Estudo e desenvolvimento de sistemas de esterilização por ... · À amiga Janice C. De Azevedo pela pronta ajuda no ... processo de irradiação por raios gama e acelerador

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos

Estudo e desenvolvimento de sistemas de esterilização por plasma

Adir José Moreira

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientadora: Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto

São Paulo

2006

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos

Área de Produção e Controle Farmacêuticos


Adir José Moreira

Dissertação para obtenção do grau de

MESTRE

Orientadora: Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto

São Paulo

2006

Adir José Moreira


Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto

orientadora/presidente

Profa. Dra. Telma Mary Kaneko 1o Examinador

Prof. Dr. Ronaldo Domingues Mansano 2º Examinador

São Paulo, 15 de Setembro de 2006.

V

Dedico

Aos meus pais Acir e Apparecida (in memorian), pelo exemplo de vida e

perseverança para lutar todos os dias, sem esmorecer frente aos obstáculos

existentes em nossas vidas.

À minha esposa Zoraide, e às minhas filhas Ana e Nicolle, fontes de inspiração constantes, para poder prosseguir nesse caminho.

VI

Agradecimentos

A Deus, sem o qual nada disso seria possível. À Professora Doutora Terezinha de Jesus Andreoli Pinto, pela orientação, confiança, e oportunidade de desenvolvimento deste trabalho, sempre incentivando e mostrando o caminho a ser seguido. Ao Professor Doutor Ronaldo Domingues Mansano, pelas informações a mim prestadas durante todo o trabalho, bem como por seu apoio durante os momentos mais necessitados. À FAPESP ( Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo), pelo apoio financeiro, essencial para a execução e conclusão do presente trabalho. Ao Laboratório de Sistemas Integráveis da Escola Politécnica da USP por permitir o uso de toda sua infra estrutura. Aos amigos do Laboratório de Sistemas Integráveis da Escola Politécnica da USP. Nelson Ordonez, companheiro de todas as horas e primeiro incentivador para iniciar essa nova fase de minha vida e pelo apoio técnico no desenvolvimento de projetos relativos à construção de novos dispositivos. Alexandre Marques Camponucci pelo apoio técnico, sempre pronto a resolver todos os problemas relacionados à área eletrônica vinculados aos equipamentos utilizados neste trabalho, bem como operação do Microscópio Eletrônico de Varredura, equipamento de vital importância para o bom andamento da conclusão do trabalho. José Antônio Rodrigues Porto pela operação do equipamento de raios –X, utilizado neste trabalho, bem como por apoiar a parte técnica de sala limpa. Elisio José de Lima pelo apoio técnico fornecido na área mecânica, sempre pronto a ajudar com sua desenvoltura e conhecimentos de mecânica, fazendo peças sempre precisas para utilização nos experimentos que se seguiram neste trabalho. Rubens de Alcântara Pereira pela ajuda essencial na finalização deste trabalho.Noemi Fonseca da Cruz pela atenção prestada aos amigos e colaboradores deste presente trabalho. Ao Professor Nilton Itiro Morimoto pela pronta compreensão, e apoio para seguir em frente com esse trabalho, liberando parte do tempo para execução do mesmo. Aos amigos do Laboratório de Controle Biológico de Qualidade, Medicamentos e Cosméticos José e Aline, pela atenção e ajuda, fundamentais para se conseguir obter os resultados aqui alcançados. À amiga Janice C. De Azevedo pela pronta ajuda no desenvolvimento inicial deste trabalho. Ao amigo Juliano de Morais Ferreira Silva, por seu companheirismo e profissionalismo, sempre pronto a ajudar com seus conhecimentos, tornando-se uma peça fundamental para o bom andamento deste trabalho.

VII

À amiga Michelle Rigamonte Boscariol, pelo companheirismo e amizade mostrado durante todo o percurso. À amiga Débora Cristina de Oliveira, pelo companheirismo, pela amizade e contribuições relevantes, tão importantes para execução deste trabalho. Ao Instituto de Física da USP nas pessoas da Professora Doutora Maria Cecília Barbosa da Silveira Salvadori responsável pelo Laboratório de Filmes Finos do Instituto de Física da USP pela permissão da utilização do Microscópio Eletrônico de Varredura, na parte conclusiva do experimento, e a técnica Fernanda Teixeira de Sá pela atenção e operação do Microscópio Eletrônico de Varredura. Ao IPEN ( Instituto de Pesquisas Energéticas Nucleares), pela utilização de sua infra-estrutura. Nas pessoas do Dr. Cláudio Rodrigues Superintendente do IPEN pela liberação do uso da infra estrutura. Sra. Elizabeth S. Ribeiro Somessari, responsável pelo setor de irradiação do IPEN, Sr. Carlos Gaia da Silveira e Sr Hélio Antônio Paes responsáveis pelos procedimentos de exposição das amostras ao processo de irradiação por raios gama e acelerador de elétrons. Ao Sr Flávio Betti do laboratório de dosimetria Termoluminescente pelas medidas da dose de radiação recebidas em equipamento de raios-X, análise importante para se poder chegar às conclusões finais referentes à esse trabalho. Ao Sr. Matias pelas suas informações, referentes aos processos de irradiação por raios – X. À amiga Mônica Valero da Silva, por sua atenção e apoio, durante a fase inicial deste trabalho. Ao Professor Doutor Luis da Silva Zambon, pela compreensão e ajuda nos momentos primordiais, sem o qual o trabalho poderia ficar comprometido. A Ronaldo Ruas, por todo apoio fornecido no inicio do trabalho. Ao Professor Doutor Patrick Bernard Verdonck pela ajuda no desenvolver deste trabalho com suas sugestões sempre construtivas. À Professora Doutora Telma Mari Kaneko por seu apoio durante o desenvolver deste trabalho. A Leila Bonadio pela rvisão bibliográfica contidas nessa obra. Enfim a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuiram para o êxito deste trabalho e que aqui não foram mencionados deixo minha mais profunda gratidão.

VIII

“Se um homem tem um talento e não tem capacidade

de usá-lo, ele fracassou. Se ele tem um talento e só

usa a metade deste ele fracassou parcialmente . Se

ele tem um talento e de certa forma aprende a usá-lo

em sua totalidade, ele triunfou gloriosamente e obteve

uma satisfação e um triunfo que poucos homens

conhecerão.”

Thomas Wolfe

IX

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da esterilização por plasma, utilizando como sensor o indicador biológico, esporos deBacillus subtilis. Nesse estudo foram utilizados reatores constituídos de acoplamento capacitivo modo RIE (Reactive Ion Etching) e acoplamento indutivo modo ICP (Inductively Coupled Plasma),sendo esse último classificado em dois tipos, cilíndrico e Planar. A diferença entre esses equipamentos está basicamente na forma de geração do plasma, sendo que no sistema RIE a potência de RF é aplicada nos eletrodos. No sistema ICP cilindrico, a potência é aplicada em uma bobina. No sistema planar que pode ser considerado como um sistema híbrido, a potência de RF é aplicada na bobina e nos eletrodos, fazendo assim com que se obtenha um plasma de alta densidade. Todos os experimentos envolvendo plasma foram desenvolvidos à temperaturas mais baixas quando comparadas com os processos esterilizantes a calor (por volta de 55 ºC), o que garante a possibilidade de aplicação em materiais poliméricos e ópticos (endoscópios, etc.). Os estudos de letalidade dos processos foram realizados utilizando esporos de Bacillus subtilis, veiculados em lamínulas de vidro, os quais foram submetidos a combinações de parâmetros de processo, permitindo a obtenção de dados comparativos quanto a sua letalidade e resistência, e, conseqüentemente, informações quanto à efetividade do processo de esterilização por plasma. Na utilização do sistema RIE os resultados obtidos mostraram-se bastante promissores, quando se utilizou potência de 150 W, pressão de 100 mTorr, vazão de 200 sccm, e tempo de 20 minutos, reduzindo a carga microbiana para próximo de zero nesse intervalo de tempo. Para potência de 100 W, utilizando todos os outros parâmetros, a carga microbiana foi reduzida com tempo de 60 minutos, não sendo este um resultado ideal, porém, ainda aceitável. Para o sistema ICP cilíndrico, os resultados foram também promissores, visto que se conseguiu reduzir a carga microbiana para próximo de zero, com 20 minutos de processo, sob pressão de 330 mTorr, potência de 350 e 400 W, e vazão do gás de 100 sccm. No sistema ICP Planar os resultados também foram muito bons, pois se conseguiu reduzir a carga microbiana para próximo de zero em 12 minutos, utilizando potência de 150 W, pressão de 100 mTorr, e vazão de 200 sccm. Esses resultados alcançados tanto para O2 puro quanto para O2 + H2O2, mostram a possibilidade da aplicação de ambos sistemas na esterilização de materiais hospitalares em geral, sendo entretanto necessários maiores estudos. Os resultados obtidos no trabalho possibilitarão projetar sistemas específicos que podem ser empregados em ambiente hospitalar e em estações de processamento de material cirúrgico.

X

Abstract

The objective of this work was to evaluate the effectiveness plasma of the sterilization, using the biological indicators with spore’s sensors Bacillus subtilis.. For this, the reactors of capacitive constituted of coupling had been used way RIE (Reactive Ion Etching) and inductive coupling was ICP (Inductively Coupled Plasma) which being the last classified in two types, cylindrical and glide. The differences between this equipment are basically in generation of plasma form, being these in systems RIE the RF power is applied in a coil. In the to glide system it can be considered with a hybrid systems, the RF power are applied in the bobbin and the electrodes which make with that it gets a high density of plasma. All the experiments involving plasma had been developed to the temperature near environment (for return of 55º C), which the possibility of application in polymeric and optic materials (the possibility of application in polymeric and optics materials (endoscopies, etc.). The studies of mortality of the process had been carried using the biological indicators constituted with spore’s sensors Bacillus subtilis, together in blade of glass, which had been subdue the combinations of parameters process, allowing get information comparative such as mortality and resistance, and consequently effectiveness process the of the sterilization information. In the use of RIE systems the results had get showed many promising when it used 150W power, 100 mTorr pressure, 200 sccm leak, 20 minutes time, reducing the microbial load near at zero in this interval time. For 100 W powers, using all the other parameters, microbial load were reduced at 60 minutes times, this results are not being ideal, but can be acceptable. To ICP cylindrical systems, the results had been promising, since it was get to reduce the microbial load near to zero, with 20 minutes of process, under 330 mTorr pressure, 350 e 400 W power and 100 sccm gas leak. In ICP glide systems the results also had been very good, because it was obtained to reduce the microbial load near to zero at 12 minutes, using 150 W power, 100 mTorr pressure and 200 sccm leak. These results reached in such way for 02 pure and to 02 + H202, in general both of the sterilization systems of hospital environment showed the possibility of the application, however was being necessary greater studies. The results will make possible the project of specific systems that can be used in hospital environment and stations of processing of surgical material

XI

Lista de figuras Figura 1 - Fluxograma evidenciando o experimento, desde a

preparação dos esporos até a contagem do número de sobreviventes. 40

Figura 2 - Fluxograma mostrando as etapas seguidas para obtenção

dos lotes de suspensão de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372. 41

Figura 3 - Distribuição das lamínulas contendo esporos de B. subtilis

var. niger ATCC 9372 acondicionados em placas de petri de vidro. 44

Figura 4 - Fluxograma mostrando as etapas realizadas para obtenção

dos esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372. 45 Figura 5 - Preparação dos suportes para exposição das amostras

contendo papel inoculado com esporos de Geobacillus sterothermophillus com carga de 1 x 106 UFC/suporte ao processo de plasma. 49

Figura 6 - Esquemático do Sistema de plasma modo RIE com

acoplamento capacitivo, mostrando o posicionamento da placa de petri dentro da câmara. 50

Figura 7 - Placa de petri contendo lamínulas de vidro de 18 X 18 mm

em triplicata inoculadas com esporos de B. Subtilis var. niger ATCC. 9372 com carga inicial de 2 x107 UFC/suporte, posicionada sobre o eletrodo, dentro do reator de plasma. 51

Figura 8 - Fluxograma evidenciando as etapas do processo de plasma.

53 Figura 9 - Fluxograma geral das etapas de liberação dos esporos. 54 Figura 10 - Fluxograma das etapas de liberação dos esporos após

processo de esterilização realizado nos dois tipos de indicadores esporos de B. subtilis e B. stearothermophillus. 54

Figura 11 - Gráfico da sobrevivência de esporos de Geobacillus

stearotehrmophillus inoculados em tiras de papel de 50 x 5 mm, com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/suportes submetidos à esterilização por plasma em sistema RIE, utilizando tubos de ensaio tipo pyrex com dimensões de 150 x 25 mm, com tampa de PVC possuindo orifício de 4mm de diâmetro para entrada do gás de processo e filtro de 0,5

XII

µm. Utilizando potência de Rádio frequência de 100 W, 330 mTorr de pressão e 500 sccm de vazão de oxigênio 4.8. 58

Figura 12 - Posicionamento das amostras contendo esporos de

Geobacillus stearothermophillus inoculados em tiras de papel com dimensões de 5 x 50 mm e carga inicial de 1 x 106 UFC/suporte sobre o eletrodo dentro da câmara de plasma de volume 7,45 litros. 60

Figura 13 - Gráfico da sobrevivência de esporos de Geobacillus

stearothermophillus inoculados em tiras de papel submetidos à esterilização por plasma em sistema RIE, com potência de RF aplicada de 100 Watts pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio com grau de pureza 4.8 e tempo de 30 minutos utilizando placas de petri de vidro sem tampa. 60

Figura 14 -Eletromicrografia evidenciando a degradação do suporte

celulósico, com dimensões de 5 x 50 mm, exposto ao processo de plasma RIE por tempo de 30 minutos, pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 4.8, e potência de 100 Watts. 61

Figura 15 - Espectrofotômetro utilizado nas avaliações dos ciclos de

esterilização por plasma. 62 Figura 16 - Microscópio eletrônico de varredura (SEM Scan Electronic

Microscopy) Phillips SEM 515. 62 Figura 17 - Exemplo de um espectro de plasma de oxigênio com

duração de 15 segundos, pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm e potência de 100 Watts. 63

Figura 18 -Evolução da raia de oxigênio durante o processo de

esterilização por plasma modo RIE, utilizando esporos de Geobacillus stearothermophillus inoculados em tiras de papel de 5 x 50 mm, com carga inicial de 1 x 106 UFC/suporte, sob as condições de 330 mTorr de pressão, 500 sccm de vazão de oxigênio 4.8, 100 Watts de potência e tempo de 30 minutos. 63

Figura 19 - Eletromicrografia de esporos de Geobacillus

stearothermophillus inoculados em tiras de papel de 5 x 50 mm com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/mL, expostos ao plasma modo RIE, sob as seguintes condições: Pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 4.8, potência de RF de 100 Watts e tempo de 10 minutos. 64

Figura 20 - Eletromicrografia de esporos de Geobacillus

stearothermophillus inoculados em tiras de papel de 5 x 50

XIII

mm com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/mL, após a esterilização por autoclave, por tempo de 15 minutos à 121 °C e 1 atm. 65

Figura 21 - Autoclave vertical Lutz Ferrando. 65 Figura 22 - Eletromicrografia de esporos de B. subtilis var. niger ATCC

9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte antes de sofrer processo de esterilização por plasma. 66

Figura 23 - Gráfico do logaritimo do número de sobreviventes de

esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, com tempo de 30 minutos, pressão de 330 mTorr, vazão de 200 sccm de oxigênio 4.8. 68





Figura 26 - Eletromicrografia de esporos de esporos de B. subtilis var.

niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, após a exposição ao plasma modo RIE por tempo de 20 minutos, potência de 150 Watts, pressão de 100 mTorr e vazão de 200 sccm de oxigênio 4.8. 70


esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, com tempos de 20 a 120 minutos, e potências de 25 a 150 Watts, pressão de 100 mTorr, vazão de 200 sccm de oxigênio 4.8. 72

