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ESTUDIO IN VITRO DE LAS COMBINACIONES DE ANTIMICROBIANOS: LIMITACIONES Y APLICACIONES
Luis Martínez Martínez
UGC de Microbiología
Hospital Universitario Reina Sofía
Dpto. de Microbiología
Universidad de Córdoba
IMIBIC
Sevilla, 15 de noviembre de 2019
SAMPAC 2019
1930s: Sífilis: arsénico + bismuto
Infección estreptocócica (S. pneumoniae y otros): Sulfamidas + antisuero
1945: Endocarditis por Streptococcus viridans: Penicilina + Estreptomicina
PRIMEROS USOS DEL
TRATAMIENTO COMBINADO
SAMPAC 2019
• Alcanzar SINERGIA entre compuestosFacilitación del acceso a la dianaBloqueo de mecanismos de resistencia (BL+BLI)Bloqueo de diferentes vías metabólicas (SXT)
• Disminuir la aparición de resistencias
• Disminuir la toxicidad
• Aumentar el espectro de actividad
• Lograr un efecto inmunomodulador y disminución
de la capacidad patógena bacteriana
TRATAMIENTO COMBINADO: INDICACIONES SAMPAC 2019
SINERGIA: Concepto POSITIVO [2+2: >4]
ANTAGONISMO: Concepto NEGATIVO
El efecto de la combinación es mayor/menor que cuando los compuestos se usan independientemente
ADICIÓN: El efecto corresponde a la suma de los efectos independientes de cada compuesto en la combinación
INDIFERENCIA: El efecto de la combinación es similar al del compuesto más activo
INTERACCIONES ENTRE ANTIMICROBIANOSSAMPAC 2019
REGLAS DE JAWETZ Y GUNNISON
Bacteriostático + bacteriostático: (puede) adición
Bactericida + bactericida: (puede) sinergia
Bacteriostático + bactericida: (puede) antagonismo
Jawetz E, Gunnison JB: Antibiot. Chernother 1952, 243
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• Trimetoprim-sulfametoxazol• Quinupristina-dalfopristina
• Ampicilina-sulbactam• Amoxicilina-ácido clavulánico• Piperacilina-tazobactam• Ticarcilina-ácido clavulánico
• Ceftazidima-avibactam• Ceftolozano-tazobactam
• Meropenem-vaborbactam
EVALUACIÓN IN VITRO DE LAS COMBINACIONES
DE ANTIMICROBIANOS: MÉTODOS YA EN USO
COMBINACIONES DISPONIBLES DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA
• Cefalosporinas 3Gen-ácido clavulánico• Carbapenémicos-inh. betalactamasas
• Eritromicina-Clindamicina
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• Tablero de ajedrez (Checkerboard arrays)
• Curvas de muerte (Time-Kill Curves)
• Métodos basados en difusión
Discos
Tiras de gradiente
EVALUACIÓN IN VITRO DE LAS COMBINACIONES
DE ANTIMICROBIANOS: MÉTODOS
SAMPAC 2019
TABLERO DE AJEDREZ
• Poca complejidad de equipamiento
• Pocas dificultades para calcular índices de interacción
• Amplia información sobre estudios previos
Pero… Metodológicamente complejoNO está estandarizado
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TABLERO DE AJEDREZ
• Microdilución en caldo• Dilución en agar• Macrodilución en tubo
SAMPAC 2019
TABLERO DE AJEDREZ
• Medio con:Combinación de concentraciones de antimicrobianos en el rango de 4-5 diluciones por debajo y 2-3 diluciones por encima de sus correspondientes CMIs.
Concentraciones de cada antimicrobiano por separado
• Cada “casilla” (placa, tubo, pocillo de microdilución) del “tablero” contiene una concentración única de cada antimicrobiano.
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Pillai SK et al. Ch. 9. Antibiotics in Laboratory Medicine, 5ª ed. Lorian V. 2005.
