Diagnóstico de Patogénicos em Alimentos

Universidade do Minho

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Diagnóstico de Patogénicos em Alimentos

Unidade Curricular: Biotecnologia Alimentar

Docentes: José Teixeira, Carla Oliveira, Lígia Rodrigues

Data de entrega: 10-10-2010

Autores:

Duarte Filipe da Silva Martins 52497

Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516

Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Biotecnologia Alimentar


Resumo

A segurança alimentar é uma meta global de saúde podendo as doenças causadas por alimentos

levar a uma grave crise ao nível da saúde mundial. O diagnóstico de patogénicos nos alimentos é uma das

soluções para a prevenção e para o reconhecimento dos problemas relacionados com a segurança e saúde

alimentares. Deste modo, o objectivo deste trabalho passa por fazer, não apenas uma revisão global dos

métodos de diagnóstico de patogénicos em alimentos, mas também descrever métodos convencionais e

rápidos, desenvolvimentos recentes, identificação e quantificação.

Métodos convencionais de diagnóstico de patogénicos, como métodos de contagem de colónias,

podem demorar várias horas ou até mesmo alguns dias para ser obtida uma resposta, o que é obviamente

insuficiente. O avanço da biotecnologia é importante para um desenvolvimento contínuo de métodos que

permitam o diagnóstico de patogénicos de uma forma mais rápida e confiável. Desenvolvimentos no campo

da imunologia, da biologia molecular, da automação e das tecnologias de computação continuam a ter um

efeito positivo no desenvolvimento de métodos tradicionais da microbiologia alimentar quanto à rapidez, à

sensibilidade e à especificidade. Métodos modernos são baseados em técnicas da biologia molecular, como

o PCR, em ensaios imunológicos, como ELISA, imunofluorescência e separação imunomagnética, em

técnicas físicas e bioquímicas com a aplicação de biosensores, como a bioluminescência e biosensores

analíticos utilizando enzimas, anticorpos e ácidos nucléicos.

São necessários estudos contínuos relativamente a técnicas de separação de microrganismos das

matrizes alimentares e concentração destes antes da sua detecção no melhoramento da segurança

alimentar por ensaios imunológicos e ensaios baseados em ácidos nucléicos. A possibilidade de

combinações de diferentes métodos deve ser ainda explorada. Porém, desenvolvimentos em protocolos de

ensaios imunológicos e PCR devem resultar num diagnóstico quantitativo de microrganismos e

simultaneamente, de mais do que um patogénico ou toxina.

Palavras-chave: patogénicos, alimentos, métodos rápidos, métodos tradicionais, ensaios imunológicos,

biosensores, ELISA.


Índice

1. Introdução.................................................................................................................................................................................. 1

2. Patogénicos nos alimentos, desafios e riscos associados .............................................................................................................. 3

2.1 Desafios ............................................................................................................................................................................... 5

3. Métodos de detecção de patogénicos ......................................................................................................................................... 5

3.1 Métodos Tradicionais ........................................................................................................................................................... 6

3.1.1 Método de contagem de células viáveis ........................................................................................................................ 6

3.2. Métodos rápidos ................................................................................................................................................................. 6

3.2.1. Técnicas biofísicas........................................................................................................................................................ 7

3.2.1.1 Contagem de células fluorescentes por microscopia ................................................................................................... 7

3.2.2. Técnicas bioquímicas ................................................................................................................................................... 8

3.2.2.1 ATP Bioluminescência............................................................................................................................................ 8

3.2.3. Ensaios imunológicos ................................................................................................................................................... 8

3.2.3.1. Ensaio de ELISA/EIA .............................................................................................................................................. 9

3.2.3.2. Ensaios de aglutinação com látex (LA) ................................................................................................................. 10

3.2.3.3. Ensaios de imunodifusão .................................................................................................................................... 10

3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência ............................................................................................................................ 11

3.2.3.5 Ensaio de separação imunomagnética (IMS) ........................................................................................................ 11

3.2.4 Ensaios de hibridação de ácidos nucleicos ................................................................................................................... 12

3.2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR).......................................................................................................................... 13

3.2.5. Biosensores ............................................................................................................................................................... 13

3.2.5.1 Biorreceptors ...................................................................................................................................................... 14

3.2.5.1.1 Anticorpos ................................................................................................................................................... 14

3.2.5.1.2 Enzimas ....................................................................................................................................................... 14

3.2.5.1.3 Ácidos Nucleicos .......................................................................................................................................... 15

3.2.5.1 Transdutores ....................................................................................................................................................... 15

3.2.5.1.1 Óptico ......................................................................................................................................................... 15

3.2.5.1.2. Electroquímico ............................................................................................................................................ 15

3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa .................................................................................................................................. 15

4. Mercado dos Métodos de Diagnósticos em Alimentos ............................................................................................................... 16

5. O Futuro das técnicas actuais .................................................................................................................................................... 17

5.1 Contagem das células viáveis .............................................................................................................................................. 17

5.2 Monitorização da Higiene ................................................................................................................................................... 18

5.3 Ensaios imunológicos ......................................................................................................................................................... 18

5.4 Biossensores e microarrays ................................................................................................................................................ 18

5.5 Ensaios baseados em ácidos nucleicos ................................................................................................................................ 18

6. Conclusão ................................................................................................................................................................................. 18

7. Bibliografia ............................................................................................................................................................................... 19

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 1 Biotecnologia Alimentar

1. Introdução

De acordo com a Codex Alimentarius Commission sobre a higiene dos alimentos, a segurança

alimentar é definida como a garantia de que os alimentos não causam danos ao consumidor, ao nível sa

saúde, quando preparados e/ou consumidos, de acordo com a sua intenção de uso. Esta definição é, no

entanto, dificultada pela ressalva de que não pode ser obtido um nivel absoluto de segurança alimentar.

