Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
FRANÇOISE HÉLÈNE VAN DE SANDE LEITE
DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE BIOFILME PARA ESTUDOS DE DESMINERALIZAÇÃO DO ESMALTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Dentística).
Orientador: .Prof. Dr. Maximiliano Sérgio Cenci Co-Orientador: Prof. Dr. Rafael Guerra Lund
Pelotas, 2009
2
Banca Examinadora: Prof. Dr. Maximiliano Sérgio Cenci Profª. Drª. Marisa Maltz Turkienicz Prof. Dr. Rafael Ratto de Moraes Profª. Drª. Elenara Ferreira de Oliveira (suplente)
3
Dedicatória
A minha mãe
Ao meu irmão
Ao meu padrasto (in memoriam)
Minhas molas propulsoras,
Inspiração constante na minha existência,
Dedico este trabalho,
O meu esforço,
O meu melhor,
O meu amor
.
4
Agradecimentos
Ao meu Orientador Prof. Dr. Maximiliano S Cenci, por sua natureza calma e
de efeito calmante, por seu empenho e apoio constantes, por sua naturalidade em
transmitir, instigar e produzir conhecimento. Agradeço por ter tido no orientador um
amigo, de espírito irreverente, questionador e gentil. E no amigo, um orientador, que
literalmente atravessa um oceano se assim preciso for! É Max, não são 100
palavras, mas SEM palavras para agradecer!!! Obrigada!
À colega de mestrado Marina S Azevedo. Minha companheira na incubação
dos �babyfilmes�! Com toda certeza eles tiveram duas mamães, uma biológica e uma
adotiva! Sua contribuição a este trabalho foi inesgotável, inestimável, indispensável!
Acima de tudo, agradeço a convivência com você, o seu bom humor, o seu
temperamento, a sua constante disposição e a sua amizade. Muito obrigada!
À Profª Drª Elenara F de Oliveira, por seu valioso incentivo e orientação em
meus primeiros passos de volta à vida acadêmica. Aquele período foi essencial à
minha formação. Obrigada por todos os ensinamentos, discussões, oportunidades, e
por despertar em mim um �carinho� especial pela Cariologia. As clínicas de
extensão, o estágio e as reuniões em torno de um mate, são sempre lembrados com
imenso carinho. Obrigada pelo apoio, pela confiança e pela amizade!
Ao Prof. Dr. Flávio F Demarco, Coordenador do Programa de Pós-Graduação
em Odontologia, por extrair o melhor das pessoas, por seu empenho, por sua
sagacidade e por sua contribuição marcante a todos os alunos da pós-graduação.
Flávio, agradeço sobretudo o seu exemplo, um verdadeiro modelo de liderança
construtiva.
5
À Professora Drª Tatiana Pereira-Cenci, por todas as contribuições diretas e
indiretas ao meu trabalho, e à minha formação durante o mestrado. Pelo exemplo de
pessoa, pesquisadora e professora � sem dúvida a melhor primeira-dama que uma
orientada poderia querer.
Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Rafael G Lund, por sua dedicação ao
Laboratório de Microbiologia, por sua disposição a me ajudar, por todos os
incentivos e por suas palavras amigas.
Aos Professores Flávio e Rogério, pelas colaborações realizadas na
qualificação deste trabalho.
À secretária do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (PPGO),
Josiane Silva, por sua competência, por sua solicitude, por seu carinho e atenção. O
PPGO não seria o mesmo sem você!
Aos técnicos dos laboratórios, Tatiana, D. Leda, Graça, Sr. Airton, Sr
Gilberto, Marcelo, que me auxiliaram tantas vezes, nas mais diversas tarefas. A
presença e o trabalho de vocês foram fundamentais. Muito obrigada!
Aos queridos Professores Sousa e Neno, com os quais eu tive a honra de
aprender e o prazer de trabalhar. Obrigada por TUDO!
A todos os alunos de graduação que me ajudaram na execução deste
trabalho, especialmente o Vinícius. Agradeço de todo o coração!
Aos meus colegas e amigos de pós-graduação Aline, Bianca, Caroline E, Carolina P, Eliana, Fabiana, Fabrício, Francine, Genara, Giana, Glória, Gregori, Laura, Luciano, Marcos, Marcus, Marília B, Marília G, Raquel, Renata B, Renata F, Rodrigo, Sandrina, Sílvia, Sônia, Thiago, Tino (César). Obrigada por todas as
experiências compartilhadas, foi uma honra conviver com vocês.
Aos professores por sua contribuição com minha formação profissional e
pessoal, Profª. Adriana E, Profª. Adriana S, Prof. Alexandre, Profª. Ana, Profª.
6
Dione, Profª. Elaine, Prof. Evandro, Prof. Josué, Profª. Márcia, Prof. Marcos P,
Prof. Marcos T, Prof. Mário, Profª. Noéli, Prof. Rudimar, Profª. Sandra, ... Dentre
tantos outros.
Ao Grupo de Estudos de Cariologia, Microbiologia e o Estudo do Flúor,
por todas as discussões, foi um belíssimo aprendizado.
Aos alunos de graduação que tanto me ensinaram sobre ensinar.
Aos meus amigos pela belíssima amizade, o carinho de vocês foi sentido
mesmo quando não pude estar presente.
Aos meus familiares, pelo apoio e incentivo, mesmo à distância.
Ao Centro de Desenvolvimento e Controle de Biomateriais (CDC-Bio) na
pessoa do Prof. Dr. Evandro Piva.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia na pessoa do Prof. Dr.
Flávio F Demarco.
À Faculdade de Odontologia na pessoa da Profª. Drª. Márcia B Pinto.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
(CAPES) pelo financiamento das minhas atividades de pós-graduação.
À Universidade Federal de Pelotas por meio do seu Magnífico Reitor, Prof.
Dr. César Borges.
7
Notas preliminares
A presente dissertação foi redigida segundo o Manual de Normas para Dissertações,
Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de 2006,
adotando o Nível de Descrição 4 � estruturas em Artigos, que consta no Apêndice D
do referido manual. Disponível no endereço eletrônico:
(http://www.ufpel.tche.br/prg/sisbi/documentos/Manual_normas_UFPel_2006.pdf).
8
Resumo LEITE, Françoise Hélène van de Sande. Desenvolvimento de um modelo de biofilme para estudos de desmineralização do esmalte. 2009. 90f. Dissertação (Mestrado) � Programa de Pós Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a desmineralização do esmalte em resposta a condições cariogênicas induzidas por diversos regimes de exposição a sacarose em um modelo de biofilme de microcosmos, e verificar se o modelo testado apresentaria efeito dose-resposta ao tratamento com clorexidina. Os biofilmes de microcosmo foram originados de saliva e crescidos sobre discos de esmalte bovino em placas de micropoços. Foi utilizado um meio definido enriquecido com mucina (DMM), suplementado com concentrações de sacarose que variaram de 0,075% a 1%, sob regimes de exposição contínua � modelo estático, ou intermitente � modelo semi-dinâmico (40min a 6h de exposição). As placas foram incubadas em condição de anaerobiose por até 10 dias sob temperatura controlada de 37°C. As trocas dos meios foram realizadas diariamente. A acidogenicidade dos biofilmes foi obtida através de leituras de pH dos sobrenadantes no meio; as alterações/ perda de dureza na superfície do esmalte (%PDS) foram calculadas através de leituras de dureza superfícial do esmalte antes e após os tratamentos. Os resultados indicaram que a acidogenicidade decorrente dos diferentes regimes de exposição a sacarose afetaram a dureza superficial do esmalte. A dureza do esmalte não foi alterada sob exposição a baixa concentração de sacarose (estático-0,075%). O %PDS do esmalte sob exposições de 0,15% de sacarose no meio foram tempo-dependentes; a perda mineral foi significativa no regime estático, enquanto que no regime semi-dinâmico (6h) não houve alteração de dureza significativa. Em concentrações de 0,5% de sacarose este efeito tempo-dependente para exposição também foi observado na alteração de dureza do esmalte. Exposições de 40min a 3h de sacarose no meio (até 10 dias) não induziram um %PDS significativo em esmalte. Contudo, com o aumento do tempo de exposição para 6h uma perda mineral significativa foi observada em esmalte. Ainda, com 0,5% em regime estático, a perda mineral foi severa, comprometendo a integridade da superfície do esmalte, independentemente dos períodos de exposição avaliados (4, 7 e 10 dias). A erosão da superfície nesta condição excluiu a possibilidade de avaliar o %PDS, sugerindo que a exposição a um pH baixo (4.3), mantido de forma constante, promoveria lesões de erosão no lugar de lesões subsuperficiais de cárie. As exposições de 0,5% e 1% de sacarose no regime semi-dinâmico (6h) induziram um %PDS significativo em esmalte. A avaliação de dose-resposta do modelo foi realizada em um regime - semi-dinâmico 1% de sacarose. Após 24h de crescimento dos biofilmes, foi realizado o tratamento com solução de clorexidina em concentrações que variaram de 0,012 a 0,12% ou com um controle (solução salina estéril) durante 1 min. O
9
tratamento foi aplicado antes do desafio com sacarose durante 3 dias. Verificou-se que a acidogenicidade dos biofilmes e as alterações de dureza do esmalte foram dose-dependentes aos tratamentos com clorexidina. Como conclusão, dentro das limitações de estudos laboratoriais, o modelo de biofilme foi capaz de responder aos diferentes níveis de desafios cariogênicos e demonstrar um efeito de dose-resposta a clorexidina, sendo apropriado para utilização como um modelo pré-clínico para testar o potencial anticariogênico de tratamentos e para estudos desmineralização. Palavras-chave: Placa Dental. Biofilmes. Esmalte Dentário. Desmineralização. In Vitro.
10
Abstract
LEITE, Françoise Hélène van de Sande. Development of an in vitro biofilm model for enamel demineralization studies. 2009. 90f. Dissertação (Mestrado) � Programa de Pós Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The aims of this study were to evaluate enamel demineralization response to cariogenic conditions induced by several sucrose regimens in microcosm biofilms, and to test the model with a dose-response evaluation to chlorhexidine. Microcosm biofilms derived from plaque enriched saliva were grown on bovine enamel discs in multi-well plates fed with defined medium enriched with mucin (DMM), which was supplemented with sucrose concentrations that ranged from 0.075% to 1%. Sucrose exposure occurred all day in batch culture or in a semi-continuous fed (40 min to 6 h). Plates were incubated anaerobically for up to 10 days at 37°C. DMM was replaced daily. Data from acidogenicity of biofilms were collected as pH readings from medium supernatants and the percentual surface hardness change (%SHC) was obtained by enamel surface hardness readings before and after treatments. The results from sucrose regimens indicated that acidogenicity of biofilms affected enamel surface hardness. Under low sucrose concentration exposures (batch-0.075%) enamel hardness was not affected. Exposures to 0.15% sucrose were time-dependent, as enamel surface experienced mineral loss in batch but not in semi-continuous (6 h) fed. With 0.5% sucrose concentration a time-dependent exposure effect was also observed in enamel hardness change. Exposures from 40 min to 3 h sucrose-fed (up to 10 days) did not caused significant %SHC in enamel, but increasing the exposure time to 6 h induced significant mineral loss. Under 0.5%-batch severe damage to enamel surface was noted, irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded surfaces excluded the possibility of SH evaluation, and suggested that the constant low pH (4.3) would promote erosion lesions instead of subsurface carious lesions. Exposures to 0.5% and 1% in 6 h sucrose-fed induced significant %SHC in enamel. The dose-response evaluation was performed in one regimen - semi-continuous 1% sucrose. After 24h of grown, biofilms were treated with chlorhexidine in concentrations that ranged from 0.012 to 0.12% or a control (sterile saline solution) during 1 min. Treatment was applied before sucrose-fed for 3 days. Biofilm acidogenicity and the changes in enamel hardness were dose-responsive to chlorhexidine treatments. In conclusion, within the limitations of laboratorial studies the biofilm model assessed promoted dose-response effect to chlorhexidine and to different sucrose feeding protocols, being suitable as a pre-clinical model for testing the anticariogenic potential of treatments and for demineralization studies.
Keywords: Dental Plaque. Biofilms. Dental Enamel. Demineralization. In Vitro.
11
Lista de Figuras
Projeto
Figura 1 � Técnica de confecção dos discos de esmalte
....................... 30
Figura 2 � Ensaio in vitro de biofilme pela técnica de microcosmos ...... 32
Figura 3 � Técnica de confecção de cavidades nos discos de esmalte 37
Relatório de campo
Figura 1 � Representação esquemática dos estudos Piloto 1, 2 e
Experimento I ......................................................................................... 52
Figura 2 � Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de
micro-placas ........................................................................................... 54
Artigo
Figure 1 � Experiment II � pH ................................................................ 67
Figure 2 � Experiment III � pH �����������������.. 68
Figure 3 � Experiment I � %SHC ........................................................... 69
Figure 4 � Experiment II � %SHC .......................................................... 70
Figure 5 � Experiment III - %SHC .......................................................... 71
12
Lista de Tabelas Artigo
Table 1 Experiment I. DMM supernatants pH readings are presented
for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days
....................... 66
Table 2 Descriptive statistics for microbial recovery from growth under
different sucrose regimens
����.................������...........�.. 72
Table 3 Descriptive statistics for microbial recovery from growth after
chlorhexidine treatments
������................................................... 73
13
Lista de abreviaturas e siglas
% Percentual °C Graus Celsius [ ] Concentração BHI Brain Heart Infusion
CDC-Bio Centro de desenvolvimento e controle de biomateriais
CHX Chlorhexidine CLX Clorexidina
DMM Defined medium with mucin � meio definido enriquecido com mucina
Eh Potencial redox et al. e outros FO Faculdade de Odontologia G Grama H Hora µg/mL Microgramas por mililitro µm Micrometro mg/mL Miligramas por mililitro Min Minuto mL Mililitros Mm Milímetro mol L-1 Mol por litro ou molar DS Dureza de superfície N Número de espécimes PDS Perda de dureza de superfície pH Potencial de hidrogênio iônico RPM Rotação por minuto
RTF Reduced transport fluid - meio de transporte reduzido
S Segundo SH Surface Hardness SHC Surface Hardness Change UFPel Universidade Federal de Pelotas UFC Unidades formadoras de colônias X Vezes
14
Sumário
Resumo .................................................................................................. 8
Abstract ..................................................................................................
10
1 Introdução Geral
................................................................................. 16
2 Projeto ................................................................................................. 20
3 Relatório de campo ............................................................................
3.1 Aspectos éticos ............................................................................... 3.2 Condições gerais ............................................................................ 3.3 Experimentos
................................................................................... 3.3.1 Piloto 1 .......................................................................................... 3.3.2 Piloto 2 .......................................................................................... 3.3.3 Experimento 1
............................................................................... 3.5 Rotinas laboratoriais .......................................................................
50 50 50
50 50 51 51
52 52 53
15
3.5.1 Coleta e processamento de saliva
.............................................. 3.5.2 Protocolo de crescimento e obtenção dos biofilmes ...............
3.6 Alterações no projeto original ���������������. 55
3.6.1 Dificuldades encontradas ����������������.. 55
3.6.2 Revisão da literatura .................................................................... 55
4 Artigo ................................................................................................... 56
5 Conclusões
.........................................................................................
81
Referências ............................................................................................
82
Apêndices .............................................................................................. 86
Anexo ..................................................................................................... 89
16
1 INTRODUÇÃO GERAL
Componentes dotados de propriedades antibacterianas/ anticariogênicas
têm sido amplamente desenvolvidos e investigados acerca de sua efetividade em
exercer uma proteção aos tecidos dentais (CENCI et al., 2008; IMAZATO et al.,
2003; SARRETT, 2005; LI et al., 2009; KIELBASSA et al., 2003).
Para avaliação pré-clinica de componentes, soluções ou materiais
biologicamente ativos é necessário que sejam utilizados modelos de estudo com
habilidade para caracterizar o seu potencial antimicrobiano/ anticariogênico,
avaliando a capacidade de inibir a desmineralização, de ativar a remineralização, e a
sua ação antimicrobiana. A adequação de um modelo de estudo é baseada na sua
capacidade de reproduzir as características do sistema que pretende investigar
(WIMPENNY, 1997). Logo, deve-se tentar reproduzir os desafios cariogênicos ao
qual o tecido dentário será exposto em condições clínicas, mimetizando as
interações complexas destes com os biofilmes dentais (WHITE, 1995).
Os biofilmes dentais podem ser definidos como comunidades microbianas
intimamente associadas e protegidas por uma matriz polimérica extracelular de
origem salivar e bacteriana (BOWDEN; LI, 1997; MARSH, 2005). A seleção e
sucessão microbianas (teoria ecológica da placa) ocorrem conforme a
disponibilidade de nutrientes e substrato, e a tolerância ao meio � o pH e a
concentração de oxigênio (BRADSHAW; MCKEE; MARSH, 1989; BOWDEN; LI,
1997; RUBY; BARBEAU, 2002). O biofilme se desenvolve seletivamente como uma
unidade estruturada para o aproveitamento energético, onde nutrientes, enzimas,
oxigênio e produtos metabólicos permeiam os espaços entre os agregados
microbianos (DAVEY; O'TOOLE G, 2000; DONLAN; COSTERTON, 2002).
