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ESTUDIO DE LOS EXTRACTOS DE TABACO (Nicotiana tabacum) Y DE
LAS METODOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN, EN LA DETERMINACIÓN
DE LA ACTIVIDAD DE ATRACCIÓN O REPELENCIA
SOBRE Macrociphum rosae
MAURICIO GUTIÉRREZ CAYÓN
JORGE ROBLES CAMARGO Ph.D.
Director del trabajo
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al título de
BIÓLOGO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
Bogotá D. C.
Febrero, 2002
NOTA DE ADVERTENCIAArticulo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946: “La universidad no se
hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis
de grado”
ESTUDIO DE LOS EXTRACTOS DE TABACO (Nicotiana tabacum) Y DELAS METODOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN, EN LA DETERMINACIÓN
DE LA ACTIVIDAD DE ATRACCIÓN O REPELENCIA SOBRE Macrociphum rosae
MAURICIO GUTIÉRREZ CAYÓN
________________________________________JORGE ROBLES CAMARGO Ph.D.
Biólogo, Director del trabajoDepartamento de Química
________________________________________NATALIA RUIZ Ph.D. (Jurado)Bióloga, Facultad de Biología
Universidad Nacional de Colombia
________________________________________MIGUEL SERRANO Ph.D. (Jurado)Biólogo, Facultad de Agronomía
Universidad Nacional de Colombia
________________________________________ÁNGELA UMAÑA MUÑOZ M.Phil.
Decana Académico de la Facultad de Ciencias
________________________________________LUZ MERCEDES SANTAMARÍA
BiólogaDirectora de la Carrera de Biología
Quiero dedicarle este trabajo a todos aquellos que creyeron y creen en mi;
pero en especial a Patricia y Alfredo (mis padres) que me ayudaron y
apoyaron de diferentes formas y en distintas ocasiones; al loco de Paco que
también me dio su apoyo durante mis estudios; y especialmente a Dios.
“El corazón del entendido adquiere sabiduría; y el oído de los sabios busca
la ciencia”
Proverbios 18:15
“Hermanos, yo mismo no pretendo haberlo alcanzado ya; pero una cosa
hago: olvidando ciertamente lo que queda atrás, y extendiéndome a lo que
está adelante,”
Filipenses 3:13
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todos los integrantes del Departamento de Química que
me dieron el apoyo para poder realizar el presente trabajo; a los miembros
de RYEGA en especial a Patricia Mora que sin su colaboración no hubiese
sido posible este proyecto; a Jorge Robles Camargo Ph.D. por dirigirme en el
desarrollo del proyecto; a Fabio Gómez, Director del Museo de Historia
Natural de Universidad Javeriana, por ser un excelente profesional,
excepcional amigo que me alentó y apoyo; a Rafael Rubio por su
colaboración en la edición de este trabajo; a Erick el “Carnal” por su ayuda,
apoyo y gran amistad; a todos mis amigos gracias; finalmente a Dios.
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN.................................................................................................................. 10
v
1. INTRODUCCIÓN................................................................................................... 12
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA.........................................14
2.1 Revisión taxonómica de la familia Solanaceae................................................. 142.2 Género Nicotiana............................................................................................... 16
2.2.1 Nicotina tabacum L.....................................................................................162.3 Metabolitos Secundarios....................................................................................162.4 Alcaloides.......................................................................................................... 172.5 Nicotina..............................................................................................................18
2.5.1 Nomenclatura química y sinónimos de la nicotina.....................................192.5.2 Formula y estructura molecular ................................................................ 192.5.1 Acción fisiológica de la Nicotina............................................................... 20
2.6 Insecticidas........................................................................................................ 202.6.1 Insecticidas botánicos................................................................................ 202.6.2 Insecticidas orgánicos sintéticos.................................................................22
2.7 Bioensayos.........................................................................................................222.7.1 Bioensayos de citotoxicidad....................................................................... 232.7.2 Bioensayo olfatométrico.............................................................................24
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN................................. 25
3.1 Formulación del problema................................................................................. 253.2. Preguntas de investigación............................................................................... 263.3. Justificación de la investigación....................................................................... 26
4. OBJETIVOS............................................................................................................ 27
4.1. Objetivos generales...........................................................................................274.2. Objetivos específicos........................................................................................ 27
5. HIPÓTESIS............................................................................................................. 28
5.1 Hipótesis nula................................................................................................ 285.2 Hipótesis alterna............................................................................................ 28
6. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................28
6.1 Métodos............................................................................................................. 286.1.1 Manipulación del material.......................................................................... 286.1.2 Maceración en frío......................................................................................286.1.3 Reflujo........................................................................................................ 296.1.4 Fraccionamiento liquido-liquido................................................................ 306.2.5 Reconocimiento de alcaloides utilizando el Reactivo de Dragendorff.......316.2.6 Bioensayo de citotoxicidad.........................................................................316.2.7 Bioensayo olfatométrico.............................................................................32
6.2 Diseño de la investigación................................................................................. 346.2.1 Muestra....................................................................................................... 356.2.2 Variables del estudio...................................................................................37
6.3 Recolección de la información.......................................................................... 376.4 Análisis de información.....................................................................................38
vi
6.4.1 Porcentaje de respuesta...............................................................................386.4.2 Concentración letal para el 50% de mortalidad (LC50)............................ 386.4.3 Análisis de varianza bifactorial por rangos de Friedman........................... 38
7. RESULTADOS....................................................................................................... 40
7.1 Resultados fitoquímicos.....................................................................................40Maceración en frío...............................................................................................40Reflujo................................................................................................................. 40
7.2 Resultados de los bioensayos de citotoxicidad con A. salina............................417.3 Cálculos de LC50.............................................................................................. 437.4 Resultados olfatométricos..................................................................................447.5 Resultados adicionales.......................................................................................45
8. DISCUSIÓN............................................................................................................ 47
9. CONCLUSIONES................................................................................................... 50
10. RECOMENDACIONES........................................................................................52
11. REFERENCIAS.....................................................................................................53
12. ANEXOS............................................................................................................... 60
12.1 Equipos utilizados ...........................................................................................6012.2 Formatos y datos..............................................................................................61
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la nicotina...............................................................................20
Figura 2. Fotografía de Artemia salina. ...................................................................... 25
Tomado de (www.ilprogressoveterinariofnovi.it/ivista/01n08/arte01.jpg)................25
Figura 3: Olfatómetro elaborado por Ramon Barros, basado en el diseño original de
Petersson (1970) y propuesto por Jaffe y Sánchez (1991); a. cámara olfatométrica, b.
fuente del aroma, c. fuente sin aroma, d. fuente de agua, e. motor de aire y f. llave
reguladora de presión...................................................................................................26
Figura 4. Sistemas de extracción; a. Maceración en frío y b. Sistema de reflujo........30
Figura 5. Sistemas de fraccionamiento liquido-liquido; a. para solventes menos
densos que el agua y b. Para solventes más densos que el agua..................................31
Figura 6. Fotografía de Macrosiphum rosae (áfido de la rosa)................................... 34
Tomado de (http://mamba.bio.uci.edu/~pjbryant/biodiv/hemipt/Rose%20Aphid.htm)
..................................................................................................................................... 34
vii
Figura 7. Fotografía de muestra de Tabaco seco molido.............................................37
Figura 8. Fotografía de nervaduras de Tabaco molidas...............................................37
Figura 9. Fotografía de polvo de tabaco...................................................................... 38
Figura 10. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto
(1000, 100 y 10 µg/ml), para las extracciones totales realizadas por maceración en
frió (ver datos en la tabla 6. anexo 12.2); control agua (CA), control metanol (CM).43
Figura 11. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto
(1000, 100 y 10 µg/ml), para las extracciones totales realizadas por reflujo en etanol
(ver datos en la tabla 6. anexo 12.2); control agua (CA), control metanol (CM)........43
Figura 12. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina para las fracciones obtenidas a
partir de la separación liquido-liquido con solventes de diferentes polaridades a partir
de los extractos totales de TNF, TNR y TSR; éter de petróleo (Éter), diclorometano
(CH2Cl2), acetato de etilo (AcEtOH), fracción de etanol acuoso (H20) y los controles
en agua (CA) y en metanol (CM) (datos anexo 12.2 tabla 6)......................................44
Figura 13. Concentraciones letales LC50 para los diferentes extractos totales (ver
datos de origen en la tabla 6. anexos 12.2).................................................................. 45
Figura 14. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto
(2000, 1000 y 100 µg/mL), para las extracciones totales realizadas por reflujo en
acetato; nervaduras de tabaco (TNR), mezclas de nervaduras (TMNR) y broza (TBR).
..................................................................................................................................... 47
Figura 15. Sistema de Rotavapor; a. BUCHI R 111 rotavapor, b. BUCHI 461 water
bath, c. BUCHI B 169 vacuum system, d. BUCHI B-720 vacuum controler............. 61
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Pesos de los extractos totales obtenidos........................................................ 40
Tabla 2. Pesos en gramos de las fracciones obtenidas a partir de los extractos totales
iniciales seleccionados (TNF, TSR y TNR) ............................................................... 40
Tabla 3. Comportamientos de M. rosae observados en el bioensayo olfatométrico,
expresados en porcentajes............................................................................................45
viii
Tabla 4. Diferencias entre las variables olfatométricas para repeticiones con duración
de 10 minutos cada una................................................................................................45
Tabla 5. Diferencias entre las variables olfatométricas, para repeticiones con duración
de 30 minutos cada una................................................................................................47
Tabla 6. Porcentajes de mortalidad para cada extracto total obtenido junto con la
LC50 por extracto en µg/ml.........................................................................................61
Tabla 7. Porcentajes de Mortalidad de A. salina para las fracciones obtenidas a
partir de TNF, TSR y TNR, además de las LC50 en µg/ml........................................ 61
ix
RESUMEN
El presente trabajo es resultado de una experimentación en laboratorio
biodirigida, es decir encaminada de acuerdo a los resultados de las pruebas
preliminares de toxicidad, y pretende demostrar si el tabaco (Nicotiana
tabacum) posee actividad biológica como atrayente o repelente de insectos,
así como de establecer una metodología básica de extracción en caso de
tener dicha actividad.