Por conseguinte, foi reconhecido que, ao invés, um nível de risco aceitável deve ser definido (von

Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

Em todo o mundo, a produção, a preparação e distribuição de alimentos têm se tornado cada vez

mais mais complexas, e as matérias-primas são frequentemente encontradas globalmente. As alterações

das técnicas de processamento de alimentos e o surgimento de novos agentes patogénicos mudaram a

epidemologia de doenças de origem alimentar. Nas últimas décadas, as principais doenças humanas

provocadas por agentes patogénicos encontram-se relacionadas com o consumo de carne mal processada,

(salsichas, salame fatiado), com produtos lácteos (queijos feitos com leite não pasteurizado, manteiga) ou

frutas e verduras (Bhunia, 2007; Altekruse et al., 2006; CDC, 2006; Doyle and Erickson, 2006; Lynch et al.,

2006).

Os agentes patogénicos são ubíquos sendo potencialmente perigosos nos alimentos, no solo e na

água, podendo conduzir por vezes, a mortes indesejadas. A presença de patogénicos nos produtos para

consumo é uma séria preocupação devido ao facto de muitos deles não receberem nenhum tratamento

antes do seu consumo. Os alimentos de origem animal são os principais locais de proliferação de muitos

dos agentes patogénicos conhecidos (Biswas et al., 2008). A aplicação de dejectos não tratados nos

terrenos agrícolas, pode contaminar o solo ou a água e, eventualmente, transmitir microrganismos

indesejados para as frutas e legumes (Brandl, 2006; Solomon et al., 2002). Os mariscos são outra fonte de

potenciais patogénicos, como o Vibrio, Listeria, Yersinia, Salmonella, Shigella, Clostridium, Campylobacter e

Hepatite A (Carter, 2005; Feldhusen, 2000). As doses infecciosas de muitos destes patogénicos são muito

baixas (1 a 10 células bacterianas).

Os microrganismos sofrem continuamente mudanças devido à sua capacidade intrínseca de evoluir e

se adaptarem às diferentes formas de stress a que são sujeitos. Novas tecnologias de produção primária e

práticas de fabrico de alimentos são constantemente desenvolvidas. A obtenção da segurança alimentar

deve ser vista como um processo contínuo, que é afectado por factores ambientais, sócio económicos,

políticos e factores culturais. Os consumidores estão cada vez mais conscientes dos problemas de

segurança alimentar, como resultado do uso de anúncios publicitários pelos meios de comunicação acerca

das eventuais doenças de origem alimentar (Griffiths, 1993; Chang, 2000; Park, 2001).

Critérios de obtenção de um produto final e diagnósticos microbiologicos são tradicionalmente

utilizados para avaliar a segurança de um produto alimentar e para definir critérios de rejeição ou aceitação

de um lote de alimentos. No entanto, esta abordagem possui algumas limitaçoes especialmente para

diagnóstico de patogénios que occorem em números reduzidos e à distribuição não homogénea destes. O


desenvolvimento da biotecnologia tem alterado em muito, os métodos de análise de alimentos e existem

inúmeras empresas que desenvolvem activamente ensaios que são específicos, mais rápidos e muitas vezes

mais sensíveis do que os métodos tradicionais. (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002; De Boer e

Beumer, 1999). Um método rápido pode ser um ensaio que dá resultados em tempo real ou

instantaneamente, mas por outro lado, pode ser uma simples modificação de um procedimento que reduz

o tempo de ensaio. O grau de eficiência de um método rápido é determinado pelo seu alcance, tipo de

diagnóstico necessário, volume das amostras a serem testadas, disponibilidade de pessoal habilitado e

pelas práticas de fabrico (Vasavada, 1993).

Para garantir a segurança de produtos alimentares é importante a implementação de programas de

gestão da segurança alimentar como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) como parte de

Boas Práticas de Fabricação (BPF) e medidas sanitárias no controlo da qualidade dos produtos. A gestão da

segurança alimentar utiliza ferramentas de informação científica de modo a serem identificados pontos

críticos de contaminação na cadeia alimentar e nos processos de produção. No entanto, a quantidade de

dados fiáveis é muitas vezes limitada e portanto, a sua obtenção é umas das prioridades para futuras

estratégias de segurança alimentar. A análise de alimentos com vista à detecção de patogénicos é uma

prática comum e de extrema importância para garantir a segurança e a qualidade alimentares (Doyle,

2001).

http://en.wikipedia.org/wiki/Hazard_Analysis_and_Critical_Control_Points


2. Patogénicos nos alimentos, desafios e riscos associados

Através da análise da media e da observação da literatura científica, hoje reconhece-se que as doenças transmitidas por alimentos são um problema

mundial, e por isso, não são restritas a um nenhum país. Dessa forma, os alimentos contaminados por patogénicos são de grande preocupação para saúde pública

mundial, visto que, os custos, em termos de doenças humanas e perdas económicas para as empresas e para o sector de saúde pública, podem ser imensos.

Ao longo do tempo, o espectro de patogénicos muda substancialmente, por várias razões. Os patogénicos cujo veículo de transmissão é bem entendido,

podem ser controlados; outros podem surgir através mutação, ou podem transferir-se para um novo grupo da cadeia alimentar. Dessa forma, os patogénicos

emergentes são objecto de muita pesquisa e discussão, exigindo novos desafios para a sua identificação e controle (Tauxe, 2002). As principais características de

organismos considerados patogénicos emergentes encontram-se na tabela 1.

Tabela 1. Microrganismos patogénicos presentes em alimentos, responsáveis pela transmissão de doenças (adaptado de Velusamy et al., 2010).

Microrganismo Alimentos associados Dose doentia (nº de m.o.)*

Tempo de incubação**

Sintomas Doença

Campylobacter jejuni

Leite cru, carne crua ou mal cozida, aves, marisco

400 - 500 2 a 5 dias Febre, dor de cabeça, dores musculares, diarreia, dor abdominal e náuseas

Campilobacteriose

Salmonella spp. Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru e

lacticínios, chocolate, aves, carnes, frutos do mar, saladas e especiarias

15 - 20 12 a 24 horas Dor de estômago, dor de cabeça, febre, calafrios, náuseas, diarreia

Salmonelose

Escherichia coli Ovos crus, ovos mal cozidos, leite cru,

lacticínios, aves, carnes, frutos do mar, vegetais folhosos

< 10 2 a 4 dias Dor de estômago, dor de cabeça, febre, calafrios, náuseas, diarreia,

Colite hemorrágica

Listeria monocytogenes

Queijo de pasta mole, leite cru, gelado mal processado, vegetais folhosos crus, carnes cruas, aves

< 102 2 dias a 3 semanas

Dor nas costas, dor de cabeça, febre, calafrios e, por vezes, dor abdominal e diarreia

Listeriose

Bacillus cereus Carnes, leite, legumes, peixes, massas,

arroz queijo > 106/g 30 minutos a 15

horas Dor abdominal, náuseas, vómitos, diarreia, cãibras

Intoxicação por Bacillus cereus


Tabela 1. (continuação).

