Fungos patogénicos: Um risco não avaliado em zonas balneares? Novas perspectivas da analise

da qualidade microbiologica de areias em Portugal

João Brandão*,

Helena Parada, Raquel Sabino, Cristina Veríssimo, Clélia Costa, Filipa C Ferreira, Raquel Rodrigues, Cecília Silva, Maria Ana Cunha

*Project Manager

Uma praia na regiao de Lisboa e Vale do Tejo num dia de novoeiro no Verão

Find wally!

Exemplos de infecções fúngicas transmissíveis pela areia a individuos saudáveis

População de risco acrescido para infecções fúngicas, comparativamente à população

geral, sem doenças concomitantes

Crianças

Idosos

Grávidas

1989 – grupo de Micologia começou a pesquisar fungos em

areias de praias em colaboração com a Direcção Geral de Saúde.

Durante10 anos, varias praias foram analisadas quanto à

flora fúngica por varias metodologias e abordagens.

Passado

• “From a recreational viewpoint, sand beaches are sought after.

Especially in higher latitudes, a significant percentage of time is spent

on the beach itself rather than in the water.”

• “A number of genera and species that may be encountered through

contact with sand are potential pathogens. Accordingly concerns has

been expressed that beach sand may act as reservoir of vectors of

infection.”

Organização Mundial de Saúde, 2003, in “Guidelines for safe recreational

water environments”, p118.

Projecto # 1 & 2

Estrutura/Metodos/Parâmetros/Padrões

2000 – 2002

&

2002 – 2006

Projecto 1: Estrutura da análise a areias de praias,

incluindo paranteros e metodologias associadas:

“Qualidade microbiológica de areias de praias litorais”

Participantes:

Associação Bandeira Azul da Europa, The Instituto Nacional de

Saúde Dr. Ricardo Jorge, Direcção Geral de Saúde, Instituto do

Ambiente, Instituo da Água, Camara Municipal deCascais,

Câmara Municipal de Viana do Castelo

210 amostras de areia

105 Amostras de água

3 praias por região:

1 Praia galardoada com a Bandeira Azul

1 Praia sem interferência humana directa

1 Praia com água documentada como de

má qualidade

5 Regiões – Colheitas

Bimensais durante 13

meses

Distribuição fúngica em água do mar, areia seca e areia molhada

Comentário: Apesar da luz directa do sol na superficie da areia, of fungos são bastante

resistentes sobrevivendo bastantes semanas à desidratação, como verificado ja em dois

trabalhos publicados aqui não referenciados.

Projecto 2: ICREW – “Improving Coastal and REcreational

Waters for all”

Financiamento Europeu (8M€), 5 Estados-membro, 19

instituições*,

7 acções piloto**

Reino Unido

Environment Agency (EA) www.environment-agency.gov.uk

Mersey Basin Campaign (MBC) www.merseybasin.org.uk

Blackpool Borough Council (BBC) www.blackpool.gov.uk

Preston City Council (PCC) www.preston.gov.uk

ICREW watersports website www.merseybasin.org.uk/watersports

Northwest Development Agency www.nwda.co.uk

Portugal

Instituto do Ambiente (IA) www.iambiente.pt

DRAOT de Alentejo (DRAOT) www.drarn-a.pt

Instituto Nacional de Saude Dr. Ricardo Jorge

Instituto Superior Tecnico www.ist.utl.pt

Direccao Geral da Saude www.dgsaude.pt

Instituto da Agua (INAG) www.inag.pt

Sub-Regiao de Saude de Portalegre

França

Conseil Regional de Bretagne www.region-bretagne.fr

Centre d’Etude et de Valorisation des Algues (CEVA) www.ceva.fr

IFREMER www.ifremer.fr

Direction regionale des sanitaires et socials de Bretagne (DRASS) www.sante.gouv.fr

SAUR France Region Ouest www.saur.fr

Espanha

Instituto Tecnologico de Canarias (ITC) www.itccanarias.org

Centro de Investigacion Fomento y Aplicacion de las Nuevas Tecnologias del Agua

Ireland

University College Dublin www.ucd.ie

*Instituições

•PA 1 - Sampling and data review

•PA 2 - Resolving diffuse pollution

•PA 3 - Developing pollution source tracking

•PA 4 - Forecasting bathing water quality

•PA 5 - Re-identification of recreational waters

•PA 6 - Sustainable sewage solutions

•PA 7 - Understanding and managing algae

**Acções Piloto:

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

35,00%

Ab

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Levedura

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sp.

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sp.

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sp.

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sp.

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p.

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sp.

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sp.

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sp.

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p.

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cla

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m s

p.

espécies

Abundância relativa das diferentes espécies na Areia Seca

Abundância relativa de fungos na areia seca de praias

litorais e interiores por género e/ou espécie

Parâmetros Micológicos 1/2

• Leveduras:

• Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos

e alergogénicos

• Dermatófitos:

Indicadores de contaminação fecal e matéria

orgânica

Indicadores de presença

animal, incluindo humanos

• Leveduras (géneros Candida, Cryptococcus e Rhodotorula),

• Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos e alergogénicos

(géneros Aspergillus, Fusarium, Scopulariopsis, Scedosporium,

Chrysosporium, Scytalidium, Histoplasma, Coccidioides, Exophiala,

Fonsecaea, Phialophora, e outros de relevância clínica com contagens

significativas (> 500 cfu/g)).