Por medio de técnicas fItoquímicas de laboratorio se extrajeron fracciones
totales etanólicas de metabolitos secundarios de cuatro muestras diferentes
de tabaco (hojas de tabaco fresco, hojas de tabaco seco, polvo de tabaco
desecho de tabacaleras y nervadura de tabaco también desechada en las
tabacaleras), en total ocho extractos diferentes, a estos se les efectuaron
pruebas preliminares cualitativas y cuantitativas de citotoxicidad con Artemia
salina, se seleccionaron los extractos de nervaduras (TNF y TNR) y el
obtenido a partir de las hojas secas de tabaco negro (N. tabacum) por medio
de reflujo; las concentraciones de letalidad media son de 46.86 µg/mL para el
extracto total de nervadura extraído por reflujo, 64.97 µg/mL para le extracto
total de hojas secas extraído por reflujo y de 73.59 µg/mL para el extracto
total de nervadura extraído por maceración.
A cada extracto total escogido se efectuó un fraccionamiento con cuatro
solventes orgánicos de diferentes polaridades, estas doce fracciones
obtenidas se sometieron también a pruebas de citotoxicidad, siendo las
fracciones de nervadura de tabaco obtenidas a partir de la utilización de
acetato de etilo las de mayor actividad toxica (LC50 = 263.22 µg/mL).
10
Los extractos totales presentaron mayor actividad biológica en las pruebas
de citotoxicidad que los extractos producto de los diferentes
fraccionamientos; a el extracto total de nervadura de tabaco obtenido por
medio del sistema de reflujo se efectuaron las pruebas olfatométricas, en las
cuales se observo una actividad de repelencia, estas pruebas se efectuaron
utilizando al áfido Macrosiphum rosae L.
Con este trabajo se concluyó que el tabaco si tiene una actividad biológica
de repelencia y que es un potencial producto para el control de posibles
plagas de insectos, además los desechos de las empresas de tabaco pueden
llegar a ser una fuente de fácil acceso para la elaboración de este producto.
11
1. INTRODUCCIÓN
Entre los diferentes usos que le ha dado el hombre a las plantas a través de
la historia encontramos la ornamentación, medicina, alimentación,
construcción, usos artesanales, como controladores de plagas y científicos
entre otros, de acuerdo a sus cualidades y características.
Las ciencias biológicas junto con las químicas en los últimos tiempos han
centrado esfuerzos para estudiar las cualidades de los diferentes
compuestos presentes en las plantas, entre los que se encuentran los
metabolitos secundarios, a los cuales se les atribuye ciertas cualidades
medicinales, repelentes, atrayentes, tóxicas y aromáticas, entre otras; la
selección de las plantas para los estudios fitoquímicos se basa
principalmente en el conocimiento de los usos artesanales de las mismas, de
esta manera los científicos tratan de identificar que compuesto o que mezcla
de compuestos tienen o no capacidades atribuidas a dicha planta, esto se
realiza por medio de la aplicación de distintas técnicas y metodologías.
La especie Nicotiana tabacum L. (Tabacos), es una de las mas conocidas por
casi toda la humanidad por lo nociva que es a la salud, no obstante, el tabaco
es uno de los grupos de plantas más cultivadas en el mundo, gracias a la
gran demanda que tiene a escala mundial, en casi todos los lugares del
mundo se puede comprar un cigarrillo.
La mayoría de las personas han escuchado de las cualidades nocivas del
tabaco, pero no de los usos que le dan muchos de las personas que viven en
el campo de la mayoría de los países que lo producen y de los indígenas
suramericanos, que les dan uso religioso en las actividades del mambeo,
como insecticida, repelente, medicina y veneno entre otros (García 1992; La
Rotta et al. 1995; Pérez-Arbelaez 1996).
12
A nivel etnobotánico el tabaco es utilizado como un insecticida natural, lo
usan en el campo por lo general para controlar plagas caseras o para
eliminar animales como garrapatas o pulgas que parasitan el ganado,
también para controlar algunos ácaros y pulgones parásitos de plantas
(Mareggiani 2001).
Una de las problemáticas actuales es la utilización de plaguicidas químicos, a
los cuales muchas de las especies que son catalogadas como plaga han
desarrollado resistencia. Otras consideradas útiles también son afectadas,
como resultado, las concentraciones son aumentadas o se cambia la
sustancia por una de mayor toxicidad. El resultado de esto es un daño
ecológico, por contaminación debido a que la mayoría de los plaguicidas
sintéticos no son biodegradables (Peter 2000).
Este trabajo pretende dar una alternativas para el control de plagas por
medio de la utilización de sustancias naturales, producto de la extracción de
metabolitos secundarios presentes diferentes muestras de tabaco negro (N.
tabacum).
13
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA.
2.1 Revisión taxonómica de la familia Solanaceae
La familia Solanaceae pertenece a la División Angiospermae, Clase
Dycotiledonae, Orden Tubiflorae, comprende cerca de 2000 especies, las
cuales crecen en todos los climas y se encuentran en los cinco continentes,
particularmente en América del Sur de donde se consideran originarias
(Muñoz 1992).
Hierbas, arbustos o rara vez árboles, algunas veces plantas trepadoras o
epifitas, frecuentemente con espinas o púas. Hojas alternas o casi opuestas,
simples (no divididas) o profundamente cortadas o segmentadas
(compuestas) en segmentos separados. Estipulas ausentes. Flores
usualmente de forma simétrica, pero algunas veces irregulares (asimétricas).
Cáliz con 5 (algunas veces 4 o 6) sépalos unidos. Corola con 5 pétalos
formando un tubo muy corto o muy largo. Estambres usualmente 5, pero
algunas veces 4 o menos. Ovario situado arriba de la base de la corola y el
cáliz (supero). Fruto seco o carnoso, con varias hasta muchas semillas.
(Steyermark 1978)
Una familia grande y habitualmente diversa, en teoría siempre con hojas
alternas (aunque algunas veces/ tienen una hoja “menor” más pequeña, mas
o menos horizontal a la hoja regular), entera a irregularmente lobulada o
remotamente agudo dentada (pero nunca aserrada). Vegetativamente, una
especie con hojas enteras que se tienden a confundirse con miembros
totalmente diferentes a Caryophylidae, que se diferencian en ramas con
anillos concéntricos conspicuos con crecimiento anómalo. Flores
generalmente pentámeras, mas o menos regular simpétalas, usualmente con
5 (excepto Brunfelsia, Schwenckia, Witherringia, Browallia) estambres (4
estambres se relacionan con las familias Scrophulariaceae, Bignoniaceae,
14
Verbenaceae, Acanthaceae, etc.) las anteras con poros terminales en
Solanum y los géneros relativamente cércanos. La mayoría de los géneros
son aromáticos con el típico olor indeseable de la planta de tomate de la
familia. Solanum, es el género más grande, usualmente tiene espinas
(incluyendo en el tronco de algunas especies de los andes que son árboles
grandes) tricomas estelados a variablemente dendroides son típicos de
algunos géneros. La gran mayoría de especies tienen bayas carnosas (a un
poco secas), subtendidas o encerradas por un cáliz expandido o
variablemente lobulado, pero algunas de las hierbas (Schwenckia, Browalia,
Datura, Nicotiana) tienen cápsula (Gentry 1996).
La subdivisión familiar basada en el hábito es particularmente difícil en esta
familia porque muchos géneros son una mezcla de estos
(predominantemente arbustivo) y ninguno consiste enteramente (o en su
mayoría) de árboles grandes o enredaderas. Taxa escandentes (excepto las
especies de Solanum: usualmente espinosas o olorosas) son usualmente
hemiepifitas. Los limites genéricos están en un grado de fluctuación en
algunos grupos. Por eso, el siguiente esquema basado en el hábito es menos
que satisfactorio para la mayoría de familia. Sin embargo, excepto para
Solanum, partición en 4 grupos, una de trepadoras hemiepifitas, una de
arbustos membranosos o de hojas grandes y árboles pequeños, una de
arbustos con hojas pequeñas de áreas secas usualmente con ramas
espinosas, y una de hierbas es usualmente factible (Gentry 1996).
Estudios fitoquímicos realizados en las especies de esta familia, la hacen
una de las más ricas y variadas, presentan actividades terapéuticas,
alucinógenas e insecticidas entre otras (Muñoz 1992); entre los metabolitos
secundarios encontrados en este grupo de plantas están: proteínas,
betaínas, cumarinas, isoprenoides, sapogeninas, glicósidos, esteroides,
15
glicoalcaloides, alcaloides, withasteroides, terpenos y flavonoides (Hoehne et
al. 1970; Harborne & Swain 1979; Muñoz 1992).