Figura 28 - Análise espectrofotométrica para processo de 30 minutos

com 150 Watts de potência, 200 sccm de vazão de oxigênio 4.8 e 100 mTorr de pressão Utilizando esporos de B. subtilis

XIV

var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte. 72


esporos de B.subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 180 sccm de oxigênio 4.8 e 20 sccm de peróxido de hidrogênio em solução 30% estabilizada. 74


esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 170 sccm de oxigênio 4.8 e 30 sccm de peróxido de hidrogênio em solução 30% estabilizada. 74


esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 20 e 30 sccm de de peróxido de hidrogênio puro em solução 30% estabilizada. 75

Figura 32 - Eletromicrografia evidenciando o ataque químico sobre as

amostras de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro com carga inicial de 2x107 UFC/suporte, expostas a processos de plasma de oxigênio + peroxido de hidrogênio nas vazões de 160 sccm + 40 sccm respectivamente, com pressão de 100 mtorr e tempo de 15 minutos. 76





XV


esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 160 sccm de oxigênio 4.8 e 40 sccm de peróxido de hidrogênio. 80


esporos de B. subtilis e Geobacillus stearothermophillus, inoculados em papel, expostas a uma potência de 150 Watts, 30 minutos e pressões de 12, 100 e 330 mTorr para as vazões de 20,200 e 100 sccm respectivamenteem plasma modo RIE. 81


esporos de B. subtilis, inoculados em lâmínula de vidro, expostas a uma potência de 150 Watts, 30 minutos e pressões de 12, 100 e 330 mTorr para as vazões de 20, 200 e 100 sccm respectivamente. 82

Figura 38 - Equipamento de plasma tipo ICP cilindrico. 83 Figura 39 - Esquema do sistema ICP cilindrico. 84 Figura 40 - Tubo de quartzo do sistema ICP cilindrico. 84 Figura 41 - Gráfico do logaritimo do número de esporos de B. subtilis

var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 85

Figura 42 - Gráfico do logaritimo do número de esporos de B. subtilis

var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 150 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 85


var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas fora da bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 86

XVI

Figura 44 - Gráfico do logaritimo do número de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas fora da bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 86


var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potências de 200 e 250 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 89


var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 300, 350 e 400 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 4.8 e pressão de 330 mTorr. 89


var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com vazões de 95 sccm de oxigênio + 5 sccm de peroxido de hidrogênio, pressão de 330 mTorr. 90





Figura 50 - Distribuição das placas de Petri dentro do reator de

plasma. 93

XVII

Figura 51 - Vista interna do dispositivo de acoplamento indutivo (posição da bobina). 94

Figura 52 - Vista lateral do dispositivo, conexões de água de

refrigeração e Rádio Frequência. 94 Figura 53 - Esquemático do sistema ICP (Inductivelly Coupled Plasma)

planar. 95 Figura 54 - Equipamento de plasma existente (RIE - Reactive Ion

Etching). 95 Figura 55 - Gráfico do logaritimo do número de esporos de B. subtilis

var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP planar, utilizando oxigênio 4.8 na vazão de 200 sccm, e pressão de 100 mTorr. 96

Figura 56 - Espectro evidenciando os comprimentos de onda do

Ultravioleta. 97 Figura 57 - Gráfico do logaritimo do número de sobreviventes de

esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, expostos à irradiação por UV, com tempo máximo de 60 minutos e dose de radiação de 0,84 a 50,4 j/cm². 97

Figura 58 - Eletromicrografia de esporos de B. subtilis var. niger ATCC

9372, inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte após exposição ao UV por 60 minutos. 98

Figura 59 - Equipamento de raios-X modelo URD6 da Zeiss Zena com

tubo de Cu. 99 Figura 60 - Gráfico do logaritimo do número de sobreviventes de

esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de raios-X, por tempo de 30 minutos. 99

Figura 61 - Equipamento de raios gama, Gamacell, modelo C6-220 da

Atomic Energy. 100 Figura 62 - Cone de varredura do acelerador de elétrons modelo DC.

1500/25/4-JOB188 da Radiation Dinamics. 100 Figura 63 - Esquema básico de um acelerador de elétrons. 101

XVIII

Figura 64 - Gráfico do logaritimo do número de sobreviventes de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de radiação por raios gama, submetidos à dose de radiação de 5,10 e 25 KGy. 102

Figura 65 -Gráfico do logaritimo do número de sobreviventes de

esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de radiação por acelerador de elétrons submetidos à dose de radiação de 5,10 e 25 KGy e corrente de feixe de 2,8,5,6 e 7,1 mA. 103

Figura 66 -Comparação dos processos esterilizantes dos indicadores

biológicos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, expostos a diferentes processos esterilizantes, e em diferentes condições. 105

XIX

Lista de Tabelas Tabela 1- Preparação das culturas de esporos. 42

Tabela 2- Parâmetros de processo utilizados na primeira fase. 52

Tabela 3- Parâmetros de processo utilizados na segunda fase. 52

Tabela 4- Leitura da temperatura dos processos em sistema RIE. 71

Tabela 5- Calibração da vazão de peróxido de hidrogênio em

função da vazão do oxigênio. 79

Tabela 6- Temperatura de processo em sistema ICP cilíndrico. 88

Tabela 7- Comparação das doses recebidas pelas amostras

submetidas ao processo de esterilização por raios-X, em

função da potência aplicada. 98

Tabela 8- Parâmetros utilizados nos processos de radiação gama. 102

Tabela 9- Parâmetros utilizados nos processo de radiação por

acelerador de elétrons. 103

Tabela 10- Comparação dos valores D obtidos nos processos de

esterilização nos diferentes equipamentos. 106

XX

Lista de Abreviações

RF Rádio Frequência sccm standard cubic centimeter W Watts Pot. Potência P. Pressão Vaz. Vazão Conc. Concentração RIE Reactive Ion Etching ICP Inductivelly Coupled Plasma SEM Scan Electronic Microscopy B. bacillus min. Minuto seg. segundo t. tempo log. Logaritmo MFC Mass Flow Controller atm Atmosfera mm milímetro

µm micrometro nm nanometro IB Indicador biológico UV Ultra violeta UR Umidade relativa RPM Rotações por minuto g grama mL mililitro mTorr miliTorr PPM Parte por milhão MHz Megahertz

XXI

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 22

2. REVISÃO DE LITERATURA 27

3. OBJETIVOS 37

4. MATERIAIS E METODOS 38

4.1. MATERIAL 38

4.2. METODO 40

4.2.1. REPIQUES DE MANUTENÇÃO 41

4.2.2. OBTENÇÃO DE ESPOROS 41

4.2.3. RECOLHIMENTO E LAVAGEM DOS ESPOROS 43

4.2.4. PADRONIZAÇÃO DAS SUSPENSÕES DE ESPOROS 43

4.2.5. PREPARAÇÃO E INÓCULO DOS SUPORTES LAMINULARES 44

4.2.6. MÉTODO DE LIBERAÇÃO EM AGITADOR VORTEX 46

4.2.7. ACOMPANHAMENTO DA LETALIDADE E RESISTÊNCIA 47

4.2.8. CICLOS LABORATORIAIS DE EXPOSIÇÃO AO PLASMA 47

4.2.9. MECANISMO DE GERAÇÃO DE PLASMA 48

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 58

6. CONCLUSÕES 107

7. REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS 109

8. DERIVADOS 113

22

1. INTRODUÇÃO

As características de efetividade e segurança, quanto à nível de esterilidade, a

ciência médica tem evoluido rapidamente possibilitando o desenvolvimento de

novas tecnologias. Essas implicam no desenvolvimento de métodos esterilizantes

que utilizem temperaturas relativamente baixas, com processos químicos gasosos,

e que possam ser aplicadas a materiais termossensíveis [CHAIGNEAU, 1983].

De um modo geral, os métodos esterilizantes podem ser divididos em físicos,

químicos e físico-químicos.

Os processos físicos são principalmente o calor úmido ou seco de vapor

saturado, radiação / raios gama. Os métodos químicos são banhos ou lavagens que

utilizam glutaraldeído, formaldeído e ácido peracético [RUSSEL,HUGO,AYLIFFE,

1982; RUTALA,1995].

Os métodos físico-químicos (no geral considerados simplesmente químicos)

envolvem principalmente processos onde se tem a ação dos dois fatores utilizados

nos métodos anteriores, tal como ocorre no uso de esterilizador por óxido de etileno,

vapor a baixa pressão e formaldeído, assim como na utilização de processos com

gases ionizados (plasma) [YOUNG, 1997].

O método de calor úmido, na forma de vapor saturado sob pressão, é o mais

usado [RUTALA, 1996]. Este método apresenta como vantagem a baixa toxidade, o

baixo custo, a ausência de resíduos, o elevado poder esporicida e a compatibilidade

com a maior parte dos materiais empregados em unidades hospitalares. Os

principais mecanismos da esterilização neste caso são: a coagulação e denaturação

irreversível de proteínas e enzimas celulares e a expansão adiabática das moléculas

de água no interior dos organismos que promovem, desta forma, a ruptura de sua

23

membrana biológica durante o ciclo de descompressão das câmaras da autoclave

[RUTALA, 1996] .

O uso de calor seco também é bastante empregado, mas diferentemente dos

processos em autoclave, não proporciona a transmissão de calor latente nem o

aumento da pressão. Assim, utiliza temperaturas mais altas. O mecanismo principal

de esterilização é dado pela oxidação dos constituintes dos organismos vivos.

O principal problema destes métodos consiste nas altas temperaturas que

podem alterar os materiais poliméricos utilizados em cateteres e outros materiais

sensíveis à temperatura. As limitações abrangem materiais empregados em

endoscopias, e em grande diversidade de outros materiais hospitalares, plásticos e

elastoméricos, a serem utilizados em vasta gama de técnicas clínicas, terapêuticas e

cirúrgicas [HOLY, 2001].

As técnicas de esterilização por plasma oferecem grandes vantagens em

relação aos outros métodos utilizados, pois são bastante efetivas quanto à redução

da carga microbiana, além de se desenvolverem em temperatura ambiente e não

utilizarem gases tóxicos. Enquanto o processo de esterilização por óxido de etileno

por exemplo, liberam resíduos tóxicos e pode envolver diluentes que contribuem

para destruição da camada de ozônio [ROWLAND, 1998], os processos de

esterilização por plasma eliminam apenas oxigênio, água e CO2, podendo assim

serem considerados como ambientalmente corretos. Além disso sua instalação não

requer níveis de segurança avançado como por exemplo no caso de sistemas de

esterilização por raios gama.

Todos esses fatores associados proporcionam segurança ao ambiente e aos

operadores [HERMELIN, ET AL, 1998; LEROUGE, ET AL, 2000].

24

Características ideais para um processo de esterilização a baixa temperatura

envolvem: alta eficácia, ação rápida, grande poder de penetração, compatibilidade

com o maior número de materiais, não utilização ou geração de produtos tóxicos,

eficiência mesmo em presença de material orgânico, facilidade de adaptação em

qualquer ambiente (hospitalar ou industrial), possibilidade de ser monitorado e

facilidade de operação [HOEFEL, 2002].

O processo empregando plasma tem como vantagens o fato de realizar

reação química com as unidades celulares muito rapidamente, viabilizando o

processo de esterilização em curto espaço de tempo; o fato de a ativação do gás de

peróxido se dar por alguns minutos e depois voltar ao estado normal sem deixar

resíduos e, no final do processo, ter como produto de degradação oxigênio e água,

não dispensa a necessidade de período de aeração. Além disso, o processo não

requer equipe específica, nem controle ou monitoração exaustiva.

O plasma de peróxido de hidrogênio não deve ser utilizado para derivados de

celulose, devido a ação da celulase. A esterilização por esse método exige

embalagens que não contenham em sua formulação celulose. São utilizados

embalagens de Tyvek siliconizado ( poliolefinas), Mylar ( polietileno em tripla

camada) e um polipropileno 100% repelente a líquido , com características de

resistência, penetração e impermeabilidade específicos. Os indicadores biológicos

utilizados para avaliação do processo também requerem atenção especial, pois

originalmente são feitos com fita de celulose impregnados com esporos de bacillus

O Plasma é um estado físico da matéria definido como uma nuvem de íons,

elétrons e partículas neutras, as quais são altamente reativas. É um estado diferente

25

dos demais conhecidos (líquido, gasoso e sólido) e vem sendo chamado de quarto

estado da matéria.

Durante os processos de plasma os elétrons de um átomo ou molécula

podem ganhar energia suficiente para passar para um nível mais energético, onde

ficam em órbita durante um certo intervalo de tempo e em seguida decaem para um

nível de menor energia. Durante o processo de decaimento ocorre perda de energia

por parte desse elétron, sendo que essa energia pode ser emitida em forma de

fótons. Assim sendo, os processos de plasma podem ser caracterizados por meio de

um sistema de espectrometria de emissão, a qual é baseada na emissão de fótons

das espécies excitadas (a espectroscopia de emissão é uma técnica não intrusiva

pois não promove contato com o plasma, permitindo ainda realizar medidas em

tempo real). A técnica de espectroscopia de emissão é muito utilizada para

caracterizar processos de plasma em geral como deposição ou ataque químico de

diversos materiais cerâmicos e poliméricos [D’AGOSTINO, 1990].

Os equipamentos atuais utilizam a etapa de plasma para eliminar os resíduos

tóxicos gerados pelos métodos de esterilização com peróxido de hidrogênio ou por

ácido peracético, já que a etapa de plasma só é efetuada no final do ciclo de

esterilização [HAYAKAWA, 1998].

Assim como inexiste a disponibilidade do emprego de um processo específico

utilizando plasma para a efetiva esterilização, também não foi desenvolvido qualquer

equipamento comercial que permita utilizar este método de esterilização [MOISAN

ET AL, 2001].

26

Adicionalmente, sabe-se de limitações possíveis quanto aos aspectos de

validação, seja no que tange a limitações dimensionais da câmara esterilizante, seja

na configuração do produto. Encontram-se como causas destas preocupações a

distribuição homogênea de plasma formado, assim como a meia vida de suas

entidades sabidamente instáveis [MOISAN ET AL, 2001].

Em processo de plasma que envolve materiais orgânicos pode haver

acompanhamento da evolução do oxigênio e seus compostos como o dióxido de

carbono, permitindo obter informações ao menos qualitativas sobre como está

ocorrendo o ataque químico [CHAU ET AL, 1996].

Desta forma durante o processo de esterilização espera-se observar a

composição química do plasma, conseguindo acompanhar tanto a absorção das

espécies reativas do plasma pelo material biológico dos esporos, quanto à emissão

de material devido à degradação da membrana dos esporos. Do ponto de vista

químico todo material biológico provocará alterações no plasma sendo possível sua

caracterização através desta técnica [D’AGOSTINO, 1990].

Torna-se fundamental portanto, minucioso estudo das diferentes variáveis

físicas, e de como podem afetar os endosporos microbianos, de forma a viabilizar o

emprego amplo da esterilização por plasma de artigos médico-hospitalares.

27

2. REVISÃO DE LITERATURA

O conceito de esterilização surgiu em meados do século XIX, quando foi

constatada que para o uso seguro de artigos médico–hospitalares haveria a

necessidade de eliminação total dos microrganismos [HUGO, RUSSEL, 1983].

Conceitualmente, um método de esterilização tem por finalidade remover ou

destruir todas as formas de vida microscópicas, saprófitas ou não, presentes no

produto considerado e com capacidade de desenvolvimento durante os estágios de

armazenamento e utilização dos mesmos. Entretanto, seria incorreto afirmar que

para métodos esterilizantes ocorra a morte de todos os microrganismos, significando

que sempre há a possibilidade de se encontrar alguns microrganismos que não

sofreram ação do processo esterilizante, permanecendo assim intactos. Podemos

dizer que o processo esterilizante visa minimizar essa possibilidade, procurando

assim atingir o nível de segurança de esterilidade pré-definido “sterility assurance

level” (SAL). Isso faz com que o procedimento esterilizante selecionado para atingir

o SAL estabelecido para um determinado produto dependa da natureza e utilização

desse produto e da carga microbiana inicial presente no mesmo [DENYER, BAIARD,

1990].

