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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CAMILA GONÇALVES RODRIGUES
ENGENHARIA DE PARTÍCULAS: EMULSÕES
MÚLTIPLAS PARA COENCAPSULAÇÃO
CAMPINAS
2017
CAMILA GONÇALVES RODRIGUES
ENGENHARIA DE PARTÍCULAS: EMULSÕES
MÚLTIPLAS PARA COENCAPSULAÇÃO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em
ENGENHARIA DE ALIMENTOS.
Orientador: Profa. Dra. Ana Carla Kawazoe Sato
Coorientadora: Profa. Dra Fabiana Perrechil Bonsanto
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação
defendida pela aluna Camila Gonçalves Rodrigues e
orientada pela Profa. Dra. Ana Carla Kawazoe Sato
CAMPINAS
2017
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Rodrigues, Camila Gonçalves, 1988-
R618e Engenharia de partículas : emulsões múltiplas para coencapsulação
/ Camila Gonçalves Rodrigues. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
Orientador: Ana Carla Kawazoe Sato.
Coorientador: Fabiana Perrechil Bonsanto
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
1. Liberação controlada. 2. Microencapsulação. 3. Emulsões múltiplas.
I. Sato, Ana Carla Kawazoe. II. Bonsanto, Fabiana Perrechil. III.
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de
Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Particle engineering : multiple emulsions for co-encapsulation
Palavras-chave em inglês:
Controlled release
Microencapsulation
Multiple emulsions
Área de concentração: Engenharia de Alimentos
Titulação: Mestra em Engenharia de Alimentos
Banca examinadora:
Ana Carla Kawazoe Sato [Orientador]
Ana Silvia Prata Soares
Ângelo Luiz Fazini Cavallieri
Data de defesa: 11-04-2017
Programa de Pós-Graduação: Engenharia de Alimentos
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Ana Carla Kawazoe Sato
Departamento de Engenharia de Alimentos FEA/UNICAMP - Orientadora
_________________________________________________________
Profa. Dra. Ana Silvia Prata
Departamento de Engenharia de Alimentos FEA/UNICAMP – Membro Titular
_________________________________________________________
Prof. Dr. Ângelo Luiz Fazani Cavallieri
Centro de Ciências da Natureza / UFSCAR – Membro Titular
_______________________________________________________
Profa. Dra. Carmen Silvia Fávaro Trindade
FZEA/USP – Membro Suplente
_____________________________________________________
Prof. Dr. Clássius Ferreira da Silva
Universidade federal de São Paulo – Membro Suplente
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica do aluno.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, pelo dom da vida, pela oportunidade de chegar até aqui e
pelas infinitas bênçãos em minha vida, por estar sempre comigo mesmo quando achava que
estava sozinha, quando pensava que o caminho estava difícil demais pra seguir ele sempre
esteve ao meu lado e me mostrou o caminho.
À Profª Dra Ana Carla Kawazoe Sato pela orientação deste trabalho, pelo apoio e confiança.
Obrigada também por ter enriquecido meu conhecimento, contribuindo para a minha
formação profissional, pessoal e principalmente pela compreensão nos momentos de dúvida
que não foram poucos, sendo além de professora psicóloga nas horas vagas.
À Profa. Dra. Fabiana Perrechil Bonsanto pelas sugestões e correções como coorientadora e
disponibilidade em ajudar sempre, mostrando-se sempre solicita.
Aos membros da banca examinadora, composta pelos professores Dra Ana Silvia Prata, Dr.
Ângelo Luiz, Dra. Carmen Silvia e Dr. Clássius Ferreira, pela atenção com que corrigiram
este trabalho e pelas valiosas sugestões.
À Unicamp por abrir suas portas para realização do mestrado e ao Departamento de
Engenharia de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos por disponibilizar todo o
necessário para a realização desta pesquisa.
Às funcionárias do laboratório de Engenharia de Processos (LEP) da FEAUNICAMP em
especial a Zildene e Vanessa, por todo o apoio.
Aos funcionários da Secretaria do DEA, Frederico e Reinaldo por sua disposição e atenção.
Aos meus pais, Carlos e Selma, por todo o apoio e incentivo e principalmente pelo enorme
carinho e amor incondicionais sempre presentes mesmo tão distantes fisicamente.
Ao meu irmão, minha cunhada e família, pela amizade, atenção e apoio.
Ao meu companheiro e parceiro de todas as horas, Thiago, pela paciência, conselhos,
incentivo e por todo o carinho.
Aos amigos feitos durante o mestrado, que tornaram os dias longe de casa menos dolorosos,
obrigada pelos dias de estudo, risadas, conversas atoa... Em especial Tati, Antônio, Jorge,
Aline, Paulinha, Gabi... e tantos outros que não disse aqui, sem vocês teria sido muito mais
difícil.
Às minhas meninas da casa, do primeiro e segundo ano na casa. Em especial agradeço meu
bem e as comadres, vocês foram muito importantes pra mim nessa etapa, levarei vocês
sempre comigo.
Agradecimentos
Aos amigos de Sete Lagoas, que sempre estivam presentes me dando forças em cada visita ou
mesmo por mensagens de apoio.
Ao voluntariado Boldrini 6T. Nesse tempo que participei do voluntariado me tornei uma
pessoa melhor e ver a vida com outros olhos, foi a melhor experiência da minha vida ate hoje.
Agradeço em especial as crianças que sempre tinham um sorriso lindo, independente do
momento que estavam passando, eram a minha dose de animo de todas as sextas.
Ao grupo de Reologia, por me receberem, pelas experiências trocadas, pela convivência diária
e pelas quartas de delícias kkkkk. Em especial a Tati pela parceria nas analises de
digestibilidade entre outras.
À todos do Laboratório de Engenharia de Processos, pelos conhecimentos transmitidos e pela
disponibilidade.
Aos alunos Eliza e Heitor, pela disposição, pelos momentos de tentativas, erros e aprendizado,
obrigada pela parceria, foi muito importante contar com o apoio de vocês.
À FAEPEX pelo apoio financeiro durante o mestrado e as empresas CISBRA e Danisco por
doarem o material para estudo.
A todos vocês só tenho que deixar o meu muito obrigado!!!
Resumo
RESUMO
Estudos sobre encapsulação vêm se tornando mais frequentes nos últimos anos. Mais
recentemente o foco tem sido na proteção e liberação controlada de compostos que promovem
benefícios à saúde e/ou que podem se degradar frente a condições adversas de processamento,
armazenamento ou até mesmo durante a digestão. Dentre as estruturas para encapsulação,
destacam-se as emulsões, que consistem na mistura de dois líquidos imiscíveis, com um dos
líquidos disperso no outro na forma de gotas. Emulsões múltiplas formam uma estrutura
composta do tipo água/óleo/água, que permite que cada uma dessas fases veicule um
composto diferente. Entretanto essa estrutura formada é termodinamicamente instável, o que
pode ser melhorado pelo uso de surfactantes, espessantes bem como uso de técnicas
complementares como a gelificação iônica. Assim, o objetivo deste trabalho foi produzir
microgéis para incorporação de compostos com funcionalidades distintas, a partir de emulsões
múltiplas do tipo água/óleo/água. Tanto as emulsões quanto o microgel formado foram
avaliados quanto a estabilidade, morfologia, reologia, tamanho de partícula e eficiência de
encapsulação. Foi avaliada a concentração de surfactante para a emulsão primária, sendo que
em todas as concentrações do surfactante poliglicerol polirricinoleato (PGPR) avaliadas foi
possível formar emulsão do tipo Água/Óleo. Quanto ao processo, a velocidade de
homogeneização foi o parâmetro mais relevante na produção de emulsões simples, sendo a
melhor de 14500 rpm. Também foi avaliada a concentração de surfactante da fase externa,
para produção de emulsões múltiplas do tipo Água1/Óleo/Água2. Foi avaliada também a
influência do surfactante na fase interna fixando o surfactante da fase externa em 2%. A
proporção de emulsão simples para múltipla foi avaliada em relação às propriedades
mecânicas dos macrogéis e propriedades reológicas de microgéis nas dispersões em água. A
melhor proporção foi a 3:7 mostrando-se eficiente para incorporar compostos, pois permite
adicionar mais compostos na fase interna além de produzir emulsões mais estáveis. O
microgel de emulsão múltipla mostrou-se eficiente para proteção dos compostos durante a
digestão in vitro e estabilidade frente a diferentes pH.
Palavras chave: Liberação controlada, microencapsulação, emulsões múltiplas
Abstract
ABSTRACT
Studies on encapsulation have become more frequent in recent years. More recently the focus
has been on the protection and controlled release of compounds that promote health benefits
and / or which may degrade under adverse conditions of processing, storage or even during
digestion. Emulsions are one of the structures that may be used for encapsulation, and consist
of mixing two immiscible liquids. Multiple emulsions are a composite structure of the
water/oil/water, in which different compounds may be vehiculated in each of these phases.
However, this structure is thermodynamically unstable, which can be improved by using
surfactants, thickeners and other complementary techniques such as ionic gelation. Thus the
objective of this work was to produce microgels from a multiple emulsion for the
incorporation of compounds with different functionalities. Both the emulsions and the
microgel were evaluated for stability, morphology, rheology, particle size and encapsulation
efficiency. The surfactant concentration for the primary emulsion (W1/O) was evaluated, and
at all poliglicerol polirricinoleato (PGPR) concentrations surfactants evaluated an W/O type
emulsion were produced. Considering the process, the shearing speed was the most relevant
parameter for the production of simple emulsions. The most adequate processing speed was
14500 rpm. The surfactant concentration of the external phase was also evaluated for the
production of W1/O/W2 multiple emulsions, as well as the influence of the surfactant in the
internal phase, by fixing the surfactant of the external phase to 2%. The ratio of single to
multiple emulsion was evaluated on the mechanical properties of macrogels and rheological
properties of microgels dispersed in water. The best ratio was 3:7, condition in which it was
possible to vehiculate more compounds in the internal phase, and produced more stable
emulsions. The multiple emulsion microgel proved to be effective for protection of the
compounds during in vitro digestion and stability against different pH.
Keywords: Controlled release, microencapsulation, multiple emulsions
Sumário
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO GERAL 11
1. INTRODUÇÃO 12
1.1 OBJETIVO GERAL: 13
1.2 ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO EM CAPÍTULOS 14
1.4 REFERÊNCIAS 15
CAPÍTULO 2 : REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17
2.1 SISTEMAS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS 18
2.1.1. TÉCNICAS 19
2.1.2 MICROENCAPSULAÇÃO 20
2.2 EMULSÕES 21
2.2.1 EMULSÕES MÚLTIPLAS 23
2.3 MICROGÉIS 26
2.4 MICROENCAPSULAÇÃO DE BIOATIVOS ALIMENTÍCIOS 26
2.4.1. MICROENCAPSULAÇÃO DE PROBIÓTICOS 27
2.4.2. MICROENCAPSULAÇÃO DE ÓLEOS 27
2.4.3 MICROENCAPSULAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C) 28
2.5 LIBERAÇÃO CONTROLADA 29
2.6. REFERÊNCIAS 30
CAPÍTULO 3: PRODUÇÃO DE EMULSÕES A1/O E A1/O/A2: EFEITO DE
PROCESSO E CONCENTRAÇÃO DE SURFACTANTE 39
1. INTRODUÇÃO 41
2. MATERIAL E MÉTODOS 42
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 45
Sumário
4 CONCLUSÃO 55
5- REFERÊNCIAS 56
CAPÍTULO 4: SISTEMAS GELIFICADOS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS
HIDROFÍLICOS E LIPOFÍLICOS 58
1.INTRODUÇÃO 60
2. MATERIAL E MÉTODOS 61
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 68
4 CONCLUSÃO 78
5- REFERÊNCIAS 79
CAPÍTULO 5: DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE GÉIS DE EMULSÃO MÚLTIPLA
PARA COENCAPSULAÇÃO DE VITAMINA, ÁCIDO GRAXO E PROBIÓTICO 83
1.INTRODUÇÃO 85
2. MATERIAL E MÉTODOS 87
3.RESULTADOS E DISCUSSÃO 94
4 CONCLUSÃO 109
5- REFERÊNCIAS 109
CAPÍTULO 6: DISCUSSÕES GERAIS 113
CAPÍTULO 7: CONCLUSÕES GERAIS 116
CAPÍTULO 8: REFERÊNCIAS 118
Capítulo 1
11
Capítulo 1
Introdução Geral
Capítulo 1
12
1. INTRODUÇÃO
Uma tendência em ascensão é a busca por alimentos naturais e saudáveis que,
além de atenderem aos requisitos nutricionais, possam oferecer benefícios ao consumidor. Em
contrapartida, a falta de tempo para preparo de alimentos e a saída da mulher para o mercado
de trabalho vêm alavancado a busca por alimentos industrializados. Assim o desafio da
indústria e da área acadêmica está na busca de pesquisas e tecnologias a fim de preservar
aromas, compostos bioativos, ou mesmo enriquecer produtos durante a industrialização, visto
que a maioria dos processos industriais causa degradação de compostos através da exposição
ao oxigênio ou uso de temperaturas acima de 70 °C.
Assim, a fim de elucidar problemas quanto à dificuldade de incorporação de
alguns ingredientes e aditivos em alimentos, a microencapsulação tem se mostrado uma boa
alternativa (SHAHIDI & HAN, 1993; GOUIN, 2004; FÁVARO-TRINDADE et al., 2008),
em especial em relação à incorporação de compostos que promovam benefícios à saúde do
consumidor. Processos que envolvam encapsulação de compostos hidrofóbicos têm
despertado grande interesse em diversas indústrias, tais como a alimentícia, farmacêutica e
médica, uma vez que compreendem substâncias como lipídeos bioativos, flavors,
antimicrobianos, algumas vitaminas e antioxidantes (MCCLEMENTS et al., 2007). Além dos
hidrofóbicos, os compostos hidrofílicos também são de bastante interesse na
microencapsulação. Assim, uma técnica promissora de incorporação de compostos
hidrofóbicos e hidrofílicos em uma mesma estrutura é através da produção de emulsões.
As emulsões consistem em produtos que abrangem parte de uma ampla gama de
alimentos industrializados, como base ou produto final. São formadas por líquidos imiscíveis,
estabilizados por uso de espécies químicas denominadas emulsificantes (MCCLEMENTS,
2005). As emulsões podem ser do tipo água em óleo ou óleo em água. Além disso, podem-se
formar sistemas mais complexos denominados de emulsão múltipla que pode ser do tipo
A/O/A ou O/A/O. Emulsões do tipo múltiplas apresentam aplicação em vários setores
industriais como cosméticos e fármacos, o que se deve à sua capacidade de retenção e
liberação controlada de componentes distintos. Entretanto seu uso é relativamente baixo
devido a sua instabilidade e estrutura complexa (MORAIS et al., 2009).
Apesar de alguns estudos abordarem o uso de emulsões múltiplas para veiculação
de compostos, não foram encontrados trabalhos que explorem simultaneamente as
propriedades das diferentes fases de uma emulsão deste tipo, o que permite a incorporação de
Capítulo 1
13
compostos hidrofílicos e hidrofóbicos bem como controle dos mecanismos de liberação.
Estudos referentes à influência das condições químicas das diferentes porções do trato
gastrointestinal na integridade das cápsulas e liberação de compostos têm grande importância
para o desenvolvimento de produtos encapsulados de grau alimentício, para que possam ser
utilizados no enriquecimento nutricional de alimentos, objetivando uma melhor absorção pelo
organismo. Além disso, também é importante o conhecimento em relação à liberação quanto a
variações de pH, temperatura, parâmetros de processo, armazenamento e estabilidade. As
estruturas podem liberar compostos não só na digestão mas também na matriz alimentícia,
podendo favorecer tanto estruturalmente como sensorialmente. É importante ressaltar que o
desenvolvimento de matrizes de encapsulação deve balancear a proteção frente às condições
drásticas de processamento, armazenamento e da etapa de digestão gástrica, com a liberação
em sítio adequado para garantir a biodisponibilidade dos compostos encapsulados
(ONWULATA, 2012).
Desta forma, este trabalho se faz importante, pois estudou o desenvolvimento de
emulsões múltiplas para incorporação de diferentes compostos, além dos mecanismos para
sua liberação em condições adequadas. Devido a complexidade e baixa estabilidade das
emulsões múltiplas, é uma técnica até então pouco utilizada na indústria de alimentos, que
deve ser aprimorada para aplicação em produtos com potencial funcional.
1.1 OBJETIVO GERAL:
Produzir microgéis para incorporação de compostos com diferentes
funcionalidades (propriedades hidrofílicas e lipofílicas), a partir de emulsões múltiplas do tipo
água/óleo/água.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
- Determinar o processo de produção das emulsões A/O e a influência da concentração de
surfactante na estabilidade de emulsões A/O/A, bem como influência da concentração de
surfactante na interface A/O. Para isso, diâmetro médio de gotas, microestrutura, índice de
cremeação e propriedades reológicas foram avaliados;
- Definir o processo de produção das emulsões A1/O/A2 e a influência da concentração de
surfactante e proporção de emulsão simples (A1/O) para fase externa (A2) na estabilidade de
Capítulo 1
14
emulsões A1/O/A2. Para isso, diâmetro médio de gotas, índice de cremeação, microscopia e
propriedades reológicas foram avaliados;
- Determinar a capacidade de formação de géis a partir das emulsões estudadas a fim de
produzir microgéis. Foram avaliadas propriedades mecânicas, morfologia e a estabilidade dos
microgéis produzidos, além da reologia da suspensão dos mesmos.
- Estudar a estabilidade e viabilidade de encapsular microrganismos probióticos, óleo de
linhaça e vitamina C a partir de emulsões múltiplas, avaliando a eficiência de encapsulação e
a liberação dos compostos encapsulados.
- Estudar a estabilidade e viabilidade dos microrganismos probióticos e demais ativos em
condições de digestão in vitro e variações de pH.
1.2. ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO EM CAPÍTULOS
A apresentação deste trabalho foi organizada em 6 capítulos como descrito a
seguir:
Capítulo 1: Introdução geral
Neste capítulo foi abordado de forma breve, a justificativa para o
desenvolvimento deste trabalho, bem como os objetivos do estudo.
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica
Neste capítulo são abordados aspectos teóricos quanto os sistemas em estudo, bem
como revisão de literatura recente e relevante sobre o tema deste trabalho.
Capítulo 3: PRODUÇÃO DE EMULSÕES A/O E A/O/A: EFEITO DE PROCESSO E
CONCENTRAÇÃO DE SURFACTANTE.
Primeiramente foi realizado a produção de emulsões simples A1/O, influência da
concentração de surfactante e processo para obtenção das mesmas. A partir desde estudo foi
escolhida uma formulação e determinada a condição de processo. Foi realizado estudo sobre a
obtenção de emulsões múltiplas bem como influência de surfactante na fase interna e externa.
Com os resultados obtidos escrevemos o artigo 2.
Capítulo 1
15
Capítulo 4: SISTEMAS GELIFICADOS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS
HIDROFÍLICOS E LIPOFÍLICOS
A fim de tornar a emulsão mais estável, obtida no capítulo 3, foram produzidos
macro e micro géis. Foram utilizadas técnicas de microscopia, propriedades mecânicas e
análises reológicas a fim de obter sistemas capazes de coencapsular compostos de forma
viável.
