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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOSTécnicas Imunológicas
Ensaios Hormonais
BIOMEDICINA FIEL
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações imunoquímicasReação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial
Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de antígeno a ser pesquisado))
Superfície da célula Disperso em solução
Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de
anticorpo) Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de
anticorpo) Afinidade Avidez Diversidade
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Classificação dos Imunoensaios
Classificação Sinalizador Deteção do
sinal Sensibilidade Automatizável?
Precipitação Nenhum visual (olho nu) turbidez, nefelometria
10 microgramas/mL Não REAGENTES NÃO
MARCADOS Aglutinação de Partículas
Látex, gelatina Céluas
visual (olho nu) contagem de partículas
5 microgramas/mL Não
Radio-imunoensaio Radioisótopos Contagem fótons 5 picogramas/mL Não
Enzimáticos Enzimas Espectrofotometria Fluorometeia Contagem fótons
0,1 picogramas/mL SIM
Fluorescentes Fluoróforos Fluorometria Contagem fótons
5 picogramas/mL SIM
Quimioluminescentes Compostos quimioluminescentes
Fluorometria Contagem fótons
5 picogramas/mL SIM
REAGENTES MARCADOS
Combinados (Axsym) Combinados Combinados variável SIM
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação
QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio.
Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos
componentes: FENÔMENO PR0-ZONA
Desnecessária separação do complexo antígeno+anticorpo (fase ligada) das substâncias livres no meioCOMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode ser quantificado: visualmente a olho nu visualmente usando um microscópio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometria
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação
Fatores interferentes: Concentrações do antígeno e do anticorpo
presentes no “sistema” (amostra+reagente)
Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH) Precipitação máxima: concentrações
equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)
Sensibilidade: 10 microgramas/mL
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação Direta Clássica
triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES VDRL – Venereal Desease Research Laboratory RPR – Reagina Plasmática Rápida RPS - Reagina Para Sífilis medido nestas reações:
presença de anticorpos para o material lipoproteico das células danificadas pela doença.
presença de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas
Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOSSensibilidade: 78% na fase primária (74 a 87%) 100% na fase secundária 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação DERIVADAS
MANUAIS Imunodifusão Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixação Eletroimunodifusáo
UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA
AUTOMATIZADAS NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA
UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Nefelometria e Turbidimetria
Possibilidade de Automação total Nefelômetros Equipamentos de bioquímica (turbidimetria)Dosagem de proteínas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína) Fator Reumatóide Microalbumina Proteína C Reativa Apoliproproteína inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas, transferrina
etc)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de AglutinaçãoFormação de agregados grandes de partículas com múltiplos determinantes antigênicos interligados por pontes moleculares de anticorpos;Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes partículasDetectam tanto a presença de IgM quanto de IgGVisualização: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lâminas:
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de AglutinaçãoFatores interferentes:
Classe do Anticorpo envolvido;Eletrólitos;Macromoléculas Hidrofílicas;Enzimas; pH (6 a 8);Tempo;Temperatura
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Falso Negativas
Quantidade pequena de anticorpos:a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a
sua superfície (sensibilizada), não formando pontes e não aglutinando;
Quantidade muito grande de anticorpos (fenômeno Pró-zona)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS
1. Determinantes antigênicos Naturais:Eritrócitos humanos – determinação grupo sangüíneo ABO Bactérias – SLIDEX meningites Protozoários
2. Partículas inertes revestidasLátex (mais comum) – teste de gravidezGelatinaBetonita, polipeptídeos
3. Células antigenicamente não relacionadas Células revestidas com antígenos solúveis: ou com antígenos solúveis adsorvidos ou fixados
Hemácias e bactérias
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas
Aglutinação direta : ex teste de gravidez
Aglutinação passiva
Hemaglutinação direta: ABO RH
Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose
Hemaglutinação Passiva
Inibição de Hemaglutinação
Inibição de Hemaglutinação passiva
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência Manual 1
Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antígeno.Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos –
Isotiocianato de Fluoresceína* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência Manual 2 - DIRETA
A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência
Pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico conjugado a substância fluorescente (conjugado)*
microscópio de fluorescência
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência Manual 3 – IFI - INDIRETA
A- pesquisa de antígeno• amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• microscópio de fluorescência• * lavagens
B- pesquisa de anticorpos• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *• microscópio de fluorescência• determinação do título e classe do Ac
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificação tipo de reação (cinética)
COMPETITIVOS Há competição entre a substância presente na
amostra (ou o padrão) e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos específicos – variante: Radioimunoensaio (RIA).
