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Estudo Eficácia e Segurança Terapêutica das Células-TroncoMesenquimais Alogênicas no Tratamento de Felinos Acometidos pela

Doença Renal Crônica e Resistentes a Eritropoetina Sintética

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SANTOS, Enrico Jardim Clemente [1]

WINCK, Caroline Pinho [2]

BRAGA, Camila Landim [3]

SANTOS, Enrico Jardim Clemente; WINCK, Caroline Pinho; BRAGA, Camila Landim. Estudo Eficácia e SegurançaTerapêutica das Células-Tronco Mesenquimais Alogênicas no Tratamento de Felinos Acometidos pelaDoença Renal Crônica e Resistentes a Eritropoetina Sintética. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo doConhecimento. Ano 02, Vol. 01. pp 296-309, Abril de 2017. ISSN 2448-0959

RESUMO

A doença renal crônica (DRC) tem grande importância na medicina veterinária de pequenos animais, poisrepresenta grande casuística não apresentando cura até o momento. Uma das consequências da DRC é aresistência a eritropoetina sintética, o que tende a resultar em uma aplasia medular ocasionando mais danos aoquadro clínico do animal. A aplasia de medular leva a um esgotamento de células oriundas da medula óssea,caracterizada por uma pancitopenia, sendo o paciente submetido à repetidas transfusões sanguíneas para melhorados sinais clínicos. Neste trabalho relatamos o caso clínico de 9 gatos sem raça definida, de 3 a 4 anos de idade,com diagnóstico de aplasia medular secundária a DRC. Após 2 anos de tratamento convencional suporte paradoença renal, os animais desenvolveram um quadro de aplasia medular responsiva apenas ao tratamentosintomático com transfusões de sangue. Os felinos foram submetidos a duas aplicações de células-troncomesenquimais (CTMs) obtendo cura da aplasia medular e normalização da função renal. Os resultados com otratamento das CTMs demonstraram resposta medular, com elevação da porcentagem do hematócrito até aestabilidade total da medula. Nesse sentido, este estudo demonstra que em casos de aplasia mieloide secundáriaa DRC, a terapia com CTs aliada ao tratamento convencional é essencial para a cura, bem como, a melhoria naqualidade de vida dos animais.

Palavra-Chave: Terapia Celular, Anemia Hipoplásica, Tecido Adiposo, Nefropatia.

INTRODUÇÃO:

A doença renal (DR) é uma síndrome que se caracteriza pelo comprometimento do metabolismo renal resultandoem consideráveis índices de morbidade e mortalidade (1,2). As terapias convencionais, visando promover umamelhora na qualidade de vida dos animais, incluem a fluidoterapia, orientação dietética (3-5). Entretanto, mesmoutilizando-se das terapias conservativas, a injúria estrutural tende a evoluir favorecendo a redução da massa renale consequentemente a falência do órgão.

No transcorrer da DR, animais que apresentam um quadro de falência renal avançada tendem a apresentar uma

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reduzida capacidade de sintetizar eritropoietina (o córtex renal produz aproximadamente 90%), ocasionando umquadro de anemia hipoplásica da linhagem eritróide o que torna o animal dependente de eritropoietina sintética(6). Tratamentos muito prolongados tendem a ocasionar um processo de uma resistência a eritropoietina sintéticalevando o animal a apresentar um quadro de aplasia medular (7).

A aplasia medular se caracteriza por apresentar um quadro de pancitopenia na circulação sanguínea periférica euma hipoplasia dos três tipos celulares (eritróide, mielóide e megacariocítica) uma vez que ocorre, na medulaóssea, a substituição do tecido hematopoiético pelo tecido adiposo (6,7). Perante este estado clínico, faz-senecessário que o paciente seja submetido a repetidas transfusões sanguíneas visando a recuperação dacapacidade de transporte de oxigênio (8) e, por conseguinte, a melhora dos sinais clínicos. Uma vez que estespacientes necessitam de periódicas transfusões sanguíneas outras fontes de tratamento para a aplasia medulardevem ser consideradas, dentre elas a utilização da terapia com células tronco mesenquimais (CTMs).

