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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DOIS CRITÉRIOS DE CLASSIFICAÇÃO
HISTOLÓGICA, CONTAGEM DE AGNOR’S E EXPRESSÃO DE C-KIT NO
MASTOCITOMA CANINO
Juliana Carvalho de Almeida Borges
Orientador: Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo
GOIÂNIA
2013
ii
iii
JULIANA CARVALHO DE ALMEIDA BORGES
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DOIS CRITÉRIOS DE CLASSIFICAÇÃO
HISTOLÓGICA, CONTAGEM DE AGNOR’S E EXPRESSÃO DE C-KIT NO
MASTOCITOMA CANINO
Dissertação apresentada para obtenção do
grau de Mestre em Ciência Animal junto à
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Patobiologia animal, experimental e comparada
Orientador:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo
Comitê de Orientação:
Profª Drª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura
Profª Drª Yandra Cássia Lobato do Prado
GOIÂNIA
2013
iv
v
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus, o maior responsável por todas as oportunidades que me
fizeram chegar até aqui.
Ao meu Orientador, Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo,
primeiramente por me aceitar como orientada, e pela sua grande amizade,
paciência, ensinamentos e imensa contribuição com o meu desenvolvimento
acadêmico.
Aos meus pais pelo amor e apoio incondicional, em todos os momentos
da minha vida;
Às minhas co-orientadoras, Profª Drª Veridiana Maria Brianezi Dignani
de Moura e Drª Yandra Cássia Lobato do Prado pela amizade e imensa
disposição em sempre ajudar no desenvolvimento desta pesquisa;
Em especial à querida amiga, doutoranda, Vanessa de Sousa Cruz
Pimenta, primeiramente pela amizade incondicional, pelo apoio na pesquisa, pelo
incentivo, pela ajuda na realização das técnicas laboratoriais, pelas sugestões no
trabalho e sua orientação amiga;
À Universidade Federal de Goiás e à Escola de Veterinária e
Zootecnia, por terem sido minha casa por quase 8 anos, contribuindo para o meu
crescimento profissional;
À Coordenação de Pós-Graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG,
por permitir o desenvolvimento de mais este trabalho;
À CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel
Superior, pela bolsa de mestrado e ao CNPq pelo financiamento dos nossos
projetos;
Aos meus amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
pelos maravilhosos momentos de estudo, lazer, pelas palavras de animo e
entusiasmo, além de contribuírem direta ou indiretamente com este trabalho,
especialmente a Janaína Costa Feistel, Fernando Augusto Fernandes Corrêa,
Danilo Rezende e Silva e Luciana Silva de Carvalho.
Ao Fabrício de Oliveira Pereira, amigo e colega de trabalho pela
excelente convivência, pelas infinitas risadas, pelo forte abraço e ombro amigo
vii
nos momentos de dificuldades pessoais e principalmente pelo auxílio e incentivo
na conclusão deste trabalho.
À amiga Lorena Lima Barbosa Guimarães pela amizade, pelo auxílio
laboratorial e por suas sugestões sempre tão importantes.
Aos professores da área de Patologia, Clínica e Cirurgia Animal da
EVZ/UFG pela amizade, pelos ensinamentos e pela contribuição de alguma forma
para a execução desta pesquisa;
A todos os estagiários, bolsistas, mestrandos, doutorandos e amigos
do Setor de Patologia Animal pelo convívio nesse período de mestrado;
Aos professores convidados, por aceitarem colaborar com a qualidade
desta dissertação participando da banca de defesa;
Aos secretários da pós-graduação, Gerson Luiz Barros e Andréia
Oliveira de Santana por sempre terem me recebido com atenção e presteza.
Meus sinceros agradecimentos.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ x
LISTA DE TABELAS ............................................................................................. xii
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. xiii
RESUMO .............................................................................................................. xiv
ABSTRACT ........................................................................................................... xv
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ........................................................ 1
1 Introdução ........................................................................................................... 1
2 Caracterização do problema ............................................................................... 3
2.1 Mastócitos ........................................................................................................ 3
2.2 Mastocitoma canino.......................................................................................... 4
2.2.1 Estadiamento clínico ..................................................................................... 6
2.2.2 Diagnóstico .................................................................................................... 6
2.3 AgNOR ............................................................................................................. 9
2.4 C-KIT .............................................................................................................. 10
3 . Objetivos ......................................................................................................... 11
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 11
3.2 Objetivos específicos...................................................................................... 11
Referências .......................................................................................................... 12
CAPÍTULO 2 – ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DOIS CRITÉRIOS DE
CLASSIFICAÇÃO HISTOLÓGICA DO MASTOCITOMA CANINOErro! Indicador
não definido.
RESUMO .............................................................................................................. 17
CHAPTER 2 – COMPARATIVE STUDY OF TWO CRITERIA FOR
HISTOLOGICAL CLASSIFICATION OF CANINE MASTOCYTOMA ............... Erro!
Indicador não definido.7
ABSTRACT .........................................................................................................177
INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 18
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 19
RESULTADOS ..................................................................................................... 20
DISCUSSÃO.............................................................................................................25
CONCLUSÕES .................................................................................................... 27
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 27
ix
CAPÍTULO 3 – DETERMINAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE AGNOR’S E
EXPRESSÃO DE C-KIT AUMENTAM A EFICIÊNCIA DA CLASSIFICAÇÃO E
PROGNÓSTICO DO MASTOCITOMA CANINO ...... Erro! Indicador não definido.
RESUMO .............................................................................................................. 30
CHAPTER 3 - DETERMINATION OF THE FREQUENCY OF AGNOR'S AND
EXPRESSION OF C-KIT INCREASE THE EFFICIENCY OF CLASSIFICATION
AND PROGNOSIS OF CANINE MASTOCYTOMA .. Erro! Indicador não definido.
ABSTRACT .......................................................................................................... 30
INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 31
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 33
RESULTADOS ..................................................................................................... 36
DISCUSSÃO............................................................................................................41
CONCLUSÕES .................................................................................................... 44
REFERÊNCIAS ...................................................................................................444
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................... 47
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Fotomicrografias de fragmento de mastocitoma cutâneo
canino Grau I. A) HE. B) Pardo de Bismark. Notam-se
células de tamanho uniforme, com forma redonda a oval,
citoplasma abundante, núcleo redondo a oval e grânulos
evidentes (setas). 400X .........................................................
21
FIGURA 2 Fotomicrografias de fragmento de mastocitoma cutâneo
canino classificados em grau intermediário. A e B) Células
pleomórficas (setas), quantidade moderada de citoplasma
(cabeça da seta), núcleos de formatos redondos a ovais. C)
Mastocitoma de grau intermediário, reavaliado em baixa
intensidade devido ao aspecto celular uniforme, citoplasma
abundante, núcleo redondo a oval (setas). D) Mastocitoma
de grau intermediário, reavaliado em alta intensidade.
Células multinucleadas (setas) pleomorfismo, citoplasma
moderado, núcleo redondo a oval. HE (A), Pardo de
Bismark (B, C D). 400X.........................................................
23
FIGURA 3 Fotomicrografias de fragmento de mastocitoma cutâneo
canino Grau III. A e B) Células pleomórficas com escassez
de citoplasma (setas), células binucleadas com
cariomegalia (cabeça da seta). Notar ausência de grânulos
em B. C) Mastocitoma reclassificado em alta intensidade.
Presença de células multinucleadas (setas), anisocitose
(seta redonda). D) Tumor reclassificado em baixa
intensidade. Mastócitos neoplásicos infiltrando o tecido
conjuntivo (setas), ausência de células multinucleadas, HE
(A, C e D), Pardo de Bismark (B). 100X.................................
24
FIGURA 1 Mastocitoma cutâneo canino. Os pontos pretos (setas)
representam as regiões organizadoras nucleolares
argirofílicas (AgNOR). A) Mastocitoma de baixa
xi
intensidade (AgNOR = 1,82), 40x. B) Mastocitoma de alta
intensidade (AgNOR= 2,06), 400x.......................................
36
FIGURA 2 Fotomicrografias de fragmentos de mastocitoma canino
marcados com anticorpo anti c-KIT. A e B apresentam
marcação citoplasmática compatível com padrão de baixa
intensidade. C e D evidênciam a positividade
citoplasmática difusa intensa, compatível com a categoria
de alta intensidade. 400X. DAB, contra-coloração com
hematoxilina................................................
38
FIGURA 3 Variação dos resultados das densidades ópticas das
regiões de alta intensidade, marcadas com o anticorpo
anti c-KIT. Valores expressos em pixels/polegada..............
39
FIGURA 4 Variação dos resultados das densidades ópticas das
regiões de baixa intensidade analisadas marcadas com o
anticorpo anti c-KIT. Notar a discrepância dos valores das
amostras 3 e 10. Valores expressos em pixels/polegada....
40
FIGURA 5 Gráfico evidenciando a densidade ótica da marcação por
c-KIT distribuição imunohistoquímica nas amostras de
mastocitomas cutâneos de cães, classificados de acordo
com os parâmetros de Kiupel. Valores expressos em
pixels/polegada ...................................................................
