Células tronco Somáticas

No indivíduo adulto, diferentes tecidos possuem a capacidade de renovação

ou ao menos de reparação total ou parcial; o sangue e a epiderme, por exemplo,

estão constantemente se renovando enquanto outros tecidos, como o hepático,

podem ser reparados por completo enquanto outros, como músculos ou tecidos

nervosos, apresentam um potencial reduzido de reparação. Este potencial está

relacionado à presença de células tronco que se encarregam da reparação,

proliferando e se diferenciando em diferentes tipos celulares encontrados nos

tecidos, as chamadas células tronco adultas.

Dentre estas, podemos destacar as células tronco hematopoéticas (CTH) e as

células tronco mesenquimais (CTM). Ambas podem ser encontradas na medula

óssea (MO). As CTM diferenciam-se in vitro e in vivo nos quatro tipos celulares

principais que formam a micro-arquitetura da medula: adipócitos, condrócitos,

osteócitos e células estromais. A interação das CTH com este micro-ambiente

permite a constante renovação do tecido sanguíneo, viabilizando a hematopoese.

Ao contrário das CTE, terapias a base de CTH são utilizadas há mais de 30

anos, na reconstituição do sistema hematopoético por meio do transplante de

medula óssea. No transplante, a incompatibilidade entre doador e receptor pode

resultar na chamada doença do enxerto contra o hospedeiro ou GVHD (graft versus

host disease), quando as células transplantadas (portanto, do sistema imune

doador) reconhecem o organismo receptor como não-próprio. As células tronco

mesenquimais também podem vir a ser utilizadas na redução da GVHD nos

transplantes, pois há fortes indícios de que elas reduzem a resposta imunológica,

por seus efeitos sobre linfócitos T e sobre células dendríticas.

Além dos usos relacionados ao sistema hematopoético, as células tronco

mesenquimais e hematopoéticas vêm sendo utilizadas de maneira crescente na

tentativa de restaurar ou repor tecidos danificados ou doentes. Estas abordagens se

baseiam na observação de que estas células, originadas na mesoderme, poderiam

se diferenciar (ou trans-diferenciar) em células de tecidos originados em outros

folhetos embrionários como hepatócitos (endoderme) ou neurônios (ectoderme),

um potencial denominado de plasticidade. De fato, estas células vêm sendo

utilizadas na tentativa de restauração de tecidos cardíacos enfartados, tecido

nervosos lesados, ou mesmo numa área denominada de engenharia de órgãos com o

intuito de gerar tecidos (e eventualmente órgãos) que possam ser implantados em

pessoas, eliminando a rejeição de tecidos, uma vez que as células tronco poderiam

ser originadas do próprio paciente. Neste âmbito, as células tronco mesenquimais

aparentemente possuem um potencial mais amplo de diferenciação (e

transdiferenciação) do que as hematopoéticas, podendo ser isoladas de vários

outros tecidos além da medula óssea.

Apesar da grande pletora de trabalhos nesta ampla área de conhecimento, o

pleno potencial de aplicação destas células somente poderá ser alcançado com

base em um conhecimento aprofundado da sua biologia funcional e molecular.

Pesquisa Básica:

Como mencionado, as CTM se destacam por sua grande capacidade de

diferenciação in vitro comparável, até certo ponto, com a de CTE (Da Silva

Meirelles, Caplan et al., 2008). Interessantemente, demonstrou-se que um tipo de

célula relacionada à MSC, chamada célula adulta progenitora multipotente (MAPC),

é capaz de contribuir para diversos tecidos de camundongos quando injetadas no

blastocisto, a exemplo da CTE (Jiang, Vaessen et al., 2002). A grande crítica

quanto às MAPCs é que as mesmas poderiam ser meros artefatos do processo de

cultivo celular utilizado para seu isolamento.

Atualmente, sabe-se que células com características de CTM encontram-se

distribuídas por todo o organismo pós-natal. Essa distribuição tão ampla foi

atribuída a sua associação com vasos sangüíneos em um modelo que propõe que

pericitos são células-tronco ao longo de toda a vasculatura (Da Silva Meirelles,

Chagastelles et al., 2006). Pericitos são células que envolvem células endoteliais

nos vasos sangüíneos. Formas especializadas ocorrem no fígado e nos glomérulos

renais. Pericitos são definidos com base em sua posição em relação a células

endoteliais, especialmente em capilares. Existe evidência, entretanto, indicando

que pericitos formam uma rede sub-endotelial por toda a vasculatura, tanto em

vasos de grande como de pequeno calibre. Pericitos apresentam uma relação

íntima com células endoteliais durante a formação dos vasos sangüíneos, e

desempenham papel importante na manutenção da estrutura destes. Marcadores

para a identificação de pericitos foram revisados em uma publicação recente (Da

Silva Meirelles, Caplan et al., 2008).

Pericitos apresentam uma sobreposição de identidade com MSCs devida a

seu potencial de diferenciação in vitro e in vivo, e também devida à expressão de

marcadores característicos de MSC in situ. Além disso, há trabalhos que evidenciam

a atuação de pericitos como MSCs in situ em tecidos como cartilagem, osso,

ligamento periodontal, endométrio e adiposo. Dados como esses levaram à

concepção de um modelo em que pericitos são células-tronco ao longo de toda a

vasculatura, e agem como MSCs em tecidos mesenquimais (Da Silva Meirelles,

Chagastelles et al., 2006). A atuação de pericitos/MSCs como componentes ativos

no processo de reparo e/ou regeneração tecidual e também na manutenção da

auto-tolerância imunológica também foi postulada (Da Silva Meirelles, Caplan et

al., 2008). De acordo com esta visão, a lesão tecidual levaria a uma liberação do

pericito de seu nicho perivascular; este passaria a um estado “ativado” e

proliferaria e, através da produção de matriz extracelular e de moléculas com

efeito trófico e imunomodulatório, exerceria funções reparadoras no local da

lesão. Uma das conseqüências disso é a pressuposição de que as células cultivadas

definidas como MSCs correspondem a pericitos ativados e não são equivalentes,

portanto, a MSCs em condições fisiológicas in vivo. A baixa eficiência de homing de

MSCs cultivadas por algumas passagens, comparada com a de MSCs em cultura

primária (Rombouts e Ploemacher, 2003), vai ao encontro dessa idéia.

Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através

do sub-projeto 10, intitulado “Conhecimento básico sobre a biologia da MSC

através de sua comparação com pericitos”, terá como objetivo primário gerar

conhecimento básico sobre a biologia da MSC através de sua comparação com

pericitos, no intuito de que suas aplicações terapêuticas sejam ampliadas. Para

este fim, as seguintes abordagens experimentais serão utilizadas: obtenção e

cultivo de MSCs humanas a partir do tecido adiposo, cordão umbilical e/ou

placenta e murinas; isolamento de pericitos humanos de amostras de tecido

adiposo ou de lipoaspirados, por meio de colunas magnéticas ou separação celular

ativada por fluorescência utilizando o anticorpo 3G5; diferenciação in vitro

osteogênica, adipogênica e condrogênica de MSCs cultivadas e de pericitos frescos

ou submetidos a cultivo celular; diferenciação in vivo em cubos cerâmicos porosos

implantados subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos; injeção de

pericitos, pericitos cultivados e MSCs derivados de camundongos Rosa26

(transgênicos expressando a enzima beta-galactosidase) em blastocistos

(colaboração com a Dra. Irina Kerkis, Instituto Butantan, São Paulo, SP); avaliação

da contribuição das células injetadas para o embrião através da de cortes

incubados com o substrato para a enzima B-galactosidase (X-gal); comparação do

perfil de moléculas de superfície expressas por pericitos, pericitos cultivados, e

MSCs (marcadores tipicamente associadas ou não a MSCs, tais como CD14, CD31,

CD34, CD44, CD45, CD90, CD29, CD105, CD117 entre outros, serão avaliados por

citometria de fluxo); estudo do perfil de citocinas com potencial imunomodulatório

(fator de crescimento de hepatócito, fator de crescimento transformador beta,

interleucina 10, interleucina 6, e interleucinas 11, 15 e 27) em pericitos frescos ou

cultivados e MSCs por citometria de fluxo; aplicação de pericitos (frescos ou

cultivados) e MSCs, obtidas de camundongos Rosa26, em modelo animal de lesão

muscular induzida por cardiotoxina (incubação de cortes transversais com X-gal e

microscopia para quantificação do número de fibras positivas para comparação

entre os tipos celulares infundidos).