A exposição de um artigo a um agente esterilizante, não garante a segurança do

processo, uma vez que esta depende de limpeza eficaz. A eleição do método de

esterilização dependerá do tipo de artigo a ser esterilizado. Estes métodos poderão

ser físicos, químicos ou físico-químicos [PINTO, SAITO, 1992].

Métodos físicos são aqueles que utilizam calor em diferentes formas e alguns

tipos de radiação para esterilizar artigos. Nas centrais de esterilização hospitalares o

método mais utilizado e factível é a autoclavação por vapor saturado sob pressão.

Outro método igualmente conhecido, porém tendendo ao desuso no ambiente

28

hospitalar pelas dificuldades operacionais e pelo avanço da tecnologia das

autoclaves a vapor, é o calor seco (estufa).

A esterilização por radiação impõe manipulação restrita às industrias que

recebem a orientação/capacitação do CNEN (Conselho Nacional de Energia

Nuclear). O uso de radiação ultravioleta para esterilização de artigos é proibido pelo

Ministério da Saúde (Portaria n. ° 674, de 31.12.97).

Dentre os métodos esterilizantes disponíveis atualmente, o mais empregado

é o método de calor úmido por apresentar como características: ausência de

toxicidade, ausência de resíduos, baixo custo, fácil controle, elevado poder

esporicida e compatibilidade com vasta gama de materiais, porém só podendo ser

aplicado para materiais resistente ao calor e umidade [HOLY, 2001].

O seu mecanismo de ação consiste em coagulação e denaturação

irreversíveis de proteínas e enzimas celulares, conduzindo à características de

esterilidade em tempo de cerca de 20 minutos. Um fator importante para a morte

microbiana, é o aumento rápido da temperatura. Isso ocorre devido à pressão

adotada nesse tipo de processo [HOLY, 2001].

O processo envolvendo calor seco exige temperaturas mais elevadas para

atingir o nível de esterilidade, pois não envolve transmissão de calor latente . Ele

inativa esporos de bactérias e microrganismos vegetativos por processo de

oxidação, ou seja, a morte microbiana se dá através da oxidação de constituintes

celulares. [RUTALA, 1996; RUSSEL, HUGO, AYLIFFE, 1999].

O calor seco é utilizado em materiais que não podem ser processados por

calor úmido, devido a possíveis danos nos mesmos, como por exemplo, materiais

que possam sofrer oxidação, produtos oleosos, pós, etc. Possui como vantagens:

alto poder de penetração, poucas variáveis a controlar e baixo custo, porém requer

29

utilização de temperatura e tempos elevados para se atingir níveis de esterilidade

desejáveis [RUTALA, 1996; RUSSEL, HUGO AYLIFFE, 1999]. No entanto não é

aplicáveil a materiais termolábeis, cabendo a esses, outras tecnologias.

Desta forma, o grande impasse surgido nas últimas décadas quanto à

esterilização de materiais termossensíveis foi valioso na busca de novos desafios. A

situação apresentava-se sob controle, a despeito das limitações da irradiação (seja

por cobalto ou elétron acelerado). Europa e Estados Unidos divergiam quanto à

esterilização, a primeira deslocando-se para formaldeído e vapor a baixa pressão e

peróxido de hidrogênio, o segundo, com elevadíssimo consumo, para óxido de

etileno, mas problemas ocupacionais e ambientais provocaram grandes mudanças

[DEN ELZEN, SWART, ROTMANS, 1992; RUTALA WEBER, 1996]. Os controles

tornaram-se mais rígidos e o atendimento a questões legais, com regulamentações

severas direcionou à pesquisas de substâncias e processos alternativos.

Vários estudos têm mostrado que a radiação ionizante é um poderoso

processo para inativação de vários tipos de microrganismos, podendo ser usada

para esterilização de produtos médicos, farmacêuticos e também para outros

produtos termolábeis, substituindo as técnicas tradicionais de esterilização térmica

[RUSSEL, HUGO AYLIFFE, 1999]. Essa técnica age como esterilizante por produzir

modificações no DNA das células, provocando lesões estruturais, o que acarreta

alterações funcionais graves por difusão de radicais livres na célula microbiana,

mas também no material submetido ao processo [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001].

A radiação ionizante é geralmente classificada em dois grupos:

eletromagnética e particulada. A radiação eletromagnética pode ser exemplificada

por raios-Gama, raios-X, ultravioleta e luz visível. Os raios infravermelhos e energia

de microondas são não particulados e viajam na velocidade da luz.

30

Radiações particuladas podem ser exemplificadas por partículas Alfa,

partículas Beta, nêutrons, elétrons e protons, as quais possuem menor poder de

penetração que a eletromagnética como raios –Gama e raios-X. Na prática somente

raios-Gama e aceleradores de elétrons têm encontrado uso em métodos de

esterilização [RUSSEL, HUGO AYLIFFE, 1999].

Os raios Gama, geralmente são emitidos por isótopos radioativos de 60Co,

137Ce e 182Ta. A forma mais utilizada é a radiação gama, cujo elemento mais

utilizado é o 60Co, que possui grande poder de penetração nos materiais. É utilizado

principalmente em implantes. O tempo de permanência do material frente à bomba

de cobalto é calculado a partir da distância do material à fonte, das condições de

atividade da fonte e da natureza do material a esterilizar. O processo é monitorado

por painel eletromecânico que avalia os riscos, ou seja, os níveis de radiação no

equipamento. Cada lote de artigos é monitorado por dosímetros que controlam a

quantidade de radiação recebida [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001].

Esse processo apesar de ocorrer a baixas temperaturas, nem sempre é

recomendado para materiais médico-hospitalares de natureza polimérica, devido a

formação de radicais livres, ligações cruzadas e duplas ligações, as quais

ocasionam alterações mecânicas e visuais [SHINTANI,1995]. Materiais

termossensíveis são em sua maioria susceptíveis a alterações moleculares quando

submetidos a processo de irradiação, fazendo com que esse tipo de processo seja

potencialmente inadequado. Devido a isso, deve-se realizar estudo de estabilidade e

investigação toxicológica, a fim de verificar a segurança dos produtos processados.

A opção então para esterilização desse tipo de material consiste no emprego

de agentes químicos na forma gasosa. Dentre os agentes químicos na forma

31

gasosa, as maiores aplicações recaem sobre o óxido de etileno e plasma de

peróxido de hidrogênio.

O óxido de etileno é um gás incolor, de alto poder virucida, esporicida,

bactericida, micobactericida e fungicida. A ação do ETO (óxido de etileno) é

atribuída à alquilação das proteínas dos microrganismos. Essa ação depende dos

parâmetros de concentração, temperatura, umidade relativa e tempo de exposição

ao gás. Sua indicação de uso é para os artigos termossensíveis. É altamente

explosivo e facilmente inflamável, devendo ser utilizado em equipamentos

específicos.

O processo empregando óxido de etileno tem sido o mais freqüentemente

utilizado como de baixa temperatura. Alguns estados americanos têm requerido

redução da emissão de óxido de etileno de 90 a 99% [36] pelos seus efeitos

nocivos.

No Brasil sua utilização encontra-se regulamentada pela Portaria

Interministerial n.o 482, de 16 de abril de 1999. Nesta Portaria encontram-se as

condições exigidas para instalação, processamento, embalagem, transporte de

artigos, saúde e segurança ocupacional.[MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999].

A exposição ao gás pode resultar em câncer, anomalias do sistema

reprodutor, alterações genéticas e doenças neurológicas caso não se respeitem às

condições de segurança estabelecidas [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1999].

O ciclo de esterilização ocorre em 5 fases: pré-umidificação – umidade em

torno de 40% admissão do gás; tempo de exposição – 3 a 4 horas; Exaustão do

gás; Aeração – tem por finalidade a remoção dos resíduos tóxicos e seus

subprodutos [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001].

32

Aliado às diversas características de elevada difusibilidade e volatilidade, que

respondem pela eficácia e segurança biológica do processo esterilizante por óxido

de etileno, a facilidade com que sempre se contornou suas características negativas

(flamabilidade, com a adoção de misturas inertes ou em plantas planejadas para

conferir a necessária segurança; toxicidade, com o emprego de equipamentos de

proteção individual-EPI’s e coletiva – EPC’s), tornou este o processo esterilizante de

maior opção, particulamente dentre os fabricantes de artigos médicos-hospitalares

[OLIVEIRA, 2000].

No reprocessamento de materiais médico-hospitalares, aspecto que se

constitui em grande preocupação nos hospitais, o óxido de etileno tem sido o

esterilizante de escolha. Entretanto, a frequente inexistência de instalações

adequadas, seja no próprio hospital ou em empresas que oferecem serviços de

terceirização, tem acarretado a busca de novas alternativas [RUTALA, GERGEN,

WEBER, 1998].

Uma das grandes possibilidades, a mais promissora e revolucionária,

consiste no emprego do plasma como processo esterilizante [SHINTANI, 1995,

JACOBS, 1994]. Embora já se tenha nos últimos anos divulgado, e inclusive

comercializado, equipamentos atrelados ao emprego do plasma, com ênfase para o

Plazlyte® (Abtox) [CHAU ET AL, 1996] e Sterrad® (Jhonson & Jhonson)

[HERMELIN ET AL, 1998], há controvérsias a serem esclarecidas.

No âmbito da tecnologia, há que se estudar o efeito da composição do gás na

letalidade dos esporos [HERMELIN ET AL, 1998], já que nos equipamentos

comercialmente disponíveis o plasma é mero agente complementar, de

detoxificação do agente ativo principal H2O2, ou ácido peracético [KREBS ET AL,

1998; KUCHMA ET AL, 1996].

33

O uso desta técnica está sendo considerado para esterilização de certos

dispositivos médicos, devido a suas vantagens com respeito a compatibilidade do

material, comparado com os processos de esterilização existentes [RUSSEL,

HUGO, ALYFFE, 1999].

Comunicação de Rutala et al. [RUTALA, GERGEN, WEBER, 1999] apresenta

resultado satisfatório do processo atrelado ao plasma quanto à letalidade de

esporos de B. stearothermophilus em lúmens de formas tubulares com 1 mm, 2 mm

e 3 mm de diâmetro. Entretanto, Alfa e colaboradores [ALFA ET AL, 1996], em

estudo amplo e comparando a eficácia esterilizante do óxido de etileno (12:88) e

plasma, em tubos de plástico de 125 cm e 3,2 mm de diâmetro interno, trabalhando

com diferentes cepas microbianas, constatarem falha na eficácia do processo por

plasma de peróxido de hidrogênio.

Há dificuldades que certamente poderiam ser resolvidas com padronização

de condições de processo e validação [WERNER, 1995].

Addy [ADDY, 1991] apresenta premissas associadas ao gás precursor, ao

efeito da temperatura e embalagem. Suportes contendo ou não adição de soro e de

sais são possíveis fatores de influência [ALFA ET AL, 1996]. A importância da

umidade, fica entre questões operacionais e de eficácia [PENNA ET AL, 1999].

O plasma, considerado o quarto estado da matéria, (diferente dos estados

sólido, líquido e gasoso) é definido como uma nuvem de íons, elétrons e partículas

neutras, altamente reativas. A geração de um campo eletromagnético pela energia

de radiofreqüência induz a formação do plasma [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001]. O

campo acelera as partículas carregadas e os elétrons, uma vez que os íons são

muito mais pesados, sendo que a energia é tranferida ao plasma através das

colisões entre ambos. As entidades altamente reativas formadas respondem

34

diretamente pelo ataque e reação com os sítios nucleofílicos dos microrganismos

presentes no processo, seja ao nível da membrana celular ou do material genético

dos mesmos, promovendo sua inativação [MOISAN ET AL, 2001; RUSSEL, HUGO,

AYLIFFE, 1999 ].

Os radicais livres gerados no plasma de peróxido de hidrogênio apresentam-

se com cargas negativas e positivas, que excitados tendem a se reorganizar,

interagindo com moléculas essenciais ao metabolismo e reprodução microbianos,

ligando-se de maneira específica às enzimas, fosfolipídeos, DNA e RNA. Essa

reação química é extremamente rápida, viabilizando o processo de esterilização em

curto espaço de tempo [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001]. O processo empregando

plasma é indicado para esterilização de artigos termossensíveis. O ciclo de

esterilização dos equipamentos atuais ocorre em torno de 1 hora. É compatível com

a maioria dos metais, plásticos, vidros, borrachas, acrílicos e incompatível com

celulose. O produto final é água, dióxido de carbono, e oxigênio, não oferecendo

portanto toxicidade para os profissionais e usuários dos produtos. [MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2001]

O processo consiste em expor os materiais contendo microrganismos a

espécies reativas geradas pela ionização de um gás, utilizando-se para isso campos

eletromagnéticos [LEROUGE ET AL, 2000; RUTALA, GERGEN WEBER, 1999;

OSHIMA ET AL, 1997; HERMELIN ET AL, 1998].

Os ciclos de esterilização por peróxido de hidrogênio tipicamente

compreendem: vácuo, injeção, difusão, plasma e ventilação [RUSSEL HUGO,

AYLIFFE, 1999].

35

Quanto aos invólucros, as dimensões dos pacotes dependerão do

equipamento utilizado na esterilização, sendo fundamental o registro do seu

conteúdo, data de esterilização e prazo de validade.

O empacotamento dos artigos para esterilização pode se dar por meio da

utilização de embalagens diversas cujos requisitos conforme a Associação

Americana de Enfermeiros de Centro Cirúrgico (Association of Operating Room

Nurses – AORN) são: ser apropriada para as instalações e método de esterilização;

proporcionar selagem adequada e resistente, proporcionar barreira adequada; ser

compatível e resistir às condições físicas de esterilização; permitir adequada

remoção de ar; permitir penetração e remoção do agente esterilizante; proteger o

conteúdo do pacote de danos físicos; resistir a punções e rasgos; apresentar

ausência de furos; não conter ingrediente tóxico; não gerar partículas; apresentar

custo x benefício positivo; ser usada de acordo com as instruções descritas pelo

fabricante. Os tipos de embalagens podem ser tecidos, não tecidos, papel grau

cirúrgico, papel crepado, “containers” rígidos [MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001].

A validação e controle de rotina dos processos de esterilização usando

sistema de plasma ainda não estão regulamentados [RUSSEL, HUGO AYLIFFE,

1982].

Uma vez que o objetivo de qualquer processo esterilizante é a morte dos

microrganismos presentes no produto, o mecanismo mais adequado para constatar

a eficácia do processo é traduzido pela letalidade do processo, sendo os esporos

bacterianos, os sensores, e principais constituintes dos indicadores biológicos. Eles

são capazes de integrar todos os parâmetros envolvidos: tempo, concentração do

agente ativo, temperatura, umidade relativa, pressão, além de condições de

36

embalagem, uma vez que podem ser alocados internamente às embalagens dos

produtos a serem esterilizados [OLIVEIRA, 2000].

A resistência dos esporos bacterianos dos indicadores biológicos deve ser

obrigatoriamente superior à dos microrganismos originalmente presentes no material

a ser esterilizado, em geral formas vegetativas bacterianas, chamados de carga

natural do produto ou “bioburdem” [KRISTENSEN, 1970].

A cepa microbiana empregada na monitoração do processo esterilizante deve

preferencialmente apresentar determinadas características, como: elevada

resistência frente a particular processo esterilizante, ausência de patogenicidade,

fácil identificação, condições específicas de crescimento, não ser produtora de

pirogênio e permitir fácil padronização. É também desejável que apresente alguma

característica que a distingua de contaminações acidentais [PINTO, 1991].