• Dermatófitos (géneros Microsporum, Epidermophyton eTrichophyton)

Parâmetros Micológicos 2/2

Parâmetros Bacteriológicos

• Coliformes

• Escherichia coli

• Enterococos

Factores que influenciam positivamente a qualidade das areias das praias

•Remoção de lixo – remoção frequente de lixo das areias e zonas

circundantes;

•Recipientes para o lixo – Tantos contentores quanto necessário e

apropriado ao longo da praia para facilitar a sua utilização;

•Descontaminação das areias – Baseado na experiencia de um

municipio q o faz regularmente à base de iodo (não expressa a opinião dos autores

desta comunicação);

•Zonas contíguas – Identificação e descontaminação de zonas

contiguas a praias com altos níveis de contaminação microbiológica

Factores que influenciam negativamente a qualidade das areias das praias

•Sobreutilização por parte de utilizadores

•Acesso a animais de estimação

•Acumulação de lixo

•Abandono de restos de pesca nos areais

•Presença ou visita noturna de roedores e outros animais não

domesticados

Projeto # 3

Consistência dos parâmetros e seus valores de referência

“Programa de monitorização da qualidade das areias”

Promoção: Associação Bandeira Azul da Europa

Laboratorios: INSA & APA

Duração: 2006-2010

Nº de praias monitorizadas: de 61 em 2006 até 81 em 2010

Nº de amostras de areia analizadas: 1206

Nº de praias monitorizadas durante 5 anos consecutivos: 33 (correspondendo a 495 de 1206 amostras)

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

Amostra 1Amostra 2

Amostra 3

17%

13%

27%

Algarve 2006 - 30 Beaches

Gestores de praias foram instruidos como controlar niveis microbiologicos

Resultado: Redução drástica dos niveis de contaminanets da primeira para as amostragens

seguintes após o primeiro de curso do projecto. Vide 2006 e 2010

Algarve 2006 x 2010

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

Amostra 1 Amostra 2

Amostra 3

29%

18%

15%

Algarve 2010 - 34 Beaches

Amostras que excederam pelo menos um dos valores de referência

Statistical review of the 33 beaches

monitored all 5 years

•60.4% das amostras revelaram-se positivas para as espécies

fúngicas de referência

•25.2% positivas para os três parâmetros bacterianos

•33.3% negativas para todos os parâmetros

•20.2% positivas para ambos os conjuntos paramétricos (fungos e

bactérias)

• Leveduras e dermatófitos tendem a aumentar presença ao longo do

verão

•Encontraram-se relações interessantes (ex. Scopulariopsis spp e

Dermatofitos leveduras e coliformes)

Alguns resultados

Parâmetros Bacteriológicos:

1. E. coli 25 ufc/g

2. Enterococos 10 ufc/g

Parâmetros Micológicos:

1. Leveduras 15 ufc/g

2. Fungos Filamentosos potencialmente patogénicos

e alergogénicos 17 ufc/g

3. Dermatófitos 8 ufc/g

Revisão dos limites propostos com base em percentis 95

Actualmente 1/2

•Prestamos o serviço à comunidade

•Testam-se métodos moleculares de detecção de dermatófitos

para responder mais rapidamente às análises (leva actualmente

3 semanas no mínimo)*

•Extensão deste tipo de análise a espécies muito específicas de

fungos, bactérias, virus (só em areias molhadas/água) e

parasitas, principalmente em areias importadas de outras

regiões geográficas para reposição de costa)

•Networking com outros grupos de investigação no tema

Actualmente 2/2

•Programa de monitorização 2006-2010 – terminou com participação de

cerca de ¼ das zonas balneares designadas em Portugal

•FEE Não avançou com integração do critério-guia para atribuição do

galardão Bandeira Azul

•Setembro 2011 – Workshop à porta fechada em Michigan City para

debater contaminações areia-agua e agua-areia – publicação em fase de

conclusão)

•2011-2012: INSA avança com análise molecular e detecção de vírus e

parasitas

•2012 Workshop para debater parâmetros e indicadores (publicação em

preparação)

•2013 lançamento de rede laboratorial com reunião annual e ensaios

laboratoriais

Análise molecular?

•dHPLC de DNA fúngico total extraído directamente da areia?

•Detecção de DNA de dermatófitos por PCR/qPCR em vez da

contagem e identificação de colónias viáveis?

•Identificação de leveduras por AFCE (Automated Fluorescence

Capilary Electrophoresis)?

Analise populacional por dHPLC

Detecção molecular de dermatófitos

•Recuperação de celulas pouco eficiente – 99% do que está na

areia, continua na areia

•Extracção directa de DNA de areia possível e funcional

•PCR de DNA de dermatófitos não dá sinal em amostras reais

por falta de DNA (baixa sensibilidade – solução: qPCR (vale o

custo?)

AFCE - Automated Fluorescent Capillary

Electrophoresis

AFCE por espécie

Fungal Presence in Archival Settings: Assessment Using Classic Culturing and Molecular

Biology Methods.Presentation at the ICOM-CC 16thTriennial Conference-Cultural Heritage /

Cultural Identity: the Role of Conservation.Lisbon, Septemeber, 2011 e submetido para

publicação

AFCE – amostra mista

AFCE – amostra mista

Análise Molecular - conclusão

Detecção de dermatófitos por PCR em tempo real: única

vantagem e em caso de urgência de resposta – análise

qualitativa – não quantitativa

Algarve