Microrganismo Alimentos associados Dose doentia (nº de m.o.)*

Tempo de incubação**

Sintomas Doença

Clostridium botulinum

Alimentos indevidamente enlatados, alimentos embalados a vácuo, alimentos firmemente embalados

< nanogramas 12 a 36 horas Visão dupla, pálpebras secas, dificuldade em falar e engolir, dificuldade em respirar

Bolutismo (transmitido por alimentos)

Clostridium perfringens

Carnes mal cozidas, produtos de carne, molhos

> 108 8 a 22 horas Cólicas abdominais e diarreia Intoxicação por C. perfringens

Shigella Saladas, vegetais crus, produtos

lácteos, aves < 10 12 a 50 horas Dor abdominal, cólicas, febre, vómitos,

diarreia contendo sangue e/ou muco Shigelose

Yersinia enterocolitica

Carne (principalmente de porco), ostras, peixes, leite cru

Desconhecida 1 a 3 dias Diarreia e/ou vómito, febre, dor abdominal Yersinose

Vibrio parahaemolyticus

Peixe cru ou mal cozido, marisco, ostras

> 105 4 horas a 4 dias Dor abdominal, dor de cabeça, febre, calafrios, náuseas, vómitos, diarreia

Gastroenterite (associada a V. parahaemolyticus)

Vibrio vulnificus Ostras cruas ou recontaminadas,

mariscos e caranguejos < 100 < 16 horas Diarreia e infecções com ferida Septicemia

primária Hepatitis A virus Sanduíches, frutas, sumos de frutas,

leite, lacticínios, verduras, saladas, mariscos, bebidas geladas

10 a 100 Desconhecido Febre, mal-estar, náuseas, anorexia, dor abdominal, desconforto, icterícia

Hepatite A

Norwalk virus/Norovirus

Ostras cruas/crustáceos, água, gelo, saladas, geada

Desconhecida (presume-se ser baixa)

1 a 2 dias Náuseas, vómitos, diarreia, cólicas abdominais

Gastroenterite viral

** dose doentia: quantidade de agente que deve ser consumida para dar origem a sintomas de doenças transmitidas por alimentos.

** tempo de incubação: duração entre o consumo de um alimento contaminado e o aparecimento dos primeiros sintomas da doença.


2.1 Desafios

O diagnóstico de patogénicos microbianos e toxinas nos alimentos defronta-se com muitos desafios

associados à análise de alimentos. A complexidade das matrizes dos alimentos e da sua composição,

apresenta-se como um grande obstáculo no desenvolvimento e preparação de amostras e estratégias de

diagnóstico. A detecção eficiente dos patogénicos alvos a partir de matrizes de alimentos é bastante difícil

em produtos avícolas, ovos e carnes. Além disso, os alimentos crus geralmente apresentam níveis altos de

flora normal, o que pode interferir no desempenho de métodos tecnológicos na detecção de patogénicos.

Por outro lado, os atributos dos patogénicos alvos têm também um impacto significativo sobre a

eficiência da detecção. Ao contrário das amostras clínicas, os patogénicos em alimentos estão geralmente

presentes em menor quantidade. Além disso, a distribuição heterogénea dos patogénicos e toxinas nos

alimentos representam um grande desafio no processamento eficaz dos mesmos, especialmente quando

estes causam doenças graves no ser humano em reduzidas doses.

Outro desafio importante para a detecção de patogénicos e toxinas nos alimentos está relacionado

com o rácio entre a quantidade de amostras de alimentos e o volume de ensaios de detecção, que é

particularmente notável no domínio das tecnologias avançadas nas quais somente uma pequena fracção de

amostras de alimentos original é submetida ao ensaio de detecção efectiva.

Devido a estes desafios, é importante que sejam implementadas estratégias de preparação de amostra

eficientes, antes de serem submetidas efectivamente a métodos de detecção de patogénicos (Ge e Meng,

2009).

3. Métodos de detecção de patogénicos

Um diagnóstico completo de patogénicos e toxinas nos alimentos abrange três etapas: a recolha da

amostra, a preparação da amostra e o ensaio de detecção. Como os patogénicos se apresentam

geralmente em número reduzido nos produtos alimentares, o processamento de grandes volumes de

amostra é muitas vezes necessário para a obtenção de uma detecção eficaz. Vários métodos de detecção

de patogénicos nos alimentos têm sido utilizados. O uso de combinações de métodos podem ser

efectuados, tendo a vantagem de apresentar uma maior sensibilidade e especificidade de diagnóstico e um

grau de detecção rápida (Ge e Meng, 2009).

Existem dois tipos de métodos microbiológicos: os métodos tradicionais e os métodos rápidos. Os

métodos tradicionais são ainda considerados como “padrão de ouro” e são muitas vezes exigidos pela

legislação internacional e nacional como os métodos de controlo oficial. A designação de métodos rápidos

é usada para diferentes tipos de diagnósticos incluindo, técnicas bioquímicas e biofísicas, ensaios

imunológicos, ensaios de hibridização de ácidos nucleicos e biosensores.


3.1 Métodos Tradicionais

Tradicionalmente, a detecção e identificação de patogénicos baseiam-se principalmente na

identificação microbiológica e bioquímica. Embora estes métodos possam ser baratos, sensíveis e dar

informações sobre o número e a natureza dos microrganismos diagnosticados, são muito limitados pelo

tempo de ensaio, sendo necessário um enriquecimento inicial para detectar os patogénicos. Cultura é o

termo utilizado para descrever a amplificação biológica de microrganismos cultiváveis usando meios de

cultura artificiais. Estes meios podem ser líquidos (caldo), sólidos (adição de ágar para ser utilizado como

superfície de apoio ao crescimento), enriquecidos (substratos que promovem o crescimento) e selectivos

para reduzir o crescimento de espécies indesejáveis, ou conter indicadores específicos para revelar o

crescimento de espécies de interesse. Os microrganismos têm inicialmente de ser recuperados em culturas

puras e o seu crescimento requer valores de temperatura e condições físico-químicas adequadas (Vidová et

al., 2008).