As CTMs são células indiferenciadas capazes de dar origem aos diversos tipos celulares que constituem todos ostecidos que compõem o organismo. Sendo caraterizadas com base no seu potencial de autorenovação,proliferação e diferenciação celular, as CTMs são responsáveis por assegurar a homeostase tecidual durante otranscorrer da vida do animal. As CTMs apresentam um grande número de moléculas bioativas, que atuammodulando a resposta inflamatória, angiogênese, e mitose das células envolvidas no processo de reparaçãotecidual (9-12). Quando introduzidas no organismo adquirem tanto a morfologia como a funcionalidade dequalquer tipo celular que constitui o tecido lesado de forma a reparar a região injuriadas. Na medicina veterináriaas células-tronco vêm sendo utilizadas e sua eficácia demonstrada em estudos relacionados à osteoartrites(13-19), lesões tendíneas (20-22), lesões na córnea (23), sequela de cinomose (24), lesão medular (25-27), aplasiamedular (28) e ulceras (29,30) dentre outras.

O objetivo no presente estudo é descrever a eficácia do tratamento com células tronco alogênicas derivada detecido adiposo de felino (CTMs-TAF) e expostas ao processo de criopreservação, no tratamento de nove gatasacometidas por aplasia medular secundária a doença renal crônica por meio da utilização de CTMs-TAF, visando amelhora da qualidade de vida dos felinos.

Material e Métodos:

Os animais foram selecionados a partir de populações de pacientes de clínicas veterinárias da cidade de São Paulomediante ao consentimento livre e esclarecido por parte dos proprietários. As CTMs utilizadas no presente estudoforam obtidas a partir de animais jovens, saudáveis com até seis meses de vida (Figura 1).

Foi coletada uma amostra de sangue para a análise da presença de coronavírus felino (FCoV), vírus daimunodeficiência felina (FIV), vírus da leucemia felina (FeLV), Chlamydia pistácia (CPS), herpes vírus felino (FHV-1),Haemobartonella felis (HFE) e micoplasma através da amplificação de fragmentos dos respectivos genomas pelométodo da reação em cadeia de polimerase (PCR) em materiais extraídos (RNA e DNA). Os RNAs foram extraídos





com Trizol LS (Invitrogen) e utilizados para síntese de cDNA através de transcrição reversa com superscript II(Invitrogen). DNAs foram extraídos utilizando-se o DNAzol (Invitrogen). Reações positivas apresentam fragmentosde DNA de 185 pb e 410 pb (FCoV), 557 pb (FIV) 166 pb (FeLV), 167 pb (CPS), 173 pb (FHV-1), 205 pb (FCV), 170pb (HFE) e 510 pb (micoplasma). Foram submetidas a cada pesquisa duas amostras extraídas, controles positivose negativos.

O tecido adiposo obtido no momento da castração foi lavado em 1x PBS de forma a retirar sangue e debris. Após alavagem o tecido foi mantido durante 30 minutos a 37C/5% de CO2 em presença de 0,075% de colagenase tipo IV(Sigma). Foi adicionado 5 ml de meio basal sendo o sobrenadante retirado e centrifugado durante 5 minutos a 200

g. O precipitado foi ressuspenso e transferido para uma garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 37C/5%CO2 durante 48 horas em presença de meio basal quando o mesmo foi trocado. Os repiques subsequentes formafeitos por meio de ação enzimática utilizando 0.025% de tripsina (Invitrogen) (31). As CTMs-TAF foram divididas

em alíquotas de 2 x 106, ressuspensas em meio de congelamento (10% de DMSO, 70% de soro fetal bovino e 20%de meio basal contendo) e armazenadas em nitrogênio líquido. Para serem aplicadas nos felinos, as células formadescongeladas em banho-maria por 2 minutos a 37C, o meio de criopreservação removido e as células transferidas

para garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 37C/ 5% CO2 para posteriormente realizar as aplicaçõesterapêuticas (Figura 1).





A análise do potencial tumorigênico foi realizado por meio da introdução de 1×106 células, 4a passagem, atravésda via subcutânea. As CTMs-TAF foram ressuspensas em 2 ml e introduzidas subcutaneamente em trêscamundongos da linhagem nude. Os animais foram mantidos em ambiente estéril durante o período de setesemanas.

Para a análise proliferativa as CTMs-TAF foram distribuídas, em triplicatas, em garrafas de 25 cm2 na concentração

de 105 células. Após três dias as células foram removidas, contadas em câmara de Neubauer e distribuídas em três

novas garrafas de 25 cm2. O processo foi repetido até a 10a passagem (32) (Figura 2).

Figure 1 – Um fragmento do tecido adiposo de um felino jovem, clínica e laboratorialmente saudável é coletado e encaminhado para oLaboratório da CELLTROVET. Neste as CTMs são isoladas, caracterizadas e armazenadas no Banco de Células-Tronco da CELLTROVET

para posteriormente serem inoculadas nos animais selecionados.