A partir do exposto, a seleção de um modelo de estudo apropriado deverá
estar inserida neste contexto.
Ensaios in vitro simplificados, como desafios físico-químicos, culturas
planctônicas e culturas em monocamadas, podem ser adequados para avaliações
preliminares (SISSONS, 1997). Contudo, frente à complexidade mencionada,
17
colocam-se aquém, e podem não predizer os resultados encontrados em avaliações
subseqüentes (TEN CATE, 2006). Isto ocorre, em parte, porque a organização
microbiana em biofilmes favorece o desenvolvimento e a manutenção dos
ecossistemas (DAVEY; O'TOOLE G, 2000). Possivelmente, a penetração/ação de
agentes antimicrobianos é dificultada pela natureza estrutural da matriz
(ANDERSON; O'TOOLE, 2008). Além disso, sua efetividade é diminuída em
situações de inatividade ou baixa atividade metabólicas, comumente observadas em
biofilmes (ANWAR; STRAP; COSTERTON, 1992; ANDERSON; O'TOOLE, 2008).
A utilização de modelos de estudo intra-orais (intra-oral models) (SISSONS,
1997) possibilita a extração de informações relevantes (MARSH, 1995; WIMPENNY,
1997). Não obstante, estes modelos exibem características que os limitam, tais
como o número e a adesão dos participantes, questões relacionadas a variáveis não
controláveis e dificuldade para reprodutibilidade (FEJERSKOV; NYVAD; LARSEN,
1994; TEN CATE, 1994). A aplicação destes modelos é adequada para confirmação
de evidências laboratoriais, que sobretudo, justifiquem o uso em voluntários.
Em virtude das dificuldades inerentes aos modelos de estudo citados, surgiu
a necessidade de desenvolver modelos de biofilme em laboratório que pudessem
suprir os questionamentos e concomitantemente apresentarem-se inseridos em um
ambiente controlado (SISSONS, 1997; MCBAIN, 2009). Os primeiros modelos in
vitro que pretendiam reproduzir as condições da microbiota oral foram delineados de
forma simplificada, onde dentes extraídos eram submetidos a um meio
bacteriológico ou a uma mistura de saliva e pão (TANG et al., 2003). As tentativas
para desenvolver estes modelos de estudo falharam até que alguns princípios
fossem respeitados, como o controle da temperatura e pH, a condição atmosférica, o
meio nutritivo e o controle da contaminação (TANG et al., 2003).
Atualmente vários experimentos têm sido realizados respeitando estas
condições, explorando distintas metodologias e tecnologias (SISSONS, 1997;
MCBAIN, 2009). Os biofilmes podem ser formados em sistemas de cultura onde as
exposições ao meio nutritivo são disponibilizadas de forma contínua ou intermitente,
caracterizando modelos estáticos (batch), semi-dinâmicos (semi-continuous ou fed-
batch) ou dinâmicos (continuous) (MCBAIN, 2009).
Os sistemas dinâmicos para o desenvolvimento de biofilmes em superfícies,
como discos de esmalte e de hidroxiapatita, requerem a utilização de equipamentos
sofisticados. Muitos destes de difícil construção, manuseio e manutenção
18
(GUGGENHEIM et al., 2004; MCBAIN, 2009). Para investigações que exijam o
crescimento dos biofilmes durante várias semanas, onde o objeto de estudo é o
próprio biofilme (como sua dinâmica de formação e maturação) estes sistemas
parecem os mais adequados (TANG et al., 2003; TEN CATE, 2006). No entanto, o
desenvolvimento de um modelo para avaliação de propriedades
antimocrobianas/anticariogênicas deve possibilitar a condução de vários estudos de
curta duração. Desta forma, estes sistemas tornam-se inadequados para o propósito
(MCBAIN, 2009; GUGGENHEIM et al., 2004).
Os sistemas estático e semi-dinâmico apresentam metodologias que
viabilizam a construção deste modelo. Os biofilmes podem ser formados em placas
de micro-poços (GUGGENHEIM et al., 2004; FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007)
permitindo seu crescimento de forma individualizada, sobre o substrato que for
conveniente. Várias condições podem testadas nas placas concomitantemente, e
diversos experimentos realizados em um curto período de tempo.
Outra diferença metodológica se refere à origem e a diversidade das
espécies microbiológicas envolvidas. Os biofilmes podem ser formados a partir de
espécies selecionadas ou de microcosmo (MCBAIN, 2009). Os modelos com
espécies previamente estabelecidas, podem ser culturas puras (uma única espécie
de microorganismo) (TOTIAM et al., 2007), ou um consórcio definido (duas ou mais
espécies) (SHU et al., 2000). Enquanto microcosmos são biofilmes com
comunidades microbianas complexas originadas do ecossistema natural, neste
contexto a saliva ou a placa/biofilme dental (CENCI et al., 2009; WIMPENNY, 1997).
A seleção de uma ou mais espécies normalmente pressupõem a
investigação de fatores individuais ou coletivos das espécies envolvidas, onde a
manipulação de uma única variável pode ser monitorada. (WIMPENNY, 1997).
Todavia, quando se deseja maior aproximação ao comportamento natural, com
manutenção da heterogeneidade microbiana durante a formação dos biofilmes, os
experimentos originados de microcosmos são mais fiéis, mantendo a complexidade
do inóculo original (MCBAIN, 2009; FILOCHE et al., 2008).
Consequentemente, a resposta às variáveis impostas, como diferentes
concentrações de princípios antimicrobianos, por exemplo, pode ser mais bem
estabelecida. Isto pode ser demonstrado por avaliações decorrentes de
experimentos realizados in situ, os quais apontaram a importância na relação entre o
potencial cariogênico do biofilme e a produção de polissacarídeos, em detrimento à
19
importância quantitativa de estreptococos mutans no biofilme (TENUTA et al., 2006).
O potencial cariogênico de outras bactérias presentes no meio bucal pode ser
subestimado quando são selecionadas algumas espécies para a formação de
biofilmes (KLEINBERG, 2002).
O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de biofilme de
microcosmo que possibilitasse a avaliação de propriedades anticariogênicas de
soluções antissépticas, com ênfase na capacidade de detectar diferenças em perda
mineral proporcionada por diferentes tratamentos. Cabe salientar que até o presente
momento nenhum modelo de biofilme de microcosmos em placas de cultura foi
validado para estudos de des e re-mineralização. Para construção do modelo,
modificações foram realizadas em um modelo previamente desenvolvido (FILOCHE;
SOMA; SISSONS, 2007), a fim de adequá-lo para estudos de perda mineral.
Regimes estáticos e semi-dinâmicos para suplementação de sacarose, em diversas
concentrações, foram investigados com intuito de observar a cariogenicidade dos
biofilmes e o efeito decorrente em esmalte bovino. Após, uma concentração e um
regime de suplementação de sacarose foi estabelecido para experimentação do
modelo em um estudo de dose-resposta à clorexidina.
20
2 PROJETO
1 INTRODUÇÃO
A cárie persiste como um problema de saúde pública na maioria dos países
industrializados (PETERSEN et al., 2005). Sua distribuição e severidade se
apresentam de forma polarizada (PETERSEN et al., 2005), relacionada às
desigualdades econômicas e sociais existentes (NERI; SOARES, 2002). Isto pode
ser evidenciado no Brasil, onde os indivíduos menos atingidos pelos programas de
saúde e atenção odontológica (BARROS; BERTOLDI, 2002; NARVAI et al., 2006),
apresentam a maior concentração de lesões não tratadas (NARVAI et al., 2006).
Neste contexto, todos os métodos preventivos e terapêuticos são importantes para
tentar atingir a população com maior equidade (CURY et al., 2004).
Uma parte do tratamento da cárie frequentemente inclui a utilização de
materiais odontológicos. Estes devem auxiliar no controle local da doença, agindo
como coadjuvantes à adequação do meio bucal. Os materiais disponíveis
atualmente para esta finalidade (WIEGAND; BUCHALLA; ATTIN, 2007), como os
cimentos de ionômero de vidro convencionais, apresentam reduzidas propriedades
mecânicas ao estresse oclusal. Outros, como as resinas modificadas e os cimentos
ionoméricos modificados, apresentam custo elevado e potencial anticariogênico
reduzido. Além disso, o mecanismo de ação destes materiais é baseado na
liberação de fluoretos (WIEGAND; BUCHALLA; ATTIN, 2007), havendo uma
carência de materiais com mecanismos adicionais de potencial inibidor de cárie ou
do acúmulo de biofilme (SARRETT, 2005).
Materiais dotados de propriedades anticariogênicas e antimicrobianas
poderiam ser fortes auxiliares no tratamento e prevenção da cárie dentária, bem
como das suas lesões. Frequentemente, as falhas restauradoras são atribuídas ao
diagnóstico de lesões cárie adjacentes às restaurações (CARs) (FONTANA;
GONZALEZ-CABEZAS, 2000; BRUNTHALER et al., 2003; MJOR, 2005),
comumente referidas como cárie secundária. Estas lesões são etiológica e
21
histologicamente idênticas às lesões primárias (THOMAS et al., 2007), e se discute
se sua formação estaria relacionada à presença (e a dimensão) de fendas � gaps �
na interface dente/ material restaurador (MJOR; MOORHEAD; DAHL, 2000; TOTIAM
et al., 2007). Neste contexto, o desenvolvimento de materiais restauradores de baixo
custo, e propriedades anticariogênicas expressivas, poderia contribuir para terapias
preventivas e curativas.
Para viabilizar o desenvolvimento e o emprego de novos materiais, é
necessário que sejam utilizados modelos de estudo com habilidade para caracterizar
o seu potencial anticariogênico, avaliando a capacidade de inibir a desmineralização,
de ativar a remineralização, e a sua ação antimicrobiana. A adequação de um
modelo de estudo para esta finalidade deve levar em consideração que as
características do meio oral interferem no comportamento dos materiais e terapias
odontológicas (FUCIO et al., 2008). Soma-se a isso a necessidade de reproduzir os
desafios cariogênicos ao qual o conjunto tecido dentário/ material será exposto,
mimetizando as interações complexas destes com os biofilmes dentais, as quais
ocorrem na clinicamente cavidade bucal (WHITE, 1995).
Os biofilmes dentais podem ser definidos como comunidades microbianas
intimamente associadas entre si e protegidas por uma matriz polimérica extracelular
de origem salivar e bacteriana (BOWDEN; LI, 1997; OVERMAN, 2000; MARSH,
2005; THOMAS; NAKAISHI, 2006). A seleção e sucessão microbianas (teoria
ecológica da placa) ocorrem conforme a disponibilidade de nutrientes e substrato, e
a tolerância ao meio � o pH e a concentração de oxigênio (BRADSHAW; MCKEE;
MARSH, 1989; MARSH; BRADSHAW, 1997; RUBY; BARBEAU, 2002). O biofilme
se desenvolve seletivamente como uma unidade estruturada para o aproveitamento
energético, onde nutrientes, enzimas, oxigênio e produtos metabólicos permeiam os
espaços (poros) entre os agregados microbianos (DAVEY; O'TOOLE G, 2000;
OVERMAN, 2000).
A partir do exposto, a seleção de um modelo de estudo apropriado, o qual
tenha a capacidade de mimetizar os eventos mediados pelo biofilme dental que
ocorrem em condições clínicas, deverá estar inserida neste contexto. Ensaios in vitro
simplificados, como desafios físico-químicos, culturas planctônicas e culturas em
monocamadas, podem ser adequados para avaliações preliminares (SISSONS,
1997). Contudo, frente à complexidade mencionada, colocam-se aquém, e podem
não predizer os resultados que serão encontrados em avaliações subseqüentes
22
(TEN CATE, 2006). Isto ocorre, em parte, porque a organização microbiana em
biofilmes favorece o desenvolvimento e a manutenção dos ecossistemas (DAVEY;
O'TOOLE G, 2000). Possivelmente, a penetração/ação de agentes antimicrobianos é
dificultada pela natureza estrutural da matriz (ANDERSON; O'TOOLE, 2008). Além
disso, sua efetividade é diminuída em situações de inatividade ou baixa atividade
metabólicas, comumente observadas em biofilmes (ANWAR; STRAP; COSTERTON,
1992; ANDERSON; O'TOOLE, 2008).
A utilização de modelos de estudo em animais e in situ possibilitam a
extração de informações relevantes (MARSH, 1995). No entanto, estes modelos
exibem características que os limitam, tais como diferenças inerentes às espécies
(WEINBERG; BRAL, 1999) e alto custo no caso do primeiro, e no segundo,
dificuldades referentes ao número e adesão dos participantes, questões
relacionadas às variáveis não controláveis e dificuldade para reprodutibilidade
(FEJERSKOV; NYVAD; LARSEN, 1994; TEN CATE, 1994; SISSONS, 1997).
Sobretudo, modelos de estudo em animais têm encontrado uma forte restrição
relativa a questões éticas. Assim, estes modelos se aplicariam após a obtenção de
evidências que justifiquem o uso de modelos em animais ou em voluntários.
Em virtude das dificuldades inerentes aos modelos citados, surgiu a
necessidade de desenvolver modelos in vitro que pudessem suprir os
questionamentos e concomitantemente apresentarem-se inseridos em um ambiente
controlado (SISSONS, 1997), o que é essencial para o avanço em pesquisa que
antecede a experimentação clínica (TANG et al., 2003). Atualmente, vários
experimentos têm sido realizados respeitando estas condições, e diferindo em
relação à origem e a diversidade das espécies microbiológicas envolvidas. As
metodologias desenvolvidas obtêm a formação de biofilmes a partir de uma única
espécie de microorganismo (ALTMAN et al., 2006), mais de uma espécie (consórcio)
(SHU et al., 2000) ou de microcosmos (a partir de inóculo de saliva, por exemplo)
(ANDERSON et al., 2002).
Cada modelo tem uma finalidade que o justifica. No entanto, quando se
deseja maior fidelidade ao comportamento natural, onde há interação e sucessão
microbiana durante a formação do biofilme, os modelos de biofilmes originados de
microcosmos (biofilmes complexos) são mais fiéis para reproduzir as relações entre
os ecossistemas in vitro (SISSONS, 1997; WIMPENNY, 1997; PRATTEN; SMITH;
WILSON, 1998; DONLAN; COSTERTON, 2002; TEN CATE, 2006).
23
Consequentemente, a resposta às variáveis impostas, como diferentes
concentrações de princípios antimicrobianos, por exemplo, pode ser mais bem
estabelecida neste tipo de modelo. Isto pode ser demonstrado por avaliações
decorrentes de experimentos realizados in situ, os quais apontaram a importância na
relação entre o potencial cariogênico do biofilme e a produção de polissacarídeos,
em detrimento à importância quantitativa de estreptococos mutans no biofilme
(TENUTA et al., 2006). O potencial cariogênico de outras bactérias presentes no
meio bucal pode ser subestimado quando são selecionadas algumas espécies para
a formação de biofilmes (KLEINBERG, 2002).
Dentre uma gama de aplicações, modelos de biofilme in vitro permitem que
as propriedades dos materiais restauradores possam ser analisadas sob diferentes
condições, as quais alteram a composição do biofilme, e podem modificar os efeitos
do material no local. Pontos importantes podem ser explorados, compreendendo: a
facilidade de estabelecer controles e limitar variáveis, a verificação de efeitos
decorrentes da patogenicidade do biofilme (níveis de desafio cariogênico, por
exemplo), permitir a replicação das amostras, reprodutibilidade, entre outras
vantagens de metodologias in vitro. Notadamente, a facilidade e rapidez com a qual
ensaios pré-clinicos podem ser realizados com esses métodos são relevantes para o
estudo e desenvolvimento de materiais restauradores.
24
2 PROPOSIÇÃO
2.1 OBJETIVO GERAL
Esta dissertação de mestrado tem como objetivo geral desenvolver um
modelo de biofilme in vitro para avaliar propriedades anticariogênicas de materiais
restauradores.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1)Revisar a literatura relevante reportando as metodologias utilizadas para o
desenvolvimento de modelos de biofilmes complexos.
2)Realizar o desenvolvimento de um modelo de biofilme in vitro.para testar
materiais restauradores.
3)Investigar o potencial antimicrobiano/ anticariogênico de um material a
base de mineral trióxido agregado (MTA) desenvolvido para uso como restaurador
direto, utilizando o modelo de biofilme.