41
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Frequências absoluta e relativa das amostras de
mastocitoma cutâneo canino de acordo com a
classificação de PATNAIK et al (1984) ........................ 20
TABELA 2 Classificação das amostras de mastocitoma cutâneo
canino de acordo com a classificação de KIUPEL ...... 21
TABELA 1
Variáveis calculadas para AgNOR/núcleo, em
mastocitomas cutâneos caninos, para os dois grupos
histopatológicos (p<0,05) ............................................. 37
TABELA 2 Variáveis calculadas para imunomarcação de c-KIT,
em mastocitomas cutâneos caninos, para os grupos
de alta e baixa intensidade. Valores de densidade
óptica expressos em pixels/polegada........................... 39
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
AgNOR – região organizadora nucleolar argirofílica
ATP – adenosina trifosfato
BSA – soro albumina bovina
CD117 – marcador de receptor tirosina quinase
DAB – diaminobenzidina
DNA – ácido desoxirribonucléico
EVZ – escola de Veterinária e Zootecnia
G1 – grau I de mastocitoma cutâneo
G2 – grau II de mastocitoma cutâneo
G3 – grau III de mastocitoma cutâneo
HE – hematoxilina e eosina
IC – intervalo de confiança
MCC – mastocitoma cutâneo canino
N – número de indivíduos na amostra
NORs – regiões organizadoras de nucléolos
OMS – organização Mundial de Saúde
PAAF – punção aspirativa por agulha fina
PBS – solução salina tamponada com fosfato
RNAr – áÁcido ribonucléico ribossomal
SCF – fator de células tronco
UFG – universidade Federal de Goiás
xiv
RESUMO
Em cães, o mastocitoma é a neoplasia cutânea mais comum, representando até
21% de todos os tumores de pele. Ainda que o fator prognóstico mais consistente
no diagnóstico seja a avaliação histopatológica, diferentes sistemas de
classificação para o mastocitoma cutâneo canino são utilizados, reduzindo o valor
prognóstico da graduação histológica. O sistema de Patnaik, de classificação em
três níveis, ainda é o mais utilizado, mas muitas vezes essa graduação é
subjetiva, podendo um mesmo tumor ser classificado em diferentes graus por
patologistas distintos. Em 2011, KIUPEL e colaboradores propuseram um novo
sistema de classificação histológica, dividindo os tumores em duas classes, baixa
intensidade e alta intensidade. Objetivou-se com este estudo avaliar a
comparação entre os métodos classificatórios de Patnaik e Kiupel, e estabelecer
uma possível relação entre o comportamento biológico do mastocitoma
classificado de acordo com o método de Kiupel, por meio da técnica histoquímica
de AgNOR’s e da expressão de c-KIT. Amostras de mastocitoma cutâneo canino
dos arquivos do Laboratório de Patologia Animal da Escola de Veterinária e
Zootecnia da Universidade Federal de Goiás foram utilizadas para este fim. Além
de explicitar a subjetividade dos tumores classificados em grau intermediário pelo
sistema Patnaik, as análises indicaram que a graduação de Kiupel gerou maior
concordância entre os patologistas, confirmando sua maior eficiência. O índice
proliferativo, determinado pelo método de AgNOR’s, foi superior nos
mastocitomas de alta intensidade. A expressão de c-KIT em geral corroborou a
graduação histopatológica. Os resultados demonstraram que o novo sistema de
classificação histopatológica de Kiupel, aliado ao estudo histoquímico e
imunoistoquímico, é mais eficiente que o método de Patnaik para o diagnóstico
histológico e prognóstico do mastocitoma, ressaltando-se que a graduação
histológica não é um parâmetro suficiente, quando utilizado como ferramenta
única.
Palavras-chave: cães, graduação histológica, Kiupel
xv
ABSTRACT
In dogs, mastocytoma is the most common skin cancer, representing up to 21% of
all skin tumors. Although the most consistent prognostic factor in diagnosis is
histopathological evaluation, different classification systems for canine cutaneous
mast cell tumors are used, reducing the prognostic value of histological grading.
The Patnaik system, based on a three-level classification, is still the most used,
despite its subjectivity. In 2011, KIUPEL and collaborators proposed a new
histological classification system, sorting the tumors into two classes, low intensity
and high intensity. The objective of this study was to evaluate the comparison
between the methods of classification of Patnaik and Kiupel, and establish a
possible relationship between the biological behavior of Kiupel method classified
mastocytoma with the through the histochemical AgNOR's technique and the
expression of c-KIT. Samples of canine cutaneous mastocytoma from the
Laboratory of Animal Pathology, School of Veterinary and Animal Science, Federal
University of Goiás were used for this purpose. In addition to highlighting the
subjectivity of tumors classified as intermediate grade system by Patnaik, the
analysis indicated that the Kiupel’s method brought up greater agreement among
pathologists, confirming its efficiency. The proliferative index determined by
AgNOR's was greater in high intensity mastocytomas. In general, the expression
of c-KIT corroborated the histological classification. The results showed that the
new Kiupel classification system, is more efficient for the histological diagnosis
and prognosis of canine mastocytoma when coupled with immunohistochemical
and histochemical study.
Keywords: dogs, histologic grading, Kiupel
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1 Introdução
A dermatologia e a oncologia são as especialidades que mais se
destacaram nas últimas décadas na Medicina Veterinária de pequenos animais,
haja vista que tumores pele são a segunda condição dermatológica mais
diagnosticada. Em cães, o mastocitoma cutâneo é a neoplasia mais comum e
representa entre 7 a 21% de todos os tumores de pele e 11 a 27% das neoplasias
malignas (PULLEY & STANNARD, 1990); (STREFEZZI et al., 2003).
O mastocitoma é uma neoplasia cutânea, de origem mesenquimal,
caracterizado por uma proliferação neoplásica de mastócitos. Apresenta
comportamento biológico variável e imprevisível, com grande capacidade de
recidivas e metástases. Ocorre em todas as espécies domésticas e sua
manifestação mais comum é a cutânea, embora possa ocorrer envolvimento
ósseo ou visceral, principalmente em diferentes localizações do trato
gastrintestinal. Cães de raças de porte grande apresentam risco maior de
desenvolver mastocitoma do que os de raças de porte pequeno (GOLDSCHMIDT
& HENDRICK, 2002; RECH et al., 2004; DIAS, 2007; WHITE et al., 2011.
O fator prognóstico mais consistente no diagnóstico de cães com
mastocitoma é a avaliação histopatológica. O grau histopatológico é determinado
após biópsia incisional ou excisional e correlaciona-se significativamente com a
escolha do tratamento. Recidivas, probabilidade de metastização e sobrevida
animal são associadas à determinação do grau de diferenciação celular.
(FURLANI et al., 2008).
Existem vários sistemas de classificação para o mastocitoma cutâneo
canino (MCC) citados na literatura, como o de Hottendorf & Nielsen (1967), o de
Bostock (1973), o de Patnaik et al., (1984), o de Morris e Dobson (2001) e o de
Meuten (2002). No entanto, a classificação de Patnaik é a mais utilizada pelos
patologistas por ser seu método de graduação mais completo (STREFEZZI et al.,
2010). Neste sistema, os tumores de Grau I são bem diferenciados com presença
de mastócitos neoplásicos na derme superficial ou profunda. No Grau II, os
tumores são maiores, tendo os mastócitos diferenciação moderada, invasão da
2
derme profunda e tecido subcutâneo. No Grau III, os mastócitos apresentam
localização extensiva na derme e subcutâneo, células pleomórficas
multinucleadas e células gigantes, citoplasma indistinto e núcleo redondo com um
ou mais nucléolos proeminentes (PATNAIK et al., 1984).
Para BOSTOCK et al. (1989) muitas vezes a graduação histológica é
subjetiva, ou seja, um mesmo mastocitoma pode ser classificado com grau
diferente por patologistas distintos. Esta possibilidade é maior quando se trata de
mastocitomas classificados como grau II, devido ao amplo comportamento
biológico designado a este grau (BOSTOCK et al., 1989).
Em 2011, KIUPEL e colaboradores propuseram um novo sistema de
classificação histológica para melhorar a concordância entre patologistas. O
sistema Kiupel divide os tumores em duas classes, baixo grau (intensidade) e alto
grau (intensidade) de acordo com a frequência de alterações citológicas das
células tumorais, como figuras de mitose, núcleos múltiplos e bizarros, e
cariomegalia. Invasão tumoral, reação do estroma e grânulos intracitoplasmáticos
não estão incluídos nos critérios de classificação de Kiupel (KIUPEL et al., 2011).
Nos últimos anos, alguns pesquisadores vêm propondo a utilização de
novas técnicas para avaliar o prognóstico dos pacientes com mastocitoma. Dentre
essas técnicas, destaca-se o método da região organizadora nucleolar argirofílica
(AgNOR). Demonstrou-se que a técnica de AgNOR é menos subjetiva do que a
avaliação histológica baseada nos graus de diferenciação (GOLDSCHMIDT &
HENDRICK, 2002).
Outra alternativa para o diagnóstico é a utilização do anticorpo anti c-
KIT, que promove imunomarcação eficiente em mastócitos neoplásicos. Essa
análise contribui para maior eficiência do diagnóstico, avaliação da progressão da
neoplasia, provável resposta à terapia e estimativa de sobrevida animal
(LONDON & SEGUIN, 2003).
Dessa forma, considera-se oportuno reunir informações importantes
sobre a avaliação histológica e histoquímica na nova proposta de classificação do
mastocitoma canino, utilizando o método de AgNOR para marcação de nucléolos
e um marcador de ativação e desenvolvimento tumoral, o c-KIT, para estabelecer
um comparativo do comportamento biológico com o novo método de graduação.
3
2 Caracterização do problema
2.1 Mastócitos
As células mastocitárias foram descritas pela primeira vez por Paul
Ehrlich em 1878 e o primeiro relato que se tem, de seu cultivo in vitro, foi no início
do ano de 1960, por GINSBURG e colaboradores, sendo posteriormente
cultivadas, por ISHIZAKA e pesquisadores, através de células do timo de ratos
(GINSBURG & LAGUNOFF, 1967; ISHIZAKA et al., 1976).
Os mastócitos são células complexas, multifuncionais, que apresentam
papel central na imunidade natural e adquirida. Eles são formados a partir das
células multipotentes hematopoiéticas, expressando o antígeno CD34, e iniciam
sua diferenciação sob influência do fator de células tronco (SCF), e da IL-3 de
uma linhagem distinta de monócitos, macrófagos e de precursores dos
granulócitos. Fibroblastos também contribuem para diferenciação e maturação
local de mastócitos através do SCF, do fator de crescimento do nervo e de outros
mecanismos (RODEWALD et al., 1996; VAN GYSEL et al., 2006).
Os mastócitos são encontrados principalmente em tecidos epiteliais de
revestimento, tais como a pele, a mucosa do trato respiratório e gastrointestinal. E
estão associadas aos vasos sanguíneos e em estreita proximidade com os nervos
periféricos. No cão, os órgãos que contém maior número de mastócitos são
pulmões, pele, intestino e fígado (O'KEEFE, 1990; JOHNSON & KRENGER,
1992; SAITO et al., 2013).
As funções mais importantes dos mastócitos são sintetizar e
armazenar mediadores e substâncias químicas da reação inflamatória. Um
aspecto característico de mastócitos maduros é a presença de grânulos
citoplasmáticos que contêm substâncias biologicamente ativas como a histamina,
a heparina, a dopamina, as prostaglandinas e diferentes interleucinas. Além da
indução da inflamação aguda, há também uma participação dos mastócitos na
reparação tecidual da inflamação crônica, das reações agudas e tardias da
anafilaxia e condições proliferativas como a mastocitose e o mastocitoma (DIAS,
2007).
4
A mastocitose caracteriza-se pelo acúmulo anormal de mastócitos na
pele ou em outros órgãos e tecidos. Dependendo do órgão envolvido, a
mastocitose pode ser classificada em cutânea ou sistêmica. Nos canídeos, a
classificação dos tumores de origem hematopoiética não contempla a existência
da mastocitose, como definida nos humanos, sendo, portanto uma proliferação de
mastócitos não-neoplásicos em processos reativos dos tipos reações
inflamatórias e alérgicas (VALENT et al., 2001; THAMM & VAIL, 2007).