Capítulo 5: DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE GÉIS DE EMULSÃO MÚLTIPLA
PARA COENCAPSULAÇÃO DE VITAMINA, ÁCIDO GRAXO E PROBIÓTICO
Com base nos resultados obtidos nos capítulos 3 e 4 resolvemos testas a
incorporação de diferentes compostos em partículas gelificadas obtidas por gelificação das
emulsões múltiplas, foi então desenvolvido o capítulo 5. Foram avaliadas a viabilidade da
encapsulação de microrganismo probiótico, óleo de linhaça e vitamina C, cinética de
liberação dos mesmos frente à digestão in vitro e estabilidade a diferentes pH 3 e 5.
Capítulo 6: Discussões Gerais
Neste capítulo foram apresentadas as principais discussões dos trabalhos e
sugestões futuras.
Capítulo 7: Conclusões Gerais
São relatadas neste capítulo as principais conclusões sobre os resultados obtidos
durante o mestrado.
Capítulo 8: Referências Gerais
São apresentadas as referências bibliográficas utilizadas no desenvolvimento deste
trabalho.
1.3 REFERÊNCIAS
- FÁVARO-TRINDADE, C.S.; PINHO, S.C; ROCHA, G.A. Microencapsulação de
ingredientes alimentícios. Brazilian Journal of Food Technology, 11(2), 103-112, 2008.
Capítulo 1
16
- GOUIN, S. Microencapsulation: industrial appraisal of existing technologies and trends.
Food Science and Technology,15, 330-347, 2004.
- MCCLEMENTS, D. J. Food emulsions: principles, practice and techniques. CRC Press:
New York, 2005.
- MCCLEMENTS, D. J.; DECKER, E. A.; WEISS, J. Emulsion-based delivery systems for
lipophilic bioactive components. Journal of Food Science, v. 72, n. 8, p. R109- R124, 2007.
- MORAIS, J. M.; ROCHA-FILHO, P. A. e BURGESS, D.J. (2009). Influence of phase
inversion on the formation and stability of one-step multiple emulsion. Langmuir, 25, 7954-
61
- ONWULATA, C.I. Encapsulation of new active ingredients. Annual Review of Food
Science and Technology, 3, 183-202, 2012.
- SHAHIDI, F.; HAN, X.Q. Encapsulation of food ingredients. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 33(6), 501-547, 1993.
Capítulo 2
17
Capítulo 2
Revisão Bibliográfica
Capítulo 2
18
2.1 SISTEMAS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS
Existe uma tendência mundial quanto ao uso de alimentos como fonte de bem-
estar e saúde. Assim, o desenvolvimento de tecnologias para elaboração de produtos se faz
necessário, de modo a se observar a necessidade do controle da biodisponibilidade de
determinados componentes dos alimentos, além de manter sabor e aroma ao longo da vida de
prateleira. É cada vez mais relevante estabelecer relações entre alimentação e saúde
(SANGUANSRI e AUGUSTIN, 2006), e a manipulação na produção de partículas é um meio
efetivo de se alcançar tais objetivos.
O uso de micropartículas é uma excelente alternativa para introduzir compostos
com funcionalidades distintas a matrizes alimentícias, tornando-as funcionais, aumentado a
estabilidade dos compostos, além de poderem melhorar a textura e facilitar processos.
Materiais de parede são definidos na literatura como sendo revestimento, parede, invólucro e
agente encapsulante ou encapsulado (RÉ, 2000, AZEREDO, 2005). O material encapsulado
pode se apresentar incrustado ou distribuído tipo disperso, ou ainda fazer parte de um
complexo molecular dentro da partícula. Segundo Desai e Parck (2005), é possível produzir
microcápsulas contendo várias substâncias contidas em uma mesma matriz, o que é
favorecido pelo tipo de material utilizado e da técnica estabelecida bem como uma junção
entre elas.
De acordo com as propriedades físico-químicas do núcleo, a composição do
material de parede e a técnica utilizada, podem ser formados diferentes tipos de partículas
(Figura 1): partícula de núcleo irregular, esfera simples envolvida por um revestimento de
espessura uniforme (Figura 1 a), matriz contínua do material de parede constituída por várias
partículas (Figura 1 b), cápsula mononuclear de parede dupla (Figura 1 c), cápsula contendo
vários núcleos no seu interior e microesferas em multicamadas (Figura 1 d)
(GHARSALLAOUI et al., 2007).
Capítulo 2
19
Figura 1. Morfologia de micropartículas obtidas por microencapsulação: (a)
microcápsula, (b) microesfera, (c) microcápsula multicamada, (d) microesfera multicamada e
multinuclear. Adaptado de Nesterenko et al., 2013
A forma e o tamanho das partículas dependem do tipo de alimento e/ou
ingrediente que se deseja encapsular. Segundo Vyas e Khar (2006), micropartículas são
partículas cujo tamanho varia de 1 a 1000 µm, podendo ou não ser de origem biodegradável,
que podem ser classificados em três tipos, de acordo com seu tamanho: macrocápsulas ou
microesferas (>5000 μm), microcápsulas (0,2-5000 μm) e nanocápsulas (<0,2 μm) (SILVA et
al., 2003). Outros dois sistemas incluídos na classificação das micropartículas são os
lipossomas e as emulsões lipídicas, também conhecidos por microesferas lipídicas.
2.1.1 Técnicas
Há várias técnicas que podem ser utilizadas para produção de partículas aplicadas
em ingredientes alimentícios. A seleção do método varia conforme a aplicação que será dada
à microcápsula, tamanho desejado, mecanismo de liberação e propriedades físico-químicas
tanto do material ativo, quanto dos agentes encapsulantes (JACKSON e LEE, 1991; RÉ,
2000, AZEREDO, 2005).
Conforme a técnica de produção, os métodos são divididos em três grupos
principais (TIWARI et al., 2010):
Físicos: Spray drying (secagem por atomização); Spray chiling (nebulização em corrente ar
frio); Spray cooling, pulverização em banho térmico, leito fluidizado, extrusão centrífuga com
múltiplos orifícios, cocristalização, emulsificação e liofilização.
Químicos: Inclusão molecular, gelificação iônica e polimerização interfacial;
Físico-químicos: coacervação simples e complexa, separação de fases, emulsificação seguida
de evaporação do solvente, pulverização em agente formador de reticulação e envolvimento
lipossômico.
Capítulo 2
20
A fim de obter microcápsulas mais estáveis e com diferentes funcionalidades, o
estudo da associação de técnicas e características dos materiais utilizados são bastante
interessantes, além da otimização do processo.
2.1.2 Microencapsulação
Microencapsulação consiste em um processo que envolve pequenas partículas
contendo ingredientes ativos, que podem ser gás, líquido ou sólidos, empacotados dentro de
um material, geralmente polissacarídeos ou oligossacarídeos (BARROS e STRINGENTA,
2011). Tem por objetivo proteger o material das condições adversas do meio como luz,
umidade, oxigênio e interações com outros compostos, mantendo um produto estável, com
maior vida de prateleira além de possibilitar a liberação controlada do composto protegido em
condições específicas. Na última década, as definições e empregos da microencapsulação têm
se tornado mais amplo e esta técnica vem se mostrando promissora para elucidar problemas
durante a incorporação de alguns ingredientes e aditivos em alimentos além de compostos
funcionais (SHAHIDI e HAN, 1993; GOUIN, 2004; FÁVARO-TRINDADE et al., 2008).
Esta técnica vem sendo estudada desde a década de 30, entretanto sua primeira
aplicação comercial ocorreu por volta de 1950, por Green e Scheicher, a fim de produzir papel
cópia sem carbono. As microcápsulas localizadas no verso da folha, ao serem pressionadas,
liberavam a tinta presente no seu interior, atingindo a folha abaixo (ARSHADY, 1990;
DUBEY et al., 2009). Na década seguinte produtos contendo óleo de laranja foram
microencapsulados para utilização em indústria de aromas para produção de pílulas e
comprimidos na indústria farmacêutica (DZIEZAK, 1988). Em alimentos, os primeiros
estudos ocorreram nos anos 60, a fim de prevenir a oxidação e perda de compostos voláteis de
óleos essenciais bem como o controle da liberação do aroma (RÉ, 2000).
De acordo com Shahidi e Han (1993), as microcápsulas apresentam a capacidade
de modificar e melhorar a aparência e as propriedades de uma substância. Além disso, o uso
da microencapsulação na indústria alimentícia permite diminuir a reatividade do material de
núcleo com o ambiente; reduzir a velocidade de evaporação ou de transferência do material de
núcleo para o meio; melhorar a manipulação do material encapsulado; promover liberação
controlada; mascarar odor e sabor desagradáveis; e possibilitar a diluição homogênea do
material encapsulado em uma formulação alimentícia.
A fim de atender necessidades especificas, algumas características das
microcápsulas podem ser alteradas, tais como: mecanismos de liberação, composição,
Capítulo 2
21
morfologia, tamanho de partículas e custo. Conforme o processo industrial varia, existe uma
série de questões que devem ser levadas em consideração na escolha do processo de
microencapsulação: a funcionalidade final do ingrediente a ser microencapsulado; o tipo de
material de parede a ser utilizado; as condições de processamento às quais o material
microencapsulado deve resistir sem liberar seu conteúdo; a concentração ótima de material
ativo na microcápsula; o mecanismo de liberação do recheio; necessidades de tamanho de
partícula, estabilidade e o limite de custo do material microencapsulado (DESAI e PARK,
2005).
Na indústria de alimentos em especial, tem-se o interesse na incorporação de
temperos, acidulantes, vitaminas e minerais (RÉ, 2000). Além disso, a encapsulação de óleos
essenciais é interessante para prevenir a oxidação e a perda de substâncias voláteis e controle
da liberação de aroma. Microrganismos probióticos também têm sido encapsulados com o
intuito de protegê-lo durante a passagem pelo trato gastrointestinal bem como durante o
processo de industrialização (YOO et al., 1996), outro destaque se da aos aditivos alimentares
como os antioxidantes, em especial o ácido ascórbico, que se degrada facilmente quando
expostos ao ambiente sendo assim é de extrema importância a sua proteção (FONTES et al.,
2009).
A fim de encapsular esses compostos a técnica mais utilizada na indústria de
alimentos é a atomização seguida de secagem por ser relativamente barata, e simples. É um
dos métodos mais antigos de encapsulação, tendo sido usado desde a década de 1930 para
preparar os primeiros compostos de flavor encapsulados (DZIEZAK, 1988). Entretanto,
técnicas de emulsificação, têm sido empregadas no preparo de micro e nanoencapsulados
hidrofílicos e lipofílicos, tais como corantes, minerais, probióticos, antioxidantes, vitaminas,
entre outros (MCCLEMENTS et al., 2007; PERRECHIL, 2008; WALSTRA e VAN VLIET,
2010; BOUYER et al., 2012; BENICHOU et al., 2004).
2.2 EMULSÕES
Emulsões são geralmente compostas por dois líquidos imiscíveis (usualmente
água e óleo), onde um deles é disperso no outro na forma de gotas. A fase dispersa é a solução
ou substância que formarão as gotas, já a fase contínua comporá o meio. Conforme a
distribuição das fases, as emulsões podem ser classificadas como emulsão óleo em água
(O/A), quando o sistema consiste de gotas de óleo em uma fase continua aquosa como por
exemplo, sopas, leite e maionese, ou emulsão água em óleo (A/O) para um sistema de água
Capítulo 2
22
dispersa em óleo, podendo citar como exemplos manteiga e margarina. Pode existir um
sistema ainda mais complexo que são as emulsões do tipo múltiplas, onde coexistem
simultaneamente os dois tipos de emulsões citados anteriormente (DICKINSON, 1992;
MCCLEMENTS, 2005; MCCLEMENTS et al., 2007).
Esse tipo de sistema ainda pode ser classificado conforme o diâmetro das gotas
em nanoemulsões (10-100 nm), miniemulsões (100-1000 nm) e macroemulsões (0,5-100 μm)
(WINDHAB et al., 2005). Quanto menor for o tamanho das gotas dispersas, menor a
diferença de densidade entre as fases e maior a viscosidade da fase contínua, melhor e maior
será a estabilidade cinética da emulsão (MCCLEMENTS, 2011; SAMAVATI et al., 2011).
Pela segunda lei da termodinâmica, todos os sistemas tendem a retornar ao seu
estado inicial de energia mínima. No caso de emulsões, há tendência natural de diminuição da
área de contato interfacial, o que resulta na tendência das emulsões à separação de fase, bem
como outras instabilidades como floculação, coalescência, cremeação, sedimentação e
maturação de Ostwald. Os processos de instabilidade mais observados em emulsões múltiplas
são a maturação de Ostwald e a coalescência (WALSTRA e VAN VLIET, 2010; BOUYER.
et al.,2012; HERZI et al., 2014).
Para aumentar a estabilidade cinética das emulsões, torna-se necessário o uso de
emulsificantes e/ou estabilizantes. Os emulsificantes são uma espécie química que se adsorve
na superfície das gotas produzidas durante a homogeneização, formando camadas protetoras
que impedem a agregação da fase dispersa e reduzem a tensão interfacial (MCCLEMENTS et
al., 2007). Os surfactantes são classificados em duas grandes classes: de baixa massa molar
(monoglicerídeos, polissorbatos, lecitina, dentre outros) e emulsificantes macromoleculares
(usualmente proteínas, principalmente do leite, da soja e do ovo) (DICKINSON, 2003). Os
espessantes por outro lado, apresentam a propriedade de aumentar a viscosidade ou gelificar a
fase contínua das emulsões, diminuindo ou impedindo o movimento das gotas
(MCCLEMENTS et al., 2007). Podem-se citar como principais espessantes utilizados os
polissacarídeos como as gomas carragena, xantana, gelana e alginato.
As emulsões são empregadas no preparo de micro e nanoencapsulados
hidrofílicos e lipofílicos devido a sua capacidade de formar sistemas contendo fases aquosas e
oleosas. Além disso, pode ser na forma sólida, semi-sólida, ou liquida, o que permite sua
incorporação em diferentes produtos (HILL, 1996; MCCLEMENTS et al., 2007;
Capítulo 2
23
PERRECHIL, 2008; WALSTRA e VAN VLIET, 2010; BOUYER et al., 2012; JIMÉNEZ-
COLMENERO, 2013).
2.2.1 Emulsões Múltiplas
Emulsões múltiplas são sistemas complexos, formados por processos de
emulsificação seguidos, onde os dois tipos de emulsões (A/O e O/A) existem
simultaneamente, constituindo emulsões do tipo A/O/A ou O/A/O (FLORENCE;
WHITEHILL, 1982; OMOTOSHO, 1990). Emulsões A/O/A são compostas de gotas de água
dispersas em gotas de óleo, dispersas ainda em outra fase aquosa, chamada de fase aquosa
externa (BOUYER et al., 2012).
A emulsão múltipla na primeira etapa é formada uma emulsão primária, do tipo
A/O ou O/A, por homogeneização intensa (alta pressão ou alta velocidade de
agitação/mistura) (Figura 2). Para que isso ocorra faz-se necessário a utilização de um
emulsificante lipofílico ou hidrofílico, capaz estabilizar e produzir a interface água-óleo ou
óleo-água. Na etapa seguinte, procede-se a mistura da emulsão primária com outra fase
aquosa ou oleosa, a partir de homogeneização com menor velocidade de agitação. Assim, faz-
se necessária a utilização de um emulsificante lipofílico ou hidrofílico, com o objetivo de
produzir e estabilizar a nova interface. Dessa maneira, uma emulsão múltipla do tipo A1/O/A2
ou O1/A/O2 é formada. Aplicam-se processos de homogeneização mais suaves na segunda
etapa, a fim de evitar a ruptura das gotas da emulsão primária e diminuir a eficiência de
encapsulação. Enquanto que se o processo de homogeneização for muito suave, podem-se
obter sistemas altamente polidispersos, se muito intenso pode provocar a quebra das gotas
(GARTI, 1997; JIMÉNEZ-COLMENERO, 2013).
Capítulo 2
24
Figura 2. Esquema para obtenção de emulsão múltipla
Fonte: Adaptado de Pereira e Garcia-Rojas, 2015
Em virtude das características estruturais, emulsões múltiplas apresentam alto
potencial para aplicação em alimentos, com propriedades de liberação de flavor, controle de
aromas e sabores indesejáveis, possibilidade de produção de alimentos com baixo conteúdo
calórico-lipídico (diet e light), disponibilização e transporte controlado de componentes
bioativos encapsulados, além da proteção dessas substâncias frente à oxidação e ação de
certas enzimas (BENICHOU et al., 2004; MUSCHIOLIK,2007; MCCLEMENTS et al., 2007;
DICKINSON, 2011; JIMÉNEZ -COLMENERO, 2013). Na Tabela 1, pode-se observar
características gerais de formação de emulsões múltiplas empregadas na encapsulação de
componentes bioativos em alimentos.
Capítulo 2
25
Tabela 1 – Características gerais de emulsões múltiplas empregadas na encapsulação de
componentes bioativos.
Tipo Encapsulado Emulsificantes Fase
Óleo
Referências
A/O/A Mg2+
PGPR (lipofílico)
Caseinato de
sódio
(hidrofílico)
Miglyol
HERZI et
al.,2014.
O/A/O Ômega-3 Caseinato de
sódio
(hidrofílico
PGPR
(lipofílico)
Mistura de
óleos ricos
em ômega-
3
Óleo de
palma/
Óleo de
girassol
O’ DWYER
et al., 2013
A/O/A Flavonóides
(Quercetina e
Antocianina)
Arlacel P135
Citrol PG3PR
(lipofílicos)
Sinperonic
PE/F127
Brij 78
(hidrofílicos)
Óleo de
girassol
AKHTAR et
al., 2013.
A/O/A Azocaseína Caseínato de
sódio
PGPR
Óleo de
linhaça e
óleo
mineral
(GIROUX;
ROBITAILLE
; BRITTEN,
2016)
A/O/A Caroteno e
Antocianina
Span 80
Tween 20
Tween 80
Óleo de
milho
(SHI et al.,
2017)
Capítulo 2
26
Apesar dos trabalhos encontrados reportarem bons resultados para produção de
emulsões múltiplas a fim de proteger compostos bioativos, nenhum deles explorou a
veiculação de compostos diferentes nas três fases.
2.3 Microgéis
A produção de micropartículas por gelificação iônica é um processo simples e de
baixo custo que ocorre quando uma solução polimérica contendo o material de interesse a se
encapsular é gotejada sobre uma solução iônica em concentrações adequadas. O processo se
dá pela formação de microgéis com estruturas de redes tridimensionais, devido a ligações
iônicas provocadas por interações de íons de baixa massa molecular com uma solução
polimérica aquosa (SILVA et al., 2003), podendo-se obter elevada eficiência de encapsulação
e partículas de diferentes formas e tamanhos (WILLAERT e BARON, 1996).