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TABLERO DE AJEDREZ
• Medio adecuado para el microorganismo a estudiar (CA-MHB, etc.)• Concentraciones en base 2, similares a las usadas para calcular la CMI• Inóculo final: 1 x 105 ufc/mL (caldo); 1 x 104/gota (agar)• Condiciones de incubación similares a las empleadas para la CMI
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TABLERO DE AJEDREZINTERPRETACION DE RESULTADOS
Calcular para cada antimicrobiano su CIF (Concentración inhibitoria fraccionaria [FIC en inglés]):
Cociente entre la concentración de antimicrobiano necesario para inhibir el crecimiento en una fila/columna y la CMI del compuesto
Índice CIF: Suma de los valores CIF de cada compuesto
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Doern CD. JCM 2014, 2124
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Círculos blancos: No crecimientoCírculos amarillos: CrecimientoD6: Sinergia (8/128 + 1/4 = 0,0625 + 0,25 = 0,3125)C7: Adición/indiferencia (4/128 + 2/4 = 0.125 + 0,5 = 0,625)
https://emerypharma.com/biology/antimicrobial-synergy-study-checkerboard-assay/
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FIC D4: 32/128 + 1/4 = 0,25 + 0, 25 = 0,5
INDICE CIF: CÁLCULO SIMPLIFICADO
Calcular el índice CIF considerando solamente las concentraciones igualmente efectivas (1/n) en relación con sus correspondientes CMIs
Adapatdo de: https://emerypharma.com/biology/antimicrobial-synergy-study-checkerboard-assay/
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ENSAYO BACTERICIDA DE COMBINACIÓN MÚLTIPLE (MCBT)SAMPAC 2019
CURVAS DE MUERTE
• Ofrecen información bactericida• Interacción bacteria-antimicrobiano dinámica
• Estandarizado por CLSI (NCCLS): M26-A (1999)
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CURVAS DE MUERTE
• Método tediosa: limitado número de combinaciones a estudiar (valorar las de mayor relevancia clínica).
• Tubos con medio líquido que contienen antimicrobiano aislado o en combinación.
• Inóculo: 5 x 105 (estudios varios: 105-107) ufc/mL.
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CURVAS DE MUERTE
• Recuento de colonias en tiempo predefinidos (ej. 0-4-8-12-24 h.)
Dilución en salino y subcultivo en medio sólido sin antimicrobiano(posibilidad de dilución en agar; más compleja aún)Cada tubo en una placa (100μL) o múltiples tubos en la misma placa (10-25μL)
Precauciones: Efecto de arrastre (carry-over) de antimicrobianosEvitar contaminaciones durante el proceso
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CURVAS DE MUERTEINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Sinergia:Incremento en la mortalidad a las 24 h en x100 en comparación con el antimicrobiano más activo
Antagonismo: Disminución en la mortalidad a las 24 h en x100 en comparación con el antimicrobiano más activo
Algunos estudios sugieren considerar los resultados a las 12 h. porque tras ese tiempo puede ocurrir un re-crecimiento de difícil interpretación
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Control
Adición
Sinergia
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MÉTODO DE DIFUSIÓN CON DISCOSSAMPAC 2019
Trimetoprim - Sulfamida
Cefalosporinas – Ac. clavulánico
Imipenem-cefalosporinas(P. aeruginosa)
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MÉTODOS DE DIFUSIÓN CON TIRAS DE GRADIENTESAMPAC 2019
MÉTODOS DE DIFUSIÓN CON TIRAS DE GRADIENTE
Determinar la CMI de cada antimicrobiano por separado
1. Método de sinergia CMI:CMI
2. Método de la proporción fija (direct overlay)3. Método de tiras cruzadas en 90º
Pankey GA et al. DMID 2013, 220
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MÉTODO DE DIFUSIÓN CON TIRAS DE GRADIENTEMétodo de sinergia CMI:CMI
Pankey GA et al. DMID 2013, 220; Pankey G et al. AAC 2005, 5166
SAMPAC 2019
SAMPAC 2019
Pankey GA et al. DMID 2013, 220; Manno G et al. EJCMID 2003, 28
MÉTODO DE DIFUSIÓN CON TIRAS DE GRADIENTEMétodo de la proporción fija (direct overlay)
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Pankey GA et al. DMID 2013, 220; White RL et al. AAC 1996, 1914
MÉTODO DE DIFUSIÓN CON TIRAS DE GRADIENTEMétodo de tiras cruzadas en 90º
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CONCORDANCIA ENTRE CURVAS DE MUERTES Y MÉTODOS POR ETEST®. Klebsiella spp. KPC (+) (n=31)
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• NO TODOS LOS MÉTODOS ESTÁN NO ESTANDARIZADOS
• LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON DIFERENTES MÉTODOS PUEDEN NO SER CONCORDANTES
• LOS MÉTODOS CON MEDIOS LÍQUIDOS SON MUY LABORIOSOS
EVALUACIÓN IN VITRO DE LAS COMBINACIONES
DE ANTIMICROBIANOS: LIMITACIONES
SAMPAC 2019
CONCLUSIONES
• Existen diversas herramientas para el estudio in vitro de
combinaciones de antimicrobianos. La mayoría son complejas
metodológicamente y de realización tediosa.
• Ya se estudian de modo habitual algunas de estas combinaciones
(combinaciones comerciales, mecanismos de resistencia).
• El método de las curvas de muerte está estandarizado y es el que
ofrece mejores correlaciones con la respuesta en modelos animales.
• Otros métodos no estandarizados no se correlacionan
adecuadamente con el de las curvas de muerte.
• LOS MÉTODOS NO ESTÁN VALIDADOS CLÍNICAMENTE.
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