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CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA EM SAÚDE E MEDICINA
INVESTIGATIVA
TESE DE DOUTORADO
ESTUDO DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS ASSOCIADAS À
LEUCEMIA/LINFOMA DE CÉLULAS T DO ADULTO NO
ESTADO DA BAHIA
MARCELO MAGALHÃES SILVA
Salvador-Brasil
Junho de 2012
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ – FIOCRUZ
CENTRO DE PESQUISA GONÇALO MONIZ - CPQGM
FIOCRUZ
Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
ESTUDO DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS ASSOCIADAS À
LEUCEMIA/LINFOMA DE CÉLULAS T DO ADULTO NO
ESTADO DA BAHIA
MARCELO MAGALHÃES SILVA
Orientadora: Maria Lourdes Farré Vallve
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Biotecnologia em Saúde e
Medicina Investigativa para a obtenção
do grau de Doutor.
Área de concentração: Biologia Celular
Salvador-Brasil
Junho de 2012
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ – FIOCRUZ
CENTRO DE PESQUISA GONÇALO MONIZ - CPQGM
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca do
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / FIOCRUZ - Salvador - Bahia.
Silva, Marcelo Magalhães
S586e Estudo de alterações genéticas associadas à leucemia/linfoma de células T do
adulto no estado da Bahia . [manuscrito] / Marcelo Magalhães Silva. - 2012.
118 f.; 30 cm
Datilografado (fotocópia).
Tese ( Doutorado) – Universidade Federal da Bahia - Fundação Oswaldo Cruz,
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e
Medicina Investigativa, 2012. Orientadora: Drª. Maria Lourdes Farré Vallve, Laboratório de Patologia
Experimental - LAPEX.
1. ATL 2. HTLV-1. 3. TP53. 4. INK4 5. Alterações Microssatélites I.Título.
CDU 616.98
Aos meus pais e à minha querida Jacke,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus pela vida, força, cuidado e opções de escolha.
Aos meus pais pelos ensinamentos e empenho para me levar onde eles não
puderam chegar.
A minha esposa Jacke pelo apoio, paciência e carinho incondicional.
À minha orientadora, Drª Lourdes Farré, pela confiança, conselhos e oportunidades
que me tornaram um profissional mais dedicado.
À Fundação Oswaldo Cruz, ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz e ao Programa
de Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa pela
estrutura, apoio financeiro e formação intelectual.
Aos colegas e colaboradores que passaram ou integram atualmente o grupo de
pesquisa da FIOCRUZ: Aline Clara, Tatiana Cunha, Rodrigo Oliveira, Everton
Batista, Juliana Argolo, Isabela Nunez, Marcela Costa, Vanessa Leite, Leandro
Cedraz, Tiago Landim e Pedro Oliveira.
À equipe do Hospital Universitário Professor Edgar Santos em especial à Drª Achiléa
Bittencourt pelo profissionalismo e dedicação à pesquisa científica.
Aos pacientes participantes desse estudo por acreditarem e contribuirem para
progresso científico da ATL.
Ao chefe do Laboratório de Patologia Experimental, Drº Zilton Andrade e a todos os
amigos e colegas de laboratório.
Às Plataformas de Seqüenciamento e de Citometria de Fluxo do CPqGM em
especial a Silvana Paz e Liliane Cunha pela disposição e auxílio.
Às professoras e amigas Fernanda Gaiotto e Idjane Santana, pelos ensinamentos e
incentivos na busca pelo conhecimento.
A todos que contribuíram de maneira de direta ou indireta para a realização desse
trabalho, muito OBRIGADO!
Certeza
De tudo, ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
Fernando Pessoa
Caçador de mim
Por tanto amor
Por tanta emoção
A vida me fez assim
Doce ou atroz
Manso ou feroz
Eu caçador de mim
Preso a canções
Entregue a paixões
Que nunca tiveram fim
Vou me encontrar
Longe do meu lugar
Eu, caçador de mim
Nada a temer senão o correr da luta
Nada a fazer senão esquecer o medo
Abrir o peito a força, numa procura
Fugir às armadilhas da mata escura
Longe se vai
Sonhando demais
Mas onde se chega assim?
Vou descobrir
O que me faz sentir
Eu, caçador de mim
Sergio Magrão e Luis Calos Sá
RESUMO
A leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) é uma severa doença
linfoproliferativa de células T CD4+ associada ao HTLV-1. Por apresentar diferentes
manifestações clínicas, essa neoplasia pode ser classificada em cinco formas:
aguda, crônica, smoldering, linfomatosa e tumoral primária de pele. Embora alguns
trabalhos venham estudando o processo oncogênico mediado pelo HTLV-1, diversos
fatores responsáveis pelo desenvolvimento da ATL ainda permanecem
desconhecidos. Este estudo teve como objetivo a investigação de alterações
genéticas em células ATL (mutações pontuais em genes supressores de tumor e
alterações microssatélites) e sua associação com a evolução clínica da doença e
sobrevida dos pacientes. A presença de mutações pontuais nos supressores de
tumor TP53, p15INK4B e p16INK4A foram avaliadas em 31 pacientes com diferentes
formas da ATL (16 agudos, dez crônicos e cinco smoldering) por análise de
seqüenciamento de DNA. Cinco pacientes (16%) apresentaram mutações pontuais
no gene TP53, sendo que quatro dentre os mesmos foram classificados com a forma
aguda. A presença de mutações nos genes avaliados foi associada com pior
prognóstico em pacientes com a forma aguda. Em um dos pacientes incluídos neste
trabalho (forma aguda) foi verificada a presença de alteração no éxon 2 do gene
p16INK4A. Mutações pontuais não foram detectadas no gene p15INK4B em nenhum dos
pacientes incluídos. Os marcadores D10S190, D10S191, D11S1391 e D18S21
foram utilizados para a análise de alterações microssatélites por metodologia semi-
automatizada. Dentre os 25 pacientes ATL avaliados (seis agudos, oito crônicos, dez
smoldering e um linfomatoso), sete apresentaram alterações microssatélites. Três
desses pacientes apresentaram instabilidade (MSI), três pacientes apresentaram
perda de heterozigosidade (LOH) e em um paciente foi verificado ambas as
alterações. Na Bahia, mutações pontuais em TP53 foram detectadas principalmente
na forma aguda da ATL e parece estar associada com pior prognóstico. Além disso,
de acordo com nossos conhecimentos, este é o primeiro estudo a descrever tanto
MSI com LOH em pacientes portando formas crônica e smoldering da ATL.
Palavras-chave: ATL, HTLV-1, TP53, INK4, alterações microssatélites.
ABSTRACT
Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) is a severe CD4+ lymphoproliferative disease
associated to human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1). ATL has different
clinical manifestations and is classified in five clinical forms: acute, chronic,
smoldering, lymphoma and primary cutaneous tumoral. Although the mechanisms of
oncogenesis of the HTLV-1 have been investigated, the factors related to ATL
development are still unknown. The goal of this study was to investigate genetic
alterations in ATL cells (point mutations in tumor suppressor genes and microsatellite
alterations) and their association with the clinical evolution of the disease and
survival. The presence of point mutations in TP53, p15INK4B e p16INK4A were
evaluated in 31 ATL patients (16 acute, ten chronic and five smoldering) by direct
sequencing. Five of them (16%) had TP53 point mutations, four of them with the
acute form of ATL. The presence of point mutations in this gene was associated to
poor prognosis in acute patients. Only one case (acute form) has an alteration in the
exon 2 of the p16INK4A gene. No point mutations of the p15INK4B were found in the
patients included. The markers D10S190, D10S191, D11S1391 and D18S21 were
considered for the microsatellite analysis using a semiautomated technique. From
the twenty-five ATL cases included (six acute, eight chronic, ten smoldering and one
lymphoma), seven showed microsatellite alteration. Among them, three patients had
microsatellite instability (MSI), three had loss of heterozygosity and one patient
presented both alterations. In Bahia, point mutations in TP53 were detected mainly in
acute form of ATL and were associated to poor prognosis. The presence of MSI and
LOH in the smoldering and chronic forms of ATL were demonstrated for the first time
in this study.
Key works: ATL, HTLV-1, TP53, INK4, microsatellite alterations.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura genômica do HTLV-1.............................................................. 17
Figura 2. Distribuição mundial de infecção pelo HTLV-1....................................... 18
Figura 3. Western blot para HTLV......................................................................... 19
Figura 4. Curva de sobrevida de 70 pacientes apresentando diferentes formas
clínicas de ATL....................................................................................... 22
Figura 5. Padrões de expansão clonal em linfócitos infectados pelo HTLV-1....... 24
Figura 6. Capacidades adquiridas pelas células tumorais.................................... 26
Figura 7. Modelo dos efeitos de protoncogenes e genes supressores de tumor sobre
a proliferação celular............................................................................... 28
Figura 8. Regulação do ciclo celular...................................................................... 30
Figura 9. Atuação de p53 na modulação da proliferação celular e apoptose........ 31
Figura 10. Estrutura organizacional do gene TP53............................................... 32
Figura 11. Estrutura organizacional dos genes p15INK4B e p16INK4A...................... 34
Figura 12. Ilustração de genótipos microssatélites................................................ 38
Figura 13. Ilustração esquemática de DNA slippage............................................. 39
Figura 14. Exemplo representativo da expansão de nucleotídeos em um alelo
microssatélite gerando instabilidade..................................................... 39
Figura 15. Exemplo representativo de instabilidade microssatélite....................... 41
Figura 16. Ilustração do modelo two-hit para inativação de um gene supressor de
tumor (TGS).......................................................................................... 44
Figura 17. Exemplo representativo da análise de LOH......................................... 45
Figura 18. Exemplo representativo da análise de LOH mostrando: (A) caso não
informativo e (B) caso informativo........................................................ 45
Figura 19. Localização cromossômica das seqüências microssatélites D10S190,
D10S191, D11S1391 e D18S21........................................................... 61
Figura 20. Gráficos dot plot utilizados para separação de linfócitos CD4+ (P2) das
células CD4- (P3) em pacientes com forma smoldering da ATL
diagnósticados na Bahia....................................................................... 65
Figura 21. Curva de sobrevivência em pacientes com forma aguda da ATL de acordo
com a presença de mutação no gene TP53......................................... 68
Figura 22. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D10S190................ 73
Figura 23. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D10S191................ 74
Figura 24. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D11S1391.............. 75
Figura 25. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D11S1391.............. 76
Figura 26. Eletroferogramas utilizados para análise de perda de heterozigosidade
(LOH).................................................................................................... 78
Figura 27. Distribuição de alterações microssatélites nos locos D10S191, D10S191,
D11S1391 E DCC em pacientes ATL diagnosticados na Bahia.......... 81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Critérios para a classificação clínica da leucemia/linfoma de células T do
adulto...................................................................................................... 22
Tabela 2. Dados gerais de 38 pacientes ATL diagnosticados na Bahia............... 52
Tabela 3. Resumo das características clínicas de 38 pacientes ATL avaliados quanto
a presença de mutações pontuais e alterações microssatélite.............. 54
Tabela 4. Número médio de linfócitos de acordo com a forma clínica de ATL..... 55
Tabela 5. Primers utilizados para a amplificação dos genes TP53, p15INK4B e
p16INK4A................................................................................................... 60
Tabela 6. Primers utilizados para a amplificação dos microssatélites................... 62
Tabela 7. Resumo das mutações em TP53 observadas em pacientes ATL......... 67
Tabela 8. Freqüência de instabilidade microssatélite em pacientes ATL
diagnosticados na Bahia........................................................................ 71
Tabela 9. Freqüência de LOH e informativiade dos marcadores microssatélites em
pacientes ATL......................................................................................... 79
Tabela 10. Avaliação de LOH em pacientes ATL diagnosticados na Bahia.......... 80
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALL - Acute lymphocytic leukemia
AML - Acute myeloid leukemia
ATF3 - Activating transcription factor 3
ATM - Ataxia-telangiectasia mutated
AZT - Azidotimidina
CD - Cluster differentiation
CDK - Cyclin-dependent kinase
CKI - Cyclin-dependent kinase inhibitor
CLL - Chronic lymphocytic leukemia
CML - Chronic myelocytic leukemia
cM - Centimorgan
CREB - cAMP response element-binding
DCC - Deleted in colorectal cancer
DIH - Dermatite infecciosa associada ao HTLV-1
E2F - E2 promoter binding factor
ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay
FOXP3 - Forkhead transcription factor 3
HAM/TSP - HTLV-I associated myelopathy/tropical spastic paraparesis
HBZ - HTLV-I Basic leucine zipper factor
hMLH - Human Mut-L-Homologon
hMSH - Human Mut-S-Homologon
hPMS - Human postmeiotic segregation increased
IFN-α - Interferon-α
IL-2 - Interleukin-2
INK4 - Inhibitor of the cyclin-dependent kinase 4
iNOS - Inducible nitric oxide synthase
LOH - Loss of heterozigozity
LTR - Long terminal repeats
MDM2 - Murine doble minute 2
MDS - Myelodysplastic syndrome
MSI - Microsatellite instability
MSI-H - Microsatellite instability High
MSI-L - Microsatellite instability Low
MSS - Microsatellite stable
NF-kB - Factor nuclear kappa B
NHL - Non-Hodgkin's lymphoma
NSCLC - Non-small cell lung cancer
PBMC - Peripheral blood mononuclear cell
PCR - Polymerase chain reaction
PUVA - Psolareno-UV-A
SNC - Sistema nervoso central
SSCP - Single-strand conformation polymorphism
TCLE - Termo de consentimento livre e esclarecido
TGFβ - Transforming growth factor beta
TGI - Trato gastrointestinal
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 17
1.1 Vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) ............................... 17
1.1.1 Estrutura genômica............................................................................... 17
1.1.2 Epidemiologia .................................................................................... 18
1.1.3 Diagnóstico Laboratorial....................................................................... 19
1.2 Doenças associadas ao HTLV-1 ............................................................... 20
1.2.1 Dermatite infecciosa associada ao HTLV-1 (DIH) ............................... 20
1.2.2 Paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1
(HAM/TSP)............................................................................................ 20
1.2.3 Leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) ............................... 21
1.2.3.1 Mecanismo de patogênese do HTLV-1 na ATL...................... 24
1.3 Bases moleculares da carcinogênese humana ......................................... 25
1.3.1 Conceitos básicos: loco e alelo..................................................... 25
1.3.2 Natureza do câncer ............................................................................. 26
1.3.3 Protoncogenes e genes supressores de tumor.................................... 27
1.3.3.1 Efeito das ações dos protoncogenes e genes supressores de
tumor sobre a proliferação celular............................................ 28
1.3.4 Genes de reparo do DNA..................................................................... 29
1.3.5 O ciclo celular....................................................................................... 29
1.3.6 Sistema de controle do ciclo celular..................................................... 30
1.3.6.1 Atuação de proteínas supressoras de tumor no controle do ciclo
celular....................................................................................... 31
1.4 Inativação de genes supressores de tumor em neoplasias............................ 32
1.4.1 Gene TP53............................................................................................32
1.4.1.1 Inativação de TP53 na ATL................................................... 33
1.4.2 Genes p16INK4A e p15INK4B ................................................................... 34
1.4.2.1 Inativação de p15INK4B e p16INK4A na ATL............................. 36
1.5 Instabilidades genômica................................................................................ 37
1.5.1 Instabilidade microssatélite................................................................... 38
1.5.1.1 Classificação dos tumores em relação à presença de MSI..... 41
1.5.1.2 Efeitos da MSI sobre a expressão gênica em tumores .......... 42
1.5.1.3 Correlações clínico-patológicas dos tumores com MSI.......... 42
1.5.2 Perda de Heterozigozidade (LOH......................................................... 43
1.5.3 Alterações microssatélites na ATL.......................................................... 46
2 JUSTIFICATIVA................................................................................................ 47
3 OBJETIVOS...................................................................................................... 49
3.1 Objetivo Geral..................................................................................................49
3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................49
4 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 50
4.1 Obtenção das amostras................................................................................... 50
4.2 Características clínicas da população estudada............................................. 53
4.3 Marcação para separação celular (Sorting cell).............................................. 55
4.4 Extração de DNA de PBMC e tecido não tumoral........................................... 56
4.5 Análise de mutações no gene TP53................................................................ 57
4.5.1 Condições de amplificação.....................................................................57
4.5.2 Purificação dos produtos de PCR.......................................................... 57
4.5.3 Seqüenciamento.....................................................................................57
4.6 Análise de mutações pontuais em p15INK4B..................................................... 58
4.7 Análise de mutações pontuais em p16INK4A..................................................... 59
4.8 Avaliação de alterações microssatélites.......................................................... 60
5 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................. 63
6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS............................................................................. 63
7 RESULTADOS.................................................................................................. 64
7.1 Avaliação de mutações pontuais em pacientes ATL....................................... 64
7.1.1 Separação de células (Cell Sorting)..................................................... 64
7.1.2 Freqüência de mutações pontuais no gene TP53................................ 66
7.1.2.1 Relação entre mutações no gene TP53 e sobrevida dos pacientes
ATL........................................................................................... 68
7.1.3 Freqüência de mutações pontuais no gene p15INK4B............................ 69
7.1.4 Freqüência de mutações pontuais no gene p16INK4A............................ 69
7.1.4.1 Relação entre mutações no gene p16INK4A e dados clínicos... 69
7.1.5 Avaliação de mutações em amostras seqüenciais............................... 69
7.2 Análise de instabilidade microssatélite (MSI).................................................. 70
7.3 Análise de perda de heterozigosidade (LOH).................................................. 77
7.4 Freqüência de alterações microssatélite (MSI e LOH).................................... 81
8 DISCUSSÃO..................................................................................................... 83
8.1 Análise de mutações no gene TP53................................................................ 84
8.2 Análise de mutações no gene p15INK4B e p16INK4A........................................... 88
8.3 Avaliação de mutações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A em amostras
seqüenciais......................................................................................................90
8.4 Vantagens da análise de mutações por seqüenciamento direto..................... 91
8.5 Análise de instabilidades microssatélites (MSI)............................................... 92
8.6 Análise de perda de heterozigosidade (LOH)................................................. 95
8.7 Relação entre mutações em TP53, p15INK4B e p16INK4A e alterações
microssatélite.................................................................................................. 98
9 CONCLUSÕES................................................................................................. 99
10 CONTRIBUIÇÕES........................................................................................... 100
11 REFERÊNCIAS................................................................................................ 101
17
1. INTRODUÇÃO
1.1 Vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1)
Em função de suas características moleculares o vírus linfotrópico de células
T humanas tipo 1 (HTLV-1) está classificado dentro da família Retroviridae,
subfamília Orthoretrovirinae e gênero Deltaretrovirus. O HTLV-1 foi isolado e descrito
pela primeira vez em 1980 a partir de uma linhagem de células extraída de um
paciente com linfoma cutâneo de células T (Poiesz et al, 1980a; Poiesz et al, 1980b).
1.1.1 Estrutura genômica
O HTLV-1 possui um genoma com aproximadamente 9032pb e como os
demais retrovírus, possui os genes gag, pol e env flanqueados por seqüências
terminais repetitivas (long terminal repeats - LTR) (Figura 1). Entre a região env e 3’-
LTR do genoma do HTLV-1, existe uma seqüência de nucleotídeos denominada pX
que codifica as proteínas Tax, Rex, HBZ, p12, p13, p30 e p21 relacionadas com a
patogênese viral (Koralnik et al., 1992; Gaudray et al., 2002; Edwards et al., 2011).
Figura 1. Estrutura genômica do HTLV-1. Fonte: Edwards et al., (2011).
18
1.1.2 Epidemiologia
Estima-se que exista entre 10 a 20 milhões de pessoas infectadas pelo HTLV-
1 em todo o mundo (Edlich et al., 2000), sendo as principais áreas endêmicas
Japão, Caribe, África Equatorial, Oriente Médio e América do Sul (Levine e Blattner,
1987; Stuver et al., 1996; Pombo de Oliveira et al., 1990; Proietti et al. 2005) (Figura
2). No Brasil, um estudo realizado em bancos de sangue demonstrou maiores
prevalências de infecção pelo HTLV-1 e 2 em doadores dos estados do Maranhão
(10/1000), Bahia (9,4/1000), Pará (9,1/1000) e Pernambuco (7,5/1000) (Catalan-
Soares et al., 2005). Uma pesquisa feita em cinco capitais brasileiras mostrou que
Salvador é a cidade com a maior taxa de prevalência do HTLV-1 entre doadores de
sangue (Galvão-Castro et al., 1997). Na capital do Estado da Bahia, prevalência do
HTLV-1 na população geral é 1,76% (Dourado et al., 2003).