Os microgéis podem ser utilizados como alternativa para aumentar a estabilidade
de emulsões, que é possível devido à capacidade gelificante e de retenção de água das
proteínas e de alguns polissacarídeos (WALSTRA, 2003). Além disso, o uso de microgéis são
muito atrativos, pois pode auxiliar na incorporação de materiais com baixa solubilidade em
água e ainda permite a incorporação dos microgéis em produtos com elevado teor de umidade,
o que não ocorre com partículas secas, como aquelas produzidas em spray dryer (BUREY et
al., 2008).
2.4 Microencapsulação de Bioativos Alimentícios
A indústria de alimentos apresenta um grande interesse na incorporação de
compostos bioativos, visto que a população está cada vez mais consciente dos benefícios que
trazem para a saúde como, por exemplo, auxiliar no tratamento de doenças degenerativas
(CELLI et al., 2015). No entanto, a maioria dos bioativos apresenta alta instabilidade e/ou
sabor indesejável o que impedem a sua aplicação direta nos produtos alimentícios. Assim a
microencapsulação é uma tecnologia que fornece proteção para compostos que sofrem stress
ambiental e degradação química, além de aumentar estabilidade, manipulação, eficácia e
biodisponibilidade destes compostos.
É possível encapsular diversos compostos, podendo citar pigmentos, micro-
organismos, compostos responsáveis por sabor e aroma, nutrientes, enzimas, conservantes,
acidulantes, entre outras, em cápsulas comestíveis (KAREL e LANGER, 1998).
Capítulo 2
27
Para a escolha da técnica de microencapsulação do bioativo de interesse, deve-se
levar em consideração diversos fatores como temperatura de degradação do composto, sitio de
atuação, polaridade, afinidade química com agente encapsulante, matriz alimentícia a ser
incorporada, vida de prateleira do produto bem como sua biodisponibilidade quando o intuito
é nutricional (CELLI et al., 2015; PAI et al., 2015).
2.4.1. Microencapsulação de probióticos
Probióticos são definidos como microrganismos vivos que, administrados em
quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. A ingestão de culturas
bacterianas probióticas é benéfica à saúde, por ajudar na proliferação de bactérias benéficas
ao organismo e, por meio de competição, o detrimento daquelas potencialmente prejudiciais,
contribuindo assim para o controle da microbiota intestinal e estabilização desta microbiota
após o uso de antibióticos (SAAD, 2006). Consumir regularmente probióticos pode aliviar
sintomas de intolerância a lactose, tratar problemas de diarréia associados ao uso de
antibióticos, bem como diminuir o risco de alergias na infância (TUOHY et al., 2003).
É importante ressaltar que, para atingir o efeito desejado, os microrganismos
probióticos devem chegar ao trato gastrointestinal em número suficiente, ou seja, cerca de 107
unidades formadoras de colônia (CFU/mL de produto) (SONG et al., 2013). Na passagem
pelo sistema digestivo, as condições físico-químicas variam significativamente, o que diminui
a viabilidade das bactérias probióticas (MARTEAU et al., 1997; CHÁVARRI et al., 2010).
Assim, técnicas de encapsulação ou microencapsulação vêm sendo estudadas para contornar
esse problema (SONG, 2014). Existem diversas técnicas para a microencapsulação de
probióticos, como spray-drying, spray-coating, coacervação, extrusão e emulsificação, sendo
que as duas últimas são bastante interessantes para aplicação em produtos de alta umidade
(BUREY, 2009).
2.4.2. Microencapsulação de óleos
Os óleos essenciais exercem grande influência na manutenção do corpo humano
em especial os poli-insaturados com destaque para os ômegas (ω). O ácido linolênico (ω-3)
após ingestão auxilia no desenvolvimento do cérebro e do sistema nervoso em crianças, reduz
risco de hipertensão e alguns tipos de câncer incluindo de cólon, mama e próstata, melhora a
inteligência e memória, inibe o envelhecimento, reduz problemas de constipação intestinal,
reduz risco de doenças coronárias e controla a diabetes (GOYAL et al., 2014., RODRIGUEZ-
Capítulo 2
28
LEYVA et al., 2010; CARRARO et al., 2012; SINGH et al., 2011). Entretanto são altamente
susceptíveis a ação de oxigênio e luz, o que leva à sua oxidação, com consequente produção
de substancias tóxicas.
Assim, os lipídios, especialmente aqueles que contêm alto teor de ácidos graxos
insaturados, têm sido microencapsulados visando reduzir a susceptibilidade à oxidação. O
agente encapsulante maltodextrina mostrou-se eficiente para evitar oxidação de óleo de
linhaça por spray drying (GRATTARD et al., 2002). Na encapsulação de óleo de peixe,
verificou-se o aumento da estabilidade do mesmo quando encapsulado com a mistura de
hidroxipropilmetilcelulose, maltodextrina e goma acácia, com matrizes amorfas contendo
trealose e a mistura de celulose e maltodextrina (WU et al., 2005; DRUSCH et al., 2006;
KOLANOWSKI et al., 2004).
Devido as emulsões apresentarem regiões polares e apolares são sistemas de
proteção com potencial para a encapsulação de compostos bioativos hidrofílicos e
hidrofóbicos. Asnaashari, Farhoosh e Sharif (2014) verificaram que o processo de
emulsificação teve uma maior contribuição na melhoria da estabilidade oxidativa do óleo de
peixe quando comparado com a adição de compostos antioxidantes.
2.4.3 Microencapsulação de ácido ascórbico (vitamina C)
Dentre os antioxidantes que existem, o ácido ascórbico é muito atrativo devido a
sua capacidade de doar átomos de hidrogênio, neutralizando radicais livres e de ser de origem
natural. Além disso, é um antioxidante seguro para a utilização em alimentos e não possui
limite de uso. Este ácido e seus sais neutros são utilizados como antioxidantes em frutas,
hortaliças e sucos, visando à prevenção do escurecimento e outras reações oxidativas
(FONTES et al., 2009).
Em contra partida, o ácido ascórbico é altamente solúvel em água (0,33 g/mL),
oxidativo e de natureza reativa, o que pode causar problemas de degradação e instabilidade
em ingredientes ou sistemas alimentares que os contêm, além de provocar alterações
indesejáveis na cor e sabor do alimento (CHANG et al., 2010). Assim, devido a sua natureza
instável se faz necessário a sua proteção das condições ambientes.
Segundo Lee et al. (2004), é possível estabilizar vitamina C em emulsão múltipla
tipo A/O/A. Nesse trabalho foi possível obter emulsões estáveis em um período de até oito
semanas e a vitamina estabilizada foi aplicado em produtos farmacêuticos e cosméticos.
Capítulo 2
29
Emulsão do tipo A/O também foram eficientes para proteção da vitamina e facilmente
liberada em excesso de água (NAKAI; NAKAI; MICHIDA, 2016).
2.5 Liberação Controlada
Um dos objetivos de se projetar microcápsulas é promover uma liberação gradual
de ingredientes ativos, onde o material de revestimento da cápsula/partícula pode ser
selecionado de modo a liberar o material microencapsulado em condições específicas.
Segundo Karel e Langer (1988), algumas situações requerem o controle da
difusão de componentes do alimento, em especial aditivos. Compostos responsáveis pelo
sabor e nutrientes devem ser liberados assim que consumidos, entretanto sua difusão deve ser
prevenida no processamento e na estocagem. O material de revestimento deve ser capaz de
resistir a condições ácidas no estômago, possibilitando que os ingredientes ativos possam
passar pelo estômago de maneira intacta (CHAMPAGNE et al., 2011). Há casos em que os
conservantes são necessários na superfície do produto, enquanto sua difusão para outras partes
deve ser controlada, evitando assim a diluição (GIBBS et al., 1999).
A liberação dos compostos pode se dar devido a uma série de mecanismos, que é
determinada principalmente pela morfologia das partículas e do material encapsulante. A
grande maioria dos materiais encapsulantes em alimentos são carboidratos, tipicamente
hidrofílicos e amorfos, capazes de formar estrutura vítrea por meio da remoção de água
(KAREL e LANGER, 1988). Processos que utilizam materiais encapsulantes hidrofílicos
geram uma liberação mais rápida do núcleo, enquanto o uso de compostos hidrofóbicos como
gorduras ou ceras tendem a retardar a liberação (WHORTON, 1995). A liberação pode ser
pelos mecanismos de erosão, difusão ou degradação, enquanto que se pode utilizar como
gatilhos o uso de diferentes solventes, pH, temperatura e pressão. Na prática observa-se uma
combinação de mecanismos e gatilhos de liberação (POTHAKAMURY e BARBOSA
CÁNOVAS, 1995):
Liberação controlada por difusão: a difusão é um dos mecanismos mais importantes no
processo de liberação. Neste caso a parede de uma partícula atua como uma membrana
semipermeável. Se essa parede estiver íntegra, a liberação do núcleo ocorre principalmente
por difusão (SHAHIDI e HAN;1993), onde a taxa é função das propriedades químicas do
núcleo e do material encapsulante (SHAHIDI e HAN;1993).
Capítulo 2
30
Liberação ativada por degradação: ocorre pela degradação de componentes como proteínas e
lipídios pela ação de enzimas como proteases e lipases, respectivamente (DEPYPERE .et al.,
2003).
Liberação ativada por solvente: o material de parede em contato com um solvente pode se
dissolver totalmente, liberando o núcleo rapidamente, ou se expandir, favorecendo a
liberação. Um gatilho mais comum na indústria alimentícia é a ativação pela água, já que a
maioria dos encapsulantes são hidrossolúveis (REINECCIUS, 1995).
Liberação controlada por pH: consiste nas alterações na solubilidade em água do material de
parede, consequentes de alterações no pH (REINECCIUS, 1995).
Liberação ativada por temperatura: com variações de temperatura o núcleo é liberado,
afetando o estado físico e a taxa de liberação. Há dois conceitos distintos: a liberação sensível
à temperatura, característica para materiais que se colapsam ou expandem assim que a
temperatura crítica é atingida, e a liberação ativada por fusão, envolve a fusão do material de
parede por aumento de temperatura (DEPYPERE et al., 2003).
Liberação ativada por pressão: acontece quando uma há uma pressão aplicada às paredes das
cápsulas, durante a mastigação por exemplo (DEPYPERE et al., 2003).
Mudanças nas características das partículas através da manipulação do processo, como
controle do tamanho das partículas, volume ou diâmetro dos poros ou área de superfície da
cápsula permite o controle de mecanismos de liberação controlada. Variações na composição,
modificações químicas (como ligações cruzadas) ou adição de grupos funcionais também
podem ser usadas para controlar a liberação (WHORTON, 1995).
2.6. REFERÊNCIAS
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Capítulo 3
39
Capítulo 3
PRODUÇÃO DE EMULSÕES A1/O E A1/O/A2: EFEITO DE PROCESSO E
CONCENTRAÇÃO DE SURFACTANTE
Artigo a ser submetido na revista: Journal of Food Engineering
Capítulo 3
40
PRODUÇÃO DE EMULSÕES A1/O E A1/O/A2: EFEITO DE PROCESSO E
CONCENTRAÇÃO DE SURFACTANTE
Autores: Rodrigues, C. G; Cozero, H. A.; Perrechil, F. A.; Sato, A. C. K.
RESUMO
A fim de produzir uma emulsão água em óleo (A/O) estável, foram testadas diferentes
concentrações de surfactante, tempo e velocidade de processo, e foram analisadas distribuição
de tamanho de gotas, tensão interfacial, microscopia e estabilidade das emulsões formadas.
Foi observado que o aumento na concentração de surfactante levou à redução na tensão
interfacial e ao aumento na estabilidade, mas, nas condições avaliadas, não influenciou no
tamanho de gotas. Quanto ao processo, a velocidade exerceu maior influência, apresentando
menor estabilidade na menor velocidade. Após esse estudo, foram produzidas emulsões
múltiplas, nas quais foi avaliado o efeito da concentração de surfactante da fase externa. Após
definição das condições para o preparo da emulsão secundária, foi avaliada a melhor
concentração de surfactante da fase interna na estabilidade das emulsões múltiplas Maiores
concentrações de surfactante na fase externa ocasionaram maior estabilidade e menor
tamanho de gota. Enquanto que a medida que aumentou a concentração de surfactante da fase
interna pode observar mais gotas no interior da emulsão múltipla.
Palavras chave: óleo de linhaça, tensão interfacial, emulsões múltiplas
Capítulo 3
41
1. INTRODUÇÃO
Emulsões consistem em sistemas formados por dois líquidos imiscíveis
(usualmente água e óleo), onde um é disperso no outro na forma de gotas, e podem ser
encontradas em uma vasta variedade de alimentos. A fase dispersa é a solução ou substância
que forma as gotas, enquanto que a fase contínua consiste no meio dispersante. Conforme a
distribuição das fases, as emulsões podem ser classificadas como emulsão óleo em água
(O/A), quando o sistema em questão consiste de gotas de óleo em uma fase continua aquosa
como, por exemplo, sopas, leite e maionese, ou emulsão água em óleo (A/O) para um sistema
de água dispersa em óleo, podendo citar como exemplos manteiga e margarina
(MCCLEMENTS, 2005; MCCLEMENTS et al., 2007). É possível formar também sistemas
mais complexos que são as emulsões do tipo múltipla, formadas por processos de
emulsificação seguidos, onde os dois tipos de emulsões (A/O e O/A) coexistem, constituindo
emulsões do tipo A/O/A ou O/A/O (FLORENCE; WHITEHILL, 1982; OMOTOSHO, 1990).
Produtos obtidos por sistemas deste tipo podem apresentar uma diversidade de
características sensoriais e físico-químicas em consequência dos diferentes tipos de
ingredientes e condições de processamento utilizadas. Porém, deve-se ressaltar que são
sistemas altamente instáveis. Conforme a segunda lei da termodinâmica, todos os sistemas
tendem a retornar ao estado de menor energia. Em se tratando de emulsões, há uma tendência
natural de diminuição da área de contato interfacial, o que resulta na tendência das emulsões a
separarem de fase. Dentre os mecanismos de instabilidade, pode-se citar a floculação,
coalescência, cremeação, sedimentação e maturação de Ostwald (WALSTRA e VAN VLIET,
2010). Porém, é possível aumentar a estabilidade cinética das mesmas, podendo torna-las
estáveis por longos períodos de tempo.
Tamanho de gotas dispersas menores, menor a diferença de densidade entre as
fases e maior a viscosidade da fase contínua podem melhorar a estabilidade cinética da
emulsão. A concentração do surfactante utilizado, bem como processo de obtenção, também
são fatores que influenciam a estabilidade de emulsões (MCCLEMENTS, 2011; SAMAVATI
et al., 2011). Propriedades reológicas de emulsões podem fornecer informações quanto a
estabilidade física das emulsões, essas medidas também permitem expressar os mecanismos
de instabilidade mencionados acima, além de estar diretamente relacionadas à consistência do
produto, bem como fluidez durante a retirada da embalagem e operações industriais
(CASTRO, 2003).
Capítulo 3
42
Assim, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver emulsões primárias com
diferentes concentrações de surfactante, avaliar a influência do processo de obtenção das
emulsões simples, além disso produzir emulsões múltiplas visando a influência da
concentração de surfactante tanto na fase externa quanto na fase interna.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Os ingredientes utilizados para preparo das emulsões foram água destilada, óleo
de linhaça doado pela Cisbra LTDA (Brasil), Polisorbato 80 (Tween 80) (Sigma) e
poliglicerol polirricinoleato (GRINDSTED PGPR) e alginato de sódio, doados pela Danisco
Brasil LTDA (Brasil) e demais ingredientes de grau analítico.
2.2 Preparo das Emulsões A1/O
Água destilada foi misturada às soluções oleosas contendo surfactante, utilizando-
se um homogeneizador tipo rotor estator “Ultra Turrax” modelo T10 (IKA, Alemanha), a
14500 rpm por 4 minutos. A água foi adicionada lentamente para melhor homogeneização das
emulsões. Foram avaliadas diferentes concentrações de PGPR (0,5 a 2% m/m) (Tabela 1),
mantendo relação em massa de água para óleo de 1:2 (m/m).
Tabela 1 – Relação de reagentes para produzir emulsão A1/O
Surfactante
PGPR (%
m/m)
Óleo de linhaça
(% m/m) Água (%
m/m)
0,5 66,34 33,16
1 66 33
1,5 65,7 32,8
2 65,4 32,6
Após esta etapa foi avaliada a influencia do processo na obtenção da emulsão
simples. Foram avaliados efeito de tempo e velocidade de homogeneização.
Capítulo 3
43
2.3 Preparo das Emulsões A1/O/A2
A emulsão primária, preparada conforme descrito no item 2.2, foi adicionada (i:
concentração de PGPR fixa em 1%, variando surfactante da múltipla, ii: variando
concentração de PGPR e concentração de Tween 80 fixa em 2%) com auxílio de bomba
digital (Masterflex L/S Cole-Parmer Instrument Company, EUA) a vazão de 4,5 mL/min em
soluções de 1% de alginato de sódio contendo surfactante Tween 80 em diferentes
concentrações (Tabela 2), sob agitação magnética a 500 rpm, durante 1 hora. A solução de
alginato foi preparada em agitador magnético a 500 rpm por 12 horas. A proporção de
emulsão simples para a solução de alginato foi mantida em 1:10 (m/m).
Tabela 2 – Relação de reagentes para produzir emulsão A1/O/A2
Surfactante
Tween 80 (%
m/m)
Solução de
alginato 1 % (%
m/m)
A1/O (%
m/m)
0,5 90,45 9,05
1 90 9
1,5 89,55 8,95
2 89,09 8,91
2.4 Distribuição de tamanho de gotas
A distribuição de tamanho de gotas das emulsões simples (A1/O) foi avaliada por
Espalhamento de Luz Dinâmico a 173° em um equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern
Instruments, Reino Unido). Para as emulsões múltiplas (A1/O/A2) a distribuição de tamanho
de gotas foi determinada com o auxílio de um Dispersor de Laser Mastersizer 2000 – versão
5.60 (Malvern Instruments, Reino Unido). O tamanho de gota das emulsões múltiplas foi
expresso como diâmetro médio volumétrico (D [4,3]) e polidispersidade.
2.5 Índice de Estabilidade
As amostras de emulsões foram colocadas em provetas de 25 mL e o índice de
estabilidade foi determinado pela relação entre o volume da fase emulsionada em relação ao
Capítulo 3
44
total da amostra, dada pela Equação 1 ao longo do tempo. De acordo com a equação, quanto
maior o valor de C, maior a estabilidade do sistema (KRISHNA et al., 1998).
C = 100 x (Vs/Vt) (1)
Onde Vt corresponde ao volume total da amostra (mL); Vs volume da fase
emulsionada (mL)
2.6 Análise de Microscopia ótica
As emulsões foram visualizadas através de microscopia ótica, com auxílio de um
microscópio óptico Carl Zeiss Modelo Axio Visio (Zeiss, Alemanha), com objetiva de 100x.