2.2 Mastocitoma canino
O mastocitoma canino é uma proliferação maligna, de mastócitos, que
corresponde a aproximadamente 11% dos tumores da pele do cão. A exata
etiologia ainda é desconhecida, mas é provavelmente multifatorial. Em ocasiões
raras, essas neoplasias estão associadas às lesões inflamatórias crônicas, e à
exposição contínua da pele, a substâncias irritantes. Alterações genéticas são
cruciais para o desenvolvimento de células neoplásicas, as modificações no gene
supressor tumoral p-53 e nas vias que regulam o ciclo celular foram relatadas
como possíveis causas para o desenvolvimento dos mastocitomas. Descreveu-se
também a existência de mutações, no ponto do gene c-KIT, que codifica o
domínio justamembrana do receptor tirosina quinase, em mastócitos neoplásicos,
justificando o crescimento descontrolado dos tumores (ZEMKE et al., 2002;
THAMM & VAIL, 2007; VILLAMIL et al., 2011; BLACKWOOD et al., 2012).
O mastocitoma cutâneo ocorre em animais de todas as idades, porém
é mais frequente em cães com média de nove anos. Não existe uma predileção
sexual, contudo há evidências de predisposição racial, sugerindo contribuição
genética para o desenvolvimento do mastocitoma e influenciando na
suscetibilidade individual à agressividade do tumor. Cães da raça Boxer, Labrador
Retriever e Golden Retriever são descritas como as mais predispostas ao
mastocitoma (THAMM & VAIL, 2007; WARLAND, 2013).
A manifestação mais comum é a cutânea. Porém, com menor
frequência, pode ocorrer envolvimento ósseo ou visceral primário de cavidade
oral, mucosa nasal, nasofaringe, laringe, traquéia, estômago, intestino, fígado,
5
baço, rim, conjuntiva ou canal espinhal extradural (OZAKI et al., 2002), (LONDON
& SEGUIN, 2003).
A maioria dos mastocitomas caninos ocorre na derme e tecido
subcutâneo, sendo os tumores de origem subcutânea, menos agressivos.
Considerando o local anatômico das lesões, os mastocitomas preferencialmente
se desenvolvem na região corporal médio-caudal, incluindo períneo, membros
posteriores, abdômen e genitália. Cabeça e pescoço são regiões de menor
ocorrência (ROSSETO et al., 2009; THOMPSON et al., 2011).
O aspecto clínico do mastocitoma cutâneo canino é bastante variável,
sendo similar a outros tumores, dificultando o diagnóstico macroscópico. As
lesões podem ser firmes ou flutuantes, papulares, nodulares ou pedunculadas, de
localização dérmica a subcutânea, sendo bem ou mal circunscritas, associadas à
alopecia e ulceração. A variação de tamanho pode ser de poucos milímetros a
vários centímetros de diâmetro. O tumor é frequentemente acompanhado dos
sinais clínicos da inflamação, especialmente o edema (THAMM & VAIL, 2007).
MORRIS & DOBSON, (2001) relataram que o comportamento clínico
do mastocitoma canino varia de acordo com o grau de intensidade da neoplasia.
Quando menor, apresenta-se como um nódulo solitário, podendo ulcerar pela
pele, em alguns casos. Irritação e hiperemia poderão ocorrer se houver liberação
de histamina pelas células tumorais. Nos casos mais agressivos, os tumores
podem se apresentar grandes, mal definidos, de consistência macia. Metástases
podem ocorrer por disseminação hematógena ou linfática.
As consequências da liberação dos grânulos mastocitários constituem
uma série de eventos, que decorrem de ações não invasivas do neoplasma, em
sítios distantes do tumor primário, ou de suas metástases, denominando-se
Síndrome Paraneoplásica do Mastocitoma. A liberação da histamina, ocasiona a
reação anafilática. Ela estimula as células parietais do estômago a produzirem
ácido clorídrico, causando danos ao endotélio vascular da mucosa
gastrointestinal, o que resulta em necrose e úlceras gastroduodenais, que
normalmente são múltiplas. Sinais relacionados à pele como prurido, eritema e
edema também decorrem da liberação continuada de histamina pelas células
neoplásicas. Já a liberação continuada de heparina, por sua vez, prolonga o
tempo de coagulação sanguínea, resultando em hemorragia (JONES et al., 2000).
6
Distúrbios paraneoplásicos do sistema nervoso são frequentes em
seres humanos, contudo, em animais, a incidência dessas alterações ainda é
desconhecida. Há relatos na literatura, de um número pequeno, de ocorrências de
neuropatia paraneoplásica em animais da espécie canina. Os principais sinais
clínicos são fraqueza, intolerância a exercícios, hipotonia muscular, paresia ou
paralisia de membros torácicos e pélvicos, atrofia muscular neurogênica e
reflexos espinhais reduzidos ou ausentes (MORRISON, 2002; VINCENT, 2005).
2.2.1 Estadiamento clínico
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o
mastocitoma apresenta quatro estádios clínicos, os quais determinam a extensão
da doença no organismo. No estádio I, o tumor apresenta-se confinado à derme,
sem envolvimento dos linfonodos regionais. No estádio II, o tumor está confinado
à derme, com envolvimento dos linfonodos regionais. Já no estádio III, há
múltiplos tumores na derme ou apenas uma grande neoplasia infiltrativa com ou
sem envolvimento dos linfonodos regionais e no estádio IV, tem-se metástase ou
recidiva e enfermidade sistêmica. A forma determinante para se estabelecer o
estágio clínico, do mastocitoma, é através do exame físico completo do animal,
com especial atenção à palpação dos linfonodos e presença de hepato e
esplenomegalia e, dessa forma, tomar-se a decisão terapêutica mais adequada
(DIAS, 2007).
2.2.2 Diagnóstico
O diagnóstico do mastocitoma pode ser feito pelos exames
citopatológico, utilizando a punção aspirativa por agulha fina (PAAF), e
histopatológico, a partir de fragmentos de tecidos oriundos de biópsia incisional ou
excisional. Tanto ao exame citopatológico quanto histopatológico os mastócitos
são caracterizados a partir da morfologia celular e da quantidade e tamanho dos
grânulos citoplasmáticos. O método PAAF é simples e confiável para o
diagnóstico, no entanto, a histopatologia é necessária para graduar o tumor e
determinar, nos casos de exéreses cirúrgicas, se as margens de tecido normal
7
estão livres de células neoplásicas. Além da avaliação da amostra tumoral, o
exame do linfonodo regional (drenante) é eficaz na detecção de infiltração e
metástases (LAVALLE et al., 2003; STREFEZZI et al., 2010).
A afinidade granular aos corantes básicos permite identificação
específica de mastócitos, tanto no diagnóstico quanto na identificação do grau de
diferenciação do tumor. Para tal, as colorações preconizadas são Giemsa e azul
de toluidina, nos exames cito e histopatológico, respectivamente. Nessas
colorações, os grânulos tingem-se de vermelho ou púrpura, característica
denominada metacromasia. A proporção de coloração de azul de toluidina é um
parâmetro importante, pois se observa uma coloração mais intensa nos tumores
melhor diferenciados, ou seja, os classificados como mastocitomas de baixa
intensidade (MEUTEN, 2002; PRADO et al., 2012).
MORRIS & DOBSON (2001) relataram que o grau de diferenciação
celular, o índice de mitose e invasão de tecidos adjacentes são eficientes para
graduar histologicamente o mastocitoma. Três graus são descritos: no primeiro, o
tumor é bem diferenciado e prognóstico favorável; no segundo, o tumor é
moderadamente diferenciado, sendo intermediário tanto no aspecto histológico,
como no comportamento; no terceiro, o tumor é pouco diferenciado, invasivo, com
alta taxa de metástase e pobre prognóstico.
MEUTEN (2002) sugeriu uma correlação entre o grau de diferenciação
celular e biológico, descrevendo um sistema de classificação apresentando três
classes. Na primeira classe, os tumores são confinados à derme, na segunda e
terceira se estendem até o tecido subcutâneo divergindo em seu grau de
diferenciação. Neste sistema, os tumores de Grau I (G1) são bem diferenciados
com pouca ou sem mitose. No Grau II (G2) são maiores, menos delimitados, se
estendem até a derme profunda e hipoderme, com pleomorfismo nuclear leve e
índice de mitose menor que dois por campo. No Grau III (G3), os tumores são
compostos por células anaplásicas com tamanhos variados, núcleos
proeminentes, grânulos citoplasmáticos menos numerosos e por vezes não
identificáveis sem a utilização de colorações histoquímicas especiais e figuras de
mitose frequentes.
A classificação mais utilizada, no entanto, ainda é o sistema de
graduação estabelecido por PATNAIK et al. (1984). Neste sistema, os tumores de
8
Grau I são bem diferenciados com presença de mastócitos neoplásicos na derme
superficial ou profunda, com células redondas a ovais, uniformes, tendo
citoplasma abundante e bem delimitado e núcleo redondo. As células neoplásicas
se assemelham aos mastócitos normais e estão arranjadas em cordões e/ou
camadas finas.
No Grau II, os tumores são maiores, tendo os mastócitos diferenciação
moderada, invasão da derme profunda e subcutâneo, células redondas a ovais a
moderadamente pleomórficas com raras células binucleadas, citoplasma distinto a
indistinto, núcleo redondo com um ou mais nucléolos visíveis. As células
neoplásicas ainda estão arranjadas em cordões, porém, mais desorganizadas e
com padrão infiltrativo de crescimento. Apresentam menor quantidade de
grânulos citoplasmáticos (PATNAIK et al., 1984; GROSS et al., 2005).
No Grau III ou pouco diferenciados, os mastócitos apresentam
localização extensiva na derme e subcutâneo. As células neoplásicas estão
organizadas em camadas sólidas e os grânulos não são discerníveis às
colorações de rotina. Mesmo as especiais podem exibir pouca metacromasia. As
células são pleomórficas, multinucleadas, o citoplasma está indistinto, o núcleo
redondo com um ou mais nucléolos proeminentes. Há poucos eosinófilos e o
estroma é escasso ou inexistente (PATNAIK et al., 1984; GROSS et al., 2005).