Figura 2. Distribuição mundial de infecção pelo HTLV-1. Em marrom escuro países com prevalência entre
1 e 5% e em laranja países com registros de prevalência menor que 1%. Fonte: Prioetti et al. (2005)
19
1.1.3 Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da infecção pelo HTLV é baseado na detecção de anticorpos
direcionados a antígenos virais. Os métodos sorológicos empregados no diagnóstico
dessa infecção viral podem ser classificados em testes de triagem e de confirmação
(Gallo et al., 1988). O principal método empregado na triagem de infecção pelo
HTLV é o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e a metodologia mais
utilizada para a confirmação da infecção pelo HTLV e identificação do tipo viral é o
Western blot (Gallo et al., 1988).
No ensaio de Western blot, diferentes antígenos virais são colocados em uma
membrana de nitrocelulose e esta é incubada com o soro teste gerando ao final um
padrão de bandas que é utilizado para a interpretação do resultado (Figura 3).
Embora Western blot seja a técnica mais recorrida para confirmação da
infecção por retrovírus, esse procedimento possui algumas limitações podendo gerar
alguns resultados “indeterminados” (Gallo et al., 1994). Devido a esse fato, a técnica
de biologia molecular baseada na reação da polimerase em cadeia (PCR) tem sido
apontada como a mais adequada para o diagnóstico de infecção pelo HTLV
(Duggan et al., 1988). O fato de não necessitar da presença de anticorpos contra o
vírus faz com que esse método seja referido como o mais seguro na avaliação de
transmissão neonatal, diagnóstico de infecção em indivíduos imunosuprimidos ou no
período compreendido entre exposição viral e soroconversão (Duggan et al., 1988).
1 2 3
Soro controle
rgp46-I
rgp46-II
p36
p32
p28
p26
p24
p19
GD2
1
Figura 3. Western blot para HTLV (Genelabs Diagnostics versão 2.4). Caso 1 apresenta positividade para HTLV-1; caso 2 apresenta positividade para HTLV-2 e caso 3 negativo para HTLV-1/2. Fonte: Calattini et al. (2005)
20
1.2 Doenças associadas ao HTLV-1
Embora a grande maioria dos portadores do HTLV-1 permaneça
assintomática ao longo da vida, aproximadamente 2 a 5% dos casos de infecção por
este vírus pode apresentar algumas enfermidades associadas (Hinuma et al., 1981;
Maloney et al., 1998). Dentre essas patologias as mais estudadas são a
leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL), a paraparesia espástica
tropical/mielopatia associada ao HTLV-1(HAM/TSP) e a dermatite infecciosa
associada ao HTLV-1 (DIH) (Yoshida et al., 1982; Shimoyama, 1991; Gessain et al.,
1985; Osame et al., 1986; La Grenade et al., 1990). Estudos realizados na Bahia
têm identificado a presença dessas três enfermidades no Estado (Bittencourt et al.,
2007a; Oliveira et al., 2005; Primo et al., 2009).
1.2.1 Dermatite infecciosa associada ao HTLV-1 (DIH)
A DIH é uma forma de eczema infeccioso, crônico e recidivante que acomete
crianças infetadas pelo HTLV-1 geralmente por via vertical (La Grenade et al., 1990).
De modo geral, as erupções eritematosas observadas principalmente no couro
cabeludo, orelha, pescoço e fossas nasais estão também associadas à presença de
Staphylococcus aureus e ou Streptococcus β-hemolyticus (Oliveira et al., 2005). O
relato de manifestações compatíveis com a DIH durante a infância em 37,5% de
pacientes adultos com ATL na Bahia sugere que esse tipo de eczema pode ser fator
de pior prognóstico na infecção pelo HTLV-1 (Bittencourt et al., 2009; Primo et al.,
2009).
1.2.2 Paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1(HAM/TSP)
A HAM/TSP é uma síndrome inflamatória crônica que tem como principal
conseqüência a desmielinização da medula espinhal principalmente nos
seguimentos torácico e lombar (Gessain et al., 1985; Osame et al., 1986). Embora
essa enfermidade tenha sido descrita há quase três décadas, muitas questões sobre
sua patogênese ainda permanecem incompreendidas e por isso, algumas
21
possibilidades têm sido levantadas para o entendimento dos danos teciduais
observados em pacientes apresentando essa condição patológica. A primeira teoria
pressupõe que o HTLV-1 infecte células presentes no sistema nervoso central
desencadeando uma resposta imune específica (Bangham e Osame, 2005). Na
segunda hipótese, anticorpos ou células que possuem a capacidade de identificar
epitopos do HTLV-1 produzem uma resposta imune contra proteínas do hospedeiro
num fenômeno denominado mimetismo (Levin et al., 2002). Uma terceira
possibilidade seria a invasão do sistema nervoso central por linfócitos CD4+
infectados e linfócitos CD8+ específicos contra o HTLV-1 proporcionando a liberação
de citocinas inflamatórias e destruição tecidual (Kubota et al., 2003).
1.2.3 Leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL)
A ATL é uma agressiva neoplasia de células T CD4+ que não responde a
quimioterapia convencional e nas formas mais graves, geralmente, é fatal
(Shimoyama, 1991; Bazarbachi et al., 2004). Este foi o primeiro tipo de câncer
diretamente relacionado a um retrovírus humano. A ATL desenvolve-se em cerca de
2 a 5% dos portadores do HTLV-1 depois de um longo período após a infecção
(Nishimura et al., 1995; Matsuoka et al., 2005). Na Bahia, a idade média de
manifestação clínica dessa doença é de 48,6 anos enquanto que no Japão essa
média de idade é de 60 anos (Bittencourt et al., 2007a; Cleghorn et al., 1995; Manns
et al., 1999).
Devido à diversidade de manifestações clínicas, a ATL foi classificada em
quatro formas com características particulares: aguda, linfomatosa, crônica e
smoldering (Shimoyama, 1991). Em 2007, Bittencourt et al. propuseram uma
modificação desta classificação com a inclusão de uma nova forma clínica
denominada tumoral primária de pele. As formas crônica e smoldering têm um curso
menos agressivo, enquanto que os pacientes portadores das demais formas
apresentam em geral um tempo de sobrevida menor que 2 anos (Figura 4). A tabela
1 mostra as principais características das diferentes formas clínicas da ATL.
22
Forma
clínica
Leucócitos
(x109)/L
Linfócitos
atípicos
Nível de DHL Hipercalcemia Órgãos envolvidos
Smoldering < 4 <5% ≥ 5%
1,5 X N Ausente Pele e/ou pulmão e/ou sangue
(≥ 5% de células atípicas no
sangue é considerado ATL
smoldering leucêmico)
Crônica ≥ 4 ≥ 5% ≤ 2 X N Ausente Qualquer órgão exceto ossos
TGI e SNC
Linfomatosa < 4 ≤ 1 % Variável Ocasionalmente Linfonodos e qualquer outro
órgão
Aguda ≥ 4 ≥ 5% Geralmente alto Geralmente alto Qualquer órgão
TPP < 4 < 5% 1,5 X N Ausente Apenas pele
Os indivíduos portadores da forma smoldering apresentam poucas células
atípicas no sangue periférico (<5%) e ausência de linfocitose. Clinicamente é
possível observar lesões cutâneas e pulmonares sem envolvimento de outros
órgãos. Alguns pacientes podem ser classificados com o tipo smoldering leucêmico
TPP, tumoral primária de pele; DHL, desidrogenase lática; N, limite superior normal; TGI, trato gastrointestinal; SNC, sistema nervoso
central. Fontes: Shimoyama (1991); Bittencourt e Oliveira (2010).
Tabela 1- Critérios para a classificação clínica da leucemia/linfoma de células T do adulto
Meses
Figura 4. Curva de sobrevida de 70 pacientes apresentando diferentes formas
clínicas de ATL. Fonte: Bittencourt et al. (2007)
Aguda
Crônica
Smoldering
Linfomatosa
Tumoral primária de pele
Forma Clínica
23
que é caracterizado pela presença de 5% ou mais de linfócitos atípicos no sangue
periférico (Bittencourt e Oliveira, 2010). A forma smoldering tem sido o tipo clínico
mais freqüentemente diagnosticado na Bahia (Bittencourt et al., 2009). A forma
crônica é caracterizada pela presença de linfocitose, manifestações cutâneas,
pulmonares e/ou hepatoesplênicas. A ausência de envolvimento ósseo, do trato
gastrointestinal e do sistema nervoso central são características importantes nessa
forma clínica (Bittencourt e Farre, 2008). Os pacientes com a forma linfomatosa
cursam com linfadenomegalia sem linfocitose. Menos de 1% dos linfócitos presentes
no sangue periférico apresentam alterações morfológicas (Shimoyama, 1991;
Bittencourt e Farre, 2008). A forma tumoral primária de pele é marcada pela
presença de tumores cutâneos sem envolvimento de linfonodos ou outros órgão
internos. A contagem de linfócitos apresenta-se dentro do intervalo de referência
para a população sadia e a presença de células atípicas no sangue periférico é
inferior a 5% (Bittencourt et al., 2007a). O tipo clínico agudo é o mais agressivo e
caracteriza-se pela presença de linfocitose com numerosas células atípicas no
sangue periférico. A observação de sintomas sistêmicos é comum nesses casos e
envolve principalmente pele, fígado, baço, ossos, sistema nervos central e trato
gastrointestinal. A sobrevida média de pacientes cursando a forma aguda é inferior a
12 meses (Shimoyama, 1991; Bittencourt et al., 2007a).
Uma característica clínica marcante da ATL é o envolvimento cutâneo,
entretanto, a freqüência desse evento varia de acordo com a forma clínica. Um
estudo realizado na Bahia verificou que 67% (47/70) dos pacientes ATL
apresentavam lesões de pele, sendo que no tipo smoldering observou-se maior
freqüência de envolvimento cutâneo (Bittencourt et al., 2007a). As manifestações
cutâneas dessa enfermidade são principalmente eritrodermia, placas, pápulas,
nódulos, tumores e/ou máculas. As lesões cutâneas observadas na ATL são sempre
múltiplas e generalizada em 50% dos pacientes (Bittencourt et al., 2009).
Os critérios estabelecidos para o diagnóstico da ATL são: 1- Presença de
anticorpos séricos para o HTLV-1; 2- Presença de linfócitos atípicos no sangue
periférico, particularmente as “células em flor” observadas principalmente na forma
aguda da ATL; 3- Comprovação de expansão linfocitária por antígenos de superfície
CD4+ e CD25+; 4- Demonstração da integração monoclonal do provírus do HTLV-1
nas células tumorais (Takatsuki 2005; Yasunaga e Matsuoka, 2007).
24
1.2.3.1 Mecanismo de patogênese do HTLV-1 na ATL
Após a infecção, o HTLV-1 transcreve o seu RNA em cDNA utilizando a
transcriptase reversa e o insere no genoma hospedeiro (Yasuna e Matsuoka, 2007).
Posteriormente, o DNA viral é transportado do citoplasma em direção ao núcleo
celular, onde o mesmo é integrado ao genoma do hospedeiro, interrompendo as
seqüências de DNA humanas. O DNA viral integrado ao genoma humano é
denominado DNA proviral (Seiki et al., 1983; Sodroski et al., 1985).
Em um portador do HTLV-1 sem manifestação de ATL, são observadas
múltiplas populações de células infectadas com integração do DNA proviral em
diferentes regiões genômicas do hospedeiro (população policlonal) (Figura 5). Em
uma percentagem dos portadores do HTLV-1, após um longo período de estímulos
mitóticos induzidos pelo vírus nas células infectadas, pode ocorrer o acúmulo de
alterações genéticas e/ou epigenéticas nestas células levando ao surgimento de um
clone celular com grande capacidade de proliferação e sobrevida (Seiki et al., 1983;
Sodroski et al., 1985). A expansão desse clone neoplásico pode dar origem a uma
população predominante de células infectadas que é caracterizada por ter o DNA
proviral integrado em uma mesma região genômica da célula hospedeira (integração
monoclonal). O desenvolvimento da ATL ocorre através da progressão de um
padrão de integração de células policlonais para um padrão de integração viral
predominantemente de células monoclonais (Figura 5).
Figura 5. Padrões de expansão clonal em linfócitos infectados pelo HTLV-1. Fonte:
Bittencourt e Farre (2008)
25
A observação de um longo período entre a infecção pelo HTLV-1 e o
surgimento dos primeiros sintomas clínicos sugere que a tumorigenese da ATL seja
um processo desencadeado por múltiplos eventos (Okamoto et al., 1989). A
transformação neoplásica atribuída a este retrovírus parece estar relacionada,
dentre outros mecanismos, à atividade dos genes virais tax e HBZ que em estudos
in vitro mostrou possuir capacidade de modular a expressão de genes virais como
p12, p13 e p30 (Choudhary e Ratener, 2011). O produto do gene tax também é
capaz de interferir na expressão ou na atividade funcional de proteínas celulares do
hospedeiro a exemplo da IL-2, ciclina D2, CDK4, CDK6 e CREB (Pise-Masison et al.,
2002), enquanto que o produto do gene HBZ pode interagir com ATF3 e NF-κB
(Hagiya et al., 2011; Zhi et al., 2011). Essas moléculas celulares participam de
importantes processos como a ativação da proliferação celular, senescência,
apoptose e reparo de erros do DNA.
O surgimento e acúmulo de mutações em importantes regiões genômicas da
célula hospedeira foram observados em pacientes com ATL, evidenciando que
alterações somáticas em genes supressores de tumor e oncogenes parecem ter
importante papel no desenvolvimento da ATL (Sakashita et al., 1992; Yamada et al.,
1997; Tawara et al., 2006). A perda de função do sistema de reparo de erros do
DNA parece atuar de forma decisiva na fixação e acúmulo de mutações celulares na
ATL (Hatta et al., 1998a; Hayami et al., 1999; Morimoto et al., 2005).
1.3 Bases moleculares da carcinogênese humana
1.3.1 Conceitos básicos: loco e alelo
Cada célula somática humana contém 46 cromossomos sendo metade desse
material oriundo da mãe (23 cromossomos) e a outra metade de origem paterna (23
cromossomos). Os membros de cada par cromossômico são denominados
homólogos e possuem os mesmos genes na mesma disposição física. A posição
precisa em que está localizada uma seqüência de nucleotídeos (como um gene, por
exemplo) em um cromossomo é denominado loco. Em qualquer loco, a composição
26
dos nucleotídeos pode variar. Todas as formas alternativas de uma determinada
seqüência de DNA em um loco são chamadas alelos.
1.3.2 Natureza do câncer
Classicamente, o câncer tem sido considerado uma doença de genes,
originada essencialmente por progressivas alterações que incluem mutações,
deleções e inserções em importantes regiões genômicas. Entretanto, nas últimas
décadas, estudos têm mostrado que o padrão de expressão gênica em células
tumorais pode ser alterado por um mecanismo que não afeta diretamente a
seqüência primária do DNA - alterações epigenéticas (Baylin e Ohm 2006). Sendo
assim, a perda de função de alguns genes é responsável pela manifestação de sete
alterações fisiológicas celulares fundamentais que juntas determinam o fenótipo
maligno, apresentando as seguintes características: (i) auto-suficiência dos sinais de
crescimento, (ii) insensibilidade aos sinais inibidores de crescimento, (iii) evasão da
morte celular programada, (iv) potencial replicativo ilimitado, (v) sustentação da
angiogênese, (vi) capacidade de invadir e metastatizar, (vii) instabilidade genômica
decorrente de defeitos do sistema de reparo do DNA (Figura 6).
Figura 6. Capacidades adquiridas pelas células tumorais. A maioria das células neoplásicas adquire
essas características em função de alterações em importantes genes. Fonte: Hanahan & Weinberg
(2000).
27
Os principais genes alvos de inativação por eventos genéticos e epigenéticos
em neoplasias pertencem às seguintes classes funcionais: protoncogenes,
supressores de tumor e reparadores de erros do DNA (Kumar et al., 2008).
1.3.3 Protoncogenes e genes supressores de tumor
Os protoncogenes codificam proteínas que promovem a proliferação celular
em condições normais. A conversão ou ativação de um protoncogene em um
oncogene geralmente é causada por mutações que podem levar a codificação de
proteínas funcionalmente alteradas, capazes de estimular o crescimento celular
excessivo ou a invasão de outros tecidos (Munoz, 1997).
Os oncogenes possuem efeito dominante sobre os protoncogenes, pois a
presença de um único alelo mutante pode levar a uma transformação neoplásica.
Em algumas situações, um simples aumento de expressão da proteína normal
codificada por um protoncogene é suficiente para inicio da tumorigênese (Kumar et
al., 2008).
Os genes supressores de tumor codificam proteínas que tem por principal
função o controle do ciclo celular evitando seu crescimento exacerbado. Alterações
que levem a perda de função dessas proteínas reguladoras podem contribuir para o
desenvolvimento de alguns tipos de cânceres.
Dentre algumas classes de proteínas reconhecidamente codificadas por
genes supressores de tumores estão: (i) proteínas intracelulares que regulam ou
inibem a progressão do ciclo celular como, por exemplo, a p16; (ii) receptores ou
transdutores de sinal que inibem a proliferação celular, como exemplo o TGFβ; (iii)
proteínas controladoras do ponto de checagem que suspendem a progressão do
ciclo celular na presença de danos no DNA ou anomalias cromossômicas, como por
exemplo, a p53 e (iv) proteínas promotoras de apoptose a exemplo da caspase 8.
De um modo geral, para a transformação neoplásica de uma célula, ambos os alelos
de um gene supressor de tumor devem ser perdidos ou inativados, por isso, as
mutações com perda de função desses genes são consideradas recessivas.
Contudo, em alguns casos, a perda da um único alelo pode ser suficiente para a
transformação neoplásica em um fenômeno chamado de haploinsuficiência (Kumar
et al., 2008). Os principais mecanismos de inativação de genes supressores de
28
tumor e oncogenes são mutações pontuais, deleções e hipermetilação de regiões
promotoras.
1.3.3.1 Efeitos das ações dos protoncogenes e genes supressores de tumor
sobre a proliferação celular
Em uma visão simplificada, os protoncogenes produzem proteínas que atuam
favorecendo (empurrando) a progressão do ciclo de divisão e conseqüente
multiplicação celular, enquanto que, os supressores de tumor codificam proteínas
que tendem a bloquear (frear) a proliferação celular. Conforme ilustrado na figura 7,
a velocidade do crescimento de uma célula em determinado momento resulta da
ação simultânea de produtos de ambos os tipos de genes.
Protoncogene Gene
supressor
Gene
supressor
Gene
supressor
inativado
Empurra Freia
Protoncogene
ativado
Mutação
Mutação
Empurra
Não freia
Equilíbrio HOMEOSTASIA
(proliferação + morte)
TUMOR
TUMOR
Figura 7. Modelo dos efeitos de protoncogenes e genes supressores de tumor sobre a
proliferação celular. As mutações em um ou outro tipo de genes resultam no surgimento de
tumores. Fonte: Munoz (1997)
29
1.3.4 Genes de reparo do DNA
Durante o processo de replicação, erros provocados pela enzima DNA
polimerase podem gerar alterações nas seqüências copiadas. Outra fonte de danos
ao DNA é a exposição a agentes carcinogênos (físicos, químicos ou biológicos).
Independentemente da causa ou natureza das alterações, a correção das mesmas é
de suma importância para a sobrevida celular e os genes de reparo do DNA
exercem papel singular nesse contexto.
Alterações na expressão de genes relacionados ao sistema de reparo do DNA
pode ser um evento chave para o acúmulo de diversas mutações em genes
associados à regulação do ciclo celular como os protoncogenes e supressores de
tumor em células neoplásicas (Munioz, 1997).
1.3.5 O ciclo celular
O desenvolvimento de uma neoplasia pode ocorrer em conseqüência de
vários fatores, dentre os quais, destaca-se a perda de controle do ciclo celular
(Sherr, 2000).
A proliferação celular segue uma seqüência de eventos organizados que
permitem a replicação do seu DNA e divisão do seu conteúdo nuclear e
citoplasmático em duas células filhas. Esses mecanismos seqüenciais de duplicação
e divisão compõem o ciclo celular que é dividido em quatro fases: G1 (gap 1) , S
(síntese), G2 (gap 2) e M (mitose) (Figura 8).