Dentre os microrganismos mais estudados para validação deste processo, o

esporo de B. subitilis é o mais empregado, por apresentar maior resistência

comparativamente a um grande número de microrganismos, sejam eles

enterobactérias, gram-positivos, vírus, fungos, etc.

Ao se entender melhor os mecanismos de geração do plasma, pretende-se

buscar um agente esterilizante ideal, que seja de alta eficácia, atividade rápida,

penetrabilidade, compatibilidade, atoxicidade e custo efetivo, podendo vir a ser bem

aceito, tanto no âmbito da indústria como do conhecimento científico [RUTALA,

1996].

3. Objetivos

O objetivo deste trabalho é avaliar a eficácia da esterilização por plasma,

utilizando indicadores biológicos constituídos por esporos de Bacillus Subtilis , em

diferentes combinações de parâmetros, quando submetidos a ciclos sub-letais

37

envolvendo geração de entidades reativas a partir da aplicação de campo

eletromagnético sobre diferentes gases ou misturas de gases, propondo assim um

método de esterilização, eficaz e seguro, tanto para os operadores como para o

ambiente.

38

4. Material e Metodos.

Foram objetos deste estudo distintas combinações de parâmetros

envolvendo a formação do plasma, a saber: modo de geração do plasma, eficiência

dos gases utilizados, pressão, vazão de gás, umidade relativa, temperatura,

potência de rádio frequência e tempos de exposição ao plasma, identificação e

isolamento do fator esterilizante. Paralelamente foram realizados testes de

esterilização em equipamentos de raios-X, raios-Gama aceleradores de eletrons,

autoclave e óxido-etileno, além de irradiação por ultravioleta com o propósito de

comparar esses métodos em relação ao plasma. A evolução do gás de processo foi

monitorada por espectrofotometria ou espectrometria de emissão, e a análise do

material esterilizado foi feita empregando microscópio eletrônico de varredura.

4.1 Material

Foram utilizados como indicadores biológicos esporos de B. subtilis var.niger

ATCC 9372, produzidos e padronizados. Além desses foram utilizados também,

indicadores biológicos de esporos de Geobacillus stearothermophillus com carga de

1x106 UFC/suporte, fabricados por Steris Corporation, inoculados em tiras de papel

com dimensões de 5 mm x 50 mm.

O equipamento de estudo deste experimento foi um sistema tipo RIE

(Reactive Ion Etching) com câmara de volume de 7,45 Litros. Testes adicionais

foram realizados em um sistema tipo ICP (Inductively Coupled Plasma) cilíndrico

com tubo de quartzo de 1200 mm de comprimento X 150 mm de diâmetro, ICP

planar com câmara de 7,45 litros. Os geradores de rádio freqüência utilizados

nesses equipamentos são RFX600 com frequência de 13,6 MHz da Advanced

Energy.

39

Outros equipamentos utilizados para esterilização neste trabalho foram:

Difratômetro de Raios-X modelo URD6, fabricado por Zeiss Jena, em 1989 sendo

utilizado tubo de Cobre , (figura 59). Equipamento de raios-Gama, Gamacell, modelo

C6-220 Type B, fabricado por Atomic Energy of Canada Ltda, Otawa - Canada, em

1974, Recarregado com fonte de 60Co em 1997 (figura 61). Acelerador de eletron

Modelo DC. 1500/25/4-JOB188,com energia de 0,5 a 1,5 MEV, corrente de feixe de

0,3 a 25 mA, varredura de 48 polegadas (0,6 metros a 1 metro), potência de 150 KW

e potência máxima de feixe de 32,5 KW, fabricado por Radiation Dinamics inc.,

Westburg , NY, ano 1978 (figuras 62 e 63), Autoclave vertical Lutz Ferrando, com

potência nominal de 5 KW, produção de vapor de 6Kg/h,(figura 21) e Esterilizador

por Oxido-etileno, da SERCON Indústria e Comércio de Aparelhos Médicos

Hospitalares LTDA, modelo HS E 39/40HETO 3000, com controle automático e

câmara horizontal de 76 Litros de capacidade, 40 cm de diâmetro e 60 cm de

profundidade.

Os ciclos de esterilização por plasma foram monitorados por um

espectrofotômetro da Princeton Instruments Inc, modelo ST-120 (figura 15), e as

amostras constituidas pelos indicadores biológicos foram observadas por

microscopia eletrônica de varredura através de um SEM, marca Phillips, modelo

SEM515 (figura 16), localizado no Laboratório de Sistemas Integráveis da Escola

Politécnica da USP. E um Microscópio Eletrônico de varredura 6460LV, com

resolução nominal de 3nm para alto vácuo e 4nm para baixo vácuo, aumento de 8 a

300.000 X com Detector de elétrons retroespalhados, Detector de elétrons

secundários (alto e baixo vácuo), Sistema de EDS (Energy Dispersive Spectroscopy)

e Modo baixo vácuo - pressão ajustável de 10 a 270 Pa (0,1 a 2,7 mbar)

40

4.2 Metodos

O procedimento iniciou-se com a preparação dos esporos, sua padronização e

confecção de indicadores biológicos, sendo os mesmos em seguida expostos aos

processos esterilizantes, para enfim serem analisados quanto a morfologia e nº de

sobreviventes, conforme figura 1

Figura 1: Fluxograma evidenciando o experimento, desde a preparação dos esporos até a contagem do número de sobreviventes.

Para possibilitar os estudos de letalidade citados anteriormente, foi

desenvolvido preliminarmente em laboratório trabalho completo de obtenção de

lotes de suspensão de esporos de Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372,

padronizados quanto à carga microbiana, veiculados em suportes constituídos de

lamínulas de vidro de 18 mm x 18 mm, e acondicionados em pequenas placas de

petri do mesmo material, constituindo assim os indicadores biológicos, os quais

foram utilizados para todos os experimentos que se seguiram posteriormente (figura

2).

Exposição das amostras ao UV

Exposição das amostras ao acelerador de elétrons

Exposição das amostras ao raio gama

Exposição das amostras ao raio-X

Análise em microscópio eletrônico de varredura Recuperação dos microrganismos viáveis

Análise dos resultados

Contagem do número de sobreviventes

Exposição das amostras no reator de plasma comanálise espectrofotométrica

Inoculação em lâmínulas de vidro

Preparação dos esporos

41

Figura 2– Fluxograma mostrando as etapas seguidas para obtenção dos lotes de

suspensão de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, dos indicadores biológicos e desafios com agente esterilizante.

4.2.1 Repiques de manutenção:

Foi utilizada cepa padrão do microrganismo anteriormente descrito, cujos

repiques de manutenção foram feitos em tubos de ensaio contendo ágar para

dosagem de antibióticos nº 1 (MerckR) incubados a 35 ±2 °C por um periodo de 24

horas, sendo a massa microbiana obtida transferida para caldo caseína soja (DifcoR)

e incubada nas mesmas condições.

4.2.2 Obtenção de esporos:

Da suspensão anterior, 5 mL foram inoculados em cada garrafa de Roux

contendo 200 mL de ágar para esporulação, composto de extrato de levedura, caldo

nutriente, sulfato de manganês tetrahidratado, cloreto de cálcio hexahidratado, agar

e água destilada. As garrafas de Roux foram incubadas a 35 ± 2 °C por cerca de 12

Análise dos resultados

Exposição aos processos de esterilização

Acondicionamento em placas de petri de vidro

Preparação e inóculo dos suportes laminulares

Padronização das suspensões de esporos

Recolhimento e lavagem dos esporos

Obtenção de esporos

Repiques de manutenção

42

a 15 dias e acompanhadas diariamente com relação ao seu grau de esporulação

através de coloração específica utilizando solução de verde malaquita e safranina .

Este procedimento, sempre envolvendo 8 garrafas de Roux (R), foi efetuado

em 5 réplicas, ao final das quais originaram os grupos de esporos de G1 a G5, que

foram reunidos num único grupo e submetido à padronização, resultando na

suspensão padronizada S1. Procedimento idêntico foi repetido para a obtenção do

segundo e último grupo S2, sendo ambos utilizados para a execução das fases de

combinações de parâmetros I a III e IV a VI, respectivamente, conforme descrito na

tabela 1 a seguir:

Tabela 1: Preparação das culturas de esporos

GRUPOS DE

SUSPENSÃO

PADRONIZADA

GRUPOS DE

GARRAFAS (G)

Nº DE

GARRAFAS

G1 08

G2 08

G3 08

G4 08

S1

(fases I a III)

G5 08

G6 08

G7 08

G8 08

G9 08

S2

(fases IV a VI)

G10 08

43

4.2.3 Recolhimento e lavagem dos esporos:

A massa celular resultante foi recolhida de cada garrafa com 30 mL de água

destilada estéril, com o auxílio de 12 gramas de pérolas de vidro. A suspensão

resultante sofreu centrifugação a 3000 rpm durante 60 minutos para completa

separação, tendo sido a seguir submetida a tratamento térmico em banho-maria a

70 ± 2 ºC durante 30 minutos a fim de eliminar possíveis microrganismos na forma

vegetativa.

4.2.4 Padronização das suspensões de esporos:

A cada grupo de 5 cultivos utilizando 8 garrafas para cada um (G1 a G5, e G6

a G10) foram obtidas 5 suspensões, as quais foram reunidas em um único frasco

originando, então, “pool” de esporos S1 e S2. O procedimento de padronização foi

iniciado com o descongelamento e a promoção de choque térmico (70 ºC por 15

minutos), seguindo-se diluições decimais em água destilada estéril, sendo as

diluições de 10-6 a 10-11 submetidas à contagem, em triplicata, pela técnica de

semeadura em profundidade “Pour Plate” [ USP; 1981]. Após a padronização,

ambos os frascos contendo o “pool” de esporos S1 e S2 foram subdivididos em

alíquotas iguais de 10mL, as quais foram congeladas à temperatura de –4 °C, sendo

que as mesmas se destinaram a posterior diluição de 10 vezes e confecção dos

respectivos indicadores biológicos a serem utilizados nos estudos de letalidade

frente ao processo esterilizante por plasma. Ainda, o número obtido na

padronização foi representativo para todas as alíquotas, tendo em vista a condição

de uniformidade entre as mesmas.

44

4.2.5 Preparação e inóculo dos suportes laminulares:

Para os estudos posteriores, cada fração padronizada de 10 mL obtida

anteriormente foi descongelada e diluída na proporção de 1mL de suspensão para 9

mL de água destilada estéril, perfazendo o total de 10 novos tubos contendo a

solução diluída de 10 vezes, os quais foram utilizados para inóculo simultâneo de

grupo de indicadores biológicos, perfazendo o total de cerca de 800 unidades

inoculadas. O inóculo foi executado sob fluxo laminar utilizando pipeta automática

na razão de 0,1 mL por suporte [PINTO, CRUZ; 1996; PINTO, SAITO, IOSIF; 1994].

Estes suportes constituidos de lamínula de vidro foram por sua vez acondicionados

em triplicatas em placas de petri de vidro de 3” de diâmetro (figura 3) constituindo

então, os indicadores biológicos, os quais foram submetidos a grupos de desafios

sub-letais frente aos processos de esterilização propostos nesse trabalho. As etapas

seguidas para obtenção dos esporos são mostradas na figura 4.

Figura 3- Distribuição das lamínulas contendo B. subtilis var. niger ATCC 9372

acondicionados em placas de petri de vidro.

45

Fração padronizada e pronta para inoculação

Diluição de 10 vezes

Congelamento a -4 °C

Subdivisão do "pool" de esporos em alíquotas de 10 mL

Contagem por técnica de semeadura em profundidade

Diluições decimais

Choque térmico a 70 ºC

Descongelamento

"Pool" de esporos

(a)

(b)

(c)

(d)

Avaliação do grau de esporulação por cerca de 15 dias

Incubação a 35 ºC

Inoculação em garrafas de roux

Retirada de 5 mL dos lotes de suspensão

Preparação de 200 mL de ágar para esporulação em garrafas de roux

Obtenção dos lotes de suspensão

Incubação por 24 horas a 35 ºC

Tranferência da massa microbiana para caldo caseína soja

incubação por 24 horas a 35 ºC

Inoculação de cepa padrão

Tubos de ensaio contendo ágar

Tratamento térmico a 70 ºC

Centrifugação a 3000 rpm por 60 minutos

Recolhimento da massa celular

46

(e)

Figura 4 – Fluxograma mostrando as etapas realizadas para obtenção dos esporos

de B. subtilis var. niger Atcc 9372. (a) Repiques de manutenção, (b) Obtenção de esporos, (c) Recolhimento e lavagem dos esporos,(d) Padronização da suspensão de esporos, (e)Preparação e inóculo dos suportes laminulares, com obtenção dos indicadores biológicos.

4.2.6 Método de liberação mecânica dos esporos em agitador vortex

O procedimento de extração dos esporos de B. subtilis foi realizado por

processo de lavagem / liberação sob agitação mecânica e sob tempo de 1 minuto. A

técnica foi iniciada com a colocação de triplicata de indicadores biológicos

submetidos aos ciclos sub-letais a plasma sob capela de fluxo laminar vertical, onde

as placas de Petri foram abertas utilizando-se procedimento asséptico. Com o

auxílio de pinça estéril, cada unidade foi introduzida em tubo de ensaio de 20 x 150

mm e os esporos ressuspensos em 10 mL / suporte de água destilada estéril. A

liberação dos esporos provenientes dos suportes laminulares foi obtida utilizando-se

agitador orbital de tubos tipo vortex, marca IKA, modelo MS1, ao qual foi mantida

agitação na velocidade máxima (3000 rpm) por tempo previamente definido de 1

minuto. No processo de extração dos esporos de B. stearothermophillus foram

adicionadas aos tubos contendo 10 mL de água destilada estéril 20 g de pérolas de

Acondicionamento em placas de petri de vidro

Inoculação nos suporte sob fluxo lâminar

Diluição na proporção de 1 mL para 9 mL de água destilada estéril

Descongelamento de 10 mL da fração padronizada

47

vidro ocorrendo a liberação dos esporos após 10 minutos de agitação na veloxidade

máxima (3000 rpm).

4.2.7 Acompanhamento da letalidade e resistência

Após quebra do vácuo dentro da câmara utilizando nitrogênio com grau de

pureza de 99,5% (H2O < 5 ppm e O2 < 5 ppm), os indicadores biológicos

provenientes dos ciclos a plasma foram armazenados a temperatura ambiente

também por aproximadamente 24 horas.

Após decorrido o período citado acima, as amostras foram deslocadas para

capela de fluxo laminar, removidas das placas de petri e os esporos liberados das

lamínulas através de técnica de liberação de esporos ( conforme ítem 5.2.6).

As suspensões resultantes foram submetidas a tratamento térmico em banho

termostatizado a 70 ± 2 ºC durante 15 minutos. Após esse processo foram

efetuadas diluições decimais, sendo aquelas de 10-1 a 10-8 submetidas à contagem,

em triplicata, pela técnica de semeadura em profundidade “Pour Plate”, usando

cerca de 15 mL de ágar caseína – soja (Difco) estéril por placa. Após solidificação,

adicionou-se superficialmente camada extra de 5 mL do mesmo meio de cultura

estéril, de forma a originar um selo ou “overlay”. A incubação das placas manteve-se

na posição invertida em estufa a 35 ± 2 ºC, durante 72 horas, seguindo-se a

contagem do número de UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Seguiu-se então

com as construções das curvas de letalidade e estudos estatísticos pertinentes.

4.2.8 Ciclos laboratoriais de exposição ao plasma

O desenvolvimento do trabalho abrange duas naturezas de área de

conhecimento, sendo o primeiro (imprescindível para que o próprio desafio tenha

48

sentido), os mecanismos de geração do plasma e de como viabilizá-lo, em desafios

controlados a corpos de prova que se constituem em monitores biológicos do

sistema, também chamados de indicadores biológicos (IB); estes são os agentes

responsáveis pelo segundo segmento, de natureza microbiológica, relativo à eficácia

do processo.