O uso dos diferentes sistemas de classificação dos mastocitomas pelos
patologistas veterinários faz o valor prognóstico da graduação histológica ser
altamente questionável. Em 1989, BOSTOCK e outros pesquisadores já
contestavam a subjetividade da graduação histológica. Questionava-se a
possibilidade de um mesmo mastocitoma ser classificado com grau diferente por
patologistas distintos, principalmente quando se trata de mastocitomas
classificados como grau II, devido ao amplo comportamento biológico designado a
este grau (BOSTOCK et al., 1989; SCASE et al., 2006; TAKEUCHI et al., 2013).
Consequentemente, com vistas à concordância entre patologistas, um
novo sistema de avaliação histológica foi proposto por Kiupel e colaboradores,
classificando os mastocitomas caninos em baixa e alta intensidade, considerando-
se alta quando da presença de pelo menos um dos seguintes critérios em dez
campos analisados: sete figuras de mitose, três células multinucleadas e três
núcleos atípicos (KIUPEL et al., 2011).
9
2.3 AgNOR
A mensuração, da atividade celular proliferativa, pode acrescentar
informações importantes para a formulação de um prognóstico mais confiável em
doenças neoplásicas. O método citológico da região organizadora nucleolar
argirofílica (AgNOR- argirophilic nucleolar organizer region) mede grau de
proliferação celular e essa técnica tem sido utilizada, nas últimas décadas, como
um marcador tumoral eficiente na medicina (GOLDSCHMIDT & HENDRICK,
2002; RECH et al., 2004).
As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) são alças de ácido
desoxirribonucléico (DNA) responsáveis por sintetizar ácido ribonucléico
ribossomal (RNAr) durante a intérfase, período de síntese protéica e de aumento
de volume, tamanho e número de organelas da célula. É no nucléolo, localizado
no núcleo celular, que há armazenamento e produção de RNAr, que ligados à
várias proteínas irão formar os ribossomos. Esses genes RNA ribossomais
possuem papel importante na transformação maligna. Um aumento no número de
AgNOR seria o resultado de proliferação celular com aumento na transcrição e
aumento do conteúdo celular de DNA, o que ocorre em células que proliferam
mais ativamente (PLOTON et al., 1986; SERAKIDES et al., 1999).
A técnica de AgNOR permite visualizar o nucléolo e estudar a variação
do tamanho do nucléolo e o número de pontos corados pela prata em tecidos. À
microscopia eletrônica, as regiões organizadoras nucleolares argirofílicas,
marcam-se como pontos marrons escuros a castanhos (PLOTON et al., 1986),
(DIAS, 2007).
AgNORs em células normais aparecem de tamanho regular e forma
redonda, mas em tecidos malignos, surgem menos uniformes em tamanho e
forma, assumindo frequentemente formas estranhas (THIELE et al., 2013).
A utilização da técnica de AgNOR em mastocitomas caninos foi
descrita pela primeira vez em 1989, por Bostock e colaboradores. Estudos da
técnica em neoplasias humanas mostraram que o número de AgNORs por núcleo
correlaciona-se com o grau histológico, sendo pior o prognóstico, quanto maior o
número de pontos argirofílicos intranucleares visualizados (BOSTOCK et al.,
1989; TOMITA et al., 1993).
10
2.4 C-KIT
Células-tronco são células capazes tanto de diferenciação como de
autorrenovação. As células-tronco hematopoéticas são as mais extensivamente
pesquisadas e podem ser divididas em três tipos: células-tronco hematopoéticas
com capacidade de autorrenovação a longo-termo, células-tronco hematopoéticas
com capacidade a curto termo e progenitores multilinhagem. C-KIT, também
designado CD117 ou KIT, é um dos marcadores de superfície presentes em
células-tronco hematopoéticas com capacidade de autorrenovação a longo-termo
(REYA et al., 2001).
Enquanto a exata etiologia do mastocitoma permanece desconhecida,
sua patogênese relacionada à expressão do c-KIT e sua detecção usando
imunoistoquímica, está bem estabelecida. Um dos mecanismos propostos para a
proliferação de mastócitos em cães é a alteração da sequência de nucleotídeos
do gene c-KIT. Todos os mastocitomas caninos expressam c-KIT, ainda que a
intensidade de reação seja diferente. Aproximadamente 40% dos mastocitomas
apresentam mutações de c-KIT Os tumores de maior grau de malignidade
apresentam sua expressão mais elevada (LONDON et al., 1999; REGUERA et al.,
2000; WELLE et al., 2008).
O proto-oncogene c-KIT codifica a proteína KIT, cuja fosforilação leva a
ativação de receptores tirosina quinase em mastócitos, estimulando a maturação,
proliferação. A falta de SCF ou do gene c-KIT inibe o desenvolvimento de
mastócitos (TIZARD, 2002).
O gene c-KIT codifica um tipo III de receptor da proteína tirosina
quinase, que é composta de ligantes extracelulares (codificado por exons de 1-9
de c-KIT), um segmento transmembrana único (exon 10), um domínio
justamembrana (exons 11 e 12) e um domínio tirosina quinase citoplasmática, que
é dividido por uma inserção no ATP-ligante (exon 13) e lobos fosfotransferase
(exon 17). Várias mutações, incluindo deleções, foram identificadas nos domínios
extracelulares de c-KIT, (exons 8 e 9), justamembrana (exon 11), e
fosfotransferase (exon 17). Mutações no domínio justamembrana do gene c-KIT
causam auto-fosforilação resultando em ativação de c-KIT e desenvolvimento
tumoral (ROSKOSKI, 2005).
11
3 . Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Nesse trabalho procurou-se descrever o padrão histológico e
histoquímico do mastocitoma canino, seguindo a nova proposta de classificação
de Kiupel, estabelecendo um comparativo do comportamento biológico por meio
do método de AgNOR e a expressão imunoistoquímica de c-KIT, em amostras
obtidas do Laboratório de Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia
da UFG, do período de janeiro de 2007 a abril de 2011.
3.2 Objetivos específicos
Analisar o padrão histológico do mastocitoma canino no novo modelo de
graduação de Kiupel.
Verificar a frequência de AgNOR nos mastócitos neoplásicos, comparando
com a graduação histológica.
Comparar resultados quantitativos da expressão de c-KIT no novo modelo de
graduação histológica de Kiupel.
12
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17
CAPÍTULO 2 – ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DOIS CRITÉRIOS DE
CLASSIFICAÇÃO HISTOLÓGICA DO MASTOCITOMA CANINO
RESUMO
O grau de diferenciação celular, índice mitótico e invasão de tecidos adjacentes
são considerados parâmetros eficientes para graduar histologicamente o
mastocitoma canino. Atualmente, a classificação mais utilizada ainda é o sistema
de três graus estabelecido por Patnaik, que muitas vezes é subjetiva.
Redentemente, Kiupel e colaboradores propuseram um novo sistema de
classificação histológica, dividindo os tumores em duas classes, baixa intensidade
e alta intensidade. No presente estudo, foram comparados os métodos
classificatórios de Patnaik e Kiupel, em fragmentos de mastocitoma canino. Os
resultados indicaram que a graduação de Kiupel apresentou maior concordância
entre os patologistas e permitiram constatar a subjetividade dos tumores
classificados em grau II pelo sistema Patnaik, sendo o modelo proposto por Kiupel
mais eficiente nesses casos.
Palavras-chave: neoplasia, cão, prognóstico.
COMPARATIVE STUDY OF TWO CRITERIA FOR HISTOLOGICAL
CLASSIFICATION OF CANINE MASTOCYTOMA
ABSTRACT
The degree of cell differentiation, mitotic index and invasion of adjacent tissues are
considered efficient parameters to histological grading of canine mastocytoma.
Currently, the most widely used classification method is still the three-grade
system established by Patnaik, which is often subjective. Recently, Kiupel and
collaborators proposed a new histological classification system, sorting the tumors
into two classes, low intensity and high intensity. In the present study, we
compared Patnaik and Kiupel methods, to grade canine mastocytoma samples.
The results indicated that Kiupel’s method increases concordance among
pathologists and allows to assess the subjects' tumors with grade II system by
Patnaik, with the model proposed by Kiupel more efficient in these cases.
Keywords: neoplasia, dog, prognosis.
18
INTRODUÇÃO
O mastocitoma é um tumor cutâneo, de origem mesenquimal,
caracterizado por uma proliferação neoplásica de mastócitos, comportamento
biológico variável e imprevisível, com grande capacidade de recidivas e
metástases. Alterações genéticas, como as modificações no gene supressor
tumoral p-53 e nas vias que regulam o ciclo celular, são cruciais para o
desenvolvimento dos mastocitomas, (MEUTEN, 2002; RECH et al., 2004; DIAS,
2007; THAMM & VAIL, 2007).
Ocorre em animais de todas as idades, porém é mais frequente em
cães com média de nove anos. Cães da raça Boxer, Labrador Retriever e Golden
Retriever são descritos como os mais predispostos ao mastocitoma (THAMM &
VAIL, 2007; WARLAND, 2013).
O diagnóstico do mastocitoma pode ser feito pelos exames
citopatológico e histopatológico, em que os mastócitos são caracterizados a partir
da morfologia celular e da quantidade e tamanho dos grânulos citoplasmáticos.
Alguns sistemas de classificação de mastocitoma cutâneo canino são descritos.
Bostock (1973) classificou mastocitomas, como Grau I, aqueles pobremente
diferenciados, Grau II, de diferenciação intermediária e Grau III, neoplasias bem
diferenciadas (LAVALLE et al., 2003; STREFEZZI et al., 2010).
A classificação mais utilizada, no entanto, ainda é o sistema de
graduação estabelecido por PATNAIK et al. (1984). Neste sistema, os tumores de
Grau I são bem diferenciados com presença de mastócitos neoplásicos na derme
superficial ou profunda, com células redondas a ovais, uniformes, tendo
citoplasma abundante e bem delimitado e núcleo redondo, semelhantes aos
mastócitos. No Grau II, os tumores são maiores, os mastócitos diferenciação
moderada, invasão da derme profunda e subcutâneo, células redondas a ovais a
moderadamente pleomórficas com raras células binucleadas, citoplasma distinto a
indistinto, núcleo redondo com um ou mais nucléolos visíveis e menor quantidade
de grânulos. No Grau III ou pouco diferenciados, os mastócitos apresentam
localização extensiva na derme e subcutâneo. As células neoplásicas se
organizam em camadas sólidas e os grânulos não são discerníveis às colorações
de rotina (PATNAIK et al., 1984; GROSS et al., 2005).
19
O uso dos diferentes sistemas de classificação dos mastocitomas,
pelos patologistas veterinários faz o valor prognóstico, da graduação histológica
ser altamente questionável. Desde 1989, BOSTOCK e outros pesquisadores já
contestavam a subjetividade da graduação histológica. Discutia-se a possibilidade
de um mesmo mastocitoma ser classificado com grau diferente por patologistas
distintos, principalmente quando se trata de mastocitomas classificados como
grau II, devido ao amplo comportamento biológico designado a este grau
(BOSTOCK et al., 1989; SCASE et al., 2006; TAKEUCHI et al., 2013).