Na fase S ocorre a síntese do DNA e a fase M consiste na etapa de divisão
celular. As fases G1 e G2 são períodos preparatórios para inicio da replicação do
DNA e mitose. O período em que a célula encontra-se em repouso do ciclo celular
(senescência) é chamado de G0. Quando uma célula é estimulada a sair da fase G0
e entrar no ciclo celular, a presença de estímulos mitóticos levam-na a ultrapassar o
ponto de controle de proliferação denominado ponto de restrição (ponto R). Uma vez
transposto o ponto R, a célula completará todas as fases da divisão (Sherr, 2000;
Yamada e Kamihira, 2005).
30
1.3.6 Sistema de controle do ciclo celular
Durante a proliferação celular, um complexo de moléculas regulatórias atua
na direção e monitoramento de cada etapa (Figura 8). No início desse processo, a
ciclina D interage como seus pares catalíticos CDK4 (quinase dependente de ciclina
4) ou CDK6 (quinase dependente de ciclina 6) formando o complexo ciclina D/CDK
(Neuveut et al., 1998). O acúmulo desse complexo desencadeia a fosforilação da
proteína Rb resultando na liberação do E2F que é um fator de transcrição de genes
importantes para a sintese de DNA (Dowdy et al., 1993). Outro complexo formado
pela ciclina E e CDK2 também contribuem para a fofosrilação de Rb induzindo a
progressão da fase G1 para a etapa de síntese de DNA (Kelly et al., 1998). A
atividade desses complexos de ciclina/CDK pode ser regulada por proteínas
inibidoras de CDK (CKI) da família INK4 e família Cip/Kip (Sherr, 2000).
G0
1
Mitógeno
Ponto R
M
G1
1 G1
1
S
Ciclina E/CDK2
Ciclina B/Cdc2
Ciclina A/CDK2 p21Waf1/Cip
1
p53
Ciclina D/CDK4,6
E2F
pRb
pRb
PPPP
E2F
p15INK4B/p16INK4A
Promotor do ciclo celular
Repressor do ciclo celular
Figura 8. Regulação do ciclo celular
31
1.3.6.1 Atuação de proteínas supressoras de tumor no controle do ciclo celular
As proteínas p15 e p16 são importantes membros da família INK4 que atuam
reprimindo o complexo ciclina D/CDK4-6, bloqueando a fosforilação de Rb e
liberação de E2F para a progressão do ciclo celular (Latres et al., 2000; Neuveut et
al., 1998). Atuando também na repressão da proliferação celular, a proteína
p21Waf1/Cip1, membro da família Cip/Kip, inibe a atividade dos complexos ciclina
D/CDK4 e ciclina E/CDK2 (Xiong et al., 1993) (Figura 8).
Dentre diversas moléculas que atuam no controle do ciclo celular, a proteína
p53 parece exercer um papel chave na manutenção da integridade genômica e
controle da apoptose. Essa importante proteína é capaz de ativar a transcrição de
p21Waf1/Cip1 reprimindo de maneira indireta a progressão do ciclo celular (Ponten et
al., 1995; Yamada e Kamihira, 2005) (Figura 9). A atividade da p53 é regulada pela
ação da ubiquitina ligase MDM2 que induz a degradação protossomal dessa
molécula (Honda e Yasuda, 1999). Em situações de dano ou estresse celular, a p53
pode ser fosforilada pela proteína quinase ATM (ataxia telangiectasia mutada)
bloqueando a interação desta com a MDM2, elevando assim, os níveis celulares de
p53 e conseqüentemente de p21, implicando em uma repressão da proliferação
celular. Em casos onde o dano é extenso, a p53 pode direcionar a célula para um
processo de morte pela ativação de vários fatores pró-apoptóticos como Bax
(Massague, 2004; Chandhasin et al., 2008).
p53
Ciclina D/CDK4,6
Ciclina E/CDK2
p21 Waf1/Cip1
↓ PROLIFERAÇÃO ↑ APOPTOSE
Bax
Dano ao
DNA ATM
Figura 9. Atuação de p53 na modulação da proliferação celular e apoptose
32
1.4 Inativação de genes supressores de tumor em neoplasias
Diante da importância da atuação de supressores de tumor na regulação da
proliferação celular, alguns trabalhos têm evidenciado que alterações de vias
envolvendo esses genes podem contribuir de forma decisiva para a oncogênese
humana (Hangaishi et al., 1996; Holstege et al., 2009). Dentre os genes mais
estudas nas neoplasias estão TP53, p15INK4B e p16INK4A.
1.4.1 Gene TP53
Localizado no braço curto do cromossomo 17, o gene TP53 é composto por
11 éxons e codifica uma fosfoproteína composta por 393 aminoácidos (Figura 10).
Mutações somáticas no gene TP53 têm sido observadas em
aproximadamente 50% dos cânceres humanos, sendo que a prevalência desse tipo
de alteração varia bastante de acordo com o tipo tumoral, oscilando entre 6 e 47%
(Petitjean et al., 2007).
De um modo geral, as mutações em TP53 parecem estar presentes em
estágios tumorais avançados e tem sido associada com menor tempo de sobrevida
em pacientes com tumores sólidos e hematológicos (Russo et al., 2005; Olivier et al.,
2006).
Introns (I)
Exons (E)
Domínios
protéicos
Aminoácidos
Figura 10. Estrutura organizacional do gene TP53. Tamanho de éxons e íntrons em pb.
Fonte: p53.free.fr
33
Estudos realizados em cânceres de fígado, bexiga e mama, têm evidenciado
que a inativação de TP53 está relacionada com um maior grau de agressividade
tumoral (Tanaka et al., 1993; Esrig et al., 1993; Olivier et al., 2006). Em neoplasias
hematológicas como a leucemia mielóide crônica (CML), a presença de mutação em
TP53 parece estar associada aos quadros clínicos mais agressivos da doença (Foti
et al., 1991).
Sidransky et al. (1992) estudando tumores de cérebro, constataram que
clones celulares contendo mutações pontuais no gene TP53 possuíam vantagens
proliferativas, conferindo menor grau de diferenciação ao tecido tumoral e maior
capacidade invasiva das células neoplásicas. Em um estudo colaborativo
internacional incluindo 3583 amostras de pacientes com tumores colorretal oriundos
de diferentes regiões geográficas também foi verificado que a presença de mutações
no TP53 confere maior capacidade de invasão celular por via linfática e vascular
(Russo et al., 2005).
Em neoplasias hematológicas como a leucemia mielóide aguda (AML),
síndrome mielodisplásica (MDS) e leucemia linfocítica crônica (CLL), o status
mutacional de TP53 pode induzir resistência a terapia convencional pela
desregulação de vias apoptóticas em células tumorais (Wattel et al., 1994).
Independentemente do tipo tumoral, a maior parte das mutações somáticas
descritas em TP53 localiza-se na região que codifica o domínio de ligação da
proteína p53 às seqüências de DNA responsáveis pela transcrição de genes
relacionados com controle do ciclo celular e apoptose. Aproximadamente 80%
dessas mutações encontra-se entre os éxons 5 e 8. Seis códons (175, 245, 248,
249, 273 e 282) são os principais alvos dessas alterações e, por isso, denominados
hot spots (Soussi e Lozano, 2005; Soussi et al., 2006).
1.4.1.1 Inativação de TP53 na ATL
Na ATL, estudos têm descrito mutações em TP53, sugerindo que essas
alterações possam ser decisivas no desenvolvimento dessa malignidade (Nagai et
al., 1991; Cesarman et al., 1992; Mitani et al., 2007). No Japão, análises em
pacientes portadores de formas linfomatosas e agudas de ATL verificaram a
presença de mutações pontuais no gene TP53 em 50% (5/10) dos casos estudados.
34
Em um desses pacientes, foi constatado o surgimento de mutação durante a
progressão da forma crônica para a forma aguda, sugerindo que alterações em
TP53 possam estar associadas à transição de uma forma branda para uma forma
grave da doença (Sakashita et al., 1992). Do mesmo modo, Nishimura et al. (1995)
demonstraram uma maior frequência de mutações no gene TP53 em pacientes com
forma clínica aguda (8/19 - 42%) em relação aos pacientes com forma crônica (1/15
- 6,7%) propondo, como descrito anteriormente, que alterações em TP53 possam
estar associadas à fases mais agressivas da ATL. Tawara et al. (2006), avaliando o
impacto das mutações em TP53 em 56 casos ATL (43 casos agudos e 13 casos
crônicos) verificaram uma menor sobrevida de pacientes apresentando mutações
pontuais nesse gene independentemente da forma clínica. Nesse estudo, uma
análise multivariada indicou que as mutações de TP53 são consideradas fator de
pior prognóstico na ATL.
1.4.2 Genes p16INK4A e p15INK4B
O gene supressor de tumor p16INK4A está localizado no cromossomo 9p21 e
compartilha uma mesma seqüência genômica com o gene p14ARF que é um
importante inibidor da MDM2 (Roussel, 1999). O gene p16INK4A possui três exons e,
como abordado anteriormente, parece atuar no controle do ciclo celular por meio da
codificação de uma proteína inibidora de CDK (Figura 11).
Figura 11. Estrutura organizacional dos genes p15INK4B e p16INK4A. Fonte: Kufe et al. (2003)
Centrômero Telômero
Proteína
Função Inibição de
CDK
Inibição de
MDM2
Inibição de
CDK
35
Assim como o gene TP53, o p16INK4A é um dos principais alvos de inativação
em neoplasias humanas. A freqüência de inativação de p16INK4A varia de acordo com
o tipo tumoral estimando-se estar presente em 20% dos cânceres de mama, 65%
dos cânceres de pulmão de células não pequenas (NSCLC), 27% dos cânceres
coloretais, 60% dos cânceres de bexiga, 68% dos tumores de cabeça e pescoço,
65% dos melanomas, 85% dos cânceres de pâncreas, 25% dos tumores de ovário,
44% dos cânceres de estomago e 61% das leucemias (US SEER data, 1999).
Alguns estudos têm mostrado que inativação de p16INK4A parece estar
relacionada com pior prognóstico em diferentes tumores. Kamiryo et al. (2002),
avaliando alterações genéticas em 46 pacientes com glioblastomas verificaram que
os casos portando deleções em p16INK4A (14/46) apresentavam menor tempo de
sobrevida comparado aos pacientes sem esse tipo de alteração. Em câncer
coloretal, a inativação conjunta dos genes p16INK4A e K-ras parece estar relacionada
com menor sobrevida dos pacientes, sendo essas alterações consideradas como
fator prognóstico independente em análises univariada e multivariada (Esteller et al.,
2001). Okamoto et al. (1994), analisando 40 tumores primários de pulmão e 31
tumores metastáticos de pulmão verificaram uma associação entre a presença de
mutações no gene p16INK4A e progressão neoplasia, sugerindo que esse tipo de
mutação possa ser um evento tardio em cânceres de pulmão de células não
pequenas (NSCLC).
Outro conhecido inibidor de CDKs, a proteína p15, é codificada pelo gene
p15INK4B que está localizado no cromossomo 9p21. Esse gene possui dois éxons e
está mapeado muito próximo ao p16INK4A (Figura 10). Em tumores humanos, os
mecanismos de inativação p15INK4B são similares aos observados em p16INK4A sendo
as deleções gênicas e hipermetilação os principais eventos relacionados com a
inativação desse gene. Embora seja considerado um evento raro, as mutações
pontuais no gene p15INK4B têm sido relatadas em algumas neoplasias como NSCLC,
onde três dos 25 pacientes analisados (12%) apresentavam mutações (Okamoto et
al., 1994). Em um trabalho incluindo amostras de 26 pacientes com ceratose
actinica, a presença de mutações pontuais no gene p15INK4B foi verificada em 8%
dos casos estudados (2/26) e parece estar relacionada com a progressão da lesão
pré-cancerosa para o carcinoma de células escamosas (Kanellou et al., 2008). Em
relação às neoplasias hematológicas como ALL, CML e NHL, alguns trabalhos têm
36
constatado que as mutações em p15INK4B são infreqüentes (Sill et al., 1996; Koduru
et al.,1995).
1.4.2.1 Inativação de p15INK4B e p16INK4A na ATL
Alguns trabalhos têm evidenciado que inativações dos genes p15INK4B e
p16INK4A sejam importantes eventos na patogênese da ATL. Uma análise por
Southern blot de 37 amostras de pacientes ATL (23 agudos, 14 crônicos e 2
linfomatosos) na cidade de Kyushu, região endêmica para HTLV-I no Japão,
mostrou que 27% dos pacientes (8 casos agudos e 2 casos crônicos) apresentaram
deleções dos genes p15INK4B e/ou p16INK4A. Um dos 14 casos avaliados com forma
crônica durante esse trabalho apresentou deleção homozigótica de p16INK4A e
evoluiu rapidamente para a forma clínica aguda falecendo dentro de seis meses
(Hatta et al., 1995). Na região endêmica de Nagoya, outro estudo demonstrou
deleções em homozigose no gene p16INK4A em 11% (5/44) dos pacientes com ATL.
Além disso, foi observada a presença de mutações pontuais em 6,8% (3/44) dos
casos analisados, demonstrando que o gene p16INK4A pode ser inativado não apenas
por deleção, mas também por mutações pontuais encontradas principalmente em
pacientes com tipo clínico grave (Uchida et al., 1996). As alterações em p15INK4B e
p16INK4A também parecem ser significantes fatores prognósticos na ATL. Yamada et
al. (1997) avaliando a inativação de p15INK4B e p16INK4A em pacientes ATL
constataram que 26 dos 77 pacientes agudos (32%) e dois entre os 37 casos
crônicos (5%) incluídos nas análises apresentavam deleções em pelo menos um
desses genes. Os pacientes com deleção de p15INK4B e/ou p16INK4A apresentaram
menor tempo de sobrevida em comparação aos demais casos sem essa alteração.
Além disso, uma redução similar do tempo de sobrevida foi observada em análises
realizadas apenas com pacientes apresentando a mesma forma clínica sugerindo
que o status desses genes possa ser considerado para avaliação prognóstica e
também na classificação da forma clínica. Pesquisas posteriores também realizadas
no Japão utilizando metodologias mais sensíveis para a análise de deleções como a
PCR quantitativa em tempo real verificaram, de igual modo, que inativação do gene
p16INK4A é um fator prognóstico independente na ATL, podendo auxiliar na
37
classificação da forma clínica e na tomada de decisões terapêutica (Takasaki et al.,
2003; Tawara et al., 2006)
1.5 Instabilidade genômica
Uma característica marcante de uma célula tumoral é a instabilidade de seu
genoma que é resultante de uma cascata de alterações genéticas capazes de
romper os mecanismos de controle da proliferação e morte celular (Loeb, 1994). O
acúmulo de mutações, considerado evento essencial no estabelecimento de um
processo carcingênico, é potencializado pela perda da capacidade de reparo de
erros do DNA (Hatta et al., 1998a; Gryfe et al., 2000; Umar et al., 2004). Uma
maneira de se avaliar a presença de instabilidades genéticas em um determinado
tecido tumoral é através do estudo de seqüências de DNA denominadas
microssatélites. Essas seqüências são compostas por 1 a 6 pares de bases
repetidas lado a lado e estão distribuídas ao longo de todo o genoma dos
organismos eucariotos (Litt e Luty, 1989). Termos como SSR (Simple Sequence
Repeats), STMS (Sequence Tagged Microsatellite Sites), STR (Simple Tandem
Repeats) e SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphisms) também são
empregados para descrever essa classe de repetições (Ferreira e Grattapaglia,
1998).
Os microssatélites têm se tornado marcadores bastante utilizados em
diversos estudos genéticos pela facilidade de amplificação via PCR. Os seguimentos
microssatélites amplificados podem ser altamente variáveis entre indivíduos, ou seja,
apresentam um polimorfismo extensivo resultante da presença de diferente número
de elementos simples repetidos. Essa característica faz desses marcadores uma
potente ferramenta utilizada para a identificação humana em estudos de medicina
forense (Butle, 2010). Assim, cada região cromossômica contendo seqüencias
microssatélites constitui um loco extremamente variável e cada segmento
amplificado de tamanho diferente representa um alelo distinto em um mesmo loco
(Ferreira e Grattapaglia, 1998). Quando um indivíduo possui o mesmo número de
repetições em ambos os alelos de um mesmo loco microssatélite este é considerado
homozigoto (Figura 12A). Alternativamente, quando um indivíduo possui alelos com
38
diferentes números de repetições em um mesmo loco microssatélite este é
denominado heterozigoto (Figura 12B).
1.5.1 Instabilidade microssatélite (microsatellite instability - MSI)
Ocasionalmente, durante a replicação do DNA a enzima DNA polimerase
pode incorporar ou deixar de incorporar erroneamente nucleotídeos na região 3´
terminal da fita recém sintetizada. Entretanto, a maquinaria celular possui estratégias
para detectar e remover nucleotídeos mal copiados durante o processo de
replicação. A primeira linha de defesa contra erros de replicação são as próprias
DNA polimerases que formam complexos protéicos compostos por diferentes
subunidades que além de atuar na síntese do novo polímero de DNA também atuam
Figura 12. Ilustração de genótipos microssatélites. (A) Indivíduos homozigoto e heterozigoto, (B)
Ilustração do padrão de amplificação microssatétile em gel de eletroforese. Fonte: Ferreira e
Grattapaglia (1998).
A
B
..........CACACACACACACACACACACACA..........
..........GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT..........
..........CACACACACACACACACACACACA..........
..........GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT..........
Indivíduo A (homozigoto)
ALELO 1 (CA)12
ALELO 2 (CA)12
..........CACACACACACACACACACA..........
..........GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT..........
Indivíduo B (heterozigoto)
ALELO 1 (CA)10
..........CACACACACACACACACACACACACACA.........
. ..........GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT.........
.
ALELO 2 (CA)14
Visualização dos genótipos em gel de eletroforese
A CA12/ CA12
B CA10/ CA14
39
na verificação de possíveis erros e na excisão de nucleotídeos incorretos. Outra
estratégia na prevenção de erros de replicação é a atividade de uma série de
proteínas codificadas por genes relacionados com o sistema de reparo (Weinberg,
2008). A ampliação dos conhecimentos sobre o genoma humano tem proporcionado
a identificação de diversos genes do sistema de reparo de erros no DNA tais como
hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS1 e hPMS2 (Morimoto et al., 2005).
As seqüências microssatélites são excepcionalmente vulneráveis a inserções
e deleções espontâneas durante o processo de replicação do DNA. Um dos
principais mecanismos responsáveis por essas alterações é o DNA slippage durante
a replicação (Li et al., 2002). Em função de uma falha no alinhamento das fitas
molde e filha devido ao deslizamento de uma fita sobre a outra, a DNA polimerase
pode erroneamente incorporar um número de nucleotídeos maior ou menor nas fitas
recém sintetizadas (Figura 13). As inserções e deleções nessas regiões repetitivas
podem não ser percebidas por deficiências do sistema de reparo, resultando na
expansão ou encolhimento das seqüências nas células filhas gerando uma condição
genética conhecida como instabilidade microssatélite (MSI), comumente observada
em tecidos tumorais (Figura 14).
CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT
CATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT
Figura 14. Exemplo representativo da expansão de nucleotídeos em um alelo microssatélite gerando
instabilidade
(ALELO NORMAL - CAT 10)
(ALELO ALTERADO - CAT 16)
FALHA DO SISTEMA DE
REPARO
Figura 13. Ilustração esquemática de DNA slippage. Erros no pareamento das fitas de DNA
podem levar a falhas da DNA polimerase que pode incorporar nucleotídeos extras a fita recém
sintetizada gerando expansão alélica de um determinado microssatélite.
Fonte:https://www.stanford.edu/group/hopes/cgi-bin/wordpress/2011/02/all-about-mutations/
Fita molde
Fita molde
Nova fita
Nova fita
Região expandida
Replicação do
DNA
Replicação do
DNA
40
A instabilidade microssatélite (MSI) foi descrita inicialmente em câncer
colorretal hereditário não polipose por três grupos independentes no inicio da
década de 1990 (Thibodeau et al., 1993; Peltomaki et al., 1993; Ionov et al., 1993).
Posteriormente, esse tipo de alteração foi identificado em outros tumores sólidos
como nefroblatomas, adenocarcinoma de pâncreas e carcinomas de pulmão e
ovário (Ramburan et al., 2004; Brentnall et al., 1995; Shridhar et al., 1994; Plisiecka-
Halasa et al., 2008). Em neoplasias hematológicas, incluindo a ATL, a presença de
MSI também tem sido freqüentemente reportada (Duval et al., 2004; Takeuchi et al.,
1997; Hatta el al., 1998a).