2.3 HIPÓTESE
O modelo de biofilme desenvolvido será capaz de reproduzir um desafio
cariogênico, produzindo lesões de subsuperfície em esmalte com padrão de dose-
resposta a sacarose, e terá habilidade para avaliar o potencial anticariogênico de
soluções antisépticas e materiais restauradores.
25
3 METODOLOGIAS UTILIZADAS PARA O DESENVOLVIMENTO DE BIOFILMES
COMPLEXOS - REVISÃO DA LITERATURA
3.1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de biofilmes complexos in vitro possibilita a investigação
das mudanças que ocorrem na sua dinâmica de formação e composição frente a
exposições a diferentes tratamentos em um ambiente controlado. Desta forma, os
eventos locais que caracterizam fatores com potencial cariogênico ou
anticariogênico podem ser analisados e compreendidos de forma mais completa,
muito além da observação isolada de eventos teciduais e bacteriológicos. O
desenvolvimento destes biofilmes pode ser alcançado a partir de metodologias e
tecnologias distintas. Os biofilmes podem ser formados em sistemas de cultura onde
as exposições são impostas de forma contínua ou intermitente, caracterizando
modelos estáticos ou dinâmicos. Outra variação diz respeito ao tempo que os
biofilmes serão crescidos, havendo ou não limitação espacial (volume) deste
crescimento. A possibilidade de mensurar o pH e o Eh (potencial redox), assim como
outras aferições que podem ser obtidas durante o período, varia nos dispositivos
empregados.
A adequação do modelo estará vinculada aos eventos que se deseja
observar. Dessa forma, uma revisão acerca de métodos e tecnologias que podem
ser empregados para obtenção e estudo de biofilmes complexos é relevante. Além
disso, poderá contribuir na orientação do delineamento experimental e para justificar
os recursos destinados para obtenção de equipamentos nesta linha de pesquisa.
3.2 OBJETIVOS
Revisar comparativamente as metodologias e tecnologias empregadas para
o desenvolvimento de biofilmes complexos. Analisar as possibilidades/ vantagens e
limitações/ dificuldades de cada método utilizado.
26
3.3 MATERIAL E MÉTODO 3.3.1 Delineamento
Esta revisão será do tipo narrativa. Terá como objetivo produzir um texto
para a fundamentação da dissertação além de gerar uma publicação em revista
especializada, tendo como público-alvo final pesquisadores, estudantes e
profissionais interessados na temática biofilmes polimicrobianos. Os tipos de estudo
a serem revisados compreenderão outras revisões (sistemáticas ou narrativas) e
artigos primários neste tema, cujo foco seja o desenvolvimento de modelos de
biofilmes complexos. A estratégia de busca dos estudos a serem revisados
envolverá busca nas principais bases de dados (Pubmed, Medline, Biblioteca
Cochrane, ISI web, EMBASE e Scielo). Os dados coletados serão dispostos em
forma de tabelas e figuras, com o objetivo de facilitar o entendimento e possibilitar a
comparação dos métodos de avaliação utilizados na literatura revisada.
27
4 METODOLOGIA PARA O DESENVOLVIMENTO DE BIOFILMES COMPLEXOS
IN VITRO
4.1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
As alterações no equilíbrio do hospedeiro que se refletem no biofilme são
complexas, e encontram relação com a grande diversidade de microorganismos
presentes na cavidade bucal (FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007). As interações
que modulam a patogenicidade do biofilme são recriadas em modelos de biofilmes
complexos, conferindo maior realidade ao modelo proposto do que os obtidos de
uma ou mais espécies selecionadas (SISSONS; WONG; SHU, 1998; TEN CATE,
2006). Além disso, o desenvolvimento de biofilmes originados de microcosmos
permite o estudo dos ecossistemas envolvidos pela possibilidade de observação
frente às condições impostas, sem as limitações e dificuldades inerentes a modelos
de estudo in situ e in vivo. Este modelo disponibiliza um volume de biofilme
adequado para as avaliações e permite acompanhar seu crescimento com acesso
facilitado durante todo o processo. Ainda, o modelo proposto apresenta um
comportamento (pH e taxa de crescimento) similar aos observados em biofilmes
naturais (SISSONS; WONG; CUTRESS, 1995). No entanto, embora modelos de
microcosmos venham sendo usados como rotina para pesquisas na Cariologia, não
foi ainda desenvolvido e validado um modelo in vitro para avaliação do potencial
anticariogênico de materiais restauradores.
Adicionalmente, outros aspectos como a avaliação do efeito dose-resposta
de fármacos e antimicrobianos nesses modelos permanece relativamente
inexplorada.
4.2 OBJETIVOS
Esta fase do estudo tem por objetivo conduzir experimentos para testar o
protocolo de obtenção de um biofilme complexo (microcosmos) desenvolvido em
28
placas de cultura de células e a resposta ao meio de incubação (saliva artificial -
DMM), frente à presença ou ausência de suplementação por sacarose. Serão
verificados: o pH, a formação e composição do biofilme compatível com o
desenvolvimento de lesão de cárie. Além disso, serão observadas alterações em
esmalte, submetido aos meios com e sem desafio cariogênico.
4.3 MATERIAL E MÉTODOS
4.3.1 Aspectos éticos
O projeto será encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (FO-UFPel/ RS). Os voluntários
assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido, a fim de autorizar sua
participação no estudo (Apêndices).
4.3.2 Cálculo da amostra
O cálculo amostral será realizado no programa Sigmastat® (Versão 3.01,
Systat Software Inc.) a partir de dados obtidos em uma avaliação preliminar do
modelo. Os dados serão analisados com ANOVA (análise de variância)
considerando os seguintes parâmetros: poder do estudo de 80%, erro tipo alfa de
5%, valores da diferença entre as médias e os desvios padrão para avaliação de
dureza e análises no biofilme. Os doadores voluntários de saliva para a pesquisa,
serão considerados como blocos estatísticos para análise, enquanto as unidades
experimentais serão representadas pelos biofilmes crescidos individualmente em
cada espécime.
4.3.3 Delineamento experimental
Será realizado um estudo in vitro, completamente aleatorizado, no qual
serão formados biofilmes em placas de micro-poços sobre discos de esmalte bovino,
tendo como inóculo saliva (microcosmos) de 2 voluntários adultos e saudáveis. Os
biofilmes serão crescidos independentemente por até 10 dias sobre 3 discos para
cada inóculo (n=3), sendo que 3 experimentos serão realizados para cada
29
combinação tipo de saliva/ meio, para avaliações em 3 períodos de formação dos
biofilmes. Os fatores em estudo serão os tipos de saliva (em 2 níveis/ indivíduos);
concentração de sacarose no meio DMM (0,15% e 0,5%); e tempo de crescimento
(3, 6 e 10 dias). As análises serão compostas por: aferições diárias de pH para
verificação do potencial cariogênico do biofilme; determinação de desmineralização
por dureza de superfície e longitudinal; composição microbiológica do biofilme
(diluição e plaqueamento).
4.3.4 Obtenção e preparo das amostras de tecido dentário (Figura 1)
Após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa, amostras de esmalte
serão obtidas de incisivos bovinos irrompidos e livres de falhas, obtidos em um
frigorífico local. Os dentes serão raspados, limpos e armazenados em água
destilada (-20ºC). Para obtenção de discos de esmalte de 5mm de diâmetro e
2,5mm de espessura, o terço médio vestibular será seccionado em furadeira
industrial com broca de núcleo de diamante (tipo trefina) em velocidade de 400
RPM. Para finalização será realizada planificação da superfície com discos de lixa
(granulometria 600, 1200, e 1500) e polimento com feltro e pasta diamantada em
politriz. Todos os procedimentos durante a confecção dos discos serão realizados
sob refrigeração por água. Será realizada avaliação de dureza inicial (descrita
adiante, na análise de perda mineral). A base (dentina) e as laterais do disco serão
isoladas com esmalte para unhas (marca cidade etc), deixando apenas a superfície
do esmalte exposta. Por fim, as amostras serão autoclavadas e armazenadas em
solução estéril a -20ºC até utilização. A esterilização em autoclave será realizada
conforme protocolo padrão, à 121ºC por 15 a 30 minutos, a 15 libras de pressão. O
controle de eficácia será realizado com indicador biológico (bacillus
stearothermophilus).
30
4.3.5 Confecção de saliva artificial � meio caldo
A obtenção do meio DMM (meio definido enriquecido com mucina) será
realizada conforme protocolo descrito anteriormente por Wong & Sissons (2001), o
qual contém mucina gástrica de suíno (2,5g/l), uréia (1.0mmol/l), sais (em mmol/l: de
CaCl2, 1,0; MgCl2, 0,2; KH2PO4, 3,5; K2HPO4, 1,5; NaCl, 10,0; KCl, 15,0; NH4Cl,
2,0), mistura de 21 aminoácidos livres, 17 vitaminas e fatores de crescimento. O
meio contém aminoácidos para o equivalente em proteína/ peptídeo (em mmol/l) em
concentrações baseadas nas da saliva humana: alanina (1,95), arginina (1,30),
asparagina (1,73), ácido aspártico (1,52), cisteína (0,05), ácido glutâmico (5,41
mmol/l), glutamina (3,03), glicina (1,95), histidina (1,08), isoleucina (2,38), leucina
(3,68), serina (3,46), treotonina (1,08), triptofano (0,43), tirosina (2,17), valina (2,38),
e caseína (5,0g/l). Para caracterizar desafio cariogênico, sacarose será acrescida ao
2,5 mm
5 mm
Figura 1. Técnica de confecção dos discos de esmalte. A.Dentes fixados com guta percha para corte em furadeira industrial com broca de núcleo de diamante (tipo trefina). B.Disco de 5mm de diâmetro. C.Sequência de discos de lixa e feltro para planificação e acabamento do disco de esmalte. D.Discos de esmalte padronizados. E.Isolamento da base e lados do disco com esmalte de unhas.
A
B
C
DE
31
meio na concentração de 0,5%, enquanto que para crescimento sem o desafio, a
concentração será de 0,15% (FILOCHE et al., 2008).
4.3.6 Coleta e processamento da saliva
Será realizada coleta de 20mL de saliva estimulada por filme de parafina
(Parafilm �M"®, American National CanTM, Chicago, IL, EUA) de três doadores
saudáveis (envolvidos na pesquisa). Os doadores suspenderão a higiene oral por
24h e a alimentação por 2h previamente à coleta de saliva. A saliva será depositada
em um coletor graduado estéril, transportada em gelo ao Laboratório de
Microbiologia (FO-UFPel). Então, a saliva será filtrada através de lã de vidro estéril,
armazenada em um recipiente estéril e homogeneizada em vortex (FILOCHE;
SOMA; SISSONS, 2007). Serão separadas da saliva coletada de cada voluntário
duas alíquotas, uma para quantificação microbiana (dados expressos em UFC/ mL),
e a outra será centrifugada (5.000g, a 4ºC por 5min) o sobrenadante será eliminado
e o precipitado será congelado para futuras análises microbianas.
4.3.7 Crescimento microbiano e formação de biofilme (Figura 2)
A saliva preparada será inoculada sobre os discos de esmalte em placas de
micro-poços (24 poços), em um volume de 400µL por poço. Após 1 hora, a saliva
será delicadamente aspirada da base dos poços, e 1,8mL de saliva artificial - meio
DMM previamente preparado - será adicionado em cada micro-poço. A amostra de
cada doador será dividida aleatoriamente em três grupos. Destes, um grupo
(controle) não receberá suplementação de sacarose no meio DMM. Nos dois outros
grupos, a adição de sacarose será efetuada no meio, nas concentrações de 0.15% e
0.5% respectivamente (FILOCHE et al., 2008). Os procedimentos serão realizados
em triplicatas.
Os biofilmes serão formados independentemente sobre os discos de esmalte
bovino. As placas serão incubadas em condição atmosférica de anaerobiose (80%
N2, 10% CO2 e 10% H2), sob temperatura controlada (37ºC) por um período de até
10 dias, e mantidas em repouso na incubadora. O meio será renovado diariamente.
Precedendo o momento de cada renovação, as placas serão agitadas
32
cuidadosamente, o sobrenadante será removido e pH (pHmetro - Analion PM608
plus, São paulo, SP) (FILOCHE et al., 2007).
1 hora
1,8 mL DMM
Renovação do meio a cada 24 h
Aspiração do inóculo
pH
3º, 6º e 10º dia
Análise do biofilme
37°C
80%N2 10% CO2 10% H2
Dureza do esmalte
SonicaçãoRTF
Discos de esmalte
Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme pela técnica de microcosmos. A.Inoculação com saliva(microcosmos) nos discos de esmalte individualizados nas placas de micropoços durante 1h emrepouso. B.Aspiração do inóculo e adição do meio (DMM, DMM + 0,5% sacarose ou DMM + 0,15%sacarose) (1,8mL).C.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C, renovação e mensuração do pHdos meios em intervalos de 24h. D.Sonicação das amostras no 3º, 6º e 10º dias para homogeneização erealização de análises no biofilme (quantificação através de diluição e plaqueamento). Avaliaçõesquantitativas de dureza (de superfície e longitudinal) nos discos de esmalte.
A
B
C
D
DMM DMM
Sacarose0,15%0,5%
DMM
400 µL inóculo
(microcosmos)
33
4.3.8 Análise dos Perfis Microbianos/ Crescimento da Placa
Após 3, 6 e 10 dias, os discos de esmalte serão removidos dos poços com
pinça estéril, e as células não aderidas serão removidas gentilmente por lavagem
com solução salina estéril (2mL) (THURNHEER et al., 2003). Então, os discos serão
colocados em tubos contendo 1mL RTF (meio de transporte reduzido), e sonicados
(Sonicador Vibra Cell - Sonics and Materials, Danbury,CT, USA) com potência de
40W, amplitude de 5%, usando 6 pulsos de 9,9s cada (BOWEN; PRUCHNO;
BELLONE, 1986) para obtenção do biofilme em suspensão homogênea.
Será realizada diluição seriada das suspensões de biofilme para contagem de
microrganismos totais, estreptococos do grupo mutans, lactobacilos (TENUTA et al.,
2006), cândida, e acidúricos totais. As suspensões serão diluídas em RTF em séries
até 1:107 e imediatamente inoculadas em duplicata nos seguintes meios de cultura:
Ágar sangue para microrganismos totais; Ágar mitis salivarius com 0,2 unidades de
bacitracina/mL (MSB), para quantificação de estreptococos do grupo mutans (GOLD;
JORDAN; VAN HOUTE, 1973); Ágar Rogosa SL para lactobacilos; CHROMagar
Cândida para quantificação e diferenciação presuntiva de espécimes de cândida; e
BHI com pH ajustado a 4,7 para quantificação de microorganismos totais acidúricos.
As placas serão incubadas em condição de anaerobiose (80% N2, 10% CO2 e 10%
H2), a 37ºC por 96h. As unidades formadoras de colônia serão contadas e os
resultados expressos em UFC/mg de espécime de biofilme (peso úmido) e em
porcentagem de estreptococos do grupo mutans, de lactobacilos, cândida e
microrganismos acidúricos totais em relação aos microrganismos totais cultiváveis.
Após remoção da alíquota da suspensão microbiana inicial (original) para
quantificação, o espécime será removido da suspensão, e esta será centrifugada. O
sobrenadante será desprezado e o precipitado será armazenado a -80ºC para
análises futuras.
4.3.9 Análise da alteração de dureza nos discos de esmalte
Será realizada uma avaliação de dureza superficial média inicial para obter
valores de referência e buscar uma padronização das amostras de esmalte. Após
cada fase de crescimento dos biofilmes, nas diferentes condições impostas ao meio,
a dureza de superfície do esmalte dos discos será mensurada novamente, e uma
34
média para cada espécime será calculada. Estas análises serão realizadas de
acordo com Cury et al. (2000) e a perda (em relação à dureza inicial) da dureza da
superfície será calculada percentualmente (%PDS). As indentações serão realizadas
com cargas de 50- ou 25-grama por 5s, para %PDS e MST, respectivamente.
4.3.10 Tratamento estatístico
De posse dos resultados experimentais deste projeto, o método estatístico
será escolhido com base na aderência ao modelo de distribuição normal e igualdade
de variância. Para todos os testes será considerado o valor p < 0,05 como
estatisticamente significativo. Os voluntários serão considerados como unidades
experimentais e blocos estatísticos, a fim de diminuir a variabilidade do experimento.
Será empregado o programa SigmaStat (Versão 3.01, Systat Software Inc.).
35
5 METODOLOGIA PARA INVESTIGAR O POTENCIAL ANTIMICROBIANO/
ANTICARIOGÊNICO DE UM MATERIAL RESTAURADOR � MTA � UTILIZANDO O MODELO DE BIOFILME IN VITRO.
5.1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de materiais restauradores odontológicos de baixo custo,
propriedades anticariogênicas expressivas e propriedades biomecânicas indicativas
de bom desempenho clínico podem ser um forte auxiliar em ações preventivas e
terapêuticas junto à Rede Nacional de Atenção e Serviços em Saúde.