3.1.1 Método de contagem de células viáveis

O método tradicional mais comum é o da contagem de células viáveis baseada na cultura de

microrganismos em placas de Petri e permite a enumeração de microrganismos. Originalmente, este

método foi introduzido para uma total contagem de células viáveis com a posterior introdução de uma

contagem diferencial de modo a ser quantificada a presença de patogénicos. O número de células viáveis é

determinado pelo cálculo do número de unidades formadoras de colónias (UFC) por mililitro ou grama de

amostra. Isto é conseguido pela diluição da amostra inicial, através de diluições em série devido ao facto de

uma placa não diluída, poder conter inúmeras colónias que impedem a sua contagem exacta. Embora as

contagens sejam de fácil execução e baratas, estas são demoradas em termos de operação e de obtenção

de dados. Geralmente, este método demora 3 dias para determinar a contagem total de células viáveis e 5

a 7 dias para detectar organismos patogénicos específicos e utiliza grandes quantidades de reagentes. Este

fornece informações sobre a qualidade dos alimentos, sua deterioração e segurança alimentar (von


3.2. Métodos rápidos

A maioria dos métodos rápidos tenta substituir a etapa de plaqueamento selectivo e diferencial

característico dos métodos tradicionais por técnicas mais rápidas. O diagnóstico de patogénicos requer

métodos sensíveis pois, para muitos patogénicos a sua tolerância nos alimentos é zero. Para obter tal

sensibilidade, a maioria dos métodos actuais necessitam de, pelo menos, uma etapa de enriquecimento,

geralmente um período mínimo de incubação de 6 a 48 horas. Idealmente, os métodos rápidos devem

permitir uma avaliação rápida dos parâmetros microbianos dos alimentos para permitir uma rápida acção

correctiva. Estes oferecem vantagens em termos de tempo de análise, mas também podem dar a


possibilidade de eliminar etapas intensivas de trabalho e adquirir altos níveis de automação. Sendo assim,

os métodos devem ter alta sensibilidade, alta especificidade, alta precisão, ser rápido, robusto e barato.

(von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

3.2.1. Técnicas biofísicas

As técnicas biofísicas são usadas para a obtenção de informação quantitativa sobre sistemas

biológicos ao nível atómico ou molecular.

Neste domínio, realizam-se pesquisas direccionadas para o esclarecimento das interacções entre os

diversos sistemas de uma célula, incluindo as interacções entre o DNA, RNA e síntese proteica, além de

como estas interacções são reguladas. Baseada na medição da actividade metabólica dos microrganismos,

uma grande variedade de técnicas é usada para responder a essas questões tais como: contagem, por

microscopia, de células fluorescentes (após filtração e coloração com alaranjado de acridina); determinação

da impedância/condutância (associada à quebra de moléculas de elevado peso molecular em moléculas

mais pequenas e carregadas); microcalorimetria (medição do calor libertado pela actividade metabólica);

radiometria/espectrofotometria de Infravermelhos (detecção do CO2 produzido pela actividade

metabólica).

3.2.1.1 Contagem de células fluorescentes por microscopia

O primeiro princípio adjacente a esta técnica de diagnóstico envolve a filtração de células. Os filtros

de membrana (de nitrocelulose, nylon, poliéster) são utilizados na modificação dos métodos tradicionais

com várias finalidades: concentração dos organismos-alvo para melhorar o limite de detecção, remoção de

inibidores de crescimento, e transferência dos organismos do meio de crescimento por ressuspensão sem

danos físicos. As amostras de alimentos filtradas, são posteriormente, pré-tratadas com detergentes e

enzimas proteolíticas, filtradas em membrana de policarbonato colorada com laranja de acridina e,

finalmente, são examinadas em microscópio de fluorescência. Desta forma, o número de células viáveis é

determinado com base na contagem de células cor-de-laranja no filtro e pode ser realizada em cerca de 10

minutos (Mandal et al., 2010).

Este procedimento, contém naturalmente as suas limitações: a coloração do laranja de acridina

faculta informações sobre a presença e identificação de microrganismos que podem estar presentes na

amostra, a necessidade de aproximadamente 104 CFU/mL para a detecção de patogénicos, a coloração

com laranja de acridina não distingue organismos Gram-positivos de Gram-negativos, certos tipos de

detritos podem emitir fluorescência quando sujeitos a coloração com laranja de acridina (BD, 2010).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula


3.2.2. Técnicas bioquímicas

A identificação de microrganismos por métodos tradicionais usando diferentes testes bioquímicos é

um trabalho intensivo. Novos sistemas de diagnósticos têm sido desenvolvidos, sendo estas técnicas

usualmente denominadas de técnicas bioquímicas modernas, que são amplamente utilizadas e tem uma

grande importância em práticas laboratoriais.

São utilizadas para o diagnóstico de patogénicos, as seguintes técnicas bioquímicas:

bioluminescência (determinação do ATP, monitorização da higiene, qualidade do produto, carga

microbiana); actividade de catalase (quantificação da carga microbiana); hidrólise do MUG (detecção por

fluorescência, detecção de E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella); análise fotométrica de alterações

bioquímicas (identificação microbiana); análise colorimétrica de alterações bioquímicas (quantificação da

carga microbiana). Ao usar estes métodos, as análises podem ser concluídas de forma rápida e com custos

baixos.

3.2.2.1 ATP Bioluminescência

Todas as células, quer estejam vivas ou mortas, contêm a molécula de adenosina trifosfato (ATP),

que pode ser analisada utilizando um complexo enzima e coenzima (Luciferase-Luciferina). Os

luminómetros quantificam a produção total de luz da amostra, que é directamente proporcional à

quantidade de ATP (Mandal et al., 2010).