Para a análise de instabilidades microssatéites, as regiões contendo essas
seqüências repetitivas devem ser amplificadas via PCR tanto em células tumorais
quanto em tecidos normais do mesmo indivíduo (Figura 15). A comparação dos
padrões de amplificação entre os diferentes tecidos é de suma importância, pois
permite identificar se possíveis instabilidades foram adquiridas durante o processo
carcinogênico (Boland et al., 1998).
41
1.5.1.1 Classificação dos tumores em relação à presença de MSI
Baseando-se nas análises de microssatétites, o Instituto Nacional do Câncer
dos Estados Unidos (National Cancer Institute), passou a recomendar a
classificação dos tumores colorretais nos seguintes grupos: 1- Microsatellite
Instability High (MSI-H): quando ≥30-40% dos marcadores analisados apresentam
instabilidade; 2- Microsatellite Instability Low (MSI-L): quando ≤30-40% dos
marcadores analisados apresentam instabilidade e 3- Microsatellite Stable (MSS):
quando nenhum marcador analisado apresenta instabilidade. Nos últimos anos,
diferentes neoplasias como tumores de cérebro, boca, linfomas/leucemias têm
Figura 15. Exemplo representativo de instabilidade microssatélite. À esquerda, ilustração dos alelos
microssatélites em tecido normal e tumoral de um mesmo indivíduo e à direita, padrão de
amplifcação microssatélite mostrando em eletroferograma. Extensão dos fragmentos é dada em
pares de bases (pb).
.........
.
.........
.
Alelo 2 (CA)262
.........
.
.........
.
Alelo 1 (CA)252
Deleção
Tecido Tumoral
Alelo 1
Alelo 2
.........
.
.........
.
Alelo 1 (CA)258
Tecido Normal
Alelo 1
Alelo 2
.........
.
.........
.
Alelo 2 (CA)262
42
adotado essa metodologia para a classificação dos tumores (Viana-Pereira et al.,
2008; Ashazila et al., 2011; Hayami et al., 1999; Durval et al., 2004).
1.5.1.2 Efeitos da MSI sobre a expressão gênica em tumores
A presença de instabilidades em microssatélites localizados em regiões
intrônicas de genes podem afetar a transcrição ou o processamento (splicing)
adequado de RNAm. Tidow et al. (2003), verificaram que a expansão de
nucleotídeos no loco microssatélite CA SSR I, localizado em uma seqüência
intrônica do gene egfr é responsável pelo aumento da transcrição desse gene,
representando um dos primeiros eventos da carcinogênese de mama. Ejima et al.
(2000), utilizando linhas celulares de câncer de colon constataram que a presença
de instabilidade em um loco microssatélite situado em um dos íntrons do gene ATM
parece estar relacionada à defeitos no splicing do RNAm e conseqüente síntese
protéica.
1.5.1.3 Correlações clínico-patológicas dos tumores com MSI
Alguns estudos têm mostrado que tumores sólidos apresentando MSI
manifestam características clínicas e patológicas que os diferencia dos tumores
estáveis para microssatélites. Em câncer de colon, a presença de MSI parece estar
relacionada com a localização anatômica e com o grau de diferenciação da massa
tumoral (Ribic et al., 2003). Uma associação semelhante foi observada em tumores
de células escamosas da cavidade oral, onde a presença de MSI está relacionada
com o estágio tumoral e diferenciação tecidual (Ashazila et al., 2011).
Em relação às implicações prognósticas dos mecanismos geradores de MSI
em tumores humanos, trabalhos realizados em câncer de cólon têm mostrado uma
associação entre a presença de MSI e maior tempo de sobrevida dos pacientes
(Thibodeau et al., 1993; Cawkwell et al., 1995; Ribic et al., 2003). Entretanto, um
estudo realizado em câncer de mama tem indicado que MSI está relacionada com
maior agressividade e pior prognóstico de pacientes apresentando esse tipo de
alteração (Paulson et al., 1996).
43
Deficiências no sistema de reparo de erros no DNA têm sido apontadas como
a principal causa do surgimento de MSI em tumores. Entretanto, mutações pontuais
em genes relacionados com a correção de erros no DNA como hMLH1, hMSH2 e
hMSH3 parecem ser eventos raros em tumores sólidos como câncer de ovário,
endométrio, pulmão e cólon e também em neoplasias hematológicos como NHL,
ALL e ATL (Hatta et al., 1998a; Komatsu et al., 2000). Embora não atue diretamente
na correção de erros no DNA, o gene TP53 atua de forma decisiva na manutenção
da integridade genômica. Em tumores de vias biliares, um trabalho tem evidenciado
uma associação entre MSI e mutação em TP53 (Nagahashi et al., 2008). A análise
de 42 pacientes diagnosticados com leucemias agudas de adultos (CML e AML)
mostrou que, cinco entre seis casos identificados com mutações em TP53
apresentavam MSI (Zhu et al., 1999).
Na ATL, nenhum estudo publicado aborda a relação entre mutações pontuais
em TP53 e a presença de MSI. Contudo, Komatsu et al. (2000) analisando 10
pacientes ATL com MSI verificaram que dois casos (20%) apresentavam mutação no
gene E2F4.
1.5.2 Perda de Heterozigozidade (Loss of Heterozigozity - LOH)
Durante a década de 70, uma seqüência de eventos foi proposta para
descrever a inativação de um gene supressor em uma célula tumoral – modelo
seqüencial two-hits (Knudson, 2001). Nesse modelo, o primeiro evento para a
inativação de um supressor de tumor é a mutação somente em um dos alelos desse
gene, resultando em um alelo mutante e outro selvagem (Figura 16). A probabilidade
de ocorrer uma segunda mutação no alelo selvagem é baixa e por isso para
inativação desse supressor de tumor o segundo evento seria uma deleção total ou
uma perda parcial do cromossomo contendo o gene em função de falhas durante a
divisão ou recombinação (Knudson, 1978). A perda de um dos alelos de um loco é
definida como perda de heterozigozidade (Figura 16).
44
A análise de LOH utilizando marcadores microssatélite pode ser empregada
para avaliação de deleções somáticas em neoplasias. A recorrente observação de
deleção em um determinado loco microssatélite em diferentes pacientes com um
mesmo tipo tumoral pode indicar a presença de um potencial gene supressor de
tumor nessa região (Canzian et al., 1996).
A avaliação de LOH em um loco microssatélite é realizada através da
comparação do padrão de amplificação do DNA obtido de células tumorais com DNA
oriundo de tecido normal em um mesmo indivíduo. Uma condição indispensável para
a análise de LOH é que a amostra normal apresente heterozigose (dois alelos
distintos para um mesmo loco). Caso um determinado tumor sofra LOH, esse evento
será evidenciado pela redução da intensidade do pico de amplificação de um dos
Alelo
Selvagem
Cromossomo
deletado
Alelo
Selvagem
Alelo
deletado
Alelo
Selvagem
Alelo
Mutante
Alelo
Selvagem
Alelo
Selvagem
Célula Normal
1º Evento: Mutação em
um alelo do TGS
2º Evento: Deleção parcial ou
total do cromossomo contendo
alelo selvagem do TGS
OU
Figura 16. Ilustração do modelo two-hit para inativação de um gene supressor de tumor (TGS)
45
dois alelos (Figura 17). A razão pela qual é observada a redução da intensidade do
pico de amplificação e não a ausência do pico é a contaminação do tecido
neoplásico com células não tumorais durante a etapa de isolamento, introduzindo
dessa forma DNA normal na amostra tumoral. Portanto, a redução da intensidade do
pico de amplificação de um alelo microssatélite pode representar a deleção alélica
de um possível gene supressor de tumor, caracterizando um dos principais eventos
relacionados com a inativação dessa classe de genes proposto pelo modelo two-hits
para desenvolvimento tumoral.
Um indivíduo apresentando heterozigose para um determinado loco
microssatélite é considerado informativo para análise de LOH nesse marcador. Por
outro lado, em casos de homozigose alélica (presença de dois alelos idênticos no
mesmo loco), não há possibilidade de se calcular LOH, pois não é possível fazer a
distinção entre os dois alelos e, por isso, consideramos esses indivíduos como não
informativos para o loco avaliado (Figura 18).
Tecido
Normal
Tumor
Figura 17. Exemplo representativo da análise de LOH. Fonte: Ashazila et al. (2011)
Figura 18. Exemplo representativo da análise de LOH mostrando: (A) caso não informativo e (B)
caso informativo. Fonte: Ashazila et al. (2011).
Tecido Normal
Tumor Tumor
Tecido Normal
A B
46
1.5.3 Alterações microssatélites na ATL
Em 1998, Hatta et al. investigaram pela primeira vez a influencia da MSI no
desenvolvimento de formas graves da ATL. Foram incluídos nesse trabalho 22
pacientes com formas clínicas aguda e linfomatosa onde foi constatado que 41%
desses casos apresentavam instabilidade em ao menos um dos 54 locos
microssatélites avaliados. Posteriormente, em outro estudo incluindo 18 pacientes
ATL (13 casos agudos, três casos crônicos, um caso linfomatose e um caso
smoldering) verificou-se a presença de MSI em quatro portadores da forma aguda,
sugerindo que as alterações microssatélites estão associadas aos quadros mais
severos da doença podendo futuramente ser empregados como marcadores de pior
prognóstico.
Em relação à freqüência de LOH, estudos também realizados no Japão
mostraram elevada incidência dessas alterações em formas graves da ATL. A
análise de LOH utilizando 94 marcadores microssatélites distribuídos pelos 22
cromossomos autossômicos em 22 pacientes ATL apresentando forma aguda e
linfomatosa revelou que em 91% (20/22) desses casos ocorriam perdas alélicas em
pelo menos um dos cromossomos. As regiões mais freqüentemente deletadas nesse
trabalho estavam situadas nos cromossomos 6 e 17 (Hatta et al. 1998b). Utilizando
24 marcadores para uma análise mais refinada do cromossomo 6 nesses 22
pacientes foi verificado que nove casos (41%) apresentavam LOH de um ou mais
locos. Em oito desses pacientes a deleção ocorreu em uma região flanqueada pelos
locos D6S1652 e D6S1644 (6q15-21). Esses dois marcadores estão compreendidos
em uma distância de aproximadamente 4 cM (centimorgan) sugerindo a existência
de um possível gene supressor de tumor localizado na região cromossômica 6q15-
21 que poderia estar envolvido no desenvolvimento da ATL (Hatta et al., 1999).
47
2 JUSTIFICATIVA
Embora pesquisas científicas tenham sido realizadas com intuito de entender
a patogênese da ATL, ainda permanecem desconhecidos os mecanismos
responsáveis pelo desenvolvimento dessa neoplasia (Sato et al., 2010). Do mesmo
modo, ainda não estão elucidados os fatores que determinam o desenvolvimento da
ATL em uma pequena porcentagem dos portadores do HTLV-1 (2 a 5%), nem os
motivos pelos quais os pacientes apresentam variadas formas clínicas.
Diversos trabalhos sobre alterações genéticas como instabilidade
microssatélite, aberrações cromossômicas e mutações pontuais em genes
supressores de tumores têm sido relacionados com maior agressividade e pior
prognóstico para vários tipos de câncer como mama, colo, pulmão e hematológicos
(Tsuji et al., 2004; Wang et al., 2004; Fleckenstein et al., 2002). Embora algumas
poucas pesquisas tenham identificado importantes alterações genéticas em genes
supressores tumorais na ATL, esses estudos são oriundos exclusivamente do Japão
onde há predominância de formas agudas e linfomatosas (Takasaki et al., 2003;
Furukawa et al., 2006; Sato et al., 2010), diferentemente do observado na Bahia
onde há predominância de formas crônica e smoldering (Bittencourt et al., 2009).
Apesar de a Bahia ser uma das regiões com maiores índices de prevalência
de ATL no mundo, nenhum estudo com essa abordagem foi realizado no Estado. Na
literatura, são muito raros os estudos sobre alterações moleculares nos genes TP53,
p15INK4B e p16INK4A em pacientes apresentando forma clínica smoldering da ATL e
mesmo nesses escassos trabalhos, as poucas amostras utilizadas para as análises
apresentavam uma percentagem de células tumorais igual ou inferior a 30% (Sugito
et al., 1991; Uchida et al., 1996). Sendo assim, esse é o primeiro estudo que temos
conhecimento a estudar alterações genéticas em genes supressores de tumor
utilizando amostras de pacientes com a forma smoldering de ATL contendo acima
65% de células CD4+.
Em relação às análises de alterações microsatélites na ATL, os trabalhos
publicados versando sobre esse tema incluem predominantemente amostras de
pacientes com formas aguda e linfomatosa sendo avaliado apenas um único caso
smoldering (Hatta et al., 1998a; Hayami et al., 1999; Hatta et al., 1999). Em todos os
estudos, a metodologia empregada para detecção dos produtos de amplificação
48
baseou-se em coloração por nitrato de prata, onde a leitura do padrão de
amplificação é realizada de maneira visual na ausência critérios de interpretação
bem estabelecidos (Canzian et al., 1996). Portanto, a metodologia de detecção
automatizada baseada em fluorescência para a análise de alterações microssatélites
utilizada nesse estudo assegura maior sensibilidade e precisão na análise dos
dados. Adicionalmente, este parece ser é o único estudo sobre MSI e LOH em ATL
realizado fora do Japão e conta com o maior número de casos crônico e smoldering
avaliados para esses tipos de alterações.
Os resultados obtidos nessa pesquisa poderão ser importantes para o
entendimento do mecanismo oncogênico da ATL, especialmente na forma
smoldering da doença, podendo auxiliar no diagnostico precoce, na identificação de
marcadores de progressão e gravidade, bem como na busca de novos alvos
terapêuticos para essa neoplasia.
O desenvolvimento do presente trabalho também tem marcante contribuição
na implementação e consolidação de estudos na área de oncologia molecular, uma
vez que são poucos os grupos pesquisas atuantes nessa área no Estado da Bahia.
As técnicas implantadas durante a realização desse projeto não se restringem
apenas à ATL, mas de igual maneira podem ser aplicadas a outros tipos tumorais e
contribuir para a definição de estágio clínico e estratégia terapêutica a ser adotada.
A nossa hipótese é que mutações pontuais de genes supressores de tumores
e alterações microssatélites estão presentes em pacientes com ATL diagnosticados
na Bahia e o maior número de casos com essas aberrações possuem forma clínica
aguda.
49
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Investigar alterações genéticas presentes na leucemia/linfoma das células T do
adulto (ATL) no Estado da Bahia.
3.2 Objetivos Específicos
1. Estudar a freqüência de mutações pontuais nos genes TP53, p16INK4A e
p15INK4B nas células tumorais de pacientes com ATL.
2. Avaliar a presença de possíveis alterações microssatélites como
instabilidades e perda de heterozigozidade nas células neoplásicas dos
pacientes estudados.
3. Investigar a existência de associação entre as anomalias genéticas
observadas com evolução para formas clínicas mais agressivas e sobrevida dos
pacientes com ATL.
50
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Obtenção das amostras
Este trabalho incluiu 47 amostras tumorais oriundas das células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) de 38 pacientes com ATL
diagnosticados no Hospital Universitário Professor Edgar Santos (HUPES/UFBA)
pelo grupo de pesquisa em linfomas/leucemias e lesões pré-linfomatosas
associadas à vírus na Bahia e linfomas cutâneos em geral entre os anos de 1999 e
2011. Para seis pacientes foram incluídas uma ou mais amostras adicionais de
sangue periférico conforme descrito posteriormente.
O diagnóstico de ATL baseou-se na positividade sorológica para HTLV-1 e
demonstração histológica e/ou citológica de leucemia/linfoma originária de células T
periféricas. Os casos com sobrevida maior que cinco anos foram considerados
atípicos e tiveram a integração proviral investigada por Southern blot ou PCR longa
invertida. Nenhum dos pacientes incluídos neste estudo apresentou infecção
simultânea com HIV.
Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE),
coletou-se cerca de 20 mL de sangue periférico de cada participante a partir do qual
foram separadas as PBMCs por gradiente de Ficoll.
Vinte e oito pacientes tiveram amostras coletas e analisadas apenas no
período sem tratamento (casos 1, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36 e 37) e dez pacientes tiveram a amostra
coletada e analisada somente após início do tratamento (casos 2, 3, 9, 10, 13, 15,
26, 27, 32 e 38). Este tratamento variou de acordo com a forma clínica. Os pacientes
com a forma smoldering foram submetidos à Psolareno-UV-A (PUVA) (casos 9, 27)
e em situações de piora clínica (casos 13, 15) foram tratados com interferon-α (IFN-
α) mais Zidovudina (AZT). Nos pacientes com forma aguda (casos 2, 3, 10 e 32) o
tratamento foi quimioterapia (CHOP) associada ou não com IFN- α mais AZT. Nos
pacientes com forma crônica (casos 26 e 38) foi usado apenas IFN- α e AZT.
Dos 38 casos incluídos nesse trabalho, seis pacientes tiveram mais de uma
amostra de sangue coletada em diferentes períodos. Nos casos 8, 11, 14, 19
51
coletou-se uma ou mais amostras de sangue adicionais após tratamento (o intervalo
entre coletas foi de aproximadamente um mês), enquanto que nos casos 15 e 33
foram coletadas amostras adicionais por mudança de forma clinica (o intervalo entre
coletas foi de três meses para caso 33 e dois anos para o caso 15) (Tabela 2).
Em 25 pacientes também foi coletado material não tumoral procedente de
cabelo, unha, raspado de mucosa oral e/ou material de biopsia (pele ou pulmão)
visando à investigação de alterações microssatélites (Tabela 2). Quando possível,
foi coletado mais de uma amostra de tecido normal de diferentes procedências por
paciente. Em 13 pacientes não foi possível conseguir amostra de tecido normal por
se tratar de casos antigos ou casos novos que foram a óbito antes da realização da
coleta.
Devido a dificuldades na obtenção de amostras conforme descrito
posteriormente, não foi possível incluir os 38 pacientes em todas as análises
propostas no presente estudo. Para a avaliação das alterações genéticas (Objetivo
específico 1) somente foi possível incluir amostras com alto conteúdo de célula
tumoral (pacientes crônicos e agudos) e amostras enriquecidas por sorting celular
(pacientes smoldering). Para a análise proposta no objetivo específico 2, somente
foram incluídos pacientes com coleta de amostra tumoral e de tecido normal
pareadas.
52
Paciente Forma Linfocitose Sorting
celular
Análise de
mutação
Análise
microssatélite
Tecido normal
coletado
1 Aguda Presente - + - Não coletado
2 Aguda Presente - + - Não coletado
3 Aguda Presente - + - Não coletado
4 Aguda Presente - + - Não coletado
5 Smoldering Presente - - + Cabelo
6 Aguda Presente - + - Não coletado
7* Smoldering Ausente + + + Unha, Mucosa
8A Aguda Presente - + - Não coletado
8B Aguda Presente - + - Não coletado
9 Smoldering Ausente - - + Unha, Mucosa
10 Aguda Presente - + - Não coletado
11A Aguda Presente - + - Não coletado
11B Aguda Presente - + + Biópsia de pele
12 Aguda Presente - + - Não coletado
13 Crônico Ausente - - + Unha, Mucosa
14A Aguda Presente - + - Não coletado
14B Aguda Presente - + - Não coletado
15A Smoldering Ausente - - + Unha, Mucosa
15B Crônico Presente - + + Unha, Mucosa
15C Crônico Presente - + + Liq. Pleura pulmonar
16 Crônico Presente - + + Biópsia pulmão
17* Smoldering Ausente + + + Cabelo
18* Smoldering Ausente - - + Cabelo, Unha, Mucosa
19A Crônico Presente - + - Não coletado
19B Crônico Presente - + - Não coletado
19C Crônico Presente - + - Não coletado
19D Crônico Presente - + + Unha
20 Crônico Presente - + - Não coletado
21* Crônico Presente - - + Cabelo, Unha
22 Linfomatosa Ausente - - + Cabelo, Unha
23* Smoldering Ausente + + + Cabelo, Unha, Mucosa
24 Crônico Presente - + + Cabelo, Unha
25 Aguda Presente - + - Não coletado
26 Crônico Ausente - + - Não coletado
27* Smoldering Presente - - + Unha, Mucosa
28 Aguda Presente - + + Mucosa
29* Smoldering Ausente + + + Unha, Mucosa
30 Smoldering Presente + + + Unha, Mucosa
31 Aguda Presente - + + Unha, Mucosa
32 Aguda Presente - + + Unha
33A Crônica Presente - + - Não coletado
33B Aguda Presente - + + Unha, Mucosa
34 Crônica Presente - + + Unha, Mucosa
35 Aguda Presente - + + Unha, Mucosa
36 Aguda Presente - + - Não coletado
37 Crônica Presente - + + Unha
38 Crônica Presente - + + Unha
Tabela 2- Dados gerais de 38 pacientes ATL diagnosticados na Bahia.