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A análise do potencial de diferenciação osteogênico das CTM-TAF foi realizado na 4ª passagem. As células foramcultivadas em meio basal Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium–High Glucose (DMEM-HG; Invitrogen), 15% de sorofetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina10.000 mg/ml; Invitrogen), 1% de l-glutamina (200mm; Invitrogen) e 1% de aminoácidos não essenciais (200mm;

Invitrogen) durante o período de 24 horas na concentração inicial de 1×105 células. Após 24 h, o meio foi trocadopara o de diferenciação osteogênica Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – Low Glucose (DMEM-LG; Invitrogen),

1% de 10-5M de dexametasona (Sigma), 1% 5mM de ácido ascórbico (Sigma), 10% de soro fetal bovino (FBS;HyClone, Logan, Utah) e 1% Streptomicina/Penicilina (Penicilina g 10.00u/ml, Streptomicina 10.000 mg/ml;

Invitrogen). A troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. No 10o dia foi adicionado 1% de 200mM de b-glicerolfosfato (Sigma) ao meio de cultura e também nas trocas subsequentes. As células foram mantidas em

cultura até o 21o dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa(31) (Figura 3a).

Para a análise do potencial de diferenciação adipogênico as CTM-TAF foram cultivadas, na 4ª passagem, em meio

basal durante por 24 h na concentração inicial de 1×105 células. Após 24 horas o meio foi trocado para o dediferenciação adipogênica composto por Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – HIGH Glucose (DMEM-HG;Invitrogen), 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1 mM de dexametasona (Sigma), 100 mM de

Figura 2 – Análise do potencial de proliferação celular das CTMs-TAF.






endomentacina (Sigma), 0,5M de isobutilmetilxantina (Sigma) + 10 µM de insulina (Sigma) e 1% de antibiótico(Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen), sendo a troca do meio foi feita a cada

3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21o dia de diferenciação. As células foram então fixadaspor 60 minutos a temperatura ambiente em presença de paraformaldéido 4%, lavadas 3 vezes com etanol 70%,mantidas a temperatura ambiente por cinco minutos com OilRed O , sendo posteriormente lavadas 3 vezes comágua destilada (31) (Figura 3c).

Para a análise do potencial de diferenciação condrogênico as CTM-TAF, na 4ª passagem, foram transferidas, na

concentração 1 x 106, para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 200g por 5 minutos. Em seguida foramcultivadas na presença de meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – HIGH Glucose (DMEM-HG; Invitrogen)suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 6,25 mM de insulina (Sigma), 0,1 mM dedexametasona (Sigma), 1 mM de piruvato de sódio (Invitrogen), 10 ng/ml TGF-β1(R&D System, LGCBiotechnology) e 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen)sendo que a troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Posteriormente o pellet esféricoformado foi fixado, incluso, cortado e corados com azul de toluidina (Sigma) (33) (Figura 3d).

Neste estudo nove gatos sem raça definida, entre 3 e 4 anos de idade, tratados há pelo menos 2 anos para DRCestando classificados, segundo a IRIS, como estágio 2 da DRC, submetidos a fluidoterapia em dias alternados,foram submetidos a exames físicos, laboratoriais (hemograma, perfil hepático e renal, urinálise e dosagemeletrolítica) e anamnese junto aos proprietários. Foram solicitados raio-x de tórax e ultrassom abdominal de forama minimizar a possibilidade de neoplasia. Os animais se encontravam laboratorialmente e clinicamente estáveis apelo menos duas semanas. Felinos que apresentassem evidencias de ureterólise, pielonefrose, anormalidadesanatômicas como rim policístico, hipertensão ou hipotensão ou doenças sistêmicas foram excluídos do estudo. Osanimais forma submetidos há transfusões sanguíneas sempre que os hematócrito se encontravam abaixo de 13%.Os níveis de ureia e creatinina, mantiveram-se em torno de 90 mg/dL e 3,0mg/dL respectivamente, sendo osanimais submetidos a fluidoterapia em dias alternados, com 250 ml de solução fisiológica 0.9%. Foi realizada a

Figura 3 – Análise morfológica fibroblastóide da cultura das células-tronco mesenquimais isoladas a partir do tecido adiposo de felinosjovens e saudáveis (CTMs-TAF) (A) e suas diferenciações osteogênica(B), adipogênica(C) e condrogênica(D); Obj. 4x(A), 40x(B), 20x(C) e

40x(D).






aplicação de duas doses de CTMs-TAF (2×106), após descongelamento, sendo uma injunsão realizada pela viaendovenosas pela veia cefálica e a outra intramedular com intervalo de 30 dias. A análise do perfil renal ehemogramas foram realizados quinzenalmente.

