Upload
dangkhuong
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
03/03/2017
1
Diagnose de Doenças de PlantasFitopatologia Aplicada
Daniel Diego Costa Carvalho
Mestre em Fitopatologia (UFLA)
Doutor em Fitopatologia (UnB)
F2v004
Cada método é utilizado para diagnosticar?
Diagnose tradicional de doenças de plantas?
Diagnose baseada em sorologia e testes bioquímicos?
Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?
Diagnose baseada em técnicas moleculares?
1. Diagnose tradicional de doenças de plantas
1.1. Diagnose de doenças conhecidas (já descritas)
SINTOMA x SINAL
SINTOMAS: manifestação das reações da planta a um agentenocivo
SINAIS: Estruturas do patógeno, ou o próprio patógeno, presentesnas plantas doentes
Agrios, 2005.
Lobo Júnior et al., 2009.
Sclerotinia sclerotiorum Heterodera glycines
Agrios, 2005.
Citrus tristeza virus
Carvalho, 2015.Agrios, 2005.
Ralstonia solanacearum
Diagnose tradicional de doenças de plantas
Como as doenças de plantas são diagnosticadas?
SINTOMAS SINAIS
Carvalho, 2015.
03/03/2017
2
Descrição da sintomatologia de doenças:
Chaves de identificação publicadas em livros
Comparação entre as ilustrações e as plantas doentes
São suficientes para o diagnóstico de uma doença
Ex: antracnose em Jiló (Colletotrichum acutatum)
Carvalho, 2015.
Procedimentos para a diagnose de doenças conhecidas
Procedimento para a análise de laboratório
Informações de campo +
Teste laboratoriais para identificação do patógeno
Literatura
Doença conhecida
Doença desconhecida
1.2. Diagnose de doenças desconhecidas:
Nenhuma evidência de doenças conhecidas nomaterial analisado, o que fazer?
Postulados de Kock: Teste de patogenicidade
POSTULADOS DE KOCH
1. ASSOCIAÇÃO CONSTANTEO microrganismo deve estar associado à doença em todas as plantas examinadas.
2. ISOLAMENTO E CULTIVOO microrganismo deve ser isolado da planta doente, cultivado em cultura pura e suas características descritas.
3. INOCULAÇÃO (Teste de patogenicidade)O microrganismo em cultura pura deve ser inoculado sobre plantas sadias (mesma espécies ou variedade) e produzir a mesma doença.
4. REISOLAMENTOO microrganismo deve ser novamente isolado em cultura pura e exibir as mesmas características.
Regras para análise de sementes, 2009.
1.3. Diagnose de doenças em sementes contaminadas
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Aspergillus spp. e Cladosporium spp.
03/03/2017
3
blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro – após 7 diasa 20ºC.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Aspergillus sp. Cladosporium sp.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Figura 1. Cladosporium herbarum provenientes de sementes de feijão cv. ‘Pérola’. A.Hilo da semente de feijão comum colonizado por C. herbarum. B. Dentículo (cicatriz)nos conídios (seta).
Guimarães & Carvalho, 2014.
Guimarães & Carvalho, 2014.
Aspergillus sp.
Cladosporium sp.
- Lâminas microscópicas semi-permanentes
- para confirmação de cada gênero fúngico
Guimarães & Carvalho, 2014.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
03/03/2017
4
1.4. Diagnose de doenças que requer o isolamento dopatógeno
Schwartz et al., 2005.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Foto: D.D.C.Carvalho (2009). Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
03/03/2017
5
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Carvalho et al., (2008).
Vasconcelos et al., (2014).
Vasconcelos et al., (2014).
1.5. Exemplos de Doenças de fácil Diagnose
Alternaria porri em cebola
Foto: E.Alves (2007).Carvalho, 2015.
Bolor (Penicillium sp)
Foto: E.Alves (2007).
03/03/2017
6
Acidovorax
Foto: D.Carvalho (2017).
1.6. Extração de nematóides para diagnóstico
Nematóide das galhas em FeijoeiroMeloidogyne sp.
Schwartz et al, 2005.
Agrios, 2005.
Pratylenchus sp.Tomate
Agrios, 2005.
Bean golden mosaic virus
Schwartz et al, 2005.
2. Diagnose baseada em sorologia
2.1. Enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA)
03/03/2017
7
3. Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica
3.1. Microscopia eletrônica de transmissão para auxílio na diagnose de vírus
Tobacco mosaic virusAlfalfa mosaic virus
Cucumber mosaic virus
Agrios, 2005.
Citrus tristeza virus
Cell inclusion bodies observed with an electron microscope.
Indicative of the presence of one or more viruses and, often, are diagnostic of the genus of the virus.
Typical pinwheel-like inclusion bodies diagnostic of potyviruses
Agrios, 2005.Agrios, 2005.