* Manifestação simultânea de ATL e HAM/TSP; (+) procedimento ou análise realizada; (-) procedimento ou análise
não realizada
53
4.2 Características clínicas da população estudada
As características clínicas dos 38 pacientes incluídos neste estudo estão
resumidas na tabela 3. Dezesseis pacientes foram inicialmente classificados com a
forma aguda (42,1%), 11 com a forma crônica (28,9%), 10 com a forma smoldering
(26,4%) e um com a forma linfomatosa (2,6%).
A manifestação simultânea de HAM/TSP e ATL foi verificada em seis casos
com forma smoldering e um paciente crônico, totalizando sete entre 38 pacientes
(18,4%). Vinte e seis pacientes (68,4%) apresentaram envolvimento cutâneo no
momento do diagnóstico.
Todos os casos smoldering analisados apresentavam lesões de pele e
cursavam com tipo não leucêmico, possuindo um percentual de células atípicas no
sangue periférico inferior a 5% e não apresentavam infiltração pulmonar no
momento do diagnóstico.
Os casos clínicos incluídos nesse estudo foram selecionados de uma coorte
de pacientes com ATL procedente de diferentes cidades do Estado da Bahia sendo
a maior parte desses indivíduos residentes da cidade de Salvador. Os critérios de
inclusão dos pacientes foram condicionados a aspectos inerentes às amostras
avaliadas e também à execução das técnicas propostas nesse estudo. A principal
limitação para a investigação de mutações pontuais foi a baixa percentagem de
células tumorais presentes no sangue periférico dos pacientes apresentando as
formas clínicas smoldering, linfomatosa e tumoral primária de pele, o que poderia
mascarar os resultados obtidos em função da predominância de células normais.
Devido a esse motivo no presente trabalho foi incluído maior número de casos com
formas crônica e aguda, pois nesses pacientes geralmente observa-se um elevado
número de linfócitos tumorais circulantes.
Para avaliação de alterações microssatélites, a principal dificuldade foi a
obtenção de amostras de tecido normal, uma vez que a maior parte dos indivíduos
pertencentes a coorte faleceu antes do inicio desta pesquisa. O fato de pacientes
com formas clínicas menos agressivas apresentarem maior tempo de sobrevida
propiciou uma maior facilidade na coleta de tecido normal para esses casos, o que é
refletido no maior número de pacientes com formas smoldering e crônica incluídos
nas análises de alterações microssatélites.
54
Para investigação de mutações pontuais nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A
foram incluídas 39 amostras de sangue proveniente de 31 pacientes. Inicialmente 16
casos foram classificados como agudos (52%), 10 casos como crônicos (32%) e
cinco casos como smoldering (16%). Os pacientes com formas crônica e aguda
analisados apresentavam linfocitose e as amostras de PBMC obtidas de pacientes
smoldering foram enriquecidas com células CD4+ por sorting celular (Tabela 2).
Nesta análise, adicionalmente foram incluídas nove amostras de cinco pacientes em
função da mudança de forma clínica (caso 33) ou pelo início de tratamento (casos 8,
11, 14, 19). O sexto paciente com amostras adicionais incluídas neste trabalho (caso
15), apresentou mudança da forma clínica smoldering para o tipo crônico. Devido ao
baixo número de linfócitos obtido no período smoldering, nesse paciente não pode
CARACTERÍSTICAS
nº de pacientes 38
Mediana de idade (variação, anos) 45 (19-89)
Forma clínica inical– nº (%)
Aguda 16 (42,1%)
Crônica 11 (28,9%)
Smoldering 10 (26,4%)
Linfomatosa 1 (2,6%)
Gênero – nº (%)
Masculino 20 (52,6%)
Feminino 18 (47,4%)
Associação com HAM/TSP 7 (18,4%)
Aguda 0 (0%)
Crônica 1 (2,6%)
Smoldering 6 (15,8%)
Linfomatosa 0 (0%)
Envolvimento de pele
Aguda 8 (21%)
Crônica 8 (21%)
Smoldering 10 (26,3%)
Total 26 (68,4%)
Tabela 3. Resumo das características clínicas de 38 pacientes ATL avaliados
quanto a presença de mutações pontuais e alterações microssatélites
55
ser realizado sorting celular e, portanto, somente foi avaliada mutação pontual
durante o período crônico (Tabela 2).
A análise de alterações microssatélite foi realizada em 25 pacientes dos quais
seis apresentavam forma aguda (24%), oito apresentavam forma crônica (32%), dez
apresentavam forma smoldering (40%) e um caso apresentava forma linfomatosa
(4%). Dois pacientes que apresentaram mudança de forma clínica (casos 15 e 33)
tiveram mais de uma amostra de sangue periférico coletada para análise de
alterações microssatélite nos diferentes períodos (Tabela 2).
Em 18 dos 38 pacientes incluídos nesse trabalho (44,7%) foram avaliadas
tanto mutações pontuais quanto alterações microssatélites (Tabela 2).
Em relação aos aspectos hematológicos, os 38 pacientes analisados nesse
estudo apresentaram em média 51,67x109 linfócitos por litro de sangue (Tabela 4).
Nos casos com forma aguda foi verificado maior número desse tipo celular com valor
médio de 82,81x109/L.
4.3 Marcação para separação celular (Sorting cell)
As amostras de PBMC dos pacientes smoldering foram marcadas com o
anticorpo monoclonal anti CD4+ (PE) (BD PharmingenTM) e incubadas no escuro por
30 minutos a 4ºC. Após a incubação, foi realizada lavagem das células em solução
PBS/BSA/Azida e em seguida centrifugou-se as mesmas durante 5 minutos a 1000
rpm e 4ºC. O pellet contendo as células foi ressuspendido em 2 mL de PBS 1X e
levado ao citômetro de fluxo FACSAriaTM (BD Biosciences) para a separação das
células positivas para CD4.
Forma clínica Número médio de linfócitos x 109 / Litro (95% IC)
Aguda 82,81 (42,82 - 122,80)
Crônica 21,41 (6,48 – 49,30)
Smoldering 3,04 (2,01 – 4,07)
Total 51,67 (26,45 – 76,90l)
Tabela 4- Número médio de linfócitos de acordo com a forma clínica de ATL
56
4.4 Extração de DNA de PBMC e tecido não tumoral
Para a extração do material genético das PBMCs, diferentes estratégias
foram estabelecidas de acordo com a forma clínica de cada paciente e com o
número de células tumorais presentes no sangue periférico. Nos pacientes com
formas clínicas aguda e crônica, a presença de elevada quantidade de células
tumorais circulantes permitiu que a extração de DNA ocorresse diretamente das
PBMCs e para isso, utilizou-se o kit Blood e Cell Culture DNA Midi (QIAGEN). Nos
pacientes com forma smoldering, a extração de DNA foi realizada a partir de material
enriquecimento com CD4+ utilizando o kit QIAamp DNA investigator (QIAGEN). As
células tumorais em pacientes com ATL são geralmente positivas para CD4 e
negativas para CD8 (Tamura et al., 1987). Entretanto, nem todas as células CD4
positivas em um paciente com ATL são necessariamente células tumorais (Tamura
et al., 1987; Sato et al., 2010). Portanto, o material genético extraído a partir de
amostras enriquecidas com células CD4+ possui predominância de DNA tumoral e
não exclusivamente DNA de células neoplásicas. A presença de 30% de células
tumorais é considerada suficiente para a avaliação de mutações pontuais por
seqüenciamento de DNA (Gonzalez-Cadavid, 1989).
O material obtido de unha, cabelo e mucosa oral foi tratado com proteinase K
e em seguida realizou-se extração de DNA através do kit QIAamp DNA investigator
(QIAGEN) seguindo as recomendações do fabricante.
O DNA extraído de diferentes tecidos foi quantificado utilizando o
equipamento NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do
fabricante. Valores da relação de absorbâncias a 260nm e 280nm (260/280)
próximos a 1,8 foram considerados satisfatórios para a pureza do DNA extraído.
57
4.5 Análise de mutações no gene TP53
4.5.1 Condições de amplificação
Partindo de 50 ng de DNA, foram amplificados por PCR 5 fragmentos
correspondentes aos éxons 4, 5-6, 7, 8 e 9 de TP53 (Tabela 5). A reação de
amplificação foi composta por tampão10X (Tris-HCl 200 M pH 8,4 e KCl 500 mM), 3
mM de MgCl2, 0,24 mM de cada dNTP, 0,15 μM de cada primer (senso e anti-senso)
e 1 unidade de Taq DNA polimerase. A PCR para os éxons de 4, 5-6, 7 e 8 ocorreu
em termociclador TC-3000 Techne (Barloworld Scientific, USA) com desnaturação
inicial a 95ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC
(desnaturação), 30 segundos em temperatura específica de cada primer
(hibridização) e 30 segundos a 72ºC (polimerização). A etapa de polimerização final
ocorreu a 72°C durante 5 minutos. Para o éxon 9, a amplificação seguiu as
seguintes etapas: desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos
de 60 segundos a 95ºC (desnaturação), 60 segundos a 65ºC (hibridização) e 120
segundos a 72ºC (polimerização). A etapa de polimerização final ocorreu a 72°C
durante 5 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de poliacrilamida
a 6%.
4.5.2 Purificação dos produtos de PCR
Alguns reagentes remanescentes ao final da PCR como primers e dNTPs
podem interferir no processo de seqüenciamento e por esse motivo, os fragmentos
amplificados foram purificados utilizando o kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN).
4.5.3 Seqüenciamento
O processo de seqüenciamento baseou-se no protocolo de terminação de
cadeia, também conhecido por método de Sanger (Sanger et al., 1977). A reação
para cada amostra seqüenciada foi constituída de 0,75 µL de tampão diluente, 1 µL
58
de BigDye® (Life Technologies), 0,5 µM de primer e 6,25 µL de DNA molde. As
condições de amplificação foram: desnaturação inicial a 96ºC por 1 minuto, 30 ciclos
de 15 segundos a 96ºC (desnaturação), 15 segundos a 50ºC (hibridização) e 4
minutos a 60ºC (polimerização).
Em cada poço contendo produto de seqüenciamento foi adicionado 40 µL de
isopropanol. Incubou-se por 30 minutos em temperatura ambiente para a
precipitação dos produtos de amplificação. Em seguida, centrifugou-se a placa por
45 minutos a 3600 rpm e descartou-se o sobrenadante. Posteriormente, adicionou-
se em cada poço 200 µL de etanol a 70% e centrifugou-se a placa por 20 minutos a
3600 rpm. Ao final, o sobrenadante foi descartado e o material precipitado foi
desidratado em temperatura ambiente por 30 minutos. As amostras foram
ressuspensas em 10 µL de formamida e desnaturadas a 95ºC por 5 minutos antes
de serem seqüenciadas no aparelho ABI 3100 (Applied Biosystems).
Os eletroferogramas obtidos após o sequenciamento foram editados
utilizando os programas BioEdit 7.0.9.0 e ChromasPro 2.33. Posteriormente, as
seqüências consensos dos contigs foram alinhadas utilizando a ferramenta de
bioinformática Clustal X.
4.6 Análise de mutações pontuais em p15INK4B
Para a análise do gene p15INK4B foram amplificados os éxons 1 e 2. As
reações de PCR foram composta por tampão10X (Tris-HCl 200 M pH 8,4 e KCl 500
mM), 2,4 mM de MgCl2, 0,24 mM de cada dNTP, 0,15 μM de ambos primers senso
e anti-senso (Tabela 5), 1 unidade de Taq DNA polimerase e 50ng de DNA
genômico. Para o éxon 1 a PCR foi composta das seguintes etapas: desnaturação
inicial a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC (desnaturação), 45
segundos a 57ºC (hibridização) e 60 segundos a 72ºC (polimerização). A
polimerização final foi realizada a 72°C durante 5 minutos. Para amplificação do
éxon 2 a PCR foi composta das seguintes etapas: desnaturação inicial a 95ºC por 5
minutos, 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC (desnaturação), 30 segundos a 61ºC
(hibridização) e 30 segundos a 72ºC (polimerização). A polimerização final foi
realizada a 72°C durante 5 minutos.
59
As condições para purificação dos produtos de amplificação, reações de
seqüenciamento e análise dos dados foram idênticas ao descrito para o gene TP53.
4.7 Análise de mutações pontuais em p16INK4A
Os éxons 1, 2 e 3 de p16INK4A foram amplificados utilizando os primers
descritos na tabela 5. As reações de PCR tiveram um volume final de 25 μL e foram
composta por tampão10X (Tris-HCl 200 M pH 8,4 e KCl 500 mM), 2,4 mM de MgCl2,
0,24 mM de cada dNTP, 0,15 μM de ambos primers senso e anti-senso, 1 unidade
de Taq DNA polimerase e 50ng de DNA genômico. Para o éxon 1, a PCR foi
composta das seguintes etapas: desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos
de 30 segundos a 95ºC (desnaturação), 30 segundos a 58ºC (hibridização) e 30
segundos a 72ºC (polimerização). A polimerização final foi realizada a 72°C durante
5 minutos. Para o éxon 2, a PCR foi composta das seguintes etapas: desnaturação
inicial a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC (desnaturação), 45
segundos a 56ºC (hibridização) e 60 segundos a 72ºC (polimerização). A
polimerização final foi realizada a 72°C durante 5 minutos. Para amplificação do
éxon 3 a PCR foi composta das seguintes etapas: desnaturação inicial a 95ºC por 5
minutos, 35 ciclos de 30 segundos a 95ºC (desnaturação), 45 segundos a 57ºC
(hibridização) e 60 segundos a 72ºC (polimerização). A polimerização final foi
realizada a 72°C durante 5 minutos.
As condições para purificação dos produtos de amplificação, reações de
seqüenciamento e analise dos dados foram idênticas ao descrito para o gene TP53.
60
Gene Éxon Primer Tamanho do
fragmento
TP53 4 5’-GACCTGCTCCTCTGACTGCT-3’ (sense)
5’-GCATTGAAGTCTCATGGAAG-3’ (anti-sense)
359pb
5-6 5’-TGCCGTGTTCCAGTTGCTTTATCT-3’ (sense)
5’-ACTGACAACCACCCTTAACCCCTCC-3’(anti-sense)
504pb
7 5’-TGCCACAGGTCTCCCCAAGG-3’ (sense)
5’-AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA-3’ (anti-sense)
235pb
8 5’-TGCCTCTTGCTTCTCTTTTCC-3’ (sense)
5’-TTACCTCGCTTAGTGCTCCCT-3’ (anti-sense)
174pb
9 5’-GG5´AGACCAAGGGTGCAGTTAT-3´(sense)
5-´GTTAGTTAGCTACAACCAGGAGCC-3´(anti-sense)
294pb
p15INK4B
1 5’-CCAGAAGCAATCCAGGCGCG-3’ (sense)
5’-AATGCACACCTCGCCAACG-3’ (anti-sense)
537pb
2 5’-CCCGGCCGGCATCTCCCATA-3’ (sense)
5’-CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT-3’ (anti-sense)
351pb
p16INK4A
1 5’-CGGAGAGGGGGAGAGCAG-3’ (sense)
5’-TCCCCTTTTTCCGGAGAATCG-3’ (anti-sense)
299pb
2 5´-GGCTCTGACCATTCTGT-3´ (sense)
5´-AGCTTTGGAAGCTCTCAG-3´ (anti-sense)
384pb
3 5’-TTTTCTTTCTGCCCTCTGCA-3’ (sense)
5’-TGAAGTCGACAGCTTCCG-3’ (anti-sense)
389pb
4.8 Avaliação de alterações microssatélites
Neste trabalho foi analisada a presença de alterações microssatélites nos
locos D10S190, D10S191, D11S1391 e D18S21 (DCC) que estão localizados nos
cromossomos 10, 11 e 18 respectivamente (Figura 19). Esses locos foram
previamente descritos como os marcadores com o maior número de instabilidades
em pacientes com formas graves da ATL no Japão (Hatta et al., 1998a) sendo por
isso selecionados para este estudo.
Tabela 5- Primers utilizados para a amplificação dos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A
61
A amplificação das seqüências microssatélite foi realizada utilizando tampão
10X (Tris-HCl 200 M pH 8,4 e KCl 500 mM), 1,5 mM de MgCl2, 0,20 mM de cada
dNTP, 0,50 μM de ambos primers senso e anti-senso, 0,5 unidade de Taq DNA
polimerase e 50ng de DNA genômico. As reações de PCR foram compostas das
seguintes etapas: desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos de 30
segundos a 95ºC (desnaturação), 30 segundos a temperatura específica de cada
primer (hibridização) e 60 segundos a 72ºC (polimerização). A polimerização final foi
realizada a 72°C durante 5 minutos.
Os primers utilizados para amplificação dos microssatélites foram marcados
com fluorescência em suas seqüências sense conforme indicado na tabela 6.
Figura 19. Localização cromossômica das seqüências microssatélites D10S190,
D10S191, D11S1391 e D18S21. Fonte: www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview
62
Marcador Primer TA Fluorescência
D10S190 5’- GTGTTTGGGTCATGGAGATG -3’ (sense)
5’- AGGCAAAGCAGGAGCA -3’ (anti-sense)
63ºC FAM
D10S191 5’- CTTTAATTGCCCTGTCTTC -3’ (sense)
5’- TTAATTCGACCACTTCCC -3’(anti-sense)
59ºC NED
D11S1391 5’- TGCATGCATACATACATACATACA -3’ (sense)
5’- CATCCATCCCTCTGTCTCTG -3’ (anti-sense)
58ºC VIC
D18S21 5’- GATGACATTTTCCCTCTAGA -3’ (sense)
5’- TTTAGTGGTTATTGCCTTGAA -3’ (anti-sense)
50ºC PET
Após a reação de PCR, 2 µL do produto de amplificação foi adicionado a uma
solução contendo 7,25 µL de formamida e 0,25 µL de marcador de peso molecular
(GeneScanTM 500 LIZ® - Applied Biosystems) e esse material foi então desnaturado
a 95º por 5 minutos e posteriormente colocado em gelo. A eletroforese dos
fragmentos microssatélite foi realizada em seqüenciador ABI 3100 e as análises dos
padrões de amplificação foram feitas com auxílio do programa Peak Scanner v1.0
(Applied Biosystems). As amostras contendo instabilidade microssatélite em mais de
um dos locos avaliados foram classificadas como MSI-H, os casos contendo
instabilidade em um único loco foram classificados com MSI-L e as amostras que
não apresentaram instabilidades foram consideradas MSS (Boland et al., 1998).
A avaliação de LOH foi realizada por metodologia semi-automatizada
baseada na intensidade do sinal de amplificação (Canzian et al., 1996). A razão
entre intensidade de amplificação de amostras de tecido normal e do PBMC foi
calculada de acordo com a seguinte equação:
)/()( 2112 ntnt aaaaL
Onde:
1na = Intensidade de amplificação do alelo 1 proveniente de DNA normal
1na = Intensidade de amplificação do alelo 2 proveniente de DNA normal
1ta = Intensidade de amplificação do alelo 1 proveniente de DNA tumoral
2ta = Intensidade de amplificação do alelo 2 proveniente de DNA tumoral
Valores de L < 0,6 ou L > 1,67, são sugestivo de desbalanço com redução
alélica superior a 40% resultando em LOH (Ramburan et al., 2004).
Tabela 6- Primers utilizados para a amplificação dos marcadores microssatélites
63
5 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Todos os pacientes avaliados concordaram em participar voluntariamente
desse projeto permitindo a coleta e criopreservação de amostras biológicas por meio
da assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Este estudo foi
aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário Professor Edgar Santos e
pelo comitê de ética em pesquisa do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz.
6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados obtidos nesse estudo foram planificados e analisados com auxílio
do programa GraphPad Prism v. 5.02. A comparação da freqüência de mutações
pontuais e alterações microssatélite entre os grupos foi realizada por meio do teste
exato de Fischer. A sobrevida dos pacientes analisados foi realizada utilizando o
método de Kaplan-Meier e as diferenças entre os grupos foi verificada pelo teste de
log-rank. A comparação dos dados entre dois grupos foi realizada por meio do teste
Mann-Whitney U. Valores de p≤0,05 foram considerados estatisticamente
significativos.