NÃO COMPETITIVOS: São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase
sólida e outro marcado com alguma substância geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui níveis de sensibilidadeanalítica superiores. Desvantagem, precisam ter dois epítodos. Variante: Imunométrico
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Competitivo ou não
Competitivo: Quanto maior a
concentração do analito menor a contagem do sinal
Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou “cut-off”
Não Competitivo Quanto maior a
concentração do analito maior a contagem do sinal
Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou “cut-off”
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
COMPETITIVOSanticorpo primário na fase sólida – (pag
963) e antígeno marcado anticorpo secundáriosecundário na fase sólida – (pag
964) e antígeno marcado
NÃO COMPETITIVOSSEQUENCIAL SANDUÍCHE
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS
Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiométrico (IRMA)
Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimático MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas
Marcador FLUORESCENTE Imunofluorométrico (IFMA) FPIA – Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay
Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescência convencional EQL,
Eletroquimioluminescência (ECLIA) Ensaio imunológico quimioluminescente magnético
CMIA
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
Fatores Interferentes: Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais.
Presença de Anticorpos Heterófilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS Fatores interferentes II
Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligação inespecífica de constituintes do soro ao suporte sólido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade.
Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificação de substâncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligação.
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA
pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em São Paulo)um dos componentes do sistema é marcado com isótopo radioativo ensaios competitivos : o reagente marcado é = à
substância que se quer dosar (antígeno) (RIA/RIE) ensaios não competitivos: o reagente marcado é
um segundo anticorpo (IRMA)O radioisótopo mais utilizado é o I125 (57,5 dias)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA
EIA – Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático
ELISA - Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay
MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas
ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay:
Ensaio imuno-enzimático fluorescente
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
ETAPAS ELISA, EIAsensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag ou do Acbloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) *adição da amostra (em diluente) *adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupção da reação: SDS ou ácido forte leitura: leitor de ELISA
* lavagens
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
EIA – ELISA Vantagens e Desvantagens
Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica;Cuidados com interferentes, reações cruzadasVersatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura;Erros operacionais, variáveis analíticasAdaptação a diferentes graus de automaçãoInstabilidade dos reagentesInfluência em manipulações e do equipamento
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA
MEIA – Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio
imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente
– Axsym) (ABBOTT)
ELFA – Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-
enzimático fluorescente
IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio
Imunofluorométrico
FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores FLUORESCENTES
Utilizam enzimas com substratos FluorescentesUtilizam aparelhos denominados de Fluorômetros;As técnicas diferem quanto ao suporte sólidoAs técnicas diferem também á forma de ampliar o sinal;Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA
Possui sensibilidade e especificidades elevadas;Bom método para dosagens hormonais
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA I
Reação entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instável o qual após estabilização gera emissão de fótons de luz medida por FM, que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos(CPS).
São reações de oxidação ►luz no espectro visível;
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA II
A sensibilidade de um método enzimático aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromogênico por um luminescente;É a emissão de luz produzida em algumas reações químicas envolvendo moléculas que emitem luz, quando passam do estado de excitação para o basal eletrônico;São altamente sensíveis;Método de escolha para quantificação de substâncias, como hormônios e marcadores tumorais.
DAISY DE SOUZA ARAÚJO PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIAPra que serve??? Qual vantagem?
1. UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3,
CA-19-9, CEA, AFP) HORMÔNIOS DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTEÍNA
2. VANTAGENS:Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato cromogênico por um luminescente