A grande semelhança entre CTM e pericitos e sua íntima relação com as

células endoteliais no processo de formação de vasos sangüíneos levanta muitas

questões quanto aos mecanismos de interação entre estas células, e como eles

contribuem para a vasculogênese ou a angiogênese. A vasculogênese refere-se à

formação de vasos sangüíneos a partir de células progenitoras endoteliais

(angioblastos), enquanto a angiogênese refere-se ao processo de formação de

novos vasos por brotamento a partir de células endoteliais maduras dos vasos pré-

existentes. A princípio acreditava-se que a formação de vasos na fase adulta

ocorria exclusivamente a partir de células endoteliais maduras (angiogenêse) os

quais teriam o potencial de recrutar pericitos durante esse processo. Estudos

recentes conduzidos por nosso grupo levaram à hipótese de que as células-tronco

mesenquimais corresponderiam às células-tronco mais primitivas presentes nas

paredes dos capilares sangüíneos dos diferentes tecidos e que seriam responsáveis

pelo processo de neovascularização durante o mecanismo de reparo tecidual

(Covas, Panepucci et al., 2008). Em paralelo, desenvolvemos protocolos in vitro de

diferenciação de células endoteliais a partir de células progenitoras endoteliais

(AC133) da medula óssea (BM-CE) e do sangue do cordão umbilical (UC-CE). As

células progenitoras endoteliais e as células endoteliais diferenciadas (BM-CEd e

UC-CEd) foram caracterizadas quanto: a) morfologia; b) perfil skyfenotípico; c)

perfil de expressão gênica, d) potencial de “uptake” de AcLDL e e) potencial

vasculogênico in vitro de formação de estruturas tubulares em matrigel. Em

conjunto, esses estudos permitiram avaliar in vitro o potencial vasculogênico das

BM-CE e UC-CE, caracterizar modificações fenotípicas ao longo do processo de

diferenciação endotelial e mapear genes e fatores de transcrição envolvidos no

processo de vasculogênese (Covas, com. pessoal). Dando continuidade a esses

estudos a proposta do presente projeto consiste em investigar as interações entre

as células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSC) e veia umbilical (UV-

MSC) e pericitos cerebrais (B-Per) com as células endoteliais da veia do cordão

(HUVEC), bem como, com as células endoteliais diferenciadas in vitro (BM-CE ou

UC-CE). A compreensão dessas interações fornecerá subsídios relevantes para a

compreensão dos mecanismos de angiogênese e vasculogênese em diferentes

situações clínicas.

Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através

do sub-projeto 11, intitulado “Avaliação do potencial angiogênico e elucidação

das interações moleculares de células-tronco mesenquimais ou pericitos com e

células endoteliais em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo”, terá como

objetivos principais, estudar as interações moleculares do “cross-talk” entre

populações celulares selecionadas por “sorting” para um dos marcadores de

células-tronco mesenquimais ou pericitos com células endoteliais em sistemas de

co-cutivo in vitro e avaliar o potencial vasculogênico in vivo em modelos de co-

infusão em matrigel, seguida da infusão sub-cutânea em camundongos

imunodeficientes e em modelo murino de insuficiência arterial periférica induzida

por ligação da artéria femoral.

Para isso, serão desenvolvidos três modelos: 1) in vitro em ensaios de co-

cultivo com e sem contato com diferentes proporções dos tipos celulares: a) BM-

MSC:HUVEC; b) UV -MSC:HUVEC; c) pericito:HUVEC; d) BM-MSC:BM-CEd; e) BM-

MSC:UC-CEd; f) UV-MSC:BM-CEd; g) UV-MSC:UC-CEd; h) pericito:BM-CEd e i)

pericito:UC-CEd e 2) ensaios in vivo em modelos de formação de vasos em matrigel

após implantes sub-cutâneos em camundongos imunodeficientes e 3) modelo de

avaliação do potencial vasculogênico das células endoteliais geradas em cultura,

em camundongos portadores de isquemia, após a indução de insuficiência arterial

periférica por ligação da artéria femoral. No modelo in vitro será realizada a

caracterização de ambos tipos celulares antes e após diferentes tempos de co-

cultivo utilizando seis parâmetros: a) morfologia; b) perfil fenotípico; c) perfil de

expressão gênica, d) potencial de uptake incorporação de AcLDL; e) potencial

vasculogênico in vitro via a formação de estruturas tubulares em matrigel e f)

caracterização histológica por microscopia confocal das estruturas neoformadas em

matrigel utilizando marcadores mesenquimais e endoteliais, bem como, por

microscopia convencional de cortes de parafina corados por HE para analisar a

presença de eritrócitos dentro dos vasos, indicando a presença de vasos sangüíneos

funcionais. No modelo in vivo, primeiramente será realizada a modificação gênica

das células-tronco mesenquimais e pericitos com marcadores fluorescentes e

bioluminescentes (DsRed e Luciferase) que permitirá a avaliação dos capilares

neoformados por microscopia confocal e utilizando o sistema IVIS de captura de

imagens in vivo para análise das estruturas formadas em matrigel. No modelo de

avaliação de insuficiência arterial periférica por ligação e remoção da artéria

femoral em um dos membros inferiores, em camundongos NODSCID, células

endoteliais geradas em culturas com e sem co-cultivo das células-tronco

mesenquimais e pericitos serão infundidas nos camundongos e a análises

histológicas processadas entre 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico.

Ainda, em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino, da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP de São Paulo, o projeto

acima tem por objetivo também isolar células tronco mesenquimais e endoteliais

do saco vitelínico de cães, por consistir o sítio original de formação dos vasos

sangüíneos durante o desenvolvimento embrionário. Estudos recentes realizados

pela Profa. Maria Angélica permitiram mapear os sítios preferenciais do saco

vitelínico, onde se situam as células endoteliais (SV-CE) e células tronco

mesenquimais (SV-CTM) (Miglino, Franciolli et al., 2008). Assim, após o isolamento

desses dois tipos celulares serão realizados ensaios de co-cultivo in vitro com e sem

contato para a compreensão das interações moleculares entre SV-CTM e SV-CE

utilizando os parâmetros acima descritos. O potencial vasculogênico também será

avaliado em modelo de formação de vasos em matrigel após implantes sub-

cutâneos de células-tronco mesenquimais com células endoteliais, em

camundongos imunodeficientes.

As CTMs encontradas na medula óssea ou veia de cordão umbilical são muito

similares do ponto de vista fenotípico e genotípico. No entanto, um estudo anterior

realizado no Centro de Terapia Celular (CEPID - FAPESP), comparando o perfil de

expressão de mRNA por SAGE, revelou pequenas diferenças, indicando que as CTMs

derivadas de medula óssea estariam mais comprometidas com linhagens

osteoblásticas e adipocíticas, enquanto que as derivadas de veia de cordão

umbilical com a funções ligadas à angiogênese ou vasculogenese (Panepucci, Siufi

et al., 2004). Se confirmadas em nível protéico, essas diferenças de expressão

podem contribuir para uma melhor compreensão das diferenças entre CTM de

origem distintas e suas implicações na escolha adequada para diferentes aplicações

na terapia celular.