RESULTADOS:

Após a realização dos exames físicos nos nove felinos constatou-se quadros de ausência de dor, auscultacardiopulmonar sem alterações, desidratação entre leve a moderada, mucosas oculares, bucal e vulvarhipocoradas, linfonodos de tamanho e consistência normais. Na anamnese, os proprietários descreveram: apetiteseletivo e prostração. Todos os animais tinham vacinas, vermifugações e controle de ectoparasitas atualizados. Aanálise do quadro clínico e laboratorial dos animais demonstrou uma reticulocitose insuficiente para a recuperaçãodos valores eritróides, bem como hemácias normocíticas e normocrômicas. Detectou-se uma redução progressivanos valores de hematócrito durante o período de tratamento dos animais para DRC sendo posteriormentediagnosticado um quadro de aplasia medular secundária a DRC, não responsiva a eritropoietina. Os níveis de ureiae creatinina, mantiveram-se em torno de 90 mg/dL e 3,0mg/dL, respectivamente sendo os animais submetidos afluidoterapia em dias alternados.

Foram aplicadas duas doses de CTMs-TAF, após o descongelamento, com intervalos de 30 dias sendo a primeirapela via endovenosa e a posterior via intramedular, na tentativa de reverter o quadro de aplasia medular. Após aprimeira aplicação, via sistêmica, os resultados da função renal apresentaram uma tênue redução para em tornode 85 mg/dL ureia e 2,7mg/dL de creatinina tendo sido detectado uma elevação dos valores do hematócrito. Osanimais apresentaram maior disposição se locomovendo, alimentando e bebendo água de forma satisfatória. Oespaçamento da transfusão ocorreu de 15 dias para o período de 21 à 23 dias (Figura 3).

Após a realização da segunda aplicação de CTMs-TA pela via intramedular os animais restabeleceram osparâmetros de referência hematimétricos (43 à 45%), mantendo os valores de ureia estáveis e creatinina estáveissendo a fluido terapia realizada em um intervalo de dias alternados (Figura 3).

Tabela 1 – Tabela representativa da variação dos níveis de hematócrito após o início da terapia com célulastronco. No gráfico são apresentados os valores relativos aos índices de hematócritos analisados semanalmente.Ocorreram duas aplicações de CTMs-TAF sendo a primeira pela via endovenosa (Dia 0) e a segunda pela viaintramedular (Dia 30).

HEMATÓCRITO

Dias Gato 1 Gato 2 Gato 3 Gato 4 Gato 5 Gato 6 Gato 7 Gato 8 Gato9

0 14% 15% 17% 16% 18% 14% 19% 20% 22%7 18% 19% 21% 18% 19% 20% 23% 24% 24%





14 17% 20% 19% 18% 17% 18% 22% 19% 24%21 14% 12% 11% 10% 14% 14% 13% 15% 16%28 16% 17% 15% 15% 18% 19% 17% 17% 22%30 16% 16% 14% 15% 18% 18% 17% 17% 21%37 21% 21% 23% 25% 24% 25% 26% 24% 26%44 36% 39% 32% 31% 34% 34% 38% 32% 35%51 44% 44% 39% 39% 42% 44% 43% 40% 44%58 43% 44% 43% 42% 44% 43% 43% 44% 42%65 43% 44% 44% 43% 44% 43% 43% 43% 43%

Os tratamentos foram finalizados há mais de 24 meses. Os animais apresentam quadros estáveis e com as funçõespreservadas, não estando sendo submetidos a qualquer tratamento relacionado a aplasia medular. Os felinosrealizam controle semestral de hemograma completo, apresentado os índices hematológicos dentro dos valores dereferência. Alimentam-se normalmente, apenas com ração terapêutica renal, realizando atividades físicas normais,o que demonstra grandes mudanças, tanto clínica como laboratorial.

Discussão:

Os nove pacientes vinham sendo tratados para DRC à aproximadamente dois anos. Baseado tanto nos sinaisclínicos de apatia e mucosas oculares, bucal e vulvar hipocoradas como dados laboratoriais que demonstraramuma diminuição dos valores de hematócrito característicos de processos anêmicos não regenerativos os animaisforam diagnosticados com um quadro de aplasia medular. Embora o tratamento com a eritropoietina sintéticainicialmente tenha se mostrado eficaz na estimulação da eritropoiese medular, aumentando a massa circulante deeritrócitos e por consequência melhorando o quadro anémico, os animais terminaram tornando-se não responsivosa eritropitina sintética (6,7).