Os materiais a base de mineral trióxido agregado (MTA) vem sendo utilizados
para diversas finalidades em odontologia, dentre elas: obturações retrógradas
(SAUNDERS, 2008); tratamento endodôntico de dentes com formação apical
incompleta (ERDEM; SEPET, 2008; WITHERSPOON et al., 2008); proteção do
complexo dentinopulpar e capeamento pulpar direto (AEINEHCHI et al., 2007; MIN
et al., 2008). A aplicação dos materiais a base de MTA é fundamentada nas suas
excelentes propriedades biológicas, tais como biocompatibilidade, indução de
deposição óssea e dentinária, e de reparo apical (WITHERSPOON, 2008).
A modificação do MTA, por adição de componentes capazes de melhorar
suas propriedades biomecânicas e de manipulação tornando-o passível de uso
como material restaurador além de protetor pulpar, parece ser promissora,
especialmente se aliada aos potenciais efeitos antimicrobiano e inibidor de
desmineralização/ favorecedor de remineralização. Neste sentido, um material
restaurador inovador a base de trióxido mineral agregado está sendo desenvolvido
no laboratório CDC-Bio da Faculdade de Odontologia (UFPel). Assim, parte da
avaliação do material será realizada no modelo de biofilme proposto. A observação
do potencial antimicrobiano/ anticariogênico deste material será realizada,
contribuindo para observação e idealização das propriedades do material.
36
5.2 OBJETIVOS
Avaliação comparativa do potencial antimicrobiano/ anticariogênico de um
material restaurador em desenvolvimento � MTA experimental, sob condições
cariogênicas no modelo de biofilme proposto.
• Avaliar a presença de cárie adjacente à restauração (CARS)
• Verificar a inibição de crescimento de microorganismos acidúricos e
acidogêncios.
5.3 MATERIAL E MÉTODOS
5.3.1 Delineamento experimental
Será realizada indução de cárie por crescimento de biofilme e adição de
sacarose no meio (DMM 0,5% sacarose), no modelo de biofilme in vitro. Os biofilmes
serão crescidos por até 10 dias sobre 5 discos de esmalte bovino para cada
saliva/tipo de material (n=5), sendo que 3 experimentos serão realizados para cada
combinação tipo de saliva/ tipo de material. Os fatores em estudo serão tipos de
saliva (em 3 níveis/ indivíduos); e tipos de material (em 4 níveis: cimento de
ionômero de vidro, cimento de ionômero de vidro modificado por resina, MTA e MTA
experimental). Os biofilmes serão formados independentemente sobre discos de
esmalte bovino restaurados, os quais serão individualizados nos poços das placas.
As avaliações serão compostas por: aferições diárias de pH (potencial cariogênico);
determinação de desmineralização por dureza de superfície e longitudinal (%PDS e
MST); composição microbiológica do biofilme (diluição e plaqueamento); e análise
bioquímica do biofilme.
5.3.2 Obtenção e preparo das amostras de tecido dentário
As amostras de esmalte serão obtidas, esterilizadas e preparadas em discos
conforme descrito anteriormente. Serão preparadas cavidades padronizadas (2mm
de diâmetro e 1,5mm de profundidade) centralizadas nos discos de esmalte. Para
37
delimitar o diâmetro e a profundidade da cavidade, uma ponta diamantada do tipo
topo plano com stop será utilizada (2294 � KG Sorensen) (Figura 3). Todos os
procedimentos serão executados sob refrigeração constante por água.
Previamente à restauração das cavidades, os discos receberão profilaxia e
lavagem com spray água/ar.
5.3.3 Confecção das restaurações com ionômero de vidro
O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. As
restaurações serão confeccionadas utilizando seringa Centrix, e o material será
inserido em um único incremento. Uma matriz de poliéster será pressionada através
de uma lamínula de vidro a fim de planificar a superfície. Após a geleificação do
material (tempo conforme especificação do fabricante), as amostras receberão
polimento com seqüência de discos de lixa e de feltro em politriz, este último,
associado às pastas para polimento (Diamond ACI e II - FGM).
5.3.4 Confecção das restaurações com ionômero de vidro modificado por resina
O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. Os
espécimes serão tratados com o Vitremer Primer (3M - ESPE) seguindo as
instruções do fabricante. As restaurações serão confeccionadas utilizando seringa
Centrix em um único incremento. Para obtenção de uma superfície plana, uma
matriz de poliéster será pressionada na superfície do material, sob uma lamínula de
2 mm
1,5 mm
AB
Figura 3. Técnica de confecção de cavidades nos discosde esmalte. A.Abertura das cavidades com pontadiamantada topo plano com stop (2294 - KG Sorensen) em alta rotação. B.Cavidades padronizadas (2mm de diâmetro por 1,5mm de profundidade).
38
vidro, sendo então imediatamente fotoativado por 40 segundos com o aparelho
fotopolimerizador (Radii® LED Curing Light, SDI, Austrália) com intensidade de
1400mW/cm2. Imediatamente após, as amostras receberão polimento com
seqüência de discos de lixa e de feltro em politriz, este último, associado às pastas
para polimento (Diamond ACI e II - FGM). Após o polimento será aplicado o selante
de superfície (Vitremer Glazer).
5.3.5 Confecção das restaurações com MTA e MTA experimental
O material será manipulado conforme as especificações do fabricante. As
restaurações serão realizadas em incremento único com auxílio de um porta-
amálgama, e a adaptação do material na cavidade será realizada através de
condensadores de amálgama. O acabamento será realizado conforme descrito para
os materiais anteriores, após o tempo de presa final (15min) sob uma gaze úmida.
Os procedimentos para o MTA experimental serão realizados conforme orientação
dos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento do material.
Todos os blocos restaurados serão armazenados em água destilada a 37ºC até o
momento de esterilização das amostras. Antecedendo a próxima fase (incubação),
todas as amostras serão esterilizadas através de radiação gama (Faculdade de
Medicina - UFPel) (RODRIGUES; CURY; NOBRE DOS SANTOS, 2004).
5.3.6 Análise dos Perfis Microbianos/ Crescimento da Placa
Será realizada diluição seriada das suspensões de biofilme para contagem
de microrganismos totais, estreptococos do grupo mutans, lactobacilos (TENUTA et
al., 2006), cândida, e acidúricos totais, conforme descrição prévia.
5.3.7 Análise da perda mineral nos blocos de esmalte
Após cada fase de crescimento dos biofilmes, o percentual de
alteração/perda de dureza de superfície do esmalte dos discos será calculado a
partir dos valores obtidos nas leituras de dureza inicial e final, esta última, obtida
após os tratamentos. Após a avaliação das superfícies, os discos serão seccionados
39
no centro, longitudinalmente, para determinar a dureza de secção transversal (MST)
(CURY; REBELLO; DEL BEL CURY, 1997). Esta determinação será realizada de
acordo com Cury et al. (2000), mas as indentações serão realizadas em 10, 20, 30,
40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 e 200 µm da superfície externa do esmalte.
Os valores de MST serão utilizados para o cálculo da área integrada de
desmineralização (∆S) para cada tratamento (SOUSA et al., 2009). As análises
serão realizadas com um microdurômetro Future-Tech FM acoplado a um indentador
Knoop. As indentações serão realizadas com cargas de 50- ou 25-grama por 5s,
para %PDS e MST, respectivamente.
5.3.8 Análise bioquímica do biofilme dental
Uma parte das amostras dos biofilmes serão separadas e congeladas (-
80°C) para a análise bioquímica. Elas serão pré-pesadas em microtubos (± 10µg).
Para análise da composição inorgânica, 0,5M HCl será adicionado a um tubo na
proporção de 0,5mL/10mg placa (peso úmido). Depois de uma extração por 3 horas
em temperatura ambiente sob constante agitação, o mesmo volume de TISAB II pH
5,0 (contendo 20g de NaOH/L) será adicionado ao tubo como tamponante (BENELLI
et al., 1993; CURY; REBELLO; DEL BEL CURY, 1997). As amostras serão
centrifugadas (11.000g) por 6min e o sobrenadante será aproveitado para
determinação da presença de F ácido-solúvel, que será analisada com um eletrodo
seletivo de íons e um analisador de íons.
5.3.9 Tratamento estatístico
De posse dos resultados experimentais, o método estatístico será escolhido
com base na aderência ao modelo de distribuição normal e igualdade de variância.
Para todos os testes será considerado o valor p < 0,05 como estatisticamente
significativo. Será empregado o programa SigmaStat (Versão 3.5, Systat Software
Inc.).
40
Referências
AEINEHCHI, M.; DADVAND, S.; FAYAZI, S.; BAYAT-MOVAHED, S. Randomized controlled trial of mineral trioxide aggregate and formocresol for pulpotomy in primary molar teeth. Int Endod J, v.40, n.4, p.261-267, Apr. 2007. ALTMAN, H.; STEINBERG, D.; PORAT, Y.; MOR, A.; FRIDMAN, D.; FRIEDMAN, M.; BACHRACH, G. In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria. J Antimicrob Chemother, v.58, n.1, p.198-201, Jul. 2006. ANDERSON, G. G.; O'TOOLE, G. A. Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, v.322, p.85-105. 2008. ANDERSON, S. A.; SISSONS, C. H.; COLEMAN, M. J.; WONG, L. Application of carbon source utilization patterns to measure the metabolic similarity of complex dental plaque biofilm microcosms. Appl Environ Microbiol, v.68, n.11, p.5779-5783, Nov. 2002. ANWAR, H.; STRAP, J. L.; COSTERTON, J. W. Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother, v.36, n.7, p.1347-1351, Jul. 1992. BARROS, A.; BERTOLDI, A. Desigualdades na utilização e no acesso a serviços odontológicos: uma avaliação em nível nacional. Ciência & Saúde Coletiva, v.7, n.4, p.709-717. 2002. BENELLI, E. M.; SERRA, M. C.; RODRIGUES, A. L., JR.; CURY, J. A. In situ anticariogenic potential of glass ionomer cement. Caries Res, v.27, n.4, p.280-284. 1993. BOWDEN, G. H.; LI, Y. H. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.81-99, Apr. 1997. BOWEN, M. B.; PRUCHNO, C.; BELLONE, C. J. Characterization of a concanavalin A supernatant-derived idiotype-specific T helper cell factor. J Immunol, v.136, n.4, p.1295-1302, Feb 15. 1986.
41
BRADSHAW, D. J.; MCKEE, A. S.; MARSH, P. D. Effects of carbohydrate pulses and pH on population shifts within oral microbial communities in vitro. J Dent Res, v.68, n.9, p.1298-1302, Sep. 1989. BRUNTHALER, A.; KONIG, F.; LUCAS, T.; SPERR, W.; SCHEDLE, A. Longevity of direct resin composite restorations in posterior teeth. Clin Oral Investig, v.7, n.2, p.63-70, Jun. 2003. CURY, J. A.; REBELLO, M. A.; DEL BEL CURY, A. A. In situ relationship between sucrose exposure and the composition of dental plaque. Caries Res, v.31, n.5, p.356-360. 1997. CURY, J. A.; TENUTA, L. M.; RIBEIRO, C. C.; PAES LEME, A. F. The importance of fluoride dentifrices to the current dental caries prevalence in Brazil. Braz Dent J, v.15, n.3, p.167-174. 2004. DAVEY, M. E.; O'TOOLE G, A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev, v.64, n.4, p.847-867, Dec. 2000. DONLAN, R. M.; COSTERTON, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, v.15, n.2, p.167-193, Apr. 2002. ERDEM, A. P.; SEPET, E. Mineral trioxide aggregate for obturation of maxillary central incisors with necrotic pulp and open apices. Dent Traumatol, v.24, n.5, p.e38-41, Oct. 2008. FEJERSKOV, O.; NYVAD, B.; LARSEN, M. J. Human experimental caries models: intra-oral environmental variability. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.134-143, Jul. 1994. FILOCHE, S. K.; COLEMAN, M. J.; ANGKER, L.; SISSONS, C. H. A fluorescence assay to determine the viable biomass of microcosm dental plaque biofilms. J Microbiol Methods, v.69, n.3, p.489-496, Jun. 2007. FILOCHE, S. K.; SOMA, D.; VAN BEKKUM, M.; SISSONS, C. H. Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment. FEMS Immunol Med Microbiol, Jul 16. 2008. FILOCHE, S. K.; SOMA, K. J.; SISSONS, C. H. Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates. Oral Microbiol Immunol, v.22, n.2, p.73-79, Apr. 2007. FONTANA, M.; GONZALEZ-CABEZAS, C. Secondary caries and restoration replacement: an unresolved problem. Compend Contin Educ Dent, v.21, n.1, p.15-18, 21-14, 26 passim; quiz 30, Jan. 2000. FUCIO, S. B.; CARVALHO, F. G.; SOBRINHO, L. C.; SINHORETI, M. A.; PUPPIN-RONTANI, R. M. The influence of 30-day-old Streptococcus mutans biofilm on the surface of esthetic restorative materials--an in vitro study. J Dent, v.36, n.10, p.833-839, Oct. 2008.
42
GOLD, O. G.; JORDAN, H. V.; VAN HOUTE, J. A selective medium for Streptococcus mutans. Arch Oral Biol, v.18, n.11, p.1357-1364, Nov. 1973. KLEINBERG, I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev Oral Biol Med, v.13, n.2, p.108-125. 2002. MARSH, P. D. The role of microbiology in models of dental caries. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.244-254; discussion 255-269, Nov. 1995. MARSH, P. D. Dental plaque: biological significance of a biofilm and community life-style. J Clin Periodontol, v.32 Suppl 6, p.7-15. 2005. MARSH, P. D.; BRADSHAW, D. J. Physiological approaches to the control of oral biofilms. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.176-185, Apr. 1997. MIN, K. S.; PARK, H. J.; LEE, S. K.; PARK, S. H.; HONG, C. U.; KIM, H. W.; LEE, H. H.; KIM, E. C. Effect of mineral trioxide aggregate on dentin bridge formation and expression of dentin sialoprotein and heme oxygenase-1 in human dental pulp. J Endod, v.34, n.6, p.666-670, Jun. 2008. MJOR, I. A. Clinical diagnosis of recurrent caries. J Am Dent Assoc, v.136, n.10, p.1426-1433, Oct. 2005. MJOR, I. A.; MOORHEAD, J. E.; DAHL, J. E. Reasons for replacement of restorations in permanent teeth in general dental practice. Int Dent J, v.50, n.6, p.361-366, Dec. 2000. NARVAI, P. C.; FRAZAO, P.; RONCALLI, A. G.; ANTUNES, J. L. Dental caries in Brazil: decline, polarization, inequality and social exclusion. Rev Panam Salud Publica, v.19, n.6, p.385-393, Jun. 2006. NERI, M.; SOARES, W. Social inequality and health in Brazil. Cad Saude Publica, v.18 Suppl, p.77-87. 2002. OVERMAN, P. R. Biofilm: a new view of plaque. J Contemp Dent Pract, v.1, n.3, p.18-29, Aug 15. 2000. PETERSEN, P. E.; BOURGEOIS, D.; OGAWA, H.; ESTUPINAN-DAY, S.; NDIAYE, C. The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bull World Health Organ, v.83, n.9, p.661-669, Sep. 2005. PRATTEN, J.; SMITH, A. W.; WILSON, M. Response of single species biofilms and microcosm dental plaques to pulsing with chlorhexidine. J Antimicrob Chemother, v.42, n.4, p.453-459, Oct. 1998. RODRIGUES, L. K.; CURY, J. A.; NOBRE DOS SANTOS, M. The effect of gamma radiation on enamel hardness and its resistance to demineralization in vitro. J Oral Sci, v.46, n.4, p.215-220, Dec. 2004.