64
7 RESULTADOS
7.1 Avaliação de mutações pontuais em pacientes ATL
7.1.1 Separação de células (Cell Sorting)
Para análise de mutações pontuais nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A
foram incluídos 31 pacientes sendo 16 casos (52%) classificados agudos, dez casos
como crônicos (32%) e cinco casos como smoldering (16%). Todos os pacientes
agudos e crônicos analisados apresentavam linfocitose como mostrado nos
materiais e métodos (Tabela 2). As amostras de PBMC obtidas de pacientes
smoldering foram enriquecidas com células CD4+ por sorting celular.
Os resultados obtidos ao final desse processo foram considerados
satisfatórios para os cinco pacientes de forma smoldering incluídos e os níveis de
pureza de linfócitos CD4+ verificados após sorting variaram entre 66 e 97% (Figura
20; Tabela 7).
65
Pureza CD4+: 97%
A
Pureza CD4+: 66%
C
Pureza CD4+: 88%
D
Figura 20. Gráficos dot plot utilizados para separação de linfócitos CD4+ (P2) das células CD4-
(P3) em pacientes com forma smoldering da ATL diagnósticados na Bahia. (A) paciente 7, (B)
paciente 17, (C) paciente 23, (D) paciente 29, (E) paciente 30.
Pureza CD4+: 94%
B
Pureza CD4+: 96%
E
66
7.1.2 Freqüência de mutações pontuais no gene TP53
A freqüência de mutações pontuais observada em TP53 nos pacientes
avaliados na Bahia foi de 5/31 correspondendo a 16,1%. Quatro entre os cinco
pacientes com mutações nesse gene apresentavam a forma clínica aguda e um
caso portava a forma crônica.
Conforme observado na tabela 7, o paciente 2 apresentou mutação pontual
no códon 155 localizado no exon 5, no caso 6 foi identificada mutação no códon 282
situado no exon 8, os casos clínicos 8 e 16 apresentaram mutação no códon 248
localizado no exon 7 e no paciente 31 foi detectada mutação no códon 155 do exon
5. Nas regiões correspondentes aos éxons 4, 6 e 9 nenhuma alteração pontual foi
observada.
Em relação à seqüência nucleotídica dos códons alterados, verificou-se que
quatro das cinco (80%) mutações identificadas em TP53 estão localizadas em sítios
CpG (condons 181, 248, 282). Nessas mutações observou-se predominantemente
transições de nucleotídeos G:C → A:T. Estas alterações foram identificadas em três
pacientes agudos e um caso crônico. No códon 155, onde não há sítio CpG, foi
observada uma transversão do tipo G:C → T:A em um paciente portador de forma
aguda.
Conforme indicado na tabela 7, as alterações detectadas no gene TP53
restringiram-se exclusivamente à região responsável pela codificação do domínio de
ligação da proteína p53 a seqüências de DNA (Soussi e May, 1996; Joerger et al.,
2006).
Todas as mutações observadas foram do tipo missense, levando a
substituição de aminoácido na proteína. As alterações verificadas nos códons 248 e
282 levam a troca de arginina por triptofano, a mutação detectada no códon 181
proporciona a substituição de arginina por histidina e a alteração observada no
códon 155 induz a substituição de treonina por aspargina. Nenhuma dentre as
mutações detectadas levou ao surgimento de códons de parada responsável pelo
termino prematuro da síntese da proteína p53.
67
Paciente Forma Mutação Pureza
Sorting CD4+
Exon Códon Função do
domínio
Função do resíduo Alteração de
nucleotídeos
Substituição de
aminoácido
Efeito sobre a função
protéica
1 Aguda -
2 Aguda + 5 155 Ligação ao DNA Sítio de fosforilação ACC para AAC Treonina para Aspargina Não funcional
3 Aguda -
4 Aguda -
6 Aguda + 8 282 Ligação ao DNA Desconhecida CGG para TGG Arginina para Triptofano Não funcional
7 Smoldering - 97%
8 Aguda + 7 248 Ligação ao DNA Ligação ao DNA CGG para TGG Arginina para Triptofano Não funcional
10 Aguda -
11 Aguda -
12 Aguda -
14 Aguda -
15 Crônico -
16 Crônico + 7 248 Ligação ao DNA Ligação ao DNA CGG para TGG Arginina para Triptofano Não funcional
17 Smoldering - 94%
19 Crônico -
20 Crônico -
23 Smoldering - 66%
24 Crônico -
25 Aguda -
26 Crônico -
28 Aguda -
29 Smoldering - 88%
30 Smoldering - 96%
31 Aguda + 5 181 Ligação ao DNA Desconhecida CGC para CAC Arginina para Histidina Parcialmente Funcional
32 Aguda -
33 Crônica -
34 Crônica -
35 Aguda -
36 Aguda -
37 Crônica -
38 Crônica -
Tabela 7. Resumo das mutações em TP53 observadas em pacientes ATL
(+) presença de mutação; (-) ausência de mutação
68
7.1.2.1 Relação entre mutações no gene TP53 e dados clínicos dos pacientes
ATL
Devido ao fato de trabalhos publicados anteriormente demonstrarem menor
sobrevida de pacientes agudos em relação às demais forma clínicas (Bittencourt et
al., 2007a; Bittencourt et al., 2009) e levando-se em consideração que, quatro dentre
os cinco pacientes com mutações em TP53 verificados no presente estudo
possuíam forma clínica aguda, uma comparação do tempo de sobrevivência em
relação à presença de mutação em TP53 foi realizada somente nesse tipo clínico,
eliminando desse modo o viés de forma clínica.
Conforme mostrado na figura 21, os pacientes agudos apresentando
mutações em TP53 apresentaram menor sobrevida que os casos sem alteração
(P=0,047). A mediana de sobrevida dos pacientes positivos para mutações em TP53
foi três vezes inferior aos demais casos agudos.
O fato de apenas um paciente crônico apresentar mutação pontual em TP53
impossibilitou a realização de testes estatísticos para comparação do tempo de
sobrevida com os demais portadores dessa forma clínica. Contudo, pode-se verificar
que a sobrevida do paciente crônico apresentando mutação em TP53 foi de 32 dias
enquanto que a mediana do grupo crônico foi 300 dias.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Mutação TP53 (-)
Mutação TP53 (+)
Log-rankP=0.0471*
Dias após diagnóstico
So
bre
viv
ên
cia
Figura 21. Curva de sobrevivência em pacientes com forma aguda da ATL de acordo com a
presença de mutação no gene TP53.
69
7.1.3 Freqüência de mutações pontuais no gene p15INK4B
Os pacientes incluídos neste estudo não apresentaram mutações pontuais
nos éxons 1 ou 2 de p15INK4B.
7.1.4 Freqüência de mutações pontuais no gene p16INK4A
Nenhuma mutação foi verificada nos éxons 1 e 3 de p16INK4A. Contudo, em
um paciente apresentando forma aguda foi observada alteração no exon 2, códon
140. Esta alteração levou a substituição G:C → A:T e a troca de um aminoácido
alanina (GCG) por um aminoácido treonina (ACG) e aconteceu em um sitio CpG.
Em nenhum dos casos analisados foi constatado mais de uma mutação em
um mesmo gene ou alterações simultâneas nos diferentes genes estudados.
7.1.4.1 Relação entre mutações no gene p16INK4A e dados clínicos
O único paciente a apresentar alteração no gene p16INK4A portava forma
clínica aguda (caso 12) e teve uma sobrevida de apenas cinco dias após o
diagnóstico enquanto que a mediana de sobrevida dos pacientes agudos foi de 165
dias. Os parâmetros hematológicos revelaram uma acentuada linfocitose para esse
paciente (129x109 linfócitos por litro de sangue) sendo que a média e mediana para
a contagem de linfócitos em pacientes agudos foram respectivamente 82,81x109 e
60,41x109 células/L. Esse caso clínico também apresentou 24% de células atípicas
no sangue periférico dentre as quais 62% possuíam morfologia de “células em flor”.
7.1.5 Avaliação de mutações em amostras seqüenciais
Em quatro dos cinco pacientes (casos 11, 14, 19 e 33) que tiveram mais de
uma amostra incluída nas análises de mutação pontual não foram detectadas
alterações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A em nenhum dos períodos coletados.
Contudo, o quinto paciente (caso 8) com duas amostras seqüenciais incluídas
70
nessas análises apresentou mutação em TP53 em ambas as amostras coletadas em
um intervalo de tempo de quatro meses. No momento das duas coletas, esse caso
clínico apresentava forma aguda sendo que no primeiro momento o mesmo não
havia iniciado tratamento, e, na segunda coleta, o paciente havia passado por
quimioterapia.
Os resultados de amplificação e seqüenciamento de DNA para análise de
mutações pontuais da primeira amostra coletada do paciente 14 (forma aguda)
foram considerados satisfatórios para todos os genes investigados nesse estudo.
Entretanto, o DNA extraído da segunda amostra de sangue coletada não amplificou
para o éxon 1 do gene p15INK4B e para éxon 2 do gene p16INK4A. Esse segundo
material foi obtido um mês após a primeira coleta e o paciente manteve a forma
clínica aguda e já encontrava-se em tratamento com IFN-α mais AZT.
Neste estudo não foram observadas diferenças em relação à presença das
alterações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A e dados clínicos como idade de
diagnóstico, envolvimento cutâneo e presença simultânea de ATL e HAM/TSP.
7.2 Análise de instabilidade microssatélite (MSI)
Como detalhado anteriormente, nesse trabalho foram avaliados quatro
marcadores microsatélites (D10S190, D10S191, D11S1391 e D18S21) localizados
nos cromossomos 10, 11 e 18 respectivamente (Figura 19). Para esta análise foram
incluídos 25 pacientes com amostras tumoral e de tecido normal pareadas. Em
vários casos, mais de uma amostra normal foi incluída para um mesmo paciente
(Tabela 2).
Todas as amostras de tecido tumoral amplificaram para estes microsatélites,
entretanto, algumas amostras de tecido normal não apresentaram amplificação
satisfatória.
Quatro entre os 25 casos estudados apresentaram falhas na amplificação
pela PCR em um dos quatro locos estudados, impossibilitando a comparação com
tecido tumoral e conseqüentemente a análise de alteração nesses marcadores
(Tabela 8). Dois pacientes apresentaram falhas na amplificação em dois locos e um
paciente apresentou falha na amplificação em um único loco. Desse modo, para a
71
análise dos marcadores D10S190, D10S191, D11S1391 e D18S21 foram incluídos
22, 25, 22 e 25 pacientes respectivamente.
Presença de Instabilidade Microssatélite
Paciente D10S190 D10S191 D11S1391 D18S21 MSI-L MSI-H
Smoldering
5 - - NA + + -
7 - - - - - -
9 - - - - - -
15 - - - - - -
17 - - - - - -
18 + - - - + -
23 - - - - - -
27 - + - - + -
29 - - - - - -
30 - - - - - -
Crônico
13 - - - - - -
16 NA - NA - - -
19 - - - - - -
21 - - - - - -
24 - - + + - +
34 NA - - - - -
37 - - - - - -
38 - - - - - -
Agudo
11 NA - NA - - -
28 - - - - - -
31 - - - - - -
32 - - - - - -
33 - - - - - -
35 - - - - - -
Linfomatoso
22 - - - - - -
Tabela 8- Freqüência de instabilidade microssatélite em pacientes ATL diagnosticados na Bahia.
(-) negativo para MSI; (+) positivo para MSI; (NA) ausência de amplificação na amostra normal com amplificação da amostra
tumoral
72
As figuras 22A, 23A, 24A e 25A mostram padrões de amplificação
microssatélites idênticos em amostras de PBMC e tecido normal de pacientes sem
alterações nos quatro marcadores avaliados.
A comparação do padrão de amplificação da amostra tumoral (PBMC) em
relação ao tecido normal nos casos clínicos 18 e 27 indica a presença MSI em
função de deleções de bases dentro dos locos D10S190 e D10S191 (Figuras 22B e
23B). Na figura 24B é possível observar instabilidade para D11S1391 no paciente 24
pela presença de um padrão trialélico. Dois dos alelos observados no tecido tumoral
possuem o mesmo tamanho dos alelos verificados no tecido normal. O terceiro alelo
observado na amostra tumoral possui maior tamanho em relação aos outros alelos
observados nesse paciente devido à inserção de bases. A alteração do padrão de
amplificação para o marcador D18S21 no caso clínico 5 pode ser observada na
figura 25B em função da inserção de base em um dos alelos na amostra tumoral.
73
PBMC
Tecido Normal
(Unha)
A
Tecido Tumoral
(PBMC)
Tecido Normal
(Unha)
B
Figura 22. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D10S190. (A) Paciente sem Instabilidade microssatélite - MSI (caso 15)
apresentando mesmo padrão de amplificação na amostra de PBMC e tecido normal. (B) Paciente com MSI (caso 18) apresentando
alteração do padrão de amplificação de amostra do PBMC em relação ao tecido normal. Seta indica instabilidade alélica.
74
A
Tecido Normal
(Mucosa oral)
B
Tecido Normal
(Unha)
Figura 23. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D10S191. (A) Paciente sem Instabilidade microssatélite - MSI (caso 32)
apresentando mesmo padrão de amplificação na amostra de PBMC e tecido normal. (B) Paciente com MSI (caso 27) apresentando
alteração do padrão de amplificação de amostra do PBMC em relação ao tecido normal. Seta indica instabilidade alélica.
PBMC
Tecido Normal
(Mucosa oral)
Tecido Normal
(Unha)
Tecido Tumoral
(PBMC)
75
Figura 24. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D11S1391. (A) Paciente sem Instabilidade microssatélite - MSI (caso 29)
apresentando mesmo padrão de amplificação na amostra de PBMC e tecido normal. (B) Paciente com MSI (caso 24) apresentando
alteração do padrão de amplificação de amostra do PBMC em relação ao tecido normal. Seta indica instabilidade alélica.
A
PBMC
Tecido Normal
(Mucosa oral)
Tecido Normal
(Unha)
Tecido Normal
(Unha)
B
Tecido Tumoral
(PBMC)
76
A
Figura 25. Eletroferograma mostrando amplificação do loco D11S1391. (A) Paciente sem Instabilidade microssatélite - MSI (caso 32) apresentando mesmo padrão de
amplificação na amostra de PBMC e tecido normal. (B) Paciente com MSI (caso 5) apresentando alteração do padrão de amplificação de amostra do PBMC em relação ao
tecido normal. Seta indica instabilidade alélica.
PBMC
Tecido Normal
(Unha)
B
Tecido Normal
(Unha)
Tecido Tumoral
(PBMC)
77
Em relação à freqüência de MSI, pôde-se observar que quatro entre os 25
casos analisados (16%) apresentaram instabilidades em pelo menos um dos locos
avaliados (Tabela 8 e Figuras 22 a 25). Três pacientes (casos 1, 18 e 27) foram
classificados com MSI-L para os locos analisados e um paciente (caso 24)
apresentou instabilidade em dois marcadores sendo classificado como MSI-H para
os locos avaliados.
Conforme constatado na tabela 8, os quatros marcadores estudados
apresentaram instabilidade em pelo menos um dos pacientes incluidos. No loco
D18S21 foram observadas MSI em dois pacientes e os demais marcadores
apresentaram-se instáveis, uma única vez, em distintos pacientes.
Três entre dez (30%) pacientes com forma clínica smoldering apresentaram
instabilidades. Na forma crônica, detectou-se em um dos pacientes (caso 24) a
presença de MSI em mais de um loco microssatélite sendo esse caso classificado
como MSI-H (14,3%). Esse paciente, um mês após a coleta, passou a apresentar
forma aguda.
Nos casos clínicos 15 e 33, que apresentaram mudança de forma clínica, não
foram observadas MSI em nenhuma das amostras consecutivas coletadas, levando-
se em consideração apenas os locos com amplificação de tecido normal e tumoral.
O paciente com forma linfomatosa não apresentou MSI em nenhum dos
quatro locos avaliados e os pacientes com clínica aguda também não apresentaram
instabilidades nos marcadores amplificados.
7.3 Análise de perda de heterozigosidade (LOH)
Exemplos de casos informativos e não informativos observados durante a
análise de LOH neste trabalho são mostrados na Figura 26.
78
Figura 26- Eletroferogramas utilizados para análise de perda de heterozigosidade (LOH). (A) Caso informativo para o marcador
D11S13191 (heterozigoto), (B) Caso não informativo para o marcador D18S21 (homozigoto), (C-F) Casos 5, 16, 17 e 32
apresentando LOH. As setas indicam alelos com LOH.
LOH
Tecido Normal
PBMC
Tecido Normal
PBMC
A
B
C
D
E
F
79
Na tabela 9 são descritos os casos informativos (aqueles que apresentam
heterozigosidade para o marcador microssatélite avaliado sem instabilidade) em
relação aos casos totais analisados para cada marcador. É importante salientar que
dos 25 pacientes incluídos, alguns casos não foram analisados para algum dos
locos por impossibilidade de amplificação do tecido normal e por isto justifica-se que
o número que casos totais seja para alguns microssatélites inferior a 25.
Os marcadores utilizados nesse estudo apresentaram uma percentagem de
casos informativos (pacientes heterozigotos sem MSI) variando entre 80% e 32%
(Tabela 9).
Todos os casos apresentaram heterozigose na amostra oriunda de tecido
normal (heterozigoto constitucional) em pelo menos um dos locos microssatélite
sendo que os casos 7, 19 e 22 foram considerados heterozigotos constitucionais
para os quatro locos avaliados (Tabela 10). Em oito dos 25 pacientes a falha na
amplificação do DNA obtido de tecido normal impossibilitou a análise de LOH em
pelo menos um dos microssatélites. A presença de apenas um alelo no loco D18S21
foi observada em 17 dos casos analisados, o que permitiu classificar-los como
homozigotos constitucionais. Nessas situações também não foi possível avaliar
LOH. Posteriormente, avaliou-se dentro dos casos informativos para cada marcador
microssatélite aqueles pacientes que apresentaram LOH (Tabela 10).
D10S190 D10S191 D11S1391 D18S21
Freqüência de LOH (%) 1/11 (9,0) 3/20 (15,0) 0/15 (0,0) 1/8 (12,5)
Informatividade (%) 11/22 (58,8) 20/25 (80,0) 15/22 (68,2) 8/25 (32,0)
Tabela 9. Freqüência de LOH e informativiade dos marcadores microssatélites em pacientes ATL
80
Considerando-se os casos com amplificação de DNA oriundo tanto de tecido
tumoral quanto normal, a presença de LOH em pelo menos dos locos analisados foi
observada em quatro casos dos 25 pacientes ATL avaliados nesse estudo (Figura
26). O loco D10S191 apresentou LOH em três pacientes enquanto que os locos
D10S190 e D18S21 apresentaram LOH em um paciente (Tabela 10).
Em relação às diferentes formas clínicas, foi verificada presença de LOH em
dois dos dez dos pacientes smoldering, em um dos oito casos crônicos e em um dos
Paciente Forma clínica D10S190 D10S191 D11S1391 D18S21
5 Smoldering 1 LOH NA 1
7 Smoldering 2 2 2 2
9 Smoldering 1 2 2 1
15 Smoldering 2 2 1 1
17 Smoldering LOH 1 1 2
18 Smoldering 1 2 2 1
23 Smoldering 1 2 2 2
27 Smoldering 2 1 1 1
29 Smoldering 2 2 2 1
30 Smoldering 1 2 2 2
13 Crônica 1 2 2 1
16 Crônica NA LOH NA LOH
19 Crônica 2 2 2 2
21 Crônica 2 2 2 1
24 Crônica 1 2 1 1
34 Crônica NA 2 2 1
37 Crônica 2 2 2 1
38 Crônica 1 2 2 1
11 Aguda NA 1 NA 2
28 Aguda 2 2 1 1
31 Aguda 2 1 2 1
32 Aguda 1 LOH 1 1
33 Aguda 1 2 1 1
35 Aguda 1 1 2 1
22 Linfomatosa 2 2 2 2
Tabela 10- Avaliação de LOH em pacientes ATL diagnosticados na Bahia
(1) Homozigoto constitucional ou não informativo; (2) Heterozigoto constitucional
com manutenção de ambos os alelos no PBMC; (LOH) Heterozigoto constitucional
com perda de um dos alelos no PBMC; (NA) ausência de amplificação por PCR
81
seis casos agudos (Tabela 10). Embora o caso linfomatoso analisado nesse trabalho
tenha apresentado informatividade (heterozigoze constitucional) em todos os locos
avaliados, nenhum padrão de LOH foi detectado nesse paciente.