A terapia com CTMs vêm apresentado resultados extremamente relevantes no campo da medicina veterinária.Dentre as doenças mais comumente tratadas temos as lesões osteoarticulares(13-19), onde se observa umamelhora significativa na claudicação, dor e amplitude do movimento e as tendíneas onde se constata uma melhorqualidade do tecido tendíneo minimizando a taxa de rencidivas (20-22). Em se tratando de aplasia mielóide,resultados promissores vêm sendo apresentados abrindo uma nova perspectiva no tratamento de animaisacometidos pela doença (28,34).

No tratamento dos pacientes em questão, foram utilizadas CTMs alogênicas isoladas a partir do tecido adiposo deum felino jovem e clinicamente saudável, após terem sido exposta ao processo de criopreservação. Tal abordagemé possível devido a atividade imunossupressora apresentadas pelas CTMs(35)

Estudos demonstraram que as CTMs possuem a capacidade de regular a resposta imune por meio da inibição da





maturação das células dendríticas, assim como a supressão da proliferação e função tanto das células natural killercomo dos linfócitos T e B. Em razão das CTMs possuírem uma baixa expressão tanto de moléculas co-estimulatórias, necessárias para a ativação das células T como do complexo de histocompatibilidade classe II(MHC-II), tornam-se imperceptíveis ao sistema imunológico(36).

Com base nos exames hematológicos foram realizadas transfusões sanguíneas quando os hematócrito seencontravam abaixo de 13% visando a normalização dos quadros clínicos e laboratoriais de forma a tornar maisefetiva a primeira aplicação das CTMs-TAF, realizada pela via endovenosa por meio da veia cefálica. Em razão doestado clínico dos animais, optou-se inicialmente pela utilização da via endovenosa por meio da punção da veiacefálica, uma vez que esta via se mostra de fácil acesso e pouco traumática (37). Embora não tenha sidoobservada uma pequena melhora no quadro hematopoiético após a primeira aplicação das CTMs-TAF, apenas umespaçamento entre as transfusões sanguínea de 15 para 21 à 23 dias em decorrência de uma queda mais lentados níveis de hematócrito, constatou-se uma tênue redução nos índices de ureia e creatinina. A fluidoterapia foimantida de forma constante em dias alternados. Estes dados sugerem que as CTMs-TAF oriundas da primeiraaplicação tenham atuado de forma a melhorar o quadro renal em detrimento do hematopoiético. Estudos vêmdemonstrando que a infusão sistêmica resulta na retenção das CTMs transplantadas em outros órgãos o quesugere que, em razão do quadro debilitado dos animais, as CTMs-TAF tenham migrado para os rins (38).

Após a segunda aplicação das CTMs-TAF, por meio da via intramedular, observou-se uma elevação significativa dastaxas de hematócrito atingindo níveis entre 43% e 45%, os quais não haviam sido obtidos desde o início do quadrode aplasia medular, não sendo necessárias transfusões posteriores. Estes resultados sugerem uma maior retençãodas CTMs-TAF na medula reduzindo a taxa de migração das células transplantadas para os demais órgãos (39).Estudos demonstram que o sucesso da terapia com CTMs está diretamente relacionado a permanência das célulastransplantadas no local lesionado, propiciando uma atuação mais efetiva das células (40).

Os dados obtidos sugerem uma possível recuperação do ambiente hematopoiético o qual é composto por CTMs,responsáveis por dar origem a diversas linhagens que constituem o estroma medular assim como células troncohematopoiéticas (CTHs) responsáveis pela produção das células sanguíneas (41). Os índices de ureia e creatininapermaneceram estáveis sendo a fluidoterapia espaçada para cada 3 dias.

Conclusões:

Este estudo piloto apresenta uma nova possibilidade para o tratamento da aplasia medular em decorrência dadoença renal, aliada com a terapia convencional, visando a melhoria da qualidade de vida dos animais. Embora osresultados demonstrem um quadro estável e dentro dos padrões de referência de normalidade, não podermosdescartar a possibilidade da reincidência do quadro de aplasia medular.

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[1] Biocientista. Mestre, Doutor, Pós-Doutor. Diretor de Inovação Tecnológica da CELLTROVET

[2] Bióloga, Mestre. Gestora do Laboratório de Biotecnologia da CELLTROVET.

[3] Médica Veterinária, Especialista em Nefrologia. Médica Veterinária na Clínica Veterinária RenalVet


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