Frente o exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Lewis Joel Greene através do

sub-projeto 12, intitulado “Comparação da expressão de proteínas de células

tronco mesenquimais humanas obtidas da medula óssea e da veia do cordão

umbilical”, terá como objetivo principal comparar o perfil protéico das CTMs

isoladas de veia de cordão umbilical e medula óssea utilizando a abordagem

proteômica 2D DIGE, seguida de espectrometria de massa, para avaliação de

proteínas pré-selecionadas.

Para isso, células tronco mesenquimais (CTM) humanas serão obtidas da

medula óssea, como descrito por Silva et al. (Silva, Covas et al., 2003) e da veia do

cordão umbilical humano como descrito por Covas et al. (Covas, Siufi et al., 2003)e

Panepucci et al. (Panepucci, Siufi et al., 2004). As proteínas serão extraídas,

quantificadas e utilizadas para a realização de eletroforese bidimensional 2DE. A

comparação do perfil de “spots” entre as diferentes amostras será realizada

através do sistema de aquisição de imagem ImageScanner e o programa

ImageMaster 4.0 (Amersham Biosciences). Os “spots” exclusivos de cada amostra

serão recortados dos géis e submetidos ao procedimento de identificação por

espectrometria de massa após, (espectrômetro tipo MALDI-TOF) após digestão in

situ com tripsina como descrito por Pereira et al. (Pereira, Faca et al., 2005). A

identificação será feita automaticamente em bancos de dados do NCBI.

Adicionalmente, a lista de massas de peptídeos de cada amostra será manualmente

submetida ao MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu/csfhtml4.0/msfit.htm) para

confirmação das identificações feitas automaticamente. A classificação funcional

das proteínas identificadas será realizada no banco de dados Gene Ontology

(Ashburner, Ball et al., 2000) através da ferramenta FatiGO

(http:fatigo.bioinfo.cnio.es)(Al-Shahrour, Diaz-Uriarte et al., 2004) na tentativa de

padronizar os termos utilizados para descrever classes e funções das proteínas.

Uma etapa adicional será a utilização do sistema 2D DIGE (two-dimensional

difference gel electrophoresis). A marcação das proteínas com marcadores

fluorescentes será realizada de acordo com instruções do fabricante (GE

Healthcare) e a aquisição da imagem dos géis será realizada sem a retirada dos géis

das placas em um "scanner" com 3 canais de fluorescência (Typhoon Trio). Esta

etapa será realizada no Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração (INCOR)

da Faculdade de Medicina da USP - São Paulo. A análise dos géis será feita com a

utilização do software DeCyder versão 6.0.

Além das CTH e das CTM, outras células tem se mostrado potencialmente

interessantes para o uso terapêutico. As células epiteliais amnióticas (CEA)

possuem capacidade de diferenciação in vitro adipogênica, condrogênica,

osteogênica, miogênica esquelética, cardiomiogênica, neurogênica, pancreática e

hepática. Elas expressam marcadores de células-tronco embrionárias (SSEA-4, TRA

1-60 e TRA 1-81, Oct-4, FGF-4, SOX-2, Rex-1), diferentemente das células

mesenquimais amnióticas. Além disso, devido a sua capacidade imunomoduladora e

baixa imunogênicidade, as células derivadas da membrana amniótica são fortes

candidatas para uso em transplantes alogênicos. As amplas propriedades de

diferenciação aliadas à facilidade de isolamento destas células e a disponibilidade

de placentas tornam o âmnio uma fonte útil e não-controversa de células para

transplante e medicina regenerativa (Miki, Lehmann et al., 2005; Toda, Okabe et

al., 2007; Parolini, Alviano et al., 2008). Estas células são mais comumente obtidas

na presença de soro bovino fetal, mas o uso clínico requer métodos de isolamento e

cultivo isentos de componentes de origem animal.

Desta forma, o grupo coordenado pelo Dr. Wilson Araújo da Silva Jr através

do sub-projeto 13, intitulado “Diferenças na expressão gênica e de marcadores

imunofenotípicos em células epiteliais amnióticas obtidas na presença e na

ausência de componentes de origem animal”, terá como objetivo, comparar

células epiteliais amnióticas cultivadas com soro bovino fetal (CEA) e uma

subpopulação de CEA, denominadas células progenitoras multipotentes amnióticas

(CPMA), isolada e cultivada sem componentes de origem animal. Para isso,

utilizando placentas obtidas na ocasião do parto, a membrana amniótica será

descolada do córion e tripsinizada para separar o epitélio do mesênquima

adjacente para obtenção das células epiteliais; separação das CEA em gradiente de

Percoll; cultivo das CEA com soro bovino fetal (SBF) e fator de crescimento

epitelial (EGF) (Parolini, Alviano et al., 2008); cultivo das CPMA sem SBF ou EGF

(Banas, Trumpower et al., 2008); análise de marcadores de CEA e CTE por

citometria de fluxo (SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, NANOG e OCT-4,

CD9, CD10, CD29, CD49f, CD90, CD104, CD34, CD45, CD117 e CD140b) e

marcadores imunológicos (HLA-ABC, HLA-DR, HLA-G, CD80, CD86, CD40, CD40L, PD-

1, PD-L1, PDL-2 e HLA-G); comparação da capacidade de se diferenciar em cada

uma das três camadas germinativas segundo Miki e colaboradores (Miki, Lehmann

et al., 2005); extração de RNA das células cultivadas de ambas as formas e

avaliação da expressão gênica global utilizando microarrays (Agilent Technologies).

Apesar do uso de marcadores ou métodos de seleção a partir de sua

propriedade de aderência ao plástico serem muito disseminados, células tronco

mais primitivas podem ser identificadas pela propriedade de excluir corantes

lipofílicos, como por exemplo Hoechst. Estas células adquirirem o perfil de

população lateral (“side population”) durante o procedimento de clonagem celular

por citometria de fluxo (Goodell, Brose et al., 1996). Originalmente células-tronco

“side population” foram isoladas da medula óssea de murinos onde estão presentes

em baixa freqüência (~0,05%) e apresentam maior potencial de reconstituir o

sistema hematopoético quando comparado as CTHCD34+. Em seguida, a presença

de SP foi demonstrada na medula óssea humana, bem como em outros tecidos,

entre eles, fígado, cérebro, glândula mamária, rim, pele, testículos e retina

(Challen e Little, 2006) sugerindo sua ampla distribuição no organismo. Porém, o

papel funcional destas células não é bem conhecido. Estudos preliminares por nosso

grupo permitiram mostrar o isolamento de células SP da medula óssea humana e

demonstrar elevados níveis de genes da pluripotência, como por exemplo, Nanog,

Oct4, c-myc e b-catenina (Picanço-Castro, com. pessoal). Considerando as

limitações das aplicações das células-tronco embrionárias, rejeição imunológica e

potencial tumorigênico, a utilização de células-tronco “side population” pode

constituir uma fonte alternativa mais segura permitindo o uso de células autólogas.

O grupo de pesquisadores do Centro de Terapia Celular desenvolve pesquisas com

células-tronco mesenquimais há oito anos. Fomos os pioneiros a demonstrar a

presença de CTM na veia umbilical (Covas, Siufi et al., 2003) e recentemente

demonstramos sua ampla distribuição em diferentes tecidos adultos, bem como,

suas similaridades com pericitos (Covas, Panepucci et al., 2008).