43
RUBY, J.; BARBEAU, J. The buccale puzzle: The symbiotic nature of endogenous infections of the oral cavity. Can J Infect Dis, v.13, n.1, p.34-41, Jan. 2002. SARRETT, D. C. Clinical challenges and the relevance of materials testing for posterior composite restorations. Dent Mater, v.21, n.1, p.9-20, Jan. 2005. SAUNDERS, W. P. A prospective clinical study of periradicular surgery using mineral trioxide aggregate as a root-end filling. J Endod, v.34, n.6, p.660-665, Jun. 2008. SHU, M.; WONG, L.; MILLER, J. H.; SISSONS, C. H. Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system. Archives of Oral Biology, v.45, n.1, p.27-40, Jan. 2000. SISSONS, C. H. Artificial dental plaque biofilm model systems. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.110-126, Apr. 1997. SISSONS, C. H.; WONG, L.; CUTRESS, T. W. Patterns and rates of growth of microcosm dental plaque biofilms. Oral Microbiol Immunol, v.10, n.3, p.160-167, Jun. 1995. SISSONS, C. H.; WONG, L.; SHU, M. Factors affecting the resting pH of in vitro human microcosm dental plaque and Streptococcus mutans biofilms. Arch Oral Biol, v.43, n.2, p.93-102, Feb. 1998. SOUSA, R. P.; ZANIN, I. C.; LIMA, J. P.; VASCONCELOS, S. M.; MELO, M. A.; BELTRAO, H. C.; RODRIGUES, L. K. In situ effects of restorative materials on dental biofilm and enamel demineralisation. J Dent, v.37, n.1, p.44-51, Jan. 2009. TANG, G.; YIP, H. K.; CUTRESS, T. W.; SAMARANAYAKE, L. P. Artificial mouth model systems and their contribution to caries research: a review. J Dent, v.31, n.3, p.161-171, Mar. 2003. TEN CATE, J. M. In situ models, physico-chemical aspects. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.125-133, Jul. 1994. TEN CATE, J. M. Biofilms, a new approach to the microbiology of dental plaque. Odontology, v.94, n.1, p.1-9, Sep. 2006. TENUTA, L. M.; RICOMINI FILHO, A. P.; DEL BEL CURY, A. A.; CURY, J. A. Effect of sucrose on the selection of mutans streptococci and lactobacilli in dental biofilm formedin situ. Caries Res, v.40, n.6, p.546-549. 2006. THOMAS, J. G.; NAKAISHI, L. A. Managing the complexity of a dynamic biofilm. J Am Dent Assoc, v.137 Suppl, p.10S-15S, Nov. 2006. THOMAS, R. Z.; RUBEN, J. L.; TEN BOSCH, J. J.; FIDLER, V.; HUYSMANS, M. C. Approximal secondary caries lesion progression, a 20-week in situ study. Caries Res, v.41, n.5, p.399-405. 2007.
44
THURNHEER, T.; GMUR, R.; SHAPIRO, S.; GUGGENHEIM, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol, v.69, n.3, p.1702-1709, Mar. 2003. TOTIAM, P.; GONZALEZ-CABEZAS, C.; FONTANA, M. R.; ZERO, D. T. A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries. Caries Res, v.41, n.6, p.467-473. 2007. WEINBERG, M. A.; BRAL, M. Laboratory animal models in periodontology. J Clin Periodontol, v.26, n.6, p.335-340, Jun. 1999. WHITE, D. J. The application of in vitro models to research on demineralization and remineralization of the teeth. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.175-193; discussion 194-177, Nov. 1995. WIEGAND, A.; BUCHALLA, W.; ATTIN, T. Review on fluoride-releasing restorative materials--fluoride release and uptake characteristics, antibacterial activity and influence on caries formation. Dent Mater, v.23, n.3, p.343-362, Mar. 2007. WIMPENNY, J. W. The validity of models. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.150-159, Apr. 1997. WITHERSPOON, D. E. Vital pulp therapy with new materials: new directions and treatment perspectives--permanent teeth. J Endod, v.34, n.7 Suppl, p.S25-28, Jul. 2008. WITHERSPOON, D. E.; SMALL, J. C.; REGAN, J. D.; NUNN, M. Retrospective analysis of open apex teeth obturated with mineral trioxide aggregate. J Endod, v.34, n.10, p.1171-1176, Oct. 2008.
45
Orçamento Despesas com materiais de consumo
MATERIAIS ODONTOLÓGICOS DE CONSUMO
QUANTIDADE VALOR UNITÁRIO
VALOR TOTAL
(R$) Touca franzida c/ 100 (Fava) 2 8,10 16,20Máscara c/ 50 (Best Fabril) 3 6,50 19,50Luvas de procedimento c/ 100 (Supermax) 5 13,50 67,50Sobre-luvas c/ 100 (MCE) 1 5,80 5,80Cera utilidade (Epoxiglass) 1 9,00 9,00Rolo papel grau cirúrgico 10cmX100m (Medstéril Investmar)
1 62,80 62,80
Microbrush c/ 100 (KGbrush KG Sorensen) 2 6,50 13,00Ácido fosfórico 37% (Magic Acid Vigodent) 1 5,90 5,90Sistema Adesivo (ADPER Single Bond 2 - 3M ESPE)
1 98,90 98,90
Resina Composta (Z250 - 3M ESPE) 2 81.00 162,00Cimento de Ionômero de Vidro (Vitrebond - 3M ESPE)
2 325,00 650,00
Cimento de ionômero de vidro modificado por resina (Vitremer 3M ESPE)
2 308,00 616,00
Mineral trióxido agregado (MTA 1g � Ângelus) 2 284,40 568,80Broca carbide (KG Sorensen) 20 3,90 78,00Ponta diamantada (KG Sorensen) 20 4,20 84,00Fita de matriz de aço (X mm) (Injecta) 20 1,50 30,00Ponteiras descartáveis para seringa Centrix, pct c/ 20
2 39,30 78,60
TOTAL 2.566,00
PAPELARIA Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)
Caixa de papel 500 fls. 95g/ m2 / tam. A4 para impressão em jato de tinta
1 15,00 15,00
Cartucho de tinta para impressora Deskjet 820 2 30,00 60,00Fita adesiva larga 1 5,00 5,00TOTAL 80,00
MATERIAIS DE CONSUMO LABORATORIAL
Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)
Anaerobac c/ 10, Probac 10 105,60 1.056,00Placa p/ cultura de tecidos fundo chato c/ tampa estéril 24 poços, TPP
100 3,54 354,00
46
Placa de petri descartável 90 x 15mm c/ 10, J. Prolab
100 1,99 199,00
Pipetas graduadas descartáveis 10 26,94 269,40Ponteira cor amarela 20 a 200µl pct. c/ 1000, Axygen T200Y
10 26,94 269,40
Ponteira cor natural 20 a 300µl pct. c/ 1000, Axygen T350-C
10 29,05 290,50
Ponteira cor azul 100 a 1000µl pct. c/ 1000, Axygen T1000-B
10 29,05 290,50
Rack c/ 96 ponteiras 0,5 a 10µl, Axygen 1 6,26 6,26Rack c/ 96 ponteiras 20 a 200µl, Axygen 1 6,26 6,26Rack c/ 96 ponteiras 20 a 300µl, Axygen 1 7,08 7,08
Rack c/ 96 ponteiras 100 a 1000µl, Axygen 1 7,08 7,08
Filtro Millex GV 0,22µm 25mm c/ 25, Millipore JBR610021
4 221,10 884,4
TOTAL 3.639,88
REAGENTES E MEIOS DE CULTURA Quantidade Valor Unitário Valor Total (R$)
Agar Mitis Salivarius c/ 500g, Acumedia 3 204,50 613,50Agar tryptic soy c/ 500g, Acumedia 1 112,58 112,58Agar base sangue columbia c/ 500g, Acumedia 1 139,10 139,10Rogosa SL Agar c/ 500g, Difco cód. 0480-17 1 1228,80 1228,80Caldo cérebro e coração (BHI) c/ 500g, Acumedia
1 100,93 100,93
Agar cérebro e coração c/ 500g, Acumedia 1 155,05 155,05Chromagar cândida c/ 500g, Difco 1 887,90 887,90Agar sabouraud dextrose 4% c/ 500g, Acumedia 1 69,50 69,50Caldo tryptic soy c/ 500g, Acumedia 1 91,95 91,95Reagentes para confecção de DMM � saliva artificial
4.610,00
TOTAL 8.009,31 Despesas com capital
MATERIAL PERMANENTE PARA LABORATÓRIO
QUANTIDADE VALOR UNITÁRIO
VALOR TOTAL
(R$) Bico de Busen c/ registro 3 39,00 117,00
Espátula de aço inox c/ colher 150 mm 2 8,00 16,00
Micropipeta monocanal vol. Variável 0,1 a 2µl, mod. LM-2, HTL
1 254,40 254,40
Micropipeta monocanal vol. Variável 0,5 a 10µl, mod. LM-10, HTL
1 254,40 254,40
Micropipeta monocanal vol. Variável 10 a 100µl, mod. LM-100, HTL
1 219,40 219,40
Micropipeta monocanal vol. Variável 20 a 200µl, mod. LM-200, HTL
1 219,40 219,40
Micropipeta monocanal vol. Variável 100 a 1000µl, mod. LM-1000, HTL
1 228,30 228,30
Pêra pipetadora 3 vias verde, 60ml 1 19,70 19,70
47
Pêra pipetadora 3 vias borracha, 100ml 1 9,89 9,89Jarra p/ anaerobiose em PVC rígido cap. 3,5Lt. Mod. JA0401, Permution
1 210,00 210,00
Jarra p/ anaerobiose em acrílico transparente cap. 3,5Lt. Mod. JA0402, Permution
2 380,30 760,60
Barra magnética lisa, 5x15mm, mod. FS5X15 1 6,83 6,83Barra magnética lisa, 7x30mm, mod. FS730 1 8,09 8,09TOTAL 2.324,01
VIDRARIA Quantidade Valor
Unitário Valor Total (R$)
Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 50ml, Boeco
5 13,86 69,30
Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 250ml, Boeco
5 10,05 50,25
Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 500ml, Boeco
5 12,40 62,00
Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 1000ml, Boeco
5 17,50 87,50
Frasco p/ reagente em vidro transparente graduado, c/ tampa azul rosqueavel autoclavavel cap. 5000ml, Boeco
1 274,70 274,70
Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 50ml, Satelit
1 15,98 15,98
Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 100ml, Satelit
1 17,54 17,54
Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 250ml, Satelit
1 20,20 20,20
Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 500ml, Satelit
5 21,20 106,00
Balão volumétrico c/ tampa polietileno cap. 1000ml, Satelit
5 26,62 133,10
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 25ml, Satelit
1 7,63 7,63
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 50ml, Satelit
1 8,00 8,00
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 100ml, Satelit
2 8,39 16,78
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 250ml, Satelit
1 18,30 18,30
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 500ml, Satelit
2 25,17 50,34
Proveta graduada de vidro c/ base hexagonal plástica cap. 1000ml, Satelit
1 33,56 33,56
TOTAL 971,18
EQUIPAMENTOS Quantidade Valor Unitário
Valor Total
48
(R$) Homogenizador de soluções (sangue) cap. 22 tubos, mod. AP-22, Phoenix
1 611,60 611,60
Mesa agitadora microprocessada mod. Q225M, Quimis 1 2928,30 2928,30Agitador de tubos Vortex mod. QL-901 1 385,00 385,00Contador de colônias digital, mod. CP600 1 1.490,00 1.490,00Centrífuga de Microtubos eppendorf 1 899,00 899,00Agitador magnético c/ aquecimento, mod. 752A 1 1.267,00 1.267,00TOTAL 7.580,9OUTROS Quantidade Valor
Unitário Valor Total (R$)
Espátula para inserção de resina Thompson 1 47,00 47,00Bandeja inox 40,5x30,5x5,5 � Coraldent GC 20 2 21,00 42,00TOTAL 89,00
OUTROS TIPOS DE DESPESA (CUSTEIO E DIVULGAÇÃO)
Valor Total (R$)
Congressos (SBPQO, ORCA) 3.500,00Passagens 3.000,00TOTAL 6.500,00
TOTAL - CONSUMO 14.295,19TOTAL - PERMANENTE 10.876,09TOTAL - OUTROS 6.589,00TOTAL 31.760,28
Fontes de financiamento
PRODOC/ CAPES (R$12.000,00 ano); Edital Universal/ CNPQ (R$19.986,00);
recursos dos pesquisadores.
49
Cronograma
PERÍODO
2008 2009 2010 ATIVIDADES A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M Pesquisa bibliográfica
X X X X X X X X X X X X X X X X
Submissão ao CEP
X
Qualificação X
Aquisição dos materiais
X X X X
Pilotos X X
Preparo dos dentes
X X X
Experimento 1 X X
Análise do biofilme
X X
Experimento 2 X X
Análise do biofilme
X X
Avaliação dos espécimes
X X X X X
Descrição dos resultados
X X X X X
Análise estatística
X X X X
Redação dos artigos
X X X X X
Redação da dissertação
X X
Defesa da dissertação
X
50
3 RELATÓRIO DE CAMPO
3.1 Aspectos éticos
O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (FO-UFPel/ RS) sob
parecer nº. 076/2009. Os voluntários assinaram um termo de consentimento livre e
esclarecido, a fim de autorizar sua participação no estudo. (Apêndices)
3.2 Condições gerais
O modelo de biofilme in vitro descrito por Filoche et al. (FILOCHE; SOMA;
SISSONS, 2007) foi utilizado com modificações. O estudo foi completamente
aleatorizado. Os biofilmes foram formados independentemente em placas 24 de
micro-poços (TPP - Techno Plastic Products, Trasadingen, SU) sobre discos de
esmalte bovino, tendo como inóculo saliva humana para obtenção de microcosmos.
Foi utilizado um meio de crescimento análogo à saliva - meio definido enriquecido
com mucina (DMM) (WONG; SISSONS, 2001). A confecção do meio foi realizada
com componentes da marca Sigma (Sigma Chemical Co., St Louis, Montana, EUA),
exceto pelos sais (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ).
A construção do modelo foi desenvolvida em 3 etapas, descritas a seguir e
representadas esquematicamente. (Figura 1)
3.3 Experimentos
3.3.1 Piloto 1 (P1)
Os biofilmes foram crescidos por até 10 dias, em duplicatas para cada
condição avaliada. Os fatores em estudo foram: a concentração de sacarose no
51
meio DMM (0,15% e 0,5%); o regime de suplementação por sacarose (Estático -
DMM com sacarose durante todo o período de formação dos biofilmes; semi-
dinâmico � com sacarose durante diferentes intervalos de tempo); e o tempo de
crescimento dos biofilmes (4, 7 e 10 dias). Foram 6 condições de meio (DMM, DMM
estático 0,15% e 0,5%, DMM semi-dinâmico 0,5% em 40min, 1h30min, 3h) X 3 time-
points (4, 7, 10) X 2 (duplicatas), num total de 36 biofilmes formados em 36 discos
de esmalte. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH para
verificação do potencial cariogênico do biofilme; e determinação de
desmineralização por dureza de superfície.
3.3.2 Piloto 2 (P2)
Os biofilmes foram crescidos por até 10 dias, em triplicatas para cada
condição avaliada. Os fatores em estudo foram: a concentração de sacarose no
regime estático (DMM com 0,075% e 0,15% de sacarose); a concentração de
sacarose no regime Semi-Dinâmico (DMM com 0,15%, 0,5% e 1% de sacarose); e o
tempo de crescimento dos biofilmes (5 e 10 dias). Foram 6 condições de meio
(DMM, estático com 0,075% e 0,15%, semi-dinâmico com 0,15%, 0,5% e 1%) X 2
time-points (5, 10) X 3 (triplicatas). Formando 36 biofilmes (36 discos de esmalte) no
total. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH; determinação de
desmineralização por dureza de superfície; e composição microbiológica do biofilme
(diluição e plaqueamento).
3.3.3 Experimento I (Exp I)
O Experimento I foi realizado para avaliação de dose-resposta do modelo. A
condição para formação dos biofilmes foi selecionada do Piloto 2, regime semi-
dinâmico � DMM com 1% de sacarose. Os biofilmes foram crescidos
independentemente por 5 dias, em quadruplicatas para cada condição avaliada. Os
fatores em estudo foram as diferentes concentrações de clorexidina (0,012%, 0,03%,
0,06% e 0,12%; lote: cs 0050508, Pharma Nostra, Anápolis, GO) utilizadas como
tratamento (imersão em 2ml de clorexidina durante 1 min/ por dia) nos biofilmes. O
experimento foi repetido de forma independente. Foram 5 tratamentos (4
concentrações de clorexidina e 1 controle) X 1 tempo de crescimento X 4
52
(quadruplicatas) X 2 (repetições). No total, 40 biofilmes foram formados nesta
condição. As análises foram compostas por: aferições diárias de pH; determinação
de desmineralização por dureza de superfície; e composição microbiológica do
biofilme através de diluição e plaqueamento.