2.7 Tipo de emulsão
Para verificar o tipo de emulsão formada (A/O ou O/A), foi realizado teste de
diluição e microscopia confocal de fluorescência. O teste de diluição é um método rápido para
determinar tipo de emulsão formada, onde é adicionada água à emulsão em partes iguais, e se
observa se ocorre separação de fase ou não (PRISTA et al., 1996). A separação de fase indica
que a fase continua é óleo sendo então uma emulsão do tipo A/O, enquanto se a separação de
fases não é observada, é um indício que a fase continua é água, ou seja, a emulsão formada é
do tipo O/A. Para análise de microscopia de fluorescência, o corante vermelho do nilo foi
adicionado às amostras de maneira a marcar as moléculas de óleo presentes. As amostras
foram examinadas utilizando um confocal Zeiss LSM 780-NLO em um microscópio Axio
Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Alemanha) com uma objetiva de 100x. As imagens foram
obtidas utilizando laser de 552 e 636 nm para excitação e emissão respectivamente do
vermelho do nilo.
2.8 Tensão Interfacial
A tensão interfacial entre o óleo de linhaça contendo diferentes concentrações de
PGPR e água foi medida a 25 ºC usando um tensiômetro Tracker-S (Teclis, França),
utilizando a metodologia de gota pendente. O volume inicial da gota foi de 6 µL.
2.9 Medidas reológicas
As propriedades reológicas da emulsão primária foram avaliadas utilizando
reômetro modelo AR 1500 ex (TA INSTRUMENTS) com geometria de cone placa (40 mm)
Capítulo 3
45
2° e 2 mm de GAP. Curvas de escoamento foram obtidas por um programa de passos com
taxa de deformação variando entre 0 e 300 s-1
. Todas as medições foram realizadas a 25 °C.
2.10 Análise dos Dados
Todos os resultados foram analisados por meio da análise de variância (ANOVA)
e as diferenças entre as médias, pelo teste de Tukey, utilizando-se o programa estatístico
SISVAR versão 5.6, a 5% de significância (FERREIRA, 2011). Foram feitas duplicatas de
processo e triplicatas de cada análise.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Tipo de emulsão e influência da concentração de surfactante
A fim de confirmar o tipo de emulsão formada, a emulsão produzida com 1% de
PGPR foi analisada por microscopia confocal (Figura 1A), onde o óleo de linhaça aparece
com a cor vermelha, enquanto as regiões pretas indicam a presença do composto hidrofílico,
no caso água. As imagens revelaram que a emulsão formada se trata de uma emulsão do tipo
A/O, o que pode também ser confirmado pelo teste de diluição (Figura 1B), onde ao adicionar
água à emulsão observou-se separação de fases indicando assim que a fase contínua se trata
de óleo.
Figura 1 – A) Microscopia confocal. B) Teste de diluição.
Foi avaliado o efeito da concentração de surfactante na tensão interfacial entre as
fases óleo e água e, depois das emulsões prontas, avaliou-se a distribuição de tamanho de
gotas, estabilidade e comportamento reológico do sistema formado logo após o preparo das
emulsões simples A/O.
Todas as emulsões, independente da concentração de surfactante avaliada,
Capítulo 3
46
apresentaram distribuição monomodal e tamanho de gotas similar (Figura 2) com leve
redução das gotas a medida que aumenta a concentração de surfactante, como pode observar
pela microscopia. Entretanto foi observada influência quanto à estabilidade e tensão
interfacial, que tenderam a aumentar e diminuir, respectivamente, com o aumento na
concentração de PGPR (Figura 3 A e B). A estabilidade de emulsões pode ser associada à
vida de prateleira, aparência e até textura do produto, e está diretamente relacionada ao
tamanho das gotas e à polidispersidade, que representa a fração de partículas em diferentes
classes de tamanho (MCCLEMENTS, 2005). Essa distribuição pode ser alterada variando a
quantidade de surfactante e condições de processamento. Quanto menor a gota, mais estável a
emulsão, por aumentar a área superficial o que facilita o recobrimento e estabilização pelo
surfactante (PERRIER-CORNET et al., 2005).
Capítulo 3
47
Figura 2 – Distribuição de tamanho de gotas e microscopia das emulsões com diferentes
concentrações de PGPR. Escala 20 µm
0
5
10
15
20
25
100 1000 10000
Inte
nsi
dad
e (
%)
Tamanho (nm)
0,5%
0
5
10
15
20
25
100 1000 10000
Inte
nsi
dad
e (
%)
Tamanho (nm)
1%
0
5
10
15
20
25
100 1000 10000
Inte
nsi
dad
e (
%)
Tamanho (nm)
1,50%
0
5
10
15
20
25
100 1000 10000
Inte
nsi
dad
e (
%)
Tamanho (nm)
2%
Capítulo 3
48
Figura 3 - A) Tensão interfacial água/óleo com a concentração de surfactante PGPR; B)
Estabilidade frente a variação na concentração de PGPR
A estabilidade foi avaliada por 24 horas. Nas três primeiras horas após o processo
de emulsificação, todas as amostras mantiveram-se estáveis cineticamente, ou seja, não
apresentaram separação de fases (Figura 3 B). Após 4 horas, as emulsões com 0,5, 1 e 1,5%
de PGPR começaram a apresentar separação de fases, porém, com estabilidade maior que
90%. No entanto, a emulsão produzida com a menor quantidade de surfactante (0,5%)
apresentou queda brusca na estabilidade após 10 horas, passando de 96 para 79 %, o que pode
ser explicado pela baixa quantidade de surfactante usada para recobrir as gotas de água
formadas, o que com o tempo leva à coalescência das gotas que tendem ao estado de menor
energia. Quanto à tensão interfacial, foi observada sua redução, com o aumento da
concentração de PGPR (Figura 3 A). Mesmo sem adição de surfactante, também houve
redução da tensão interfacial no decorrer do tempo, o que pode ser explicado pela presença de
impurezas com poder de tensoativo (HALL et al., 2006). Com a presença do surfactante, foi
observado uma queda brusca no valor da tensão interfacial inicial de aproximadamente 13
para 8 mN/m, o que corrobora com o observado na estabilidade. Este fato se deve à interação
do surfactante na interface, onde concentrações maiores possibilitam um melhor recobrimento
das gotas de água. O surfactante deve adsorver-se rapidamente na interface durante o processo
de emulsificação a fim de reduzir a tensão interfacial, tornando mais fácil a ruptura das gotas
e formando uma camada protetora em torno delas, evitando a sua floculação e, por
consequência, retarda a desestabilização de emulsões (JAFARI; BEHESHTI; ASSADPOUR,
2013).
0
2
4
6
8
10
12
14
0 500 1000 1500
Ten
são
mN
/m
Tempo (s)
0%
0,50%
1%
1,50%
2%
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30
Esta
bili
dad
e(
%)
Tempo (h)
0,50%
1%
1,50%
2%
Capítulo 3
49
O efeito da adição de PGPR na estabilidade das emulsões pode ser entendido
melhor através do estudo da reologia das emulsões (Figura 4). O entendimento das
propriedades reológicas em emulsões é muito importante por diversos motivos. A eficiência
de ruptura das gotas em um homogeneizador e a vida de prateleira de emulsões alimentícias,
por exemplo, dependem da viscosidade dos componentes individuais (CASTRO, 2003).
Muitos dos atributos sensoriais também estão diretamente relacionados com as propriedades
reológicas como, por exemplo, cremosidade, espalhabilidade e dureza. Finalmente, as
medidas reológicas são frequentemente utilizadas como uma ferramenta analítica para
fornecer informações fundamentais sobre a organização estrutural e interações entre os
componentes em emulsões (MCCLEMENTS, 2005).
Figura 4 – Efeito da concentração de PGPR nas propriedades reológicas de emulsões A/O.
Todas as emulsões A/O mostraram baixa pseudoplasticidade, uma vez que o
índice de comportamento de escoamento (n) das amostras variou entre 0,967 a 0,977 (Figura
4). De maneira geral o índice de consistência (k) aumentou com a concentração de PGPR.
Assim, tem-se que a elevação na concentração de PGPR promoveu aumento da viscosidade e
de sua pseudoplasticidade. O aumento da área superficial da fase dispersa das emulsões afeta
fortemente sua reologia já que o aumento de número de gotas e a diminuição uniforme no
tamanho das mesmas aumentam a viscosidade da emulsão formada e consequentemente
aumenta a sua estabilidade (MCCLEMENTS, 2005) como visto para emulsões como
concentrações maiores de PGPR. Esse comportamento também foi observado por Kuhn;
Cunha, (2012) com valores de n entre 0,78 a 0,95 para emulsões A/O de óleo de linhaça
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0 50 100 150 200 250 300
Ten
são
(P
a)
Taxa de deformação (s-1)
Capítulo 3
50
estabilizadas por proteína de soro de leite que nesse caso foi associado à agregação das
proteínas aumentando assim o tamanho.
A concentração de 1% de surfactante PGPR, atende aos parâmetros desejados,
com valores de estabilidade e tensão interfacial próximos a maior concentração estudada
(2%), bem como parâmetros reológicos, o que se torna interessante devido a tendência de
redução de aditivos alimentares
3.2 Influência do processo
Para esta etapa foi utilizada a concentração de 1% de PGPR para avaliação do
processo. Foi avaliado o efeito da velocidade (Figura 5 A) bem como o tempo de processo no
tamanho de gotas (Figura 5 B). A velocidade de homogeneização teve maior influência no
tamanho de gotas quando comparada ao tempo de processo, como pode ser observado na
Figura 5.
Figura 5 – A) Distribuição de tamanho de gotas com a variação da velocidade. 4 min 9500
rpm 4 min 14500 rpm 4 min 30000 rpm B) Distribuição de tamanho de gotas com a
variação do tempo de homogeneização . 2 min 14500 rpm 4 min 14500 rpm 8 min
14500 rpm
Quando o tempo foi fixado em 4 minutos, observou-se tamanhos de gotas
menores nas velocidades 9500 e 30000 rpm (Figura 5A). Entretanto, a menor velocidade de
homogeneização (9500 rpm) levou ao maior decréscimo na estabilidade, que apresentou
queda brusca nas primeiras 5 horas após o processo (Figura 6). A variação no tempo de
homogeneização apresentou pouca influência na distribuição de tamanho de gotas (Figura 5B)
e na estabilidade das emulsões (Figura 6). Nos momentos iniciais da agitação para formar
emulsões começa a formação de gotículas e a medida que esse processo avança, tanto em
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Inte
nsi
dad
e (
%)
Tamanho (nm)
Capítulo 3
51
tempo quanto em velocidade, aumenta a probabilidade de colisão das gotas já formadas, que
dependendo da velocidade podem colidir fortemente, dando origem a gotas menores.
Figura 6 – Estabilidade da emulsão em diferentes tempos e velocidades de processo.
A melhor estabilidade foi observada a velocidade de 14500 rpm. A maior
velocidade estudada pode ter provocado quebra brusca das gotas causando coalescência e
consequentemente menor estabilidade (MCCLEMENTS, 2005). Assim, a homogeneização
por 4 min a 14500 rpm foi definida como condição de processo mais adequada para a
formação da emulsão simples água em óleo, nas condições avaliadas pelo presente estudo.
3.3 Produção de emulsão múltipla
A fim de determinar a melhor concentração de surfactante Tween 80 para
estabilizar a emulsão múltipla (A1/O/A2), foi utilizado 1% de PGRP como surfactante da fase
interna (A1/O) e avaliada distribuição de tamanho das gotas (Figura 7 A e C) e estabilidade
(Figura 7 B) da emulsão múltipla produzida com diferentes concentrações de Tween 80.
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%)
Tempo (h)
2min 14500 rpm
4min 9500 rpm
4min 14500 rpm
4min 30000 rpm
8min 14500 rpm
Capítulo 3
52
Figura 7 – Emulsões múltiplas (A1/O/A2) com diferentes concentrações de Tween 80, A)
Distribuição de tamanho de gota B) Estabilidade C) D[4,3] e polidispersidade. Letras iguais
não diferem estatisticamente entre si a 5% de significância letras maiúsculas para
polidispersidade e minúsculas para D[4,3].
As distribuições de tamanho de gotas das emulsões com diferentes concentrações
de Tween 80 foram similares, porém pode-se observar um leve deslocamento do pico da
curva para tamanhos menores (Figura 7A) nas emulsões contendo 2% de surfactante, o que
pode ser associado à estabilidade por um período maior (Figura 7B). Não diferiram
estatisticamente os valores de D[4,3] e polidispersidade (Figura 7 C), porém pode se observar
uma leve tendência de redução de tamanho de gota a medida que a concentração de
surfactante aumentou (Figura 8). Enquanto para menores concentrações de Tween a separação
de fases foi observada após a primeira hora de preparo. Nas condições de maior concentração
de surfactante a emulsão ainda encontrava-se estável em duas horas de observação. Pelas
microscopias, foi possível observar que todas as concentrações de Tween estudadas levaram à
formação de emulsões múltiplas e que, com 2% de Tween 80, as gotas foram menores e em
quantidades maiores quando comparado com as outras concentrações estudadas (Figura 8).
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1 100 10000
Vo
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%)
Tamanho (μm)
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
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Esta
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e %
Tempo (horas)
0,50%1%1,50%2%
0,00
10,00
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0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
0 0,5 1 1,5 2 2,5
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Concentração de Tween 80 (%)
Polidispersidade
D[4,3]
Aa Aa Aa
Aa
A) B)
C)
Capítulo 3
53
Este fato pode ter ocorrido devido a quantidade de surfactante ter sido a ideal para estabilizar
as gotas formadas.
Figura 8 – Microscopia das emulsões múltiplas com diferentes concentrações de Tween 80.
Escala 20 µm
3.4 Influência da concentração de surfactante da fase interna (A1/O) na produção
de emulsão múltipla a 2% de Tween 80.
Após a definição da concentração de surfactante da emulsão secundária (2%), foi
realizado um novo estudo para avaliar como, e se a concentração de surfactante da emulsão
primária influenciaria as características da emulsão múltipla. Assim, variou-se a concentração
de PGPR na fase interna (A1/O) e analisou-se a distribuição de tamanho de gota e estabilidade
das emulsões múltiplas (A1/O/A2). As emulsões múltiplas produzidas com todas as
concentrações avaliadas apresentaram distribuição bimodal, o que pode ser resultado das
gotas de emulsões múltiplas formadas e gotas de óleo livre ou emulsão simples que não
formaram emulsão múltipla, como pode ser observado pelas microscopias (Figura 9). Onde os
picos maiores seriam as emulsões múltiplas. A distribuição de tamanho de gota das emulsões
com diferentes concentrações de PGPR na fase interna apresentaram tendência similar com
exceção para a de 1,5% de PGPR, que apresentou gotas maiores (Figura 9). Devido ao maior
tamanho de gota, a mesma concentração teve uma queda mais brusca na estabilidade entre a
primeira e segunda hora de observação passando de 100 para 77,5% de índice de estabilidade
(Figura 10). O aumento da concentração de surfactante da fase interna, promoveu uma
Capítulo 3
54
tendência de aumento no valor de D[4,3] e redução da polidispersidade (Figura 9 B). Porém,
não houve diferença estatística.
Figura 9 – Emulsões múltiplas produzidas variando a concentração de surfactante PGRP da
fase interna A) Distribuição de tamanho, B) Polidispersidade e D[4,3] Letras iguais não
diferem entre si a 5 % de significância (letras maiúsculas para polidispersidade e minúsculas
para D[4,3]). Escala 20 µm
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%)
Tamanho (µm)
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Tamanho (µm)
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0,01 1 100 10000
Vo
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%)
Tamanho (µm)
2 %
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1,50
2,00
2,50
0 0,5 1 1,5 2 2,5
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Concentração de PGPR (%)
0,5% 1%
1,5%
Aa Aa
Aa
Aa
Capítulo 3
55
Figura 10 – Estabilidade das emulsões A1/O/A2
A emulsão múltipla contendo 2% de PGPR na fase interna, apresentou maior
número de gotas no interior da emulsão. A quantidade de gotas no interior das emulsões
múltiplas aumentou a medida que aumentava a concentração de PGPR na fase interna (Figura
9 A). A concentração de surfactante da fase interna influenciou a estabilidade das emulsões
múltiplas, devido a maior ou menor quantidade de gotas dentro da múltipla.
4 CONCLUSÃO
Pode-se concluir que todas as concentrações estudadas de surfactante da fase
interna (PGPR), e condições de processos avaliadas foi possível produzir emulsões simples do
tipo água em óleo. Considerando uma tendência na redução na quantidade de aditivos em
alimentos mantendo estabilidade do produto final, o uso de 1% de PGPR pode se tornar uma
boa alternativa para produção da emulsão primária para produção de emulsões múltiplas.
Quanto ao processo, a velocidade de homogeneização dentro da faixa estudada exerce maior
influência no tamanho das gotas e estabilidade da emulsão simples quando comparado ao
tempo de processo. Para a produção de A1/O/A2 todas as concentrações de surfactante
formaram emulsões múltiplas com destaque para 2% de Tween que apresentou tamanho de
gotas menores e maior estabilidade. Quando foi fixada a concentração de surfactante da fase
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bili
dad
e %
Tempo (horas)
0,50%
1%
1,50%
2%
Concentração PGPR da emulsão
primária
Capítulo 3
56
externa e variou-se a da fase interna, foi possível observar que a concentração de surfactante
da fase interna exerce influência na estabilidade e tamanho de gotas da emulsão múltipla final,
além de quantidade de gotas dentro da emulsão múltipla, sendo mais recomendado então
utilizar as concentrações intermediárias (1 e 1,5%).
5 REFERÊNCIAS
CASTRO, A. G. Coord. A química e a reologia no processamento de alimentos. Instituto
Piaget, 295 p. 2003.
DAMODARAN, S. et al. Química de alimentos de fennema. Porto Alegre: Artmed, 2010.
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Research, v. 51, p. 1-97, 2006.
JAFARI, S. M.; BEHESHTI, P.; ASSADPOUR, E. Emulsification properties of a novel
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KRISHNA G, WOOD GC, SHETH BB. Improving emulsification efficacy of lecithin by
formulation design. I. Effect of adding a secondary surfactant. PDA J Pharm Sci Technol.
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KUHN, K. R.; CUNHA, R. L. Flaxseed oil - Whey protein isolate emulsions: Effect of high
pressure homogenization. Journal of Food Engineering, v. 111, n. 2, p. 449–457, 2012.
MCCLEMENTS, D. J. Food emulsions: principles, practice and techniques. CRC Press:
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MCCLEMENTS, D. J.; DECKER, E. A.; WEISS, J. Emulsion-based delivery systems for
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MCCLEMENTS, D.J. Edible nanoemulsions: fabrication, properties, and functional
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OMOTOSHO, J.A. The effect of acacia, gelatinand polyvinyl pyrrolidona on chloroquine
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Capítulo 3
57
SAMAVATI, V. et al. Stability and rheology of dispersions containing polysaccharide, oleic
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Disponível em: <http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ j.1745-4603.2011.00317.x/pdf>.
Acesso em: 06 jun. 2016. doi: 10.1111/j.1745-4603.2011.00317.
PERRIER-CORNET, J. M.; MARIE, P.; GERVAIS, P. Comparison of emulsification
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PRISTA LN, ALVES AC, MORGADO R 1996. Tecnologia Farmacêutica. Lisboa: Fundação
Calouste Gulbenkian. v. 1.