4.2.9 Mecanismos de geração de plasma

Como parte preliminar do trabalho, foram utilizados indicadores biológicos de

Geobacillus stearothermophilus comerciais Steris Corporation, sobre suporte

celulósico (tiras de papel), com carga inicial de 106 UFC/suporte, tendo por objetivo

avaliar os efeitos do plasma de oxigênio sobre o suporte celulósico analisando o

nível de esterilização e os danos causados no suporte; além da influência de uma

barreira à penetração do gás.

Neste experimento as condições de processo foram: tempos de 15 a 75

minutos, e o tempo de difusão de 10 minutos. Foram utilizadas duas potências

diferentes, 100 e 150 W, sendo a maior para tempos de 15 a 30 minutos e a menor

para tempos de 30 a 75 minutos. A pressão foi mantida em 330 mTorr e a vazão em

500 sccm.

Os indicadores biológicos foram inseridos em tubos de ensaio (figura 5a), e

os mesmos foram fechados com tampa de PVC, as quais possuiam orificio de 4 mm

de diâmetro (Figura 5b), de modo que o gás de processo pudesse entrar por ele

atingindo o suporte contendo os microrganismos. A fim de evitar possíveis

contaminações, foram colocados na tampa de PVC, filtros de 0,5 µm ( figura 5c).

Após a montagem do sistema os tubos foram inseridos dentro da câmara sobre o

eletrodo do reator (figura 5d). A pressão foi reduzida até 10-3 Torr por sistema de

vácuo composto de bomba mecânica rotativa e bomba de alta vazão tipo roots. O

49

sistema de circulação de água de refrigeração do eletrodo foi ajustado a 5oC,

mantendo a temperatura durante todo o processo próxima à do ambiente.

a

b c d Figura 5- Preparação dos suportes para exposição das amostras contendo papel

inoculado com Geobacillus sterothermophillus com carga de 1 x 106 UFC/suporte ao processo de plasma. (a) Sistema pronto para processo em plasma, (b) Vista frontal da tampa de PVC, evidenciando o orifício de 4mm de diâmetro para passagem do gás de processo, (c) Vista interna da tampa de PVC, evidenciando a posição do filtro de 0,5 µm, (d) Sistema devidamente montado contendo Geobacillus stearothermophillus em carga inicial de 1,0 x 106 UFC/suporte, posicionado sobre o eletrodo do reator pronto para iniciar processo de plasma (desafio).

Outro estudo preliminar foi para avaliar os efeitos, sobre os indicadores

biológicos, quando submetidos ao plasma obtido em sistema com acoplamento

capacitativo modo RIE (Reactive Ion Etching), sob combinações de parâmetros de

processo do mesmo, tais como pressão e potência RF (rádio frequência), além da

natureza do gás inserido no sistema, responsável pela diversidade de entidades do

plasma. No início do trabalho foram verificados e qualificados os processos de

esterilização por plasma utilizando os indicadores biológicos (Estudo da Eficácia

50

Biológica) no desenvolvimento de processos de plasma em um sistema de

acoplamento capacitivo modo RIE (Figura 6).

.

Figura 6: Esquemático do Sistema de plasma modo RIE com acoplamento capacitivo, mostrando o posicionamento da placa de petri dentro da câmara.

Neste sistema o indicador biológico foi colocado em uma placa de petri sobre o

eletrodo do reator (Figura 7). A pressão no sistema foi reduzida até 10-3 Torr. O

sistema de circulação de água de refrigeração do eletrodo foi regulado a uma

temperatura de 5 ºC. Após a redução da pressão, foi injetado o gás de processo no

interior do reator por meio de controladores de fluxos de massa (mass flow

controllers). Para a realização dos processos de esterilização foram utilizados como

gases de processo, o oxigênio e peróxido de hidrogênio. Sendo o O2 utilizado com

grau de pureza 99,998% fornecido pela White Martins, e o H2O2 solução a 30%

estabilizada da Baker.

51

Figura 7: Placa de petri contendo lamínula de vidro de 18 X 18 mm em triplicata

inoculadas com B. Subtilis var. niger ATCC. 9372 com carga inicial de 2 x107 UFC/suporte, posicionada sobre o eletrodo, dentro do reator de plasma

Os processos foram realizados tanto com oxigênio puro ou com misturas

entre oxigênio e peróxido de hidrogênio (conforme tab. 2 e 3).

Após a injeção dos gases o plasma foi gerado por meio de um gerador de

rádio freqüência (RF) que opera em 13,56 MHz o qual permitiu controlar a potência

aplicada ao processo. Desta forma foram controlados tanto a geração de radicais no

plasma, como o ataque iônico nas amostras.

Os ciclos sub-letais obedeceram a tempos de contato variáveis: 2, 5, 10, 15,

30, 45, 60, e 90 minutos.

O processo de plasma foi executado sob vácuo, mas o carregamento das

amostras foi a pressão atmosférica, temperatura ambiente (22 ºC) com umidade

relativa de 60 ± 5%. Após o posicionamento das amostras no reator, a pressão foi

reduzida e a umidade relativa foi de 30 ± 5%, mantida constante

52

As amostras contendo os indicadores biológicos - em triplicata - foram

colocadas no interior do equipamento, cada qual correspondendo ao seu tempo de

exposição, perfazendo um total de 8 ciclos por potência aplicada no gerador de

plasma. Os processos foram realizados conforme mostrados na figura 8.

As etapas foram divididas conforme tabelas 2 e 3:

Tab. 2 - Parâmetros de processo utilizados na esterilização por plasma de oxigênio

puro com grau de pureza 99,998%.

FASE I Modo Vazão

(sccm) Gás Pressão

(mTorr) Potência

(W) Tempo (min)

U.R (%)

RIE 200 O2 100 100,150 2,5,10,15,30,45,60,90 60-70

Tab. 3 - Parâmetros de processo utilizados na esterilização com mistura de gases. Oxigênio 99,998% e solução de peróxido de hidrogênio a 30%.

FASE II

Modo Vazão (sccm)

Gás Concentração (%)

Pressão (mTorr)

Potência (W)

Tempo (min)

U.R (%)

RIE 200 O2 + H2O2

5,10,20 100 100,150 2,5,10,15,30,45,60,90

60-70

53

Geração do plasma

Aplicação da potência de rádio frequência atraves de geradores de RF

Ajuste da pressão de processo através do controle de vácuo da câmara

Introdução do gás de processo através dos controladores de fluxo de massa

Ajuste dos parâmetros de processo

Redução da pressão para próximo de 1 mTorr

Abertura da válvula de vácuo da câmara

Abertura da válvula da linha de vácuo

Acionamento das bombas de vácuo+ sistema de refrigeração

(a)

(b)

Figura 8 – Fluxograma evidenciando as etapas do processo de plasma (a) Ajuste

dos parâmetros de processo e limpeza da câmara. (b) Inserção das amostras e processo de plasma.

O material processado foi submetido a procedimento em que os esporos

foram após choque térmico, extraídos, transferidos para meio de cultura e em

ambiente controlado para serem submetidos a enumeração das colônias de bacilos

sobreviventes ao processo (figuras 9 e 10). Também foi utilizado um microscópio

Amostra embalada e enviada paralaboratório de controle microbiológicopara contagem do nº de sobreviventes

Com a tampa da câmara semi-abertaé retirada a placa de petri, com o auxiliode uma pinça estéril

Adiçao de nitrogêniopara abertura da câmara

Fechamento da válvula da linhade vácuo e medidor de pressão

Fechamento da válvula de vácuoda câmara

Abertura da válvula de vácuoda câmara para eliminação dogás residual

Interrupção do fornecimentodo gás de processo

Interrupção do fornecimentode potência de RF

54

eletrônico de varredura para verificar variações na morfologia dos esporos

decorrente dos processos de esterilização.

Figura 9 – Fluxograma geral das etapas de preparação de material para liberação e

enumeração dos esporos.

Figura 10- Fluxograma das etapas de liberação dos esporos após processo de

esterilização (desafio) realizado nos dois tipos de indicadores B. subtilis e B. stearothermophillus.


Incubação na posição invertida35 ºC por 48 horas

Adição de + 15 mL de ágar caseína -soja

Solidificação

Semeadura em profundidade15 mL de ágar caseína -soja


Tratamento térmico70 °C por 15 min.

Centrifugação em equipamento vortex3000 rpm por 1 min.

Lamínulas de vidroTriplicatas em tubos de ensaio com 27 mL de água estéril


Incubação na posição invertida45 ºC por 72 horas

Adição de + 15 mL de ágar caseína -soja

Solidificação

Semeadura em profundidade15 mL de ágar caseína -soja


Tratamento térmico80 ºC por 15 min.

Centrifugação em equipamento vortex3000 rpm por 10 min.

PapelUnidade em tubo de ensaio com 10 mL de água estéril

adição de 20 g de pérolas de vidro

Liberação dos esporos

Meio de cultura Tubos de ensaio com água destilada Material auxiliar ( pinças, tesouras, etc.)

Esterilização em autoclave

Acondicionamento do material para esterilização em autoclave

Preparação do material para recuperação dos microrganismos viáveis

55

A fim de comparar a eficácia dos processos de esterilização por plasma, com

outros processos esterilizantes, alguns indicadores biológicos contendo esporos de

B. stearothermophillus e B. subtilis, foram expostos a irradiação por U.V; raios–X;

raios-gama, autoclave e aceleradores de elétrons, sendo em seguida feita a

contagem dos sobreviventes. Para isto foram utilizados equipamentos específicos

para cada exposição.

Os processos de plasma foram caracterizados por meio de um sistema de

espectrometria de emissão que é baseada na emissão de fótons das espécies

excitadas.

Durante os processos de plasma os elétrons de um átomo ou molécula

podem ganhar energia suficiente para passar para um nível mais energético, onde

ficam em órbita durante um certo intervalo de tempo e em seguida decaem para um

nível de menor energia. Durante o processo de decaimento ocorre perda de energia

por parte desse elétron, sendo que essa energia pode ser emitida em forma de

fótons. A espectroscopia de emissão é uma técnica não intrusiva pois não há

contato com o plasma, sendo ainda possível realizar medida em tempo real .

Em processo de plasma que envolve materiais orgânicos há um

acompanhamento da evolução do oxigênio e seus compostos como o dióxido de

carbono, possibilitando avaliar de forma qualitativa como está ocorrendo o ataque

químico.

Desta maneira, durante o processo de esterilização espera-se identificar a

composição química do plasma, conseguindo acompanhar tanto a absorção das

espécies reativas do plasma pelo material biológico dos esporos, quanto a emissão

de material devido a degradação das membranas dos esporos. Do ponto de vista

56

químico todo material biológico provocará alterações no plasma, sendo possível sua

caracterização através desta técnica [D’AGOSTINO, 1990].

Testes de esterilização suplementares.

Raios-X – As lâmínulas contendo os indicadores biológicos foram inseridas uma a

uma no porta amostras giratório fazendo um total de três amostras por ciclo; e as

mesmas foram direcionadas frente ao colimador ( fig.59). Após posicionar então as

amostras,a porta do difratômetro foi fechada e aplicada a tensão e corrente

respectiva a cada potência desejada expondo as amostras a tempo de 30 minutos

cada. As potências trabalhadas nese experimento foram de 600 a 1200 Watts. Para

isso foram variadas as correntes de 20 a 30 mA, e as tensões de 30 a 40 Kvolts.

Terminado o tempo de exposição as amostras foram enviadas para contagem do

número de sobreviventes.

Raios Gama – As placas de petri (fechadas) contendo as amostras em triplicata

foram inseridas no porta amostras do equipamento gamacell, modelo C6-220 ( fig.

61), em seguida o porta amostras foi fechado e a placa de petri foi baixada em

direção à fonte de radiação. Como nesse equipamento a dose de radiação é fixa, a

amostra permaneceu por tempos de 86,3 min a 432 minutos a fim de que fosse

obtida as doses de radiação de 5 a 25 KGy. Após esses tempos, as amostras foram

retiradas e enviadas para contagem do número de sobreviventes.

Acelerador de elétrons – as amostras foram colocadas sobre esteiras, as quais

levaram as mesmas até a fonte de radiação (figura 62) a uma velocidade de

6,72m/min para as doses de 5 e 10 KGy, e 3,36 m/min para dose de 25 KGy (tab.

57

9), tendo um contato com o cone de varredura - onde é emitida a radiação- por

tempos de 0,466 segundos para 5 e 10 KGy e 0,892 segundos para 25 KGy (figura

63). Só que nesse caso como o poder de penetração é menor, foi retirada a tampa

da placa de petri e a mesma foi recoberta com um filme plástico, a fim de evitar

contaminação da amostra. Após o término de cada processo as amostras foram

retiradas fechadas novamente com a tampa da placa de petri, embalada e enviadas

para contagem do número de sobreviventes.

58

5. Resultados e discussão

Para verificar a eficácia do plasma como agente esterilizante iniciaram-se os

testes utilizando um tubo de ensaio, no qual foram inseridas tiras de Geobacillus

stearothermophillus. Esse tubo foi fechado com uma tampa de PVC, a qual possuía

um pequeno orifício que dificultava a entrada do gás de processo.

Os resultados obtidos nestes processos não foram satisfatórios (figura 11),

sugerindo que quanto maior o contato da amostra com o plasma, maior será o poder

de esterilização devido aos agentes gerados pelo plasma.

Figura 11: Gráfico da sobrevivência de esporos de Geobacillus stearotehrmophillus inoculados em tiras de papel de 50 x 5 mm, com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/suportes submetidos à esterilização por plasma em sistema RIE, utilizando tubos de ensaio tipo pyrex com dimensões de 150 x 25 mm, com tampa de PVC possuindo orifício de 4 mm de diâmetro para entrada do gás de processo e filtro de 0,5 µm. Utilizando potência de Rádio freqência de 100 W, 330 mTorr de pressão e 500 sccm de vazão de oxigênio com pureza de 99,998%.

0 10 20 30 40 50 60 70 801

2

3

4

5

6 Redução logaritmica Resposta polinomial

loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

59

Admitindo-se isto, analisou-se então a reação dos esporos de Geobacillus

stearothermophilus, quando expostos diretamente sob a ação do plasma. Nos

processos anteriores o tubo de ensaio possuia apenas um pequeno orificio, o que

dificultava a ação direta dos radicais sobre a amostra. Nesta etapa utilizou-se placas

de petri de vidro sem a tampa, a fim de que não formasse a barreira como no caso

anterior, fazendo com que os radicais penetrasse mais facilmente na amostra,

permitindo a ação direta do gás sobre o microrganismo.

O processo nessa etapa se deu da seguinte forma: placas de petri de vidro

(sem tampa), contendo tiras com Geobacillus stearothermophilus foram inseridas no

reator (figura 12). A pressão foi baixada para 10-3 Torr, e inserido o gás de processo.

Os tempos usados nesta fase variaram de 2 a 60 minutos, com potência 100W,

pressão de oxigênio de 0,333 Torr e vazão de O2 igual a 500 sccm.

Os resultados da contagem dos sobreviventes, mostraram a esterilização de

forma eficiente (Figura 13), embora com tempos maiores tenha ocorrido degradação

do material celulósico. Essa degradação ocorreu não por aquecimento, pois a

temperatura de processo permaneceu por volta de 50 ºC, mas sim por ataque

iônico/químico ocasionado pelo plasma.

Um modo de evitar a degradação de material celulósico é acompanhar o

processo por meio de um espectrofotômetro. A espectroscopia de emissão é uma

técnica não intrusiva pois não há contato com o plasma sendo ainda possível

realizar medida em tempo real [D’AGOSTINO; 1990] .