Em 2011, KIUPEL e colaboradores propuseram um novo sistema de
classificação histológica, para melhorar a concordância entre patologistas. O
sistema Kiupel divide os tumores em duas classes, baixa intensidade e alta
intensidade, considerando-se alta quando da presença de pelo menos um dos
seguintes critérios em dez campos analisados: sete figuras de mitose, três células
multinucleadas e três núcleos atípicos (KIUPEL et al., 2011).
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi realizar a classificação
histológica de casos de mastocitoma canino de acordo com os novos critérios de
graduação propostos por KIUPEL et al (2011), estabelecendo uma comparação
com a classificação de PATNAIK et al., 1984.
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi desenvolvido na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)
da Universidade Federal de Goiás (UFG). As análises histológicas e
histoquímicas foram realizadas no Laboratório de Histopatologia do Setor de
Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zooctenia (EVZ) da Universidade
Federal de Goiás (UFG).
O estudo foi realizado com 30 amostras, previamente incluídas em
parafina, selecionadas a partir dos arquivos do Laboratório de Patologia Animal
da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, do
período de janeiro de 2007 a abril de 2011. Os fragmentos, com espessura de
5µm, foram seccionados em micrótomo automático, aderidos em lâminas
histológicas para. Protocolos de rotina do Laboratório de Histopatologia da
20
EVZ/UFG foram utilizados para a coloração (HE) hematoxilina-eosina e pardo de
Bismarck (LEACH, 1947; LUNA, 1968).
As lâminas foram montadas com meio a base de tolueno (Entellan,
Merck, Alemanha) e lamínulas histológicas. A avaliação foi feita em microscópio
de luz para promover a categorização do mastocitoma nos diferentes graus,
inicialmente adotando o sistema de graduação, de três classes, estabelecido por
PATNAIK et al. (1984) e posteriormente o método proposto por KIUPEL et al.
(2011) que divide os tumores em duas classes, baixa intensidade e alta
intensidade, considerando-se alta quando da presença de pelo menos um dos
seguintes critérios em dez campos analisados: sete figuras de mitose, três células
multinucleadas e três núcleos atípicosdez campos analisados, em (KIUPEL et al.,
2011).
As duas classificações foram comparadas entre si.
RESULTADOS
O total de registros, de mastocitoma cutâneo canino, avaliados no
período estudado, foi classificado de acordo com o grau histológico estabelecido
por PATNAIK et al. (1984). A tabela 1 expõe as frequências das amostras
histológicas, distribuídas na classificação de três graus. Posteriormente, as
mesmas amostras foram reexaminadas e graduadas de acordo com o sistema de
classificação de KIUPEL et al (2011) em dois níveis: baixa intensidade e alta
intensidade, para efeito comparativo (Tabela 2).
Tabela 1 – Frequências absoluta e relativa das amostras de mastocitoma cutâneo
canino de acordo com a classificação de PATNAIK et al (1984)
Graduação Frequência Relativa (%) Frequência Absoluta
Grau I 20 6
Grau II 50 15
Grau III 30 9
Total 100 30
21
Tabela 2 – Classificação das amostras de mastocitoma cutâneo canino de acordo
com a classificação de KIUPEL
Classificação de Kiupel Frequência Relativa (%) Frequência Absoluta
Alta Intensidade 53,33 16
Baixa Intensidade 46,67 14
Total 100 30
De acordo com a classificação de PATNAIK et al (1984), todos os
tumores classificados como grau I, apresentaram suas células com aspecto
uniforme, de tamanho redondo a oval, citoplasma abundante, núcleo redondo a
oval e localizaram-se na derme superficial. Comparando-se os achados da
classificação morfológica descritiva com os da graduação histopatológica, dentre
os 30 registros de mastocitomas cutâneos caninos, os seis casos (20%)
classificados como grau I, pelo sistema Patnaik foram reclassificadas em
mastocitomas de baixa intensidade pelo método de KIUPEL et al. (2011). As
características, dessas amostras, podem ser visualizadas na Figura 1.
FIGURA 1 – Fotomicrografias de fragmentos de mastocitoma cutâneo
canino Grau I. A) HE, 400X. B) Pardo de Bismark, 400X.
Nas duas figuras notam-se células de tamanho uniforme,
com forma redonda a oval, citoplasma abundante, núcleo
redondo a oval e grânulos evidentes (setas).
B A
22
Dos 15 casos, classificados como grau II, de acordo com Patnaik, 70%
dos tumores localizaram-se na derme superficial, assim como os tumores de grau
I e apenas 30% das demais amostras localizavam-se na derme profunda.
Anisocitose, pleomorfismo e algumas células multinucleadas estavam presentes,
havia uma quantidade moderada de citoplasma e o núcleo apresentou-se de
formato redondo a oval (Figura 2 A e B). Em comparação com a classificação de
Kiupel, nove (60%), das 15 amostras, foram reclassificadas em mastocitomas de
baixa intensidade (Figura 2 C e D) e seis (40%) como alta intensidade, como pode
ser visualizado na Figura 3.
23
FIGURA 2 – Fotomicrografias de fragmentos de mastocitoma cutâneo
canino classificados em grau II. A e B) Células
pleomórficas (setas), quantidade moderada de citoplasma
(cabeça da seta), núcleos de formatos redondos a ovais.
C) Mastocitoma de grau intermediário, reavaliado em baixa
intensidade devido ao aspecto celular uniforme, citoplasma
abundante, núcleo redondo a oval (setas). D) Mastocitoma
de grau intermediário, reavaliado em alta intensidade.
Células multinucleadas (setas), pleomorfismo, citoplasma
moderado, núcleo redondo a oval. HE (A), Pardo de
Bismark (B, C e D). 400X.
24
FIGURA 3 – Fotomicrografias de fragmento de mastocitoma cutâneo
canino Grau III. A e B) Células pleomórficas com escassez de
citoplasma (setas), células binucleadas com cariomegalia
(cabeça da seta). Notar ausência de grânulos em B. C)
Mastocitoma reclassificado em alta intensidade. Presença de
células multinucleadas (setas), anisocitose (seta redonda). D)
Tumor reclassificado em baixa intensidade. Mastócitos
neoplásicos infiltrando o tecido conjuntivo (setas), ausência de
células multinucleadas, HE (A, C e D), Pardo de Bismark (B).
100X.
25
Apresentando características morfológicas acentuadamente malignas,
80% dos tumores grau III encontraram-se na derme profunda, exibindo o caráter
invasivo da neoplasia e apenas 20% que estavam na derme superficial. Aspecto
celular pleomórfico, escassez de citoplasma, núcleo redondo a oval e bastantes
células multinucleadas podem ser visualizadas na Figura 3.
Dentre as nove amostras classificadas em grau III, oito (88,89%)
apresentaram as características de alta intensidade, com sete ou mais figuras de
mitose, no mínimo três células multinucleadas, três ou mais núcleos bizarros e
cariomegalia. Porém uma amostra (11,11%) foi reclassificada em baixa
intensidade, pois apesar do aspecto infiltrativo, foram observadas poucas células
multinucleadas e não havia figuras de mitose (Figura 3).
DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliou-se a relação entre a graduação
histopatológica, de mastocitomas cutâneos caninos, pelos métodos de Patnaik
(1984) e Kiupel (2011), visando-se estabelecer uma comparação entre os dois
critérios de classificação. O sistema de Patnaik tem sido utilizado há várias
décadas como padrão ouro na classificação de mastocitomas, seguindo
características principalmente qualitativas. Porém, tem ocorrido elevada
discrepância entre os observadores, principalmente devido à subjetividade dos
critérios para se estabelecer a classificação. Recidivas, probabilidade de
metástase e tempo de sobrevida animal são variáveis de suma importância,
associadas ao grau de diferenciação celular, o que torna a eficácia da graduação
um fator indispensável. Uma possível diferença, na categorização histopatológica
dos mastocitomas, faz o valor prognóstico e também a escolha do tratamento do
paciente ser altamente questionável (NORTHUP, 2005; FURLANI et al., 2008).
A partir da graduação das 30 amostras de mastocitomas, seis delas
foram classificadas em grau I, de acordo com os critérios de Patnaik, e todas
foram reclassificadas como de baixa intensidade no modelo de Kiupel. Essa
concordância, em relação ao grau I, normalmente ocorre devido ao fato de as
células neoplásicas estarem bem diferenciadas, assemelhando-se aos mastócitos
normais, sendo monomórficas e estando arranjadas em cordões e/ou camadas
26
finas. O núcleo é redondo ou ovalado, pequeno, com nucléolos quase invisíveis.
Essas características são mais perceptiveis aos patologistas, proporcionando
conformidade na atribuição desse grau (MEUTEN, 2002).
Conforme esperado, os tumores de grau II de Patnaik se dividiram em
processos de malignidade de baixa e de alta intensidade, tornando evidente sua
heterogeneidade biológica. Esses dados corroboram com os achados já citados
na literatura, por BOSTOCK et al. (1989), SEGUIN et al. (2001) e BALSIMELLI,
(2012), devido aos amplos parâmetros que reúnem o referido grau no modelo de
PATNAIK. A taxa de celularidade é moderada, as células são ligeiramente
pleomórficas e o aspecto do citoplasma não diferencia muito dos tumores grau I,
pois também são distintos. Células binucleadas são observadas, assim como
áreas de necrose e algumas raras figuras de mitose. Essa heterogeneidade na
população celular, atribuída ao grau II, pode justificar a discrepância na
determinação da graduação histopatológica do mastocitoma, entre os patologistas
veterinários, gerando falha no diagnóstico e na previsão do comportamento
biológico da neoplasia.
Os tumores classificadas em grau III, nesse estudo, apresentaram em
sua maioria características de alta intensidade. Porém, uma amostra (11,11%) foi
reclassificada em baixa intensidade de acordo com os critérios de Kiupel, pois
apesar do aspecto infiltrativo, foram observadas poucas células multinucleadas e
não havia figuras de mitose. Esse resultado contraria os achados de BALSIMELLI
(2012) e SCHLIEBEN (2012), onde todos os tumores de grau III foram
reclassificados em alta intensidade.
