-1 in human and mouse organs and cultured cells. The Journal of
Clinical Investigation. 99: 838–845. 1997.
78
SHOELSON SE; LEE J; YUAN M. Inflammation and the IKK beta/I kappa B/NF-
kappa B axis in obesity- and diet-induced insulin resistance. Int J Obes Relat
Metab Disord 27 Suppl 3:S49-52, 2003.
TANIGUCHI CM; KONDO T; SAJAN M; LUO J; BRONSON R; ASANO T;
FARESE R; CANTLEY LC; KAHN CR. Divergent regulation of hepatic glucose
and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKC lambda/ zeta.
Cell Metabolism. 3: 343–353. 2006.
TANIGUCHI CM; UEKI K; KAHN CR. Complementary roles of IRS-1 and IRS-2 in
the hepatic regulation of metabolism. The Journal of Clinical Investigation. 113:
718-727. 2005.
TOMITA K; TAMIYA G; ANDO S; KITAMURA N; KOIZUMI H; KATO S; HORIE
Y; KANEKO T; AZUMA T; NAGATA H; ISHII H; HIBI T. AICAR, an AMPK
activator, has protective effects on alcohol-induced fatty liver in rats. Alcohol Clin
Exp Res. 2005.
VOLPE JJ; VAGELOS PR. Regulation of mammalian fatty-acid synthetase. The roles
carbohydrate and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America. 3:889-93. 1974.
WAKIL SJ. Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme. Biochemistry 28:
4521–4530. 1989.
WAKIL SJ; STOOPS JK; JOSHI VC. Fatty acid synthesis and its regulation. Annual
Review of Biochemistry. 52: 537–579. 1983.
WANG X; SATO R; BROWN MS; HUA X; GOLDSTEIN JL. SREBP-1, a membrane-
bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis. Cell. 77: 53–62.
1994.
WHITE MF. The IRS-signalling system: a network of docking proteins that mediate
insulin action. Molecular and Cellular Biochemistry. 182 1-2:3-11, 1998.
YABE D; KOMURO R; LIANG G; GOLDSTEIN JL; BROWN MS. Liver specific
mRNA for insig-2 down-regulated by insulin: implications for fatty acid synthesis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 100: 3155-3160. 2003.
YAHAGI N; SHIMANO H; HASTY AH; MATSUZAKA T; IDE T; YOSHIKAWA T;
AMEMIYA-KUDO M; TOMITA S; OKAZAKI H; TAMURA Y; IIZUKA Y;
OHASHI K; OSUGA J; HARADA K; GOTODA T; NAGAI R; ISHIBASHI S;
79
YAMADA N. Absence of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1)
ameliorates fatty livers but not obesity or insulin resistance in Lep(ob)/Lep(ob)
mice. The Journal of Biology Chemistry. 277:19353-19357. 2002.
YANG X; JANSSON PA; NAGAEV I; JACK MM; CARVALHO E;
SUNNERHAGEN KS; CAM MC; CUSHMAN SW; SMITH U. Evidence of
impaired adipogenesis in insulin resistance. Biochemical and Biophysical
Research Communications. 317:1045–1051. 2004.
YELLATURU CR; DENG X; CAGEN LM; WILCOX HG; PARK EA; RAGHOW R;
ELAM MB. Posttranslational processing of SREBP-1 in rat hepatocytes is
regulated by insulin and cAMP. Biochemical Biophysical Research
Communications. 332: 174-180. 2005.
YU S; MATSUSUE K; KASHIREDDY P; CAO WQ; YELDANDI V; YELDANDI
AV; RAO MS; GONZALEZ FJ; REDDY JK. Adipocyte-specific gene expression
and adipogenic steatosis in the mouse liver due to peroxisome proliferator-activated
receptorγ1 (PPARγ1) overexpression. The Journal of Biology Chemistry.
278:498–505. 2003.
YU XX; MURRAY SF; PANDEY SK; BOOTEN SL; BAO D; SONG XZ; KELLY S;
CHEN S; MCKAY R; MONIA BP; BHANOT S. Antisense oligonucleotide
reduction of DGAT2 expression improves hepatic steatosis and hyperlipidemia in
obese mice. Hepatology. 42:362-371. 2005.
ZAWADZKI JK; WOLFE RR; MOTT DM; LILLIOJA S; HOWARD BV;
BOGARDUS C. Increased rate of Cori cycle in obese subjects with type 2 diabetes
and effect of weight reduction. Diabetes. 37: 154–9. 1988.
ZHENG Y; EILERTSEN KJ; GE L; ZHANG L; SUNDBERG JP; PROUTY SM;
STENN KS; PARIMOO S. Scd1 is expressed in sebaceous glands and is disrupted
in the asebia mouse. Nature Genetics. 23:268–270. 1999.
ZHONG Z; CONNOR HD; MASON RP; LEMASTERS JJ; THURMAN RG. Ethanol,
not fat accumulation per se, increases free radical in a low-flow, reflow liver
perfusion model. Transplantation 66: 1431-1438. 1998.
80
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