É necessário um mínimo de 140 células para produzir um sinal sendo o limite de detecção

equivalente a 1000 células bacterianas (1pg ATP). Este método carece de especificidade, mas devido à

rápida obtenção de resultados, é apropriado para a gestão dos programas de HACCP. Como já referido, o

ATP está presente em células mortas e vivas. Para determinar o ATP proveniente de células vivas, utilize-se

uma extracção selectiva. O ATP de células mortas começa por ser extraído com detergente não-iónico e é,

em seguida, destruído com altos níveis de ATPase por 5 minutos. Posteriormente, quantifica-se o ATP de

interesse extraindo-o com ácido tricloro-acético (5%) ou com um solvente orgânico (acetona, etanol ou

clorofórmio) (Mandal et al., 2010).

3.2.3. Ensaios imunológicos

Os ensaios imunológicos com anticorpos são talvez das únicas tecnologias que têm sido utilizadas

com sucesso na detecção de células de bactérias, esporos, vírus e toxinas (Iqbal et al., 2000). Métodos

baseados nas ligações antigene-anticorpo são amplamente utilizados na determinação de patogénicos de

origem alimentar. Métodos baseados na imunologia têm sido usados na detecção de Escherichia coli,

Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcal enterotoxins (Velusamy et al., 2010). A fim de garantir

a confiança na detecção de patogénicos alimentares usando métodos baseados em anticorpos, a influência

do stress nas reacções de anticorpos deve ser cuidadosamente examinada e entendida, assim como as


actividades fisiológicas das células, que são muitas vezes alteradas em resposta desse stress (Hahm e

Bhunia, 2006).

O princípio básico dos ensaios imunológicos é a ligação dos anticorpos a um antigene alvo, seguido

pela detecção do complexo antigene-anticorpo. Os anticorpos são produzidos pelo corpo em resposta a

uma invasão de um patogénico específico. Experimentalmente, essas moléculas são produzidas em animais

de laboratório contra um componente antigénico específico do patogénico ou toxina. A característica mais

importante de um anticorpo é a sua capacidade de reconhecer apenas o antigene alvo na presença de

outros organismos ou outros compostos presentes nos alimentos. Além disso, o sucesso do uso de

anticorpos para a detecção de patogénicos, depende da expressão do antigene alvo de um patogénico, que

muitas vezes é influenciado pela temperatura, conservantes, ácidos, sais ou outros produtos químicos

constituintes dos alimentos.

Apesar do tempo de ensaio ser muito menor em comparação com os métodos tradicionais, ainda é

incompleta a capacidade de detectar microrganismos em “real-time” (tempo-real). Se as quantidades de

patogénicos forem suficientemente altas, os ensaios imunológicos podem ser utilizados para fornecer

informações em tempo real mas, podem surgir problemas como a baixa sensibilidade dos ensaios, baixa

afinidade do anticorpo para o patogénico e a potencial interferência de contaminantes. (Meng e Doyle,

2002).

Durante as últimas décadas, foram desenvolvidas inúmeras técnicas imunológicas na detecção de

contaminações microbianas, tornando-se num método mais sensível, específico, reprodutível e confiável,

para uma ampla variedade de microrganismos e seus produtos. Neste trabalho será dada importância a

alguns ensaios imunológicos: ensaios de ELISA/EIA, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação com

latéx, ensaios imuno-fluorescentes (FIA) e ensaios de separação imunomagnética.

3.2.3.1. Ensaio de ELISA/EIA

O ensaio de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ou EIA (enzyme immunoassay) é o

formato de ensaio de anticorpos de maior prevalência para a detecção de patogénicos nos alimentos.

Normalmente, é concebido como um ensaio de “sanduíche” onde, um anticorpo ligado a uma matriz sólida

(anticorpo primário) é utilizado para capturar o antigene de culturas de enriquecimento (etapas 1 e 2,

figura 1) . As paredes dos poços de uma placa de poliestireno (placa de 96 poços) são o suporte sólido mais

utilizado, sendo exemplos de outros suportes, sondas, pás, membranas e pontas de pipeta. Os antigenes

não ligados são lavados (etapa 3, figura 1) e os complexos antigene-anticorpo são detectados com a

utilização de um segundo anticorpo, estando este, conjugado a uma enzima, a qual é específica para um

epítopo diferente no antigene (etapa 4, figura 1). Do mesmo modo, os anticorpos não ligados nesta etapa

são lavados. Uma substância é adicionada para que a enzima a possa converter num sinal detectável,

normalmente numa alteração da cor do substrato químico (etapas 5 e 6, figura 1). A quantidade de enzima


presente é quantificada através da determinação colorimétrica do substrato. O limite de detecção de uma

ELISA encontra-se entre . Uma incubação overnight para detectar patogénicos com

baixa ocorrência é necessária (FDA, 2009; Vidová et al., 2008; von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

As etapas de um ensaio ELISA são mostradas na figura 1.

Figura 1. Etapas básicas de um ensaio ELISA (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

3.2.3.2. Ensaios de aglutinação com látex (LA)

Os ensaios de aglutinação são os mais simples na utilização de anticorpos para análise de

alimentos. Os anticorpos, revestidos com esferas de látex coloridas, são utilizados para aglutinar antigenes

específicos de modo a ser formado um precipitado visível. Apesar da reacção de aglutinação ser

extremamente simples e ocorrer quase de imediato, possui reduzida sensibilidade e requer cerca de

células para a sua ocorrência. Contudo, este pode ser até 100 vezes melhor do que os ensaios

tradicionais. Na detecção de toxinas patogénicas, este formato de ensaio é conhecido como aglutinação

reversa passiva em látex (RPLA) porque, os anticorpos estão fixos (reverso) nas esferas de látex (matriz

passiva) e são usados para detectar os antigenes solúveis (toxinas), ao contrário do LA tradicional em que

os antigenes são insolúveis (células). Na análise de alimentos, o LA é usado principalmente para a

identificação ou confirmação de culturas puras isoladas (Feng, 1997).

3.2.3.3. Ensaios de imunodifusão

Este é outro método simples na análise de alimentos que envolve a adição de antigenes e

anticorpos que se difundem em poços num gel de agarose.