WALSTRA, P.;VAN VLIET, T. Sistemas dispersos: considerações básicas. In:
DAMODARAN, S. et al. Química de alimentos de fennema. Porto Alegre: Artmed, 2010.
Cap.13, p.611-660.
Capítulo 4
58
Capítulo 4
SISTEMAS GELIFICADOS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS
HIDROFÍLICOS E LIPOFÍLICOS
Artigo a ser submetido na revista: Journal of Dispersion Science and Technology
Capítulo 4
59
SISTEMAS GELIFICADOS PARA VEICULAÇÃO DE COMPOSTOS
HIDROFÍLICOS E LIPOFÍLICOS
Autores: Rodrigues, C. G.; Perrechil, F. A.; Sato, A. C. K.
RESUMO
Visando a veiculação de diferentes compostos em uma mesma estrutura, micropartículas
gelificadas foram produzidas a partir de emulsões múltiplas. Assim, propriedades mecânicas e
capacidade de retenção de água destes géis foram avaliadas. Emulsões múltiplas do tipo água
em óleo em água foram produzidas utilizando água destilada, óleo de linhaça e alginato de
sódio, com PGPR e Tween 80 como agentes emulsificantes. Foram avaliadas duas proporções
de emulsão simples em relação à quantidade da solução de alginato 1% (m/v), a saber: 1:10 e
3:7. Também foi produzida uma emulsão controle do tipo O/A2 nas mesmas proporções. Com
as emulsões formadas foram produzidos macrogéis (diálise) e microgéis (atomização). Não
houve diferença significativa nos parâmetros de capacidade de retenção de água, tensão e
deformação de ruptura de todas as amostras, emulsões controle, múltiplas e solução de
alginato puro. Já o módulo de elasticidade apresentou diferença entre a emulsão múltipla 3:7 e
a solução de alginato puro, mostrando que a emulsão é menos firme, as outras emulsões não
diferiram do alginato puro. Os géis obtidos a partir das emulsões múltiplas em ambas as
proporções, e a partir da emulsão simples na proporção de 1:10 apresentaram um anel central,
evidenciando a separação de fases. Os microgéis obtidos por atomização apresentaram
tamanho na ordem de 10 a 1000 µm e sua suspensão apresentou comportamento
pseudoplastico para todas as concentrações estudadas.
.
Palavras chave: Propriedades mecânicas, reologia, emulsões múltiplas
Capítulo 4
60
1.INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, os sistemas de administração de compostos bioativos em
alimentos funcionais tem chamado muita atenção (WAN, GUO, & YANG, 2015). Isto se
deve a busca dos consumidores por alimentos que possam além de nutrir proporcionar
benefícios a saúde. Entretanto, tem sido provado que, em alguns casos, um único composto
bioativo não funciona sozinho, uma vez que as vias metabólicas humanas complexas
requerem combinações de outros ingredientes. Assim, uma estratégia de distribuição de
compostos, uma coencapsulação, com ação sinérgica é mais efetiva na promoção da saúde
(VO & KIM, 2013). Neste sentido, o uso de sistemas emulsionados podem ser uma
alternativa, pois permitem veicular compostos distintos nas diferentes fases.
Emulsões consistem em sistemas heterogêneos, termodinamicamente instáveis,
definidos por mistura de dois líquidos imiscíveis, onde um deles está disperso no outro na
forma de gotas (GAD, 2008). De acordo com natureza da fase dispersa, as emulsões simples
são classificadas em óleo em água (O/A), se o óleo é a fase dispersa, e se a água é a fase
dispersa a emulsão é dita água em óleo (A/O). Existem ainda sistemas mais complexos,
denominados de emulsões múltiplas (ASERIN, 2008; BENICHOU; ASERIN; GARTI,2007;
MEZZENGA; FOLMER; HUGHES, 2004; SEIFRIZ, 1923; SU et al., 2006) do tipo água-
óleo-água (A/O/A) e óleo-água-óleo (O/A/O) (MUSCHIOLIK, 2007). Devido à
complexidade e instabilidade das emulsões múltiplas são pouco utilizadas na área de
alimentos, o que requer mais estudos para torná-las mais viáveis, como por exemplo a
produção de géis.
A produção de géis a partir de diferentes compostos tem despertado o interesse de
indústrias de alimentos para produção de sistemas de encapsulação ou sistemas modificadores
de textura, pois as interações formadas podem promover diferenças significativas na
microestrutura (WALKENSTRÖM et al., 2003). O conhecimento das características físico-
químicas e interações moleculares entre os componentes dos géis possibilitam modificar
características reológicas e consequentemente, as características sensoriais dos produtos
(WALKENSTRÖM et al., 2003; KUHN, PICONE e CUNHA, 2012). Para um bom
entendimento de atributos de textura, determinação de características sensoriais e de
qualidade de produtos, a caracterização reológica das soluções é de extrema importância,
assegurando sua estabilidade em processos que envolvem altas taxas de cisalhamento, assim
Capítulo 4
61
como para compreensão das alterações da estrutura durante o processo de formação de géis,
em condições de baixa deformação (KUHN, PICONE e CUNHA, 2012; MA et al., 2014).
Muitos polímeros vêm sendo utilizados para produção de sistemas de
encapsulação pela indústria alimentícia, entre eles pode-se citar carragena, quitosana, pectina,
celulose, gelana, gelatina, alginato, entre outros (KUHN, PICONE e CUNHA, 2012). O
alginato é um polissacarídeo natural, com grupos carboxílicos em sua estrutura capazes de
formar hidrogéis por interações eletrostáticas em presença de íons de cálcio, originando
estruturas conhecidas como caixas de ovos. Esta propriedade, juntamente com sua excelente
biocompatibilidade, baixo custo e por não apresentar toxicidade, fazem do alginato um dos
biopolímeros mais atraentes para produção de microcápsulas para entrega controlada e
proteção de ativos (COOK et al., 2011).
Visto isso, o presente trabalho teve como objetivo formar sistemas gelificados a
partir de emulsões múltiplas visando a sua utilização como matriz de coencapsulação para
aplicação em produtos líquidos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Os ingredientes utilizados para preparo das emulsões foram água destilada, óleo
de linhaça doado pela Cisbra LTDA (Brasil), Polisorbato 80 (Tween 80) (Sigma) e
poliglicerol polirricinoleato (GRINDSTED PGPR) (BLH = 15) e alginato de sódio, doados
pela Danisco Brasil LTDA (Brasil). Foram utilizadas membranas de diálise (SnakeSkin
Dialysis Tubing, 3500, Pierce, Rockford, IL, USA) para a formação dos macrogéis por
imersão em solução de cloreto de cálcio (CaCl2) dihidratado (Dinâmica - Química
contemporânea LTDA. CAS 10035-04-8). Os demais materiais utilizados foram de grau
analítico.
2.2 Preparo das Emulsões Controle O/A2
Emulsões O/A2 foram produzidas para se determinar proporções de fase
intermediária para fase externa (Tabela 1). O óleo de linhaça foi adicionado às soluções
aquosas de alginato (A2) em diferentes proporções (Tabela 1), contendo surfactante Tween 80
e misturadas, utilizando-se um homogeneizador tipo rotor estator “Ultra Turrax” modelo T10
Capítulo 4
62
(IKA, Alemanha), a 14500 rpm por 4 minutos. O óleo foi adicionado lentamente para melhor
homogeneização das emulsões (Figura 1 B).
2.3 Preparo das Emulsões A1/O/A2
Primeiramente foi produzida a emulsão primária simples A1/O, onde água
destilada foi misturada à solução oleosa contendo surfactante PGPR a 1% (m/m), utilizando-
se um homogeneizador tipo rotor estator “Ultra Turrax” modelo T10 (IKA, Alemanha), a
14500 rpm por 4 minutos. A água foi adicionada lentamente para melhor homogeneização das
emulsões, mantendo relação em massa de água para óleo de 1:2. Para produção da emulsão
múltipla A1/O/A2 (Tabela 1) a emulsão primária foi adicionada com auxilio de bomba digital
(Masterflex L/S Cole-Parmer Instrument Company, EUA) a vazão de 4,5 mL/min em solução
de alginato 1% (m/m) com surfactante Tween 80, utilizando agitação magnética com
velocidade de 500 rpm durante 1 hora (Figura 1 A).
Nesta etapa, avaliou-se a influência da proporção de emulsão primária em relação
à fase externa (1:10 ou 3:7 m/m), nas propriedades das emulsões múltiplas, sendo que a
concentração de surfactante (Tween) foi fixada em 2% (m/m). Foram avaliadas as
propriedades reológicas das emulsões, distribuição de tamanho de gota e estabilidade tanto
das emulsões controle (O/A2) quanto das múltiplas (A1/O/A2).
Tabela 1 – Composição das emulsões O/A2 e múltipla A1/O/A2
Surfactante
Tween 80 (%
m/m)
Óleo (%
m/m)/ Simples
(A1/O)
Solução de
alginato
1% (%
m/m)
Proporção óleo
e A1/O /solução
de alginato
m/m (-)
2 8,91 89,09 1:10
2 29,4 68,6 3:7
Capítulo 4
63
Figura 1 – Esquema de produção das emulsões, A) Emulsão múltipla A1/O/A2, B) Emulsão
controle O/A2
2.4 Preparo dos macrogéis
As emulsões controle O/A2 e múltiplas A1/O/A2 nas duas proporções, foram
transferidas para membranas de diálise (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3500, Pierce, Rockford,
IL, USA) onde permaneceram em contato com solução de CaCl2 0,15 mol/L a temperatura
ambiente por 48 horas, para formação do gel através da difusão de íons Ca+2
(Figura 2).
Foram avaliadas as propriedades mecânicas e capacidade de retenção de água dos géis
obtidos.
O
A2
A1/O
O/A2
A1/O/A2
A1
Capítulo 4
64
Figura 2 – Gelificação por membrana de diálise
2.5 Preparo dos microgéis
As micropartículas foram obtidas de acordo com a metodologia proposta por Li et
al. (2009) com algumas modificações. As emulsões foram bombeadas em bico atomizador
(Labmaq do Brasil LTDA, Brasil) de diâmetro de 0,7 mm com o auxílio de bomba peristáltica
(Masterflex, modelo 7518-00), sendo atomizadas em solução de CaCl2 0,15 M a temperatura
ambiente. A altura entre o bico atomizador e a solução de CaCl2 foi fixada em 30 cm, a vazão
de alimentação da bomba peristáltica ajustada em 0,7 mL/min e a pressão do compressor a 1
bar, enquanto a taxa de fluxo de ar comprimido no bico foi fixada ao máximo possível (0,12
m3/h), afim de evitar respingos da solução salina (PERRECHIL; SATO; CUNHA, 2011). As
partículas gelificadas foram mantidas sob agitação em solução salina por cerca de 30 minutos
e posteriormente filtradas em peneira com abertura de 0,053 mm (PERRECHIL; SATO;
CUNHA, 2011). As micropartículas produzidas foram armazenadas em recipientes
hermeticamente fechados em incubadora BOD (Marconi - MA 415 UR) a 4 °C, para
avaliação da distribuição do tamanho de partículas, reologia da sua dispersão em meio aquoso
e microscopia ótica.
2.6 Distribuição de tamanho de gotas
A distribuição de tamanho de gotas das emulsões O/A2 e A1/O/A2 em todas as
proporções e dos microgéis foi determinada, com o auxílio de um analisador de tamanho de
partículas por difração a laser Mastersizer 2000 – versão 5.60 (Malvern Instruments LTDA.,
Worcestershire, RU). Três leituras foram obtidas por amostra. Foram analisados o tamanho de
partícula, expresso como diâmetro médio volumétrico (D [4,3]) e a polidispersidade.
Capítulo 4
65
2.7 Índice de Estabilidade
As amostras de emulsões foram colocadas em provetas de 25 mL e o índice de
estabilidade foi determinado pela relação entre o volume da fase emulsionada em relação ao
total da amostra, dada pela Equação 1 ao longo do tempo. De acordo com a equação, quanto
maior o valor de C, maior a estabilidade do sistema (KRISHNA et al., 1998).
C = 100 x (Vs/Vt) (1)
Onde Vt corresponde ao volume total da amostra (mL); Vs volume da fase emulsionada (mL)
2.8 Microscopias
2.8.1 Microscopia ótica
Para garantir que as emulsões foram formadas, foi feita microscopia ótica tanto
para as emulsões simples quanto para as múltiplas. As análises foram realizadas com auxílio
de um microscópio óptico Carl Zeiss Modelo: Axio Visio (Zeiss, Alemanha), com objetiva de
100x.
2.8.2 Microscopia confocal
A microscopia confocal foi utilizada para analisar a estrutura das emulsões
A1/O/A2 antes e após passar pelo bico atomizador. Para essa análise, o corante vermelho do
nilo foi adicionado às amostras de maneira a marcar as moléculas de óleo presente. As
amostras foram examinadas utilizando um confocal Zeiss LSM 780-NLO acoplado a um
microscópio Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Alemanha), com uma objetiva de 100x. As
imagens foram recolhidas utilizando laser de 552 nm para excitação e 636 nm para emissão
do vermelho do nilo.
2.9 Medidas reológicas
As propriedades reológicas das suspensões de microgel (10, 20 e 40% m/v) das
partículas dispersas em água foram medidas. Para isso foi utilizado reômetro modelo AR
1500 ex (TA INSTRUMENTS) com uma geometria de placas paralelas rugosas (40 mm) e 2
mm de gap. As curvas de escoamento foram obtidas com a taxa de deformação variando entre
0 e 300 s-1
. Todas as medições foram realizadas em triplicata a 25 °C. Curvas de escoamento
também foram obtidas das emulsões O/A2 e A1/O/A2 em todas as proporções,com geometria
Capítulo 4
66
de cone placa (40 mm) 2° e taxa de deformação variando entre 0 e 1000 s-1
. Todos os dados
foram ajustadas ao modelo Herschel-Bulkley (Equação 2).
(2)
Onde: σ = tensão (Pa), σ0 = tensão inicial (Pa) , k = índice de consistência (Pa.sn), n= (-)
índice de comportamento e γ= taxa de deformação (s-1
)
2.10 Propriedades Mecânicas
As propriedades mecânicas dos macrogéis obtidos pelas emulsões simples e
múltiplas (tensão de ruptura, deformação de ruptura e módulo de elasticidade) foram
avaliadas após 48 horas de contato com solução de CaCl2. Os macrogéis foram retirados da
membrana e cortados perpendicularmente, com altura igual ao diâmetro medido (2 cm), sendo
submetidos a medidas de compressão uniaxial em Texturômetro universal TA-XT Plus
Texture Analyzer (Stable Micro Systems, UK) utilizando geometria acrílica de 80 mm de
diâmetro lubrificada com silicone para evitar forças de cisalhamento. As propriedades
mecânicas foram obtidas por compressão dos géis a 80% da altura original, a 25 °C, com
velocidade de compressão de 1 mm/s. A tensão de Hencky (σt), deformação de Hencky (ɛt) e
módulo de elasticidade (E), foram calculados de acordo com as Equações de (3) a (5), sendo
que os dados de ruptura (σrup) e (εrup) equivalem ao ponto do primeiro pico observado e o
módulo de elasticidade foi obtido dentro da região de deformações reversíveis, até o máximo
de 5% de deformação.
Capítulo 4
67
(3)
(4)
(5)
Onde:
Ft = força (N), H(t) = altura com o tempo (mm), H0 = altura inicial (mm), A0 = altura inicial
(m2);
2.11 Capacidade de Retenção de Água (WHC)
Após estocagem por 48 horas a 25 ºC, amostras cilíndricas de aproximadamente
1g de gel foram envolvidas em papel de seda e papel de filtro antes de serem colocadas em
tubos de centrífuga de capacidade de 50 mL. Os géis foram, então, centrifugados a 25 ºC em
uma centrífuga modelo Allegra 25 – R (Beckman Coulter, Alemanha), utilizando o rotor A-10
a 124g por 10 minutos. A quantidade de água liberada do gel foi quantificada
gravimetricamente, de acordo com a equação 6, sendo que a WHC foi expressa em
porcentagem de água retida:
(6)
Onde:
águaliberada é a quantidade de água retida no papel de seda e de filtro e a águagel é a quantidade
inicial de água na amostra.
2.12 Análise dos Dados
Todos os resultados foram analisados por meio da análise de variância (ANOVA)
e as diferenças entre as médias, pelo teste de Tukey, utilizando-se o programa estatístico
SISVAR, versão 5.6, a 5% de significância (FERREIRA, 2011). Foram feitas duplicatas de
processo e triplicatas de cada leitura.
Capítulo 4
68
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Emulsões
Nas duas razões estudadas foi possível a formação de emulsões O/A2 e A1/O/A2,
com tamanhos de gotas menores que 1000 µm (Figura 3 A). As emulsões controle O/A2
apresentaram distribuição de tamanho de gotas bem similares entre si, com distribuição
bimodal. Comparando as emulsões controle com as múltiplas, as primeiras apresentaram
tamanhos de gotas menores, com valores de D[4,3] em torno de 10 µm, enquanto as múltiplas
apresentaram valores duas vezes maiores. Esse fato se deve por processos diferentes na
obtenção das gotas, a emulsão O/A2 passou por processo de homogeneização em ultra turrax,
que por sua vez é mais intenso e como consequência obtém-se gotas de diâmetros menores.
Além disso, deve-se levar em consideração que emulsões múltiplas têm outra emulsão na fase
interna. A emulsão múltipla produzida na proporção de 1:10 apresentou tamanho maior que a
3:7 como pode ser observado pela microscopia e corrobora com o valor de D[4,3] de 35 µm
para a proporção 1:10, em comparação ao valor de D[4,3] de 22 µm para a proporção 3:7
(Figura 3B). Este fato corrobora com os dados obtidos pela reologia, onde as emulsões
múltiplas na proporção 3:7 apresentaram maior viscosidade, consequentemente maior
dificuldade de aproximação das gotas (Figura 6). Devido à relação entre emulsão simples e
fase externa ser maior na emulsão múltipla de 3:7, foram observadas mais gotas. Quanto a
polidispersidade, não houve diferença significativa das emulsões, onde todos os sistemas
estudados apresentaram baixa polidispersidade entre 1,75 e 1,60.
