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Bomfim e Mandarim-de-LacerdaEnalapril altera a formação da matriz colágena do miocárdio de ratos

Arq Bras Cardiol2003; 81: 64-8.

Laboratório de Morfometria e Morfologia Cardiovascular, Centro Biomédico, Insti-tuto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, UERJ, Rio de Janeiro, RJ.Correspondência: Alfredo de Souza Bomfim - Rua Ministro Octávio Kelly, 221/ 904- 24220-300, Icaraí, Niterói. Email: abomfim@unisys.com.brRecebido para publicação em 2/5/02Aceito em 2/9/02

Arq Bras Cardiol, volume 81 (nº 1), 64-8, 2003

Alfredo de Souza Bomfim, Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda

Rio de Janeiro, RJ

Enalapril Altera a Formação da Matriz Colágena doMiocárdio de Ratos Espontaneamente Hipertensos

Artigo Original

A expressão quantitativa e qualitativa da matriz extrace-lular (MEC) é de importância central para a função cardíaca1.Em íntima relação com o compartimento celular, os compo-nentes da matriz extracelular são críticos na transmissão deinformações do meio extracelular para os cardiomiócitos2. Ainteração do compartimento celular com o interstício cardía-co ocorre em resposta a estímulos fisiológicos de desen-volvimento normal e em situações de sobrecarga, quando ocrescimento desproporcional dos componentes celular eextracelular é a base para a disfunção ventricular vista na hi-pertrofia miocárdica patológica3-6. Um dos elementos-chavena compreensão deste padrão heterogêneo de crescimentoe de seus efeitos deletérios na função cardíaca é a alteraçãoquantitativa e qualitativa da matriz colágena. De fato, a fi-brose intersticial, ao determinar alterações na estrutura físicado miocárdio, afeta adversamente a função ventricular mes-mo quando os cardiomiócitos hipertrofiados ainda preser-vam a capacidade de contrair5,7.

Os colágenos dos tipos I e III, produzidos por fibroblas-tos, são os componentes principais da matriz colágena no mio-cárdio8, cujo o desenvolvimento é regulado por diversos fato-res de crescimento. Diversos estudos têm apontado a angio-tensina II como um mediador do crescimento da matriz coláge-na capaz de induzir proliferação de fibroblastos e aumento dasíntese de colágeno por fibroblasto9-11. Recentemente, recep-tores AT1 e AT2 para angiotensina II foram identificados notecido cardíaco fetal chamando atenção para a possibilidade deque esse hormônio possa atuar na regulação da expressão damatriz colágena do miocárdio desde os estágios mais precocesda formação embrionária do coração12-14.

Este estudo foi concebido para testar a hipótese de quea inibição da enzima conversora da angiotensina (ECA)durante o período gestacional pode interferir na morfogê-nese do miocárdio através da atenuação do conteúdo de co-lágeno matricial.

Métodos

Esta investigação foi realizada em conformidade com oGuide For The Care Use Of Laboratory Animals publicado

Objetivo - Avaliar o efeito da inibição da enzima con-versora da angiotensina durante o desenvolvimento em-brionário sobre a matriz colágena (MC) do coração de ra-tos espontaneamente hipertensos (SHR) recém-nascidos.

Métodos - Foram estudados dois grupos de SHR(n=5 cada): tratado – gerados a partir de fêmeas SHR tra-tadas com maleato de enalapril (15mg.kg-1.dia-1) durantea gestação e não tratado – filhos de fêmeas não tratadas.Os recém-natos foram sacrificados nas primeiras 24h após onascimento e seus corações foram retirados e processadospara estudo histológico. Três campos por animal foramcapturados para análise digital assistida por computadore determinação das densidades de volume (V

v) de núcleos e

MC. As imagens foram segmentadas com o auxílio do soft-ware Image Pro Plus® 4.5.029 (Media Cybernetics).

Resultados - Não houve diferença entre o grupo tra-tado e o não tratado com relação à massa corporal, massacardíaca e relação entre massa cardíaca e massa corporal.Foram observados redução significativa da V

v[matriz] e

concomitante aumento da Vv[núcleos] no grupo tratado

em relação ao grupo não.