7.4 Freqüência de alterações microssatélites (MSI e LOH)
Alterações microssatélites (MSI e/ou LOH) foram constatadas em sete dos 25
pacientes analisados (Figura 27).
Paciente
Forma Clínica
Marcador
D10S190 D10S191 D11S1391 D18S21
5 Smoldering LOH MSI
7 Smoldering
9 Smoldering
15 Smoldering
17 Smoldering LOH
18 Smoldering MSI
23 Smoldering
27 Smoldering MSI
29 Smoldering
30 Smoldering
13 Crônica
16 Crônica LOH LOH
19 Crônica
21 Crônica
24 Crônica MSI MSI
34 Crônica
37 Crônica
38 Crônica
11 Aguda
28 Aguda
31 Aguda
32 Aguda LOH
33 Aguda
35 Aguda
22 Linfomatosa
Figura 27- Distribuição de alterações microssatélites nos locos D10S191, D10S191,
D11S1391 e DCC em pacientes ATL diagnosticados na Bahia. LOH - perda de
heterozigosidade. MSI – instabilidade microssatélite.
82
Em todos os locos estudados foi possível detectar a presença tanto de MSI
quanto LOH, com exceção do marcador D11S1391, onde houve a constatação
exclusivamente de MSI (Figura 27). No loco D10S191 foram observadas alterações
microssatélites em quatro pacientes.
Quatro entre os dez pacientes com forma smoldering apresentaram MSI e/ou
LOH. Somente em um paciente (caso 5 - forma smoldering) foram observadas
ambas alterações simultaneamente, sendo que a LOH foi detectada no loco
D10S191 e a MSI no loco D18S21.
Não foram observadas diferenças estatísticas em relação à presença de MSI
ou LOH com dados clínicos como tempo de sobreviva, idade do diagnóstico,
envolvimento cutâneo e presença simultânea de ATL e HAM/TSP.
83
8 DISCUSSÃO
No presente trabalho foram avaliadas a presença e os efeitos de mutações
pontuais em importantes genes supressores de tumor como TP53, p15INK4B e p16INK4
em pacientes com diferentes formas clínicas da ATL. Adicionalmente, também foram
analisadas instabilidades genômicas nas células tumorais de pacientes com essa
enfermidade utilizando marcadores microssatélites.
Trinta e oito pacientes apresentando quatro das cinco formas clínicas
descritas para ATL foram incluídos neste estudo, porém, a representatividade das
formas clínicas foi diferente da reportada na Bahia pelo nosso grupo (Bittencourt et
al., 2007a), onde os tipos agudo, crônico, smoldering, linfomatoso e tumoral primário
de pele representaram respectivamente 27%, 14%, 27%, 24% e 7% dos casos
analisados. A presente pesquisa foi composta por amostra de conveniência sendo
esta determinada pelas limitações das análises propostas. Para a avaliação de
mutações pontuais há necessidade de uma percentagem elevada de células
tumorais na amostra analisada para que as células normais não mascarem os
resultados. Os pacientes com forma aguda e crônica apresentam elevado número
de linfócitos tumorais circulantes enquanto que nas formas smoldering, linfomatosa e
tumoral primária a quantidade de linfócitos tumorais no sangue periférico é baixa.
Desse modo, foi incluído maior número de casos agudo e crônico nas análises de
mutações pontuais. Adicionalmente, para esse tipo de investigação conseguimos
incluir cinco pacientes de forma smoldering onde foi possível realizar sorting celular
para enriquecimento da amostra em função do grande número de linfócitos obtidos a
partir do sangue periférico coletado. Durante a realização desse trabalho não
conseguimos incluir mais pacientes com formas smoldering, linfomatoso e tumoral
primário devido à escassez de células tumorais circulantes observada nesses
pacientes, sendo este um limitante das análises de mutações pontuais e o principal
motivo pela menor proporção de pacientes apresentando essas formas nesse tipo
de avaliação.
Em relação à proporção das formas clínicas incluídas nas análises de
alterações microssatélites, a maior freqüência de formas smoldering e crônica (40%
e 32% respectivamente) e menor proporção de pacientes com a forma clínica aguda,
linfoma e tumoral primária de pele foi influenciada pelo fato de ter-se iniciado a
coleta de amostras normais recentemente. Sendo assim, os casos mais antigos
84
destas formas clinicas já haviam falecido, não sendo possível a coleta de novo
material. Por outro lado, não foi incluído nenhum paciente da forma tumoral primaria
por não termos tecido fresco ou criopreservado das lesões tumorais da pele. No
futuro, temos como perspectiva aumentar o número amostral do estudo e tentar
aproximar a distribuição dos pacientes incluídos com o reportado para a ATL na
Bahia.
A associação entre ATL e HAM/TSP observada em 18,4% dos casos
avaliados neste trabalho é similar à observada por estudos prévios realizados na
Bahia, onde esses percentuais variaram entre 14 e 19% (Bittencourt et al., 2007a;
Bittencourt et al., 2009). Assim como nos trabalhos citados, a verificação simultânea
de ATL e HAM/TSP parece ser mais freqüente nas formas smoldering e crônica da
ATL. Diferentemente do observado na Bahia, a presença concomitante de ambas as
enfermidades associadas ao HTLV-1 é um evento raro no Japão, onde os principais
relatos foram feitos na forma linfomatosa da ATL (Tamiya et al., 1995). Nenhuma
relação foi verificada entre presença simultânea de HAM/TSP e ATL com as
alterações genéticas avaliadas no presente trabalho.
A presença de envolvimento cutâneo em 68,4% é similar aos 67%
observados por Bittencourt et al. (2007) e se deve provavelmente a inclusão de uma
considerável proporção de portadores das formas crônica e smoldering. Este
parâmetro clínico também não foi associado à presença de alterações genéticas.
8.1 Análise de mutações no gene TP53
A freqüência de mutações pontuais em TP53 constatada em pacientes com
ATL na Bahia, que foi de 16,1%, encontra-se dentro das freqüências descritas em
outras regiões endêmicas para essa doença, onde esses valores variaram entre 6 e
50% (Sugito et al., 1991; Sakashita et al., 1992). O maior número de alterações em
TP53 observada na forma aguda da ATL é consistente com os resultados obtidos
em pesquisas prévias incluindo casos agudos e crônicos, mostrando similares
freqüências para mutação nesse gene na forma aguda (Nagai et al., 1991;
Nishimura et al., 1995). Este trabalho também contribui com a literatura pela inclusão
do maior número de pacientes com forma smoldering, um total de cinco casos. Na
85
literatura existe um único trabalho que incluiu somente um paciente com forma
smoldering e, como observado na Bahia, não foi verificada nenhuma alteração no
TP53 (Sugito et al., 1991).
Levando-se em consideração o tempo de sobrevida, a constatação de uma
significativa redução desse parâmetro nos casos agudos portando mutações no
gene TP53 em comparação aos demais pacientes desse mesmo tipo clínico, sugere
que a inativação desse gene por mutação pontual pode ser um possível fator de pior
prognóstico da ATL na Bahia. Trabalhos realizados no Japão também têm buscado
relacionar alterações em TP53 aos fatores prognósticos da ATL. Nishimura et al.
(1995), analisando a influência de alterações (mutações/LOH) em TP53 em relação
ao tempo de sobrevida, verificou mediana de sobrevida de três meses para
pacientes com alterações em TP53 enquanto que nos casos sem anomalias nesse
gene a sobrevida mediana foi de 18 meses. Entretanto, diferente do observado no
nosso trabalho, esta relação não foi estatisticamente significante nos pacientes com
formas graves de ATL. Na Bahia, o valor da mediana de sobrevida dos pacientes
agudos foi de dois meses para os casos com mutação em TP53 e de seis meses
para os demais casos dessa forma clínica.
Provavelmente devido ao limitado número amostral, nenhuma diferença
significativa foi observada entre a presença de mutação em TP53 e número de
linfócitos circulantes em pacientes apresentando a forma aguda da ATL.
A presença de mutação pontual no gene TP53 em um dentre os dez (10%)
pacientes crônicos incluídos no presente trabalho é similar às freqüências
reportadas em outros estudos, onde esses valores oscilaram entre 6 e 15%
(Nishimura et al., 1995; Tawara et al., 2006). O menor tempo de sobrevida do
paciente crônico (caso 16) com mutação TP53 nesse trabalho, que foi
aproximadamente dez vezes inferior à mediana de sobrevida dos demais casos
crônicos, sugere que esse tipo de alteração pode ser um possível fator de pior
prognostico também para esta forma clínica, como observado na forma aguda.
Comparando-se a freqüência de mutações observadas em TP53 no trabalho
com alguns tumores sólidos humanos, pôde-se perceber que a presença desse tipo
de alteração em 16,1% dos pacientes ATL na Bahia foi inferior às percentagens
previamente descritas para esse gene em carcinoma de células escamosas de
cabeça e pescoço (53%), câncer colorretal (29%), câncer de pâncreas (33%),
displasia endometrial glandular (43%) e carcinoma intraepitelial endometrial seroso
86
(72%) (Poeta et al., 2007; Iacopetta et al., 2006; Casey et al., 1993; Jia et al., 2008).
Contudo, em outras neoplasias, a inativação de TP53 por mutação parece ter menor
participação no desenvolvimento tumoral como relatado em trabalhos com câncer de
mama (4%), gliomas (14%) e tumores de próstata (4%) (Lalloo et al., 2006; Rasheed
et al., 1994; Agell et al., 2008). Em relação às neoplasias do sistema hematopoiético,
os registros do banco de dados da International Agency for Research on Cancer
(IARC), indicam uma freqüência de mutação em TP53 de 11%, considerada similar à
verificada no presente trabalho. Segundo Petitjean et al. (2007), os principais
motivos relacionados à variação da freqüência dessas mutações em diferentes
neoplasias seriam o tipo, o estágio ou a etiologia do tumor.
Todas a mutações observadas no gene TP53 em pacientes com ATL
diagnosticados na Bahia situaram-se na região compreendida entre os éxons 5 e 8.
Aproximadamente 86% das mutações descritas em neoplasias humanas encontram-
se nesses éxons (Olivier et al., 2010). A inclusão dos exons 4 e 9 neste estudo
reduziu a possibilidade de subestimação da freqüência de alterações nos pacientes
analisados.
Dois entre os quatro códons alterados nesse estudo (códon 248 e 282) estão
freqüentemente mutados em tumores humanos e juntamente com os códons 175,
245, 249 e 273 formam os chamados hotspots (Soussi et al., 2006). Cerca de 30%
de todas as mutações descritas em TP53 estão localizadas nessas seis regiões
(Petitjean et al., 2007).
A presença de mutações no códon 248 observadas em dois pacientes
incluídos neste estudo sugere que esse deve ser um importante ponto de
investigação na ATL. As substituições de nucleotídeos nesse códon são
classificadas como mutações de contato, pois, interferem diretamente na interação
da proteína p53 com seqüências do DNA, inativando funcionalmente essa via de
supressão tumoral (Joerger et al., 2006). Embora nesse trabalho, devido ao limitado
número amostral, não tenha sido possível comparar a linfocitose entre os pacientes
apresentando diferentes mutações em TP53, uma análise in vitro da atividade
oncogênica de distintas mutações de TP53 em diferentes linhagens celulares com
leucemia linfoblástica aguda (ALL-T) constatou que as células com mutação no
códon 248 induziam um forte aumento da atividade proliferativa em relação a células
com mutações em outros códons (Hsiao et al., 1994). Neste mesmo estudo, ensaios
in vivo mostraram que camundongos transplantados com células contendo a
87
mutação no códon 248 de TP53 apresentavam maior capacidade de disseminação,
proliferação e desenvolvimento de doença hematológica. Talvez a presença de
mutação no códon 248 observada no presente estudo possa ser importante para
uma maior agressividade da ATL, o que também parece ocorrer no Japão
(Nishimura et al., 1995).
A mutação no hotspot 282 observada em um paciente com forma aguda da
ATL é responsável por alterações estruturais da proteína p53 inviabilizando a ligação
da mesma a seqüências de DNA, o que também resulta na perda de função
supressora de tumor executada por essa proteína (Joerger et al., 2006). Perego et
al. (1996) analisando linhagens celulares de câncer de ovário verificaram uma
possível associação entre resistência à apoptose induzida por cisplatina com a
presença de mutação no códon 282 e conseqüente redução da expressão do RNAm
do gene bax. O presente trabalho parece descrever pela primeira vez a presença de
mutação pontual no códon 282 e estudos futuros devem ser realizados na ATL para
verificar os efeitos da mutação nesse códon sobre a sobrevida celular e a resistência
à apoptose. As alterações nos códons 155 e 181 observadas em dois casos com
ATL parecem não ser freqüentes em neoplasias humanas e são também descritas
pela primeira vez em pacientes com ATL.
Todas as mutações observadas neste estudo levaram a substituição de um
aminoácido na proteína p53 (mutação tipo missense) provocando em todos os casos
uma inibição completa ou parcial da atividade dessa proteína (Kato et al., 2003).
Em relação à seqüência dos nucleotídeos alterados e o tipo de substituição,
os dados obtidos nesse trabalho evidenciam um tendência a transições em regiões
sítios CpG do gene TP53 nos pacientes analisados. Segundo Soussi e Beroud
(2003), 51% de todas as mutações pontuais descritas em TP53 são transições, das
quais 59% situam-se entre os 42 sítios CpG presentes nesse gene. Tawara et al.
(2006) verificaram que mais de 30% das mutações em TP53 observadas em
pacientes ATL no Japão localizavam-se em seqüencias CpG.
Em células normais de mamíferos, as citosinas presentes nos sítios CpG
freqüentemente encontram-se metiladas e são denominadas de 5-metilcitosinas. Na
presença de alguns compostos carcinogênicos, a 5-metilcitosina pode sofrer
desaminação gerando uma timina (Staib et al., 2003). Trabalhos realizados em
pacientes com câncer de pulmão e cólon, observaram associação entre expressão e
atividade da enzima iNOS (óxido nítrico sintase) e mutações do tipo transição G:C →
88
A:T em sitos CpG do gene TP53 (Ambs et al., 1998; Ambs et al., 1999). Em relação
à ATL, algumas pesquisas têm mostrado uma superexpressão do gene iNOS em
células positivas para o HTLV-1, expressando a proteína Tax em comparação com
linhagens celulares não infectada por este vírus (Mori et al., 1999; Sonoki et al.,
1999). Estes mesmos estudos também detectaram expressão de RNAm para iNOS
e Tax em pacientes apresentando formas aguda e crônica de ATL, sugerindo que o
gene iNOS possa desempenhar algum papel na oncogênese mediada pelo HTLV-1.
Portanto, um possível mecanismo responsável pela geração de mutação na maior
parte dos pacientes estudados na Bahia poderia ser a desaminação de
metilcitosinas pela elevação da síntese de iNOS. Pesquisas futuras devem ser
realizadas para confirmação dessa hipótese.
8.2 Análise de mutações no gene p15INK4B e p16INK4A
A ausência de mutações pontuais em p15INK4B observadas neste trabalho
sugere que esse seja um mecanismo infrequente de inativação desse gene em
pacientes com ATL e corrobora com Hatta et al. (1995), que de igual modo,
verificaram a inexistência de mutações pontuais em p15INK4B em 37 pacientes ATL
(23 agudos e 14 cronicos). Embora o presente trabalho não tenha identificado
mutações em p15INK4B, pesquisas deixam evidente a importância da inativação
desse gene por outros mecanismos como deleção ou hipermetilação no
desenvolvimento de formas graves de ATL (Hatta et al., 1995; Hangaishi et al., 1996;
Yamada et al., 1997; Hofmann et al., 2001).
Dentre todos os pacientes incluídos neste trabalho, apenas o caso 12,
portador de forma aguda, apresentou substituição de nucleotídeo no gene p16INK4A.
A transição G:C → A:T observada neste paciente está localizada no códon 140 e
leva a substituição do aminoácido arginina por treonina. Inicialmente essa alteração
foi descrita em literatura como uma mutação pontual (Kamb et al., 1994), entretanto,
posteriormente passou a ser considerada um polimorfismo (Sato et al., 1996). No
presente trabalho não é possível definir se a alteração observada no gene p16INK4A é
uma variante alélica polimórfica ou mutação devido ao fato de não termos acesso ao
material biológico não tumoral desse paciente para fins de comparação. De maneira
interessante, esta alteração envolve transição G:C → A:T em um sítio CpG idêntico
89
ao observado em 80% das mutações detectadas no gene TP53 nos pacientes
incluídos neste estudo, podendo ter surgido pelo mesmo mecanismo possivelmente
envolvido nas mutações de TP53 observadas anteriormente.
O caso 12 apresentou o menor tempo de sobrevida entre todos os casos
agudos e acentuada linfocitose com a presença de uma considerável percentagem
de células em flor (62%). Na literatura são escassos os trabalhos relacionando esta
alteração de p16INK4A com fatores prognósticos em câncer. Em um desses trabalhos,
Berns et al. (1995) constataram não haver diferença na sobrevida de pacientes com
essa alteração comparados a portadores do alelo selvagem em câncer de mama. Na
ATL não existem relatos sobre os efeitos dessa alteração sobre essa neoplasia
sendo, portanto, tema em potencial a ser explorado.
Diversos trabalhos têm evidenciado que a inativação dos genes p15INK4B e
p16INK4A pode ser fundamental para o desenvolvimento de tumores humanos (Attri et
al., 2005; Sato et al., 2010). Em câncer de esôfago, pâncreas e pulmão os genes
p15INK4B e p16INK4A são freqüentemente inativados por mutações pontuais (Caldas et
al., 1994) enquanto que, em melanomas, tumores do sistema nervoso e neoplasias
hematológicas as deleções dessas regiões parecem ser recursos importantes para a
desestabilização de ambos os genes (Cachia et al., 2000; Huang et al., 2005; Kim et
al., 2009). A inativação de p15INK4B e p16INK4A por hipermetilação de seqüências
promotoras parece estar freqüentemente associada ao desenvolvimento de diversas
tumores humanos como os cânceres de mama, próstata, cólon e renal (Herman et
al., 1995; Rocco e Sidransky, 2001). Na ATL, estudos prévios realizados no Japão
têm reportado os três mecanismos acima citados na inativação de p15INK4B e/ou
p16INK4A (Uchida et al., 1996; Takasaki et al., 2003; Sato et al., 2010). Os dados
obtidos no presente trabalho são suficientes apenas para inferir sobre a freqüência
de um dentre os eventos relacionados com inativação de p15INK4B e p16INK4A, sendo
necessárias pesquisas incluindo diferentes mecanismos de inativação para melhor
entendimento de uma possível supressão desses genes e suas conseqüências
clínicas em pacientes de ATL.
Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que não há sobreposições de
mutações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A nos pacientes de ATL avaliados. Na
literatura não temos conhecimentos de relatos de trabalhos estudando mutações
pontuais nesses três genes simultaneamente. Na ATL, existem alguns estudos
avaliando mutação pontual de TP53 juntamente com deleção dos genes p15INK4B
90
e/ou p16INK4A (Furukawa et al., 2006; Tawara et al., 2006). Assim como no presente
estudo, nenhum desses trabalhos demonstrou alterações simultâneas no gene TP53
e p15INK4B ou p16INK4A. Esses genes supressores de tumor participam de vias cujo
objetivo final converge no bloqueio da fosforilação da proteína Rb (retinoblastoma)
impedindo a progressão do ciclo celular. Sendo assim, acredita-se que qualquer
alteração em TP53 ou p15INK4B/p16INK4A seria suficientemente danosa ao ponto de
provocar um desequilíbrio no processo de proliferação celular e estabelecimento da
neoplasia na ATL (Yamada e Kamihira, 2005, Tawara et al., 2006). Em outros
tumores humanos como câncer de esôfago (Gonzalez et al., 1997), células
escamosas da cavidade oral (Lazarus et al., 1998), astrocitomas (Tsuzuki et al.,
1996), sarcomas de Ewing (Huang et al., 2005), um número maior de eventos
parece ser importante para o processo de oncogênese, sendo possível verificar a
presença de alterações simultâneas em TP53 e p16INK4A em algumas situações.
Os trabalhos sobre alterações em outros genes reguladores do ciclo celular
como p27KIP1, retinoblastoma e E2F4 têm mostrado que, embora pouco freqüentes,
essas alterações também podem participar da oncogênese mediada pelo HTLV-1
(Morosetti et al., 1995; Hatta et al., 1997; Komatsu et al., 2000). Diante desse
contexto, se faz necessário uma análise incluindo maior número de potenciais genes
envolvidos no desenvolvimento da ATL. De igual modo, é importante a realização de
outros estudos que também incluam formas smoldering que é a forma menos
estudada neste sentido.