Quanto à categorização histopatológica dos mastocitomas, em dois
níveis, os resultados mostraram ser mais consistentes do que o atual sistema de
classificação, de Patnaik, por promover uma melhor distinção, entre as alterações
celulares, malignas e de baixa intensidade. Notou-se também uma tendência, dos
patologistas, em classificar com maior frequência o grau II, atribuindo 50% das
amostras, do estudo, a esse grau intermediário, de pouco valor prognóstico para o
clínico. Além disso, a partir da reclassificação, nesse estudo, foi constatada a
subjetividade dos tumores classificados em grau II pelo sistema Patnaik,
concordando com RAMOS-VARA et al., (2011), que afirmam ser o novo modelo
de graduação histopatológica proposta por KIUPEL mais eficiente nesses casos,
27
devido ao fato de os critérios para julgamento serem do tipo quantitativo,
permitindo a redução da subjetividade.
A classificação dos mastocitomas, somente em baixa e alta
intensidade, pode promover maior consistência no estadiamento tumoral e um
melhor valor prognóstico, quando comparado ao atual sistema de graduação, em
três níveis. No entanto, uma diminuição no número de categorias, traria uma
facilidade na classificação, mas não na acurácia do prognóstico. Por ser um
método de classificação recente, seu valor clínico ainda deverá ser bastante
avaliado e discutido, cabendo estudos prospectivos no sentido de avaliar sua real
relevância.
CONCLUSÕES
Diante da reclassificação histopatológica descritiva, concluiu-se que
a proposta de Kiupel de agrupar os mastocitomas em duas classes é mais
objetiva que a de Patnaik, diminuindo a variação interobservador na determinação
do estádio da neoplasia, gerando uma maior padronização no diagnóstico.
Constatou-se também a subjetividade dos tumores classificados em
grau II, pelo sistema Patnaik, sendo o modelo proposto por Kiupel mais eficiente
nesses casos.
REFERÊNCIAS 1. BALSIMELLI, B. Relação entre as graduações histológicas de Patnaik e de
Kiupel e o padrão de expressão de c-KIT em mastocitomas cutâneos caninos: um estudo histológico e imuno-histoquímico. XV Congresso Metodista de Iniciação e Produção Científica - XIV Seminário de Extensão - IX Seminário PIBIC/UMESP, 2013.
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28
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29
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19. THAMM, D. H.; VAIL, D. M. Mast cell tumors. In: WITHROW, S. J.MACEWEN, E. G. Withrow & MackEwen's Small animal clinical oncology.
St. Louis: Saunders Elsevier, 2007. p.402-424.
20. WARLAND, J. D., J. Breed predispositions in canine mast cell tumour: A single centre experience in the United Kingdom. Veterinary Journal, London,
v.197, n.2, p.496-498, 2013.
30
CAPÍTULO 3 – DETERMINAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE AGNOR’S E
EXPRESSÃO DE C-KIT AUMENTAM A EFICIÊNCIA DA CLASSIFICAÇÃO E
PROGNÓSTICO DO MASTOCITOMA CANINO
RESUMO
Fatores como estadiamento clínico da neoplasia, avaliação histoquímica e expressão de marcadores devem ser considerados para a determinação do prognóstico do mastocitoma canino. Recentemente, Kiupel e colaboradores propuseram um novo sistema de classificação histológica, agrupando os tumores em duas classes, baixa intensidade ou alta intensidade. O objetivo deste trabalho foi correlacionar dois indicadores de prognóstico tumoral, a contagem das AgNOR’s e a expressão do marcador de proliferação celular c-KIT, com a graduação histopatológica para o mastocitoma proposta por Kiupel. O presente estudo foi realizado em 20 amostras de mastocitoma canino, graduados histologicamente segundo o novo critério proposto por Kiupel, pertencentes aos arquivos do Laboratório de Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. O índice proliferativo, determinado pelo método de AgNOR’s, foi superior nas variáveis estudadas nos mastocitomas de alta intensidade, enquanto a expressão de c-KIT em geral correspondeu à intensidade da graduação histopatológica. Os resultados demonstraram que o novo sistema de classificação histopatológica de Kiupel é mais eficiente para o diagnóstico histológico e prognóstico do mastocitoma quando aliado ao estudo histoquímico e imunoistoquímico. Palavras-chave:, cão, classificação histológica, contagem de nucléolos, imunoistoquímica, neoplasia
CHAPTER 3 - DETERMINATION OF THE FREQUENCY OF AGNOR'S AND
EXPRESSION OF C-KIT INCREASE THE EFFICIENCY OF CLASSIFICATION
AND PROGNOSIS OF CANINE MASTOCYTOMA
ABSTRACT
Factors such as clinical staging of the tumor, markers expression and histochemical evaluation should be considered to determine the prognosis of canine mast cell tumors. Recently, Kiupel and collaborators proposed a new histological classification system, grouping tumors into two classes, low intensity or high intensity. The aim of this study was to correlate two indicators of prognosis tumor, the count of AgNOR's and the expression of cell proliferation marker c-KIT, with histopathological grading for mastocytoma proposed by Kiupel. This study was conducted on 20 samples of canine mast cell tumor, graded according to the Kiupel criteria, from the files of the Laboratory of Animal Pathology, School of Veterinary Medicine and Animal Science of the Federal University of Goiás. The proliferative index, determined by AgNOR's method, was higher in the variables in the mast cell high intensity, while the expression of c-KIT in general corresponded
31
to the intensity of histopathological grading. The results showed that the Kiupel, classification system is more efficient for the histological diagnosis and prognosis of mast cell tumor when coupled with immunohistochemical and histochemical tests. Keywords: counting nucleoli, dog, histologic classification, immunohistochemistry, neoplasia
INTRODUÇÃO
Mastocitoma é a proliferação neoplásica dos mastócitos. A exata
etiologia ainda é desconhecida, mas é provavelmente multifatorial. Em ocasiões
raras, essas neoplasias estão associadas às lesões inflamatórias crônicas e à
exposição contínua da pele a substâncias irritantes. As alterações genéticas são
cruciais para o desenvolvimento de células neoplásicas. Modificações no gene
supressor tumoral p-53 e nas vias que regulam o ciclo celular foram relatadas
como possíveis causas para o desenvolvimento dos mastocitomas. Descreveu-se
também a existência de mutações no ponto do gene c-KIT que codifica o domínio
justamembrana do receptor tirosina quinase em mastócitos neoplásicos,
justificando o crescimento descontrolado dos tumores (ZEMKE et al., 2002;
THAMM & VAIL, 2007; BLACKWOOD et al., 2012).
A graduação histológica é necessária para o estabelecimento de uma
conduta terapêutica apropriada para cada caso. A utilização de diferentes
sistemas de classificação para o mastocitoma canino é contestada desde 1989,
com a alegação de que um mesmo mastocitoma poderia ser classificado com
grau diferente por patologistas distintos. Em 2011, KIUPEL e colaboradores
propuseram um novo sistema de classificação histológica, com o intuito de
melhorar a concordância entre patologistas. O sistema Kiupel divide os tumores
em duas classes, baixa intensidade e alta intensidade, de acordo com a
frequência de alterações citológicas das células tumorais como núcleos múltiplos
e bizarros, figuras de mitose e cariomegalia. Considerando-se alta intensidade
quando da presença de pelo menos um dos seguintes critérios em dez campos
analisados: sete figuras de mitose, três células multinucleadas e três núcleos
atípicos (KIUPEL et al., 2011).
32
No entanto, outros fatores devem ser considerados para a
determinação do prognóstico do mastocitoma. A Organização Mundial de Saúde
(OMS) preconiza quatro estádios clínicos para determinar a extensão desta
neoplasia no organismo. Classifica-se como estádio I quando o tumor apresenta-
se confinado à derme, sem envolvimento dos linfonodos regionais. Como estádio
II quando o tumor está confinado à derme, com envolvimento dos linfonodos
regionais. Já como estádio III, quando há múltiplos tumores na derme ou apenas
uma grande neoplasia infiltrativa, com ou sem envolvimento dos linfonodos
regionais. E como estádio IV quando há metástase, recidiva ou enfermidade
sistêmica concomitante (DIAS, 2007).
Alguns pesquisadores tem proposto utilizar de novas técnicas para
avaliar o prognóstico dos pacientes com mastocitoma. Dentre essas técnicas,
destaca-se o método da região organizadora nucleolar argirofílica (AgNOR -
argirophilic nucleolar organizer region). As proteínas AGNORs são definidas como
sítios onde estão localizados genes rRNA durante a interfase e durante a mitose.
As AGNORs são alças de DNA que ocorrem no nucléolo das células e possuem
genes RNA ribossomais. Esses genes RNA ribossomais possuem papel
importante durante a síntese protéica, crescimento e diferenciação celular e
também na transformação maligna. Um aumento no número de AgNOR seria
resultado de proliferação celular com aumento na transcrição e aumento do
conteúdo celular de DNA, o que ocorre em células que se proliferam mais
ativamente (PLOTON et al., 1986; SERAKIDES et al., 1999).
A técnica de AgNOR é menos subjetiva do que a avaliação
histopatológica baseada nos graus de diferenciação. Ela permite visualizar o
nucléolo, estudar a variação do seu tamanho e o número de pontos corados pela
prata em tecidos. Além disso, é possível medir o grau de proliferação celular
tendo sido utilizada, nas últimas décadas, como um marcador tumoral eficiente
em pacientes humanos. O fato é que o número de AgNORs por núcleo
correlaciona-se com o grau histológico, sendo pior o prognóstico, quanto maior o
número de pontos argirofílicos intranucleares visualizados. A mensuração, da
atividade celular proliferativa, pode acrescentar informações importantes para a
formulação de um prognóstico mais confiável em doenças neoplásicas.
(GOLDSCHMIDT & HENDRICK, 2002; RECH et al., 2004).
33
A utilização da técnica de AgNOR em mastocitomas caninos foi
descrita pela primeira vez em 1989 por Bostock e colaboradores. Estudos da
técnica em neoplasias humanas, mostram que o número de AgNORs por núcleo,
correlaciona-se com o grau histológico, sendo pior o prognóstico, quanto maior o
número de pontos argirofílicos intranucleares visualizados. Por meio da técnica de
AgNOR é possível visualizar o nucléolo e o número de pontos corados pela prata
em tecidos. À microscopia, as regiões organizadoras nucleolares argirofílicas,
marcam-se como pontos marrons escuros a castanhos. AgNORs em células
normais aparecem de tamanho regular e forma redonda, mas em tecidos
malignos, surgem menos uniformes em tamanho, assumindo formas diferentes
(PLOTON et al., 1986. BOSTOCK et al., 1989; TOMITA et al., 1993; DIAS, 2007;
THIELE et al., 2013).