Capítulo 4
69
1:10 3:7
Figura 3 – A) Distribuição de tamanho de gotas das emulsões simples e múltiplas. Escala 20
µm, B) Polidispersidade e D[4,3] de emulsões simples e múltiplas, letras iguais não diferem
de si estatisticamente a 5% de significância. Letras maiúsculas para polidispersidade e letras
minúsculas para D[4,3]
As emulsões na proporção de 3:7, tanto para as emulsões simples quanto múltipla,
0
2
4
6
8
10
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
8
10
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
8
10
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
8
10
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
1,50
1,55
1,60
1,65
1,70
1,75
1,80
1:10O/A2
3:7O/A2
1:10A/O/A
3:7A/O/A
D{4
,3]
(µm
)
Po
lidid
pe
rsid
ade
(-)
Emulsões
a
b
Ac
A
A
A
a
Capítulo 4
70
foram as que apresentaram maior estabilidade cinética sem separação de fases, ao longo das
cinco horas avaliadas (Figura 5). Quanto maior a estabilidade cinética de uma emulsão maior
a sua viabilidade para incorporação de compostos, sem que os mesmos sejam cremeados ou
floculados perdendo assim sua proteção. Acredita-se que a estabilidade observada teve maior
influência da quantidade de gotas presentes do que do tamanho das gotas, uma vez que as
emulsões mais estáveis foram as produzidas na proporção 3:7, e não as emulsões simples, que
apresentaram gotas de menor tamanho. Considerando que as emulsões na proporção 3:7
apresentaram maior quantidade de fase dispersa e, consequentemente, maior quantidade de
gotas, estas podem ter atuado como barreira às demais, impedindo a cremeação das gotas no
tempo estudado. Segundo Lizarraga et al., (2008) quanto maior a concentração de gotas,
menor e a velocidade terminal, ou seja, menor velocidade de cremeação. Além disso, a menor
separação de fases pode ter sido favorecida pelo mecanismo de repulsão estérica, uma vez que
a quantidade de gotas era maior (Figura 3 A). Tornando o potencial estérico mais relevante,
pois a viscosidade da fase continua é a mesma e as gotas não estavam carregadas, pode-se
dizer pela teoria DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) que quanto menor for a
distância entre as gotas, que é provocado pelas gotas em quantidades maiores, a força de
repulsão tende a infinito (Figura 4 c), tornando a emulsão mais estável cineticamente.
Figura 4 – Esquema de distribuição de gotas nas diferentes proporções a) 3:7, b) 1:10 e
c) Diagrama representando as possíveis forças atrativas adaptado de Base; Raras, 2015
Capítulo 4
71
Figura 5 – Estabilidade das emulsões controles e múltiplas
A Figura 6 apresenta as curvas de escoamento das emulsões controle e múltiplas
preparadas nas proporções 1:10 e 3:7, além da solução pura de alginato. Todas as amostras
apresentaram comportamento de fluido pseudoplástico com valores de n menores que 1
(Figura 6). Emulsões constituídas por elevadas concentrações de fase dispersa são conhecidas
por exibirem um comportamento de fluídos Não-Newtoniano e pseudoplástico (SCHUCH;
LEAL; SCHUCHMANN, 2014), devido ao rearranjo de gotículas no fluido, minimizando o
atrito (MASON, 1999). A emulsão A1/O/A2 3:7, teve menor valor de n, 0,554 mostrando
assim que a emulsão múltipla nesta proporção é mais pseudoplástica que as outras amostras.
As emulsões na proporção 3:7 apresentaram maior viscosidade que a solução de alginato e as
1:10 menores valores (Figura 6), o que pode ser relacionado aos resultados obtidos pela
estabilidade (Figura 5). Emulsões mais viscosas tendem a ser mais estáveis cineticamente,
pois retardam a aproximação das gotas que possibilitam processos de desestabilização, como
cremeação e floculação por exemplo. A maior quantidade de fase dispersa leva a um maior
incremento da viscosidade, o que aumenta a estabilidade cinética, uma vez que dificulta a
movimentação das gotas.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6
Esta
bili
dad
e (
%)
Tempo (horas)
Múltipla 3:7
Múltipla 1:10
Controle 3:7
Controle 1:10
Capítulo 4
72
Figura 6 - Propriedades reológicas das soluções.
3.2 Macrogéis
A produção de géis a partir das emulsões simples e múltiplas pode influenciar
fortemente esta estrutura além de conferir propriedade funcional, sensorial e torná-las
estáveis. Assim, com o objetivo de verificar as propriedades dos géis formados após 48 horas
de contato com solução de CaCl2, as propriedades mecânicas e a capacidade de retenção de
água foram avaliadas (Figura 8). Todas as amostras estudadas formaram géis, como pode ser
observado pela Figura 7. Para caracterizar os géis de emulsão, foram produzidos os macrogéis
e analisadas propriedades mecânicas e capacidade de retenção de água (WHC). Estas análises
foram realizadas em géis de tamanho maior uma vez que o tamanho pequeno das partículas
produzidas por atomização dificulta a avaliação das propriedades mecânicas e a fratura para
observação da estrutura interna. A estrutura de géis formados por biopolímeros sofre
influência das características físico-químicas das macromoléculas, além da natureza e
intensidade das interações entre os biopolímeros. O conhecimento de como sistemas
biopoliméricos ocorrem é importante para o desenvolvimento de produtos alimentícios com
características desejáveis (KUHN, PICONE e CUNHA, 2012).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 200 400 600 800 1000 1200
η(P
a.s)
γ (s-1)
Capítulo 4
73
Amostra 1:10 3:7
Controle (O/A2)
Múltipla (A1/O/A2)
Figura 7 – Géis de emulsões controle e múltiplas
Nas amostras de géis preparados a partir das emulsões múltiplas e da emulsão
controle na proporção de 1:10, foi observada separação de fases (Figuras 7), o que poderia
levar a uma falsa interpretação dos resultados obtidos, ou seja afetar as propriedades
mecânicas, pois cada fase responderia de uma forma quando aplicada a mesma força. Não
houve diferença significativa nos valores de WHC e εrup (5% de significância). Foi possível
observar uma tendência na redução de σrup nos sistemas contendo as emulsões, ou seja,
sistemas sem presença de gotas como o alginato tendem ser mais duros, pois as gotas
presentes na emulsão tornam o sistema menos compacto (Figura 8). As propriedades de
tensão de ruptura de géis relacionam-se com a dureza do gel, enquanto que a deformação de
ruptura reflete as propriedades coesivas ou a deformação de géis submetidos a uma força. A
região linear obtida para o módulo de elasticidade implica na capacidade dos materiais em
retornar à forma original quando submetidos a uma carga que é posteriormente removida. O
que pode ser um indicativo das interações moleculares na rede polimérica formada, indicando
a dinâmica da estrutura formada (FOEGEDING, BOWLAND e HARDIN, 1995; PIRES
VILELA, CAVALLIERI e LOPES DA CUNHA, 2011).
Capítulo 4
74
Figura 8 – Módulo de elasticidade (E), capacidade de retenção de água (WHC), tensão (σ) e
deformação de ruptura (ε) Múltipla 1:10 Múltipla 3:7
Controle 1:10 Controle 3:7 Alginato
Segundo Guo et al., (2014), o modulo de elasticidade tende a reduzir a medida
que aumenta o tamanho de gotas de sistemas gelificados com proteína de soro. Entretanto,
esse comportamento não foi observado para as emulsões estudadas, visto que além da
influência do tamanho de gotas, também podem ter exercido influência a proporção de fase
dispersa e tipo de emulsão formada simples ou múltipla.
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
σ r
up
(P
a)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
ε r
up
(-)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
WH
C (
%)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
E (P
a)
ab
ab ab
b
a
a a
a
a a
ab b
a
ab
c a
a
a
a a
Capítulo 4
75
3.3 Microgéis
As emulsões simples e múltiplas foram submetidas a atomização seguida por
gelificação iônica, para posterior análise de distribuição tamanho de partícula e reologia da
dispersão em solução aquosa, visto que está estrutura que terá potencial para aplicação em
alimentos.
3.3.1 Influência da atomização
A emulsão múltipla foi sujeita ao processo de atomização, e sua estrutura foi
avaliada por microscopia confocal, de modo a verificar o efeito do processo na estabilidade da
emulsão. Foi possível comprovar que a emulsão era realmente do tipo A/O/A (Figura 9 A),
ficando a fase oleosa corada em vermelho. Após o processo de atomização, utilizado para o
preparo dos microgéis, as gotas de óleo ficaram menores, onde pode se observar algumas
gotas de óleo e outras gotas que ainda permaneceram com a estrutura múltipla (Figura 9B).
As gotas de emulsão múltipla ao passarem pelo bico atomizador, são forçadas a passar de uma
área maior (mangueira) para uma menor, o que leva a um estrangulamento das gotas
resultando em gotas menores e até mesmo a perda da estrutura múltipla como pode ser
observado pela microscopia confocal.
Figura 9 – Microscopia confocal, A) Emulsão múltipla, B) Emulsão múltipla
atomizada
3.3.2 Tamanho dos Microgéis
A distribuição de tamanho de todos os microgéis produzidos apresentou
comportamento bimodal. Os géis obtidos por emulsões controle apresentaram distribuição de
tamanho similar ao gel obtido por alginato, com D[4,3] em torno de 100 µm, independente da
relação entre a fase interna e externa. Os géis de emulsão múltipla na proporção de 1:10
apresentaram maiores valores de D[4,3] e polidispersidade, (Figura 10).
A1
A2
O
Capítulo 4
76
Micropartículas de tamanhos menores (<1000 µm) são mais desejáveis para
incorporação em alimentos, visto que leva a menor alteração nas características sensoriais e
propriedades de textura (PINTO, 2006). O que indica que, levando em consideração esse
parâmetro, todos os géis obtidos tem potencial para aplicação em incorporação de compostos
para fins alimentícios.
Figura 10 – Distribuição de tamanho de géis, A) Emulsões controle, B) Emulsões múltiplas
C) D[4,3] e Polispersidade dos géis. Letras iguais não diferem estatisticamente entre si a 5%
de significância. Letras maiúsculas correspondem a polidispersidade e letras minúsculas a
D[4,3]
0
2
4
6
8
10
0,1 1 10 100 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
Gel O/A 1:10
Gel O/A 3:7
Alginato
0
2
4
6
8
10
0,1 1 10 100 1000V
olu
me
(%
)
Tamanho (µm)
Gel A/O/A 1:10
Gel A/O/A 3:7
Alginato
0
100
200
300
400
500
600
0
2
4
6
8
10
12
14
1:10 O/A2 3:7 O/A2 1:10 A/O/A 3:7 A/O/A Alginato
D{4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Géis
Aa Aa Aa Aa
Bb
Capítulo 4
77
3.3.3 Avaliação da reologia das suspensões de microgel
A fim de determinar qual concentração de microgel, pode ser incorporada em
alimentos, os microgéis de emulsões simples, múltiplas, e alginato puro foram dispersos em
água a 10, 20 e 40 %. Foram realizadas três varreduras da taxa de cisalhamento para verificar
a dependência do tempo, e os resultados indicaram que nenhuma das amostras apresentou
tixotropia, com um comportamento pseudoplástico. Quando ajustados pelo modelo Herschel-
Bulkley (Tabela 2) onde os géis de alginato puro apresentaram n igual a 1, característicos de
fluidos newtonianos. Esse dado pode ser relacionado com as propriedades mecânicas (Figura
8), onde o gel de alginato foi o mais firme, consequentemente suas partículas tem mais
dificuldade em deformarem. As emulsões apresentaram comportamento pseudoplástico com n
menor que 1 em todas as concentrações estudadas e não diferiram entre si (5% de
significância). Uma explicação para esse fato pode ser que o óleo livre presente nos géis de
emulsão (Figura 3 A) tenha atuado como um lubrificante das partículas, facilitando o
escoamento dos géis de emulsão. Quanto ao índice de consistência (k) pode-se dizer que tem
tendência a reduzir com a presença de gotas. Não foi observada grandes diferenças nas
concentrações estudadas (5% de significância ).
Capítulo 4
78
Tabela 2 - Ajustes dos parâmetros pelo modelo lei da potência das dispersões
Amostra Concentração
(%)
Parâmetros
k (Pa.sn) n (-)
Alginato
10 0,0053 ab 1 a
20 0,0055 a 1 a
40 0,0058 a 1 a
O/A2 1:10
10 0,0048 ab 0,721 b
20 0,0048 ab 0,723 b
40 0,0047 ab 0,731 b
O/A2 3:7
10 0,0045 ab 0,734 b
20 0,0045 ab 0,734 b
40 0,0049 ab 0,726 b
A1/O/A2
1:10
10 0,0041 a 0,699 b
20 0,0046 ab 0,729 b
40 0,0040 b 0,762 b
A1/O/A2 3:7
10 0,0057 a 0,693 b
20 0,0045 ab 0,737 b
40 0,0044 ab 0,747 b
4 CONCLUSÃO
As formulações estudadas foram caracterizadas pelas curvas de escoamento,
apresentando comportamento pseudoplástico com valores de n menores que 1. As emulsões
na proporção de 3:7 mantiveram-se mais estáveis, sendo assim mais indicadas para utilização.
Além disso, também promoveram o aumento na viscosidade com maior índice de consistência
(k).
Com todas as amostras foi possível formar macrogéis, onde o gel obtido pela
emulsão múltipla na proporção de 3:7 obteve menor valor de modulo de elasticidade. Todas
as amostras apresentaram capacidade de retenção de água superior a 50% indicando
capacidade de incorporação de compostos hidrofílicos.
Capítulo 4
79
Não houve diferença nas dispersões dos microgeis de emulsão quanto aos
parâmetros reológicos, o que indica que a maior concentração pode ser incorporada em
alimentos sem alterar a sua reologia.
Estes resultados indicaram o potencial de utilização de microgéis de emulsão múltipla
na proporção de 3:7, para coencapsulação de compostos hidrofílicos e lipofílicos
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80
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Capítulo 5
83
Capítulo 5
DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE GÉIS DE EMULSÃO MÚLTIPLA PARA
COENCAPSULAÇÃO DE VITAMINA, ÁCIDO GRAXO E PROBIÓTICO
Artigo a ser submetido a revista: Carbohydrate Polymers
Capítulo 5
84
DIGESTIBILIDADE IN VITRO DE GÉIS DE EMULSÃO MÚLTIPLA PARA CO-
ENCAPSULAÇÃO DE VITAMINA, ÁCIDO GRAXO E PROBIÓTICO
Autores: Rodrigues, C. G.; Perrechil, F. A.; Sato, A. C. K.
RESUMO
Compostos bioativos tem sido foco nas pesquisas atuais por conferirem benefícios a saúde do
consumidor, entretanto são sensíveis a diversos fatores externos como altas temperaturas e
oxigênio. Para os efeitos benéficos serem atingidos, os compostos devem resistir ainda ao
sistema gastrointestinal chegando em quantidades adequadas ao intestino onde são
absorvidos, no caso de compostos como os ácidos graxos e vitaminas, ou se aderem à
superfície intestinal, como os microrganismo probióticos. O presente trabalho teve como
objetivo a produção de microgéis de emulsões múltiplas para coencapsulação de probiótico,
vitamina C e ácidos graxos insaturados, e avaliação da sua estabilidade durante a digestão in
vitro, condições de armazenamento e estabilidade frente a diferentes valores de pH. Os
microgéis obtidos após processo de atomização de emulsões múltiplas foram submetidos a
digestão in vitro e testes de estabilidade em diferentes pH (3 e 5). A estabilidade das
partículas em diferentes valores de pH mostrou um aumento expressivo na contagem de
probióticos livres após 24 horas, o que foi atribuído pela rede porosa formada pelo alginato,
favorecendo o inchaço da partícula e consequente liberação por difusão. Durante a digestão
foram retiradas alíquotas a cada 20 minutos para quantificação dos compostos liberados,
tamanho de partícula e microscopia. Foi observado um deslocamento na distribuição de
tamanho das partículas para tamanhos menores com o tempo de digestão, resultado
evidenciado pela microscopia. A quantificação dos compostos mostrou aumento na fase
entérica, indicando que a técnica utilizada foi eficiente para proteção dos ativos às condições
gástricas. Os resultados deste trabalho mostraram que é possível encapsular compostos com
diferentes polaridades em uma mesma estrutura, melhorando a sua viabilidade após processo
de digestão em relação aos compostos não encapsulados.
Palavras chave: Liberação, Digestão, Probióticos, Microgéis
Capítulo 5
85
1.INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, tem aumentado o interesse no estudo de bioativos para a
formulação de alimentos funcionais, devido às atividades fisiológicas e benefícios para a
saúde. Para exercer efeitos fisiológicos in vivo, os compostos bioativos devem resistir à
digestão gastrointestinal e atingir os seus locais-alvo, além de resistirem a processos na
indústria de alimentos (CHEN & LI, 2012). Dentre a vasta classe de compostos que exercem
beneficio a saúde, podem ser citados os probióticos, ácido ascorbico e ácidos graxos
insaturados do tipo ômega, como ω-3 e ω-6.
Os probióticos são microrganismos vivos que, quando ingeridos, conferem
benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Tem a propriedade de recompor a
microbiota intestinal por se aderirem a parede do intestino e colonizá-la, conferindo
benefícios como aumento da resistência às bactérias patógenas, podendo auxiliar na
prevenção contra infecções, estimular a multiplicação de bactérias benéficas, reduzir efeitos
de intolerância à lactose e reforçar os mecanismos de defesa naturais do hospedeiro
(HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002; SAAD, 2006). Entretanto, para que esses benefícios
ocorram, os probióticos devem ser ingeridos em uma quantidade recomendada em produtos
alimentares de no mínimo 106
UFC/g, ou que sejam consumidos em quantidades suficientes a
fim de se obter uma dose diária de 108 UFC (CHÁVARRI et al., 2010). Para isso devem
resistir ao processamento dos alimentos, como agitação, mudança de temperatura e passar
pelo trato gastrointestinal.
O ácido ascórbico é utilizado como antioxidante, o qual protege as qualidades
sensoriais e nutritivas dos alimentos evitando escurecimento. Os antioxidantes podem atuar
como antioxidantes primários e secundários. Os primários são aceptores de radicais livres que
atrasam ou inibem a etapa da iniciação ou interrompem a etapa de propagação da oxidação.
Os secundários agem através de numerosos mecanismos possíveis, os quais diminuem a taxa
de oxidação, mas não convertem radicais livres em compostos mais estáveis (REISCHE,
LILLARD e EITENMILLER, 2002). A inibição de radicais livres pode auxiliar na prevenção
de doenças causadas pelos mesmos, como problemas no sistema imunológico,
envelhecimento precoce, dentre outras doenças degenerativas. Porém, os antioxidantes
apresentam alta instabilidade e reatividade, degradando-se rapidamente por diferentes
mecanismos (BASTOS, ARAÚJO e LEÃO, 2009).
Capítulo 5
86
Os ácidos graxos do tipo ω-3 após ingeridos podem auxiliar no desenvolvimento
do cérebro e do sistema nervoso em crianças, reduz risco de hipertensão, e alguns tipos de
câncer incluindo de cólon, mama e próstata, melhora memória, inibe o envelhecimento, reduz
problemas de constipação intestinal, reduz risco de doenças coronárias e controla a diabetes
(GOYAL et al., 2014., RODRIGUEZ-LEYVA et al., 2010; CARRARO et al., 2012; SINGH
et al., 2011). No entanto, esses compostos são altamente susceptíveis a ação de oxigênio e luz,
o que leva a sua oxidação com consequente produção de substancias tóxicas, reduzindo o seu
efeito benéfico à saúde (GOYAL et al., 2014).
Devido à instabilidade desses compostos e do probiótico faz-se necessária a sua
proteção, que pode ser realizada por várias técnicas, como a microencapsulação. A escolha do
método de microencapsulação do bioativo de interesse deve levar em consideração diversos
fatores como, temperatura de degradação do composto, sítio de atuação, polaridade, afinidade
química bem como sua biodisponibilidade quando o intuito é nutricional (CELLI et al., 2015;
PAI et al., 2015).