Conclusão - O tratamento de ratas hipertensas du-rante a gravidez com enalapril altera o conteúdo de colá-geno e a estrutura do miocárdio dos recém-nascidos.

Palavras-chave: angiotensina, enalapril, matriz colágena,ratos espontaneamente hipertensos.

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pelo US National Institutes of Health (publicação n° 85-23,revisada em 1985). Foram estudados ratos recém-natos gera-dos a partir de fêmeas espontaneamente hipertensas (SHR)mantidas no biotério do Laboratório de Morfometria e Mor-fologia Cardiovascular do Instituto de Biologia Roberto Al-cântara Gomes, Universidade do Estado de Rio de Janeiro(IBRAG/UERJ). As fêmeas gestantes foram mantidas emcaixas de polipropileno sob condições de temperatura(21±1°C) e umidade (60±10%) controladas e com ciclos dia-noite de 12h (por iluminação artificial) e de exaustão de ar(15min/h). Os animais recém-natos foram divididos em doisgrupos (n=5 cada): tratado - de fêmeas tratadas com maleatode enalapril (15mg.kg-1.dia-1) dissolvido na água de beber,iniciado durante o período de acasalamento e mantido até odia do nascimento, e não tratado. Os recém-natos foramanalisados (aferição da massa corporal e massa cardíaca embalança com 0,001g de precisão) e sacrificados nas primeiras24h de vida por decapitação.

Os corações removidos foram imediatamente fixadospor imersão em solução de Bouin por 48h em temperaturaambiente, e processados para inclusão em Paraplast plus®

(Sigma Co., St Louis). Cortes com 3mm de espessura foramcorados pelo Picro-sirius red para estudo em microscopiade luz. As lâminas foram analisadas (três campos por animal)em microscópio Leica DMRBE acoplado a câmera Kappa

sob luz polarizada e imagens digitalizadas para análise as-sistida por computador. As imagens capturadas foram seg-mentadas semi-automaticamente para a determinação dasdensidades de volume de núcleos (V

v núcleo) e MC (V

v ma-

triz) com o auxílio do software Image Pro Plus 4.5.029 (Me-dia Cybernetics).

As diferenças biométricas dos recém-natos foram tes-tadas com o teste t de Student (não pareado). Os dados

estereológicos foram analisados com o teste não paramétri-co de Kolmogorov-Smirnov. Um valor de p<0,05 foi conside-rado estatisticamente significativo15.

Resultados

Os resultados estão resumidos na tabela I e figuras 1 a 3.Não houve diferença entre o grupo tratado e o não tratadocom relação a massa corporal, massa cardíaca e relação entremassa cardíaca e massa corporal. Foram observados reduçãosignificativa da V

v[matriz] e concomitante aumento da

Vv[núcleos] no grupo tratado em relação ao grupo não tra-

tado (figs.1e2). A observação da matriz colágena em micros-copia de luz ressaltou as diferenças entre os grupos de SHRsprincipalmente com o uso da luz polarizada, que mostrou fi-bras colágenas em maior quantidade nos recém-natos do gru-po não tratado (fig. 3).

Discussão

A angiotensina II desempenha papel importante na re-

Tabela 1 - Massa corporal (Mcorp) e massa cardíaca (Mcard) avaliados nosanimais espontaneamente hipertensos tratados (T) e não tratados (NT).Resultados apresentados como média±DP. NS é não significativo, p é a pro-babilidade da diferença ser diferente de zero (teste t de Student não pareado)

Dados Grupos pNT T

Mcorp (g) 4,5 ± 0,8 4,8 ± 1,0 NSMcard (mg) 37,0 ± 2,6 39,0 ± 4,4 NSMcorp/Mcard (mg/g) 8,5 ± 1,4 8,6 ± 1,9 NS