Com essa técnica foi possível observar o consumo de oxigênio durante o

processo, tanto do microrganismo, como da degradação do material celulósico

(figura 14). Comparando os resultados, pode-se notar que de 7 a 10 minutos houve

boa taxa de mortalidade, sem que houvesse degradação do papel, já para os

60

tempos de 30 a 60 minutos o ataque do plasma foi intenso sobre o material

celulósico, causando degradação do mesmo.

Figura 12: Posicionamento da amostra de Geobacillus stearothermophillus

inoculados em tiras de papel com dimensões de 5 x 50 mm e carga inicial de 1,0 x 106 UFC/suporte sobre o eletrodo dentro da câmara de plasma de volume de 7,45 litros

Figura 13: Gráfico da sobrevivência de esporos de Geobacillus stearothermophillus inoculados em tiras de papel com dimensões de 5 x 50 mm, com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/ suporte submetidos à esterilização por plasma modo RIE, com potência de RF aplicada de 100 Watts, pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 4,8 e tempo de 30 minutos, utilizando placas de petri sem tampa.

0 10 20 30 40 50 60

0

1

2

3

4

5

6Redução logaritmica Resposta polinomial

loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

61

Figura 14: Eletromicrografia evidenciando a degradação do suporte celulósico com dimensões iniciais de 5 x 50 mm, exposto ao processo ao processo de plasma modo RIE por tempo de 30 minutos, pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 99,998% e potência de Rádio Frequência de 100 Watts.

O consumo de oxigênio durante o processo, foi analisado por

espectrofotômetro (Figura 15), e os danos causados no material que continham a

amostra (tira celulosica), bem como a comparação do microrganismo antes e após o

processo foram analisados por microscopia eletrônica (figura 16).

Por análise espectrofotométrica, foi possível observar o consumo de oxigênio

pelos microrganismos (Figura 17), fazendo o monitoramento do tempo de formação

da raia de 777.5 nm, a qual corresponde a primeira ionização do oxigênio atômico,

permitindo assim observar durante o processo de esterilização a corrosão química

dos microrganismos através do consumo de oxigênio pela redução temporal de

amplitude dessa raia, ocorrendo um aumento dessa amplitude ao final do processo

e um novo ciclo de redução no inicio da degradação do suporte (Figura 18), ou seja

durante o processo os microrganismo sofrem corrosão seguindo um consumo

gradativo até por volta de 7 minutos, quando há então um aumento do consumo de

62

oxigênio até por volta de 10 minutos. Após esse tempo a corrosão aumenta

novamente, mostrando que o processo começa a atacar o material. Com essa

técnica foi possível observar o ponto final da esterilização, fazendo com que à

medida que começasse a aumentar a amplitude da raia de oxigênio, fosse desligado

o gerador de RF, extinguindo o plasma e conseqüentemente evitando a degradação

do material celulósico.

Figura 15: Espectrofotômetro utilizado nas avaliações dos ciclos de esterilização por plasma.

Figura 16 – Microscopio Eletrônico de Varredura SEM 515

63

Figura 17: Exemplo de um espectro de plasma de oxigênio com duração de 15 segundos. Pressão de 330 mTorr , vazão de 500 sccm e potência de 100 Watts. A raia de 777.5 nm corresponde a primeira ionização do oxigênio atômico

Figura 18: Evolução da raia do oxigênio durante o processo de esterilização por plasma modo RIE, utilizando esporos de Geobacillus stearothermophillus inoculados em tiras de papel de 5 x 50 mm com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/mL, sob as seguintes condições: Pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 99,998%, potência de RF de 100 Watts e tempo de 30 minutos.

300 400 500 600 700 800 900 1000

777,5

nm

Inte

nsid

ade(

u.a.

)

comprimento de onda (nm)

0 2 4 6 8 10

0

2

4

6

8

10

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 18001600

1650

1700

1750

1800

1850

1900

1950

2000

2050

Inte

nsid

ade

(a.u

.)

Tempo(s)

0

0

Limite do tempo de processo antes de atacar o suporte celulósico.

Ponto final do processo de esterilização

64

Pode-se observar também por análise microscópica o efeito que o plasma

causa na estrutura do microrganismo, e como ele começa a agir já nos primeiros

minutos, e conforme aumenta o tempo de exposição, o microrganismo vai se

desintegrando, restando no final do processo basicamente o material celulósico

(Figura 19). Isso ocorre provavelmente pela corrosão química sofrida pela amostra

durante o processo, a qual rompe a membrana celular provocando lesões

estruturais, facilitando a entrada dos radicais livres na célula microbiana, e por sua

vez provocando alterações funcionais graves, tornando não mais viáveis mesmo os

esporos não completamente destruídos.

Na figura 20 é mostrado um microrganismo submetido a um processo de

esterilização em autoclave (figura 21), onde o mecanismo de ação consiste em

coagulação e denaturação irreversível de proteínas e enzimas celulares, sendo que

o tempo necessário para atingir o nível de esterilidade no geral proposto é reduzido

da ordem de 15 a 20 minutos e a condição de pressão adotada promove rápido

aumento da temperatura, o qual é importante para morte microbiana [RUTALA,

WEBER;1996].

Figura 19: Eletromicrografia de esporo de Geobacillus stearothermophillus

inoculados em tiras de papel de 5 x 50 mm com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/mL, expostos ao plasma modo RIE, sob as seguintes condições: Pressão de 330 mTorr, vazão de 500 sccm de oxigênio 99,998%, potência de RF de 100 Watts e tempo de 10 minutos.

65

Figura 20: Eletromicrografia de esporo de Geobacillus stearothermophillus

inoculados em tiras de papel de 5 x 50 mm com carga inicial de 1,0 x 106 UFC/mL, após a esterilização por autoclave, por tempo de 15 minutos à 121 °C e 1 atm.

Figura 21 - Autocalve vertical Lutz Ferrando

Comparando os dois processos anteriores pode-se observar que o processo

de plasma foi mais agressivo que o processo em autoclave, conseguindo neutralizar

66

o microrganismo em menor tempo, com menor temperatura e baixa pressão e

conseqüentemente menores danos ao material processado.

Com essa etapa preliminar realizada, a etapa seguinte foi expor as amostras

contendo esporos de Bacillus subitilis inoculadas em lamínulas de vidro, com carga

microbiana de 20 milhões de Unidades Formadoras de Colônias por mL (2,0 x 107

UFC/mL) (figura 22) ao processo de plasma no sistema RIE, utilizando ainda o gás

oxigênio 99,998.

Figura 22: Eletromicrografia de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte antes de sofrer processo de esterilização por plasma.

Os primeiros testes realizados para esse tipo de suporte / indicador foram

feitos utilizando-se os parâmetros dos testes preliminares realizados com

Geobacillus stearothermophillus. Porém, os resultados não corresponderam às

expectativas. Isso ocorreu principalmente devido ao suporte, pois o material

celulósico possui porosidade que facilita a penetração do gás, fazendo com que o

mesmo pudesse interagir mais facilmente com os microrganismos, além disso, ainda

existe o fato de que os microrganismos ficam mais espalhados no suporte, e por fim

67

os Geobacillus stearothermophillus são maiores que os B subtilis, o que

adicionalmente pode facilitar o ataque por parte do plasma. Já para o suporte de

vidro, o plasma atinge somente a superfície da lamínula, interagindo com os

microrganismos presentes na superfície. De uma certa maneira ao inocular a

lamínula, os microrganismos ficam dispostos uns sobre os outros, formando uma

espécie de biofilme. O processo para conseguir destruir esse biofilme deve ser mais

agressivo, o que não era conseguido ao se utilizar os parâmetros preliminares. A fim

de corrigir esse problema realizaram-se então primeiramente testes, variando

pressão e vazão.

O primeiro teste foi com pressão de 330 mTorr e fluxo de 200 sccm potência

de 50, 100 e 150 Watts para tempos de 30 minutos (figura 23). Com essa vazão e

potências tem-se uma quantidade de espécies reativas que mantêm-se dentro da

câmara por mais tempo que nas condições seguintes devido à pressão ser maior, o

que implica em maior ataque ao material a ser estertilizado, podendo em certas

instâncias não ser aplicável a todo tipo de material.

O segundo teste foi com pressão de 50 mTorr, vazão de 81 sccm, potências

de 50, 100 e 150 Watts para tempos de 30 minutos (figura 24). Neste caso a

quantidade de espécies reativas é bem menor que no anterior, e o tempo de

permanência das mesmas, é relativamente curto devido à pressão adotada, isso faz

com que o material sofra menos danos, o que pode implicar em uma possível

aplicação para materiais mais sensíveis a esse tipo de processo por plasma.

O terceiro teste foi com pressão de 100 mTorr, vazão de 200 sccm e

potências de 50, 100 e 150 Watts (figura 25). Neste caso as espécies reativas

geradas na mesma quantidade que no primeiro caso, tendem a permanecer por um

tempo menor dentro da câmara, agredindo o material em menor proporção, e

68

possibilitando sua aplicação a uma quantidade de material a ser esterilizado bem

maior. O primeiro e o segundo teste não produziram resultados satisfatórios, sendo

assim descartadas essas condições. Já no terceiro teste os resultados foram

significativos, o que levou a fixar essas condições de pressão, vazão, e variar o

tempo e potência. Observa-se através de análise microscópica, que após processo

de 150 W, 200 sccm, 100 mTorr e 20 minutos, os espaços entre os microrganismos

se acentuaram, e os microrganismos restantes foram deteriorados pelo processo

(figura 26).

Figura 23: Gráfico do logaritmo do número B. Subtilis var. niger ATCC 9372,

inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga inicial de 2,0 x107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo de plasma modo RIE por tempo 30 minutos, pressão de 330 mTorr, 200 sccm de oxigênio 99,998% e potências de RF de 50 100 e 150 Watts.

0 5 10 15 20 25 303,63,84,04,24,44,64,85,05,25,45,65,86,06,26,46,66,87,07,2

50 Watts 100 Watts 150 Wattslo

garít

mo

do n

úmer

o de

sob

revi

vent

es

tempo (min)

69

Figura 24: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger

ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, com tempo de 30 minutos, pressão de 50 mTorr, vazão de 81 sccm de oxigênio 99,998%.

0 5 10 15 20 25 30

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,57,07,5

50 Watts 100 Watts 150 Wattslo

garít

mo

do n

úmer

o de

sob

revi

vent

es

tempo (min)

Figura 25: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, com tempo de 30 minutos, pressão de 100 mTorr, vazão de 200 sccm de oxigênio 99,998%.

0 5 10 15 20 25 302,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

50 watts 100 watts 150 wattslo

garít

mo

do n

úmer

o de

sob

revi

vent

e

tempo (min)

70

Figura 26: Eletromicrografia de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, após a exposição ao plasma modo RIE por tempo de 20 minutos, potência de 150 Watts, pressão de 100 mTorr e vazão de 200 sccm de oxigênio 99,998%.

Fixados então a pressão e a vazão (100 mTorr e 200 sccm respectivamente),

as amostras foram expostas por tempos de 40, 80 e 120 (segundos), 3, 6 9, 12, 15,

20, 30, 45, 60, 80, 120 ( minutos), com potências de RF de 25, 50, 100, 150 Watts

para cada tempo. Assim observou-se que para potências de 25 e 50 Watts, a carga

microbiana sofreu pequena redução, mesmo para os tempos maiores (2 horas). Já

para as potências de 100 e 150 Watts, a carga microbiana sofreu redução de 2,0 x

107 para próximo de zero com tempo de 20 minutos aproximadamente (figura 27). O

principal mecanismo de ação desse processo é a dissociação do gás e o ataque

iônico que ocorre sobre a amostra, o qual causa a erosão dos microrganismos

átomo a átomo. Isso ocorre através da produção de espécies reativas, que

promovem o processo de oxidação e degradação do material, transformando a

parede microbiana em produtos voláteis [MOISAN ET AL,2001].

Esses processos foram acompanhados por análise espectrofotométrica a fim

de determinar o ponto final do processo de esterilização (figura 28). Outro

71

procedimento, pensando-se em sua aplicação para materiais termolábeis, foi a

leitura da temperatura de processo, a qual é mostrada na tabela 4.

Tabela 4: Temperatura dos processos em sistema RIE.

Eletrodo refrigerado a

–8 ºC

Eletrodo refrigerado a

5 ºC

Tempo (min)

Temperatura(°C)

Temperatura(°C)

1 25 35 2 26 36 3 27 37 4 28 38 5 29 39 6 30 40 7 32 41 8 33 42 9 35 43

10 36 44 11 37 45 12 38 46 13 39 47 14 41 49 15 42 50 16 43 51 17 44 52 18 45 54 19 46 55 20 47 57

*Potência 150 Watts, Vazão de oxigênio de 200 sccm, e pressão de 100 mTorr

72

Figura 27: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, com tempos de 20 a 120 minutos, e potências de 25 a 150 Watts, pressão de 100 mTorr, vazão de 200 sccm de oxigênio 99,998%.

Figura 28: Espectro de um processo de 30 minutos com 150 Watts de potência, 200 sccm de vazão de oxigênio 99,998% e 100 mTorr de pressão, utilizando B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte.

0 20 40 60 80 100 120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Redução logaritmica 25 Watts Redução logaritmica50 Watts Redução logaritmica100 WattsRedução logaritmica150 Watts

Resp. polin. 25 Watts Resp. polin. 50 WattsResp. polin. 100 Watts Resp. polin. 150 Watts

loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

1850

1900

1950

2000

2050

2100

2150

inte

nsid

ade

(u.a

)

Tempo (s)

Ponto final do Processo de esterilização

73

A fase II deste projeto consistiu na esterilização dos indicadores biológicos em

equipamento RIE utilizando misturas de oxigênio com peróxido de hidrogênio.A

esterilização é o resultado da combinação da vaporização do peróxido de hidrogênio

e radicais livres gerados do gás durante o processo de plasma

[SPRINGSTORE;1994]

Neste procedimento as amostras de B. subitilis foram expostas a um mistura

de oxigênio e peróxido de hidrogênio nas concentrações de 180 sccm de oxigênio

para 20 sccm de peróxido de hidrogênio, 170 sccm de oxigênio para 30 sccm de

peróxido de hidrogênio e 160 sccm de oxigênio para 40 sccm de peróxido de

hidrogênio, sob uma potência de 50, 100 e 150 Watts nos eletrodos, uma pressão

de 100 mTorr, e tempos de 20, 30 e 40 minutos. Adicionalmente utilizou-se processo

de esterilização por plasma de peróxido de hidrogênio puro. Os resultados desses

processos mostraram-se pouco eficientes para as potências de 50 e 100 Watts,

reduzindo muito pouco a carga microbiana.

Já para a potência de 150 Watts, os resultados foram satisfatórios, reduzindo

a carga microbiana para próximo de zero em poucos minutos de processo. Os

resultados desses processos são mostrados nos gráficos a seguir (Figuras 29, 30 e

31).

74

Figura 29: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 180 sccm de oxigênio 99,998% e 20 sccm de peróxido de hidrogênio solução 30%.

Figura 30: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger

ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 170 sccm de oxigênio 99,998% e 30 sccm de peróxido de hidrogênio solução 30%.

0 5 10 15 20 25 30

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

Redução logaritmica Resposta polinomial

0 10 20 30 40

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,0

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

Redução logaritmica 50 Watts Redução logaritmica 100 Watts Redução logaritmica 150 Watts Resp. polin. 50 Watts Resp. polin. 100 Watts Resp. polin. 150 Watts

75

Figura 31: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 20 e 30 sccm de de peróxido de hidrogênio puro solução 30%.

Por análise microscópica foi possível observar os danos causados na membrana

celular dos microrganismos ( figuras 32, 33 e 34), quando expostos a processos por

plasma. Observa-se que a corrosão química sobre os microrganismos é muito

grande, fazendo com que sejam inativados completamente. As figuras com

ampliação de 30000 vezes mostram mais detalhadamente, como foram agredidos

quimicamente pela ação do plasma.