Dada a importância da identificação e caracterização de células-tronco mais

primitivas para sua avaliação quanto ao potencial terapêutico, em tese superior, o

grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas, através do sub-projeto 14,

intitulado “Isolamento e caracterização funcional de células-tronco

pluripotentes - side population”, tem como objetivo geral, isolar e caracterizar

células-tronco SP de três tecidos humanos: medula óssea, veia umbilical e capilares

cerebrais, bem como, a partir de culturas de células-tronco mesenquimais da

medula óssea e veia umbilical e de pericitos obtidos a partir de capilares

sanguíneos. Para isso, serão realizados estudos de caracterização fenotípica,

morfológica e perfil de expressão gênica para avaliar as similaridades e

heteregeneidades das células SP dos diferentes tecidos e das células SP obtidas a

partir de culturas de células-tronco mesenquimais. Em paralelo, células-tronco SP

isoladas dos três tecidos no dia zero serão submetidas ao cultivo em três diferentes

meios: a) meio de cultivo de CTM; b) meio de cultivo de célula-tronco

hematopoética e c) meio de cultivo de células-tronco embrionárias. Também será

realizada a caracterização desses tipos celulares utilizando os mesmos parâmetros

acima descritos. A cultura que se mostrar mais promissora será utilizada

subsequentemente em modelos animais para testar seu potencial regenerativo.

Em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino, o presente

projeto objetiva também isolar células-tronco “side population” da medula óssea e

capilares cerebrais de ovelhas e do saco vitelínico de cães e caracterizar quanto o

perfil morfológico, fenotípico, expressão gênica e avaliar o potencial terapêutico

em modelos de aplasia de medula, lesões de retina e lesões de isquemia cerebral.

Uma segunda colaboração com o grupo do Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles

visa ao isolamento de células-tronco “side population” da medula óssea e cordão

umbilical de fetos bovinos portadores de GFP “in útero”. De maneira similar, as

células-tronco “side population” desses animais transgênicos serão avaliadas

seguindo os mesmos parâmetros citados acima. Também, serão realizados

experimentos de transferência nuclear em oócitos enucleados bovinos utilizando o

núcleo de células SP/GFP+ para avaliar o potencial de reprogramação genética

deste tipo celular. Em paralelo, será avaliado o potencial de enxertia dessas

células SP-GFP+ em modelo de transplante de camundongos imunodeficientes

utilizando o sistema IVIS. Ainda em colaboração com o Prof Flávio, o núcleo das

células SP humanas poderão ser induzidas à reprogramação utilizando como

receptor o citoplasto bovino.

O uso de todo o potencial de qualquer célula tronco, em terapias visando à

regeneração de algum tecido, depende do entendimento aprofundado dos

mecanismos que controlam estes processos. As células-tronco mesenquimais (CTMs)

são capazes de se diferenciar em múltiplos tipos celulares, entretanto, o

conhecimento das vias e moléculas que regulam a manutenção do estado de

indiferenciação, bem como o processo de diferenciação ainda não estão

esclarecidos. Nesta última década, uma atenção especial tem sido dada aos RNAs

não-codificantes (noncoding RNA), visto que são considerados importantes

elementos relacionados ao sistema de regulação endógeno. Os miRNAs compõem

um pequeno grupo destes RNAs endógenos, formados por uma seqüência de

composta por 18 a 25 nucleotídeos. Em humanos, já foram identificados mais de

500 miRNAs (Griffiths-Jones, Grocock et al., 2006). Os miRNAs exibem diversas

funções biológicas, como na secreção de insulina, hematopoese, desenvolvimento

embrionário e muscular e manutenção e diferenciação das células tronco (Bartel,

2004; Du e Zamore, 2005; Wienholds e Plasterk, 2005). Eles também participam dos

aspectos funcionais das células como proliferação, sobrevivência e apoptose (Di

Leva, Calin et al., 2006). Alguns autores, já demonstraram que microRNAs

(miRNAs) apresentam-se desregulados em situações como no câncer, em doenças

virais e genéticas, na manutenção e diferenciação de células tronco adultas e

embrionárias, entre outras. Recentemente, Mizuno e cols. (Mizuno, Yagi et al.,

2008) demonstraram a diminuição da expressão do miR-125b durante o processo de

diferenciação osteoblástica em de CTMs murinas. Até o presente momento,

nenhum miRNA foi relacionado como um importante fator na diferenciação de

CTMs humanas.

Desta forma, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através do

sub-projeto 15, intitulado “Avaliação Funcional de microRNAs na diferenciação

de células mesenquimais estromais multipotentes humanas”, terá como objetivo

geral, avaliar do perfil de expressão, bem como o papel de miRNAs durante a

diferenciação de CTMs em osteócitos. Com esse objetivo, as seguintes abordagens

experimentais serão adotadas: isolar e cultivar CTM de medula óssea; promover a

diferenciação em osteócitos e coletar amostras em diferentes tempos: dias zero,

24 horas, 72 horas, 7 dias, 14 dias e 21 dias; quantificar o nível de expressão de

miRNAs maduros utilizado o método TaqMan® microRNA assays Human e selecionar

aqueles potencialmente envolvidos; analisar o efeito funcional de miRNAs

selecionados reduzindo seus níveis utilizando o sistema Anti-miR™ miRNA Inhibitor

(Ambion); analisar o efeito funcional de miRNAs selecionados reduzindo seus níveis

utilizando o sistema Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule (Ambion); detectar

potenciais genes alvos para o miRNA-125b utilizado algoritmos como miRanda e

RNAhybrid.

A capacidade de auto-renovação assim como o potencial de diferenciação

em tipos celulares de diferentes tecidos tornam às células-tronco adultas uma

ferramenta importante para o estudo de certas doenças. Mais especificamente, a

facilidade de obtenção e cultivo das CTM e sua capacidade de diferenciação em

osteoblastos permitem que essas células sejam utilizadas como modelo de estudo

para doenças ósseas. A osteogênese imperfeita (OI), uma das displasias ósseas mais

frequentes, ocorre igualmente entre todos os grupos étnicos e é caracterizada

como uma desordem genética das células mesenquimais na qual uma osteopenia

generalizada leva a deformidade óssea, fragilidade óssea excessiva e baixa

estatura. As características principais da doença são decorrentes da produção

insuficiente ou defeituosa de moléculas de colágeno. Alguns estudos têm sido

conduzidos com o objetivo de se identificar genes com expressão exclusiva ou

diferenciada durante o processo de diferenciação osteogênica. No entanto, são

poucos os estudos funcionais referentes aos genes diferencialmente expressos

neste processo, em células derivadas de pacientes com OI. Desta forma, o grupo

coordenado pelo Dr. Wilson Araújo da Silva Jr através do sub-projeto 16,

intitulado “Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação osteogênica in

vitro em amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita”, terá

como objetivo geral, analisar o perfil de expressão gênica em células-tronco

mesenquimais durante o processo de diferenciação em osteoblastos de pacientes

portadores de Osteogênese Imperfeita e de indivíduos controle. Com este objetivo,

propõe-se: o cultivo e expansão das células-tronco mesenquimais de pacientes e

doadores normais; análise de expressão gênica em larga escala utilizando

microarrays; análise de bioinformática para a identificação de redes gênicas

fundamentais para a osteogênese; análise de expressão por PCR em tempo real;

estudos funcionais de interferência gênica utilizando RNAi.

A localização sistêmica das CTMs na parede de todos os vasos sanguíneos

(Uccelli, Moretta et al., 2008) associadas à suas propriedades imunossupressora e

imunoreguladora (Nauta e Fibbe, 2007) levantam questões sobre o eventual

participação destas células em doenças auto-imunes (DAIs) inflamatórias. Existem

poucos estudos sobre as características genéticas e funcionais de CTMs de

pacientes com DAIs (Sun, Zhang et al., 2007; Larghero, Farge et al., 2008) e

nenhum dado sobre as CTMs de modelos animais de DAIs geneticamente

determinadas. Portanto, ainda não está estabelecido se as CTMs de pacientes com

DAIs ou de modelos animais genéticos de DAIs são células normais ou defectivas. O

diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) (Atkinson e Eisenbarth, 2001) e a esclerose múltipla

(EM) (Sospedra e Martin, 2005) são mediadas por células T auto-reativas e

caracterizadas pela destruição seletiva de células β pancreáticas produtoras de

insulina e do sistema nervoso central, respectivamente. Adicionalmente, a

suscetibilidade ao DM-1 e a EM é determinada por fatores genéticos e ambientais.