Fig. 1 – Fotomicrografias do miocárdio de recém-natos de SHR corados com picro sirius red. A e B ilustram o miocárdio de recém-natos de mães não tratadas durante a gestação e C eD de recém-natos de mães tratadas durante a gestação com maleato de enalapril. As fotomicrografias A e C foram obtidas com campo claro, enquanto que as B e D foram obtidas com luzpolarizada. O uso da luz polarizada evidencia melhor as fibras colágenas miocárdicas nos animais não tratados (amarelo-vermelho brilhante), enquanto há nítida diminuição da matrizcolágena no recém-nato oriundo de mãe tratada (barra=200µm)

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gulação do remodelamento do miocárdio em resposta a si-tuações de sobrecarga, como na doença hipertensiva do co-ração e nas porções remanescentes de corações acometi-dos de infarto agudo do miocárdio16. Em corações hipertro-fiados, embora os cardiomiócitos preservem sua capacidadede contrair, freqüentemente o miocárdio exibe marcantesalterações funcionais17. Este aparente paradoxo é compre-endido quando analisado à luz das alterações observadasna estrutura do interstício miocárdico. A concentração e aorganização dos componentes da matriz colágena influenci-am as características físicas do tecido cardiovascular. O de-senvolvimento de insuficiência cardíaca na hipertensão ar-terial está relacionado à fibrose miocárdica em modelos ani-mais experimentais bem como em estudos com humanos18.

A composição da matriz colágena também afeta omodo como as células percebem as forças aplicadas ao teci-do. A rigidez do miocárdio influencia o grau de deformaçãoda matriz em resposta a estímulo mecânico; o alinhamentocelular determinado pela matriz define que porções da célulaserão expostas à força. Através do citoesqueleto, todas as

células, não apenas os cardiomiócitos e células musculareslisas, são capazes de gerar tensão19.

Pelo menos cinco tipos de colágeno foram encontra-dos no coração. Os mais abundantes são os colágenos ti-pos I e III que, juntos, representam cerca de 90% do coláge-no cardíaco. Os fibroblastos são as células responsáveispela síntese e degradação do colágeno. O colágeno possuialta proporção de hidroxiprolina, um aminoácido que estápresente em pequenas concentrações em um número muitorestrito de outras proteínas. O conteúdo de colágeno tissu-lar pode ser avaliado através da medida do conteúdo de hi-droxiprolina3. Por possuírem características físicas diversas,a proporção relativa dos colágenos tipos I e III influencia aspropriedades do tecido miocárdico. O colágeno tipo I formafibras espessas, de grande resistência à tensão, enquanto ocolágeno tipo III, mais maleável, forma uma fina rede de fi-brilas. Juntos, os dois tipos são responsáveis pela estrutu-ra e distensibilidade do coração normal4. Outros três tiposde colágeno foram observados no coração. Os tipos IV e Vsão constituintes da membrana basal. O colágeno tipo IV foiimplicado na regulação da angiogênese, como constituinteda membrana basal de vasos neoformados20. O tipo VI é en-contrado no interstício junto com outros colágenos fibrilarese desempenha papel na regulação do tamanho da fibra.

O sistema renina-angiotensina-aldosterona vem sen-do reconhecido como peça-chave nos eventos que culmi-nam com o desenvolvimento de fibrose miocárdica. A an-giotensina II é capaz de estimular a síntese de colágeno pe-los fibroblastos através dos receptores tipo AT1. A angio-tensina II também inibe a atividade da colagenase in vitro5.Sua ação nos fibroblastos parece ser modulada pelo cálcio.A administração de angiotensina II aumenta a concentraçãode cálcio intracelular em fibroblastos, efeito modulado emparte pela insulina21. Foi demonstrado que a fibrosemiocárdica induzida pela angitensina II e aldosterona é ate-nuada pela administração concomitante de mibefradil, umbloqueador de canais de cálcio22.

O impacto positivo da intervenção farmacológica noremodelamento miocárdico tem sido demonstrado em estu-dos clínicos com o uso de drogas inibidoras da enzima con-versora da angiotensina em humanos acometidos de infartoagudo do miocárdio23,24 e em ensaios experimentais empre-gando diversos modelos de hipertensão. Estudo clínicorecente que avaliou o efeito do lisinopril em pacienteshipertensos com diagnóstico ecocardiográfico de hipertro-fia ventricular esquerda e fibrose ventricular, evidenciadapor biópsia, demonstrou que a droga foi capaz de promoverregressão da fibrose preexistente25. De modo análogo emSHR o emprego de inibidores da enzima conversora daangiotensina resultou em atenuação e mesmo regressão dafibrose perivascular e intersticial26.