2.2 Género NicotianaEsta compuesto por 41 especies; hierbas terrestres (algunas veces robustas
y arbustivas, especialmente en Nicotiana), robustas, la mayoría son viscosas,
hierbas pubescentes las cuales en su mayoría se encuentran en los valles
interandinos usualmente con hojas grandes y membranosas; cáliz alargado,
típicamente mas o menos inflado, frecuente mente 5 sépalos rígidos; corola
tubular, las anteras son siempre exertas (Gentry 1996).
2.2.1 Nicotina tabacum L.
Planta herbácea anual, pubescente, glutinosa, tallo derecho, rollizo,
superiormente ramoso, hojas oblongo-lanceoladas, aguzadas, sentadas, las
inferiores escurridas, semiabrazadoras, flores pediceladas, bracteadas, cáliz
oblongo, lacinias lanceoladas, agudas, desiguales, corola por fuera
lanuginosa, garganta subinflada, limbo muy abierto, segmentos agudos,
cápsula de la longitud del cáliz o un poco mayor. (Ramírez-Goyenc 1911)
2.3 Metabolitos Secundarios
Según Azcon–Bieto y Taion (1993) además de las rutas del metabolismo
primario, idénticas o similares en todos los organismos vivos, las plantas
pueden seguir otras rutas metabólicas que llevan a la formación de
compuestos usualmente peculiares de un grupo taxonómico determinado
(especie, género, familia o grupo estrechamente relacionado de familias);
estas rutas constituyen el metabolismo secundario, y sus productos se
denominan metabolitos secundarios. Además señalan que el metabolismo
secundario se puede definir como la biosíntesis, transformación y
degradación de compuestos endógenos mediante proteínas de
especialización (Azcon–Bieto & Taion 1993).
16
Los metabolitos secundarios, en general, no tienen un papel reconocido en
los procesos de fotosíntesis, respiración, transportes de solutos,
translocación, asimilación de nutrientes y diferenciación (Taiz & Zeiger 1998),
pero pueden tener diferentes funciones fisiológicas dependiendo del tipo de
compuesto secundario y de la especie, como de almacenamiento, defensa y
atracción principalmente. Los productos secundarios se clasifican por lo
general en tres principales grupos: terpenos, fenoles y alcaloides (Azcon–
Bieto & Taion 1993; Taiz & Zeiger 1998).
2.4 Alcaloides
El término alcaloide fue introducido por el alemán Wilhelm Meissner en 1819
(Dostal 2000). Los alcaloides son un grupo de compuestos secundarios que
contienen nitrógeno en su molécula, a menudo formando parte de un anillo
heterocíclico, y como su propio nombre lo indica son de naturaleza básica;
son producidos por diversas rutas metabólicas a partir de aminoácidos en
particular el ácido aspártico, lisina, tirosina y triptofano, o de algunos ácidos
como el antranilico o el nicotínico entre otros. Se encuentran
aproximadamente en un 20% de las plantas vasculares; es el grupo de
compuestos con el mayor conocimiento gracias a sus efectos farmacológicos
en los vertebrados (Azcon–Bieto & Taion 1993; Taiz & Zeiger 1998).
La mayoría de los alcaloides son sólidos, aunque algunos como la coniina y
la nicotina son líquidos; se han estudiado 256 alcaloides presentes en
hongos, algas y otros vegetales inferiores, 4088 alcaloides en plantas
superiores y se han encontrado 50 alcaloides en órganos animales
(Domínguez 1985).
Según Hartmann (1991) la función de los alcaloides es incierta; en ciertas
ocasiones se les comparó con compuestos como la urea o el ácido úrico de
los animales, metabolitos para el almacenamiento de nitrógeno o como
17
reguladores de crecimiento, pero la evidencia para poder sopesar estas
teorías es muy escasa y en muchos casos no es consistente; gran parte de
los alcaloides que se conocen en la actualidad se reconocen como
sustancias que cumplen una función primordialmente de defensa contra
depredadores evitando la herbivoría (Taiz & Zeiger 1998).
Estos metabolitos pueden ser producidos en diferentes partes de la planta,
dependiendo de la especie, por ejemplo, hiosciamina y nicotina en raíces,
cocaína en las hojas, morfina en látex (Ascon–Bieto & Taion, 1993). Existen
casos en los cuales los alcaloides sólo aparecen en alguna etapa de
crecimiento o época del año, o determinadas situaciones ecológicas; con
respecto a la distribución de los alcaloides en las plantas, en ocasiones se
hallan restringidos a cierto órgano o a ciertas partes; o pueden distribuirse
en toda la planta (Domínguez 1985).
2.5 Nicotina
La nicotina fue conocida en 1809 (Dostal 2000), el alcaloide es conformado
por una piridina 3-sustituida enlazada a un anillo N-metilpirrolidina, junto con
la nornicotina son los alcaloides mas importantes de N. tabacum (Ascon–
Bieto & Taion 1993). Se ha establecido que la nicotina se sintetiza
principalmente en las raíces de la planta; de allí es conducida por la savia a
través del tallo y acumulada en las hojas bajo la forma de sales orgánicas.
Las hojas una vez cortadas de la planta, no aumentan su tenor de nicotina,
confirmando que la síntesis o producción del alcaloide se realiza
exclusivamente en la raíz (Quiroga 1990).
En lo referente a la distribución en la hoja, se ha observado que la nicotina
aumenta de la base a la punta de la misma y del sistema central de
nervadura a la periferia, del sistema de nervaduras secundarias al
parénquima intercalado entre ellas y de las hojas tiernas a las maduras; esta
18
distribución responde a las leyes del desarrollo fisiológico del tejido de las
hojas del tabaco. En lo que respecta a la distribución del alcaloide según la
posición de la hoja, la nicotina aumenta desde la base de la planta al ápice o
parte superior; es interesante hacer notar que la semilla de tabaco no
contiene nicotina (Quiroga 1990).
La nicotina es un compuesto que se descompone al exponerse a
incrementos de temperatura, también presenta reacciones fotoquímicas y
procesos de fotólisis; es de color amarillo pálido, marrón o cristalino, de
aspecto aceitoso, tiene olor característico, es combustible, higroscópica,
soluble en agua y alcohol, es toxica, adictiva y venenosa (García 1986).
2.5.1 Nomenclatura química y sinónimos de la nicotina
N-metil-pirrolidin-Beta-piridina
(S)- 3-(1-Metilpirrolidin-2-il)-piridina
3-(1-Metil-2-pirrolidinil)-piridina
beta-Piridil-alpha -N-metil-pirrolidina
1-Metil-2-(3-piridil)-pirrolidina
2.5.2 Formula y estructura molecular
La formula química de la nicotina es C10H14N2. La estructuras de la nicotina
se observa en la figura 1.
Figura 1. Estructura de la nicotina.
19
2.5.1 Acción fisiológica de la Nicotina
La nicotina a sido utilizada como insecticida desde los mediados del siglo
XVII (Bloomquist 1999). Actúa bloqueando los receptores nicotínicos de la
sinapsis del sistema nervioso central y periférico (Mareggiani 2001). La
nicotina compite con la acetilcolina por ocupar el receptor nicotínico en el
proceso sináptico, de esta forma impide la acción de la acetilcolina,
produciendo problemas en el funcionamiento del sistema nervioso autónomo,
sistema nervioso central y sistemas neuromuscular de los insectos
(Yamamoto et al. 1998; Tomizawa et al. 2000).
Al provocar la inactivación de los receptores, se desorganiza el
funcionamiento normal de los sistemas nervioso y neuromuscular, la muerte
sobreviene rápidamente, en general por paralización de los músculos
respiratorios (Eckert 1994).
2.6 Insecticidas
Son productos cuya finalidad principal es eliminar y repeler a los insectos y
otros artrópodos; su clasificación depende de la naturaleza del compuesto
activo, de esta manera encontramos insecticidas inorgánicos, orgánicos
sintéticos y botánicos.
2.6.1 Insecticidas botánicos
Los insecticidas botánicos son todos aquellos que son producidos por medio
de la extracción de metabolitos secundarios de diferentes plantas o por la
utilización de toda la planta (Ware 2001).
Las plantas presentan muchas técnicas de defensa tanto físicas como
químicas ante la acción de animales herbívoros, entre las primeras
encontramos las espinas, pubescencias y poca palatabilidad de las hojas;
las defensas químicas varían de acuerdo a la planta y al organismo agresor,
20
estos compuestos son producto de metabolismos secundarios como
terpenos, fenoles y compuestos nitrogenados (Taiz & Zeiger 1998).
En la actualidad se han reportado más de dos mil especies botánicas que
poseen propiedades que permiten su empleo como plaguicidas naturales en
la agricultura. Muchos metabolitos son característicos de un género y hasta
de una sola especie, por lo cual es posible que aún numerosos compuestos
potencialmente útiles sean desconocidos hasta el presente (Mareggiani
2001).
Dependiendo del tipo de sustancia la acción de la misma ante los organismos
atacantes puede ser variada; unos compuestos funcionan como atrayentes
(Schoonhoven 1972; Belles et al. 1985; Taiz & Zeiger 1998), otras
sustancias son repelentes (Bowers 1985; Taiz & Zeiger 1998), sustancias
inhibidoras de procesos biológicos como crecimiento o reproductivos
(Adytiachaudhury et al. 1985; Elliger & Waiss 1989; Taiz & Zeiger 1998),
antialimentarios (Escoubas 1993; Taiz & Zeiger 1998), y compuestos con
actividad insecticida (Champagne et al. 1989; Rodríguez 1989; Calle et
al.1990; Ascon–Bieto & Taion 1993; Arango 1994; Taiz & Zeiger 1998).