Assim, a caracterização molecular das CTM obtidas destes pacientes poderá revelar

genes e vias de sinalização alterados e/ou defeitos funcionais, possivelmente

relacionados ao desencadeamento da auto-imunidade e/ou à patogênese da

doença, que poderão ser estudados detalhadamente e possibilitar futuramente o

desenvolvimento de novas formas terapêuticas para o tratamento dessas DAIs. Por

outro lado, se os resultados mostrarem que as CTMs de pacientes com EM são

normais genética e funcionalmente, elas poderão ser usadas seguramente como

fonte celular autóloga para o tratamento de pacientes com DM-1 e EM.

Desse modo, o grupo coordenado pelo Dr. Júlio César Voltarelli através do

sub-projeto 17, intitulado “Análise gênica, protéica e funcional de células-

tronco mesenquimais de pacientes com doenças auto-imunes”, terá como

objetivo, avaliar as características funcionais e o perfil de expressão gênica e

protéica em larga escala de CTMs de pacientes com DM-1 e EM. Para isso, serão

estudados 15 pacientes com DM-1 e 15 pacientes com EM, os quais serão

submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de

transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (IAD/TACTH), na Unidade

de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Serão

colhidas amostras de medula óssea (MO) dos pacientes com DM-1 ou EM antes da

IAD/TACTH e seis meses após o transplante. Serão colhidas amostras de MO de

indivíduos saudáveis (doadores voluntários de medula) para isolamento de CTMs

para controle dos experimentos. As células mononucleares da MO dos pacientes

serão isoladas por centrifugação em gradiente de densidade para o isolamento e

cultura de CTMs e na terceira passagem, serão separadas amostras de CTMs para:

1) caracterização biológica das CTMs (unidades formadoras de colônia

fibroblastóides, imunofenotipagem, capacidade proliferativa (tempo de duplicação

celular); 2) avaliação da capacidade imunossupressora das CTMs in vitro (ensaio de

inibição da proliferação de linfócitos pelo co-cultivo com CTMs); 3) diferenciação

em adipócitos e osteócitos; 4) extração de RNA para análises de expressão gênica

em larga escala por microarrays e validação por RT-PCR em tempo real; 5)

extração de proteínas para análises de expressão protéica em larga escala pela

técnica de gel de eletroforese bidimensional.

Os mecanismos moleculares responsáveis por propriedades como auto-

renovação, manutenção do estado indiferenciado, e quiêscencia, não são

encontradas apenas nas células tronco normais. Muitas vezes estes mecanismos

podem ser encontrados atuando em outras células em situações patologicas. É o

caso da leucemia mielóide aguda (LMA). Os novos regimes quimioterápicos

desenvolvidos para a LMA têm conseguido induzir a remissão da doença e

aumentado a sobrevida dos pacientes leucêmicos. Porém, as recidivas continuam a

ser um problema bastante comum, especialmente entre pacientes mais idosos e/ou

pacientes com mau prognóstico. As recidivas foram atribuídas à existência de

células-tronco leucêmicas quiescentes e, por essa razão, resistentes à

quimioterapia. As células leucêmicas originárias de células precursoras normais são

similares a estas, porém não idênticas, pois eventos genéticos como mutações e

translocações cromossômicas foram responsáveis por suas propriedades

neoplásicas. Uma característica das células neoplásicas é que os complexos

caminhos que controlam o mecanismo de apoptose estão, de alguma forma,

prejudicados ou impedidos por fatores que, provavelmente, incluem a redução da

expressão de algumas proteínas apoptóticas, bem como o aumento da produção de

proteínas ou enzimas antiapoptóticas. Vários estudos têm demonstrado que

diferenças nos níveis de RNA e proteínas envolvidas na apoptose e controle do ciclo

celular são recorrentemente vistas quando analisam-se células leucêmicas e células

normais. Também foram demonstradas diferenças nos níveis protéicos quando as

células leucêmicas são tratadas com os quimioterápicos ácido all trans-retinóico

(ATRA) e As2O3. Assim, o grupo coordenado pelo Dr. Lewis Joel Greenne através do

sub-projeto 18, intitulado “Determinação dos níveis de algumas proteínas

relacionadas ao processo apoptótico e controle do ciclo celular de células

precursoras hematopoéticas normais e células precursoras”, terá como objetivo,

identificar diferenças nos níveis de proteínas envolvidas em processos apoptóticos

e no controle do ciclo celular em células-tronco hematopoéticas normais (CTHs) e

células-tronco leucêmicas (CTLs). Será feita também a comparação entre os níveis

de expressão de proteínas de blastos leucêmicos tratados e não tratados com

As2O3. Para isso, uma abordagem proteômica seletiva será usada. Proteínas de CTH

normais (CD34+CD38-) e CTLs (CD34+CD38-CD123+), ou ainda blastos leucêmicos

tratados e não tratados com As2O3, serão separadas por eletroforese bidimensional

e identificadas por espectrometria de masssa (MS) após serem hidrolisadas por

tripsina. Além da identificação das proteínas por espectrometria de masssa (MS)

será feito a sua imunodetecção por Western Blott. As proteínas a serem estudas

são: Flavoproteína Transferidora de Elétron - subunidade beta, Proteína

antioxidante-2, Transgelina-2, HMGB-1, c-H-ras, Anexina I, Peroxirredoxina-2, Rho-

GDI alfa, Rho-GDI beta e também três proteínas descritas nas duas vias clássicas da

apoptose: caspase-3, caspase-9 e BCL2. A proteína nucleofosmina-1, de grande

interesse no controle do ciclo celular, também será monitorada no presente

estudo.

O grupo coordenado pelo Dr. Eduardo Magalhães Rego estudará os

mecanismos subjacentes à transformação maligna das células tronco

hematopoética usando dois modelos animais: a) camundongos mutantes para gene

da disquerina (subprojeto 19), e b) macacos verdes transplantados com células

tronco hematopoéticas transduzidas como o gene de fusão CALM-AF10 (subprojeto

20). As mutações do gene da disquerina estão associadas à doença humana

disceratose congênita, e os pacientes com esta doença apresentam redução da

atividade hematopoética e propensão ao desenvolvimento de cânceres. Estas

manifestações estão diretamente associadas à desregulação de características

fundamentais das células tronco hematopoéticas (quiescência e auto-renovação). A

disquerina é uma enzima essencial a formação dos ribossomos, e nossa hipótese é

que a desregulação da biogênese destas organelas está ligada a perda da

capacidade de auto-renovação e à transformação maligna. Caso seja confirmada,

esta hipótese abrirá uma nova fronteira na investigação da patogênese e

tratamento do câncer. O segundo modelo estudará como o gene híbrido CALM-AF10

desvia da via de diferenciação normal as células tronco hematopoéticas, causando

a leucemia aguda.