DMM com adição de sacarose
0,075%
DMM - 18h e DMM com sacarose � 6h
0,15%
0,5%
0,012% CLX 0,06% CLX 0,03% CLX 0,12% CLX
2 inóculos
1%
0,15%
DMM - 18h e DMM com 1% sacarose � 6h
DMM
0
2 inóculos
Regime Estático Regime Semi-Dinâmico
Regime Estático Regime Semi-Dinâmico
DMM com adição de sacarose DMM e DMM com sacarose 0,5%
40min
1h 30min
3h
23h 20min
22h 30min
21h
0,15% 0,5%
DMM
CONTROLE
Clorexidina (CLX)
DMM com adição de sacarose
0,075%
DMM - 18h e DMM com sacarose � 6h
0,15%
0,5%
0,012% CLX 0,06% CLX 0,03% CLX 0,12% CLX
2 inóculos
1%
0,15%
DMM - 18h e DMM com 1% sacarose � 6h
DMM
0
2 inóculos
Regime Estático Regime Semi-Dinâmico
Regime Estático Regime Semi-Dinâmico
DMM com adição de sacarose DMM e DMM com sacarose 0,5%
40min
1h 30min
3h
23h 20min
22h 30min
21h
0,15% 0,5%
DMM
CONTROLE
Clorexidina (CLX)
3.5 Rotinas laboratoriais
3.5.1 Coleta e processamento da saliva
Foi realizada a coleta de saliva estimulada por filme de parafina (Parafilm
�M"®, American National CanTM, Chicago, Illinois, EUA) de um voluntário adulto e
saudável (M.S.A.), que não havia estado sob terapia antibiótica por 1 ano. O doador
suspendia a higiene oral por 24h previamente às coletas, que foram realizadas no
período matutino (em jejum). A saliva era depositada em um coletor graduado estéril
e transportada em gelo ao Laboratório de Microbiologia (FO-UFPel). Uma alíquota
de saliva (0,5mL) foi separada para quantificação microbiana (UFC/mL). O restante
foi homogeneizado em agitador de tubos tipo Vortex e imediatamente utilizado como
Figura 1. Representação esquemática dos estudos Piloto 1, 2 e Experimento I.
53
inóculo. Para cada experimento, a coleta de saliva foi realizada no momento de sua
utilização.
3.5.2 Protocolo de obtenção e crescimento dos biofilmes (Figura 2)
A saliva foi inoculada sobre os discos de esmalte em placas de 24 micro-
poços, em um volume de 400µL por poço. Após 1h em repouso sob temperatura
ambiente, a saliva foi delicadamente aspirada da base dos poços, e 1,8mL de meio
DMM (com ou sem sacarose) foram adicionados em cada micro-poço. Destes, o
grupo controle não recebeu suplementação de sacarose no meio (DMM). Nos
grupos de regime semi-dinâmico, a adição de DMM com sacarose foi efetuada nos
tempos (40min, 1h30min, 3h, 6h) e concentrações (0,15%, 0,5%, 1%) determinadas
em cada piloto/experimento e as placas foram incubadas. Após o período de desafio
cariogênico os discos eram enxaguados através de imersão em 2mL de solução
salina estéril, inseridos em uma nova placa contendo DMM, e novamente incubados.
Os grupos de regime receberam DMM com as concentrações de sacarose
estabelecidas (0,075%, 0,15% e 0,5%) durante todo o experimento. Os biofilmes
foram formados independentemente sobre os discos de esmalte suspensos em
dispositivos de fio ortodôntico, em cada micro-poço. As placas foram incubadas em
condição atmosférica de anaerobiose (5-10% CO2 e menos que 1% O2) em jarras
(Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda., Santa Cecília, SP) com geradores
de anaerobiose (Anaerobac- Probac) sob temperatura controlada (37ºC), e mantidas
em repouso na incubadora. Os meios, DMM com e sem adição de sacarose, foram
renovados diariamente. Após cada renovação, foi realizada a leitura de pH (pHmetro
� Quimis Aparelhos Científicos Ltda, Diadema, SP; eletrodo V621 � Analion,
Ribeirão Preto, SP) do sobrenadante, individualmente em cada micro-poço
(FILOCHE; SOMA; SISSONS, 2007). Após os tempos pré-determinados (time-
points) nos pilotos e experimento (4, 7 e 10 dias; 5 e 10 dias; 5 dias), os discos de
esmalte foram removidos dos poços com pinça estéril, e as bactérias não aderidas
foram removidas gentilmente por lavagem em 2mL de solução salina estéril
(THURNHEER et al., 2003). Os biofilmes foram removidos da superfície de esmalte
com lâminas plásticas esterizadas, depositados em micro-tubos estéreis pré-
pesados contendo esferas de vidro. Os tubos foram novamente pesados para que o
volume apropriado (1 mL/mg de biofilme, w/w) de meio de transporte reduzido (RTF)
54
fosse adicionado. A homogeneização da suspensão de biofilme foi realizada com
agitação em Vortex durante 2min. No Experimento I, uma variação foi realizada no
protocolo de remoção dos biofilmes. Estes experimentos foram realizados em
duplicatas. Na primeira, os biofilmes foram coletados como descrito anteriormente.
Na segunda, os discos de esmalte foram depositados dentro dos micro-tubos (com
esferas de vidro) contendo 1mL de RTF e vortexados por 2min.
pH
A
DC
B
E
FG
H
I
Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de microplacas.A.Inserção individualizada dos discos em placas de 24 micro-poços. B.Inoculação com 400 µL de saliva durante 1h em repouso. C.Aspiração do inóculo. D.Adição de 1,8mL de DMM (com ou sem sacarose conforme cada delineamento experimental). E.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C. F.Renovação ou troca dos meios (intervalos de 24h para regimes Estáticos e após períodos estabelecidos nos Semi-Dinâmicos). G.Mensuração do pH dos meios após cada troca. H.Remoção de bactérias não aderidas (solução salina estéril). I.Coleta dos biofilmes (apenas biofilme ou disco com biofilme) após cada time-point para avaliações. J.Dispersão e homogeneização dos biofilmes em RTF com agitação em vortex (2min).
J
Saliva
Solução Salina
1,8mL
400µL
Troca dos meios
Coleta do Biofilme
Aspiração do inóculo
Homogeneização do Biofilme com o
RTF
pHpH
A
DC
B
E
FG
H
I
Figura 2. Ensaio in vitro de biofilme de microcosmos pela técnica de microplacas.A.Inserção individualizada dos discos em placas de 24 micro-poços. B.Inoculação com 400 µL de saliva durante 1h em repouso. C.Aspiração do inóculo. D.Adição de 1,8mL de DMM (com ou sem sacarose conforme cada delineamento experimental). E.Incubação das placas em anaerobiose à 37°C. F.Renovação ou troca dos meios (intervalos de 24h para regimes Estáticos e após períodos estabelecidos nos Semi-Dinâmicos). G.Mensuração do pH dos meios após cada troca. H.Remoção de bactérias não aderidas (solução salina estéril). I.Coleta dos biofilmes (apenas biofilme ou disco com biofilme) após cada time-point para avaliações. J.Dispersão e homogeneização dos biofilmes em RTF com agitação em vortex (2min).
JJ
Saliva
Solução Salina
1,8mL
400µL
Troca dos meios
Coleta do Biofilme
Aspiração do inóculo
Homogeneização do Biofilme com o
RTF
55
3.6 Alterações no projeto original
3.6.1 Dificuldades encontradas
Em virtude do tempo despendido na adequação do Laboratório de
Microbiologia e obtenção de equipamentos necessários à pesquisa, o cronograma
previsto para iniciação dos experimentos foi alterado. Além disso, as investigações
realizadas nos experimentos piloto foram expandidas, afim de estabelecer a
resposta do esmalte a diversas concentrações e regimes de exposição a sacarose
de uma forma mais elucidativa do que havia sido prevista no projeto. Desta forma, o
experimento previsto para o teste de materais restauradores no modelo proposto
não foi realizado.
3.6.2 Revisão da literatura
A revisão da literatura foi realizada para fundamentação da dissertação. No
entanto, não foi redigida na forma de artigo pois revisões com o mesmo escopo
haviam sido recentemente publicadas.
56
4 ARTIGO Título: Development of an in vitro biofilm model for enamel demineralization and dose-response studies §
Françoise H. van de Sande*, Marina S. Azevedo, Rafael G. Lund, Maximiliano S.
Cenci
Dentistry School, Federal University of Pelotas, Brazil
Adress Rua Gonçalves Chaves, 457, Pelotas, RS, Brasil. 96015-560.
Tel./Fax: +55-53-3222-6690.
E-mail: [email protected]
§ Artigo formatado segundo as normas do periódico Archives of Oral Biology
57
ABSTRACT
The general aim of this study was to develop a laboratorial model to test
anticariogenic potencial of therapies. Specific aims were to evaluate enamel
demineralization response to cariogenic conditions induced by several sucrose
regimens in microcosm biofilms, and after setting the nutritional condition, to test the
model with a dose-response evaluation to chlorhexidine. Biofilms were initiated from
human saliva and grown up to 10 days on bovine enamel discs in multi-well plates
with defined medium with mucin (DMM), which was supplemented with sucrose
concentrations that ranged from 0.075% to 1%. Sucrose exposure occurred under
batch or semi-continuous fed. Data from acidogenicity of biofilms were collected as
pH readings from DMM supernatants and the percentual surface hardness change
(%SHC) was obtained by enamel surface hardness readings before and after
experimental runs. The results from sucrose regimens indicated that acidogenicity of
biofilms affected enamel surface hardness. Under low sucrose concentration
exposure (batch-0.075%) enamel hardness was not affected. Exposures to 0.15%
sucrose were time-dependent, as enamel surface experienced mineral loss in batch
but not in semi-continuous (6 h) fed. With 0.5% sucrose concentration a time-
dependent exposure effect was also observed in enamel hardness change.
Exposures from 40 min to 3 h sucrose-fed (up to 10 days) did not caused significant
%SHC in enamel, but increasing the exposure time to 6 h induced significant mineral
loss. Also, under 0.5%-batch severe damage to enamel surface was noted,
irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded
surfaces excluded the possibility of %SHC evaluation, and suggested that the
constant low pH would promote erosion lesions instead of subsurface carious
lesions. Exposures to 0.5% and 1% under 6 h sucrose-fed induced similar %SHC in
58
enamel. The dose-response evaluation to chlorhexidine solution (concentrations from
0.012 to 0.12%) was taken in one regimen (semi-continuous 1% sucrose) and both
biofilm acidity and enamel mineral loss were dose-responsive to treatments. Overall,
the biofilm model assessed promoted dose-response effect to chlorhexidine and to
different sucrose feeding protocols, being suitable as a pre-clinical model for testing
the anticariogenic potential of treatments and for demineralization studies.
Keywords: biofilm, microcosm, dental plaque, demineralization, caries
59
1. Introduction
Biofilm communities naturally formed in loco are often difficult to investigate
and for most experimental conditions they present several uncontrolled variables or
ethical issues. The development of methodologies that provide the establishment of
biofilms under controlled conditions has been useful to study natural processes more
accurately.1
Laboratory-based experimental biofilm model systems have been extensively
developed. Several devices were built for this purpose, as the Constant Depth Film
Fermentor (CDFF)2, the Multiple Sorbarod Device (MSD)3, and the Multi-plaque
Artificial Mouth (MAM)4. These systems require the use of sophisticated continuous
culture equipments, some of them not commercially available neither easily
constructed. Although they provide the growth of biofilms up to several weeks, for
short-term biofilm-related studies (as anticariogenic properties) simpler methods
should be preferred.1,5 Systems where biofilms are developed on multi-well plates
seem to be advantageous alternatives to rapidly obtain results when several tests
and conditions need to be addressed.5
With respect to the microbial composition of biofilms, investigations have
focused on single-species biofilms6-8, multispecies biofilms with a predefined
community composition9-12, or microcosm biofilms.3,13-15 Each approach harbours
specific questions to be answered.1
Microcosms can be described as ecosystems that are used to mimic naturally
formed biofilms.1,16 For studies concerning supragingival plaque, a microcosm
implies the use of dental plaque or human saliva as source of inoculum for an in vitro
device.17
60
To verify anticariogenic and antibacterial properties of treatments under a
closest clinical scenario, biofilms derived from microcosm may be preferred. For
resembling dental biofilm microbial composition, they evolve under heterogenic and
diverse microbial composition. Their growth is driven by the availability of nutrients18
and atmosphere condition, and selection is not restricted from few species or groups.
Biofilm models developed in microplates were described by Guggenheim12
and Filoche19. These models are of interest because they allow biofilm growth under
simple, but controlled laboratory conditions. In this later model, which was a
microcosm model, it was shown that sucrose exposure significantly affected the
species` composition in the biofilm, similarly to what occurs in vivo and others in vitro
models19. Differences in the cariogenicity of plaque biofilms were addressed,
suggesting that the microplate model would be suitable to investigate caries-related
conditions. However, biofilms were grown over ThermanoxTM coverslips19 and no
effect from biofilm acidogenicity could be extrapolated to dental hard tissues.
In the present study a microcosm biofilm developed in micro-plates was used
to establish a model suitable for evaluation of the enamel demineralization response
to cariogenic conditions. To set the model, enamel served as substrate and biofilms
were formed under exposure to several sucrose concentrations and supplementation
regimens. Additionally, to verify if the model was dose-responsive to treatments, an
evaluation with Chlorhexidine was performed.
61
2. Materials and Methods
Ethical approval was granted by the Ethics Committee of the Dentistry School
of the Federal University of Pelotas (Pelotas, RS, Brazil).
2.1. Experimental conditions
The microcosm biofilm model described by Filoche et al.19 was used, with
modifications in this study. Human saliva was used as inoculum to provide biofilms
representative of microorganisms found in human supragingival plaque (microcosm
dental plaque). Enamel discs were used as substrate and the nutrient growth media
used for the experiments was a defined medium enriched with mucin (DMM)20. Two
independent experiments were carried out as pilot studies aiming to evaluate and set
the conditions before establishing the model. In both, biofilms were grown up to 10
days and two major conditions of cariogenic challenge were designed. Biofilms were
grown under DMM supplemented with sucrose all time in batch culture, or DMM with
and without sucrose in a semi-continuous fed-batch regimen. Different sucrose
concentrations were made for both conditions.
In Experiment I, 36 biofilms were grown; replicates (n=2) were evaluated in
three time-points (4, 7 and 10 days) and sucrose concentration was 0.15% or 0.5% in
batch and 0.5% in semi-continuous fed. Time of sucrose supplementation in semi-
continuous subgroups was 40 min, 1 h 30 min or 3 h, daily. In Experiment II, 36
biofilms were grown; replicates (n=3) were evaluated in two time-points (5 and 10
days). Biofilms were grown in batch under 0.075% or 0.15% sucrose
supplementation and in semi-continuous under 0.15%, 0.5% or 1% sucrose-fed for 6
h daily.
62
Then, in Experiment III one condition of the cariogenic challenge was selected
- semi-continuous 1% sucrose-fed; 40 biofilms were grown in two independent
experiments (n=20) up to 5 days. Replicates (n=8) were evaluated under different
concentrations of chlorhexidine treatment to assess the dose-response of the biofilm
model. Control groups were biofilms supplied with DMM in the pilot studies
(Experiment I and II) and no chlorhexidine treatment in Experiment III.
2.2. Enamel Discs
Enamel discs (5 mm diameter and 2 mm thickness) were obtained from
recently extracted bovine central incisors. A cylindrical diamond-coated drill (trephine)
was used perpendicular to the buccal surface of the teeth. Dentine and enamel
surfaces were wet ground with 400 and 800/1200/1500/2000-grit silicon carbide
papers, respectively. Both surfaces were plan- parallel. A nail varnish was applied on
the sides (enamel/dentine) and bottom (dentine) of the disc, leaving only the buccal
enamel surface exposed. The discs were fixed with a holder prepared with
orthodontic wire and kept in a vertical position during the experimental procedures.
They were autoclaved21 and kept at 4°C (humid atmosphere) until use.
2.3. Saliva collection
For each experimental run, fresh stimulated saliva was collected from a
healthy subject (female, aged 26), who had not been under antibiotic therapy for at
least one year. Fifty mL of saliva was collected in the morning (during fasting) and
the volunteer abstained from oral hygiene for 24 hours prior to collection. One aliquot
of the saliva was taken to determine the baseline microbial composition (CFUs/mL).
63
2.4. Inoculation Procedure and Microcosm Growth
Enamel discs were transferred aseptically into sterile wells (24-well tissue
culture plate; TPP - Techno Plastic Products, Trasadingen, SU) and 400 µL of fresh
homogenised saliva was dispensed onto each enamel disc. After one hour at room
temperature (22 ± 3 °C) the saliva was aspirated and 1.8 mL of growth media was
added according to the experiments and groups. DMM with 0.075%, 0.15% or 0.5%
sucrose into batch groups and DMM with 0.15%, 0.5% or 1% sucrose in semi-
continuous groups. In this last condition, after the sucrose-fed, discs were dip
washed for 10 s in sterile saline solution and transferred to a new plate with DMM.
The negative control group was supplied with DMM for all the experimental period.
Plates were incubated in an environment of 5-10% CO2, less than 1% O2 (Anaerobac
- Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda., Santa Cecília, SP, Brazil), in
anaerobic jars (Probac do Brasil produtos Bacteriológicos Ltda) for up to 10 days at
37°C without shaking. The growth media was replaced daily for all conditions.