0 5 10 15 20

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

20 sccm H2O2

30 sccm H2O2

76

Figura 32 - Eletromicrografia evidenciando o ataque químico sobre as amostras de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro com carga inicial de 2x107 UFC/suporte, expostas a processos de plasma de oxigênio + peroxido de hidrogênio nas vazões de 160 sccm + 40 sccm respectivamente, com pressão de 100 mtorr e tempo de 15 minutos. (a) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 5000 vezes, (b) 150 Watts de potência de RF aplicada, ampliação de 5000 vezes, (c) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000, (d) 150 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000 vezes.

(a) (b)

(c) (d)

77

Figura 33 - Eletromicrografia evidenciando o ataque químico sobre as amostras de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro com carga inicial de 2x107 UFC/suporte, expostas a processos de plasma de oxigênio + peroxido de hidrogênio nas vazões de 180 sccm + 20 sccm respectivamente, com pressão de 100 mtorr e tempo de 15 minutos. (a) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 5000 vezes, (b) 150 Watts de potência de RF aplicada, ampliação de 5000 vezes, (c) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000, (d) 150 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000 vezes.

(a) (b)

© (d)

78

Figura 34- Eletromicrografia evidenciando o ataque químico sobre as amostras de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro com carga inicial de 2x107 UFC/suporte, expostas a processos de plasma de oxigênio + peroxido de hidrogênio nas vazões de 190 sccm + 10 sccm respectivamente, com pressão de 100 mtorr e tempo de 15 minutos. (a) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 5000 vezes, (b) 150 Watts de potência de RF aplicada, ampliação de 5000 vezes, (c) 100 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000, (d) 150 Watts de potência de RF, ampliação da micrografia de 30000 vezes.

(a) (b)

© (d)

79

Nas figuras 29, 30 e 31 são mostrados resultados de processo de plasma de

peróxido de hidrogênio, utilizando um Mass Flow Controller para leitura de vazão do

gás. Entretanto devido ao poder biocida do peróxido de hidrogênio esperava-se

resultados melhores que os obtidos com plasma de oxigênio. Tendo-se em conta

que o que estava ocorrendo pudesse ser decorrente de uma contaminação, buscou-

se eliminar possíveis problemas, como contaminação da câmara (que parecia ser o

mais provável), contaminação do eletrodo, procedimento de recuperação dos

microrganismos; enfim foram realizados vários testes objetivando a resolução do

problema. Os testes realizados evidenciaram contaminação no Mass Flow

Controller. Ele foi então retirado e a vazão regulada em função da pressão, por meio

de uma válvula agulha graduada. Calculou-se portanto o fator de correção

correspondente ao gás de processo, gerando então uma tabela onde cada pressão

regulada correspondeu à vazão desejada (tab.5). Desta forma obteve-se boa

reprodutibilidade dos resultados condizentes com o resultado esperado (figura 35).

Tabela 5. Calibração da vazão de peróxido de hidrogênio em função da vazão do oxigênio

Pressão (mTorr)

Vazão de H2O2 (sccm)

Vazão de O2 (sccm)

6,8 10 11 10,6 15 17 12,0 20 22 14,5 25 28 16,6 30 33 18,7 35 39 20,5 40 44 22,6 45 50 24,8 50 56 26,2 55 61 28,2 60 67 29,8 65 72 31,5 70 78 34,9 80 90 37,7 90 100 40,4 100 111

80

Observa-se que com a concentração de peróxido de hidrogênio em 40 sccm,

o tempo de exposição da amostra necessária para da redução da carga microbiana

para próximo de zero foi bem reduzido. Isto significa um menor aquecimento da

amostra, o que pode possibilitar sua aplicação a materiais termossensíveis.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo(min)

Redução logaritmica Resposta Polinomial

Figura 35: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro de 18 x 18 mm com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, exposto ao processo de plasma modo RIE, pressão de 100 mTorr, vazão de 160 sccm de oxigênio 99,998% e 40 sccm de peróxido de hidrogênio.

Alguns parâmetros foram alterados, a fim de averiguar o comportamento do

processo em relação à sua eficiência, e o que se comprovou é que em outras

condições, esta diminui, ou seja, a redução da carga microbiana é afetada,

caracterizando ineficácia do processo. Como essa condição é mais agressiva que as

demais devido à utilização do peróxido de hidrogênio, o próximo passo seria a

utilização de materiais metálicos, celulósicos, poliméricos, etc., e com isso avaliar a

81

estrutura do corpo de prova após submissão ao processo de esterilização, bem

como avaliar sua eficiência.

Para que se pudesse comparar a eficiência do processo de esterilização do

oxigênio puro (figura 36), com o oxigênio e peróxido de hidrogênio (figura 37), foram

realizados alguns testes com papel inoculado com B. subtilis, e com Geobacillus

stearothermophillus. Para o processo com oxigênio puro o resultado foi bem

satisfatório conforme já foi mencionado, porém com mistura de oxigênio e peróxido

de hidrogênio a carga microbiana sofreu pequena redução, embora não tenha

ocorrido degradação do material celulósico.

Figura 36: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subtilis e

Geobacillus stearothermophillus, inoculados em papel, expostas a uma potência de 150 Watts, 30 minutos e pressões de 12, 100 e 330 mTorr para as vazões de 20,200 e 100 sccm de oxigênio 99,998% ,respectivamente em plasma modo RIE.

Pode-se notar que o melhor resultado é obtido quando aplicada uma pressão

alta em relação à vazão do gás inserido na câmara.

0 50 100 150 200

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Vazão de Oxigênio (sccm)

Redução logaritmica B. subtilis Redução logaritmica Geobacillus stearothermophillus Resp. Polin. B. subtilis Resp. Polin. Geobacillus stearothermophillus

82

Figura 37: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de B. subitilis ,

inoculados em lâmínula de vidro, expostas a uma potência de 150 Watts, 30 minutos e pressões de 12, 100 e 330 mTorr para as vazões de 20, 200 e 100 sccm respectivamente com concentrações de 20% de peróxido de hidrogênio para 80 % de oxigênio.

Foram realizados ainda testes com indicadores de B. subitilis em plasma tipo

ICP (figura 38), o qual é constituido de um tubo de quartzo de comprimento de 120

cm, com uma bobina de RF de aproximadamente 15 cm envolvendo a entrada do

tubo, (figuras 39 e 40), onde sistema de bombeamento é feito por uma bomba de

vácuo mecânica da Edwards com vazão de 28 m3 por hora. As amostras foram

inseridas sob pressão ambiente na câmara, e posicionadas sobre e fora da bobina

com o auxilio de uma pinça estéril. Após a inserção da amostra, a pressão foi

reduzida para próximo de 1mTorr, a seguir foi injetado o gás de processo , e após

regulagem da pressão de trabalho foi aplicada a potência de RF. Neste

equipamento foi possível analisar o efeito do processo de esterilização em amostras

posicionadas diretamente sobre a bobina de plasma, aplicando potência de 100 e

150 W (figuras 41 e 42), e amostras posicionadas a 22 cm da tampa do reator

0 50 100 150 2006,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Vazão (sccm)

Redução logaritmica Resposta Polinomial

83

(aproximadamente 5 cm fora da bobina de plasma), aplicando potência de 100 e

150 W (figuras 43 e 44). O objetivo desse teste foi avaliar a eficiência da

esterilização em ambiente de plasma com menor ataque iônico, para amostras

posicionadas diretamente sobre a bobina, e quando submetida aos radicais livres

gerados pelo plasma de oxigênio, portanto posicionadas fora da região de plasma.

As condições de processo para ambas as posições das amostras foram:

pressão 330 mTorr, vazão de 100 sccm, potências de 100 e 150 Watts, tempo de

9, 15, 20 e 30 minutos.

Figura 38: Equipamento de plasma tipo ICP cilindrico

84

Figura 39: Esquema do sistema ICP cilindrico

Figura 40: Tubo de quartzo do sistema ICP cilindrico

RF

Escudo

Bobina

Tubo de quartzo

~

Gás Plasma

85

Figura 41: Gráfico do logaritmo do número de esporos de B. subtilis var. niger ATCC

9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.

Figura 42: Gráfico do logaritmo do número de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 150 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.

0 5 10 15 20 25 30

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4 Redução logaritmica Resposta Polinomial

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0


Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

86


9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas fora da bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.


9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas fora da bobina do plasma com potência de 100 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.

0 5 10 15 20 25 30

5,6

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

7,0

7,2

7,4 Redução logaritmica Resposta polinomial

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0


Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

87

Com o objetivo de se obter melhores resultados aumentou-se a potência de

processo para 200, 250, 300, 350 e 400 W, com tempo fixo de 30 min, pressão de

330 mTorr, vazão de 100 sccm O2. Nestes testes o processo se mostrou eficaz, para

as potências de 300, 350 e 400 Watts, sendo que para 200 e 250 Watts, a carga

microbiana foi pouco reduzida (figura 45). Para se conseguir um resultado

satisfatório o tempo de exposição da amostra deveria ser mais longo, o que

inviabilizaria o propósito deste trabalho.

Feito isto utilizamos as potências de 300, 350 e 400 Watts, com tempos

variáveis, a vazão de Oxigênio de 100 sccm, e a pressão de 330 mTorr.

Os resultados mostraram-se satisfatórios, reduzindo a carga microbiana

próximo a zero (figura 46), porém o tempo de exposição da amostra, se comparado

com o sistema RIE, foi maior. A temperatura dos processos é mostrada na tabela 6,

onde pode verificar que apesar das temperaturas serem altas, o tempo do ciclo de

esterilização é curto, o que significa que a morte microbiana não é somente

ocasionada pela temperatura, mas sim por um conjunto de ações do plasma e

temperatura.

88

Tabela 6: Temperatura de processo em sistema ICP cilindrico

Processo a 150 Watts



Tempo (min)

Temperatura (°C)

1 37 40 40 2 45 52 54 3 52 61 65 4 59 70 75 5 65 77 85 6 71 85 95 7 76 92 105 8 81 99 112 9 86 106 121 10 90 114 128 11 95 120 132 12 100 125 137 13 104 130 142 14 108 134 149 15 112 138 154 16 115 142 160 17 118 146 165 18 121 150 169 19 124 153 172 20 127 156 175

* Potência de 150 Watts, vazão de oxigênio de 100 sccm, pressão de 330 mTorr

89

Figura 45: Gráfico do logaritmo do número de esporos de B. subtilis var. niger

ATCC 9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potências de 200 e 250 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.


9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com potência de 300, 350 e 400 Watts, vazão de 100 sccm de oxigênio 99,998% e pressão de 330 mTorr.

0 5 10 15 20 25 30

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

200 Watts 250 Watts

0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

Redução logaritmica 300 Watts Redução logaritmica 350 Watts Redução logaritmica 400 Watts Resp. Polin. 300 Watts Resp. Polin. 350 Watts Resp. Polin. 400 Watts

90

Além do ciclo com oxigênio foram realizados, também testes de esterilização

utilizando peróxido de hidrogênio nas concentrações de 5, 10 e 20 % para 95, 90 e

80 % respectivamente de oxigênio de um total de 100 sccm de vazão, 300, 350 e

400 Watts de potência, 330 mTorr e tempos de 3, 6 ,9, 12, 15, e 40 minutos.

Para a vazão de 5 sccm de peróxido de hidrogênio, o processo foi eficiente

por volta de 20 minutos ( Figura 47), sendo que a redução da carga microbiana foi

próxima a zero após esse tempo de exposição.

Figura 47: Gráfico do logaritmo do número esporos de B. subtilis var. niger ATCC

9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com vazões de 95 sccm de oxigênio + 5 sccm de peroxido de hidrogênio, pressão de 330 mTorr.

Para a vazão de 10 sccm de peróxido de hidrogênio, houve uma redução um

pouco menor do que ocorreu para a vazão de 5 sccm ( Figura 48).

0 10 20 30 40-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)


91

Figura 48: Gráfico do logaritmo do número de B. subtilis var. Niger ATCC 9372

inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com vazões de 90 sccm de oxigênio + 10 sccm de peróxido de hidrogênio, pressão de 330 mTorr.

Quando utilizada a vazão de 20 sccm de peróxido de hidrogênio, a eficiência

foi menor ainda em relação aos processos anteriores (Figura 49), contrariando o que

se esperava. Isso se deveu ao fato de se ter utilizado o MFC, contaminado, que

posteriormente foi utilizado também no sistema RIE, onde foi constatado o

problema. De qualquer forma esses resultados apresentados mostraram-se

satisfatórios, quando comparados com os métodos atuais, merecendo maiores

estudos para conhecer sua real eficácia frente aos desafios de natureza biocida.

0 10 20 30 40-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)


92


9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP, quando expostas diretamente sobre a bobina do plasma com vazões de 80 sccm de oxigênio + 20 sccm de peroxido de hidrogênio, pressão de 330 mTorr.

Outra possibilidade existente neste sistema é a de posicionar o material fora

da região de alta densidade de plasma, isso faz com que se reduza mais ainda o

ataque iônico sobre o material, permitindo praticamente só a ação dos radicais

livres, os quais interagem com as substâncias celulares como enzimas,

fosfolipideos, DNA, RNA etc, impedindo o metabolismo ou reprodução celular.

Dessa forma as amostras poderiam ser posicionadas ao longo do tubo do reator de

plasma, para que se determine o decaimento da carga microbiana em relação a

distância da bobina de RF. Na figura 50 é mostrado um esquema de como poderia

ser feita essa distribuição dentro do reator.

0 10 20 30 40-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)


93

Figura 50: Distribuição das placas dentro do reator de plasma tipo ICP cilíndrico.

Um outro processo de plasma utilizado neste trabalho, foi um sistema

híbrido, ou seja, a utilização de um sistema capacitivo e um indutivo, onde se pode

aplicar potência de RF, tanto nos eletrodos como na bobina, ou nos dois ao mesmo

tempo. Para isso foi desenvolvido um sistema (figuras 51, 52 e 53), o qual foi

acoplado ao equipamento de plasma RIE (figura 54), já existente. Com isso foi

possível utilizar tanto o ICP como o RIE em um único equipamento. Essa nova

configuração consiste em uma antena de RF, onde foi acoplado um gerador, a fim

de permitir a aplicação da potência e geração do plasma, sendo essa antena

refrigerada a água (para evitar aquecimento excessivo do cabo).

Esse dispositivo permite a aplicação de potência aos eletrodos do sitema RIE

(sistema capacitivo) e na antena (sistema indutivo), produzindo assim um plasma de

alta densidade HDP (High Density Plasma), formando um sistema híbrido

denominado ICP planar. Com isso torna-se possível estudar o efeito do plasma

sobre os indicadores, utilizando combinações de potências sobre a bobina e sobre o

eletrodo.

94

Figura 51: Vista interna do dispositivo de acoplamento indutivo (posição da bobina).

Figura 52: Vista lateral do dispositivo, conexões de água de refrigeração e Rádio

Frequência.

95

Figura 53: Esquemático do sistema ICP ( Inductivelly Coupled Plasma) planar.

Figura 54: Equipamento de plasma existente (RIE - Reactive Ion Etching).

Os resultados dos processos realizados com o sistema planar são mostrados

na figura 55. Observa-se que o tempo de processo é relativamente curto, o que

implica em menor aquecimento do material. Outra vantagem desse sistema é a

refrigeração do eletrodo, sobre o qual são colocados os materiais a serem

esterilizados, onde a temperatura pode ser reduzida a valores relativamente baixos,

96

fazendo com que o material não aqueça, o que se pressupõe que possa ser

aplicado para materiais termossensíveis. Neste equipamento devido aos dois

sistemas (capacitivo e indutivo), ocorre uma densidade iônica muito grande,

eliminado os microrganismos em um tempo mais curto.

Fig. 55: Gráfico do logaritmo do número de esporos de B. subtilis var. niger ATCC

9372 inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm com carga de 2 x 107 UFC/suporte, sobreviventes ao processo por plasma tipo ICP planar, utilizando oxigênio 99,998% na vazão de 200 sccm, e pressão de 100 mTorr.