Especificamente, o sub-projeto 19 intitulado “O papel da disquerina na

diferenciação das células hematopoéticas” objetiva determinar o papel da

biogênese ribossomal na auto-renovação e diferenciação da célula tronco

hematopoética. Para determinar se as anormalidades nos camundongos Dkc1m são

devido a um defeito autônomo da célula, realizaremos ensaios de repopulação

competitivos. Nestes experimentos, células tronco hematopoéticas de mutantes

Dkc1 serão testadas contra seus correlatos selvagens quanto a sua capacidade de

repovoar receptores C57/BL6 letalmente irradiados. Se a função do gene Dkc1 for

essencial para a célula tronco, esperamos por um número reduzido de células

maduras de todas as linhagens (linfóide, granulocítica/monocítica e

megacariocítica) nos camundongos receptores de células Dkcm. Tendo em vista

nossos resultados preliminares, o melhor candidato a progenitor hematopoético

alvo das mutações Dkc é o Progenitor Linfóide Comum (CLP). Assim, isolaremos os

CLPs de camundongos Dkc1m e controles selvagens, e realizaremos os ensaios de

repopulação competitivos como descritos acima, mas desta vez, os receptores

serão camundongos rag-/-, os quais não apresentam células T e B maduras no

sangue periférico. Para comprovar a relação causa-efeito, será quantificada a

expressão do gene Dkc1 nos precursores isolados a partir da medula óssea dos

camundongos transgênicos. Planejamos isolar HSCs, CLPs, Frações A and B da

linfopoese, Progenitores Mielóides Comuns (CMPs), Progenitores

Granulocíticos/Monocíticos (GMPs), and e Progenitores Mielóides/Eritróides (MEPs)

da MO de camundongos Dkc1m e selvagens por Fluorescence-activated cell sorter

(FACS), e analisaremos a expressão do gene Dkc por PCR em tempo real. Além

disto, quantificaremos a apoptose e crescimento celular dos progenitors linfóides

Dkcm.

No estudo de leucemias agudas humanas, a experimentação animal oferece

subsídios indispensáveis para o entendimento de mecanismos fisiológicos e

moleculares envolvidos no desenvolvimento das mesmas. No subprojeto 20

intitulado “Modelo de Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus

aethiops) Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com Vetor

Retroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10” objetiva produzir um modelo de

Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus aethiops) usando células

tronco hematopoéticas transduzidas com vetor retroviral contendo o gene híbrido

CALM-AF10. Embora o modelo murino seja o mais amplamente utilizado, devido ao

seu relativo baixo custo e facilidade de manutenção e manipulação. Esse modelo,

contudo, apresenta várias limitações. Do ponto de vista experimental, a realização

de algumas técnicas é limitada pelo tamanho do animal, dificultando a coleta

seriada de amostras em volume adequado. Do ponto de vista genético, o modelo

murino difere do humano em vários aspectos, o que leva à necessidade da

validação de determinados resultados em um organismo filogeneticamente mais

próximo do homem para a realização de pesquisas pré-clínicas. O macaco verde

africano (Chlorocebus aethiops) é um dos primatas não-humanos mais utilizados em

pesquisa biomédica. O Chlorocebus aethiops tornou-se um importante modelo

para o estudo do HIV, uma vez que, diferente do macaco Rhesus, esse animal é

facilmente infectado pelo vírus da imunodeficiência símia, mas não progride para a

doença. Além disso, essa espécie não apresenta limitação populacional, é de

pequena estatura e fácil manejo, não sendo tão suscetível a doenças como o

Rhesus. A translocação t(10;11)(p13;q14), envolvendo os genes CALM e AF10 é

descrita em pacientes com leucemias linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda

e linfoma maligno. Apresenta prognóstico desfavorável, semelhante ao dos

pacientes com translocações envolvendo o gene MLL. As células leucêmicas de

pacientes e camundongos apresentando a fusão CALM-AF10 coexpressam antígenos

das linhagens mielóide e linfóide, fazendo com que o estudo dessas células possa

contribuir na identificação e caracterização de células tronco leucêmicas. A

necessidade de um modelo animal mais próximo do humano para pesquisa

translacional e pré-clínica no estudo de células tronco normais e leucêmicas, a

disponibilidade de Chlorocebus aethiops dentro do Centro Nacional de Primatas

(CENP) e de equipe com experiência nos modelos propostos torna o projeto em

questão realizável de forma prática e relevante quanto aos objetivos.

Neste projeto, serão desenvolvidos: 1) a padronização dos métodos de coleta de

sangue e medula óssea no laboratório do CENP e avaliação dos parâmetros de

hemograma e mielograma, bem como citogenética do Chlorocebus aethiops; 2)

determinação de protocolo de imunossupressão com estudo de doses de drogas

mieloablativas ou radiação a ser realizado junto ao CENP; 3) estabelecimento de

um protocolo de infecção dessas células com sobrenadante de cultura de células

produtoras de partículas retrovirais contendo vetor de expressão de gene repórter

e o gene híbrido CALm-AF10; 4) monitoramento dos paramentros hematológicos do

sangue e da medula óssea de animais receptores e no caso de desenvolverem a

leucemia aguda, será realizada a análise citogenética e de expressão gênica das

células malignas; 5) análise do efeito de novos agentes antileucêmicos como o

ester do ácido ceféico, CAPE, in vitro e in vivo.

Como já mencionado, as CTMs são consideradas uma fonte celular

importante para terapias celulares e têm sido utilizadas com eficácia no

tratamento de diversas doenças, tais como doenças hematológicas, imuno-

mediadas e cardiovasculares, tanto em modelos experimentais quanto em humanos

(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008). As propriedades imunoregulatórias

(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008) e regenerativas (Fu, Fang et al., 2006;

Badillo, Redden et al., 2007; Sasaki, Abe et al., 2008)das CTM, seu fácil isolamento

de tecidos adultos e expansão in vitro e sua capacidade de migração para sítios de

inflamação(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008) levaram à recente

realização de estudos pré-clínicos que demonstraram seu grande potencial

terapêutico no tratamento de úlceras de pele. As mesmas propriedades destacadas

também tornam as CTM uma alternativa terapêutica interessante para o

tratamento de úlceras de pele ocasionadas por queimaduras extensas, visando

acelerar o processo de regeneração da pele lesada. Queimaduras térmicas extensas

de pele são de difícil tratamento, principalmente porque levam ao

comprometimento do sistema imunológico e de outros órgãos, podendo levar o

paciente a óbito em poucos dias. A expansão de CTMs autólogas com número

suficiente de células para aplicação leva de 2-3 semanas. No entanto, pacientes

com queimaduras graves necessitam de tratamento com urgência, inviabilizando a

terapia celular autóloga. Por outro lado, a utilização de CTMs alogênicas,

previamente estabelecidas de outros doadores saudáveis, possibilitaria uma maior

rapidez no tratamento dos pacientes queimados, e consequentemente, diminuindo

o risco de infecções, através do aumento da velocidade de regeneração da pele

lesada.

A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina que reconhece β-galactosídeos e

participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta

imunológica, a homeostasia leucocitária e a regeneração tecidual de músculos e

nervos (Salatino, Croci et al., 2008). Vários relatos da literatura reportam o

potencial uso terapêutico da Gal-1 para tratamento de doenças auto-imunes,

inflamatórias e degenerativas (Salatino, Croci et al., 2008). Embora haja descrito

alguns poucos estudos (Rasulov, Vasilenko et al., 2006) que utilizaram CTMs no

tratamento de queimaduras de pele, ainda não foi realizado um estudo detalhado

dos mecanismos de ação pelos quais as CTMs aceleram o processo de regeneração

da pele e promovem a melhora clínica das úlceras ocasionadas por queimaduras

graves e extensas.

Dessa forma, o grupo coordenado pelo Dr. Júlio César Voltarelli através do

sub-projeto 21, intitulado “Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco

mesenquimais na regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura

térmica extensa em modelo animal”, visa estudar o potencial terapêutico de

CTMs xenogênicas e alogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por

queimaduras térmicas extensas em ratos. Considerando que a Gal-1 participa do

processo de regeneração tecidual e é altamente expressa em CTMs, pretendemos

estudar também o impacto da Gal-1 sobre o potencial terapêutico de CTMs

xenogênicas no tratamento de úlceras provocadas por queimaduras.