Preceding media replacements, the plates were gently shaken and the discs
transferred to a new plate where fresh medium was added. For the Experimental
Model (III), biofilms were formed under semi-continuous 1% sucrose-fed up to 5
days. Treatments consisted in one minute immersion in 2mL of 0.012- 0.03- 0.06 or
0.12% chlorhexidine (CHX) solution freshly prepared (cs 0050508, Pharma Nostra �
Anápolis, GO, Brazil). Exposures started at the second day of the experiment and
were applied before the cariogenic challenge. After treatments, discs were dip
washed for 10 s in sterile physiological saline. The control group was treated with
sterile physiological saline under the same protocol. Final exposure to antimicrobial
agent occurred at day 4. For all experiments, after the experimental periods, discs
64
were cleaned with tooth brush and distilled water and kept at 4°C in microtubes
(humid atmosphere) until demineralization analysis.
2.5. Biofilm supernatant pH readings
After growth media replacements, each well from the discarded plate had its
pH recorded (Quimis 50w � Quimis Aparelhos Científicos Ltda., Diadema, SP, Brazil;
V621 electrode � Analion, Ribeirão Preto, SP, Brazil). Once a day for batch cultures
and twice a day for semi-continuous groups.
2.6. Biofilm microbial composition
After each time-point, discs were gently dip-washed in 2 mL of sterile
physiological saline to remove loosely adherent bacteria and placed over a sterile
tissue to absorb the liquid excess. Dental biofilm formed on enamel discs was
collected individually. They were removed with sterile plastic points and transferred
into a sterile pre-weighted microtube (1.5 mL) containing sterile glass beads. They
were weighted using an analytical balance (AUW220D, Shimadzu, Kyoto, Japan) and
biofilm wet weight was calculated. Reduced transport fluid (RTF) was added (1
mL/mg of biofilm, w/w) and the biofilm was dispersed by vortex for two minutes. Then
it was serially diluted (1:100�10-6) in RFT and 20 µL of the diluted sample was plated
in duplicate onto selective and non-selective media as follows: Brain Heart Infusion
adjusted to pH 7.2 and Blood Agar (for total microorganisms counts); Brain Heart
Infusion adjusted to pH 4.8 (for total aciduric counts); Mitis Salivarius agar (for total
streptococci counts); Mitis Salivarius agar supplemented with 0.2 units of
bacitracin/mL (for mutans streptococci) and Rogosa agar (for total lactobacilli). Plates
were incubated anaerobically for 96 h at 37 °C. The numbers of colony-forming units
65
(CFUs) were determined. Counts on selective plates were based on colony
morphology and verified by Gram-stain and cell appearance using light microscopy.
2.7. Enamel Hardness
Hardness testing of the enamel discs was performed by six indentations,
spaced 100 µm from each other, with a Knoop diamond loaded with 50 g weight for 5
s (Micro Hardness Tester FM 700, Future-Tech Corp., Kawasaki, Japan). The
surface hardness reading was performed before (sound enamel) (SH) and after
experiments (SH2). The percentage of surface hardness change was calculated
[%SHC = 100(SH2 -SH)/SH].
2.8 Statistical analysis
The null hypothesis assumed no differences for the factors treatment group
(experiment I, II and III) or time of biofilm formation (experiment I and II) or
interactions (experiment I and II), considering the response variables under study.
The assumptions of equality of variances and normal distribution of errors were
checked for each variable, and when assumptions were violated, the data were
transformed, or a corresponding non-parametric method was used. Data were
analyzed by Two-way ANOVA, followed by all pairwise comparisons (Tukey�s
method) to identify the specific differences among groups in the experiment 1, or
One-way ANOVA and Tukey�s test (experiment 2) (α = 0.05). Data were analysed
using the SAS software v. 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, N.C., USA).
66
3 Results
3.1 Effect of sucrose regimens on pH
For experiment I, descriptive statistics are presented in table (Table 1). Lower
pH mean values from medium supernatants readings were found for 0.5%-batch.
Within semi-continuous subgroups 0.5%-3 h sucrose-fed presented slightly lower pH
mean values than 40 min- and 1 h 30 min-sucrose fed.
In Experiment II, from first to last day, the lowest pH values were found for the
supernatants of 0.5% and 1% after the sucrose-fed (p<0.05). Within the first 5 days,
0.075%-, 0.15%-batch and 0.15%-semi-continuous presented only marginal
differences compared to the control (p>0.05); up to 10 days, all groups were
statistically different from the control (p<0.05). (Figure 1)
Table 1. Experiment I. DMM supernatants pH readings are presented for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days. Semi-continuous values presented are from pH readings after the sucrose-fed. batch semi-continuous 0.5% control 0.15% 0.5% 40 min 1 h 30 min 3 h DMM 4 days 6.0 ±0.16 4.3 ±0.04 5.4 ±0.34 5.1 ±0.35 4.8 ±0.04 7.5 ±0.15 7 days 6.5 ±0.18 4.3 ±0.05 5.9 ±0.68 5.9 ±0.88 5.6 ±0.85 7.7 ±0.24 10 days 6.3 ±0.58 4.3 ±0.16 5.8 ±0.67 5.7 ±0.70 5.3 ±0.61 7.5 ±0.41 Values are means ±SD
67
In Experiment III pH readings from the supernatants began before
chlorhexidine treatment was initiated (day 1). Mean pH values after sucrose-fed were
higher for the 0.12% CHX during the treatment period. Most significant differences
were noted at day 4, corresponding to the third day of treatments. (Figure 2)
Figure 1. Experiment II. pH mean values and standard deviationare represented by bars for sucrose regimens - batch and semi-continuous after sucrose-fed - and control. Lowercase anduppercase letters are for comparisons up to 5 days and 10 days,respectively. Distinct letters shows pH values that werestatistically different within treatments (p<0.05).
a A
a a B
b C b C
a D
A
68
3.2 Percentage of surface hardness change (%SHC) in enamel
In experiment I the %SHC was statistically similar within semi-continuous
subgroups and control in all time-points evaluated - 4, 7 and 10 days (p>0.05) (Figure
3). Within batch subgroups, the %SHC of 0.5%-sucrose could not be calculated due
to the impossibility to perform hardness readings after the determined time-points;
with 0.15%-sucrose the %SHC mean values were significantly different in each time-
point (p<0.05). (Figure 3)
Figure 2. Experiment III. pH mean values are represented by shapes foreach chlorhexidine (CHX) treatment and control (saline solution) up to 4days after the 6 h sucrose-fed; day 1 represent pH mean values beforeCHX treatment began and days 2, 3 and 4 are readings from each day oftreatment. Groups connected by vertical lines represent no statisticallysignificant differencesin each day (p>0.05).
69
Sucrose exposure significantly affected %SHC within groups from batch and
semi-continuous biofilm cultures in experiment II (p<0.001). Sucrose exposures of
0.075% -batch and 0.15%-semi-continuous did not differ from the control for %SHC
(p>0.05) (Figure 4). Within semi-continuous conditions, 1% and 0.5% sucrose
exposure presented similar %SHC (p>0.05). (Figure 4)
Figure 3. Experiment I. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presentedin bars for sucrose regimens and control up to 4, 7 and 10 days.Distinct letters shows %SHC that was statistically different withintreatments and time-points (p<0.05).
70
In experiment III, chlohrexidine treatment significanly affected %SHC in
enamel. Treatment with 0.12% solution was related to lower %SHC average values,
which were different from the control (p<0.05) but statistically similar to all other CHX
concentrations (p>0.05). (Figure 5)
Figure 4. Experiment II. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presented in bars for sucrose regimens and control. Distinct letters shows %SHC that was statistically different within treatments (p<0.05).
71
3.3 Bacterial counts
Total colony-forming units (CFU) per sample are presented with descriptive
statistics for experiments II and III in tables (Tables 2 and 3).
Figure 5. Experiment III. Mean values and standard deviation ofthe percentage surface hardness change (%SHC) are presented in bars for chlorhexidine treatments and control (saline solution). Distinct letters shows %SHC that was statistically different within treatments (p<0.05).
72
Table 2 � Descriptive statistics for microbial recovery from biofilm growth under the different sucrose regimens up to 5 and 10 days.
Control Batch Semi-Dynamic DMM 0.075% 0.15% 0.15% S1 0.15% S2 0.50% 1% S1 1% S2
total 4,8E+04 * 7,5E+05 * 1.3E+04 * 1.3E+06 ±1.2E+06 3.7E+07 ±4.4E+07 6.0E+06 ±4.9E+06 2.4E+08 ±4.6E+08 5.2E+06 ±2.8E+06
streptococci 5.8E+04 ±4.9E+04 2.6E+05 * 2.5E+04 * 3.1E+05 * 1.2E+06 ±5.7E+05 2.7E+06 ±4.1E+06 1.3E+06 ±4.0E+05 6.6E+06 ±4.1E+06
aciduric 4.8E+04 ±6.2E+04 2.9E+04 ±4.5E+04 4.5E+03 ±6.9E+03 5.8E+04 ±6.0E+04 2.4E+04 ±2.0E+04 6.0E+05 ±9.1E+05 4.9E+05 ±7.1E+05 1.4E+06 ±1.1E+06
mutans ND ND ND ND 2.5E+02 * ND ND ND
5 d
lactobacillus ND ND 3.8E+04 * 8.2E+04 ±6,1E+04 8.3E+04 * ND 4.5E+03 * 1.9E+03 ±1,8E+02
total 1.2E+08 ±2.4E+08 ND ND 4.3E+05 ±1.6E+05 3.3E+06 ±2.6E+06 4.4E+06 ±3.1E+06 4.5E+06 ±4.1E+06 1.8E+06 ±3.5E+05
streptococci 2.5E+05 ±3.6E+04 4.5E+04 ±2.8E+04 1.4E+05 * 1.8E+05 ±1.2E+05 7.6E+05 ±5.1E+05 1.5E+06 ±9.0E+05 1.3E+06 ±1.6E+05 8.8E+05 ±4.9E+05
aciduric 6.9E+04 ±4.1E+04 1.3E+04 ±1.4E+04 4.6E+03 ±1.7E+03 1.7E+05 ±1.3E+05 2.7E+04 ±1.8E+04 1.1E+04 ±3.2E+03 5.1E+05 ±8.4E+05 6.4E+05 ±5.7E+05
mutans 3.6E+03 ±4.1E+03 ND 3.5E+02 * 3.0E+04 ±2.9E+04 1.1E+05 ±1.6E+05 4.2E+04 ±1.8E+04 7.3E+04 ±9.5E+04 4.0E+05 ±5.4E+05
10 d
lactobacillus 2.8E+05 ±3.8E+05 ND ND 4.5E+04 * 1.9E+05 * 1.8E+05 ±1.2E+05 ND 1.4E+05 ±7.5E+04
Values are mean ± SD of CFU/mg of biofilm (w/w).
ND - Not Detected
* A single replicate was recovered.
73
Table 3. Descriptive statistics for microbial recovery from biofilms growth 24h after the last chlorhexidine (%) treatment. Control 0.012% 0.03% 0.06% 0.12%
total 1.9E+08 ±1.8E+08 1.7E+08 ±3.9E+07 1.2E+08 ±4.2E+07 8.6E+07 ±5.3E+07 8.5E+07 ±4.0E+07
aciduric 6.2E+07 ±4.5E+07 9.7E+07 ±7.6E+07 4.1E+07 ±3.6E+07 4.0E+07 ±3.2E+07 2.7E+07 ±2.3E+07
mutans 1.7E+05 ±8.8E+04 1.3E+05 * 3.5E+02 * 7.5E+05 ±5.5E+05 1.3E+05 ±5.8E+04
lactobacillus 4.3E+05 * 2.5E+06 ±2.6E+06 1.1E+05 ±1.1E+05 1.1E+06 ±1.8E+06 2.1E+06 ±2.4E+06
Values are means ± SD of CFU/mg of biofilm (w/w)* a single replicate was recovered.
74
4 Discussion
The present study used a microcosm biofilm model to induce cariogenic
activity and caries-like lesions formation in bovine enamel. Only a few studies deals
with pre-clinical models using multi-well plates and a simplified experiment design to
induce cariogenic challenge in vitro5,19, and only one model has been established for
demineralization studies under a reliable clinical-like treatment protocol5. The present
model is the first to study the dose-response effect to sucrose feeding regimens and
antimicrobial treatment on enamel demineralization under microcosm biofilm growth
in a simple method, using multi-well plates and human saliva as inoculum.
Instead of pooling saliva, each microcosm was grown from one single saliva
donor. The relevance of individualizing the microcosm relies on the possibility to
observe inter-individual differences22,23 what may be of interest in further evaluations
that can be performed with this model.
Within sucrose regimens some observations can be highlighted. Under batch
0.5% sucrose supplementation severe damage on enamel surface was noted,
irrespective of the time-points evaluated (4, 7 and 10 days). The resulting eroded
surfaces excluded the possibility of SH evaluation, and suggested that a constant low
pH would promote erosion lesions instead of subsurface carious lesions. The pH
observed for that condition was approximately 4.3 during the whole experiment, and
it is in agreement to the data reported by Filoche et al.19
Furthermore, a semi-continuous sucrose supplementation seemed desirable
to form biofilms with alternated nutritional availability and alternate pH conditions,
allowing demineralization and remineralization periods. Exposures from 40 min to 3 h
sucrose-fed did not cause significant %SHC in enamel compared to the control.
75
Therefore, in experiment II, the time of sucrose exposure was increased to 6 h and a
carious-like lesion developed in enamel maintaining an intact surface.
A dose-dependent response to chlorhexidine was observed in the model, for
both pH and mineral loss variables. The chlorhexidine concentrations used aimed to
produce a bacteriostatic effect24, and treatment was performed for one minute once a
day to simulate a clinical protocol. It is important to highlight that a pre-clinical model
should demonstrate dose-response effect to therapies applied in accordance with
clinical protocols, with short periods of exposure to the treatments and fast
clearance5, which was demonstrated in the present study.
The chlorhexidine treatment was applied after 24 h from inoculation, to allow
biofilm initial establishment. Analysed data revealed that after the first exposure, pH
values arisen, and kept higher than the control, especially for the 0.12% CHX
concentration, which could be associated with a longer effect of the treatment on
bacterial acidogenicity. The CFU counts analysis did not expresse differences among
treatments. Probably this was observed because biofilms were able to recover
(recalcitrance ability)25 as samples were collected after 24 h from the latest CHX
exposure.
A randomized in vivo study reported for the salivary bacterial counts tested,
that reduction of the selected species lasted for 5 h after rinsing with 0.12%
chlorhexidine mouthwashes26. In a different microcosm model, it was shown that in
the first day of chlorhexidine pulses there was a substantial microbial reduction, but
within 4 days (with continued treatments) the viable counts had rapidly recovered27.
Nonetheless it was found an altered bacterial composition27. Those questions can be
further addressed in the presented model by sampling biofilms within different
76
periods after last treatment exposure and more sensitive microorganisms�
identification techniques.
Anticariogenic therapies and dental materials behaviour have been extensively
carried out with single species biofilm models that could be complemented by
microcosm studies. Overall the presented model has considerable potential for use in
studies into the multivariate factors that may affect the cariogenic biofilm grown over
dental surfaces.
In conclusion, different levels of cariogenic activity and demineralization of
enamel surface were shown according to the sucrose regimens. The model with
intermittent sucrose supplementation is appropriate to evaluate the dose-response to
antibiotics and for studies of demineralization. However, further studies should be
carried out to test the model reproducibility and dose-response effect to other
anticariogenic agents.
.
77
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the undergraduate students, laboratory technicians, and Prof Dr
Evandro Piva head of CDC-Bio (Laboratory Center of Development and Control of
Biomaterials - Faculty of Dentistry, Federal University of Pelotas, Brazil).This study is
based on the first author�s master study (Graduate Program in Dentistry, Restorative
Dentistry Area, Faculty of Dentistry of Pelotas, Federal University of Pelotas, UFPel,
Brazil). The first and second authors received scholarships during this study from
CAPES � DS. PROCAD (251/2007) and PRODOC (420030/0-0) also supported this
study.
78
References
1. A. J. McBain, Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview, Adv Appl Microbiol 69 (2009) pp. 99-132.
2. A. C. Peters and J. W. Wimpenny, A constant-depth laboratory model film fermentor, Biotechnol Bioeng 32 (3) (1988) pp. 263-70.
3. A. J. McBain, C. Sissons, R. G. Ledder, P. K. Sreenivasan, W. De Vizio and P. Gilbert, Development and characterization of a simple perfused oral microcosm, J Appl Microbiol 98 (3) (2005) pp. 624-34.
4. C. H. Sissons, T. W. Cutress, M. P. Hoffman and J. S. Wakefield, A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization, J Dent Res 70 (11) (1991) pp. 1409-16.
5. B. Guggenheim, M. Guggenheim, R. Gmur, E. Giertsen and T. Thurnheer, Application of the Zurich biofilm model to problems of cariology, Caries Res 38 (3) (2004) pp. 212-22.