Um processo interessante é a emulsificação, em especial as emulsões do tipo
múltiplas. Emulsões múltiplas são sistemas complexos, formados por processos de
emulsificações seguidas, onde os dois tipos de emulsões (A/O e O/A) existem
simultaneamente, constituindo emulsões do tipo A/O/A ou O/A/O, permitindo a encapsulação
de compostos lipofílicos e hidrofílicos simultaneamente (FLORENCE; WHITEHILL, 1982;
OMOTOSHO, 1990). É possível ainda associar mais de uma técnica com a finalidade de
proteger melhor os compostos, bem como aumentar a estabilidade da estrutura formada. Uma
alternativa é atomização seguida de gelificação iônica, que exclui o uso de altas temperaturas,
o que pode reduzir a viabilidade dos microrganismos bem como causar degradação de outros
compostos como acelerar processo oxidativo em óleos. Esta técnica ainda pode ser produzida
em grande escala e apresenta baixo custo de produção. Além disto, a produção de partículas
por esta técnica possibilita a aplicação dos microgéis em produtos que apresentam alta
atividade de água (CHAN, LEE e HENG, 2002; LI et al., 2009).
Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir microgéis a partir de
emulsões múltiplas para coencapsular diferentes ativos (probiótico, vitamina C e ácidos
Capítulo 5
87
graxos insaturados) e avaliara a sua estabilidade frente ao processo de digestão in vitro e
estabilidade frente a diferentes valores de pH.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Para o preparo dos sistemas de encapsulação foram utilizados água destilada,
polisorbato 80 (Tween 80) (Sigma), poliglicerol polirricinoleato (GRINDSTED PGPR) (BLH
= 15) e alginato de sódio doados pela Danisco Brasil LTDA (Brasil). Como materiais ativos,
empregou-se a cultura de Lactobacilus acidophilus (Chr. Hansen, Dinamarca), ácido
ascórbico comercial da marca Synth (Brasil) e óleo de linhaça doado pela Cisbra LTDA
(Brasil). Cloreto de cálcio (CaCl2) dihidratado (Dinâmica - Química contemporânea Ltda.
CAS 10035-04-8) foi utilizado para solução salina.
Para o preparo dos fluidos gastro-intestinais simulados, utilizou-se pepsina
porcina 3200-4500 U/mg (P6887), pancreatina 8 x USP (P7545) e extrato de bile 160mM
(B8631) extraídos de suínos, da Sigma-Aldrich (EUA). Os demais ingredientes utilizados
foram de grau analítico.
2.2 Ativação da cultura microbiana
A cultura de L. acidophilus foi ativada em 10 mL de caldo MRS (de Man, Rogosa
e Sharpe) e incubada por 37 °C/18 horas. O material foi transferido para outro recipiente,
contendo 90 mL de caldo MRS, e incubado sob as mesmas condições. O material obtido desta
etapa foi submetido ao processo de centrifugação a 2400 g por 9 minutos em temperatura de
20 °C, lavado duas vezes em 30 mL de citrato de sódio 2%, seguido de lavagem em 30 mL de
água destilada, antes da adição nos sistemas de encapsulação (LI et al., 2009; SANDOVAL-
CASTILLA et al., 2010).
2.3 Preparo das emulsões múltiplas
Emulsões simples água em óleo (A/O) foram produzidas pela adição de água
destilada contendo 7,5 % (m/m) de vitamina C (de modo que ficasse 1% no sistema final) ao
óleo de linhaça contendo 1% de PGPR na proporção de 1:2 (m/m), utilizando-se um
Capítulo 5
88
homogeneizador tipo rotor estator “Ultra Turrax” modelo T10 (IKA, Alemanha), a 14500 rpm
por 4 min.
Emulsões múltiplas do tipo A/O/A foram produzidas pela adição da emulsão
primária A/O com auxilio de bomba digital (Masterflex L/S Cole-Parmer Instrument
Company, EUA) a vazão de 4,5 mL/min em soluções de 1% de alginato, contendo o
probiótico (um tubo da ativação) e surfactante Tween 80. Utilizou-se agitação magnética com
velocidade de 500 rpm durante 1 hora mantendo a concentração de 2% de Tween 80 e a
proporção de emulsão primária para fase externa de 3:7 (m/m).
2.4 Preparo dos microgéis
As micropartículas foram produzidas de acordo com a metodologia proposta por
Li et al. (2009), com algumas modificações. As emulsões múltiplas contendo os compostos
ativos foram transportadas por bomba peristáltica (Masterflex, modelo 7518-00) com
alimentação de 90 rpm e atomizadas a uma altura de 30 cm em solução de cloreto de cálcio
0,15 M, onde foram mantidas sob agitação magnética por 30 minutos (Figura 1). Utilizou-se
bico atomizador (Labmaq do Brasil LTDA) de diâmetro de 0,7 mm com ar comprimido.
Posteriormente os microgéis foram filtrados em peneira com abertura de 0,053
mm, lavados em água destilada e armazenados em recipientes hermeticamente fechados a 4
°C para avaliação da eficiência de encapsulação, estabilidade em diferentes pH e simulação
gastrointestinal in vitro.
Figura 1 – Esquema de gelificação iônica por atomização
Capítulo 5
89
2.5 Digestão in vitro
Para avaliar o comportamento dos microgéis e a viabilidade dos ativos
encapsulados ao longo do processo digestivo, os microgéis foram incubados em agitador
orbital do tipo shaker (modelo T-420, Tecnal, Brasil) a 100 rpm e 37 °C, juntamente com os
fluidos salivares simulados (FSS), fluidos gástricos simulados (FGS) e fluidos intestinais
simulados (FIS), de modo a simular a digestão gástrica e entérica segundo metodologia
proposta por Minekus et al. (2014). FSS, FGS e FIS foram produzidos como proposto por
Minekus et al. (2014), juntamente com a adição de enzimas, CaCl2 e água, sendo as
concentrações eletrolíticas apresentadas, concentradas em 1,25 vezes. Antes de serem
transferidos para etapa de simulação gástrica, os microgéis foram diluídos em água, na
proporção de 1g de microgel para 4 mL de água, ou 1g de solução contendo o ativo livre em 4
mL de água de modo a reproduzir a diluição nos alimentos após isso foi adicionado então na
proporção de 50:50 (v/v) no FSS.
O FGS foi adicionado de pepsina, para obtenção de 2000 U/mL ao final da
mistura, calculados com base na ficha técnica do produto. Para ajustar o pH em 3, utilizou-se
HCl 6 M ao final da mistura, que foi incubada à 37 ºC por um período de 2 horas em agitador
orbital tipo shaker.
Na etapa de digestão entérica, a mistura resultante da etapa anterior (digestão
gástrica) foi adicionada de extrato de bile 160 mM, para obtenção de uma concentração de 10
mM no final da mistura. A pancreatina é composta por diferentes enzimas, incluindo amilase,
tripsina, lipase, ribonoclease e protease, portanto sua utilização compreende parte das enzimas
presentes no trato digestivo (MINEKUS et al., 2014). De acordo com a metodologia descrita
pelos autores, pancreatina 800 U/mL foi preparada para adição na etapa de digestão entérica.
Adicionou-se CaCl2 0,3 M ao final da mistura que teve o pH ajustado em 7 com o
auxílio de solução de NaOH 1 M antes da incubação das amostras por mais 2 horas à 37 ºC.
Os ensaios foram realizados em duplicata. Em intervalos de 20 minutos, alíquotas foram
removidas para a avaliação da distribuição de tamanho de partículas, morfologia por
microscopia ótica, determinação do perfil de liberação dos microrganismos por contagem de
UFC/g, quantificação de vitamina C e ácidos graxos livres ao longo do processo digestivo.
Capítulo 5
90
2.6 Liberação com o pH
A fim de simular aplicação em diferentes produtos, foi verificado como os
compostos e o probiótico são liberados em soluções aquosas com diferentes valores de pH. Os
microgéis obtidos foram colocados em recipientes com pH 3 e 5 e alíquotas foram retiradas
nos tempos 0, 1, 2, 24, 72 e 120 horas para análises de distribuição de tamanho de partícula,
microscopia e quantificação dos ativos liberados na água.
2.7 Quantificação dos ativos
2.7.1 Quantificação de L. acidophilus
A contagem das células viáveis de L. acidophilus foi realizada pela técnica de
plaqueamento por gota (20 µL), em superfície de ágar MRS (de Man, Rogosa e Sharpe)
(Merck). As placas foram transferidas para jarras de anaerobiose (Permution) e
posteriormente armazenadas em estufa a 37 °C/48 horas. As análises foram realizadas em
triplicata e os resultados expressos em UFC/g.
2.7.2 Quantificação de ácidos graxos livres
A quantificação de ácidos graxos livres (FFA) após o processo de digestão e
liberação em soluções aquosas com diferentes pH foram determinadas utilizando o método de
titulação (Pinsirodom, 2005). Este método consiste em titular 5 mL de amostra com gotas de
fenolftaleína a 1% (p/v), por titulação direta com NaOH 0,1 mol/L. A percentagem de FFA
foi calculada a partir do número de moles de NaOH necessário para neutralizar o FFA
dividido pelo número de moles de FFA que poderiam ser produzidos a partir da total digestão
dos triglicerídeos (Equação 1) (assumindo que 2 FFA são produzidas por 1 molécula de
triacilglicerol) (Li, Hu, Du, Xiao, & McClements, 2011):
% FFA = 100 x (vNaOH x mNaOH x Mlipid) / (Wlipid x 2) (1)
Onde vNaOH é o volume de hidróxido de sódio gasto para neutralizar o FFA gerado (em
mL), mNaOH é a molaridade do hidróxido de sódio utilizado (em mol/L), wlipid é o peso total de
óleo de linhaça inicialmente presente em solução e Mlipid é a massa molar do óleo de linhaça
(872 g/mol).
2.7.3 Quantificação de Vitamina C
Capítulo 5
91
O teor de ácido ascórbico foi determinado utilizando o método 967.21 da AOAC
(1997), que se refere ao método de titulação com 2, 6 – diclorofenol-indofenol (DCFI), com
as modificações descritas por Benassi e Antunes (1988) que substituíram a solução de
extração padrão (solução de ácido metafosfórico) por solução de ácido oxálico. Uma solução
de ácido L-ascórbico foi utilizada como padrão. A concentração de ácido ascórbico foi
calculada por comparação com o padrão conforme Equação 2.
mg Vit C/100 mL = V titulação da amostra – V titulação branco x F/V amostra x 100 (2)
Onde:
F = mg de ácido ascórbico / V gasto no padrão – V gasto no branco
V = volume (mL)
2.8 Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação foi determinada pela relação entre a quantidade do
composto (probiótico, óleo e vitamina C) adicionado inicialmente (N0) e a quantidade retida
nos microgéis após o processo de encapsulação (N) (Equação 3), determinada após a quebra
do gel.
𝑬𝑬=(𝑵/𝑵𝟎).𝟏𝟎𝟎 (3)
Para quebrar o gel, 1 g de microgéis foram transferidos para 10 mL de citrato de
sódio (0,06 mol/L) em pH 8,18±0,02 e submetidos à agitação magnética por 45 minutos a 37
°C. O probiótico e vitamina C foram quantificados, conforme itens 2.7.1 e 2.7.3
respectivamente.
2.9 Método Bligh-Dyer
A eficiência de encapsulação do óleo, foi determinada pelo método de Bligh-Dyer
(BLIGH E DYER, 1959). Por se tratar de amostras com alto teor de umidade usou-se entre 2 a
3 g das emulsões e microgéis para extração a frio dos lipídios totais (LT), que foram
transferidos para um erlenmayer e adicionados 10 mL de clorofórmio (CHCl3), 20 mL de
metanol e 8 mL de água destilada. O extrato foi agitado por 30 min e em seguida adicionados
mais 10 mL de CHCl3 e 10 mL da solução de sulfato de sódio 1,5%. O erlenmayer foi
tampado e agitado por mais 2 minutos. Deixou-se a amostra decantar em funil de separação, e
na parte inferior foi adicionado cerca de 1g de sulfato de sódio anidro, para remover traços de
água. A amostra foi então filtrada rapidamente em funil e 5 mL do filtrado foram transferidos
Capítulo 5
92
para béquer de 50 mL para evaporação do solvente em estufa a 80°C (15-20 minutos). Após,
foi resfriado e pesado em balança analítica e procedido os cálculos (Equação 4).
% lipídeos totais = p x 4 x 100/ g (4)
Onde: p= massa dos lipídeos (g) contido em 5 mL
g= massa da amostra (g)
2.10 Distribuição de tamanho de gotas
A distribuição de tamanho de gotas de emulsões e partículas dos microgéis foi
determinada com o auxílio de um analisador de tamanho de partículas por difração a laser
Mastersizer 2000 – versão 5.60 (Malvern Instruments LTDA., Worcestershire, RU). Três
leituras foram obtidas de cada amostra. Foi analisado o tamanho de partículas, expresso como
diâmetro médio volumétrico (D [4,3]), e a polidispersidade.
2.11 Análises Microscópicas
2.11.1 Microscopia ótica
As emulsões e as partículas de microgéis foram visualizadas através de
microscopia ótica, com auxílio de um microscópio óptico Carl Zeiss Modelo Axio Visio
(Zeiss, Alemanha), com objetiva de 100x.
2.11.2 Microscopia confocal
A microscopia confocal de fluorescência foi utilizada para analisar a estrutura das
emulsões A1/O/A2. Para essa análise, o corante vermelho do nilo foi adicionado às amostras
de maneira a marcar as moléculas de óleo presente e a calceína foi utilizada para fase aquosa
interna. As amostras foram examinadas utilizando um confocal Zeiss LSM 780-NLO em um
microscópio Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Alemanha) com uma objetiva de 100x. As
imagens foram obtidas utilizando comprimento de onda de 552 e 495 nm para excitação e 639
e 515 nm para emissão do vermelho do nilo e da calceína, respectivamente.
2.11.3 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As partículas produzidas foram preparadas para microscopia eletrônica de
varredura de acordo com a metodologia descrita por Aline et al., (2011) com algumas
Capítulo 5
93
modificações. Amostras de macrogéis foram preparadas por gotejamento da emulsão múltipla
utilizando uma mangueira de 13 mm de diâmetro com auxílio de bomba peristáltica
(Masterflex, modelo7518-00) (Figura 2), de modo a se verificar a estrutura interna das
partículas formadas. Microgéis, produzidos conforme descrito na seção 2.4 foram analisados
para avaliação da sua estrutura externa. Após a produção, as partículas foram fixadas por 24
horas em tampão glutaraldeído (2,5%) e cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2) com a finalidade
de minimizar modificações estruturais durante os tratamentos de secagem posteriores. As
amostras de macrogéis fixadas foram fraturadas em nitrogênio líquido, para exposição da
estrutura interna, e lavadas por duas vezes em tampão cacodilato. Após, a fixação, as
partículas foram desidratadas em soluções de etanol (30%, 50%, 70%, 90%). A desidratação
foi finalizada com três lavagens em etanol 100% seguida pela secagem em ponto crítico
(Balzers Critical Point Dryer CPD03).
As amostras foram fixadas em porta-espécimens metálicos (stubs) e metalizadas
com uma liga de ouro/paládio por 200 segundos em Sputter Coater (Balzers Sputter Coater
SCD 050), para serem então observadas em microscópio eletrônico de varredura (VEJA 3
SBU, Tescan Republica Tcheca). As imagens foram captadas com aceleração de voltagem de
5 kV e amplificação de 1000x.
Figura 2 – Obtenção da macro esfera para analise de MEV
Capítulo 5
94
2.12 Análise dos Dados
Todos os resultados foram analisados por meio da análise de variância (ANOVA)
e as diferenças entre as médias, pelo teste de Tukey, utilizando-se o programa estatístico
SISVAR versão 5.6 a 5% de significância (FERREIRA, 2011).
3.RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Avaliação da emulsão múltipla
Após o preparo dos sistemas com a adição dos ativos, foram realizadas
microscopia ótica e confocal (Figuras 3A e B), que permitiram comprovar a formação da
emulsão múltipla.
Figura 3 – Emulsão múltipla A) Microscopia óptica e B) Microscopia confocal.
Foi possível observar que o probiótico ficou na fase externa, como pode ser
observado pela Figura 3 A apresentando formato de bastonete com aproximadamente 10 µm
comprimento, tamanho característico de lactobacilos segunda literatura (NG, 2009) e que,
pela microscopia confocal (Figura 3 B), a fase intermediaria era óleo, ficando corada em
vermelho pelo corante lipofílico vermelho do nilo. A fase interna (A1) hidrofílica, corada com
calceína, apresentou a coloração verde, enquanto a fase externa (A2) não foi corada,
permanecendo a coloração preta pela microscopia confocal de fluorescência.
Probiótico
A1
Óleo
Capítulo 5
95
3.2. Macro e microgéis
A formação de microgéis ocorre por difusão dos cátions bivalentes presentes na
solução salina através da superfície da gota, promovendo a formação de ligações cruzadas nas
partículas formando estrutura do tipo de caixas de ovos com o alginato (Figura 4) (BUREY et
al., 2008; ELLIS e JACQUIER, 2009).
Figura 4 – Processo de gelificação da emulsão múltipla por íons cálcio
Com a finalidade de investigar a interação dos compostos da matriz de
encapsulação, a estrutura dos macrogéis formados por gelificação iônica da emulsão múltipla
contendo solução de vitamina C, óleo de linhaça, alginato e probiótico, os géis foram
avaliados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Figura 5 A e B).
Figura 5 – Gel de emulsão A) MEV da superfície da partícula, B) MEV do possível interior
da partícula. Aumento 1000x Escala 50 µm
Foi possível observar que o gel formado apresentou estrutura externa homogênea
e complexa porém, compacta e com pouca porosidade (Figura 5 A), como observado por
Ca2+
Capítulo 5
96
Hermansson et al., (2016). Quando fraturado, observou-se presença de gotas presas à rede
(Figura 5 B), o que pode ser associado à presença das gotas de óleo da emulsão simples A1/O,
como observado na Figura 3 B e esquematizado na Figura 4. Ao gotejar a emulsão múltipla
contendo alginato na fase externa, forma-se gotas com gotas da emulsão simples dentro
(A1/O), que podem ser observadas após a fratura das partículas pela MEV (Figura 5B). Essas
gotas internas são da mesma magnitude das gotas de óleo mostradas na microscopia otica
(Figura 3A) evidenciando assim que realmente se trata de gotas de óleo.
Após a avaliação da estrutura interna, a estrutura externa das micropartículas foi
avaliada (Figura 6 A e B).