Para isto, CTMs serão isoladas da medula óssea de camundongos C57BL/6

selvagens (Gal-1+/+) ou destituídos do gene para Gal-1 (Gal-1-/-) ou de ratos e

expandidas in vitro. As CTMs (alogênicas, xenogênicas selvagens ou Gal-1+/+) e/ou

a galectina-1 recombinante murina (Gal-1rm) serão aplicadas pela via tópica e/ou

sistêmica, em animais previamente submetidos à queimadura de pele extensa.

Serão avaliados após o tratamento ou não das queimaduras com as CTMs: a

gravidade da queimadura, o processo de regeneração tecidual, o estado de

imunossupressão sistêmica, a expressão de fatores angiogênicos, fatores de

crescimento, de quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras e a expressão

protéica diferencial por análises proteômicas. Serão, portanto, estudados

detalhadamente nesse projeto os mecanismos de ação das CTMs no processo de

regeneração de úlceras ocasionadas por queimaduras térmicas extensas. Além

disso, será feita uma comparação entre potencial terapêutico de CTMs

administradas por via tópica ou via sistêmica e uma comparação entre o potencial

terapêutico de CTMs alogênicas e xenogênicas.

Dado o potencial de auto-renovação e homing das CTM, em adição a suas

propriedades terapêuticas diretas, exploradas nos protocolos de terapia celular,

estas células podem ser usadas como células entregadoras de proteínas

terapêuticas a pacientes com deficiências específicas. É o caso da Hemofilia B,

uma doença genética associada ao cromossomo X que consiste na deficiência do

fator IX da coagulação sangüínea. Ocorre em 1:20.000 homens, os quais em geral

são tratados com injeção intravenosa da proteína do fator IX purificada a partir do

plasma de indivíduos normais. Esse tratamento apresenta dois inconvenientes

principais: 1) risco de contaminação viral e 2) elevado custo, o que limita seu uso a

20% da população mundial de hemofílicos (Lillicrap, Nair et al., 2006). Por outro

lado, o caráter monogênico da doença, e a o fato de que um pequeno aumento no

nível do fator de coagulação (1 a 5% do normal) ser suficiente para a melhoria do

estado clínico do paciente tem incentivado grupos de pesquisadores a

desenvolverem estratégias de terapia celular e gênica como alternativa terapêutica

para essa doença. Entre os modelos desenvolvidos podemos citar: 1) protocolos de

terapia gênica que envolvem a infusão de vetores virais portadores do FIX

recombinante e 2) protocolos de terapia celular, que consistem na infusão de

células autólogas, em geral fibroblastos de pele, modificadas geneticamente a

expressarem o fator IX recombinante. Atualmente, existem dois ensaios clínicos de

terapia gênica para hemofilia B que empregam o adenovírus recombinante portador

do FIX. As principais limitações destes ensaios clínicos consistem na resposta

imunológica frente à toxicidade das proteínas adenovirais e a necessidade da

grande demanda de partículas virais em função da baixa eficiência. Para contornar

esse problema, o uso da terapia celular pode consistir em uma estratégia mais

promissora, considerando que a produção em larga escala de células é mais

factível, aliado ao fato que o uso de CTM geneticamente modificadas podem

conduzir a uma resposta imunológica menor e manutenção da expressão da

proteína recombinate por um período mais prolongado.

O grupo de pesquisadores do Hemocentro de Ribeirão Preto tem grande

experiência com modificação gênica de células-tronco e linhagens celulares

humanas utilizando o sistema retroviral e desenvolve pesquisa de clonagem e

expressão dos fatores VIII e IX de coagulação sangüínea em células de mamífero há

11 anos. Durante esse período, foi gerada uma biblioteca de 43 linhagens

recombinantes, sendo três delas relativas ao fator IX de coagulação sangüínea

humana. Também desenvolve pesquisas com células-tronco mesenquimais (CTM) há

oito anos, e atualmente existem relatos da literatura de ensaios clínicos que estão

sendo desenvolvidos envolvendo o uso de CTM modificadas geneticamente para a

infusão em indivíduos portadores de osteogênese imperfecta. Sendo assim, o grupo

coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas, através do sub-projeto 22, intitulado

“Uso de celulas-tronco mesenquimais modificadas geneticamente para

expressão do fator VIII em modelos murinos portadores de Hemofilia B”, propõe

realizar a modificação gênica de pericitos hepáticos com o fator IX recombinante

utilizando o sistema retroviral, seguida da infusão em modelo murino de hemofilia

B. Para isso, as seguintes abordagens experimentais serão adotadas: isolamento,

seleção e cultivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea; isolamento,

seleção e cultivo de pericitos cerebrais e hepáticos (um gradiente de dextran será

utilizado para a separação das células dos capilares, seguida da seleção por

citometria de fluxo de células coradas com Hoeschst 33342 e sensíveis ao

tratamento com a droga verapamil); análise morfológica por microscopia de

contraste de fase e microscopia convencional após coloração por Leishman;

avaliação do perfi imunofenotípico com um painel de 18 anticorpos monoclonais

através de citometria de fluxo; avaliação do perfil citogenético por bandamento

cromossômico GTG, com no mínimo 400 bandas por meio de microscópio óptico,

utilizando o software BANDView®EXPO (Applied Spectral Imaging). Os cariótipos

serão descritos de acordo com os critérios internacionais de nomenclatura

cromossômica (ISCN,2005); determinação do potencial de diferenciação; avaliação

da expressão gênica por PCR em tempo real; avaliação do transcriptoma por por

microarray (Agilent).

O crescente número de aplicações clínicas envolvendo células-

troncomesenquimais gera a necessidade da produção em larga escala destas células

com adequada qualidade terapêutica. A metodologia atual de cultivo das células-

tronco mesenquimais apresenta quatro limitações principais: 1) excessiva

manipulação que pode interferir com as propriedades funcionais das células em

virtude das sucessivas passagens com tratamentos enzimáticos que as mesmas são

expostas; 2) maior risco de contaminação decorrente da extensa manipulação; 3)

inexistência do controle dos parâmetros de cultivo e conseqüentemente da

fisiologia celular e 4) alto custo e tempo prolongado de cultivo para a geração da

quantidade adequada e não diferenciada de células. Desta forma, o

desenvolvimento de uma tecnologia capaz de otimizar o sistema de cultivo das

CTM, reduzindo as limitações mencionadas, promovendo um aumento de escala e

permitindo um melhor controle dos parâmetros de cultivo, permitiria a obtenção

de um produto de alto padrão clínico de forma eficiente, econômica e segura. O

cultivo de células-tronco em biorreatores utilizando microcarregadores, do ponto

de vista da engenharia de tecidos, tem sido reportado na literatura como eficiente

em termos da expansão das mesmas e manutenção do fenótipo original (Malda e

Frondoza, 2006; Frauenschuh, Reichmann et al., 2007; Schop, Janssen et al.,

2008). Além disso, determinados microcarregadores chegam a possuir uma área

disponível para crescimento celular da ordem de 20 cm2/mL, ao passo que as

culturas convencionais em monocamadas disponibilizam cerca de 4 cm2/mL.

Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através

do sub-projeto 23, intitulado “Desenvolvimento de um bioprocesso para

expansão de Células-Tronco Mesenquimais em microcarregadores”, terá como

objetivo principal, desenvolver um bioprocesso para cultivo e expansão de células

tronco mesenquimais da medula óssea e da parede da veia umbilical em

microcarregadores e avaliar as propriedades biológicas e funcionais pós-cultivo. Os

métodos envolvidos neste projeto compreenderão: separação de células

mononucleares e cultivo e expansão de CTM da medula óssea em garrafas de

cultura estática; cultivo das CTM em biorreator spinner em microcarregador

comerciais (Cytodex 3 - GE Healthcare e Cultispher S - Percell Biolytica) com

controle da concentração de oxigênio dissolvido, pH e agitação; análise

morfológica por microscopia de contraste de fase e microscopia convencional após

a coloração por Leishman; avaliação do perfi imunofenotípico por citometria de

fluxo com um painel de 18 anticorpos monoclonais (CD105, CD73, Stro-1,; CD90-

PE,CD29, CD13, HLA ABC, CD49e, CD54, CD44, CD51/61, CD106, CD34, CD14, CD45,

HLA-DR, CD31, KDR; determinação do perfil citogenético por cariotipagem

utilizando bandamento GTG; avaliação do potencial de diferenciação in vitro

(coloração com SudanII/Scarlat para adipócito; von kossa e fosfatase alcalina para

osteócito; hematoxilina-eosina para condócitos e análise imuno-histoquímica para

colágeno tipo II); quantificação da expressão gênica por RT-PCR em tempo real.