A imunohistoquímica é um método valioso de avaliação tumoral. O
produto do oncogene c-KIT pode ser usado como um marcador para o
diagnóstico e prognóstico do mastocitoma. A proteína KIT tem sua expressão
detectada em células tronco hematopoiéticas, sendo a alteração da sequência de
nucleotídeos do gene c-KIT um dos mecanismos propostos para a proliferação de
mastócitos em cães. Enquanto a exata etiologia do mastocitoma permanece
desconhecida, sua patogênese relacionada à expressão do c-KIT e sua detecção
pela imunohistoquímica está bem estabelecidas. Todos os mastocitomas caninos
expressam c-KIT, ainda que a intensidade de reação seja diferente. Os tumores
de maior grau de malignidade apresentam expressão mais elevada (REGUERA et
al., 2000; PREZIOSI et al., 2004; WELLE et al., 2008).
Nesta perspectiva, o objetivo deste trabalho foi verificar o modelo de
graduação do mastocitoma canino proposto por KIUPEL etal (2011),
estabelecendo um comparativo do comportamento biológico, por meio do método
histoquímico de AgNOR e da expressão imunoistoquímica de c-KIT.
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto foi desenvolvido na Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)
da Universidade Federal de Goiás (UFG). As análises histológicas e
histoquímicas foram realizadas no Laboratório de Histopatologia e as de
34
imunoistoquímica, no laboratório de Imunopatologia do Setor de Patologia Animal
da Escola de Veterinária e Zooctenia (EVZ) da Universidade Federal de Goiás
(UFG).
O estudo foi realizado em 20 amostras de mastocitoma canino,
graduados segundo a classificação de KIUPEL, sendo 10 casos de baixa
intensidade e 10 casos de alta intensidade. As amostras pertencem aos arquivos
do Laboratório de Patologia Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Para a realização da técnica de coloração pela prata (AgNOR’s),
fragmentos incluídos em parafina, com espessura de 5µm, foram seccionados em
micrótomo semi-automático e aderidos em lâminas histológicas. As lâminas
obtidas foram submetidas à hidratação progressiva por imersão em etanol 70%
durante 15 minutos, seguido por imersão em água deionizada por 10 minutos.
Para a solubilização das proteínas citoplasmáticas e melhoria da qualidade da
coloração, as lâminas foram imersas em uma solução de triton X-100 a 0,5% em
PBS, durante 15 minutos em temperatura ambiente e após, lavadas durante 10
minutos em água corrente. Este procedimento foi acrescentado ao protocolo de
coloração como uma medida para facilitar a análise morfométrica, uma vez que a
solubilização de algumas proteínas citoplasmáticas produz um fundo mais claro e
com maior contraste e definição das proteínas AgNors, além de tornar os núcleos
das células mais limpos e permeáveis à prata (VIDAL & MELLO, 1995).
As lâminas foram coradas pelo método da prata coloidal descrito por
(PLOTON et al., 1986). Esta técnica consiste da mistura de duas partes de uma
solução aquosa de prata a 50% com uma parte de uma solução aquosa de
gelatina a 2% em água deionizada com ácido fórmico a 1%. Para a diminuição
dos depósitos inespecíficos de prata sobre o material, foi realizada a coloração
com lâminas invertidas. Um mililitro da solução de prata coloidal foi depositado
sobre uma bandeja de coloração de polipropileno e as lâminas, depositadas sobre
o corante posteriormente. A bandeja foi mantida em estufa a 37◦C por 12 a 15
minutos. Após serem retiradas da estufa, as lâminas foram lavadas rapidamente
em água corrente para tirar o excesso da prata e colocadas em cubas com álcool
etílico absoluto por 5 minutos. Em seguida, o material foi lavado em água corrente
por 5 minutos e imerso no corante metil green por mais 5 minutos. Em seguida,
35
dois banhos de dois minutos cada em álcool isopropílico, novamente mergulhados
em álcool etílico absoluto por 40 segundos, diafanizadas em xilol para montagem
com lamínula e resina sintética.
Para determinar a freqüência de AgNOR, os nucléolos evidenciados no
interior dos núcleos, foram contados através do método de contagem direta à
microscopia óptica. Procedeu-se a contagem dos grânulos em 100 mastócitos
neoplásicos por lâmina, dividindo o valor encontrado, em cada caso, por 100.
Para a análise estatística foi utilizado o teste não paramétrico x². Para cada grupo,
baixa e alta intensidade, foi calculado a média para representar a tendência
central, o intervalo de confiança de 95% pela regressão logística e o limite do
intervalo de confiança.
A técnica da imunohistoquímica teve início quando fragmentos
incluídos em parafina, com espessura de 5µm, foram seccionados em micrótomo
automático, aderidos em lâminas impregnadas por solução de organosilano a 3%
(aminopropyl-triethoxysilane, Sigma – USA) em acetona. Em seguida, houve a
desparafinização em estufa à 60ºC, seguindo a fase de hidratação. Logo após,
realizou-se o bloqueio da atividade da peroxidase endógena por 15 minutos,
incubando as lâminas com peróxido de hidrogênio diluído em solução de PBS
(phosphate buffered saline), pH 7,2. A recuperação antigênica ocorreu em
solução de citrato, pH 6,0, em banho-maria (solução pré-aquecida a 96ºC), por 15
minutos. O bloqueio da marcação inespecífica foi feito com 3% de soro albumina
bovina (BSA) por uma hora, em câmara úmida e temperatura ambiente, para
prevenir ligações não específicas.
O anticorpo primário c-KIT (polyclonal/coelho, SC168, Santa Cruz
Biotechnology, USA) foi diluído em BSA 1,5% (1:2000), instilado nos fragmentos e
o material incubado overnight em câmara úmida, sob refrigeração a 4ºC. Os
controles negativos foram realizados omitindo o anticorpo primário em um
fragmento de cada grau.
As secções foram lavadas em PBS e incubadas, em seguida, utilizando
o KIT LSAB (DAKO Ref: K0690 - USA), em que o anticorpo secundário
permaneceu por 30 minutos e o complexo estreptoavidina-biotina-peroxidase por
mais 30 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas em PBS.
A reação foi revelada com a adição do cromógeno diaminobenzidina-peroxidase
36
(Liquid DAB Substrate Chromogen System, DAKO Ref: K3468 - USA) por três
minutos. As lâminas foram montadas com meio a base de tolueno (Entellan,
Merck, Alemanha) e lamínulas histológicas. Procedeu-se a análise em
microscópio de luz comum.
As lâminas marcadas com o anticorpo anti c-KIT foram analisadas pelo
software processador de imagem Image J (National Institute of Health,
Washington DC, EUA). Foram selecionadas três áreas de concentração de
células neoplásicas por lâmina, como regiões de interesse para avaliação pelo
processador de imagens. O programa forneceu o valor das densidades ópticas,
nas áreas selecionadas, expresso na unidade pixels/polegada. Os resultados
foram transferidos para uma planilha eletrônica. Para cada grupo, de baixa e alta
intensidade, foi calculado a média para representar a tendência central, o
intervalo de confiança de 95% pela regressão logística e o limite do intervalo de
confiança.
RESULTADOS
As regiões organizadoras nucleolares argirofílicas coraram-se, como
pequenos pontos escuros dispersos pelo núcleo e foram mais freqüentemente
observadas nos mastocitomas de alto grau (Figura 1).
FIGURA 1 – Mastocitoma cutâneo canino. Os pontos pretos (setas)
representam as regiões organizadoras nucleolares argirofílicas
(AgNOR). A) Mastocitoma de baixa intensidade (AgNOR =
A B
37
1,82), 40x. B) Mastocitoma de alta intensidade (AgNOR=
2,06), 400x.
A tabela 1 apresenta os resultados encontrados a partir da contagem
de AgNOR de 100 células tumorais. A média de nucléolos nos tumores de alta
intensidade foi de 2,06 e nos de baixa intensidade foi de 1,82. Apenas uma
amostra (10%) estava abaixo do limite do intervalo de confiança calculado para o
grupo de alta intensidade. Dentre os processos de baixa intensidade, nenhuma
amostra esteve fora do limite do intervalo de confiança.
TABELA 1 – Variáveis calculadas para AgNOR/núcleo, em mastocitomas
cutâneos caninos, para os dois grupos histopatológicos (p<0,05)
Intensidade N Média Mínimo - Máximo IC Limites do IC
Baixa 10 1,82 1,44 – 2,30 0,05 1,37 – 2,35
Alta 10 2,06 1,14 – 3,00 0,64 1,42 – 2,70
A partir da técnica de imunoistoquímica, os fragmentos tratados com o
anticorpo anti c-KIT apresentaram marcações citoplasmáticas em todos os
mastócitos neoplásicos (Figura 2).
38
FIGURA 2 - Fotomicrografias de fragmentos de mastocitoma canino marcados
com anticorpo anti c-KIT. A e B apresentam marcação
citoplasmática compatível com padrão de baixa intensidade. C e D
evidenciam a positividade citoplasmática difusa acentuada,
compatível com a categoria de alta intensidade. 400X. DAB,
contra-coloração com hematoxilina.
A análise da expressão do anticorpo, nas categorias de baixa e alta
intensidade, encontra-se na Tabela 2.
A B
C D
C
39
TABELA 2 – Variáveis calculadas para imunomarcação de c-KIT, em
mastocitomas cutâneos caninos, para os grupos de alta e baixa
intensidade. Valores de densidade óptica expressos em
pixels/polegada.
Intensidade N Média Mínimo - Máximo IC Limites do IC
Alta 10 78682,44 29777,67 – 173854,00 26290,92 52391,52 – 104973,40
Baixa 10 71490,50 18379,00 – 195730,00 41560,07 29930,43 – 113050,60
Os resultados demonstraram variações discrepantes, entre as
amostras de alta intensidade, analisadas. A figura 3 apresenta a dispersão desses
valores encontrados.
FIGURA 3 – Variação dos resultados das densidades ópticas das
regiões de alta intensidade, marcadas com o anticorpo
anti c-KIT. Valores expressos em pixels/polegada.
Dentre os valores de imunomarcação, de c-KIT, encontrados no grupo
de baixa intensidade, duas amostras apresentaram-se acima do limite máximo do
40
intervalo de confiança (113050,60). Na Figura 4 é possível notar a discrepância
dessas amostras, frente às demais.
FIGURA 4 – Variação dos resultados das densidades ópticas das
regiões de baixa intensidade analisadas marcadas
com o anticorpo anti c-KIT. Notar a discrepância dos
valores das amostras 3 e 10. Valores expressos em
pixels/polegada.