Dentro de los tipos de sustancias con actividad insecticida encontradas en
la literatura se encuentran terpenos como los piretroides , aceites
esenciales (Margina & Zhelijazkov 1994, Taiz & Zeiger 1998),
sesquiterpenolactonas, triterpenos (Rodríguez 1989), flavonoides (Moreno-
Murillo et al. 1980, 1981), rotenonas, cumarinas (Hu et al. 1993), y
alcaloides (Secoy & Smith 1983; Velcheva et al. 1996; Taiz & Zeiger 1998).
21
2.6.2 Insecticidas orgánicos sintéticos
Son todos aquellos que en su estructura se encuentran carbono, hidrógeno y
oxigeno, además de otros inorgánicos; se clasifican en organofosforados,
organocarbamatos, organoclorados y piretroides (Peter & Cherian 2000).
El primer insecticida organofosforado sintetizado fue el tetra-etil-pirofosfato
(TEPP), en 1854, además del TEPP encontramos a parathion, phorate,
mevinphos, disulfoton, coumaphos, chlorpyrifos, trichlorfon, ronnel estos son
insecticidas de alta y mediana toxicidad. Los insecticidas organocarbamatos
son derivados del ácido carbamico, tienen un gran espectro de uso en los
sistemas agrícolas y en los insecticidas de uso casero, en contraste a los
organofosforados producen reacciones reversibles en el ciclo de la
acetilcolinesterasa (Peter & Cherian 2000).
Los organoclorados son insecticidas que atacan los estimulantes del sistema
nervioso central, es el grupo de químicos mas toxico y común en el mercado,
entre este grupo encontramos el dicloro-difenil-triclorometano (DDT),
chlorbenzilato, kelthane, methoxyclor, lindane, toxaphene, clordane,
heptaclor, aldrin y enderin (Peter & Cherian 2000).
Los piretroides componen la ultima línea de insecticidas orgánicos, son
sintéticos y su estructura se basa en la piretro (compuesto natural de las
flores de Chrysanthemum cinerarieaefolium Trel. y C. Indicum L.),
compuesto que actúa primordialmente en los canales de sodio (Peter &
Cherian 2000).
2.7 Bioensayos
En términos generales un bioensayo puede ser definido como cualquier
prueba que involucra organismos vivos (Miller, 1994). A su vez Lagunes y
Villanueva (1994) señalan que bioensayo es cualquier método por medio del
22
cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de
la respuesta biológica que produce, en resumen un bioensayo es una
metodología que se utiliza para determinar la respuesta de organismos vivos
a una determinada sustancia química.
Un bioensayo posee dos componentes; el estímulo y la respuesta, el
estímulo se define como el agente que produce una respuesta en el
organismo tratado mientras que la respuesta se conoce como el efecto o
manifestación que produce la aplicación del estímulo (Lagunes & Villanueva,
1994).
Según Lagunes y Villanueva (1994) los bioensayos se dividen en directos e
indirectos, el bioensayo directo es aquel en donde se aplica una dosis
conocida a cada organismo en forma individual mientras que el bioensayo
indirecto es aquel en que se aplica una cierta solución dosificada en un
volumen conocido en donde se encuentra una población también conocida.
Los bioensayos, independiente de la metodología, que evalúen directamente
la respuesta al estímulo se deben clasificar como directos y todos aquellos
que no midan la respuesta sino que posibles reacciones que estas produzcan
se clasifican como indirectos (Lagunes & Villanueva, 1994).
2.7.1 Bioensayos de citotoxicidad
Son pruebas biológicas económicas y rápidas con las cuales se puede
estimar el nivel de toxicidad de diferentes sustancias químicas inorgánicas o
de compuestos orgánicos como lo son los extractos vegetales; en estas
pruebas se trabajan principalmente con Artemia salina (figura 2), debido a su
fácil adquisición y manejo (Meyer et al. 1982; McLauglin 1991; Solis et
al.1993).
23
La prueba consiste en exponer a las artemias recién eclosionadas (24 horas
después de la incubación) a diferentes concentraciones de una sustancia
determinada para obtener el porcentaje o proporción de individuos muertos,
así como calcular las concentraciones a las cuales el 50% de los individuos
muere, lo que se denomina LC50 (Meyer et al. 1982; McLauglin 1991; Solis
et al.1993).
Figura 2. Fotografía1 de Artemia salina.
2.7.2 Bioensayo olfatométrico
Las pruebas olfatométricas son bioensayos en los cuales se mide la
respuesta de los insectos ante la presencia de determinados aromas,
mediante la cuantificación de la presencia de los mismos en zonas definidas
dentro de una cámara olfatométrica (olfatómetro, figura 3); con este tipo de
ensayo se estima la repelencia o atracción de insectos por determinada
sustancia (Petterson 1970; Arango 1994; Cerda et al. 1994)..
Los aromas pueden tener diferentes orígenes, los más comunes son los
sintéticos y los naturales, entre estos últimos se pueden utilizar plantas
completas o sus extractos o sustancias específicas producidas en rutas 1 Tomado de (www.ilprogressoveterinariofnovi.it/ivista/01n08/arte01.jpg)
24
metabólicas secundarias. En la mayoría de los casos se trabajan con una o
diferentes especies de áfidos o directamente con los insectos de interés
como escarabajos, pulgas o moscas (Petterson 1970; Arango 1994; Cerda et
al. 1994).
Figura 3: Olfatómetro elaborado por Ramon Barros, basado en el diseño original de Petersson (1970) y propuesto por Jaffe y Sánchez (1991); a. cámara olfatométrica, b. fuente del aroma, c. fuente sin aroma, d. fuente de agua, e. motor de aire y f. llave reguladora de presión.
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.
3.1 Formulación del problema.
La utilización de sustancias insecticidas de origen químico (DDT y piretroides
entre otros), tienen una gran repercusión en los ecosistemas tanto agrícolas
como naturales, siendo estas sustancias en su mayoría nocivas no solo para
el hombre, además la especificidad de los agentes químicos para el control
de plagas es muy baja, y no solo atacan a las plagas sino también a
organismos que pueden ser benéficos para el hombre como algunos
predadores. Los insecticidas y repelentes sintéticos tienen una degradación
muy lenta, convirtiéndose en uno de los factores contaminantes con mayor
relevancia en los sistemas agropecuarios y naturales.
25
dc
efb
a
Dirección del aire
Dirección del aroma
El tabaco es considerado una planta útil en Colombia por que tiene una gran
importancia comercial, siendo uno de los cultivos más comunes de las zonas
cálidas; aunque se conocen sus capacidades biológicas y su importancia
sociocultural para muchas etnias indígenas, las cuales en su mayoría son
ignoradas.
3.2. Preguntas de investigación.
¿ El tabaco tiene actividad biológica de repelencia o atracción sobre el áfido
Macrosiphum rosae?.
¿Qué extracto o fracción obtenida, presenta mayor actividad biológica
citotoxica?.
¿Cuál es solvente con el que se logra una mejor extracción de la mezcla
mínima o compuesto que presenta actividad biológica?.
¿Cuál es la naturaleza del compuesto o de la mezcla de compuestos que
presentan actividad biológica?.
3.3. Justificación de la investigación.
Existen plantas con características insecticidas y repelentes de insectos, es
importante el realizar el estudio de estas para ver su factibilidad de uso en
campo, inclusive su comercialización, uno de estos casos es el tabaco (N.
tabacum), que es utilizado como un agente insecticida biológico, donde es de
suma importancia establecer cual es la fracción, mezcla mínima o compuesto
que presenta dicha actividad; con esto se pueden dar alternativas nuevas y
netamente de carácter natural, para la sustitución de agentes químicos
sintéticos usados para el control de algunas plagas.
La aplicación indiscriminada de los insecticidas sintéticos clásicos para
control de plagas, además de impactar sobre el medio ambiente, ha
provocado la aparición de poblaciones de insectos resistentes a esos
productos (Mareggiani 2001); uno de estos casos es áfido de la rosa
26
(Macrosiphum rosae) que es una de las plagas más comunes tanto en las
rosas de los jardines como de los cultivos industrializados.
Es sabido que los insecticidas orgánicos son una de las mayores
problemáticas ambientales, el vertimiento de los rezagos de pesticidas por
lavados de suelos a los sistemas naturales, la gran cantidad de casos de
intoxicación por parte de las personas que han manipulado los químicos,
ingieren alimentos contaminados o agua contaminada es cada vez mayor
(Poggi-Varaldo 1999; Peter & Cherian 2000).
4. OBJETIVOS.
4.1. Objetivos generales.
Determinar la acción atrayente o repelente sobre Macrosiphum rosae del
extracto o fracción de tabaco (N. tabacum) que presente una mayor actividad
citotoxica.
Comparar la eficiencia tanto biológica como química de los métodos
fitoquímicos de extracción y fraccionamiento utilizados.
4.2. Objetivos específicos.
• Establecer que tipo de muestra de hojas de tabaco (hojas frescas, hojas
secas, polvo de hojas de tabaco y nervaduras de tabaco) posee mayor
actividad citotóxica sobre A. salina.
• Obtener la mezcla mínima posible que tenga presente la mayor actividad
citotóxica sobre A. salina.