O encontro dos reagentes, em proporções definidas, leva à formação de complexos antigene-

anticorpo insolúveis que precipitam, tornando-se visíveis sob a forma de uma linha ou banda de

precipitação. Uma extrema variação na concentração de antigenes e/ou anticorpos pode alterar a


localização ou inibir a formação desta mesma banda. Esta reacção pode ser, ainda, influenciada por uma

variedade de condições físico-químicas, entre elas, a concentração electrolítica, pH e temperatura.

Alterações bruscas da temperatura, durante a incubação, levam a formação de compostos indesejáveis no

teste. Altos níveis de lípidos e proteínas nos reagentes podem afectar a formação e observação da linha de

precipitação.

3.2.3.4.Ensaios de imunofluorescência

Esta técnica tem sido amplamente utilizada tanto em microbiologia alimentar, como em

microbiologia clínica desde o seu desenvolvimento em 1942. Um anticorpo específico para um dado

antigene é acoplado a um composto fluorescente sendo emitida fluorescência aquando da formação do

complexo antigene-anticorpo, que pode ser detectada através da utilização de um microscópio de

fluorescência. Os marcadores fluorescentes geralmente usados são a Rodamina B., isocianato de

fluresceina e isotiocianato de fluoresceina. Na figura 2 pode ser observado uma fotografia na qual foi

identificada a Yersinia pestis por imunofluorescência.

Figura 2. Identificação de Yersinia pestis por imunofluorescência (Vidová et al., 2008).

3.2.3.5 Ensaio de separação imunomagnética (IMS)

O ensaio de separação imunomagnética pode ser utilizado para substituir ou complementar e

acelerar a etapa de enriquecimento que normalmente é necessária antes da detecção de patogénicos. O

IMS apenas funciona como método de detecção quando combinado com outros métodos de detecção (von


No seu procedimento de separação, são utilizados grânulos paramagnéticos que são activados à

superfície e podem ser revestidos com anticorpos por incubação num refrigerador por períodos de tempo

variáveis até 24 horas. Os anticorpos não absorvidos são removidos através de uma lavagem. Quando é

feito um tratamento adequado, os grânulos revestidos são adicionados aos alimentos que contém os

antigenes homólogos dos patogénicos contaminantes, sendo posteriormente incubados, para permitir a

reacção do complexo antigene-anticorpo com os grânulos revestidos. O antigene concentrado é analisado

por outros métodos, como por exemplo ensaios de imunofluorescência e citometria de fluxo (Vidová et al.,

2008). Pode observar-se na figura 3 a detecção de uma Salmonella spp. utilizando o IMS.


Figura 3. The Aureon Biosystems Salmonella A-Beads: Partículas paramagnéticas do tipo 1,5µm polydisperse cluster com

anticorpos purificados por afinidade contra a Salmonella spp. (Vidová et al., 2008).

Este é um processo que não é efectivamente quantitativo devido às diferentes taxas de

recuperação do complexo antigene-anticorpo e à possibilidade de vários antigenes estarem associados a

um grânulo-anticorpo. As taxas de recuperação encontram-se tipicamente entre 25 a 50%. Uma das

vantagens deste ensaio é a redução da flora microbiana que reduz o tempo necessário para a selecção de

colónias suspeitas. Uma desvantagem do IMS está relacionada com a necessidade da sua optimização para

cada tipo de amostra, pois o seu desempenho é determinado por uma série de factores como por exemplo

a concentração de anticorpos revestidos pelas partículas magnéticas, o número de partículas por teste, as

condições de incubação, o tipo de amostra, os regimes de lavagem e a especificidade do anticorpo.

3.2.4 Ensaios de hibridação de ácidos nucleicos

Avanços na biotecnologia têm conduzido ao desenvolvimento de diversos ensaios de diagnóstico

de patogénicos. Análises rápidas que utilizam a hibridação de ácidos nucléicos e técnicas de amplificação

dos mesmos possuem uma maior sensibilidade e especificidade. Muitos métodos atingem altos níveis de

automação, facilitando as suas aplicações em ensaios de rotina (Wang et al., 1997). Certas técnicas e

métodos têm bons resultados quando usados em pesquisas laboratoriais mas não são tão úteis no

diagnóstico de patogénicos (Rijpens and Herman, 2002). Basicamente, estes ensaios são realizados

utilizando material genético (DNA e RNA) no diagnóstico para a identificação de patogénicos suspeitos. O

avanço deste tipo de diagnóstico é consequente de duas vantagens essenciais: os ácidos nucleicos podem

ser medidos de uma forma rápida e sensível e a sequência de nucleótidos num determinado gene é

altamente específico e pode ser usado para diferenciar serotipos intimamente relacionados (Kwang, 2006).

O princípio essencial dos ensaios baseados em ácidos nucléicos é a formação específica de cadeias duplas

de moléculas DNA a partir de duas cadeias moleculares complementares em determinadas condições

físico-químicas. Existem diversos ensaios baseados em acidos nucleicos mas apenas o DNA probe e o PCR

têm sido desenvolvidos comercialmente para o diagnóstico de patogénicos aliementares (Wang, 2002).


A identificação de patogénicos pela hibridação de DNA é baseado na presença de genes

particulares. O gene é composto por moléculas de ácidos nucleicos, mais frequentemente por móleculas

duplas de DNA. Pequenos fragmentos de uma cadeia simples de DNA podem ser sintetizados, basenado-se

em sequencais de nucleótidos do gene de interesse. As cadeias duplas de DNA devem ser desnaturadas

antes da reacção de hibridação.

3.2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR)

Este método pode detectar uma única cópia de uma sequência de DNA alvo, e portanto, pode ser

usado para detectar um único patogénico alvo nos alimentos. É um método promissor, pois detecta o

organismo alvo através da amplificação e não sinais sendo, portanto, menos propenso a produzir falsos-

positivos. O DNA alvo pode ser amplificado um milhão de vezes em menos de uma hora (Batt, 2007). É

utilizado para reforçar a sensibilidade dos ensaios baseados em ácidos nucléicos. O PCR possui vantagens

sobre outros métodos de diagnóstico de patogénicos como uma maior especificidade, sensibilidade,

rapidez, precisão e capacidade de detectar pequenas quantidades de ácidos nucleicos alvo numa amostra

(Toze, 1999). Recentemente, foi publicado que a reacção de PCR é mais sensível na detecção de Salmonella

em alimentos marinhos, comparada com o ensaio de ELISA (Kumar et al., 2008). Quando analisados por

PCR, sinais falso-negativos podem ocorrer estando relacionados com a lise das células alvo necessárias para

a extracção de ácidos nucleicos, pela degradação destes últimos e /ou pela própria inibição directa do PCR.