6. H. Altman, D. Steinberg, Y. Porat, A. Mor, D. Fridman, M. Friedman, et al., In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bacteria, J Antimicrob Chemother 58 (1) (2006) pp. 198-201.
7. L. Daneshmehr, K. Matin, T. Nikaido and J. Tagami, Effects of root dentin surface coating with all-in-one adhesive materials on biofilm adherence, J Dent 36 (1) (2008) pp. 33-41.
8. P. Totiam, C. Gonzalez-Cabezas, M. R. Fontana and D. T. Zero, A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries, Caries Res 41 (6) (2007) pp. 467-73.
9. S. L. Kinniment, J. W. Wimpenny, D. Adams and P. D. Marsh, Development of a steady-state oral microbial biofilm community using the constant-depth film fermenter, Microbiology 142 ( Pt 3) (1996) pp. 631-8.
10. M. Shu, L. Wong, J. H. Miller and C. H. Sissons, Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system, Archives of Oral Biology 45 (1) (2000) pp. 27-40.
79
11. T. Thurnheer, R. Gmur, S. Shapiro and B. Guggenheim, Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque, Appl Environ Microbiol 69 (3) (2003) pp. 1702-9.
12. B. Guggenheim, E. Giertsen, P. Schupbach and S. Shapiro, Validation of an in vitro biofilm model of supragingival plaque, J Dent Res 80 (1) (2001) pp. 363-70.
13. F. Dalwai, D. A. Spratt and J. Pratten, Modeling shifts in microbial populations associated with health or disease, Appl Environ Microbiol 72 (5) (2006) pp. 3678-84.
14. L. Wong and C. H. Sissons, Human dental plaque microcosm biofilms: effect of nutrient variation on calcium phosphate deposition and growth, Arch Oral Biol 52 (3) (2007) pp. 280-9.
15. M. S. Cenci, T. Pereira-Cenci, J. A. Cury and J. M. Ten Cate, Relationship between Gap Size and Dentine Secondary Caries Formation Assessed in a Microcosm Biofilm Model, Caries Res 43 (2) (2009) pp. 97-102.
16. G. Roeselers, B. Zippel, M. Staal, M. van Loosdrecht and G. Muyzer, On the reproducibility of microcosm experiments - different community composition in parallel phototrophic biofilm microcosms, FEMS Microbiol Ecol 58 (2) (2006) pp. 169-78.
17. J. W. Wimpenny, The validity of models, Adv Dent Res 11 (1) (1997) pp. 150-9.
18. E. Zaura and J. M. ten Cate, Dental plaque as a biofilm: a pilot study of the effects of nutrients on plaque pH and dentin demineralization, Caries Res 38 Suppl 1 (2004) pp. 9-15.
19. S. K. Filoche, K. J. Soma and C. H. Sissons, Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates, Oral Microbiol Immunol 22 (2) (2007) pp. 73-9.
20. L. Wong and C. Sissons, A comparison of human dental plaque microcosm biofilms grown in an undefined medium and a chemically defined artificial saliva, Arch Oral Biol 46 (6) (2001) pp. 477-86.
21. B. T. Amaechi, S. M. Higham and W. M. Edgar, Efficacy of sterilisation methods and their effect on enamel demineralisation, Caries Res 32 (6) (1998) pp. 441-6.
22. R. G. Ledder, P. Gilbert, A. Pluen, P. K. Sreenivasan, W. De Vizio and A. J. McBain, Individual microflora beget unique oral microcosms, J Appl Microbiol 100 (5) (2006) pp. 1123-31.
23. S. K. Filoche, D. Soma, M. van Bekkum and C. H. Sissons, Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment, FEMS Immunol Med Microbiol (2008).
24. L. G. Ribeiro, L. N. Hashizume and M. Maltz, The effect of different formulations of chlorhexidine in reducing levels of mutans streptococci in the oral cavity: A systematic review of the literature, J Dent 35 (5) (2007) pp. 359-70.
80
25. G. G. Anderson and G. A. O'Toole, Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms, Curr Top Microbiol Immunol 322 (2008) pp. 85-105.
26. D. Herrera, S. Roldan, I. Santacruz, S. Santos, M. Masdevall and M. Sanz, Differences in antimicrobial activity of four commercial 0.12% chlorhexidine mouthrinse formulations: an in vitro contact test and salivary bacterial counts study, J Clin Periodontol 30 (4) (2003) pp. 307-14.
27. J. Pratten and M. Wilson, Antimicrobial susceptibility and composition of microcosm dental plaques supplemented with sucrose, Antimicrob Agents Chemother 43 (7) (1999) pp. 1595-9.
81
5 CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo permitem inferir que:
- o modelo in vitro de biofilme de microcosmo utilizado permitiu a observação
de diferentes níveis de atividade cariogênica e desmineralização na superfície do
esmalte, de acordo com diferentes exposições ao desafio com sacarose.
- o modelo com suplementação intermitente (6h) de sacarose 1% é adequado
para avaliação de dose-resposta a antimicrobianos e para estudos de
desmineralização.
Contudo, mais avaliações devem ser realizadas para avaliar a
reprodutibilidade do modelo.
82
Referências
ANDERSON, G. G.; O'TOOLE, G. A. Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol, v.322, p.85-105. 2008. ANWAR, H.; STRAP, J. L.; COSTERTON, J. W. Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother, v.36, n.7, p.1347-1351, Jul. 1992. BERNARDO, M.; LUIS, H.; MARTIN, M. D.; LEROUX, B. G.; RUE, T.; LEITAO, J.; DEROUEN, T. A. Survival and reasons for failure of amalgam versus composite posterior restorations placed in a randomized clinical trial. J Am Dent Assoc, v.138, n.6, p.775-783, Jun. 2007. BOWDEN, G. H.; LI, Y. H. Nutritional influences on biofilm development. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.81-99, Apr. 1997. BRADSHAW, D. J.; MCKEE, A. S.; MARSH, P. D. Effects of carbohydrate pulses and pH on population shifts within oral microbial communities in vitro. J Dent Res, v.68, n.9, p.1298-1302, Sep. 1989. CENCI, M. S.; PEREIRA-CENCI, T.; CURY, J. A.; TEN CATE, J. M. Relationship between Gap Size and Dentine Secondary Caries Formation Assessed in a Microcosm Biofilm Model. Caries Res, v.43, n.2, p.97-102, Mar 24. 2009. CENCI, M. S.; TENUTA, L. M.; PEREIRA-CENCI, T.; DEL BEL CURY, A. A.; TEN CATE, J. M.; CURY, J. A. Effect of microleakage and fluoride on enamel-dentine demineralization around restorations. Caries Res, v.42, n.5, p.369-379. 2008. DAVEY, M. E.; O'TOOLE G, A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev, v.64, n.4, p.847-867, Dec. 2000. DELIGEORGI, V.; MJOR, I. A.; WILSON, N. H. An overview of reasons for the placement and replacement of restorations. Prim Dent Care, v.8, n.1, p.5-11, Jan. 2001. DONLAN, R. M.; COSTERTON, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, v.15, n.2, p.167-193, Apr. 2002. FEJERSKOV, O.; NYVAD, B.; LARSEN, M. J. Human experimental caries models: intra-oral environmental variability. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.134-143, Jul. 1994.
83
FILOCHE, S. K.; SOMA, D.; VAN BEKKUM, M.; SISSONS, C. H. Plaques from different individuals yield different microbiota responses to oral-antiseptic treatment. FEMS Immunol Med Microbiol, Jul 16. 2008. FILOCHE, S. K.; SOMA, K. J.; SISSONS, C. H. Caries-related plaque microcosm biofilms developed in microplates. Oral Microbiol Immunol, v.22, n.2, p.73-79, Apr. 2007. GUGGENHEIM, B.; GUGGENHEIM, M.; GMUR, R.; GIERTSEN, E.; THURNHEER, T. Application of the Zurich biofilm model to problems of cariology. Caries Res, v.38, n.3, p.212-222, May-Jun. 2004. IMAZATO, S.; KINOMOTO, Y.; TARUMI, H.; EBISU, S.; TAY, F. R. Antibacterial activity and bonding characteristics of an adhesive resin containing antibacterial monomer MDPB. Dent Mater, v.19, n.4, p.313-319, Jun. 2003. IMAZATO, S.; KURAMOTO, A.; TAKAHASHI, Y.; EBISU, S.; PETERS, M. C. In vitro antibacterial effects of the dentin primer of Clearfil Protect Bond. Dent Mater, v.22, n.6, p.527-532, Jun. 2006. KIELBASSA, A. M.; SCHULTE-MONTING, J.; GARCIA-GODOY, F.; MEYER-LUECKEL, H. Initial in situ secondary caries formation: effect of various fluoride-containing restorative materials. Oper Dent, v.28, n.6, p.765-772, Nov-Dec. 2003. KLEINBERG, I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev Oral Biol Med, v.13, n.2, p.108-125. 2002. LI, F.; CHAI, Z. G.; SUN, M. N.; WANG, F.; MA, S.; ZHANG, L.; FANG, M.; CHEN, J. H. Anti-biofilm effect of dental adhesive with cationic monomer. J Dent Res, v.88, n.4, p.372-376, Apr. 2009. MARSH, P. D. The role of microbiology in models of dental caries. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.244-254; discussion 255-269, Nov. 1995. MARSH, P. D. Dental plaque: biological significance of a biofilm and community life-style. J Clin Periodontol, v.32 Suppl 6, p.7-15. 2005. MARSH, P. D. Dental plaque as a biofilm and a microbial community - implications for health and disease. BMC Oral Health, v.6 Suppl 1, p.S14. 2006. MCBAIN, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Adv Appl Microbiol, v.69, p.99-132. 2009. MJOR, I. A. Clinical diagnosis of recurrent caries. J Am Dent Assoc, v.136, n.10, p.1426-1433, Oct. 2005. MJOR, I. A.; QVIST, V. Marginal failures of amalgam and composite restorations. J Dent, v.25, n.1, p.25-30, Jan. 1997.
84
MJOR, I. A.; TOFFENETTI, F. Secondary caries: a literature review with case reports. Quintessence Int, v.31, n.3, p.165-179, Mar. 2000. OPDAM, N. J.; BRONKHORST, E. M.; ROETERS, J. M.; LOOMANS, B. A. A retrospective clinical study on longevity of posterior composite and amalgam restorations. Dent Mater, v.23, n.1, p.2-8, Jan. 2007. PAPAGIANNOULIS, L.; KAKABOURA, A.; ELIADES, G. In vivo vs in vitro anticariogenic behavior of glass-ionomer and resin composite restorative materials. Dent Mater, v.18, n.8, p.561-569, Dec. 2002. PEREIRA-CENCI, T.; CENCI, M. S.; FEDOROWICZ, Z.; MARCHESAN, M. A. Antibacterial agents in composite restorations for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev, n.3, p.CD007819. 2009. RUBY, J.; BARBEAU, J. The buccale puzzle: The symbiotic nature of endogenous infections of the oral cavity. Can J Infect Dis, v.13, n.1, p.34-41, Jan. 2002. SARRETT, D. C. Clinical challenges and the relevance of materials testing for posterior composite restorations. Dent Mater, v.21, n.1, p.9-20, Jan. 2005. SHU, M.; WONG, L.; MILLER, J. H.; SISSONS, C. H. Development of multi-species consortia biofilms of oral bacteria as an enamel and root caries model system. Archives of Oral Biology, v.45, n.1, p.27-40, Jan. 2000. SISSONS, C. H. Artificial dental plaque biofilm model systems. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.110-126, Apr. 1997. SISSONS, C. H.; CUTRESS, T. W.; HOFFMAN, M. P.; WAKEFIELD, J. S. A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization. J Dent Res, v.70, n.11, p.1409-1416, Nov. 1991. TANG, G.; YIP, H. K.; CUTRESS, T. W.; SAMARANAYAKE, L. P. Artificial mouth model systems and their contribution to caries research: a review. J Dent, v.31, n.3, p.161-171, Mar. 2003. TEN CATE, J. M. In situ models, physico-chemical aspects. Adv Dent Res, v.8, n.2, p.125-133, Jul. 1994. TEN CATE, J. M. Biofilms, a new approach to the microbiology of dental plaque. Odontology, v.94, n.1, p.1-9, Sep. 2006. TENUTA, L. M.; RICOMINI FILHO, A. P.; DEL BEL CURY, A. A.; CURY, J. A. Effect of sucrose on the selection of mutans streptococci and lactobacilli in dental biofilm formedin situ. Caries Res, v.40, n.6, p.546-549. 2006.
85
THURNHEER, T.; GMUR, R.; SHAPIRO, S.; GUGGENHEIM, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol, v.69, n.3, p.1702-1709, Mar. 2003. TOTIAM, P.; GONZALEZ-CABEZAS, C.; FONTANA, M. R.; ZERO, D. T. A new in vitro model to study the relationship of gap size and secondary caries. Caries Res, v.41, n.6, p.467-473. 2007. TYAS, M. J. Placement and replacement of restorations by selected practitioners. Aust Dent J, v.50, n.2, p.81-89; quiz 127, Jun. 2005. WHITE, D. J. The application of in vitro models to research on demineralization and remineralization of the teeth. Adv Dent Res, v.9, n.3, p.175-193; discussion 194-177, Nov. 1995. WIEGAND, A.; BUCHALLA, W.; ATTIN, T. Review on fluoride-releasing restorative materials--fluoride release and uptake characteristics, antibacterial activity and influence on caries formation. Dent Mater, v.23, n.3, p.343-362, Mar. 2007. WIMPENNY, J. W. The validity of models. Adv Dent Res, v.11, n.1, p.150-159, Apr. 1997. WONG, L.; SISSONS, C. A comparison of human dental plaque microcosm biofilms grown in an undefined medium and a chemically defined artificial saliva. Arch Oral Biol, v.46, n.6, p.477-486, Jun. 2001.
86
Apêndices
87
Apendice 1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE) Eu, _________________________________________RG nº _______________, concordo em participar da pesquisa �DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO DE BIOFILME PARA AVALIAÇÃO DE POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE MATERIAIS RESTAURADORES�. Sei que a minha identidade não será revelada, que as informações sobre os exames somente serão vistas pelos pesquisadores e que será mantida a minha privacidade quando da publicação dos dados em revistas de odontologia. As coletas de saliva serão realizados na clínica odontológica da pós-graduação da Faculdade de Odontologia da UFPel, por examinadores, acompanhados por um pesquisador responsável. Os procedimentos realizados durante a pesquisa não oferecem riscos à minha saúde. Os pesquisadores garantem respostas a todas perguntas e esclarecimentos sobre dúvidas. Há a possibilidade de retirada do consentimento e desistência da participação em qualquer momento, mas enquanto estiver participando da pesquisa tenho o compromisso de fornecer informação atualizada e o dever de comparecer às consultas. É assegurada a gratuidade de todas as etapas da presente pesquisa. Este documento será revisado para aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta Instituição de atenção à saúde. Data __/__/____. _______________________________________________ Nome e assinatura
88
Apêndice 2
Experimento 1 (experimento III no artigo). Leituras de pH dos sobrenadantes do meio realizadas após a suplementação de 6h com sacarose 1% e após 18h em DMM. O dia 1 corresponde as leituras realizadas antes do tratamento com clorexidina ser iniciado; os dias consecutivos, as leituras após os tratamentos com as respectivas concentrações de clorexidina ou controle. dias 1 2 3 4
Sacarose DMM Sacarose DMM Sacarose DMM Sacarose DMM
controle 4,03 ± 0,01a 7,24 ±0,23ab 4,20 ±0,05a 7,16 ±0,06a 3,96 ±0,01a 7,55 ±0,08a 4,27 ±0,02a 7,92 ±0,06b
0,012% 4,04 ±0,02ab 7,61 ±0,05c 5,48 ±0,37ab 7,30 ±0,05a 4,40 ±0,08a 7,51 ±0,06a 4,45 ±0,06ab 7,79 ±0,06ab
0,03% 4,18 ±0,04ab 7,37 ±0,19bc 6,03 ±0,68ab 7,23 ±0,08a 5,07 ±0,78ab 7,40 ±0,11a 4,64 ±0,20b 7,77 ±0,03a
0,06% 4,19 ±0,02ab 7,05 ±0,09a 6,38 ±0,11ab 7,15 ±0,11a 5,74 ±0,40ab 7,46 ±0,07a 4,94 ±0,20c 7,81 ±0,07ab
0,12% 4,21 ±0,02b 7,22 ±0,05ab 6,62 ±0,04b 7,31 ±0,08a 6,46 ±0,10b 7,56 ±0,05a 6,35 ±0,16d 7,81 ±0,08ab
Valores expressam as médias ± DP. Em colunas, as diferenças estatísticamente significativas entre os tratamentos p<0,05 estão representadas por letras distintas em cada dia após 6h em sacarose e 18h em DMM.
89
Anexo
90