• Establecer la naturaleza química de la mezcla mínima activa.
• Determinar si existe repelencia o atracción del insecto M. rosae por la
fracción activa.
• Establecer una metodología de extracción.
27
5. HIPÓTESIS
5.1 Hipótesis nula
El extracto o fracción de N. tabacum con mayor actividad citotóxica no
presenta actividad de repelencia sobre M. Rosae.
5.2 Hipótesis alterna
El extracto o fracción de N. tabacum con mayor actividad citotóxica presenta
actividad de repelencia sobre M. Rosae.
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Métodos
Los métodos que a continuación se describen, se eligieron por ser los mas
adecuados para la realización de la investigación y para el cumplimiento de
los objetivos planteados; en el caso de los bioensayos se encuentran
estandarizados y son los comúnmente utilizados para este tipo de estudio.
6.1.1 Manipulación del material
El material fue facilitado por RYEGA (empresa de carácter agroindustrial); la
manipulación del material fue la misma para las muestras (hojas frescas,
hojas secas, polvo de hojas de tabaco y nervaduras de tabaco), las cuales
se molieron (exceptuando el polvo de tabaco) para garantizar una extracción
más eficiente; se pesaron 500 gramos de cada muestra para la primera
extracción; y para extracciones posteriores se utilizaron pesos de 250
gramos de material vegetal.
6.1.2 Maceración en frío
Consiste en mantener el material vegetal en contacto con un liquido
(solvente) frío, en un recipiente de vidrio; por lo general se trata que el
solvente cubra de uno a tres centímetros a la muestra (figura 4). Esta
28
operación requiere de un tiempo largo, de 96 horas a 8 días, y generalmente
va acompañada de trituración mecánica del material y de un periódico
agitado y homogenizado de la mezcla (Pedrozo 1999).
Para este caso en particular se pesaron 500 g de las diferentes muestras
(hojas frescas, hojas secas, polvo de hojas de tabaco y nervaduras de
tabaco), se les aplicó etanol, y se realizó la extracción durante 15 días.
6.1.3 Reflujo
El procedimiento es similar al de la maceración, se diferencia en que la
extracción se realiza por encima de la temperatura del punto de ebullición
del solvente, además se requiere de un refrigerante para poder reciclar el
solvente (figura 4); este método también es conocido como decocción, la
eficiencia de la extracción depende del tiempo que el material este sometido
en el sistema (Pedrozo 1999).
Figura 4. Sistemas de extracción; a. Maceración en frío y b. Sistema de reflujo.
Para la primera extracción se utilizaron 500g de cada muestra (hojas frescas,
hojas secas, polvo de hojas de tabaco y nervaduras de tabaco) y etanol
como solvente; para la segunda extracción se utilizaron 250g de nervadura
de tabaco y acetato de etilo como solvente.
29
Refrigerante
Solvente
Material vegetal
Fuente de calor
a. b.
6.1.4 Fraccionamiento liquido-liquido
Se utilizaron dos técnicas de fraccionamiento; las primeras conocidas como
extracciones continuas (figura 5) son complejas pero más efectivas, para
este tipo de fraccionamiento es necesario una fuente de calor y un
condensador, la estructura del sistema depende de la densidad de los
solventes, si son más densos o menos densos que el agua (Pedrozo 1999).
Las discontinuas en las cuales se coloca el liquido a extraer junto con el
solvente de fragmentación (las dos sustancias son inmiscibles) en un
embudo de decantación, se tapa y se agita manualmente, este procedimiento
se repite varias veces cambiando el solvente (Pedrozo 1999).
Figura 5. Sistemas de fraccionamiento liquido-liquido; a. para solventes menos densos que el agua y b. Para solventes más densos que el agua.
30
a. b.
Fuente de calor
Condensador
Extracto total
Solvente
Recolector
6.2.5 Reconocimiento de alcaloides utilizando el Reactivo de
Dragendorff
Para la obtención del reactivo se disuelven 8 g de Bi(NO3)35H2O en 20 mL de
HNO3 (al 30%) y 27.2 g de KI en 50 mL de agua destilada. Se mezclan las
dos soluciones y se dejan reposar 24 horas; se decanta la solución y se
llena hasta el aforo(100 mL) con agua. Si existe presencia de alcaloides da
una coloración Amarillo-marrón; se presenta precipitado si se aplica a una
solución o se puede utilizar para el revelado de cromatografías en capa
delgada (Domínguez 1985).
A dos gramos de la muestra se le agregaron 8 mL de ácido clorhídrico al 1%,
se calentó y se dejo enfriar a temperatura ambiente, luego se le agregó el
reactivo y se observó la formación o no de precipitado.
6.2.6 Bioensayo de citotoxicidad
La metodología utilizada es la descrita por Meyer et al. 1982 y Solis et
al.1993; se prepara una solución de agua marina artificial con agua destilada
y sal marina comercial a una concentración de 38 g/L en una pecera
pequeña, en la cual se ponen a incubar los huevos de A. salina durante 48
horas; a una tercera parte de la pecera se le cubre con pintura negra y se
coloca una división en acetato negro con poros de 2 mm, los huevos son
colocados en esta división oscura; pasado el tiempo de incubación las larvas
que son fototrópicas se dirigen hacia una fuente de luz previamente
dispuesta cerca del compartimiento transparente, esto facilita su recolección
para la prueba.
Se preparan soluciones de los extractos con concentraciones de 1000, 100 y
10 µg/mL de la siguiente forma: en un vial se colocan 20 mg de la muestra y
se disuelven en 2mL de metanol, quedando con una concentración de 10.000
µg/mL; se colocan en tres viales 0.5 mL de la anterior solución en cada uno;
31
se repite el procedimiento con 0.05 mL y 0.005 mL; se deja evaporar el
metanol y se le agrega 5 mL de aguamarina artificial a cada uno de los
viales (Meyer et al. 1982; Solis et al.1993); concentraciones menores a 10
µg/mL solo se usan para bioensayos de sustancias muy toxicas (McLauglin
1991).
Se colocan diez A. salina en cada vial, dejándolas 24 horas expuestas a la
solución; se contabilizan el número de individuos vivos y muertos
totalizándolos en porcentajes o proporciones. A este tipo de ensayo se le
aplica la prueba LC50 (TRIMMED SPEARMAN-KARBER ESTIMATION OF
LC50 VALUES <LC50> versión 1.00/january 1999) y se obtiene la
concentración letal para que exista un 50 % de mortalidad de individuos
(Meyer et al. 1982; McLauglin 1991; Solis et al.1993). Para cada extracto se
realizaron dos replicas de esta metodología en total seis repeticiones.
6.2.7 Bioensayo olfatométrico
Para estos bioensayos se utilizó como población 100 áfidos pertenecientes a
la especie M. rosae (Áfido de la Rosa, figura 6). En esta metodología se
contabilizó el número de individuos para cada una de las cuatro posibilidades
en presencia de 4 g de muestra. La cantidad de material utilizado ni sus
concentraciones son tenidas en cuenta, se puede utilizar la planta completa
si es el caso (Petterson 1970; Jaffe & Sánchez 1991; Arango 199; Cerda et
al. 1994).
Por medio de una tubería plástica, los diferentes aromas se conducen a la
cámara olfatométrica, el aire es obligado a pasar por una trampa de agua,
para poder homogenizar la presión y la humedad; la cantidad de aire es
regulada por medio de llaves, se trata en lo posible de que sea de 6 mL/seg.
(Petterson 1970; Jaffe & Sánchez 1991; Arango 1994; Cerda et al. 1994).
32
Figura 6. Fotografía2 de Macrosiphum rosae (áfido de la rosa).
Se expusieron 10 individuos de M. rosae al aroma durarte 10 minutos por
cada repetición, realizándose 10 repeticiones en las mismas condiciones
(Petterson 1970; Jaffe & Sánchez 1991; Arango 1994; Cerda et al. 1994).
Los insectos se ambientaron a la cámara durante 5 minutos; previamente se
limpio con acetona la cámara con fin de no dejar algún rastro de cualquier
otro aroma; transcurrido el tiempo, se porcentualiza el número de individuos
que presentan el comportamiento de repelencia por el aroma (R), son
aquellos que se dirigen a la fuente de aireo los que se alejan de la fuente del
aroma; atracción por el aroma (A), son los individuos que se dirigen a la
cámara donde se encuentra la fuente de aroma; comportamiento de
pasividad (P), todos los individuos que permanecen en la zona de
aclimatación y el comportamiento de indecisión (I) todos los individuos que se
desplazan de una cámara a otra (Jaffe & Sánchez 1991).
Para los bioensayos olfatométricos no se tuvo en cuenta ni las edades ni el
sexo de los áfidos.
2 Tomado de (http://mamba.bio.uci.edu/~pjbryant/biodiv/hemipt/Rose%20Aphid.htm)
33
6.2 Diseño de la investigación
La investigación fue de carácter experimental y constó de dos actividades
paralelas que dependían una de la otra; la primera fue la aplicación de
metodologías fitoquímicas de extracción y fraccionamiento, a partir de las
cuales se aislaron del material vegetal los metabolitos secundarios; la
segunda comprendió todas las pruebas biológicas realizadas para comprobar
la actividad biológica de los extractos totales o de las fracciones obtenidas,
además indicaron en que punto la extracción o fraccionamiento se detenía o
no el proceso.