Sendo assim, é importante fazer um controlo adequado na aplicação do PCR para o diagnóstico de

patogénicos alimentares (Murphy et al., 2007). Na figura 4 encontra-se esquematizado o processo de PCR.

Uma das principais limitações do PCR é a não distinção entre células viáveis e não viáveis, uma vez que o

DNA encontra-se sempre presente quer a célula esteja viva ou morta. Mas essa limitação pode ser

superada usando PCR transcriptase reversa (RT-PCR).

3.2.5. Biosensores

Um biossensor é um dispositivo analítico que converte uma resposta biológica num sinal eléctrico.

Este é composto por um elemento de biorreconhecimento - o biorreceptor - que reconhece o analito que

se pretende identificar e um elemento que converte a resposta obtida num sinal eléctrico quantificável - o

transdutor. Através de um amplificador o sinal é aumentado, seguindo para um processador de sinal no

qual poderá ser armazenado, apresentado e analisado. Podem ser utilizados como biossensores, tecidos,

microrganismos, organelos, células, enzimas, anticorpos, ácidos nucleicos, entre outros, e a transdução

pode ser óptica, electroquímica, termométrica, piezoeléctrica, magnética e micromecânica ou combinações

de duas ou mais destas técnicas (Velusamy et al., 2010). A figura 4 demonstra esquematicamente o

funcionamento de um biossensor.


Figura 4. Funcionamento esquemático de um biossensor (Velusamy et al., 2010).

3.2.5.1 Biorreceptors

Biorreceptores são espécies moleculares que utilizam um mecanismo bioquímico para o

reconhecimento. Estes podem ser anticorpos/antigenes, enzimas, ácidos nucleicos/DNA, estruturas

moleculares/células e bacteriófagos. As enzimas, os anticorpos e os ácidos nucleicos formam o principal

grupo de biorreceptores.

3.2.5.1.1 Anticorpos

Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais ou recombinantes dependendo das suas

propriedades selectivas e do modo como são sintetizados. Por vezes, são imobilizados num substrato,

podendo este servir como superfície de detecção.

A forma como um antigene e um complexo antigene-anticorpo específico interagem, é semelhante

ao modelo de chave e fechadura. O antigene original liga-se ao complexo antigene-anticorpo específico,

ficando estas estruturas tridimensionais encaixadas. Assim, é possível encontrar um anticorpo que

reconheça e se ligue a uma grande variedade de produtos químicos, biomoléculas e microrganismos.

Podem utilizar-se anticorpos como sondas específicas para o reconhecimento de analitos de interesse em

que se encontram, mesmo que em reduzidas quantidades, numa mistura com um grande número de

substâncias químicas. São exemplos de biossensores que utilizam anticorpos como o elemento

biorreceptor na detecção de patogénicos em alimentos, o SPR (surface plasmon resonance), sensores de

ressonância magnetoelástica e imunossensores.

3.2.5.1.2 Enzimas

As enzimas são utilizadas como biossensores com base na sua alta especificidade e também na sua

actividade catalítica de amplificação de bactérias patogénicas, de modo a serem detectadas e

quantificadas, permitindo uma análise sensível. Estas oferecem outras vantagens como a alta sensibilidade,

possibilidade de visualização directa e serem estáveis durante anos.


3.2.5.1.3 Ácidos Nucleicos

Na utilização de ácidos nucleicos como biorrecepetores, a identificação dos analitos alvo

constituídos por ácidos nucleicos é conseguida pela complementaridade de bases azotadas, que são

componentes genéricos de um microrganismo. Os biossensores que utilizam ácidos nucleicos para o

biorreconhecimento são simples, rápidos e baratos. Devido à sua ampla actividade física, química e

biológica, biossensores baseados em ácidos nucleicos são geralmente referidos como ideais para a

detecção de patogénicos alimentares tais como E. coli O157:H7, Salmonella spp. e Campylobacter jejuni.

As microarrays de DNA têm sido referidas também como detecção de patogénicos alimentares tais

como Listeria spp., Campylobacter spp., genes de S. aureus enterotoxina e genes de toxinas de Clostridium

perfringens e seus factores virulentos.

3.2.5.1 Transdutores

Os biossensores podem ser classificados baseados no método de transdução aplicados. Os métodos

de transdução mais populares são o óptico, o electroquímico e o método baseado na sensibilidade à massa,

possuindo cada um destes métodos várias subclasses.

3.2.5.1.1 Óptico

Os biossensores ópticos têm recebido especial interesse na detecção de patogénicos devido à sua

elevada sensibilidade e selectividade. A detecção óptica pode ser baseada na absorção, reflexão, dispersão,

infravermelhos, quimioluminescência, fluorescência e fosforescência.

3.2.5.1.2. Electroquímico

Os biossensores electroquímicos podem ser amperimétrico, potenciométrico, impedimétrico e

condutométrico baseados em parâmetros observados tal como a corrente eléctrica, o potencial,

impedância e condutância, respectivamente. Estes têm como vantagens o baixo custo, a capacidade de

funcionarem em amostras turvas e a sua fácil miniaturização, apesar da sua sensibilidade e selectividade

serem mais reduzidas que nos métodos ópticos.