Como mencionado anteriormente, certas características das células tronco

são comumente encontradas e células tumorais ou leucêmicas. De fato, muitos

genes tem suas funções descritas inicialmente por terem sido identificados atuando

de maneira patológica em neoplasias diversas. Neste sentido, os próximos dois sub-

projetos se caracterizam pelo estudo e identificação de genes envolvidos em

situações patológicas. Estes estudos envolvem técnicas de genomica funcional

(proteomica e estudos cromossômicos de alta resolução) e os grupos responsáveis

por eles, além de identificarem genes e suas funções com uso destas técnicas

atuarão em diversos outros sub-projetos propostos neste projeto.

As células gliais podem sofrer mutações para formar células tumorais gliais

ou gliomas, dentre os quais 70% originam de astrócitos. A alteração de receptores

de EGF (amplificação, formação de proteína truncada) tem sido bem estudada em

glioma e vários alvos downstream do receptor têm sido caracterizados como

PI3K/Akt e via de mTorr (Ohgaki e Kleihues, 2007). Nós desenvolvemos um estudo

proteômico em amostras de astrocitomas cirurgicamente removidas de pacientes,

baseado em eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MALDI-

TOF e ESI-MS/MS), para identificar proteínas diferencialmente expressas na

progressão tumoral, de acordo com o aumento dos graus de malignidade (graus II,

III e IV). As proteínas identificadas como superexpressas em graus mais avançados

do tumor foram: nucleofosmina (NPM), anexina I, anexina V, peptidil-prolil cis-

trans isomerase e alfa-cristalina cadeia B e estas apresentaram correlação com os

estádios de astrocitomas. A proteína NPM apresentou níveis de expressão

aumentados durante a evolução de astrocitomas, e demonstrou ter uma correlação

direta com a progressão tumoral, que foi confirmada por sondagem de amostras de

pacientes por anticorpo monoclonal anti-NPM através de Western Blot e por

microarranjo de DNA. A nucleofosmina (NPM), também conhecida como B23,

numatrina 1 ou NO38, é altamente conservada em vertebrados e distribuída entre

diversas espécies com peso molecular entre 35 a 40kDa e pI de 5,0 a 5.1. Em

humanos, existem duas isoformas, NPM1 (B23.1) e NPM1.2 (B23.2), as quais são

geradas a partir de uma simples via de splicing alternativo do gene. NPM é uma

fosfoproteína nucleolar que transita entre o núcleo e citoplasma durante o ciclo

celular e interage com diversas proteínas. Devido a esse comportamento, a NPM é

uma proteína multifuncional, incluindo o processamento de RNA ribossomal,

duplicação do centrossomo, resposta a estímulos de estresse tais como irradiação

UV e hipóxia, manutenção da estabilidade genômica através do controle de ploidias

celulares, participação em processos de reparo de DNA e a regulação da transcrição

através da modulação de eventos de condensação e descondensação da cromatina

(Grisendi, Mecucci et al., 2006; Lim e Wang, 2006). Não há dados na literatura que

relacionam NPM diretamente com gliomas, porém o trabalho de Sandsmark e cols.

(Sandsmark, Zhang et al., 2007) mostra NPM envolvida em sinalização celular e

reorganização dinâmica do citoesqueleto de astrócitos.

Assim, o grupo coordenado pelo Dr. Jose Cesar Rosa através do sub-projeto

24, intitulado “Proteômica funcional: estudos do papel da nucleofosmina na

gliomagênese”, terá como objetivo principalestudar, através de metodologia

proteômica, o papel desempenhado por NPM em linhagens celulares T98G e

U87MG, derivadas de glioblastoma multiforme (grau IV). Para isso, iremos

correlacionar mudanças do proteoma com proliferação, migração celular e

apoptose sob estímulo de EGF e seu efeito sobre o nível dessa proteína, bem como,

o efeito do silenciamento da expressão de NPM por RNA de interferência (RNAi).

Consequentemente, poderemos inferir através de metodologia proteômica, outras

proteínas up ou down-regulated que estarão diretamente ligada a expressão de

NPM. Também, nós estenderemos nossos estudos proteômicos em amostras de

pacientes para mais 5 amostras de cada grau de malignidade, utilizando estratégia

de 2DE/MALDI-TOF/TOF e complementação por shotgun peptide sequencing (SPS)

com o objetivo de estender a identificação de novos biomarcadores e possíveis

alvos para intervenção teraupêutica.

A leucemia linfocítica crônica é caracterizada pela progressiva linfocitose de

pequenas células B maduras, com imunofenótipo CD5+/CD19+ e contínuo acúmulo

de células no sangue, medula óssea e órgãos linfóides (Caligaris-Cappio e Hamblin,

1999). Essa neoplasia representa cerca de 40% de todas as leucemias em adultos

com mais de 65 anos de idade, somente raros casos ocorrem em idade inferior aos

30 anos de idade. Além do status mutacional da região variável da imunoglobulina

de cadeia pesada (IGHV), expressão de ZAP70 e CD38, alterações no número de

cópias de DNA são detectadas em 50-80% dos casos de LLC e constituem

importantes marcadores prognósticos da doença (Doneda, Montillo et al., 2003). As

mais comuns anormalidades cromossômicas observadas na LLC são a trissomia do 12

e deleções em 13q14, 11q22~q23 e 17p13, dentre as quais, a del(13)(q14) está

associada a um prognóstico favorável e as demais perdas cromossômicas conferem

um prognóstico ruim (Dohner, Stilgenbauer et al., 2000). Embora várias regiões

genômicas envolvidas em alterações cromossômicas tenham sido descritas na LLC,

relativamente poucos supressores tumorais e oncogenes têm sido sugeridos

(Tyybakinoja, Vilpo et al., 2007). A combinação de métodos em citogenômica,

(cariotipagem espectral e arrayCGH) permitirá a identificação e caracterização de

pontos de quebra, associados à presença de alterações cromossômicas, detecção

de alterações no número de cópias de DNA e identificação de possíveis genes

envolvidos. A análise em alta resolução identificará deleções submicroscópicas, as

quais serão informativas, especialmente em pacientes com cariótipo normal.

Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Roberto Passetto Falcão

através do sub-projeto 25, intitulado “Ferramentas de citogenômica aplicadas à

investigação da instabilidade cromossômica na leucemia linfocítica crônica

(LLC)”, terá como objetivo avaliar o perfil genômico da LLC, por meio de

ferramentas de citogenética molecular, como a cariotipagem espectral (SKY) e

arrayCGH para melhor definir e caracterizar regiões genômicas crípticas e possíveis

genes envolvidos. Adicionalmente, o projeto visará à criação de um banco de

amostras de pacientes com LLC (células, DNA e RNA) a ser utilizado para o

desenvolvimento de outros projetos de pesquisa. Para isso, as seguintes

metodologias serão empregadas: obtenção de células metafásicas para aplicação

da técnica de SKY; hibridação das células metafásicas para análise espectral

(Applied Spectral Imaging); extração de DNA do sangue de paciente e indivíduos

controle e avaliação de alterações no número de cópias de regiões genômicas

(duplicações ou deleções) pelo método de arrayCGH utilizando a plataforma

Agilent.