La investigación se realizó teniendo en cuenta las siguientes fases:
• Fase 1: Obtención de un extracto total etanólico de las diferentes
muestras de tabaco, utilizando las metodologías de maceración en frío
y Reflujo; después de la extracción se recuperó la mayor cantidad de
solvente por medio de un rotavapor (anexo 12.1, figura 13) a presión y
temperatura controladas, finalmente se dejó que el excedente de
solvente (en este caso etanol) se evaporara de manera natural.
• Fase 2: Pruebas de citotoxicidad y elección de los extractos con mayor
actividad; a partir de los resultados obtenidos con los ensayos
biológicos con A. salina en porcentajes de mortalidad (M) y con su
respectiva LC50 permitieron escoger los extractos que presentaron
mayor actividad biológica.
• Fase 3: Obtención de fracciones a partir de los extractos etanólicos
totales seleccionados, por medio de extracción discontinua y continua
liquido-liquido, utilizando solventes de diferente polaridad (éter de
petróleo, diclorometano, acetato de etilo), obteniéndose cuatro
fracciones con diferente composición de acuerdo a su polaridad por
34
cada extracto total elegido; también se recuperaron los solventes por
medio de un rotavapor con presión y temperatura controladas, los
excedentes de solventes se evaporaron naturalmente.
• Fase 4: La prueba de citotoxicidad utilizada fue el test contra A. salina
que permitió la elección de las fracciones con mayor actividad
biológica.
• Fase 5: Determinación de la naturaleza de la mezcla mínima activa;
por medio de la aplicación del reactivo de Dragendorff, utilizado para
la comprobación de la presencia de alcaloides.
• Fase 6: La prueba olfatométricas se realizó sobre los áfidos con el
extracto total que presentó la mayor actividad biológica contra A.
salina.
Para la investigación se tuvieron como variables de respuesta la mortalidad
de A. salina y la repelencia del extracto sobre M. rosae; estas variables se
expresaron en porcentajes, también se calcularon las concentraciones letales
para el 50% de mortalidad (LC50) expresadas en µg/mL.
6.2.1 Muestra
Las muestras fueron tomadas de plantas de N. tabacum, y de los desechos
producidos en su tratamiento por parte de las tabacaleras y empresas de
cigarrillos (figuras 7, 8 y 9); en el laboratorio todas tuvieron el mismo
tratamiento y se efectuaron extracciones a partir de los mismos pesos, las
muestras corresponden a:
1. Hojas de tabaco (N. tabacum) frescas (TF).
2. Hojas de tabaco (N. tabacum) secas (TS).
35
3. Polvo de tabaco (N. tabacum) producto del procesamiento de la hoja
de tabaco (TP).
4. Nervadura de tabaco (N. tabacum) producto de la desnervación de las
hojas (TN).
Figura 7. Fotografía de muestra de Tabaco seco molido.
Figura 8. Fotografía de nervaduras de Tabaco molidas.
36
Figura 9. Fotografía de polvo de tabaco.
6.2.2 Variables del estudio
1. La concentración de los extractos en µg/mL para las pruebas de
citotoxicidad y cálculos de LC50.
2. La respuesta de A. salina ante la presencia de los extractos con sus
diferentes concentraciones; lo que se midió en porcentajes de
mortalidad (M).
3. La respuesta de M. rosae ante la exposición al aroma del extracto
potencialmente mas activo; en porcentaje de individuos que
presentaron un comportamiento determinado (atracción (A), repelencia
(R), indecisión (I), pasividad (P)).
6.3 Recolección de la información
La información fue recolectada a partir de las observaciones de los
bioensayos de citotoxicidad y olfatométricos; el número de individuos
muertos de A. salina en los ensayos citotóxicos; la repuesta de M. rosae ante
la presencia del aroma del extracto de mayor actividad; dichos porcentajes,
se registraron en las respectivas fichas (anexo 12.2, tablas 2 y 3).
37
6.4 Análisis de información
Los datos de los bioensayos de citotoxicidad se analizaron estadísticamente
en porcentajes de mortalidad (porcentajes de respuesta) y en
concentraciones de letalidades medias (LC50); a los datos obtenidos
(porcentajes de respuesta) en la prueba olfatométrica se les aplicó el análisis
de varianza bifactorial por rangos de Friedman, con fin de corroborar la
significancia de la atracción o repelencia del extracto mas activo.
6.4.1 Porcentaje de respuesta
Es simplemente el porcentaje de individuos para cada una de las categorías
de respuesta; para las pruebas de citotoxicidad se calculó el porcentaje de
mortalidad (M), o porcentaje de organismos muertos de los expuestos a las
diferentes concentraciones de los extractos y fracciones después de 24
horas; para la prueba olfatométrica se calcularon los porcentajes de
individuos que presentaron los comportamientos de repelencia (R), atracción
(A), indecisión (I) y pasividad (P).
6.4.2 Concentración letal para el 50% de mortalidad (LC50)
La LC50 es una técnica estadística utilizada para estimar a que
concentraciones se logra la muerte del 50% de los individuos implicados en
el bioensayo, con intervalos del 95% de confianza (Hamilton et al.1977,
Meyer et al. 1982; McLauglin 1991; Solis et al.1993). Para calcular los
valores se utilizó un programa llamado TRIMMED SPEARMAN-KARBER
ESTIMATION OF LC50 VALUES <LC50> versión 1.00/january 1999.
6.4.3 Análisis de varianza bifactorial por rangos de Friedman
Es una prueba de varianza no paramétrica, usada para las comparaciones
múltiples entre grupos o variables, se ajusta para corroborar la relevancia de
los datos tomados a partir de la prueba olfatométrica; para acoger o rechazar
la hipótesis nula, permitiendo concluir que condición o grupo de datos es el
38
más significativo a partir de las pruebas de comparación (Sydney & Castellan
1995).
El análisis de Friedman se basa en la siguiente ecuación:
)1(3)1(
121
2 −−
+
= ∑=
kNRkNk
Fk
jjr
donde N es el número de repeticiones, k es el numero de variables de la
prueba, Rj es la suma de rangos para la variable j-ésima.
El valor calculado para el análisis de Friedman se compara con la tabla M
(valores críticos para la prueba estadística de análisis de varianza bifactorial
por rangos de Friedman), si el valor calculado es mayor que el tabulado se
rechaza la hipótesis nula (Sydney & Castellan 1995).
Para la determinación de las diferencias significativas entre las variables
(repelencia, atracción, indecisión y pasividad) se utilizó la siguiente formula:
Existe diferencia si:
6)1(
)1(+Ζ≥− −
kNkRR kkvu α
Ru y Rv son los valores de las sumatorias de dos variables diferentes, se
deben calcular todas las combinaciones posibles, el número de
comparaciones (# c) es = k(k-1)/2; el valor de Z α/k(k-1) es tabulado, para este
caso es de 2.638 (Sydney & Castellan 1995).
39
7. RESULTADOS
7.1 Resultados fitoquímicos
Se obtuvieron ocho extractos totales, cuatro por medio de la Maceración en
frío y cuatro por medio del Reflujo, en ambos caso se utilizó etanol como
solvente (tabla 1).
Tabla 1. Pesos de los extractos totales obtenidos
Método de
extracciónExtracto total Abreviatura
Peso seco del
extracto en
gramos
Maceración en frío
Hojas frescas de
tabacoTFF 11.3295
Hojas secas de tabaco TSF 41.9160Polvo de tabaco TPF 34.7520Nervaduras de tabaco TNF 46.8240
Reflujo
Hojas frescas de
tabacoTFR 15.5400
Hojas secas de tabaco TSR 42.3400Polvo de tabaco TPR 31.5000Nervaduras de tabaco TNR 50.4000
Se escogieron tres de los ocho extractos para realizar los fraccionamientos
de acuerdo a la mayor eficiencia de extracción y toxicidad, se tuvo en cuenta
los mayores pesos y los resultados de los bioensayos de citotoxicidad (M y la
LC50); estos últimos resultados se muestran mas adelante.
Del proceso de fraccionamiento se obtuvieron 12 fracciones a partir de los
tres extractos seleccionados (TNF, TNR y TSR) como se muestra en la tabla
2.
Tabla 2. Pesos en gramos de las fracciones obtenidas a partir de los
extractos totales iniciales seleccionados (TNF, TSR y TNR)
Solvente TNF TNR TSR
40
Éter de petróleo 10,2714 10,7008 11,4433Diclorometano 11,9586 15,0651 8,3598Acetato de etilo 2,7816 3,9444 2,4325Etanol acuoso 19,4712 18,1697 17,987
La prueba química con el reactivo de Dragendorff en los extractos TNR, TNS,
TSR y para la fracción mínima activa dieron positivas observándose un
precipitado amarillo en todos los casos.
7.2 Resultados de los bioensayos de citotoxicidad con A. salina
Es de importancia mencionar que los porcentajes de mortalidad de las
pruebas de citotoxicidad son la cuantificación de las observaciones y son
tomados como resultados cualitativos, a los que no se les aplico ningún
estadístico de comprobación. En la figura 10 se observan los M (porcentajes
de mortalidad) para los extractos etanólicos totales obtenidos a partir de la
maceración en frío (con base a la tabla 6.; anexo 12.2); en donde el valor
mas alto corresponde a TNF con un 100% de individuos muertos para 1000
µg/mL, 48.33% para 100 µg/mL y 1.67% para 10µg/mL.