Relacionando-se a graduação histopatológica de Kiupel com o padrão
de imunoexpressão, de c-KIT, evidenciou-se que a média de marcação, nos
processos de alta intensidade (78682,44), foi maior que a média, nos processos
de baixa intensidade (71490,50). O gráfico, na figura 5, apresenta a distribuição
dos valores, de c-KIT, encontrados para os grupos de alta e baixa intensidade.
41
FIGURA 5 – Gráfico evidenciando a densidade ótica da marcação por c-
KIT distribuição imunohistoquímica nas amostras de
mastocitomas cutâneos de cães, classificados de acordo com
os parâmetros de Kiupel. Valores expressos em
pixels/polegada.
DISCUSSÃO
A associação de métodos citológicos, histopatológicos e
imunoistoquímicos fornecem informações adicionais, para o estabelecimento de
diagnóstico e prognóstico do mastocitoma cutâneo canino.
Neste estudo, o resultado da média geral nas contagens de pontos de
AgNORs por núcleo foi de 1,96, apresentando uma amplitude de 1,56 a 2,37.
RECH (2003), em estudo semelhante, registrou uma média geral de 1,9, com
amplitude variando entre 1,2 a 4,3. DIAS (2007) encontrou uma média geral de
2,81 e amplitude de 1,33 a 3,6. THOMPSON (2011) mostrou em seu estudo,
contagens de AgNORs entre 1,2 a 4,1 por célula, com uma média de 2,2 por
núcleo. Além da técnica de impregnação de proteínas aliadas à atividade
proliferativa ser considerada eficaz, rápida e de custo acessível, esses
42
parâmetros são de grande valia considerando a premência de resultados e
terapêutica exigidos pelos proprietários dos animais de estimação.
Nesta pesquisa, intervalos de confiança de 95%, foram estimados pela
regressão logística para cada grau, com a intenção de criar um número de
estimativas prováveis dentro de um parâmetro estatístico. Desta forma, foi
estabelecido um limite em torno da estimativa obtida. Para o conjunto de
mastocitomas de baixa intensidade, a média de contagem de AgNORS por
células foi de 1,864, com margens de intervalo de confiança variando entre 1,37 e
2,35. Desta forma, nenhuma amostra situou-se fora do limite permitido, o que
corrobora com a literatura quando afirma que a contagem de AgNORs por núcleo
correlaciona-se com o grau histológico, sendo pior o prognóstico quanto maior o
número de pontos argirofílicos intranucleares visualizados (TOMITA et al., 1993;
GAMBA et al., 2008).
Os mastocitomas classificados em alta intensidade apresentaram
contagem maior de AgNORs, quando comparada ao grupo de baixa intensidade,
provavelmente devido à sua alta taxa de multiplicação celular. A média foi de 2,06
pontos argirofílicos por núcleo e seu limite de confiança pode variar de 1,42 e
2,70. Nesse grupo, apenas uma amostra (10%) apresentou-se abaixo do limite
estabelecido. Esse fato pode ter ocorrido devido a técnica de AgNOR ser sensível
a vários fatores, tais como fixação dos tecidos, espessura dos cortes, tempo de
incubação da prata, preparação das soluções empregadas e precipitação da
prata, portanto para que o valor prognóstico seja válido, faz-se necessário
estabelecer a relação da técnica do AgNOR com os estudos clínicos (ZACZEK et
al., 1994).
No presente estudo, também foi investigada a expressão da proteína c-
KIT, por meio da associação da técnica de imunohistoquímica com análise pelo
software Image J e cálculos estatísticos. A média de expressão encontrada no
grupo de alta intensidade foi maior que a do grupo de baixa intensidade. O c-KIT
é um imunomarcador, de proliferação celular, e uma relação positiva é esperada
entre a presença de mutações de c-KIT e maior grau do mastocitoma canino
(MISDORP, 2004). Em estudo realizado por ZEMKE et al. (2002), foi relatada a
relação entre a graduação histopatológica e a intensidade de marcação maior em
graus menos diferenciados da neoplasia, mostrando que esses devem apresentar
43
alterações genéticas mais significativas para o aumento da produção e
consequentemente expressão do oncogene c-KIT. Tal observação corrobora com
os valores de marcação intensa, de c-KIT, visualizada nos mastocitomas de alta
intensidade, do presente estudo.
A média dos valores, de imunomarcação, no grupo de alta intensidade
foi maior que no grupo de baixa intensidade. Esse resultado pode ser comparado
com a verificação de THOMPSON (2012) que encontrou associação entre
mutação em c-KIT e elevado grau de intensidade em mastocitomas cutâneos
caninos. É bem estabelecido que mutações, em c-KIT estão significativamente
associadas a um maior grau de malignidade neoplásica e também com maior
risco de recorrência e morte do paciente.
Por outro lado, no grupo de baixa intensidade, duas amostras (20%)
ultrapassaram o limite do intervalo de confiança, apresentando valores de
imunomarcação individual muito acima do esperado. É possível que tais amostras
sejam provenientes de cães que apresentavam lesões múltiplas, mesmo sendo
bem diferenciadas histologicamente. Esses achados assemelham-se aos de
PINCZOWSKI (2008), onde os mastocitomas de menor grau apresentaram os
maiores percentuais de intensidade de marcação.
Ainda em relação à imunomarcação de c-KIT, nas amostras dos dois
grupos de mastocitoma cutâneo canino houve casos de valores muito
discrepantes, além de marcação citoplasmática difusa. Para o intervalo de
confiança estabelecido para as amostras de alta intensidade, duas (20%)
situaram-se abaixo do limite. No estudo de GIANTIN et al (2012), não foram
encontradas diferenças, estatisticamente significativas, na expressão de c-KIT,
entre os grupos de mastocitomas no sistema de baixa e de alta intensidade de
Kiupel, que seria devido à elevada variabilidade na expressão de RNAm do c-KIT
nos grupos de maior grau de malignidade, ou ainda por ter sido utilizada uma
amostragem pequena. Assim, uma superexpressão de c-KIT pode desempenhar
um papel de proliferação e transformação maligna, mas aparentemente não indica
o comportamento biológico, apenas de utilidade prognóstica.
KIUPEL et. al. (2011) sugerem que o prognóstico para o mastocitoma
cutâneo canino não deve ser baseado apenas na graduação histopatológica, mas
sempre associado a métodos imunocelulares. De fato, os dados desta pesquisa
44
indicam que a classificação de Kiupel, isoladamente, não é um parâmetro
suficiente para o estabelecimento do prognóstico ou tratamento do mastocitoma,
pois este não pode ser considerado como uma neoplasia pouco maligna em
nenhum grau histológico, e seu comportamento biológico é sempre imprevisível.
Há, ainda, uma necessidade de associar a graduação histopatológica, a outros
métodos de diagnóstico, haja vista que essa associação determina ganho
prognóstico.
CONCLUSÕES
As médias AgNOR/núcleo dos tumores de alta intensidade são
significativamente mais elevadas em relação aos de baixa intensidade quando
avaliadas em grupo, demonstrando sua eficiência como indicador prognóstico
objetivo para os mastocitomas.
A magnitude da expressão de c-KIT corresponde à graduação
histológica, sendo a média mais acentuada no grupo de alta intensidade.ou seja,
onde apresenta mais células tumorais indiferenciadas.
As variações individuais dentro dos grupos indica que os critérios de
classificação histológica baseados exclusivamente na morfologia do tecido
tumoral não devem ser os únicos parâmetios de classificação e prognóstico do
mastocitoma canino.
REFERENCIAS
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47
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na medicina veterinária de pequenos animais, a oncologia tem
evoluído substancialmente, sendo as neoplasias de pele diagnosticadas com
grande freqüência por serem as alterações mais facilmente percebidas pelos
proprietários. No cão, o mastocitoma cutâneo é a neoplasia mais comum,
compreendendo até 21% dos tumores de pele. Sua exata etiologia ainda é
desconhecida.
Após a retirada cirúrgica da neoplasia, a avaliação histopatológica
ainda é o fator prognóstico mais consistente no diagnóstico e correlaciona-se com
a escolha do tratamento e a sobrevida do animal. A classificação mais utilizada é
o sistema de três graus, estabelecido por PATNAIK et al (1984), porém muitas
vezes essa graduação histológica é subjetiva e um mesmo tumor pode ser
classificado em diferentes graus por patologistas distintos.
O fato de o convívio, entre humanos e caninos, ter se tornando cada
vez mais intenso, faz os proprietários estarem cada vez mais atentos aos seus
animais, aumentando a procura pela assistência veterinária e a exigência de
maior acurácia tanto no diagnóstico quanto no tratamento das afecções.
O novo sistema de classificação histológica proposto por KIUPEL et al.
(2011) categoriza os mastocitomas caninos em baixa intensidade e alta
intensidade, de acordo com as características observadas. No presente estudo,
os resultados indicaram que a graduação, de Kiupel proporcionou maior
concordância entre os patologistas, principalmente por estabelecer
quantitativamente as características mínimas, para designar-se uma amostra
como de alta instensidade: sete figuras de mitose, três células multinucleadas e
três núcleos atípicos.
O prognóstico para o mastocitoma cutâneo canino, entretanto, não
deve ser baseado apenas na graduação histopatológica, mas sempre associado a
métodos, como sugerem KIUPEL et. al., (2011). Assim, o uso da técnica, das
proteínas argirofílicas (AgNORs), é efetivo por atuar como eficiente marcador de
proliferação celular, podendo essa ser usada para avaliar a malignidade do
mastocitoma. Como esperado, em geral, os mastocitomas classificados em alta
intensidade apresentaram uma contagem maior de AgNORs, devido ao fato de a
48
contagem por núcleo, correlacionar-se com o grau histológico, sendo pior o
prognóstico, quanto maior o número de pontos argirofílicos intranucleares
visualizados.
A técnica de imunohistoquímica, utilizando-se c-KIT, é bem
estabelecida como um marcador para diagnóstico e prognóstico do mastocitoma
cutâneo canino. No presente estudo, as amostras não se apresentaram
homogêneas, em nenhum grupo, e valores discrepantes foram encontrados,
porém relacionando-se a graduação, de Kiupel, com o padrão de imunoexpressão
de c-KIT, a média dos tumores, categorizados em maior intensidade, apresentou
expressão de c-KIT mais elevada, corroborando com os dados da literatura.
Dessa forma, foi observada uma relação entre o aumento dos valores
de imunomarcação celular por c-KIT, da expressão de AgNORs com o alto grau
histológico de malignidade, o que sugere um mecanismo patológico comum entre
estes fatores no mastocitoma canino. Isso indica que para uma acurácia no
prognóstico, deve-se associar a graduação histopatológica a outros métodos de
diagnóstico.