Os indicadores biológicos de B. subitilis foram também expostos a radiação

por UV, que possui comprimento de onda de 370 nm a 450 nm (figura 56), em

tempos de 1, 5, 10, 30, 45, 60 minutos, a potência efetiva da lâmpada de 14

mW/cm² e a dose de radiação igual a potência efetiva vezes o tempo de processo,

assim as doses variaram de 0,84 J/cm² a 50,4 J/cm². A carga microbiana foi pouco

reduzida (figura 57).O plasma também emite UV, e por analogia podemos dizer que

a morte microbiana ocorrida durante os processo de plasma, não foi em função

principal da radiação po UV, mas sim por corrosão química. Por análise

0 5 10 15 20 25 30

-0,50,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,0

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo (min)

(A) 150 Watts bobina + 50 Watts Eletrodo (B) 100 Watts bobina + 100 Watts Eletrodo (C) 150 Watts bobina + 100 Watts Eletrodo (D) 200 Watts bobina + 100 Watts Eletrodo (E) 200 Watts bobina + 50 Watts Eletrodo Resp. Polin. (A) Resp. Polin. (B) Resp. Polin. (D) Resp. Polin. (E)

97

microscópica podemos observar como os microrganismos continuaram inalterados

(figura 58), comprovando o resultado da contagem dos sobreviventes.

Figura 56: Espectro evidenciando os comprimentos de onda do Ultra Violeta .

Figura 57: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de esporos de B.

subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte, expostos à irradiação por UV, com tempo máximo de 60 minutos e dose de radiação de 0,84 a 50,4 j/cm².

0 10 20 30 40 50 60

7,00

7,05

7,10

7,15

7,20

7,25


loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Tempo(min)

300 350 400 450 500 550 600

0

2000

4000

6000

8000

10000In

tens

idad

e (u

.a.)

Comprimento de onda (nm)

98

Figura 58 - Eletromicrografia de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372,

inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte após exposição ao UV por 60 minutos.

Outro procedimento foi submeter as amostras à processo de raios-X,

conforme Tabela 7. Para este teste foi utilizado um sistema de raios-X, modelo

URD6, com tubo de cobre de capacidade de 1000 Watts de potência (figura 59).

Tabela 7: Comparação das doses recebidas pelas amostras submetidas ao

processo de esterilização por raios-X, em função da potência aplicada.

Dosímetro Tempo de exposição

(min)

Tensão (KV)

Corrente (mA)

Dose de radiação

(KGy)

1 30 0,0289 2 25 0,0133 3

40

20 0,0124 4

30 30 20 0,0067

Apesar das potências aplicadas serem altas em relação ao processo de

plasma, as doses de radiação foram muito baixas para qualquer efeito de

99

esterilização (figura 60). Os processos de esterilização por plasma emitem radiação

ionizante, só que em doses bem menores, e os resultados são alcançados em

tempo inferiores ao processo por raios-X, o que significa dizer que a radiação

emitida pelo plasma não é responsável pela letalidade dos microrganismos expostos

ao processo.

Figura 59: Equipamento de raios-X modelo URD6 da Zeiss ena com tubo de Cobre.


subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de raios-X, por tempo de 30 minutos.

0 200 400 600 800 10004,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0


loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Potência (watts)

100

Testes de esterilização por raios-gama (figura 61) e aceleradores de elétrons (figura 62), também foram realizados a fim de se pudesse comparar a eficiência dos mesmos em relação ao processo por plasma.

Figura 61: Equipamento de raios gama, Gamacell, modelo C6-220 da Atomic Energy.

Figura 62: Cone de varredura do acelerador de elétrons modelo DC. 1500/25/4-JOB188 da Radiation Dinamics.

101

No processo por raios-gama, as amostras foram inseridas dentro da câmara,

onde ficaram expostas à radiação por 60Co, conforme Tabela 8. Os resultados

encontrados para este processo são mostrados na figura 64.

Os processos utilizando aceleradores de eletrons funcionaram da seguinte

forma: as amostras foram colocadas sobre esteiras, as quais levaram as mesmas

até a fonte de radiação (figura 62) a uma velocidade de 6,72m/min para as doses de

5 e 10 KGy, e 3,36 m/min para dose de 25 KGy (tab. 9), tendo um contato com o

cone de varredura - onde é emitida a radiação- por tempos de 0,466 segundos para

5 e 10 KGy e 0,892 segundos para 25 KGy (figura 63).Os resultados são mostrados

Figura 63: Esquema básico de um acelerador de elétrons

102

Tabela 8: Parâmetros utilizados nos processos de radiação gama

Esterilização em equipamento Gamacell Dosagem

(kgy) Número de

sobreviventes UFC/suporte

Tempo de exposição

(min)

0 2,0 x 107 0 5 3,5 x 10 86,3 10 <10 173 25 <10 432

Figura 64: Gráfico do logaritmo do número de sobreviventes de esporos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de radiação por raios gama, submetidos à dose de radiação de 5,10 e 25 KGy.

0 5 10 15 20 25-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8 Redução logaritmica Resposta Polinomial

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Dose de radiação (KGy)

103

Para redução significativa da carga microbiana no processo de irradiação por

raios Gama, o tempo foi longo, quando comparado com outras técnicas, além de

exigir doses relativamente altas. Outro inconveniente foi a mudança de coloração

ocorrida nas placas de Petri após o processo, o que evidencia restrição na sua

aplicação.

Tabela 9: Parâmetros utilizados nos processo de radiação por acelerador de

elétrons

Dosagem (kgy)

Número de sobreviventesUFC/suporte

Corrente de feixe

(mA)

Dose irradiada

por passada

(KGy)

Tempo de exposição

por passada

(s)

Número de

passada

0 2,0 x 107 - - - - 5 <10 2,8 2,5 0,233 2

10 <10 5,6 5 0,233 2 25 <10 7,1 12,5 0,446 2


subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínula de vidro 18 x 18 mm, com carga inicial de 2 x 107 UFC/suporte expostos ao processo de radiação por acelerador de elétrons submetidos à dose de radiação de 5,10 e 25 KGy e corrente de feixe de 2,8,5,6 e 7,1 mA.

0 5 10 15 20 25-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8Redução logaritmica Resposta Polinomial

Loga

rítm

o do

núm

ero

de s

obre

vive

ntes

Dose de radiação (KGy)

104

Os processos de esterilização realizados por acelerador de elétrons, foram

muito eficientes, reduzindo a carga microbiana em poucos segundos, o que

caracterizaria sua aplicação para materiais termossensíveis, porém sua aplicação

fica limitada da mesma maneira que a radiação por raios Gama, devido à mudança

de coloração das placas de petri, além do custo da instalação desse equipamento,

levando-se em conta a escolha do local e segurança.

Na tabela 10, são mostradas todas as técnicas com seus respectivos valores

D, onde podemos observar que a técnica proposta neste trabalho é mais eficiente,

pois o tempo de esterilização é menor em relação à maioria das técnicas, a

temperatura de processo é relativamente baixa, o que caracteriza sua aplicação

para materiais termossensíveis. Adicionalmente não elimina resíduos nocivos ao

meio ambiente e operador e não requer nível de segurança avançado para sua

instalação. A figura 66 mostra uma comparação entre os processos envolvidos

neste trablaho, onde é possível observar a degradação causada nos

microrganismos, quando expostos ao processo de plasma, enquanto nos processos

por outras técnicas, não se observa tal degradação, o que comprova que no

processo por plasma a morte microbiana se dá devido aos ataques químicos

sofridos pelos microrganismos durante os processos.

Pode-se observar que os valores obtidos nos processos de plasma são

relativamente baixos, com maior ênfase para o processo em plasma ICP planar,

onde o resultado foi melhor que o obtido em processo em ETO.

O processo com acelerador de elétrons seria uma excelente alternativa, não fosse o

fato de utilizar radiação para esterilização, o que faz com que esse processo não

seja o mais adequado, embora conduzindo a um valor D tão baixo. A esterilização

por radiação Gama, apresentou bons resultados, embora o tempo do processo

105

tenha sido muito longo, e a dose para redução da carga microbiana tenha sido mais

alta que a utilizada no acelerador de elétrons. Esse tempo de processo de

esterilização por raios gama se deu pelo fato do equipamento utilizado possuir dose

de radiação fixa, ou seja a dose de radiação é obtida em função do tempo de

exposição da amostra. Os processos utilizando UV e raios-X mostraram-se

totalmente ineficazes para as doses aplicadas. Já a esterilização por processo de

autoclavagem foi eficiente, porém seus processos limitam-se a materiais resistentes

à temperatura.

Figura 66 - Comparação dos processos esterilizantes dos indicadores biológicos de B. subtilis var. niger ATCC 9372, expostos a diferentes processos esterilizantes, e em diferentes condições. (a) Amostra antes de sofrer processo de esterilização, (b) Amostra após sofrer processo de esterilização por UV durante 60 min com dose de radiação de 50,4 j/cm², (c) Amostra exposta ao processo de esterilização por plasma durante 15 minutos, com potência de 150 Watts, pressão de 100 mTorr, e vazões de 40 sccm de H2O2 e 160 sccm de O2 . (d) Amostra exposta ao processo de esterilização por plasma durante 15 minutos com potência de 150 Watts, pressão de 100 mTorr, e vazões de 40 sccm de H2O2 e 160 sccm de O2. (e) Amostra exposta ao processo de esterilização em acelerador de elétrons com dose de radiação de 5 KGy durante um intervalo de tempo de 0,466 segundos. (f) Amostra exposta ao processo de esterilização por raios gama, com dose de radiação de 5 KGy, com intervalo de tempo de 86,3 minutos.

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

106

Tabela 10: Comparação dos valores D obtidos nos processos de esterilização nos

diferentes equipamentos.

Processo Valor D

100 Watts 8,21 Plasma RIE (O2)

150 Watts 2,74

350 Watts 2,74 Plasma ICP cilindrico

400 Watts 2,74

100 Watts na bobina + 100 Watts no

eletrodo.

2,74


eletrodo.

2,05

Plasma ICP planar


eletrodo.

1,36

5 KGy 11,18

10 KGy 23,70

Raios Gama

25KGy 59,18

5KGy 0,00095

10KGy 0,00095

Acelerador de elétrons

25KGy 0,002

Autoclave 121 °C 2,05

ETO 2,05

Os resultados deste trabalho mostram que o sistema aqui estudado pode ser

empregado para esterilização de materiais termossensíveis, com menor custo de

equipamento, e segurança, não poluindo o ambiente e com resultados muito

eficientes.

107

7. Conclusões:

Os resultados deste projeto mostram que tanto o ICP quanto o RIE, cada qual

a seu modo podem ser aplicados para esterilização de equipamentos médicos,

levando-se em consideração que maiores estudos devem ser realizados para

validação quanto a diversos tipos de suportes.

No que diz respeito aos materiais termossensíveis, embora tenham

apresentado bons resultados em sistema RIE, maiores estudos devem ser

realizados para que se possa validar tal aplicação. Um outro estudo a ser feito é a

aplicação de plasma em sistema ICP cilindrico na esterilização de materiais

termossensíveis. Seguindo o mesmo plano de pesquisa feito pelo sistema RIE,

acredita-se em um resultado melhor para o sistema ICP, visto que o processo é

menos agressivo que o sistema RIE, pois o material seria esterilizado pela ação dos

radicais livres sofrendo pouco ataque iônico, e conseqüentemente ocorrendo um

menor dano ao mesmo.

Outro sistema muito promissor, principalmente quando se pensa em

esterilização de materiais termossenssíveis, é o ICP planar. Esse sistema possui a

vantagem da refrigeração do eletrodo, o que faz com que o material permaneça em

uma temperatura relativamente baixa durante todo o processo, fazendo com que o

material não sofra danos referentes à temperatura do processo.

Dentre os processos apresentados neste trabalho, o plasma foi o que melhor

se destacou, pois mesmo quando o tempo de processo foi semelhante à autoclave,

a vantagem do plasma foi a temperatura, já para o caso do acelerador de elétrons,

onde o tempo foi bem menor que o plasma, atingindo resultados iguais de redução

108

da carga microbiana, há que se pensar no custo da instalação deste equipamento,

bem como segurança aos operadores a ao meio ambiente, além de outros

problemas inerentes ao processo de radiação. Além disso esse equipamento possui

baixo poder de penetração, o que inviabiliza sua aplicação para materiais de grosso

calibre.

Os testes comparativos de irradiação (raios gama, acelerador de elétrons),

mostraram-se eficazes isoladamente, porém com doses e/ou tempo muito altos, o

que claro é inadequado quando se pensa em segurança e praticidade. Para

irradiação por UV e Raios-X, houve pouca redução da carga microbiana, o que

indica que as doses de radiação devem ser mais altas que as emitidas por esses

equipamentos testados. O plasma emite radiação ionizante em pequena escala, não

atingindo as doses emitidas pelos equipamentos utilizados neste trabalho, portanto

podemos dizer que no processo de esterilização por plasma, o principal agente letal

é a corrosão química.

De forma geral os métodos físico-químicos apresentam como vantagens

serem realizados a baixas temperaturas, e esta é requerida para esterilizaçao de

materiais termossensíveis. O método esterilizante ideal inexiste, pois todas as

tecnologias apresentam limitações.

109

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Derivados

Artigo publicado.

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Trabalhos completos publicados em anais de congressos

• PINTO, T.J. A. ; OLIVEIRA, Débora Cristina de ; A. M. Oliveira ; MOREIRA, Adir José ; Boscariol, M.R. ; SILVA, Juliano de Morais Ferreira ; MANSANO, Ronaldo Domingues ; ORDONEZ, N. . Surface characterization of polymeric biomaterials processed by reactive ion etching (RIE) plasma sterilization. In: 2006 Annual Meeting, 2006, Pittsburgh, Pennsylvania. Society for biomaterials 2006 Annual Meeting. v. 2. p. 619-619

• SILVA, Juliano de Morais Ferreira ; OLIVEIRA, D. C. ; Boscariol, M.R. ;

PINTO, T.J. A. ; MOREIRA, Adir José ; ORDONEZ, N. ; MANSANO, Ronaldo. Esterilização por plasma de oxigênio. In: XXV CBRAVIC - Congresso Brasileiro de Aplicações de Vácuo na Indústrria e na Ciência., 2004, Rio de Janeiro-RJ. Anais PUC RIO, 2004. p. 55-55.

Resumos publicado em anais de congressos

• OLIVEIRA, D. C. ; VITALLI, Fernando Adas Pereira ; A. M. Oliveira ; SILVA,

Juliano de Morais Ferreira ; Michelle Rigamonti Boscariol ; MOREIRA, Adir José ; ORDONEZ, N. ; MANSANO, Ronaldo Domingues ; PINTO, T.J. A. . Sterilization by O2 gas plasma: a study of its effectiveness against bacillus subtilis var. niger ATCC 9372 spores inoculated in medical devices. In: ISAB 2005- 3RD International Symposium and Advanced Biomaterials/Biomechanics, 2005, Montreal-Quebec. Anais, 2005. p. 238-238.

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Morais Ferreira ; OLIVEIRA, Débora Cristina de ; PINTO, T.J. A. . Esterilização por plasma de acoplamento indutivo. In: XXVIII Encontro Nacional de Física da Matéria Condensada, 2005, Santos-SP. Anais, 2005. p. 238-239.

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Michelle Rigamonti Boscariol ; SILVA, Juliano de Morais Ferreira ; PINTO,

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Resumos publicados em anais de congressos(artigos)

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Palestras: Palestra proferida no 8º congresso de tecnologia da FATEC-SP com o título: O Plasma e suas Aplicações na Indústria e Pesquisa, em outubro de 2006.

Documents

Estudo e desenvolvimento de sistemas de esterilização por ... · À amiga Janice C. De Azevedo pela pronta ajuda no ... processo de irradiação por raios gama e acelerador