Los extractos etanólicos totales de nervaduras (TNR) y de hojas secas (TSR)
presentaron las mortalidad es más altas del grupo de extractos obtenidos por
medio del sistema de reflujo; para el TNR de 98.33% para 1000 µg/mL,
53.33% para 100 µg/mL y 23.33% para 10µg/mL; y para el TSR de100%
para 1000 µg/mL, 40% para 100 µg/mL y 13.33% para 10µg/mL de extracto;
la actividad biológica en este grupo de extractos es similar (figura 11 con
base en la tabla 6, anexo 12.2).
41
µg/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CA CM TFF TSF TPF TNF
Extracto
Porc
enta
je d
e m
orta
lidad
100010010
Figura 10. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto (1000, 100 y 10 µg/ml), para las extracciones totales realizadas por maceración en frió (ver datos en la tabla 6. anexo 12.2); control agua (CA), control metanol (CM).
µg/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CA CM TFR TSR TPR TNR
Extracto
Por
cent
aje
de m
orta
lidad
100010010
Figura 11. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto (1000, 100 y 10 µg/ml), para las extracciones totales realizadas por reflujo en etanol (ver datos en la tabla 6. anexo 12.2); control agua (CA), control metanol (CM).
Para el caso de las fracciones solo se presentó actividad biológica en los
bioensayos correspondientes a concentraciones de 1000 µg/mL; la actividad
42
biológica más alta corresponde a las tres fracciones en acetato de etilo; las
mortalidad es que presentaron las demás fracciones son bajas (figura 12).
µg/mL
0102030405060708090
100
C TNF TSR TNR
Fracción
Porc
enta
je d
e m
orta
lidad
100010010
Figura 12. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina para las fracciones obtenidas a partir de la separación liquido-liquido con solventes de diferentes polaridades a partir de los extractos totales de TNF, TNR y TSR; éter de petróleo (Éter), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etilo (AcEtOH), fracción de etanol acuoso (H20) y los controles en agua (CA) y en metanol (CM) (datos anexo 12.2 tabla 6).
7.3 Cálculos de LC50
Por medio del programa TRIMMED SPEARMAN-KARBER ESTIMATION OF
LC50 VALUES <LC50> versión 1.00, se calcularon los valores de la LC50
para todos los bioensayos de citotoxicidad, todas las concentraciones
calculadas tienen un 95% de confianza; en las pruebas realizadas para los
extractos etanólicos totales los valores más bajos de la LC50 son los de
46.86 µg/mL para TNR, de 64.97 µg/mL para TSR y de 73.59 µg/mL como lo
muestra la figura 12; para el caso de las fracciones las LC50 estimadas son
las mismas para las fracciones de acetato de etilo (263.22 µg/mL con
intervalos de confianza del 95%). Se obtuvo una fracción mínima con
actividad biológica M del 100% a contracción de 1000 µg/mL, con un LC50
de 316.6 µg/mL, esta fracción (FMTA) es resultado de la extracción por
medio de sistemas de fraccionamiento continuo liquido-liquido.
43
LC50 en µg/ml
178,05101,01
270,30
73,59
561,15
64,97 87,6546,86
TFF TSF TPF TNF TFR TSR TPR TNR
Extracto
µg/ml
Figura 13. Concentraciones letales LC50 para los diferentes extractos totales (ver datos de origen en la tabla 6. anexos 12.2)
7.4 Resultados olfatométricos
Después de 10 repeticiones de la metodología del bioensayo, se sumaron el
número de individuos por cada uno de los comportamientos de acuerdo a las
observaciones directas de cada repetición, se encontró que los
comportamientos predominantes fueron los de repelencia con un 32% y la
pasividad con 33 % de los individuos que se utilizaron en el ensayo
olfatométrico con M. rosae; los comportamientos de los individuos se pueden
observar en la tabla 3. expresados en porcentajes de individuos que tuvieron
dicho comportamiento (R. repelencia, A atracción, I indecisión y P pasividad);
el valor calculado del análisis de varianza de Fridman para esta prueba es de
13.52 y el tabulado es de 7.82 (valor correspondiente a cuatro variables, con
∞ repeticiones, con α < 0.05, es decir con 95% de confianza, según Sydney y
Castellan 1995)
44
Tabla 3. Comportamientos de M. rosae observados en el bioensayo
olfatométrico, expresados en porcentajes
ComportamientoPorcentaje de individuos
(%)Repelencia (R) 32Atracción (A) 18Indecisión (I) 17Pasividad (P) 33
La diferencia critica entre los diferentes comportamientos (R, A, I y P) se
encuentra en la tabla 4; el valor calculado es de 11.38 para Z α/k(k-1) se toman
los valor superiores al valor calculado. Los comportamientos que presentaron
diferencias criticas son la repelencia y la pasividad.
Tabla 4. Diferencias entre las variables olfatométricas para repeticiones
con duración de 10 minutos cada una.
Comparación Diferencias entre condiciones
R* vs. A 14R* vs. I 15R vs. P 1A vs. I 1A vs. P* 15I vs. P* 16
R = Repelencia, A = Atracción, I = indecisión, P = Pasividad, * variable con diferencias criticas
7.5 Resultados adicionales
Con estos resultados se pretende mostrar los datos obtenidos a partir de
materiales obtenidos después de todo el proceso metodológico, así como la
comprobación de los tiempos aplicados según la literatura para las pruebas
biológicas olfatométricas. Adicionalmente se trabajaron muestras de broza
(desechos en la producción de los cigarrillos, contienen pedazos de
nervaduras y fragmentos de lamina de las hojas) y las nervaduras
45
desechadas en la elaboración de cigarrillos, ambas son mezclas de
diferentes tabacos N. tabacum y N. Rustica.
Se efectuaron extracciones totales por medio del sistema de reflujo con
acetato de etilo; además las concentraciones se tomaron con un rango más
amplio para poder tener un estimativo más correcto en caso de que no se
presentasen las mismas actividades toxicológicas; como se observa en la
figura 13 los M para el extracto total broza son muy bajos (97% a 2000
µg/mL, 58% a 1000 µg/mL, 17% a 100 µg/mL y de 0% a 10 µg/mL) en
comparación a los de las nervaduras de tabaco negro (N. tabacum).
µg/mL
0102030405060708090
100
TNR TMNR TBR
Extracto
Porc
enta
je d
e m
orta
lidad
20001000100
Figura 14. Porcentaje de mortalidad (M) de A. salina por concentraciones de extracto (2000, 1000 y 100 µg/mL), para las extracciones totales realizadas por reflujo en acetato; nervaduras de tabaco (TNR), mezclas de nervaduras (TMNR) y broza (TBR).También se ampliaron los tiempos de exposición de M. rosae ante el aroma
del extracto etanólico total de nervaduras de tabaco, de 10 minutos a 30
minutos por repetición, para poder determinar si la metodología tomada de la
literatura realmente es la más adecuada para este caso; se observó que la
actividad de repelencia es mayor, debido a que muestra un 48% de
individuos repelidos, un 3% de los individuos atraídos, un 15 % de individuos
indecisos y un 34 % de los individuos permanecieron pasivos.
46
En algunas de las repeticiones olfatométricas se observó la muerte de varios
individuos, en total se observo que un 10% de los áfidos murieron.
La Fr. (Análisis de Friedman) calculado para estos ensayos es de 71.64, y la
variable con mayores diferencias criticas fue la repelencia (tabla 5), es
importante anotar que todas las comparaciones son significativas debido a
que son mayores al valor calculado de Z α/k(k-1) (11,80) pero se toman los
valores mayores cuando se presentan estos casos (Sydney & Castellan
1995).
Tabla 5. Diferencias entre las variables olfatométricas, para repeticiones
con duración de 30 minutos cada una
Comparación Diferencias entre condiciones
R* vs. A 45R* vs. I 33R vs. P 14A vs. I 12A vs. P 31I vs. P 19
R = Repelencia, A = Atracción, I = indecisión, P = Pasividad, * variable con diferencias criticas.
8. DISCUSIÓN
De acuerdo a los resultados obtenidos, se observo que existen diferencias en
el porcentaje de mortalidad (M) de acuerdo al tipo de muestra utilizada en las
extracciones totales etanólicas. en el caso de las hojas frescas de N.
tabacum, el material posee un peso adicional correspondiente al agua
almacenada (Azcon–Bieto & Taion 1993; Taiz & Zeiger 1998) en
comparación al material seco o deshidratado, si se hace la comparación del
material vegetal neto, sin tener en cuenta el peso del agua, el peso es menor
47
y por lo tanto los compuestos activos se ven también disminuidos (Pedrozo
1999).
Las LC50 correspondientes a los extractos TNF, TSR y TNR son las más
bajas de las ocho primeras extracciones, esto puede ser debido a que la
nicotina es producida en las raíces de la planta, es transportada a través de
los tallos para que finalmente sea almacenada en las hojas, en cercanía de
las nervaduras principales de la misma, la parte periférica de la hoja tienen
concentraciones menores de nicotina (Quiroga 1990); según Ascon–Bieto y
Taion (1993) la nicotina es principal metabolito secundario con actividad
biológica presente en el tabaco; también es importante resaltar que las
correspondientes muestras se encontraban deshidratadas, por lo tanto la
cantidad de material vegetal tratado es mayor que en el caso de las hojas de
frescas (Pedrozo 1999).