Figura 6 – Microgel atomizado. A) Microscopia óptica, B) MEV aumento 1000x
As imagens de microscopia mostraram que o microgel apresentou estrutura
externa com rugosidades e com formato não esférico (Figura 6). Pode-se observar também
redução significativa no tamanho das partículas obtidas após o processo de atomização, em
comparação com as macroesferas (Figura 5A e 6B). As partículas obtidas apresentaram
formato não esférico e gotas de óleo dispersas, o que pode ser relacionado à distância entre o
bico atomizador e a solução gelificante, que não foi suficiente para a formação de gotas
esféricas (Figura 5A). Segundo Puguan, Yu e Kim (2014), microgéis de alginato produzidos
por gelificação externa apresentam um gradiente de concentração provocado pelo processo de
Capítulo 5
97
difusão, onde inicia-se na superfície da cápsula e causa resistência aos íons de Ca+2
subsequentes, resultando na formação de uma estrutura heterogênea, com a superfície mais
concentrada.
3.2.1 Eficiência de encapsulação
A Tabela 1 apresenta os resultados de eficiência de encapsulação obtidas a partir
da dissolução dos microgéis contendo ativos coencapsulados.
Tabela 1 – Eficiência de encapsulação
Probiótico (%) Vitamina C (%) Óleo (%)
72,76 1,89 79,8
O probiótico e o óleos tiveram boa retenção, mesmo estando na camada mais
externa da emulsão. A baixa eficiência de encapsulação da vitamina C, pode ser explicada
pela perda ocorrida durante o processo de atomização, ter migrado pela rede do gel devido sua
baixa massa molar, ou até mesmo ter degradado. A partir dos resultados obtidos foi possível
observar que a técnica proposta permite coencapsular mais de um ativo, porém são
necessários novos estudos para aumentar a eficiência de encapsulação.
3.3 Estabilidade dos microgéis em soluções aquosas a diferentes pH
Com o objetivo de estudar a estabilidade dos microgéis, foram colocados em
diferentes pH a saber 3 e 5, e foi analisado tamanho, microscopia e compostos liberados. Ao
avaliar a estabilidade frente os pH, foi possível observar que em solução com pH mais ácido o
valor de D[4,3] aumentou, abaixando em seguida (Figura 7), já para a solução com pH 5 o
mesmo parâmetro não teve nenhum aumento.
Capítulo 5
98
Tempo
(Horas) pH 3 pH 5
0
1
24
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
1
2
3
4
5
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
Capítulo 5
99
72
120
Figura 7 – Distribuição de tamanho, D[4,3] e polidispersidade
Os compostos liberados nas soluções ácidas contendo o microgel foram
quantificados nos tempos de 0 a 120 horas, a fim de determinar se ficariam estáveis nos
valores de pH estudados ou não. Não houve diferença na quantificação de todos os compostos
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
2
4
6
0,1 10 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 24 72 120
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Tempo (horas)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 24 72 120
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Tempo (horas)
Capítulo 5
100
em relação aos pH estudados. Entretanto, mesmo a partícula estando intacta em todos os
tempos estudados (Figura 7), foi possível a quantificação dos mesmos em relação ao tempo,
com destaque para o probiótico que aumentou a contagem no decorrer do tempo com
tendência crescente (Figura 8). Pode associar esse dado, com a microscopia (Figura 3 A),
onde foi possível observar que o probiótico ficou na camada mais externa da emulsão,
consequentemente na mais externa do gel formado.
Figura 8 – Unidades formadoras de colônia de probiótico ao longo do tempo em diferentes pH
. Tempo 0
Quanto aos ácidos graxos livres, que podem ser relacionados com o óleo presente,
houve um pico nas primeiras horas e permaneceu estável nas horas seguintes (Figura 9). O
pico inicial pode ter sido provocado pela presença de óleo na superfície da partícula,
consequente do processo de atomização, ficando constante após 72 horas.
1
2
4
8
0,1 1 10 100 1000
Log
UFC
/g
Tempo (h)
Probiótico
pH 3
pH 5
a a a
b
Capítulo 5
101
Figura 9 – Ácidos graxos livres ao longo do tempo em diferentes pH Tempo 0
A vitamina C foi o ativo que teve menor eficiência porém, a sua quantificação
durante o tempo nas soluções ácidas, se manteve mais estável (Figura 10). Essa quantificação
pode ser explicada pela migração da vitamina C pela rede do gel.
Figura 10 – Vitamina C ao longo do tempo em diferentes pH. Tempo 0
Os pH estudados não interferiram na liberação dos compostos, porém no pH 3
pode ser observado leve intumescimento como pode ser observado pelo valor de D[4,3] na
Figura 7.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0,1 1 10 100 1000
% F
FA
Tempo (h)
Ácido Graxo
pH3
pH 5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0,1 1 10 100 1000
mg
vi.
C/1
00
mL
Tempo (hora)
Vitamina C
pH 3
pH 5
Capítulo 5
102
3.4 Digestibilidade
As gotículas produzidas por emulsão múltipla e microgel contendo os ativos
encapsulados foram submetidos à digestão in vitro, sendo avaliados quanto à distribuição de
tamanho de gotas/partículas (Figura 11), microscopia ótica (Figura 12) e quantificação dos
compostos ativos liberados (Figura 13). Os resultados foram comparados à estabilidade dos
ativos não encapsulados ao longo da digestão.
3.3.1 Tamanho de partículas e morfologia
Ao fim do processo digestivo (após 4 horas) tanto o gel quanto as gotículas de
emulsão apresentaram tamanhos menores do que no início do processo. O gel aumentou de
tamanho após 60 minutos, ainda na fase gástrica, indicando assim que a partícula formada
passa por um intumescimento provocado provavelmente pela entrada de água nos poros,
como pode ser observado pelos valores de D[4,3] que passa de 100 para 500 µm (Figura 11).
O tamanho dos microgéis começa a reduzir a medida que inicia a fase entérica, indicando que
a estrutura inicial pode estar se degradando (Figura 11). A estabilidade de microgéis de
alginato foi relatada por Li et al. (2009), onde observaram que os microgéis apresentaram um
inchamento nos primeiros 30 minutos, mantendo-se estáveis quando expostos às condições
gástricas. A erosão das cápsulas foi observada nas condições intestinais simuladas, o que está
de acordo com os resultados apresentados. Com o decorrer do tempo, o pico menor
encontrado na distribuição de tamanho das partículas do microgel tende a aumentar, o que
pode ser associado à liberação do óleo pela degradação da estrutura gelificada. Para a emulsão
múltipla durante a fase gástrica a distribuição é parecida com a do tempo 0. Na fase entérica o
sistema fica mais polidisperso e aumenta a faixa de tamanhos maiores, que pode ser explicado
por possível aglomeração das gotas (Figura 11).
Capítulo 5
103
Gel Emulsão
Figura 11 – Curvas de distribuição de tamanho de partículas, polidispersidade e diâmetro
médio volumétrico (D[4,3]) dos microgéis e da emulsão múltipla durante a digestão
A Figura 12 apresenta as imagens obtidas por microscopia ótica das amostras
submetidas à simulação gastrointestinal ao longo do tempo. É possível observar que os
microgéis foram capazes de manter sua estrutura ao longo da passagem pelo trato gástrico, ou
seja, quando submetidos às condições ácidas e à presença de pepsina, o que corrobora com os
resultados de distribuição de tamanho (Figura 11). Além disso, as imagens evidenciam a
presença de óleo junto com as partículas de microgel, que correspondem aos picos nas faixas
0
1
2
3
4
5
6
0,1 1 10 100 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
60
120
180
240
Tempo (min)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0,1 1 10 100 1000
Vo
lum
e (
%)
Tamanho (µm)
0
60
120
180
240
Tempo (min)
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
0 60 120 180 240
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Tempo de digestão (min)
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
0 60 120 180 240
D[4
,3]
(µm
)
Po
lidis
pe
rsid
ade
(-)
Tempo de digestão (min)
Gástrica Entérica Entérica Gástrica
Capítulo 5
104
de 100 e 20 µm observados na Figura 11. A emulsão múltipla, por outro lado, se desestabiliza
rapidamente logo na etapa de digestão gástrica, onde após a primeira hora já não é possível
observar mais a estrutura de emulsão múltipla (Figura 12). Isso pode ser explicado devido a
sua baixa estabilidade como já discutido em sessões anteriores.
Capítulo 5
105
Tempo (min) Gel Emulsão A1/O/A2
0
60
120
180
240
Figura 12 – Microscopia óptica durante a digestão. Escala 20µm.
Capítulo 5
106
Outra observação relevante de Li et al. (2009) é que a instabilidade das cápsulas
está associada à mudança de pH do meio ao passar de ácido para neutro, além da exposição
aos sais biliares, pois os íons Ca+2
ligados aos grupos carboxílicos do alginato iniciam um
processo de troca iônica com os sais presentes na etapa de simulação entérica. Como
resultado, ocorre relaxação das cadeias, com consequente repulsão dos grupos negativos
COO- do alginato, ocorrendo inchamento e ruptura do gel.
3.3.2 Quantificação dos compostos ativos
Ao longo do processo digestivo observou-se que a contagem de probióticos sem
nenhuma proteção (livre) decresceu de 4,26 para 2,52 log UFC/g na primeira hora da fase
gástrica, com contagem igual a zero na final desta fase (Figura 13 A). Os resultados mostram
que a incorporação destes em sua forma livre não confere efeito benéfico à saúde, pois não
houve contagem na fase entérica, segundo Saad (2006) para que os probióticos exerçam
benefício ao hospedeiro, devem chegar ao intestino. No entanto, avaliando a contagem dos
microrganismos probióticos protegidos pelo microgel, observou-se contagem de 3,52 log
UFC/g com aumento para 6,30 log UFC/g após 80 minutos de simulação da digestão, ainda
na fase gástrica. Este aumento na contagem pode ser associado ao aumento da difusão devido
ao intumescimento da partícula (Figura 11), favorecendo a sua liberação para o meio (Figura
13 A). Em relação à emulsão múltipla, observou-se que esta também exerceu efeito protetor
sobre o probiótico, quando foi observado um aumento na contagem no início da fase entérica.
É importante ressaltar que mesmo que a estrutura não tenha apresentando estabilidade (Figura
12), a contagem de microrganismos incorporados nas emulsões múltiplas apresentou um
aumento significativo no começo da fase entérica, onde espera-se que os microrganismos
possam exercer sua atividade biológica. Esse efeito protetor da emulsão pode ser pela
presença de óleo no meio, onde o probiótico pode ter permanecido na interface. Assim, a
queda que se observa no início da digestão é devido à presença de probiótico livre na fase
externa, que perderia rapidamente sua viabilidade nas condições gástricas. Ortakci e Sert
(2012) observaram que os L. acidophilus livres não sobreviveram a etapa de simulação
gástrica. O aumento que houve, ainda na fase gástrica, pode ser explicado pela sua liberação
gradual da interface água/óleo.
Capítulo 5
107
A quantificação do óleo de linhaça, que pode ser relacionada com os ácidos
graxos livres, manteve-se estável ao longo de toda a fase gástrica, independente da estrutura
(emulsão ou microgel de emulsão) (Figura 13 B). Observa-se que a quantidade de ácidos
graxos livres das emulsões múltiplas foi superior aos sistemas gelificados ao longo da etapa
gástrica, o que pode ser associado à rápida desestabilização das emulsões não gelificadas
(Figura 12). Logo no início da fase entérica, observa-se uma redução significativa na
quantidade de FFA, o que pode ser associada à degradação do óleo. Em relação aos
microgéis, observa-se que foi possível quantificar o óleo de linhaça, mesmo este estando na
fase intermediária. A sua quantificação na fase gástrica, pode ser associada às gotas de óleo
livre ao redor das partículas (Figura 12), que podem ter passado para a parte mais externa do
gel, durante o processo de atomização. O aumento na quantidade de FFA ao longo da fase
entérica pode ser diretamente associado à liberação do óleo devido a degradação da partícula
nesta etapa. Tal resultado torna o uso desta estrutura bastante interessante para a veiculação
do óleo, uma vez que a maior parte dos lipídeos são absorvidas no intestino delgado (MUN et
al., 2007).
Capítulo 5
108
Figura 13 – Liberação na digestão in vitro, A)Unidades formadoras de colônia de probiótico,
B) ácidos graxos livres, C) Vitamina C
Como a vitamina tem baixo peso molar, pode ter ocorrido perda no processo de
gelificação, saindo pela rede do gel. Devido a essa possível perda sua quantificação foi baixa
(Figura 13 C), onde o que foi quantificado foi o que estava na superfície e permaneceu
constante o que pode indicar que nem toda a vitamina C do interior foi liberada. A alta
quantificação da vitamina C na emulsão, pode ser explicada que diferentemente do microgel
não passou por nenhum processo após a sua produção e já foi iniciada a digestão assim que
foi produzida. Devido a lenta liberação da vitamina C incorporada no microgel, é interessante
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0 40 80 120 160 200 240 280
log
UFC
/g
Tempo (min)
Gel
Emulsão
Livre
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 40 80 120 160 200 240 280
% F
FA
Tempo (min)
Emulsão
Gel
5
205
405
605
805
1005
1205
1405
1605
1805
0 40 80 120 160 200 240
mg
Vit
C/1
00
mL
Tempo (min)
Gel
Emulsão
Gástrica Entérica
Gástrica Entérica
Gástrica Entérica
Capítulo 5
109
utilizar esta fase interna para proteção de compostos que se desejava esse tipo de liberação,
como por exemplo, compostos que devem chegar nos últimos estágios da fase entérica.
4 CONCLUSÃO
Os microgéis produzidos por gelificação iônica a partir de emulsão múltipla e
alginato, foram eficientes para manutenção da viabilidade dos L. acidophilus, óleo de linhaça
e vitamina C, durante digestibilidade in vitro e estabilidade frente às variações de pH. Os
resultados obtidos mostraram que o microgel promoveu melhor proteção dos compostos tanto
livres quanto na emulsão.
As soluções mais ácidas promoveram a liberação dos compostos para o meio.
Assim microgéis desse tipo devem ser incorporados em alimentos mais básicos.
Os resultados foram importantes e promissores para aplicação de compostos que
necessitem de liberação lenta e gradual, além de permitir coencapsulação de compostos
lipofílicos e hidrofílicos, possibilitando investigações futuras para veiculação de ativos que
necessitem de microcápsulas com maior resistência.
É recorrente que atributos funcionais vêm ganhando cada vez mais espaço no
mercado. Sendo assim, faz-se necessário mais estudos referentes a liberação controlado de
ativos coencapsulados por microgéis bem como de emulsões múltiplas.
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Capítulo 6
113
Capítulo 6
Discussões Gerais
Capítulo 6
114
A fim de produzir emulsões simples água em óleo (A/O) estáveis, foram testadas diferentes
concentrações de PGPR como surfactante, tempo e velocidade de processo. A velocidade
exerce maior influência no tamanho de gotas que o tempo de homogeneização. O aumento da
concentração levou a redução da tensão interfacial e aumento da estabilidade das emulsões. A
concentração de 1% atingiu os parâmetros de estabilidade no tempo desejado, sendo definida
para as próximas etapas deste trabalho. Definida a concentração de surfactante da fase interna,
o mesmo estudo foi realizado para definir a concentração de surfactante da fase externa de
emulsões múltiplas do tipo A/O/A, além disso, foi avaliado também a influência da
concentração de surfactante da fase interna na estabilidade da emulsão múltipla. Tanto a
concentração da fase interna quanto a da fase externa exercem influência na estabilidade de
emulsões múltiplas, onde maiores concentrações de surfactante na fase interna tendem a
formar emulsões múltiplas com mais gotas e mais estáveis, enquanto maiores concentrações
de surfactante na fase externa ocasionaram maior estabilidade e menor tamanho de gota. Após
esse primeiro estudo, visando a veiculação de diferentes compostos em uma mesma estrutura,
micropartículas gelificadas foram produzidas a partir de emulsões múltiplas com
concentração de surfactante PGPR na fase interna de 1 % e Tween 80 na fase externa de 2%.
Assim, propriedades mecânicas e capacidade de retenção de água destes géis foram avaliadas,
a partir de emulsões múltiplas (A1/O/A2) e controle (O/A2) em duas razões 1:10 e 3:7 (m/m).
Não foi observada diferença significativa nos parâmetros de capacidade de retenção de água,
tensão e deformação de ruptura entre as amostras produzidas a partir das emulsões simples,
múltiplas e solução de alginato puro (p<0,005), com uma tendência na redução da tensão na
ruptura nos sistemas produzidos a partir das emulsões. Os microgéis obtidos por atomização
apresentaram tamanho na ordem de 10 a 1000 µm e sua suspensão apresentou comportamento
pseudoplástico, com exceção das suspensões obtidas por alginato puro, que apresentou
dispersão em meio aquoso com comportamento newtoniano, o que foi associado à maior
dureza deste gel. Após determinadas as propriedades das emulsões e dos géis de emulsão foi
feito estudo visando incorporação de compostos bem como sua liberação frente a atividade
digestiva e estabilidade frente a diferentes pH. A estabilidade das partículas em diferentes
valores de pH mostrou um aumento expressivo na contagem de probióticos após 24 horas, o
que pode ser atribuído pela rede porosa formada pelo alginato, favorecendo o inchaço da
partícula e consequente liberação por difusão. Em relação aos ensaios de simulação de
Capítulo 6
115
digestão, houve um deslocamento na distribuição de tamanho das partículas para tamanhos
menores com o tempo de digestão, resultado que pôde ser comprovado pela microscopia. A
quantificação dos compostos mostrou um aumento na fase entérica, indicando que a técnica
utilizada foi eficiente para proteção dos ativos às condições gástricas. Os resultados deste
trabalho mostraram que é possível encapsular compostos com diferentes polaridades em uma
mesma estrutura, melhorando a sua viabilidade após processo de digestão em relação aos
compostos não encapsulados.
Capítulo 7
116
Capítulo 7
Conclusões Gerais
Capítulo 7
117
Todas as concentrações estudadas de surfactante da fase interna (PGPR), e
condições de processos avaliadas podem produzir emulsões simples do tipo água em óleo,
sendo que não foi observada influência do tempo de processo nas características das
emulsões. O uso de 1% de PGPR pode se tornar uma boa alternativa para produção da
emulsão primária, destinadas à produção de emulsões múltiplas. Para a produção das
emulsões do tipo A1/O/A2, todas as concentrações de surfactante formaram emulsões
múltiplas com destaque para 2% de Tween que apresentou tamanho de gotas menores e maior
estabilidade.
As emulsões múltiplas e controle nas razões entre fazer interna (emulsão
simples/primária ou óleo) e externa (solução de alginato) 1:10 e 3:7 foram caracterizadas
pelas curvas de escoamento, apresentando comportamento pseudoplástico com valores de n
menores que 1. As emulsões na proporção de 3:7 mantiveram-se mais estáveis, o que foi
associado à maior quantidade de gotas, sendo assim mais indicadas para utilização. Com todas
as amostras foi possível a formação de macrogéis com capacidade de retenção de água
superior a 50 %, indicando capacidade de incorporação de compostos hidrofílicos.
A estrutura formada foi eficiente na proteção dos compostos frente a
digestibilidade, onde aumentou a quantificação na fase entérica, local onde são absorvidos. Os
resultados foram importantes e promissores para aplicação de compostos que necessitem de
liberação lenta e gradual, além de permitir coencapsulação de compostos lipofílicos e
hidrofílicos, possibilitando investigações futuras para veiculação de ativos que necessitem de
microcápsulas com maior resistência.
Capítulo 8
118
Capítulo 8
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