Nanismo do milho: Spiroplasma kunkelii
3.2. Microscopia eletrônica de transmissão e varredura para auxílio na diagnose de micoplasmas.
03/03/2017
8
4. Diagnose baseada em técnicas moleculares
4.1. Hibridização molecular
Imobilização do ácido nucléico em um suporte sólido e formação de híbridos
2
Ácido Nucléico Imobilizado
Ácido Nucléico Imobilizado
Sonda
Sonda
Sondas Radioativas ** ** * * *
nucleotídeo radioativo (P-32)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular
Membrana
Membrana
Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA
EY YYE EE YEY
Revelar
NBT-BICPColorimetria
ECLQuimioluminescência
4.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Desenvolvido por Kary Mullis (Mullis & Faloona, 1987)
Amplifica fragmentos de DNA in vitro milhares de vezes
Reação:
DNA genômico
Tampão
Primers (~20 bases) “forward” e “reverse”
dNTPs (nucleotídeos A, T, C, G)
Taq (polimerase de DNA)
MgCl2 (Cofator da Taq)
H2O ultra pura
http://www.bio-rad.com/en-us/product/mj-mini-thermal-cycler
http://biomol.com.br/produto/amplitherm-termociclador-sem-gradiente-96-microtubos
03/03/2017
9
http://pt.depositphotos.com/45206661/stock-photo-loading-samples-into-gel-for.htmlhttp://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php
VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
CF4 forward 5’-CACAGCCACCTACATGC 3’
CF5 reverse 5’- ATCGGGAGTCCGAG 3’
Detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens em sementes de feijão ( Phaseolus vulgaris)
(PCR)
Regras para análise de sementes, 2009.Análise eletroforética em gel de agarose (1%) dos produtos amplificados por PCR para confirmação da identidade dos isolados de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
Regras para análise de sementes, 2009.
03/03/2017
10
Aplicações da PCR:
Detecção
Identificação
Quantificação (PCR real time)
Fitopatógenos
Cada método é utilizado para diagnosticar?
Diagnose tradicional de doenças de plantas?Doenças conhecidas e doenças não conhecidasFungos, Bactérias, Micoplasmas, vírus, nematóides
Diagnose baseada em sorologia e testes bioquímicos?ELISA (vírus), testes bioquímicos (bactérias)Fungos, Bactérias, vírus
Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?MEV e METMicoplasmas (Spiroplasmas), vírus...
Diagnose baseada em técnicas moleculares?Fungos, Bactérias, vírus...
Bibliografia citada e recomendada:
AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 5 ed. San Diego, Academic Press,2005, 948p.
CARVALHO, D.D.C.; ALVES, E.; BATISTA, T.R.S.; CAMARGOS, R.B.;LOPES, E.A.G.L. Comparison of methodologies for conidia production byAlternaria alternata from citrus. Brazilian Journal of Microbiology, v.39,p.792-798, 2008.
CARVALHO, D.D.C. Herbário de Doenças de Plantas – FitopatologiaAplicada. Ipameri: Universidade Estadual de Goiás, 2017, 32 p.
GUIMARÃES, G.R.; CARVALHO, D.D.C. Incidência e caracterizaçãomorfológica de Cladosporium herbarum em feijão comum cv. ‘Pérola’.Revista Brasileira de Biociências, v.12, n.3, p.137-140, 2014.
LOBO JUNIOR, M.; GERALDINE, A.M.; CARVALHO, D.D.C.; COBUCCI,T. Uso de cultivares de feijão comum com arquitetura ereta e cic loprecoce para escape do mofo branco ( Sclerotinia sclerotiorum).Embrapa Arroz e Feijão, Comunicado técnico, 182, 2009, 4p.
REGRAS PARA ANÁLISE DE SEMENTES. Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária.Mapa/ACS, Brasília, 2009, 399p.
SCHWARTZ, H.F.; STEADMAN, J.R.; HALL, R.; FOSTER, R.L.Compendium of bean diseases , 2nd ed. APS Press, St. Paul. 2005.
VASCONCELOS, C.V.; SILVA, D.C.; CARVALHO, D.D.C. Ocorrência deAlternaria alternata (Fr.:Fr) Kessil. em tubérculos de batata, no Brasil.Pesquisa Agropecuária Tropical , v.44, n.2, p.219-222, 2014.
Leitura Obrigatória:
REZENDE, J.A.M.; MASSOLA JUNIOR, N.S.; BEDENDO, I.P.;KRUGNER, T.L. Conceito de doença, sintomatologia e diagnose. In:AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual deFitopatologia: Princípios e conceitos . 4ed, Piracicaba, AgronômicaCeres, v.1, 2011, p.37-60.
Este material é gratuito para download
Acesse: www.labfito.webnode.com