Los resultados obtenidos en las pruebas de citotoxicidad de las fracciones
producto del fraccionamiento discontinuo de los extractos TNF, TSR y TNR,
son un poco confusos por que la letalidad se ve disminuida
considerablemente incluso en las fracciones mas activas. En el caso de las
fracciones solubles en acetato de etilo no se ve actividad significativa en las
concentraciones de 100 y 10 µg/mL; también el hecho que se observó
actividad tóxica en extracciones solubles en otros solventes, como es el caso
de las fracciones solubles en éter de petróleo (en especial la proveniente de
TNR). La presencia de actividad biológica en estas fracciones son
indicadores de que existen compuestos activos con diferentes polaridades
incluso diferente naturaleza química con niveles de toxicidad como terpenos
como los piretroides, aceites esenciales (Margina & Zhelijazkov 1994, Taiz
& Zeiger 1998), sesquiterpenolactonas, triterpenos (Rodríguez 1989),
flavonoides (Moreno-Murillo et al. 1980, 1981), rotenonas, cumarinas (Hu et
48
al. 1993); ésta puede ser la razón de que los extractos etanólicos totales
tengan una mayor toxicidad.
La representatividad de las fracciones solubles en éter de petróleo y en
etanol acuoso no es mucha debido a que las concentraciones de letalidad
media están por encima de 1000 µg/mL, en estos casos no se toman como
mezclas o sustancias toxicas (Hamilton et al. 1977), pero no podemos negar
su importancia de su actividad fisiológica como lo demuestran cuando se
encuentran todas juntas en los extractos totales etanólicos.
La concentración de letalidad media (LC50) en las pruebas con A. salina para
la mezcla mínima de tabaco es muy alta en comparación a la del extracto
total de nervadura de tabaco, esta última tiene una concentración un 80 %
inferior a la de la mezcla mínima activa (LC50 para TNR = 46.86 µg/mL vs.
LC50 para la mezcla mínima activa es de 316.60 µg/mL). La mezcla de
diferentes tipos de tabaco (mezclas de nervaduras y la broza) se efectúa
para bajar el contenido de nicotina en los cigarrillos (Quiroga 1990), por
ende los demás compuestos activos presentes en dicha mezcla también se
verán disminuidos
Los valores del análisis de varianza bifactorial por rangos de Friedman nos
muestran que existen diferencias significativas entre los comportamientos
adoptados por los M. rosae, negándose la hipótesis nula; al presentarse
mortalidad (10 individuos en total) en la prueba de 30 minutos por repetición
los individuos que muestran pasivos indican que existen características
toxicas del aroma; además se demostró que la metodología propuesta por
Petterson (1970), Jaffe & Sánchez (1991), Arango (1994) y Cerda et al.
(1994) no tienen la efectividad con respecto al tiempo de exposición.
49
9. CONCLUSIONES
Por medio de los resultados de las pruebas estadísticas de Friedman (tamto
las correspondientes para los tiempos de exposición de 10 minutos como
para las pruebas de 30 minutos) se concluyó que los extractos totales de
nervadura de tabaco extraídos mediante la técnica de reflujo, utilizando
etanol como solvente, tienen actividad biológica de repelencia de M. rosae.
A partir de las concentraciones de letalidad media LC50 y los porcentajes de
mortalidad se logró determinar que los extractos totales etanólicos son más
tóxicos que las fracciones obtenidas en los fraccionamientos liquido-liquido,
incluso que la mezcla mínima activa obtenida de las nervaduras de tabaco.
Aunque la nicotina es una de las sustancias mayormente estudiada debido a
la problemática de la salud humana, y que se ha reportado como una
sustancia potencialmente insecticida, no es el único compuesto del tabaco
con actividad biológica; la eficiencia de un insecticida y repelente botánico
con base a la extracción del tabaco no solo se debe a la acción de la
nicotina, también a la acción de toda la mezcla de compuestos secundarios
extraídos.
Se observaron diferencias entre los métodos de extracción, siendo el sistema
de reflujo con el que se obtuvo mayores cantidades de extracto (TSR 42.34 g
y TNR 50.40 g a partir de 500 gramos de muestra); mejores resultados en la
prueba biológica de toxicidad (LC50 = 46.86 µg/mL para TNR y LC50 = 64.97
µg/mL para TSR), mostrando que los extractos TSR y TNR fueron más
tóxicos, por lo tanto se obtuvieron metabolitos secundarios con actividad
biológica en mayor cantidad.
Se comprobó la existencia de alcaloides a través de la prueba con el reactivo
de Dragendorff, la presencia de otros metabolitos secundarios como algunos
50
terpenos (fracciones en éter de petroleo) y flavonoides (fracciones en etanol
acuoso) pueden ser la razón de la mayor actividad biológica de TNR, TNF y
TSR.
La broza no es la mejor fuente de extractos activos, debido a la mezcla de
especies y variedades, pero las nervaduras desechadas por las empresas de
cigarrillos tiene características similares en cuanto a la actividad biológica en
relación con las nervaduras de N. tabacum.
Con este trabajo se concluyó que las nervaduras secas de N. tabacum si
tiene una actividad biológica de repelencia, es un potencial producto para el
control de posibles plagas de insectos; un gran porcentaje de individuos
permanecieron inactivos un 10% de estos murieron; además los desechos de
las empresas de tabaco podrían llegar a ser una fuente de fácil acceso para
la elaboración de este producto.
Con base en la metodología de la investigación para la elaboración de un
producto insecticida y repelente de insectos a partir del tabaco (N. tabacum)
se beben seguir los siguientes pasos:
1. El material debe ser deshidratado y molido con fin de facilitar y
potencializar la extracción.
2. Montar un sistema de extracción que utilice una fuente de calor, el
reflujo o el sistema de Soxhlet, utilizando como solvente etanol; se
debe tener en cuenta que muchos metabolitos secundarios son
termolábiles como la nicotina, es fundamental el control de la
temperatura; por cada kilogramo de material se utiliza entre tres y
cuatro litros de solvente; el sistema de reflujo es más económico,
sencillo y es utilizado para extracciones rápidas.
51
3. Se efectúa un filtrado para separa el material vegetal del extracto total
etanólico.
4. Se recupera el solvente a presiones y temperaturas controladas; en
laboratorio la recuperación de los solventes se efectúa por medio de
un rotavapor aunque existen en el mercado aparatos industriales
similares y de mayor escala.
5. El secado de la resina o mezcla activa se realiza dejando que el
excedente de solvente se evapore de manera natural.
Esta metodología propuesta es mucho más rápida y menos costosa que la
utilizada para la extracción de alcaloides como la nicotina, en la cual se
utilizan solventes (acetato de etilo, diclorometano y cloroformo) y reactivos
como ácido sulfúrico entre otros (Scharepin et al. 2000) que son costosos y
en su mayoría se encuentran regulados por el gobierno.
10. RECOMENDACIONES
• Es recomendable realizar pruebas fisiológicas de contacto e ingestión
para insectos con los extractos totales.
• Estudiar las posibles actividades fungicida y bactericida de los
extractos.
• En caso de comercialización del producto, efectuar las pruebas de
toxicidad con peces, aves y mamíferos.
• Seria interesante efectuar estudios fitoquímicos de los compuestos
que actúan como colaboradores de la nicotina en los extractos totales
del tabaco.
• Es importante revaluar los tiempos de exposición al aroma en futuras
pruebas olfatométricas, con el fin de poder estimar mejor las
actividades biológicas de los compuestos o mezclas de compuestos
de estudio.
52
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selective actions of neonicotinoids. Arch-Insect-Biochem-Physiol.
37(1): 24-32
59
12. ANEXOS
12.1 Equipos utilizados
Figura 15. Sistema de Rotavapor; a. BUCHI R 111 rotavapor, b. BUCHI 461 water bath, c. BUCHI B 169 vacuum system, d. BUCHI B-720 vacuum controler.
60
a.
c.
b.
d.
12.2 Formatos y datos
Tabla 6. Porcentajes de mortalidad para cada extracto total obtenido
junto con la LC50 por extracto en µg/ml
Tratamientos ConcentracionesExtracción Extracto 1000
µg/ml100µg/ml 10µg/ml
LC50 en µg/ml
Maceración en frío
TFF 83,33 21,67 15,00 178,05TSF 93,33 35,00 8,33 101,01TPF 76,67 16,67 1,67 270,30TNF 100,00 48,33 1,67 73,59
Reflujo
TFR 26,67 11,67 0,00 561,15TSR 100,00 40,00 13,33 64,97TPR 90,00 41,67 8,33 87,65TNR 98,33 53,33 23,33 46,86
Controles Agua 0 0 0Metanol 100 100 100
Tabla 7. Porcentajes de Mortalidad de A. salina para las fracciones
obtenidas a partir de TNF, TSR y TNR, además de las LC50 en µg/ml.
Tratamientos ConcentracionesExtracto Solvente 1000 µg/ml 100µg/ml 10µg/ml
LC50 en µg/ml
TNF
Éter de ptr. 10 0 0 NCDiclorometano 0 0 0 NCAcetato de Et. 100 0 0 263.22Etanol acuoso 20 0 0 NC
TSR
Éter de ptr. 11.67 0 0 NCDiclorometano 3.33 0 0 NCAcetato de Et. 100 0 0 263.22Etanol acuoso 50 0 0 316.23
TNF
Éter de ptr. 40 0 0 NCDiclorometano 0 0 0 NCAcetato de Et. 100 0 0 263.22Etanol acuoso 11.67 0 0 NC
Controles Agua 0 0 0Metanol 100 100 100
NC = concentraciones no calculables o no validos.
61