O reconhecimento da ação da angiotensina II na gêne-se da fibrose que acompanha as hipertrofias patológicas domiocárdio acenou para a possibilidade de que esse hormô-nio possa estar envolvido também na regulação da hiper-trofia fisiológica do crescimento miocárdico e do desenvol-vimento embrionário da matriz intersticial. Estudos recentes

Fig. 3 – Variação da densidade volumétrica de núcleos de cardiomiócitos em recém-na-tos de ratos espontaneamente hipertensos tratados ou não com maleato de enalaprildurante a gestação. Gráfico do tipo box-whisker apresentando a mediana e o intervalointerquartil, e os quartis superior e inferior.

Fig. 2 – Variação da densidade volumétrica da matriz extracelular miocárdica em recém-natos de ratos espontaneamente hipertensos tratados ou não com maleato de enalaprildurante a gestação. Gráfico do tipo box-whisker apresentando a mediana e o intervalointerquartil, e os quartis superior e inferior.

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Referências

têm demonstrado que receptores AT1 e AT2 para angioten-sina II se expressam muito cedo no tecido cardíaco fetal. Aalta densidade de receptores para angiotensina II no miocár-dio embrionário tem sido interpretada como indício de que aangiotensina II tem papel regulador da expressão de coláge-no durante o desenvolvimento fetal27. Esta função, a ela atri-buída, é reforçada por experimentos com ratos tratados cominibidores da enzima conversora da angiotensiva durante agestação, que resultaram em anormalidades na formação decrânio, ossos longos, vértebras e costelas28-30. Nossos re-sultados estão de acordo com este ponto de vista. No pre-sente estudo, a inibição da enzima conversora da angioten-sina pelo maleato de enalapril administrado durante o perío-do gestacional em fêmeas SHR resultou no nascimento deanimais com menor densidade de volume de matriz colágenamiocárdica em relação ao grupo não tratado. Este achadosugere que a formação da matriz colágena do coração é mo-dulada, desde os estágios mais precoces do desenvolvi-mento, pela ação da angiotensina II e também a formação docompartimento celular.

Fibras espessas de colágeno foram observadas ape-nas no grupo não tratado. No grupo tratado com enalapril,no entanto, a síntese de colágeno não foi inteiramente inibi-da. Estas observações sugerem que outros reguladorespodem estar envolvidos ou que os fibroblastos possam serativados por angiotensina II produzida localmente. Como opresente estudo não empregou o bloqueio farmacológico

dos receptores AT1 e AT2, não é possível afastar a hipótesede ação local da angiotensina II, como foi sugerido em estu-dos anteriores31,32. Embora estudos prévios empregandobloqueadores dos receptores AT1 tenham demonstrado deforma bastante consistente seu efeito no acúmulo de colá-geno fetal, não pode ser descartado um papel concomitanteda bradicinina que se acumula pela ação do enalapril. A bra-dicinina é capaz de alterar a renovação de colágeno de fibro-blastos em cultura33. Além disso, a bradicinina é um media-dor da liberação de prostaglandinas que podem estimular aexpressão no fibroblasto e a atividade da colagenase, quepode aumentar a degradação e atenuar o acúmulo de colá-geno34,35. Não foi nosso objetivo estimar o impacto funcio-nal da alteração fenotípica induzida pelo enalapril. Altera-ções induzidas muito precocemente na embriogênese po-dem, em tese, determinar alterações permanentes na estrutu-ra do coração, como malformações valvares e defeitos sep-tais, mas essa informação somente poderá ser obtida atra-vés da observação posterior do crescimento de animaismantidos vivos após o parto.

Agradecimentos

À Thatiany de Souza Marinho e Ana Claudia VianaSoares pelo apoio técnico e ao CNPq e Faperj pelo financia-mento parcial recebido.

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