3.2.5.1.3.Sensibilidade à massa

Os biossensores com sensibilidade à massa são adequados para detecções muito sensíveis nas

quais a transdução é baseada em pequenas alterações na massa. Os principais meios de análise da massa

dependem do uso de cristais piezoeléctricos, geralmente de quartzo, que podem ser postos em vibração a

uma frequência específica através da aplicação de um sinal eléctrico. A frequência de vibração é

dependente da frequência eléctrica aplicada bem como da massa do cristal. Assim, quando a massa

aumenta devido à ligação de compostos químicos, a frequência de vibração dos cristais é alterada


resultando numa alteração do sinal medido electricamente que poderá ser utilizado para calcular a massa

adicional do cristal. Este tipo de biossensores são relativamente fáceis de utilizar e de reduzido custo,

porém, são muito menos comuns na detecção de patogénicos em alimentos do que os ópticos e

electroquímicos.

4. Mercado dos Métodos de Diagnósticos em Alimentos

O mercado mundial da análise aos alimentos que engloba todos os métodos de diagnóstico,

contabilizou cerca de 1.1 biliões de euros em 1999. Particularmente, o ramo dos métodos microbiológicos

aos alimentos, que têm como objectivo detectar a presença de microrganismos, totalizou cerca de 565

milhões de euros, sendo estimado que foram realizados cerca de 440 milhões destes testes nesse mesmo

ano (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

Apesar da crescente evolução dos métodos rápidos de diagonóstico de patogénicos, principalmente nos

EUA, os métodos tradicionais dominam ainda o mercado dos testes de controlo de higiene e qualidade. Em

1999, foram realizados a nível mundial 44 milhões de testes microbiológicos, sendo que cerca de 80%

destes testes foram realizados recorrendo a métodos tradicionais (Tabela 2).

Tabela 2. Mercado Global dos testes microbiológicos no ano de 1999 - métodos tradicionais versus métodos rápidos (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

O mercado europeu dos testes de diagnóstico aos alimentos contabilizou no ano de 1999, cerca de

490 milhões de euros, sendo apenas 18 % desta quantia referente a métodos rápidos como é possível

verificar pela tabela 3.


Tabela 3. Mercado Europeu dos testes de diagnóstico aos alimentos no ano de 2009 (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

Como se verifica pela tabela 3, na Europa foram realizados em 1999 cerca de 28 milhões de testes a

patogénicos, totalizando uma receita de cerca de 98 milhões de euros. Neste ano os métodos rápidos para

detecção de patogénicos geraram receitas de cerca de 13 milhões de euros correspondendo a 13 % do

mercado.

Como é possível verificar pela tabela 4 no mercado dos métodos rápidos, os imunoensaios

contabilizaram ainda a maior fatia deste mercado seguido do métodos de DNA (PCR).

Tabela 4. Mercado dos testes microbiológicos aos alimentos utilizando métodos rápidos no ano de 2009 (von Blanknfeld-Enkvist e Brannback, 2002).

5. O Futuro das técnicas actuais

O ramo tecnológico de diagnóstico de patogénicos em alimentos é visto como uma recente área de

negócio rentável, sendo emergente particularmente devido à actual indefinição da indústria e mercado

alimentares. Devido à crescente exigência pública no que respeita à segurança e higiene alimentares, este

ramo tecnológico enfrenta vários desafios quanto à procura de novas técnicas e ao aperfeiçoamento das já

existentes. Referem-se abaixo aspectos a melhorar em algumas das técnicas já descritas.

5.1 Contagem das células viáveis

Apesar da importância da contagem de células viáveis sejam elas coliformes, leveduras ou bolores

na avaliação da qualidade e segurança dos produtos alimentares, no contexto industrial, existe a


necessidade de métodos alternativos mais baratos, consistentes e que apresentem resultados em tempo

real tais como métodos baseados em contagem de células fluorescentes por microscopia, citometria de

fluxo e biossensores.

5.2 Monitorização da Higiene

O desenvolvimento de métodos, que permitam a monitorização em tempo real da higiene dos

processos alimentares industriais permitirão, consequentemente, uma melhor segurança na indústria

alimentar. Métodos baseados em ATP bioluminescência, Adenilato Kinase e biossensores podem ser

desenvolvidos nesse sentido.

5.3 Ensaios imunológicos

Vários sistemas comerciais baseados em ELISA que permitem a análise automática, encontram-se

já no mercado. O uso de novos anticorpos recombinantes e técnicas de molecular imprinting permitirão

melhorar a sensibilidade e versatilidade desta técnica.

5.4 Biossensores e microarrays

Os biossensores possuem um elevado potencial na automação dos processos e permitem a

construção de equipamentos simples e portáteis para uma maior facilidade e rapidez nas análises. Estas

propriedades poderão permitir a sua utilização em novas áreas como a qualidade e controlo de processos,

como são exemplos, o controlo de processos de fermentação e a qualidade e segurança das matérias-

primas.

5.5 Ensaios baseados em ácidos nucleicos

O desenvolvimento de ensaios homogéneos e de automação têm melhorado a performance dos

métodos de análise baseados em PCR numa grande parte dos laboratórios alimentares. Novos formatos de

ensaios podem ser explorados para o diagnóstico de patogénicos na indústria alimentar.

6. Conclusão

A segurança alimentar tem-se tornado uma preocupação ao nível da saúde pública devido ao

aumento da exposição por parte dos alimentos a seres patogénicos, principalmente, derivada às técnicas

de produção e ao crescente amontoar de etapas de processamento a que estes são sujeitos, por vezes em

condições de higiene menos apropriadas. Muitas das vezes, o objectivo passa por uma produção em massa

e obtenção de lucros, e não pela segurança alimentar do produto para o ser humano.

Deste modo, visando garantir a segurança de produtos alimentares é importante a implementação

de programas de gestão da segurança alimentar como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control

http://en.wikipedia.org/wiki/Hazard_Analysis_and_Critical_Control_Points


Points).

Durante as últimas décadas, novas tecnologias têm sido desenvolvidas no sentido da detecção de

patogénicos nos alimentos. Estas técnicas tendem a evoluir no sentido de se tornarem mais rápidas e

fiáveis, com uma maior sensibilidade e selectividade e a um menor custo, sendo possível atingir um nível no

qual se consiga realizar uma monitorização de patogénicos em tempo real recorrendo, por exemplo, a

biossensores. Este, devido às actuais inquietações ao nível da higiene alimentar, tornou-se um mercado de

elevada rendibilidade e em clara expansão a nível mundial.

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Diagnóstico de Patogénicos em Alimentos