8.3 Avaliação de mutações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A em amostras
seqüenciais
A análise de mutações nos genes TP53, p15INK4B e p16INK4A em amostras
seqüenciais evidenciou não haver alteração do status mutacional desses genes em
função da alteração de forma clínica ou início de tratamento. Em um dos pacientes
(caso 8) avaliados antes e depois do tratamento, foi observada mutação do gene
TP53 nas duas amostras. O paciente foi a óbito um mês após a realização da
segunda coleta, sugerindo que o tratamento não foi eficaz na eliminação desse
clone tumoral.
91
Outro achado interessante nesse trabalho foi a ausência de amplificação do
exon 1 de p15INK4B e do exon 2 de p16INK4A em uma das duas amostra coletada num
dos pacientes agudos (caso 14). Na primeira amostra, todos os éxons dos três
genes avaliados foram amplificados e não apresentaram mutações. Entretanto, a
ausência de amplificação na segunda amostra, obtida um mês após a primeira
coleta e durante tratamento com AZT mais IFN-α, pode indicar uma possível deleção
das regiões não amplificadas. Para a confirmação dessa hipótese se faz necessário
o emprego de técnicas especificas como Southern blot ou PCR quantitativa em
tempo real.
8.4 Vantagens da análise de mutações por seqüenciamento direto
A técnica de seqüenciamento de DNA utilizada nesse trabalho é considerada
o método mais confiável para avaliação de mutações pontuais em tumores humanos
(Greenblatt et al., 1994). Embora a técnica de SSCP seja consagrada e amplamente
utilizada para identificação de mutações pontuais, apresenta menor sensibilidade em
relação às outras metodologias (Condie et al., 1993). Além disso, os resultados
positivos obtidos pelo SSCP necessitam ser confirmados por seqüenciamento,
procedimento esse realizado para todos os pacientes nesse trabalho.
Em ATL, todos os estudos sobre mutações pontuais em TP53, p15INK4B e
p16INK4A, exceto o de Sakashita et al. (1992), a metodologia utilizada para a
identificação de alterações foi SSCP, levantando alguns questionamentos sobre a
presença de resultados falso negativos (Sugito et al., 1991).
Independentemente da metodologia empregada na análise de mutações
pontuais, resultados falso negativos também podem ocorrer em função de erros na
obtenção da amostra. A freqüência de células CD4+ superior a 65% nos pacientes
apresentando forma smoldering confere maior confiabilidade aos dados obtidos
nesse trabalho, reduzindo a possibilidade de mascaramento dos resultados pela
presença de células não tumorais. Segundo Gonzalez-Cadavid et al. (1989), o
seqüenciamento de DNA é capaz de detectar mutações em heterozigose em
amostras com aproximadamente 30% de células tumorais.
92
8.5 Análise de instabilidades microssatélites (MSI)
A constatação de MSI em 16% dos pacientes ATL avaliados na Bahia foi
considerada inferior as freqüências reportadas para esse tipo de instabilidade no
Japão, onde essa percentagem variou entre 40 e 44% (Hatta et al., 1998a, Hayami
et al., 1999). Adicionalmente, a instabilidade em microssatélites no presente estudo
não foi observada na forma aguda. Deste modo, a maior inclusão de formas agudas
não necessariamente poderia levar a um aumento das percentagens deste
fenômeno conforme reportadas no Japão, onde as formas agudas e linfomatosas
representaram de 78 a 100% da amostra. Neste estudo, as formas agudas
representaram apenas 28% dos casos analisados. Estes resultados sugerem que
esse tipo de instabilidade não seja um evento comum nas formas graves de ATL
diagnosticados na Bahia, diferentemente do observado no Japão. Somente existe
um trabalho de análise de MSI que inclui um único paciente da forma smoldering. No
presente trabalho foram incluídos dez pacientes com a forma smoldering que
concentram o maior número deste tipo de alterações.
A constatação de MSI em pacientes com formas smoldering e crônica neste
trabalho é um achado novo na literatura e evidencia a participação de mecanismos
relacionados com o surgimento de tais instabilidades com o desenvolvimento de
quadros de curso indolente na ATL. Estes resultados sugerem falhas do sistema de
reparo de DNA nas formas mais indolentes da ATL. Um estudo avaliando a
expressão dos genes hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS1 e hPMS2 em 11
pacientes de forma aguda identificou redução ou perda de expressão de dois ou
mais genes em todos os casos clínicos, evidenciando a importância da inativação
dos genes de reparo do DNA no desenvolvimento de formas graves da ATL
(Morimoto et al., 2005). Entretanto, o conhecimento sobre a expressão de genes
relacionados com o sistema de reparo em células de ATL ainda é bastante
incipiente.
Todos os casos smoldering portadores de MSI, apresentaram alterações em
um loco (MSI-L). O único caso (nº 24) com instabilidade em mais de um loco (MSI-H)
era de forma clínica crônica evoluindo posteriormente para a forma aguda. Esse
caso apresentou um padrão trialélico para o loco D11S1391 indicando possível
duplicação dessa região ou trissomia envolvendo o cromossomo 11 (Clayton et al.,
2004). Infelizmente, por não termos obtido tecido tumoral na forma aguda, não foi
93
possível analisar possíveis alterações microssatélites na transição da forma crônica
para aguda. Em outras neoplasias hematológicas, a presença de MSI-H tem sido
constantemente associada à transição de quadros brandos para formas graves de
doenças. Wada et al. (1994) analisando o envolvimento de MSI com a evolução
clínica da leucemia mielógena crônica (CML) verificaram que 52,6% dos pacientes
com transição da forma crônica para o quadro de crise blástica apresentaram MSI-H.
Esses autores concluíram que o acúmulo de MSI seria um evento tardio na evolução
da CML para a fase de crise blástica. De acordo com Tasaka et al. (1997), a
presença de MSI pode desempenhar um importante papel na transição de formas
clínicas brandas para formas graves da leucemia mielocítica aguda (AML). Na ATL,
a idéia de associação das MSI com a transição de formas clínicas também tem sido
defendida, contudo, até então, não há nenhuma comprovação de tal relação. Além
disso, os resultados obtidos no presente estudo mostram que as MSI em ATL são
eventos que não estão restritos somente as formas graves da doença sendo
também observadas nas formas smoldering. Um dos pacientes classificado com
forma smoldering com MSI foi diagnosticado com ATL na adolescência (Bittencourt
et al., 2007b) e tem sobrevida de mais de 21 anos, mantendo-se com mesma forma
de ATL. Os outros dois pacientes com forma smoldering e com MSI têm 3 e 4 anos
de acompanhamento mantendo-se também com o mesmo tipo clínico.
A presença de MSI em pacientes ATL na Bahia mostrou-se superior à
observada em alguns tumores sólidos como nefroblastomas (8,5%), carcinoma de
ovário (1,5%) e meduloblastoma (11,1%) e também parece ser maior que o
constatado em neoplasias hematológicas como ALL (2,5%) e NHL (2%) (Ramburan
et al., 2004; Plisiecka-Halasa et al., 2008, Viana-Pereira et al., 2008; Best et al.,
2010; Duval et al., 2004).
A constatação de instabilidade nos quatro locos microssatélites avaliados em
pacientes de diferentes áreas endêmicas sugere que esses marcadores possam ser
eficientes ferramentas diagnósticas de instabilidades genômicas na ATL. Como
reportado no Japão, o loco com maior número de pacientes com alteração foi o
D18S21 (Hatta et al, 1998a) que está localizado na região intrônica 7-8 do possível
gene supressor de tumor DCC (Wada et al., 1994; Inokuchi et al., 2002).
A presença de instabilidade no loco D10S190 observada em um paciente tipo
smoldering na Bahia, também possui peculiar interesse, pois assim como DCC, este
marcador está localizado em uma região intragênica (intron 3-4) do candidato a
94
supressor tumoral denominado CASC2 (Baldinu et al., 2004, Baldinu et al., 2007). A
menor expressão do transcrito CASC2α em tumores de endométrio em comparação
com tecido normal sugere que esse seja um possível gene supressor de tumor.
Atualmente, pouco se sabe sobre os efeitos das alterações nos marcadores D18S21
e D10S190 em relação à expressão das proteínas DCC e CASC2 na ATL, sendo
esse, portanto, mais um tema a ser investigado.
Os marcadores D10S191 e D11S1391, que apresentaram MSI nos casos 27
e 24 respectivamente, flanqueiam genes relacionados com sistema de reparo (ATM)
e adesão celular (ITGA8) (Takeuchi et al., 1999; Matolweni et al., 2006) e indicam a
importância do estudo de possíveis alterações destes genes nos pacientes com
instabilidade nos microssatélites D10S191 e D11S1391.
Embora a MSI observada nos pacientes de ATL incluídos neste estudo possa
refletir erros de replicação provocados por deficiências da maquinaria de reparo, os
possíveis genes alvos dessas alterações não estão identificados. Em tumores
sólidos como o câncer de cólon, mutações em genes relacionados com sistema de
reparo do DNA como hMLH1 e hMSH2 tem sido associadas a MSI (Bapat et al.,
1999). Em pacientes portadores de neoplasias hematológicas apresentando MSI, a
análise de mutações pontuais em seqüências repetitivas localizadas nos genes
TGF-βRII, BAX, IGFIIR e hMSH3 mostrou não haver alterações nessas regiões,
contudo, em amostras de pacientes de ATL, foram observadas mutações do gene
E2F4 em 20% (2/10) dos casos analisados (Komatsu et al., 2000). Como citado
anteriormente, alterações genéticas nos genes de reparo do DNA precisam ser mais
exploradas na ATL.
Além de fatores genéticos, alguns trabalhos têm evidenciado que a
proliferação de células contendo instabilidade microssatélites pode estar relacionada
à resposta imune antitumoral do hospedeiro. Em tumores colorretais, a presença de
MSI parece estar associada a uma maior infiltração de linfócitos T citotóxicos (CD8+)
e células T regulatórias (CD8- FOXP3+) comparando-se com tumores estáveis para
microssatélites, sugerindo que a densa infiltração de células FOXP3+ possa
contribuir com o crescimento local dos tumores portando MSI (Michel et al., 2008).
Duval et al. (2004), analisando instabilidades microssatélite em 603 pacientes
portadores de linfomas não-Hodgkins demonstraram que a presença de tais
alterações estava especificamente associada a linfomas relacionados com
imunodeficiências (desordens linfoproliferativas pós-transplante e linfomas
95
relacionados com infecção pelo HIV), sugerindo que o processo de oncogênese
nesses casos pode ser favorecido pela deficiência da resposta imune. Diante desse
contexto, estudos incluindo a avaliação do estado imunológico dos casos de ATL
com MSI podem contribuir para o entendimento do efeito de tais alterações nas
características clínicas desses pacientes.
8.6 Análise de perda de heterozigosidade (LOH)
A presença de LOH pode estar relacionada com a inativação de genes
candidatos a supressores de tumor localizados em regiões próximas dos locos
avaliados. Na literatura ainda são poucas as pesquisas que discutem a influência de
LOH no desenvolvimento da ATL. Porém, no único trabalho a estudar de maneira
mais abrangente esse tema, foi constatada a presença de LOH em 91% (20/22) dos
casos analisados (Hatta et al., 1998b). O nosso trabalho observou um menor
número de pacientes com LOH em relação ao estudo japonês, o que se pode
justificar pelo menor número de marcadores utilizados, uma vez que no Japão a
maior freqüência de LOH foi verificada em cromossomos não estudados no presente
trabalho. Além disso, o estudo japonês incluiu somente formas graves da doença.
Porém, somente um entre os seis (20%) casos com forma aguda incluídos no
presente trabalho apresentou LOH e como observado para MSI, o maior número de
casos com LOH apresentou formas menos agressivas da ATL. Deste modo, os
dados obtidos nesse estudo sugerem que a LOH não seja um evento
exclusivamente relacionado com o desenvolvimento de formas graves da ATL e de
acordo com os nossos conhecimentos demonstra de maneira inédita a presença
desse tipo de alteração em pacientes com formas smoldering e crônica.
No presente estudo, o marcador D10S191 apresentou LOH em três pacientes
com distintas formas clínicas da ATL (um smoldering, um crônico e um caso agudo),
demonstrando que deleções desse loco podem ocorrer em qualquer forma da
doença. Shima et al. (2005) avaliando LOH dessa região em carcinoma colorretal
também verificaram maior freqüência de LOH no loco D10S191 em pacientes com
fase inicial da doença (36%) comparando-se com estágios mais avançados (20%).
Esses autores propuseram que as deleções dessa região poderiam inativar um
96
possível gene supressor de tumor ainda não identificado e que estaria relacionado
com o desenvolvimento desse tipo de câncer.
Perdas de heterozigosidade no loco D10S190 têm sido reportadas em
diferentes neoplasias (Palmieri et al., 2000; Takimoto et al., 2001). A identificação de
LOH nesse loco em um dos casos smoldering incluídos nesse estudo sugere que
essa deleção possa estar relacionada com a inativação de um possível gene
supressor de tumor localizado nessa região. Como mostrado para MSI, LOH no loco
D10S190 também poderia estar relacionado com alterações no gene CASC2
(Baldinu et al., 2004)
A verificação de LOH no loco D18S21 (localizado no intron 7-8 do gene DCC)
em um dos pacientes analisados na Bahia aponta a importância de estudar
possíveis alterações no gene DCC. A presença de LOH nessa região foi relacionada
com alterações quantitativas ou qualitativas da proteína codificada por esse gene em
câncer colorretal (Tarafa et al. 2000) e em outros tumores sólidos (Uchino et al.,
1992; Pearlstein et al., 1998; Gao et al., 1993; Ramburan et al., 2004). Em
neoplasias hematológicas como CML e AML, LOH em DCC parece ser um evento
freqüente em pacientes apresentando quadros clínicos graves ou com deficiências
de genes do sistema de reparo do DNA (Wada et al., 1994; Zhu et al., 1999).
A freqüência de LOH detectada nos casos de ATL analisados neste estudo é
similar à observada em outros tumores humanos, sugerindo que esse seja um
mecanismo de inativação de possíveis genes supressores de tumor situados
próximos aos marcadores avaliados (Wada et al., 1994, Ramburan et al., 2004;
Ashazila et al., 2011).
Nos pacientes com ATL avaliados, tanto MSI quanto LOH parecem contribuir
de forma similar para o estabelecimento dessa neoplasia. Um maior número de
casos com um maior número de marcadores deverá ser incluído para confirmar
estes achados. Somente em um paciente foi detectado MSI e LOH simultaneamente
(LOH no loco D10S191 e MSI no loco D18S21), mostrando que diferentes genes
supressores tumorais podem ser inativados por distintos mecanismos na ATL
Um fato de destaque nesse estudo é que as alterações microssatélites foram
realizadas por técnica semi-automatizada enquanto que, nos estudos japoneses
disponíveis, a metodologia utilizada para a detecção dos microssatélites foi a
coloração com nitrato de prata, que oferece menor sensibilidade.
97
Dentre os diferentes tecidos não tumorais incluídos neste estudo, o material
coletado de unhas pareceu o mais adequado para análise de alterações
microssatélites, pois, em geral, apresentou rendimento de extração, padrão e
intensidade de amplificação satisfatória. Outro fator importante é a facilidade de
coleta e armazenamento da amostra.
Apesar do bom rendimento de extração e elevado grau de pureza, as
amostras de DNA obtidas a partir de cabelo apresentaram, de modo geral,
dificuldades de amplificação provavelmente provocada pela presença de melanina.
De acordo com a literatura, a ação inibitória da melanina sobre a PCR ocorre em
função de sua ligação à Taq DNA polimerase, bloqueando a atividade funcional
dessa enzima (Butler, 2010). Para a obtenção de uma amostra capilar adequada
para análises de biologia molecular, é importante a coleta dos fios com comprimento
máximo de 10 cm e contendo o bulbo capilar (Uchihi et al., 1992). Entretanto, na
prática clínica isso nem sempre é possível pelo desconforto proporcionado ao
paciente.
Embora as amostras coletadas a partir de mucosa oral tenham apresentado
ótimos padrões amplificação via PCR, em algumas situações o material coletado
desse tecido não apresentou rendimento de extração de DNA satisfatório. Esse fato
se deve provavelmente a problemas no procedimento de coleta ou armazenagem do
material, o que pode ter levado a degradação dos ácidos nucléicos por processos
químicos ou enzimáticos (Butler, 2010).
A dificuldade na amplificação de alguns microssatélites em amostras
extraídas de parafina talvez tenha ocorrido em função da degradação do DNA no
material de partida. Falhas de amplificação de fragmentos específicos de DNA não
são eventos infrequentes em amostras extraídas de tecido em parafina (An e
Fleming, 1991).
A inclusão de mais de uma amostra normal procedente de diferente tecido
para um mesmo paciente facilita a avaliação das alterações em microssatélites por
definir com maior segurança o padrão normal do loco microssatélite para o paciente.
98
8.7 Relação entre mutações em TP53, p15INK4B e p16INK4A e alterações
microssatélite
Alguns estudos têm apontado uma relação entre mutações no gene TP53 e
alterações em locos microssatélites ligados ou não a este gene como BAT-25, BAT-
26, D2S123, D5S346 e D17S250 (Nagahashi et al., 2008; Nyiranesa et al., 2011).
Não foram encontrados trabalhos na literatura que relacionem os locos
microssátelites incluídos neste estudo e mutações em TP53. No presente estudo, foi
observado estes dois tipos de alteração no caso 16, portador de forma crônica, que
teve sobrevida 20 vezes inferior a mediana dos casos crônicos incluídos na
avaliação de alterações microssatélites. No caso 31, único portador da forma clínica
aguda com mutação em TP53 que também foi avaliado simultaneamente para
alterações em microssatélites, não teve MSI nem LOH.
As alterações microssatélites observadas nos pacientes incluídos nesse
estudo não foram relacionadas com a inativação de p15INK4B e p16INK4A por
mutações pontuais. Entretanto esses genes podem estar inativados por outros
mecanismos como deleção ou hipermetilação nesses casos clínicos.
Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que a avaliação de mutações
pontuais nos genes TP53 pode ser útil para inferências prognósticas em portadores
da forma aguda e crônica da ATL no estado da Bahia. Por outro lado, as análises de
alterações microssatélites parecem ser importantes no desenvolvimento de formas
menos graves da doença.
99
9 CONCLUSÕES
Diante dos resultados apresentados nesse trabalho, pode-se concluir que:
Mutações pontuais no gene TP53 podem estar presentes nas formas aguda e
crônica da ATL na Bahia.
Os genes p15INK4B e p16INK4A não são freqüentemente inativados por mutações
pontuais nos pacientes com ATL na Bahia.
Na Bahia, as alterações microssatélites são eventos observados principalmente
nas formas crônica e smoldering da ATL.
Pacientes agudos portadores de alteração em TP53 apresentam menor tempo
de sobrevida em relação aos demais casos dessa forma clínica.
100
10 CONTRIBUIÇÕES
Este estudo teve como principais contribuições para a literatura:
Descrição de mutações nos códons 282, 181 e 155 em pacientes com ATL.
Demonstração de menor sobrevida de pacientes agudos com mutação em TP53
em relação à pacientes agudos sem alterações nos genes avaliados.
Verificação da ocorrência simultânea de mutação pontual no gene TP53 e
alteração microssatélite (LOH) na forma crônica da ATL.
Demostração da presença de alterações microssatélite em formas menos
agressivas da ATL.
101
11 REFERÊNCIAS
Agell, L., S. Hernandez, et al. KLF6 and TP53 mutations are a rare event in prostate cancer: distinguishing between Taq polymerase artifacts and true mutations. Mod Pathol, v.21, n.12, Dec, p.1470-8. 2008.
Ambs, S., W. P. Bennett, et al. Relationship between p53 mutations and inducible nitric oxide synthase expression in human colorectal cancer. J Natl Cancer Inst, v.91, n.1, Jan 6, p.86-8. 1999.
Ambs, S., M. O. Ogunfusika, et al. Up-regulation of inducible nitric oxide synthase expression in cancer-prone p53 knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A, v.95, n.15, Jul 21, p.8823-8. 1998.
An, S. F. e K. A. Fleming. Removal of inhibitor(s) of the polymerase chain reaction from formalin fixed, paraffin wax embedded tissues. J Clin Pathol, v.44, n.11, Nov, p.924-7. 1991.
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